CZ249596A3 - Amplification method of nucleic acids - Google Patents
Amplification method of nucleic acids Download PDFInfo
- Publication number
- CZ249596A3 CZ249596A3 CZ962495A CZ249596A CZ249596A3 CZ 249596 A3 CZ249596 A3 CZ 249596A3 CZ 962495 A CZ962495 A CZ 962495A CZ 249596 A CZ249596 A CZ 249596A CZ 249596 A3 CZ249596 A3 CZ 249596A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- enzyme
- thermostable
- reaction
- amplification
- dna polymerase
- Prior art date
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 148
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 148
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 42
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 62
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 161
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 161
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 109
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 94
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 86
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 86
- AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 3-methylfuran-2,5-dione Chemical compound CC1=CC(=O)OC1=O AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 25
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 24
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 22
- FMJUDUJLTNVWCH-UHFFFAOYSA-N 2-ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound CCOC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FMJUDUJLTNVWCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 15
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 claims description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 14
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical class O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- MFGALGYVFGDXIX-UHFFFAOYSA-N 2,3-Dimethylmaleic anhydride Chemical compound CC1=C(C)C(=O)OC1=O MFGALGYVFGDXIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HMMBJOWWRLZEMI-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrahydro-2-benzofuran-1,3-dione Chemical compound C1CCCC2=C1C(=O)OC2=O HMMBJOWWRLZEMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 claims description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 241000589596 Thermus Species 0.000 claims description 3
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 claims description 2
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 71
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 84
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 58
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 21
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 19
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 19
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 17
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 12
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 11
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 6
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 5
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 4
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 4
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 4
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 3
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- KMOUUZVZFBCRAM-OLQVQODUSA-N (3as,7ar)-3a,4,7,7a-tetrahydro-2-benzofuran-1,3-dione Chemical compound C1C=CC[C@@H]2C(=O)OC(=O)[C@@H]21 KMOUUZVZFBCRAM-OLQVQODUSA-N 0.000 description 1
- QCQARTXACZAUOH-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,4,4-trihydroxy-3-methylbutane-2-sulfonic acid Chemical compound OC(O)(O)C(C(S(=O)(=O)O)(N)C)C QCQARTXACZAUOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 238000005698 Diels-Alder reaction Methods 0.000 description 1
- 241001427367 Gardena Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101710085030 Gene 32 protein Proteins 0.000 description 1
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 241000204671 Pyrodictium Species 0.000 description 1
- 241000531165 Pyrodictium abyssi Species 0.000 description 1
- 241000204670 Pyrodictium occultum Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000205188 Thermococcus Species 0.000 description 1
- 241000204315 Thermosipho <sea snail> Species 0.000 description 1
- 241000206213 Thermosipho africanus Species 0.000 description 1
- 241000204652 Thermotoga Species 0.000 description 1
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 150000001993 dienes Chemical class 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000012985 polymerization agent Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000018767 positive regulation of catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000005583 trifluoroacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Description
Oblast techniky
Předložený vynález se týká oblasti chemie nukleových kyselin. Specifičtěji se týká způsobů amplifikace sekvencí nukleové kyseliny a způsobů redukce nespecifické amplifikace.
Dosavadní stav techniky
Proces polymerasové řetězové reakce (PCR) pro amplifikaci sekvencí nukleové kyseliny je dobře nám v oboru a je popsán v US patentech č. 4683202, 4683195 a 4965188. Komerční prodejci jako je Perkin Elmer, Norwalk, CT, prodávají PCR činidla a publikují PCR protokoly.
V každém cyklu PCR amplifikace je dvojřetězcová cílová sekvence denaturována, ke každému řetězci denaturovaného cíle jsou tepelně hybridizovány primery a primery jsou prodlouženy působením DNA polymerasy. Specifičnost amplifikace závisí na specifitě primerové hybridizace. Primery jsou vybrány tak, aby byly komplementární k nebo v podstatě komplementární k sekvencím, vyskytujícím se na 3' konci každého řetězce cílové nukleokyselinové sekvence. Za zvýšených teplot používaných typicky v PCR hybridizují primery pouze k zamýšlené cílové sekvenci. Avšak amplifikace reakčních směsí jsou typicky prováděny při teplotě místnosti, tedy pod teplotou potřebnou k zajištění specifičnosti primerové hybridizace. Za takových méně přísných podmínek, se primery mohou vázat nespecificky k jiné pouze parciálně komplementární nukleokyselinové sekvenci (nebo i k jiným primerům) a iniciovat syntézu nežádoucích prodloužených produktů, které mohou být amplifikovány spolu s cílovou sekvencí. Amplifikace nespecifických příměrových prodloužených produktů může soutěžit s amplifikaci požadovaných cílových sekvencí a může významně snižovat účinnost amplifikace požadované sekvence. Problémy vyvolané nespecifickou amplifikaci jsou dále diskutovány v Chou a spol., 1992, Nucleic Acids Research 29 (7):1717 -1723.
Nespecifická amplifikace muže být redukována redukcí tvorby prodloužených produktů z primerů navázaných k necílovým sekvencím před startem reakce. V jedné metodě označené jako horký-start protokol (hot-start) se jedno nebo více podstatných činidel neuvádí do reakční směsi, dokud teplota není dostatečně vysoká pro poskytnutí nezbytné hybridizační specifity. Tímto způsobem nemůže reakční směs podporovat primerové prodloužení během doby, kdy reakční podmínky nezaručují specifickou primerovou hybridizaci.
Metody horkého startu mohou být prováděny ručně při otevření reakční zkumavky po počátečním vysokoteplotním inkubačním stupni a přidáním chybějících činidel. Nicméně jsou ruční metody s horkým startem pracovně náročné a zvyšují riziko kontaminace reakční směsi. Metody s horkým startem, které používají tepelně labilní materiál jako je vosk pro oddělení nebo zachycení reakčních složek jsou popsány v US patentu č. 5411876 a Chou a spol., 1992, supra. V těchto metodách taví vysokoteplotní předreakční inkubace tepelně labilní materiál čímž umožňuje, aby se činidla promísila.
Další metoda redukce tvorby prodloužených produktů z primerů navázaných k necílovým sekvencím před začátkem reakce zmírňuje inhibic DNA polymerasy za použití sloučeniny, která se nekovalentně váže k DNA polymerase tepelně reverzibilním způsobem. US patent č. 5338671 popisuje použití protilátek specifických pro termostabilní DNA polymerasu pro inhibici DNA polymerasové aktivity. Protilátky musí být inkubovány s DNA polymerasou v pufru při teplotě místnosti pro sestavení reakční směsi za účelem umožnění tvorby komplexu protilátkaDNA polymerasa. Protilátková inhibice DNA polymerasové aktivity je inaktivována vysokoteplotní předreakČní inkubací. Nevýhodou této metody je, že produkce protilátek specifických k DNA polymerase je nákladná a časově náročná, zejména ve velkých množstvích. Navíc přídavek protilátek k reakční směsi může vyžadovat přepracování amplifikační reakce.
Tvorba prodloužených produktů může být také inhibována přídavkem sloučeniny, která se nekovalentně váže k primerúm tepelně reverzibilním způsobem, čímž brání primerúm před hybridizací k jakékoliv sekvenci, cílové nebo jiné. Například jednořetězcový vazebný protein přidaný k reakční směsi bude vázat primery a tím bránit primerové hybridizaci a inhibici příměrového prodloužení. Zlepšení výtěžku PCR produktů za použití genového 32 proteinu jsou popsána Schwarzem a spol., 1990, Nucleic Acids Research 18(4):10.
Nespecifická amplifikace může být redukována degradací prodloužených produktů vytvořených z primerů navázaných k necílovým sekvencím před startem reakce, jako je použití metod popsaných v US patentu č. 5418149 a ve WO 92/01814. Degradace nově syntetizovaných prodloužených produktů se dosáhne inkorporací dUTP a UNG do reakční směsi a inkubací reakční směsi při 45 až 60 °C pro provedení amplifikační reakce. Nevýhodou této metody je, že degradace prodlouženého produktu soutěží se tvorbou prodlouženého produktu a eliminace nespecifického příměrového prodlouženého produktu je pravděpodobně méně úplná.
Běžné techniky molekulární biologie, proteinové chemie a nukleokyselinové chemie, které jsou známé odborníkům v oboru, jsou plně vysvětleny v literatuře. Viz např. Molecular
Cloning -A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, New York (Sambrook a spol., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait, vyd., 1984); Nucleic Acid Habridization (B.D.Hames a S.J.Higgins vyd. 1984) ; Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press) a serie Methods in Enzymology (Academie Press, lne.). Všechny patenty, patentové přihlášky a publikace zde uváděné, jak dříve tak dále, jsou zde zahrnuty jako odkaz.
Podstata vynálezu
Předložený vynález poskytuje způsoby a činidla pro amplifikaci nukleové kyseliny za použití amplifikační reakce na bázi primerů jak jsou specifikovány v připojených nárocích. Tyto metody a činidla poskytují jednoduché a ekonomické řešení problému nespecifické amplifikace. Metody používají reverzibilně inaktivovaný tepelně stabilní enzym, který může být reaktivován inkubací v aplifikační reakční směsi při zvýšené teplotě. Nespecifická amplifikace je většinou redukována, protože reakční směs neposkytuje podporu primerového prodloužení dokud teplota reakční směsi nebyla zvýšena na teplotu, která umožňuje primerovou hybridizační specifičnost.
Jeden aspekt předloženého vynálezu se týká reverzibilně inaktivovaných tepelně stabilních enzymů, které jsou produkovány reakcí mezi termostabilním enzymem, který katalyzuje primerovou prodlužovací reakci a modifikačním činidlem. Reakce vede k významné, výhodně v podstatě kompletní redukci enzymové aktivity. Inkubace modifikovaného enzymu ve vodném pufru při alkalickém pH při teplotě, která je menší než asi 25 °C nevede v podstatě ke zvýšení enzymové aktivity za méně než asi 20 minut. Inkubace modifikovaného enzymu ve vodném pufru, upraveném na pH 8-9 při 25 °C, při teplotě vyšší než asi 50 °C poskytne alespoň dvojnásobné zvýšení v aktivitě příměrového prodloužení za méně než asi 20 minut. Reverzibilně inaktivované termostabilní enzymy podle vynálezu, ve svém aktivním stavu, buď katalýzují primerové prodloužení nebo jsou nezbytné pro to, aby došlo k příměrovému prodloužení. Preferované enzymy zahrnují termostabilní DNA polymerasy a ligasy.
Preferovaná modifikovaná činidla jsou anhydridy dikarboxylových kyselin obecného vzorce
kde Rj_ a R2 jsou vodík nebo organické radikály, které mohou být spojeny, nebo obecného vzorce
kde Ri a R2 jsou organické radikály, které mohou být spojeny a vodíky jsou cis. Organický radikál může být přímo připojen ke kruhu vazbou uhlík-uhlík nebo přes vazbu uhlík-heteroatom, jako je vazba uhlík-kyslík, uhlík-dusík nebo uhlík-síra. Organické radikály mohou být také vzájemně spojeny za vzniku kruhové struktury jako je například v 3,4,5,6tetrahydroftalanhydridu.
Preferovaná činidla zahrnují maleinanhydrid; substituované maleinanhydridy jako je citrakonový anhydrid, cis-akonitový anhydrid a 2,3-dimethylmaleinanhydrid; anhydrid kyseliny exo-cis-3,6-endoxo-A4-tetrahydroftalové; a 3,4,5,6tetrahydroftalanhydrid. Zejména jsou preferovány anhydrid kyseliny citrakonové a anhydrid kyseliny cis-akonitové pro přípravu reverzibilně inaktivovaných DNA polymeras pro použití v PCR amplifikacích.
Jiný aspekt předloženého vynálezu se týká metod pro provedení reakcí amplifikace nukleová kyseliny za použití reverzibilně inaktivovaného terraostabilního enzymu podle předloženého vynálezu. Předložený vynález poskytuje metody amplifikace cílové nukleová kyseliny obsažené ve vzorku, zahrnující stupně:
(a) kontaktu vzorku s amplifikační reakční směsí, obsahující primer komplementární k cílové nukleová kyselině a modifikovaný termostabilní enzym, kde modifikovaný termostabilní enzym je produkován reakcí směsi termostabilního enzymu, který katalyzuje primerovou prodlužovací reakci a modifikačního činidla, přičemž se reakce provádí v alkalickém pH při teplotě, která je menší než asi 25 °C, přičemž reakce vede k chemické modifikaci enzymu, která vede v podstatě k úplné inaktivaci enzymové aktivity a přičemž inkubace modifikovaného enzymu ve vodném pufru upraveném na pH 8-9 při 25 °C, při teplotě vyšší než asi 50 °C vede k alespoň dvjnásobnému zvýšení enzymové aktivity během méně než 20 minut a (b) inkubace výsledné směsi ze stupně (a) při teplotě, která je větší než asi 50 °C po dobu dostačující k reaktivaci enzymu a vytvoření produktu příměrového prodloužení.
Preferovanou metodou podle vynálezu je metoda amplifikace cílové nukleové kyseliny obsažené ve vzorku, zahrnuj ící:
(a) kontakt vzorku s amplifikační reakční směsí, obsahující primer komplementární k cílové nukleové kyselině a modifikovaný termostabilní enzym, kde modifikovaný termostabilní enzym je produkován reakcí směsi termostabilního enzymu anhydridu dikarboxylové kyseliny obecného vzorce
kde R-£ a R2 jsou vodík nebo organické radikály, které mohou být spojeny, nebo obecného vzorce
kde R^ a R2 jsou organické radikály, které mohou být spojeny a vodíky jsou cis, přičemž reakce poskytuje v podstatě kompletní inaktivaci enzymové aktivity a
(b) inkubaci výsledné směsi ze stupně (a) při teplotě, která je větší než asi 50 °C po dobu dostačující k reaktivaci enzymu a vytvoření produktů příměrového prodloužení.
Preferovaná provedení metod používají reverzibilně modifikované enzymy modifikované použitím preferovaných modifikačních činidel. V některých provedeních vynálezu se inkubační stupeň, stupeň (b) provádí před startem amplifikační reakce. V jiných provedeních je inkubace, která vede k reaktivaci enzymu, integrálním stupněm v amplifikačním procesu. Například denaturační stupeň prováděný v každém PCR cyklu může současně působit reaktivaci modifikované DNA polymerasy.
V preferovaném provedení vynálezu je amplifikační reakcí polymerasová řetězová reakce (PCR) a používá se reverzibilně inaktivovaná termostabilní DNA polymerasa. Reakční směs se inkubuje před provedením amplifikační reakce při teplotě, která je vyšší než teplota teplotní hybridizace amplifikační reakce. DNA polymerasa je tak inaktivována dokud je teplota nad teplotou, která umožňuje specifitu amplifikační reakce, čímž snižuje nespecifickou amplifikaci.
Jiný aspekt vynálezu se týká amplifikačních reakčních směsí, které obsahují reverzibilně inaktivovaný termostabilní enzym podle předloženého vynálezu spolu s činidly pro provedení amplifikační reakce. V preferovaném provedení obsahuje amplifikační reakční směs oligonukleotidové primery pro provedení PCR.
Další aspekt vynálezu se týká kitú, které obsahují reverzibilně inaktivovaný termostabilní enzym podle vynálezu a jedno nebo více amplifikačních činidel.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1 představuje vzorce anhydridu kyseliny citrakonové, anhydridu kyseliny cis-akonitové a anhydridu kyseliny 2,3dimethylmaleinové a reakci mezi anhydridem kyseliny citrakonové a lysinem.
Obr. 2 představuje výsledky apmlifikací provedených za použití citrakonylatované Taq DNA polymerasy jak je popsáno v příkladu 4
Obr. 3 představuje výsledky amplifikací provedených za použití citrakonylatovaných DNA polyraeras jak je popsáno v příkladu 6
Obr. 4 představuje výsledky při měnící se době předinkubace v amplifikacích prováděných za použití citrakonylatovaných a cis-akonitylatovaných DNA polymeras jak jsou popsány v příkladu 9
Obr. 5 představuje výsledky při měnících se počtech amplifikačních cyklů v amplifikacích prováděných za použití citrakonylatovaných a cis-akonitylatovaných DNA polymeras jak jsou popsány v příkladu 10.
Pro výklad vynálezu jsou dále definovány některé výrazy.
Výrazy nukleová kyselina a oligonukleotid označují primery, sondy a oligomerní fragmenty, které jsou detegovány a měly by to genericky být polydeoxyribonukleotidy (obsahující 2-deoxy-D-ribosu), polyribonukleotidy (obsahující D-ribosu) a mnoho jiných typů polynukleotidú, které jsou Nglykosidy purinové nebo pyrimidinové báze, nebo modifikované purinové nebo pyrimidinové báze. Není zde rozdíl v délce mezi výrazy nukleová kyselina a oligonukleotid a tyto výrazy budou používány zaměnitelně. Tyto výrazy se týkají pouze primární struktury molekuly. Tyto výrazy tak zahrnují dvoj- a jednořetězcové DNA jakož i dvoj- a jednořetězcové RNA.
Oligonukleotidy mohou být připraveny jakoukoliv vhodnou metodou. Přehled metod syntézy je uveden v práci Goodchilda, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165-137.
Výraz hybridizace označuje tvorbu dvoušroubovicové struktury ze dvou jednořetězcových nukleových kyselin způsobenou párováním komplementárních bází. Hybridizace se může objevit mezi plně komplementárními nukleokyselínovými řetězci nebo mezi v podstatě komplementárními nukleokyselínovými řetězci, které obsahují malé regiony chybného párování. Podmínky, za kterých budou hybridizovat pouze plně ěkomplementární nukleokyselinové řetězce jsou označovány jako přísné hybridizačni podmínky nebo sekvenčně-specifické hybridizační podmínky. Stabilní dvušroubovice v podstatě komplementárních sekvencí mohou být dosaženy za méně přísných hybridizačních podmínek. Odborník v oboru technologie nukleových kyselin může stanovit stabilitu dvoušroubovice empiricky při zvážení mnoha proměnných, zahrnujících například délku a koncentraci bázových párů oligonukleotidů, iontovou sílu a výskyt chybného párování bází, podle návodů známých v oboru (viz např. Sambrook a spol., 1989, supra).
Obecně jsou přísné hybridizační podmínky zvoleny asi 5 °C pod bodem tepelného tání (thermal melting point - Tm) pro specifickou sekvenci při definované iontové síle a pH. Tm je teplota (při definované iontové síle a pH), při které 50 % bázových párů je disociováno. Uvolněním přísnosti hybridizačních podmínek umožní toleranci sekvenčního chybného párování; stupeň tolerovaného chybného párování může být kontrolován úpravou hybridizačních podmínek.
Výraz primer se týká oligonukleotidů, jak přírodního tak syntetického, schopného působit jako počáteční bod DNA syntézy za podmínek, ve kterých je syntéza produktu příměrového prodloužení komplementárního k řetězci nukleové kyseliny vyvolána, tj. za přítomnosti čtyř rozdílných nukleosid trifosfátů a činidla pro polymerizaci (tj. DNA polymerasy nebo reverzní transkriptasy) ve vhodndém pufru a při vhodné teplotě. Oligonukleotidová analogy jako jsou peptidové nukleové kyseliny, mohou působit jako primery a jsou zahrnuty ve výrazu primer jak je zde použit. Primer je výhodně jednořetězcový oligodeoxyribonukleotid. Vhodná délka primeru závisí na zamýšleném použití primeru, ale typicky je v rozmezí od 6 do 50 nukleotidů. Krátké primerové molekuly obecně vyžadují chladničkové teploty pro tvorbu dostatečně stabilních hybridních komplexů s templátem. Primer nemusí odrážet přesnou sekvenci templátu nukleové kyseliny, ale musí být dostatečně komplementární k hybridizaci s templátem.
Výraz primerové prodloužení jak je zde použit , se týká jak syntézy DNA vzniklé z polymerizace jednotlivých nukleosidtrifosfátů za použití primeru jako počátečního bodu a k připojení dalších oligonukleotidů k primeru k prodloužení primeru. Jak je zde použit je výraz primerové prodloužení zamýšlen jako zahrnující ligaci dvou oligonukleotidů za vzniku delšího produktu, který může sloužit jako cíl v budoucích amplifikačních cyklech. Jak je zde použit, je výraz primer míněn jako zahrnující oligonukleotidy použité v ligaci zprostředkovaných amplifikačních procesech, které jsou prodlouženy ligaci druhého oligonukleotidů, který hybridizuje v sousední poloze.
Primery mohou zahrnovat další rysy, které umožňují detekci nebo imobilizaci primeru, ale nemění základní vlastnost primeru, působení jako počáteční bod iniciace DNA syntézy. Například mohou primery obsahovat další nukleokyselinovou sekvenci na 5' konci, která nehybridizuje k cílové nukleové kyselině, ale která usnadňuje klonování amplifikovaného produktu. Region primeru, který je dostatečně komplementární k templátu k hybridizaci, je zde označován jako hybridizující region.
Výraz cílový region a cílová nukleová kyselina se týká regionu nebo subsekvence nukleové kyseliny, který je amplifikován. Místo primerové hybridizace se může označit jako cílový region pro primerovou hybridizaci.
Jak je zde použito, je oligonukleotidový primer specifický pro cílovou sekvenci, je-li počet chybných párování přítomných mezi oligonukleotidem a cílovou sekvencí menší než počet chybných párování přítomných mezi oligonukleotidem a necílovými sekvencemi, které mohou být přítomny ve vzorku. Hybridizační podmínky ymohou být zvoleny tak, že se za nich vytváření stabilní dvoušroubovice pouze není-li počet přítomných chybných párování větší než počet chybných párování přítomných mezi oligonukleotidem a cílovou sekvencí. Za takových podmínek může oligonukleotid tvořit stabilní dvoušroubovici pouze s cílovou sekvencí. Použití cílově specifických primerů za vhodných přísných amplifikačních podmínek umožňuje specifickou amplifikaci těch cílových sekvencí, které obsahují cílová vazebná místa. Použití sekvenčně specifických amplifikačních podmínek umožňuje specifickou amplifikaci těch cílových sekvencí, které obsahují exaktně komplementární primerová vazebná místa.
Výraz nespecifická amplifikace označuje amplifikaci nukleokyselinových sekvencí jiných než cílových sekvencí, které vznikají z hybridizace primerů k sekvencím jiným než je cílová sekvence a pak slouží jako substrát pro primerové prodloužení. Hybridizace primeru k necílové sekvenci je označena jako nespecifická hybridizace a muže se objevovat během nižší teploty, redukovaných přísných předreakčních podmínek.
Výraz termostabilní enzym označuje enzym, který je relativně stabilní k teplu. Termostabilní enzymy mohou odolávat vyšší teplotní inkubaci použité pro odstranění modifikovaných skupin, typicky větší než 50 °C, aniž by byly postiženy nevratnou ztrátou aktivity. Modifikované termostabilní enzymy použitelné v metodách podle předloženého vynálezu zahrnují termostabilní DNA polymerasy a termostabilní ligasy.
Výraz termostabilní DNA polymerasa označuje enzym, který je relativně stabilní k teplu a katalyzuje polymerizaci nukleosid trifosfátů za vzniku produktů příměrového prodloužení, které jsou komplementární k jednomu z nukleokyselínových řetězců cílové sekvence. Enzym iniciuje syntézu na 3' konci primeru a postupuje ve směsu.k 5* konci templátů do ukončení syntézy. Čištěné termostabilní DNA polymerasy jsou popsány v US patentu č. 4889818; US patentu č. 5352600, US patentu č. 5079352; WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200; WO 92/06202; US patentu č. 5491086, WO 92/09689 a US patentu č. 5210036.
Enzym získaný z organismu zde označuje enzym, který je čištěn z organismu nebo rekombinantní verzi enzymu, který je čištěn z organismu a zahrnuje enzymy, ve kterých byly aminokyselinové sekvence modifikovány použitím technik molekulární biologie.
Výraz reverzibilně inaktivovaný jaka je zde použit se týká enzymu, který byl inaktivován reakcí se sloučeninou, která vede ke kovalentní modifikaci (označované také jako chemická modifikace) enzymu, kde modifikující sloučenina je odstranitelná za vhodných podmínek. Reakce, která vede k odstranění modifikující sloučeniny nesmí být reverzní modifikační reakce. Pokud je to reakce, která vede k odstranění modifikující sloučeniny a obnovení funkce enzymu, je enzym považován za reverzně inaktivovaný.
Výraz reakční směs označuje roztok, obsahující činidla nezbytná k provedení dané reakce. Amplifikační reakční směs označuje roztok, obsahující nezbytná činidla pro provedení amplifikační reakce, typicky obsahující oligonukleotidové primery a DNA polymerasu nebo ligasu ve vhodném pufru. PCR reakční směs typicky obsahuje oligonukleotidové primery, termostabilní DNA polymerasu, dNTP, a dvojvazný kovový kationt ve vhodném pufru. Reakční směs je označována jako kompletní, jestliže obsahuje všechna činidla nezbytná k provedení reakce a nekompletní, jestliže obsahuje pouze část nezbytných činidel. Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že reakční složky jsou rutinně uchovávány jako oddělené roztoky, obsahující každý část všech složek, z důvodů výhodnosti, skladovací stability a pro umožnění nezávislé úpravy koncentracaí složek podle aplikace a dále že se reakční složky spojí před reakcí pro vytvoření kompletní reakční směsi.
Metody podle předloženého vynálezu zahrnují provedení amplifikační reakce za použití reverzibilně inaktivovaného termostabilního enzymu, kde je aktivní enzym vyžadovát pro primerové prodloužení. Před vysokoteplotní inkubací, která aktivuje enzym, amplifikační reakční směs nepodporuje primerové prodloužení a nevznikají žádné prodloužené produkty, nespecifické ani jiné. Po vysokoteplotní inkubaci, která reaktivuje enzym se amplifikační reakce udržuje při zvýšených teplotách, které zajištují reakční spefičnost.
Produkty příměrového prodloužení jsou vytvářeny pouze za podmínek, které zajiščují amplifikační specifitu.
V metodách podle předloženého vynálezu teplem inaktivovaný enzym, ve svém aktivním stavu, katalyzuje reakci primerového prodloužení. Pro použití v typické amplifikační reakci, např. PCR, vykazuje reverzibilně inaktivovaný termostabilní enzym, ve svém aktivním stavu, DNA polymerasovou aktivitu. Pro použití v ligasou zprostředkovaných amplifikačních systémech vykazuje reverzibilně inaktivovaný termostabilní enzym ve svém aktivním stavu aktivitu DNA ligasy.
V ligasou zprostředkovaném amplifikačním systému se vytvoří “produkt prodloužení ligací prvního oligonukleotidů (zahrnut do výrazu primer) ke druhému oligonukleotidů, který hybridizuje přiléhající ke 3' konci prvního oligonukleotidů. Druhý oligonukleotid může hybridizovat bezprostředně přiléhající k priméru a v tomto případě je pouze vyžadována ligace, nebo může hybridizovat jedna nebo více bází vzdálených od priméru a v tomto případě je vyžadována polymerasová akativita pro prodloužení priméru před ligací. V každém případě je zde spojení dvou oligonukleotidů, které hybridizují k přiléhajícím regionům cílové DNA označeno výrazem primerové prodloužení.
Reverzibilně inaktivované termostabilní enzymem podle vynálezu jsou produkovány reakcí mezi enzymem a modifikačním činidlem, která vede k reverzibilní chemické reakci enzymu, která vede k úplné ztrátě nebo téměř úplné, enzymové aktivity. Modifikace zahrnuje kovalentní připojení modifukátorové skupiny k proteinu. Modifikátorová skupina se volí tak, že modifikace je reverzní při inkubaci při zvýšené teplotě v amplifikačním reakčním pufru. Vhodné enzymy a modifikátorové skupiny jsou popsány dále.
Reverzibilně inaktivované enzymy, které vykazují ve svém aktivním stavu DNA polymerasovou aktivitu, se připraví z termostabilních DNA polymeras. Termostabilní DNA polymerasy použitelné v amplifikačních reakcích jsou dobře známé v oboru a mohou být získány z mnoha zdrojů jako jsou termofilní eubakterie nebo archaebakterie ze druků rodu Thermus, Thermotoga, Thermococcus, Pyrodictium, Pyrococcus a Thermosipho. Představiteli rodů, ze kterých byly získány termostabilní DNA polymerasy použitelné v PCR amplifikacích zahrnují Thermus aguaticus, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Pyrodictium occultum, Pyrodictium abyssi a Thermosipho africanus. Termostabilní DNA polymerasy jsou popsány v US patentu č. 4889318, US patentu č. 5352600, US patentu č. 5079352, WO 91/09950, WO 92/03556, WO 92/06200, WO 92/06202, US patentu č. 5491086, WO 92/09689 a US patentu č. 5210036. Termostabilní DNA polymerasy jsou obchodně dostupné od Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Reverzibilně inaktivované termostabilní enzymy vhodné pro použití v jiných amplifikačních postupech, jako jsou ligasou zprostředkované amplifikace, jsou připraveny z termostabilních enzymů popsaných v odkazech citovaných dále, které popisují různé amplifikační metody.
Metody podle předloženého vynálezu nejsou omezeny na použití enzymů uvedených jako příklady. Například jakákoliv termostabilní DNA polymerasa popsaná v literatuře pro použití v amplifikačních reakcích může být modifikována jak je zde popsáno pro vprodukci reverzibilně inaktivovaného enzymu vhodného pro použití v předložených metodách. Obecně může být v předložené metodě použit jakýkoliv enzym, který katalyzuje primerové prodloužení nebo je vyžadován pro k tomu, aby došlo k příměrovému prodloužení a je dostatečně termostabilní, aby odolal vysokoteplotní reaktivační inkubaci aniž by byl nevratně inaktivován a může být modifikován jak je zde popsáno pro produkci reverzibilně inaktivovaného enzymu. Odborník v oboru bude schopen optimalizovat modifikaci reakce a podmínky amplifikační reakce pro jakýkoliv daný enzym na bázi uvedených poznatků.
V preferovaných provedeních vynálezu se reverzibilní inaktivace termostabilního enzymu provádí reverzibilním blokováním lysinových zbytků chemickou modifikací εaminoskupiny lysinových zbytků. Modifikace lysinů v aktivním regionu proteinu vede k inaktivaci proteinu. Dále modifikace lysinů mimo aktivní region může přispívat k inaktivaci proteinu sterickou interakcí nebo konformačními změnami. V literatuře bylo popsáno množství sloučenin, které reagují s aminoskupinami reverzibilním způsobem. Například aminoskupiny byly reverzibilně modifikovány trifluoracetylácí (viz Goldnerg a Anfinsen, 1962, Biochemistry 1:410), amidinací (viz Hunter a Ludwig, 1962, J.Amer.Chem.Soc. 84:3491), maleylací (viz Butler a spol., 1967, Biochem.J. 103:78), acetoacetylací (viz Marzotto a spol., 1967, Biochem.
Biophys.Res.Commun. 26:517 a Marzotto a spol., 1968, Biochim.Biophys.Acta 154:450), tetrafluorsukcinylácí (viz Braunitzer a spol., 1968, Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem. 349:265) a citrakonylácí (viz Dixon a Perham, 1968,
Biochem.J. 109:312-314; a Habbeb a Atassi, 1970, Biochemistry 9 (25) :4939-4944) .
Preferovaná činidla pro chemickou modifikaci saminoskupiny lysinových zbytků jsou anhydridy dikarboxylových kyselin obecného vzorce kde Rtl a R2 jsou vodík nebo organické radikály, které mohou být spojeny, nebo obecného vzorce kde R]_ a R2 Ísou organické radikály, které mohou být spojeny a vodíky jsou cis. Organický radikál muže být přímo připojen ke kruhu vazbou uhlík-uhlík nebo přes vazbu uhlík-heteroatom, jako je vazba uhlík-kyslík, uhlík-dusík nebo uhlík-síra. Organické radikály mohou být také vzájemně spojeny za vzniku kruhové struktury jako je například v 3,4,5,6tetrahydroftalanhydridu.
Anhydridy dikarboxylových kyselin reagují s aminoskupinami proteinů za získání odpovídajících acylovaných produktů jak je ukázáno pro citrakonový anhydrid na obr. 1. Reverzibilita výše uvedených anhydridů dikarboxylových kyselin se předpokládá být zvýšená přítomností bud dvojné vazby cis-uhlík-uhlík nebo cis vodíky, která udržuje terminální karboxylovou skupinu acylovaného zbytku v prostorové orientaci vhodné pro interakci s amidovou skupinou a následnou deacylaci. Viz Palacian a spol., 1990,
Mol.Cell.Biochem. 97:101-111 pro popisy pravděpodobných mechanismů jak acylačních tak deacylačních reakcí. Jiné substituenty mohou podobně omezovat rotaci kolem vazby 2,3 acylové skupiny v acylovaném produktu a o takových sloučeninách se předpokládá, že budou působit v metodách podle předloženého vynálezu.
Preferovaná činidla zahrnují maleinanhydrid; substituované maleinanhydridy jako je citrakonový anhydrid, cis-akonitový anhydrid a 2,3-dimethylmaleinanhydrid; anhydrid kyseliny exo-cis-3,6-endoxo-Δ4-tetrahydroftalové; a 3,4,5,6tetrahydroftalanhydrid. Činidla jsou obchodně dostupná od např. Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI), Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO) nebo Spectrum Chemical Mfg. Corp.
(Gardena, CA). Modifikace termostabilních DNA polymeras použitím substituovaných maleinanhydridových činidel, citrakonanhydridu a cis-akonitové anhydridu jsou popsána v příkladech.
Relativní stability aminoskupin acylovaných za použití výše uvedených činidel se snižují v následujícím pořadí: maleinanhydrid; anhydrid kyseliny exo-cis-3,6-endoxo-Δ4tetrahydroftalové; 3,4,5,6-tetrahydroftalanhydrid, cisakonitový anhydrid a 2,3-dimethylmaleinanhydrid (viz Palacian a spol-., supra) . Optimální aktivační inkubační podmínky pro enzymy modifikované jednotlivým činidlem jsou stanoveny empiricky jak je popsáno v příkladech.
US patent č. 5262525 popisuje metody pro chemickou modifikaci proteinů, které používají sloučeniny, které jsou anhydridy dikarboxylových kyselin připravené Diels-Alderovou reakcí maleinanhydridu a dienu. Sloučeniny popsané v tomto patentu, které mají zde specifikovanou stabilitu mohou být vhodné v předloženém vynálezu.
Metody podle předloženého vynálezu nejsou omezney na uváděné příklady modifikátorových sloučenin nebo modifikací proteinu chemickou modifikací lysinových zbytku. Jakákoliv ze sloučenin popsaných v literatuře, která reaguje s proteiny za vzniku reverzibilní ztráty veškeré nebo téměř veškeré enzymové aktivity, kde modifikace je reverzibilní při inkubaci při zvýšené teplotě v amplifikačním reakčním pufru, je vhodná pro přípravu reverzibilně inaktivovaného enzymu.
Jak se stávají dostupnými nové sloučeniny, které reverzibilně modifikují protein, budou tyto také vhodné pro použití v předloženém vynálezu. Sloučeniny pro přípravu modifikovaných termostabilních enzymů podle předloženého vynálezu zahrnují sloučeniny, které zabezpečují následující vlastnosti:
(1) reakce s termostabilním enzymem, který katalyzuje primerové prodloužení vede k významné inaktivaci enzymu;
(2) inkubace výsledného modifikovaného enzymu ve vodném pufru při pH kolem 8-9 při teplotě při nebo pod teplotou místnosti (25 °C) nevede k žádnému významnému zvýšení enzymové aktivity za méně než asi 20 minut; a (3) inkubace výsledného modifikovaného termostabilního enzymu v amplifikačním pufru, upraveném na pH asi 8-9 při teplotě místnosti, při zvýšené teplotě větší než asi 50 °C vede k alespoň dvojnásobnému zvýšení enzymové aktivity za méně než asi 20 minut.
Vhodnost určité modifikátorové sloučeniny může být empiricky rutinně stanovena podle zde uvedeného návodu.
Eperimentální postupy pro měření výše uvedených vlastností, stupeň zeslabení enzymové aktivity vzniklá z modifikace proteinu a stupeň obnovení enzymové aktivity po inkubaci při zvýšených teplotách, jsou popsány v příkladech.
Příprava reverzibilně inaktivovaných termostabilních enzymu
Chemická modifikace lysinových zbytků v proteinech je založena na schopnosti ε-aminoskupiny tohoto zbytku reagovat jako nukleofil. Neprotonovaná aminoskupina je reaktivní forma, která je výhodná při alkalickém pH. Modifikační reakce se provádí při pH 8,0 až 9,0 ve vodném pufru při teplotě při nebo teplotě pod teplotou místnosti (25 °C. Reakce je v podstatě kompletní po 12 až 24 hodinách inkubace. Vhodné reakční podmínky jsou v oboru známé a jsou popsány dále v příkladech.
Anhydridy dikarboxylových kyselin reagují snadněji s vodou za vzniku odpovídajících kyselin. Proto velká část činidla je hydrolyzována během modifikace proteinových aminoskupin. Rychlost hydrolýzy stoupá s pH. Zvýšení hydrolýzy, které se objevuje při pH větším než asi 9 může být výsledkem suboptimální acylace proteinu.
Obecně se v acylační reakci použije molární přebytek modifikátorového činidla vzhledem k proteinu. Optimální molární poměr modifikátorového činidla k enzymu závisí na použitém činidle a stanoví se empiricky. Například TaqDNA polymerasa je v podstatě kompletně inaktivována (< 5 % původní aktivity) reakcí se 20-násobkem nebo i vyššího molárního přebytku anhydridu kyseliny citrakonové. Minimální molární poměr modifikátoru, který vede v podstatě ke kompletní inatktivaci enzymu může být stanoven provedením inaktivačních reakcí s postupnými ředěními modifikátorového činidla jak je popsáno v příkladech.
V metodách podle předloženého vynálezu není nezbytné, aby byl enzym plně inaktivován, pouze enzym musí být významně inaktivován. Enzym je významně inaktivován, jestliže aktivita enzymu po reakci s modifikátorem je menší než asi 50 % původní aktivity. Redukce v nespecifické amplifikaci může být dosažena za použití významně inaktivovaného enzymu. Molární poměr modifikátoru k enzymu v reakci může být empiricky zvolen tak, že povede bud k úplné inaktivaci nebo významné inaktivaci enzymu po provedení postupu. Vhodné molární poměry jsou poskytnuty v příkladech. Vhodné reakční podmínky pro inaktivaci enzymů, které nejsou uvedeny příklady, mohou být stanoveny rutinními pokusy podle návodů.
Důležitým aspektem tepelně inaktivovaných enzymů podle předloženého vynálezu je jejich skladovací stabilita. Obecně jsou zde popsané sloučeniny stabilní po prodloužená časová období, což odstraňuje nutnost přípravy bezprostředně před použitím. Například citrakonylátovaná Taq DNA polymerasa byla zjištěna jako zůstávající neaktivovaná alespoň po čtyři týdny, je-li uchovávána při 25 °C. Doporučované podmínky skladování se mění v závislosti na použitém modifikátoru, ale obecně by měl být přípravek inaktivovaného enzymu uchováván při nebo pod teplotou místnosti (25 °C), výhodně v chladničce. Zejména by měly být uchovávány nestabilnější modifikované enzymy, jako jsou ty, které byly modifikovány
2,3-dimethyImaleinanhydr idem.
Způsoby podle předloženého vynálezu zahrnují reakci směsi, obsahující reversibilně inaktivovaný termostabilní enzym a podrobení reakční směsi vysokoteplotní inkubací před nebo jako integrální část amplifikační reakce. Vysokoteplotní inkubace vede k deacylaci aminoskupin a obnovení enzymové aktivity.
Deacylace modifikovaných aminoskupin vzniká jak ze zvýšení teploty tak z průvodního snížení pH. Amplifikační reakce jsou typicky prováděny v Tris-HCl pufru upraveném na pH 8,0 až 9,0 při teplotě místnosti. Při teplotě místnosti upřednostňují alkalické podmínky reakčního pufru acylovanou formu aminoskupiny. Ačkoliv je pH reakčního pufru upraveno na pH 8,0 až 9,0 při teplotě místnosti, snižuje se pH Tris-HCl reakčního pufru se zvyšující se teplotou. pH reakčního pufru se snižuje při zvýšených teplotách, při kterých se provádí amplifikace a, zejména, při kterých se provádí aktivační inkubace. Snížení pH reakčního pufru napomáhá deacylaci aminoskupin.
Změna v pH, ke které dochází za vysoko teplotních reakčních podmínek, závisí na použitém pufru. Teplotní závislost na pH pro různé pufry používané v biologických reakcích je uvedena v práci Gooda a spol., 1966, Biochemistry 5 (2).-467 -477. Pro Tris-pufry změna pKa, tj . pH při středu pufrovacího rozmezí, se týká teploty následovně: ApKa/°C= 0,031. Například Tris-HCl pufr sestavený při 25 °C prochází poklesem v pKa na 2,17, jestliže se zahřeje na 95 °C pro aktivační inkubaci.
Ačkoliv se amplifikační reakce typicky provádějí v TrisHCl pufru, mohou být amplifikační reakce provedeny v pofrech, které vykazují menší nebo větší změnu pH s teplotou. V závislosti na použitém pufru může být žádoucí více nebo méně stabilně modifikovaný enzym. Například použití modifikačního činidla, které vede k méně stabilně modifikovanému enzymu umožňuje obnovení dostatečné enzymové aktivity za menších změn pufrového pH. Empirické porovnání relativních stabilit enzymů modifikovaných různými činidly, jak jsou uvedena výše, naznačuje výběr modifikovaného enzymu vhodného pro použití v konkrétních pufrech.
V metodách podle předloženého vynálezu je dosaženo aktivace modifikovaného enzymu inkubací provedenou při teplotě, která je rovna nebo je vyšší než teplota primerové hybridizace (teplotní hybridizace) použitá v amplifikační reakci pro zajištění amplifikační specifičnosti. Délka inkubace vyžadovaná pro obnovení enzymové aktivity závisí na teplotě a pH reakční směsi a na stabilitě acylovaných aminoskupin enzymu, která závisí na modifikátorových činidlech použitých při přípravě modifikovaného enzymu. Je možno použít široké rozmezí inkubačních podmínek; optimální podmínky se stanoví empiricky pro každou reakci. Obecně se inkubace provádí v amplifikačním reakčním pufru při teplotě větší než asi 50 °C po dobu mezi asi 10 sekundami a asi 20 minutami. Optimalizace inkubačních podmínek pro reaktivaci enzymů není uvedena v příkladech ani nejsou uvedeny příklady reakční směsi, ale je možno tyto stanovit rutinními pokusy podle zde uvedených návodů.
V preferovaném provedení se PCR amplifikace provádí za použití reverzně inaktivované termostabilní DNA polymerasy. Teplota tepelné hybridizace použitá v PCR amplifikaci je typicky asi 55 až 75 °C a předreakční inkubace se provádí při teplotě rovné nebo vyšší než je teplota teplotní hybridizace, výhodně při teplotě vyšší než asi 90 °C. Amplifikační reakční směs se výhodně inkubuje při asi 90 až 100 °C po asi 12 minut pro reaktivaci DNA polymerasy před teplotní cyklizací. Vhodné před reakční inkubační podmínky pro typické PCR amplifikace jsou popsány v příkladech spolu s vlivem měnících se před reakčních inkubačních podmínek na amplifikaci.
První stupeň v typické PCR amplifikaci zahrnuje tepelnou denaturaci dvouřetězcové cílové nukleové kyseliny. Přesné podmínky vyžadované pro denaturaci vzorku nukleové kyseliny závisí na dálce a složení vzorku nukleové kysliny. Typicky je inkubace při 90 až 100 °C po asi 10 sekund až asi 4 minuty účinná pro úplnou denaturaci vzorku nukleové kyseliny.
Počáteční denaturační stupeň může sloužit jako před reakční inkubace k reaktivaci DNA polymerasy. Nicméně v závislosti na dílce a teplotě počárečního denaturačního stupně a modifikátoru použitém pro inaktivaci DNA polymerasy, obnovení DNA polymerasové aktivity může být kompletní. Je-li požadováno maximální obnovení enzymové aktivity může být před reakční inkubace prodloužena nebo alternativně může být zvýšen počet amplifikačních cyklů.
V preferovaném provedení vynálezu jsou modifikovaný enzym a počáteční denaturační podmínky zvoleny tak, že pouze frakce obnovitelné enzymové aktivity je obnovena během počátečního inkubačního stupně. Následné cykly PCR, který každý zahrnuje vysokoteplotní denaturační stupeň, vedou k dalšímu obnovení enzymové aktivity. Aktivace enzymové aktivity je tak opožděna proti počátečnímu cyklování amplifikace. Toto časové uvolňování DNA polymerasové aktivity bylo pozorováno k dalšímu snížení nespecifické amplifikace. Je známo, že přebytek DNA polymerasy se podílí na nespecifické amplifikaci. V předložených metodách je přítomné množství DNA polymerasové aktivity nízké během počátečních stupňů amplifikace, je-li počet cílových sekvencí nízký, což redukuje množství vytvořených nespecifických prodloužených produktů. Maximální DNA polymerasové aktivita je přítomna během posledních stupňů amplifikace, kdy je počet cílových sekvencí vysoký a kdy jsou možné vysoké amplifikační výtěžky. Je-li to nezbytné může být počet amplifikačních cyklů zvýšen pro kompenzaci nižšího množství DNA polymerasové aktivity přítomné v počátečních cyklech. Vliv měnících se počtů amplifikačních cyklů na amplifikaci je uveden v příkladech.
Výhoda metod podle předloženého vynálezu je v tom, že metody nevyžadují žádnou manipulaci reakční směsi po počáteční přípravě reakční směsi. Metody jsou ideální pro použití v automatizovaných amplifikačních systémech a v in šitu amplifikačních metodách, kde přídavek činidel po počátečním denaturačním stupni nebo použití voskových barier je nevýhodné nebo nepraktické.
Metody podle předloženého vynálezu jsou zvláště vhodné pro redukci nespecifické amplifikace v PCR. Nicméně vynález není omezen na jakýkoliv určitý amplifikační systém. Reverzibilně inaktivované enzymy podle předloženého vynálezu mohou být použity v jakémkoliv amplifikačním systému na bázi primerů, který používá termostabilní enzymy a zmírňuje reakční teplotu pro dosažení amplifikační specifičnosti. Předložené metody mohou být aplikovány na isotermální amplifikační systémy, které používají termostabilní enzymy. Pouze přechodná inkubace při zvýšené teplotě je vyžadována pro obnovení enzymové aktivity. Po té, co se reakční směs podrobí vysokoteplotní inkubaci za účelem obnovení enzymové aktivity, provádí se reakce při vhodné reakční teplotě.
Jiné amplifikační metody navíc k PCR (US patenty č. 4683195; 4683202 a 4965188) zahrnují, ale nejsou tak omezeny, následující: Ligase Chain Reaction (LCR, Wu a Wallace, 1989, Genomics 4:560-569 a Barany, 1991, Proč. Nati.Acad.Sci. USA 88:189-193); Polymerase Ligase Chain Reaction (Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1:5-16); Gap-LCR (PCT patentová publikace č. WO 90/01069); Repair Chain Reaction (evropská patentová přihláška č. 439182 A2), 3SR (Kwoh a spol. 1989, Proč.Nati.Acad.SCI. USA 86:1173-1177; Guatelli a spol. 1990, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 87:1874-1878; PCT patentová publikace WO 92/08800) a NASBA (US patent č. 5130238) . Tento vynález není omezen na jakýkoliv určitý amplifikační systém. Pokud jsou vyvíjeny jiné systémy, mohou tyto systémy být přínosem pro provedení tohoto vynálezu. Poslední přehled amplifikačních systémů byl publikován v práci Abramsona a Myerse, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47.
Ukázky metod přípravy vhodných pro každou amplifikační reakci jsou popsány v oboru (viz například Sambrook a spol., supra a odkazy popisující amplifikační metody citované výše). Jednoduché a rychlé metody přípravy vzorků pro PCR amplifikace cílových sekvencí jsou popsány v Higuchi, 1989, v PCR Technology (Erlich ed., Stockton Press, New York) a v PCR Protocols, kapitoly 18-20 (Innis a spol., vyd. Academie Press, 1990). Odborník v oboru bude schopen vybrat a empiricky optimalizovat vhodný protokol.
Metody pro detekci amplifikovaných produktů byly popsány v literatuře. Standardní metody zahrnují analýzu gelovou elektroforézou nebo hybridizací oligonukleotidovými sondami. Detekce hybridů vytvořených mezi sondami a amplifikovanými nukleovými kyselinami může být provedena mnoha formami, zahrnujícími dot-blot esejový formát a reverzní dor-blot esejový formát, (viz Saiki a spol., 1986, Nátuře 324:163-166; Saiki a spol. 1989, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 86:6230; PCT patentová publikace č. WO 89/11548; US patenty č. 5008182 a 5176775; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (vyd.Innis a spol., Academie Press, San Diego, CA): 337-347. Reverzní dot-blot metody využívající mikrojamkových destiček jsou popsány v související US Seriál No. 141355 (odpovídá EPA 420260); US patent č. 5232829; Loeffelholz a spol., 1992,
J. Clin.Microbiol. 30(ll):2847-2851; Mulder a spol., 1994, J.Clin.Microbiol. 32 (2) :292 - 300; a Jackson a spol., 1991,
AIDS 5:1463-1467.
Další vhodná esejová metoda, označovaná jako 5'nukleasová esej, je popsána v US patentu č. 5210015 a práci
Hollanda a spol.,1991, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 88:7276-7280.
V 5'-nukleasové eseji jsou značené sondy degradovány současně s příměrovým prodloužením při 5' ke 3' exonukleasové aktivitě DNA plymerasy, např. Taq DNA polymerasy. Detekce produktu rozpadu sondy indikuje jak objevení se hybridizace mezi sondou a cílovou DNA tak výskyt amplifikační reakce. US patent č. 5491063 (odpovídá EP-A 699763) a EP-A 713921 popisuje zlepšené metody pro detekci degradace sondy, která se vyskytuje současně s amplifikací.
Alternativní metoda pro detekci amplifikace nukleové kyseliny moitorováním zvýšení celkového množství dvoušroubovicové DNA v reakční směsi je popsána v práci, jejímž autorem je Higuchi a spol., 1992, Bio/Technology 10:413-417' Higuchi a spol, 1993, Bio/Technology 11:10261030' a evropské patentové přihlášce č. 487218 a 512334. Detekce dvoušroubovicové cílové DNA je založena na zvýšené fluorescenci, kterou ethidiniumbromid (EtBr) a jiné DNA vazebné značky vykazují, jsou-li navázány na dvoušroubovicovou DNA. Zvýšení dvoušroubovicové DNA vzniklé ze syntézy cílových sekvencí vede k detegovatelnému zvýšení fluorescence. Problémem této metody je, že syntéza necílové sekvence, tj. nespecifická amplifikace, vede ke zvýšení fluorescence, které interferuje s měřením zvýšení fluorescence vzniklé ze syntézy cílových sekvencí. Metody podle předloženého vynálezu jsou proto zvláště vhodné, že snižují nespecifickou amplifikaci a tím minimalizují zvýšení fluorescence vzniklé z amplifikace necílových sekvencí.
Předložený vynález se také týká kitů, multikontejnerových jednotek, obsahujících vhodné složky pro uskutečnění předložené metody. Vhodný kit obsahuje reverzibilně inaktivovaný termostabilní enzym a jedno nebo více činidel pro provedení aplifikační reakce jako jsou oligonukleotidové primery, substrátové nukleosidové trifosfáty, kofaktory a vhodný pufr.
Příklady předloženého vynálezu uvedené dále jsou poskytnuty pouze pro ilustrativní účely a neomezují rozsah vynálezu. Různá provedení vynálezu v rozsahu nároků, které následují za příklady, budou zřejmá odborníkům v oboru po studiu předcházejícího textu a následujících příkladů.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Esej polymerasové aktivity
Všechna měření DNA polymerasové aktivity popsaná v příkladech dále byla provedena za použití následující eseje DNA polymerasové aktivity. Tato esej je v podstatě popsána v práci Lawyera a spol., 1989, J.Biol.Chem. 264:6427-6437 a v AmpliTaqR DNA polymerase product insert (Perkin Elmer, Norwalk, CT), obě práce jsou zde uvedeny jako odkazy.
Jedna jednotka enzymové aktivity je definována jako množství, které inkorporuje 10 nmol dTNP do kyselinového nerozpustného materiálu za 30 minut v 10 min inkubci při 74 °C. Pro labilitu modifikovaných enzymů byly aktivity měřeny při 50 °C a normalizovány na standardní Taq DNA polymerasový roztok, který byl také zkoušen při 74 °C. Reakce byly provedeny v 50 μΐ objemu, obsahujícím následující činidla:
mM TAPS (tris-hydroxymethyl) -methyl-amino-propansulfonová kyselina, sodná sůl), pH 9,3 (při teplotě místnosti);
mM KCl;
mM MgCl2;
mM β-merkaptoethanol;
0 /iM každého z dATP, dGTP a dTTP;
100 /iM [ot-32P]-dCTP (0,05-0,1 Ci/mmol) ;
DNA aktivovaného lososího sperma.
Příklad 2
Tento příklad popisuje modifikaci Taq DNA polymerasy za použití anhydridu kyseliny citrakonové. Měření aktivity citrakonylatované Taq DNA polymerasy, která indikují molární poměr modifikátoru k enzymu v inaktivační reakci vyžadovaný pro dosažení kompletní inaktivace DNA polymerasová aktivity jsou popsány v příkladu 3 dále.
Taq DNA polymerasa (AmpliTaqR, Perkin Elmer, Norwalk CT) byla použita v počáteční koncentraci 1,3 mg/ml. V počátečním pokusu byla Taq DNA polymerasa nejprve dialyzována proti 1000-násobnému přebytku v objemu 0,1 boritanu sodného při pH 8,63. Tento stupeň byl shledán jako nepodstatný a v dalších pokusech byla TaqDNA polymerasa použita v Tris pufru (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 65 mM KCl, pH 7,5) přímo bez dialýzy proti boritanu sodnému.
Anhydrid kyseliny citrakonové (11,06 M) je obchodně dostupný (Aldrich, Milwaukee, WI). Výchozí roztok anhydridu kyseliny citrakonové se vytvoří ředěním ll,06M anhydridu kyseliny citrakonové 100-násobně v DMA (N,Ndimethylformamid).
Pro jednu sadu reakcí bylo vytvořeno postupné ředění roztoku anhydridu kyseliny citrakonové opakovaným 2-násobným ředěním v DMF. Pro každý roztok v sérii byly přidány 4 μΐ zředěného roztoku anhydridu kyseliny citrakonové ke 400 μΐ TaqDNA polymerasového roztoku (s dialýzou s boritanem sodným), za vzniku roztoků, obsahujících molární poměry anhydridů kyseliny citrakonové k TaqDNA polymerase přibližně 80/1, 40/1, 20/1 a 10/1. Roztoky byly inkubovány přes noc při 4 °C pro inaktivaci TaqDNA polymerasy. Enzym, který byl modifikován v reakci s N-molárním přebytkem modifikátoru je zde označován jako NX enzym. Výsledné citrakonylatované TaqDNA polymerasy jsou zde označovány jako 80X, 40X, 20X a 10X TaqDNA polymerasy.
Další modifikační reakce byly prováděny za použití 80, 160X a 240x molárních poměrů anhydridů kyseliny citrakonové k TaqDNA polymerase (bez dialýzy proti boritanu sodnému). 160X a 240X poměry byly vytvořeny vhodnou úpravou výchozího ředění 11,OSM anhydridů kyseliny citrakonové v DMF (N,Ndimethylformamid). Například pro konečný 160X poměr se ll,06M anhydrid kyseliny citrakonové zředí 1/50 v DMF, a 4 μΐ výsledného výchozího roztoku anhydridů kyseliny citrakonové se přidají ke 400 μΐ TaqDNA polymerasového roztoku. Výsledné TaqDNA polymerasy jsou označovány zde jako 240X, 160X a 80X TaqDNA polymerasy.
Příklad 3
Inaktivace a tepelné obnovení DNA polymerasové aktivity za použití anhydridů kyseliny citrakonové
Tento příklad popisuje měření citrakonylatovaných TaqDNA polymeras z příkladu 2 jak před tak po reaktivaci citrakonylatované TaqDNA polymerasy tepelnou inkubací. Byl měřen vliv pH na množství aktivity získané po tepelné reakcivaci citrakonylatovaných TaqDNA polymeras.
Vzorky citrakonylatovaných TaqDNA polymeras byly zředěny
1/200 v pufru, obsahujícím 10 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 2 mM
MgCl2, 0,5 % Tweenu 20, 0,5 % NP-40, 16 % glycerinu. pH pufru bylo 8,25 při teplotě místnosti. Zředěné vzorky citrakonylatované TaqDNA polymerasy byly inkubovány při 90 °C po 20 minut nebo udržovány při teplotě místnosti jako kontrola. Po zpracování byly vzorky zředěny 1/5 v enzymovém ředícím pufru ( 25 mM TRis-HCl, 50 mM KCl, 1 mM βmetkaptoethanolu, 0,5 % Tween™20, 0,5 % NP-40, 0,1 % želatiny) a aktivita byla sledována jak je popsáno v příkladu
1. DNA polymerasové aktivity po zpracování jsou uvedeny dále. Molární poměr se týká molárního poměru anhydridu kyseliny citrakonové k TaqDNA polymerase za použití modifikační reakce. Každá z aktivit je průměrem ze dvou aktivit naměřených v duplikátu vzorků.
Aktivita (% kontroly) molární poměr nezahříváno kontrola 100
80X 0
0X 0
20x 3,7
10X 38 °C inkubace
Kompletní inaktivace TaqDNA polymerasy byla získána za apoužití více než 20-násobného molárního přebytku anhydridu kyseliny citrakonové. Po inkubaci plně inaktivované TaqDNA polymerasy při 9 0 °C po 2 0 minut bylo obnoveno minimálně 16 % aktivity.
I když byla obnovena vyšší enzymová aktivita za použití 40X citrakonylatované TaqDNA polymerasy než za použití 80X citrakonylatované TaqDNA polymerasy , je mnohem praktičtější použít 80X )nebo vyšší) citrakonylatovanou TaqDNA polymerasu v komerčním kitu pro umožnění větších výrobních tolerancí.
Podobné pokusy byly provedeny za použití pufru upraveného na pH 7,75 při teplotě místnosti. Výsledky jsou uvedeny dále.
Aktivita (% kontroly) molární poměr nezahříváno °C inkubace kontrola 100
80X 0
40X 0
20X 3,5
10X 35
Množství obnovené DNA polymerasové aktivity bylo větší při nižším pH.
Aktivity 80X a 160X TaqDNA polymerasy (bez dialýzy boritanem sodným) byly měřeny před a po reaktivaci tepelnou inkubací v podstatě jak popsáno výše. pH pufru použitého pro inkubace bylo 8,0 při teplotě místnosti. Výsledky jsou uvedeny dále. Každá z aktivit je průměr ze dvou aktivit naměřených z duplikátních vzorků.
Aktivita (% kontroly) molární poměr nezahříváno °C inkubace kontrola 100
0X 0
80X 0
Vliv pH na reaktivaci je možno zjistit ze srovnání aktivity obnovené za použití 80X TaqDNA polymeras ze tří reaktivací při různém pH. Výše uvedené údaje naznačují, že se enzymová aktivita obnoví i při vysokém molárním přebytku modifikátoiu použitého v modifikační reakci.
Příklad 4
PCR amplifikace za použití citrakonylatovaných TaqDNA polymerasy
Tento příklad popisuje použití citrakonylatované Taq termostabilní DNA polymerasy popsané v příkladu 2 v PCR amplifikaci.
PCR protokol
Amplifikace byly prováděny za použití 1/20, 1/40 a 1/80 ředění 240X modifikované TaqDNA polymerasy popsané v příkladu 2. Ředění byla prováděna v pufru složeném ze 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 (při teplotě místnosti), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová), 1 mM DTT (dithiothteitol), 50 % glycerinu, 0,5 % Tweenu 20, 0,5 % Nonidetu P40 (AmpliTaqR uchovávací pufr, Perkin Elmer, Norwalk, CT). Pro porovnání byly amplifikace také provedeny za použití 1/10, 1/20, 1/40 a 1/80 ředění nemodifikované TaqDNA polymerasy.
Klonovaná HTLV-I genomická sekvence byla amplifikována za použití primerů SK432 a SK111. Primerové sekvence jsou uvedeny v US patentu č. 5418149, zahrnutém zde jako odkaz.
PCR byla provedena ve 100 μΐ reakčním objemu za následujících reakčních podmínek.
Reakční směs:
kopií HTLV-IDNA templátu mM Tris, pH 8,3 mM KCl
0,5 μΜ každého primerů 200 fžM dATP, dCTP a dGTP 4 00 μΜ. dUTP
0,5 /il roztoku citrakonylatované TaqDNA polymerasy
2,5 mM MgCl2 1 ng hpDNA jednotka UNG (Perkin Elmer, Norwalk, CT)
Profil tepelného cyklování:
Před reakční podmínky: (90 °C za 10 minut) cykly denaturace 9 8 °C 1 minuta teplotní hybridizace/ prodloužení 60 °C 2 minuty cyklů denaturace 94 °C 1 minuta teplotní hybridizace/ prodloužení 60 °C 1 minuta konečná inkubace 60 °C 7 minut
Amplifikované produkty byly analyzovány pomocí elektrofořezy na 4% agarosovém gelu za použití Ix TBE (0,089 M Tris, 0,089 M kyseliny borité, 0,0025 M dvojsodného EDTA) vyvíjecího pufru. Elektroforeza byla provedena při 100 voltech po přibližně 2 hodiny. Ethidium bromid (0,5 μΙ/ml) byl přidán po elektroforéze pro vybarvení jakékoliv přítomné DNA. Gel byl odbarven v IX TBE a pruhy DNA vybarvené ethidiumbromidem byly vizualizovány použití UV ozařování.
Výsledky
Výsledky jsou uvedeny na obr. 2. Pruh, odpovídající amplifikované cílové sekvenci je označen. Pruky, objevující se na gelu jiné než pruh, který odpovídá amplifikované cílové sekvenci odpovídají produktům vzniklým nespecifickou amplifikaci necílových sekvencí. Vliv použití citrakonylatované TaqDNA polymerasy (značená Taq, HS) na amlifikaci je možno zjistit z porovnání tvaru pruhu a intenzity v každé z drah. Protože amplifikace nespecifických produktů soutěží s amplifikaci cílové sekvence, zvýšení amplifikace cílové sekvence dále indikuje velikost redukce nespecifické amplifikace. Proto změna v relativním množství produktů v každé dráze bej lépe indikuje vliv před reakčních zpracování na nespecifickou amplifikaci.
Amplifikace za použití nemodifikované TaqDNA polymerasy vedou k převážně nespecifickým amplifikačním produktů.
Použití citrakonylatované TaqDNA polymerasy vede k významnému zvýšení intenzity pruhu, odpovídajícího amplifikované cílové sekvenci a významnému snížení v intenzitě pruhů odpovídajících nespecifickým amplifikačním produktům. Údaje znamenají, že PCR amplifikace za použití reverzibilně inaktivované DNA polymerasy významně redukuje nespecifickou amplifikaci a významně zvyšuje množství ,, požadované amplifikované cílové sekvence.
Příklad 5
Jiné citrakonylatované termostabilní DNA polymerasy
Tento příklad popisuje citrakonylaci několija jiných termostabilních DNA polymeras navíc k TaqDNA polymerase popsané výše. Byly modifikovány následující termostabilní DNA polymerasy:
1) termostabilní DNA polymerasa z Thermus thermophilus (rTth, Perkin Elmer, Norwalk, CT) jak je popsána ve WO 91/09950, zahrnutém zde jako odkaz.
2) mutant termostabilní DNA polymerasy z Thermatoga maritima (UITma™, Perkin Elmer, Norwalk, CT) jak je popsána ve WO 92/03556, zahrnutém zde jako odkaz.
3) mutantní forma termostabilní DNA polymerasy z Thermus aquaticus, který postrádá 3' k 5' exonukleasovou aktivitu, jak je popsána ve WO 92/06200, zahrnutém zde jako odkaz. Tento enzym je zde označován jako Taq CS nebo AmpliTaqRCS.
Pro každou z výše uvedených tří DNA polymeras byl připraven počáteční roztok o přibližné koncentraci 200 200 jednotek//íl. Pro srovnání 1,3 mg/ml TaqDNA polymerasy , jak je použita v předchozích příkladech, je přibližně ekvivalentní 260 jednctkám/μΐ. Každá z DNA polymeras byla modifikována v podstatě jak je popsáno v příkladu 2 výše. Deset fil anhydridu kyseliny citrakonové bylo zředěno v 500 μ£ DMF. Potom bylo 10 μΐ zředěného anhydridu kyseliny citrakaonové kombinováno s 1000 μΐ každého z enzy,ových roztoků. Výsledné roztoky byly inkubovány přes noc při 4 °C.
Příklad 6
PCR amplifikace za použití citrakonylatovaných DNA polymeras
Tento příklad popisuje použití citrakonylatovaných termostabilních DNA polymeras popsané v příkladech 2 a 5 v PCR amplifikacích.
PCR protokol
Amplifikace byly prováděny za použití ředění DNA polymeras. Ředění byla prováděna v pufru složeném ze 20 mM
Tris-HCl, pH 8,0 (při teplotě místnosti), 100 mM KCl, 0,1 mM
EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová), 1 mM DTT (dithiothteitol), 50 % glycerinu, 0,5 % Tweenu 20, 0,5 % Nonidetu P40 (AmpliTaqR uchovávací pufr, Perkin Elmer, Norwalk, CT).
HIV-1 genomická sekvence byla amplifikována za použití primeru SK145 a SK431 (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Primery SK 145 a SK 431 jsou popsány v US patentu č. 5431149 a v následujících vědeckých publikacích: SK 145 je popsán v práci Kwoka a spol., 1990, Nucleic Acids Res. 13:999-1005; SK 431 je popsán v práci Jacksona a spol., 1991, AIDS 5:1463-1467. PCR byla provedena ve 100 /il reakčním objemu za následujících reakčních podmínek.
Reakční směs:
kopií HTLV-IDNA templátu mM Tris, pH 8,3 mM KCl
0,5 /iM každého primeru
200 /iM dATP, dCTP a dGTP
400 /iM dUTP
0,5 /il roztoku DNA polymerasového roztoku
2,5 mM MgCl2 ng hpDNA jednotka UNG (Perkin Elmer, Norwalk, CT)
Profil tepelného cyklování:
Před reakční podmínky: (95 °C za 12 minut) cyklů denaturace 94 °C 1 minuta teplotní hybridizace/ prodloužení konečná inkubace °C 1 minutu 60 °C 7 minut
Před reakční stupeň slouží také jako počáteční denaturační stupeň. Počáteční denaturační stupeň se rutinně používá v typická amplifikační reakci pro zajištění kompletní denaturace dvoušroubovicového cíle. Každý cyklus PCR začíná denaturačním stupněm při 94 °C po 1 minutu. Potom bezprostředně následuje před reakční inkubace prováděná při 95 °C po 12 minut, reakční směs se inkubuje při 94 °C 1 minutu během denaturačního stupně prvního cyklu.
Amplifikované produkty byly analyzovány pomocí elektroforezy na agarosovém gelu (100 ml 3% NuSieve^ a 0?5% SeaChemR) za použití lx TBE (0,089 M Tris, 0,089 M kyseliny borité, 0,0025 M dvojsodněho EDTA) vyvíjecího pufru. Elektroforeza byla provedena při 100 voltech po přibližně 2 hodiny. Ethidium bromid (0,5 μΐ/ml) byl přidán po elektroforéze pro vybarvení jakékoliv přítomné DNA. Gel byl odbarven v IX TBE a pruhy DNA vybarvené ethidiumbromidera byly vizualizovány použití UV ozařování.
Amplifikace za použití citrakonylátovaných DNA polymeras
Ředění (1/10, 1/20, 1/40 a 1/80) citrakonylatovanýcn DNA polymeras popsaná v příkladu 5 a 240X citrakonylatované TaqDNA polymerasy popsané v příkladu 1 byla použita pro amplifikace HIV-1 nukleové kyseliny a amplifikované produkty byly analyzovány elektroforezou na agarosovém gelu. Pro srovnání byly amplifikace provedeny za použití ředěněí nepodifikované TaqDNA polymerasy.
Výsledky jsou uvedeny na obr. 3. Pruh, odpovídající amplifikované cílové sekvenci je označen. Pruhy, objevující se na gelu jiné než pruh, který odpovídá amplifikované cílové sekvenci, odpovídají produktům vzniklým nespecifickou amplifikací necílových sekvencí. Vliv použití citrakonylátované DNA polymerasy na amlifikaci je možno zjistit z porovnání tvaru pruhů a intenzity v každé z drah.
Protože amplifikace nespecifických produktů soutěží s amplifikaci cílové sekvence, zvýšení amplifikace cílové sekvence dále indikuje velikost redukce nespecifické amplifikace. Proto změna v relativním množství produktů v každé dráze bej lépe indikuje vliv před reakčních zpracování na nespecifickou amplifikaci.
Amplifikace za použití nemodifikované TaqDNA polymerasy vedou k převážně nespecifickým amplifikačním produktů. Použití citrakonylatované TaqDNA polymerasy vede k významnému zvýšení intenzity pruhu, odpovídajícího amplifikované cílové sekvenci u téměř 1/30 ředění a významnému snížení v intenzitě pruhů odpovídajících nespecifickým amplifikačním produktům. Údaje znamenají, že PCR amplifikace za použití reverzibilně inaktivované DNA polymerasy významně redukuje nespecifickou amplifikaci a významně zvyšuje množství požadované amplifikované cílqvé sekvence.
Použití citrakonylátovaných UITma, Taq CS a rTth DNA polymeras také vede k větší produkci specifického amplifikačního produktu, než tomu je v amplifikacích za použití nemodifikované TaqDNA polymerasy, spolu se současnou redukcí množství nespecifického amplifikačního produktu. Výsledky demonstrují, že metody podle předloženého vynálezu jsou aplikovatelné na termostabilní DNA polymerasy obecně.
Je třeba uvést, že ačkoliv výsledky demonstrují funkčnost předloženého vynálezu, výsledky získané s citrakonylátovanými Taq, UITma, Taq CS a rTth DNA polymerasami nejsou přímo srovnatelné, protože modifikační podmínky byly nesrovnatelně optimalizovány pro každou DNA polymerasu. Ačkoliv každý počáteční roztok DNA polymerasy obsahuje stejně jednotek/ml, molarita roztoku nebyla stanovena a proto nebyl stanoven molární přebytek anhydridu kyseliny citrakonové v každé modifikační reakci. Odborník v oboru bude schopen zjistit empiricky optimální modifikační podmínky za použití zde popsaných protokolů.
Příklad 7
Cis-Akonitylovaná DNA polymerasa
Tento příklad popisuje použití modifikace TaqDNA polymerasy za použití anhydridu kyseliny cis-akonitové.
Byly provedeny modifikace za použití anhydridu kyseliny cis-akotinové jak je popsáno v příkladu 2 s tím hlavním rozdílem, že anhydrid kyseliny cis-akonitové je dostupný jako prášek a ne jako kapalina. TaqDNA polymerasa (AmpliTaqR, Perkin Elmer, Norwalk CT) v Tris pufru (50 Mm Tris-HCl, 1 mM EDTA, 68 mM HCl, pH 7,5) byl použit za výchozí koncentrace
1,3 mg/ml. Výchozí roztok anhydridu kyseliny cis-akonitové (Aldrich, Milwaukee, WI) byl vytvořen rozpuštěním anhydridu kyseliny cis-akonitové v 1 ml 100% EtOH.
K roztoku 1000 fil TaqDNA polymerasy bylo přidáno bud 10 nebo 20 fil roztoku anhydridu kyseliny cis-akonitové a získány tak roztoky, obsahující molární poměry anhydridu kyseliny cis-akonitové k TaqDNA polymerase přibližně 90/1 a 180/1. Roztoky byly inkubovány přes noc při 4 °C pro inaktivaci TaqDNA polymerasy.
Porovnání amplifikací za použití cis-akonitylatované
TaqDNA polymerasy a amplifikací za použití citrakonylátované
TaqDNA polymerasy jsou popsána dále.
Příklad 8
Inaktivace a tepelná obnova DNA polymerasové aktivity za použití anhydridu kyseliny cis-akonitové
Aktivity 90X a 180X cis-akonitylovaných TaqDNA polymeras připravených v příkladu 7 byly měřeny před a po reaktivaci tepelnou inkubací v podstatě jak je popsáno v příkladu 3 výše. pH pufru během inkubací bylo 8,0. Výsledky jsou uvedeny dále. Každá z aktivit je průměr ze dvou aktivit naměřených v duplikátních vzorcích.
Aktivita (% kontroly) molární poměr kontrola 180X 9 0X nezahříváno
100 °C inkubace
113
Porovnání výsledků s výsledky z příkladu 3 znamená, že cis-akonitylace je snadněji reverzní než citrakonylace. Vyšší molární přebytek anhydridu kyseliny cis-akonitové je nezbytný ke kompletní inaktivaci DNA polymerasy a je obnovena větší aktivita po vysokotepelné inkubaci. Důvod pro naměření aktivity větší než 100 % po modifikaci 90-násobným molárním přebytkem anhydridu kyseliny cis-akonitové s následnou tepelnou reaktivací je neznámý, ale může být přičten nepřesnosti v aktivitní eseji nebo může odrážet aktuální modifikaci DNA polymerasy.
Příklad 9
Vliv předreakční inkubační doby
Tento příklad popisuje vliv předreakční inkubační doby na množství získaného produktu.
Amplifikace byly provedeny za použití citrakonylátovaných a cis-akonitylovaných TaqDNA polymeras připravených jak popsáno výše. Pro každou sadu byly použity amplifikační podmíky, TaqDNA polymerasy modifikované použitím 80-násobného a 160-násobného molárního přebytku anhydridu kyseliny citrakonové a 90-násobného a 180-násobného molárního přebytku anhydridu kyseliny cis-akonitové. Amplifikace byly provedeny za použití HIV-1 modelového systému popsaného v příkladu 6 výše s tím rozdílem, že počáteční předreakční podmínky byly měněny. Pro každý enzymový přípravek byly prováděny amplifikace za použití předreakčních inkubací 12, 6, 3 a 0 minut.
Jak je uvedeno výše, slouží také předreakční inkubační stupeň jako počáteční denaturační stupeň. Každý cyklus PCR začíná denaturačním stupněm. Bezprostředně po počáteční předreakční inkubaci provedené při 95 °C po 12, 6,3 nebo Ominut, se každá reakční směs inkubuje při 94 °C po 1 minutu během denaturačního stupně prvního cyklu. Tak i když není použita žádné předreakční inkubace, je enzymová aktivita obnovena během denaturačního stupně počátečního cyklu.
Amplifikační produkty byly analyzovány elektroforézou na agarozovém gelu. Výsledky jsou uvedeny na obr. 4. Pruh, odpovídající amplifikované cílové sekvenci je označen. Pruhy, objevující se na gelu, jiné než pruh, který odpovídá amplifikované cílové sekvenci, odpovídají produktům generovaným nespecifickou amplifikácí necílových sekvencí.
Výsledky ukazují, že použitím cis-akonitylovaných DNA polymeras, všechny předreakční inkubační doby vedou k silnému pruhu, odpovídajícímu amplifikovanému produktu. Amplifikace prováděné bez předreakční inkubace nevedou k takovému množství produktu jako amplifikace za použití prodloužených předreakčních inkubací.
Naopak výsledky ukazují, že při použití citrakonylatované DNA polymerasy, předreakční inkubace alespoň 3 minuty byla vyžadována pro získání maximálního množství amplifikovaného produktu. Amplifikace prováděné bez předreakční inkubace vedly k výzmně menšímu množství amolifikovaného produktu. Výsledky indikují, že aktivita cis-akonytylátovaných DNA polymeras je obnovena mnohem rychleji než u citrakonylatovaných DNA polymeras.
Příklad 10
Vliv počtu cyklů
Tento příklad popisuje vliv zvýšení počtu amplifikačních cyklů na kompenzování krátké předreakční inkubační doby.
Byly provedeny amplifikace za použití TaqDNA polymeras modifikovaných použitím 80-násobného a 160-násobného molárního přebytku anhydridu kyseliny citrakonové a 90násobného a 180-násobného molárního přebytku anhydridu kyseliny cis-akonitové. Amplifikace byly provedeny v podstatě jak je popsáno výše za použití HIV-1 modelového systému popsaného v příkladu 6 s tím rozdílem, že byly měněny počty počátečních předreakčních inkubací a cyklů. Pro každý enzymový přípravek byly provedeny amplifikace za použití následujících podmínek:
předreakční inkubace 12 minut, 80 °C amplifikační cykly
Amplifikační produkty byly analyzovány elektroforézou na agarosovém gelu. Výsledky jsou uvedeny na obr. 5. Výsledky ukazují, že zvýšení počtu amplifikačních cyklů může kompenzovat ztrátu účinnosti vzniklou z nekompletní reaktivace DNA polymerasové aktivity, jestliže nebyla použita předreakční inkubace.
Pro každou DNA polymerasu vede zvýšení počtu amplifikačních cyklů ke zvýšení amplifikovaného produktu. Vliv byl nejmenší při použití cis akonitylátované TaqDNA polymerasy, jak je uvedeno na obr. 9 při potřebě malé, pokud vůbec nějaké, předreakční inkubace.
!
Claims (14)
- PATENTOVÉNÁROKY1. Termostabilní enzym, který je reverzibilně inaktivován chemickou modifikací, vyznačující se t 'í m, že inkubace modifikovaného enzymu ve vodném pufru při alkalickém pH při teplotě, která je menší než asi 25 °C nevede v podstatě ke zvýšení enzymové aktivity za méně než asi 20 minut a že inkubace uvedeného chemicky modifikovaného enzymu ve vodném pufru, upraveném na pH asi 8-9 při 25 °C, při teplotě vyšší než asi 50 °C poskytne alespoň dvojnásobné zvýšení enzymové aktivity za méně než asi 20 minut.
- 2. Chemicky modifikovaný termostabilní enzym podle nároku 1, kde uvedená enzymová aktivita je termostabilní DNA polymerasové aktivita nebo termostabilní ligasová aktivita.
- 3. Chemicky modifikovaný termostabilní enzym podle nároku 1, kde uvedená enzymová aktivita je termostabilní DNA polymerasové aktivita a kde uvedená termostabilní DNA polymerasa je získána ze druhů vybraných ze skupiny rodů, zahrnujících Thermus aquaticus, Thermus thermohilus a Thermotoga maritima.
- 4. Chemicky modifikovaný termostabilní enzym podle kteréhokoliv z nároků l až 3,který je produkován.reakcí směsi termostabilního enzymu s modifikačním činidlem.
- 5. Chemicky modifikovaný termostabilní enzym podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3,který je produkován reakcí směsi termostabilního enzymu s modifikačním činidlem, kde se uvedená reakce provádí v alkalickém pH při teplotě, která je menší než asi 25 °C, kde uvedené Činidlo je anhydrid dikarboxylové kyseliny obecného vzorce kde R]_ a R2 jsou vodík nebo organické radikály, které mohou být spojeny, nebo obecného vzorce kde R]_ a R2 jsou organické radikály, které mohou být spojeny a vodíky jsou cis a kde uvedená reakce vede v podstatě k úplné inaktivaci enzymové aktivity.
- 6. Chemicky modifikovaný termostabilní enzym podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3,který je produkován reakcí směsi termostabilního enzymu s modifikačním činidlem, kde uvedené modifikační činidlo je vybráno ze skupiny, zahrnující maleinanhydridy, anhydrid kyseliny exo-cis-3,6-endoxo-Δ4tetrahydroftalové; anhydrid kyseliny citrakonové, 3,4,5,6tetrahydroftalanhydrid, anhydrid kyseliny cis-akonitové a anhydrid kyseliny 2,3-dimelhylmaleinové.
- 7. Chemicky modifikovaný termostabilní enzym podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, který je produkován reakcí směsi termostabilního enzymu s modifikačním činidlem, kde uvedené modifikační činidlo je ve více než 20-násobném přebytku k uvedenému termostabilnímu enzymu.
- 8. Chemicky modifikovaný termostabilní enzym podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, který je produkován reakcí směsi termostabilního enzymu s modifikačním činidlem, kde uvedeným termostabilním enzymem je termostabilní DNA polymerasa získaná z Thermus aquaticus a kde uvedeným modifikačním činidlem je anhydrid kyseliny citrakonové.
- 9. Chemicky modifikovaný termostabilní enzym podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, který je produkován reakcí směsi termostabilního enzymu s modifikačním činidlem, kde uvedený termostabilní enzym je termostabilní DNA polymerasa získaná z Thermus thermophillus a kde uvedeným modifikačním činidlem je anhydrid kyseliny cis-akonitové.
- 10. Způsob přípravy chemicky modifikovaného termostabilního enzymu, který je reverzibilně inaktivován, vyznačuj íc í se t í m, že uvedený způsob zahrnuje reakci směsi termostabilního enzymu a modifikačním činidlem, kde uvedená reakce se provádí v alkalickém pH při teplotěě, která je menší než asi 25 °C, přičemž uvedeným činidlem je anhydrid dikarboxylové kyseliny obecného vzorce kde a R2 jsou vodík nebo organické radikály, které mohou být spojeny, nebo obecného vzorce kde Ri a R2 jsou organické radikály, které mohou být spojeny a vodíky jsou cis a kde uvedená reakce vede v podstatě k úplné inaktivaci enzymové aktivity.
- 11. Způsob amplifikace cílové nukleové kyseliny ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně (a) kontaktu uvedeného vzorku s amplifikační reakční směsí, obsahující primer komplementární k uvedené cílové nukleové kyselině a chemicky modifikovaný termostabilní enzym podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 a (b) inkubaci výsledné směsi ze stupně (a) při teplotě, která je větší než asi 50 °C po dobu dostačující k reaktivaci uvedeného chemicky modifikovaného termostabilního enzymu a umožnění tvorby produktů primerového prodloužení.
- 12. Amplifikační směs polymerasové řetězové reakce, v y z n a-č ující se tím, že obsahuje pár primerů a chemicky modifikovaný termostabilní enzym podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9.
- 13. Kit pro provedení polymerasové řetězové reakce, obsahující chemicky modifikovaný termostabilní enzym podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9.
- 14. Vynález jak byl zde dříve popsán.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US267395P | 1995-08-25 | 1995-08-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ249596A3 true CZ249596A3 (en) | 1997-06-11 |
| CZ289237B6 CZ289237B6 (cs) | 2001-12-12 |
Family
ID=21701916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19962495A CZ289237B6 (cs) | 1995-08-25 | 1996-08-23 | Chemicky modifikovaný termostabilní enzym, způsob jeho přípravy, způsob amplifikace cílové nukleové kyseliny a amplifikační směs a kit pro polymerázové řetězové reakce |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5773258A (cs) |
| EP (1) | EP0771870B1 (cs) |
| JP (1) | JP3026554B2 (cs) |
| KR (1) | KR100221097B1 (cs) |
| CN (1) | CN1282741C (cs) |
| AT (1) | ATE176499T1 (cs) |
| AU (1) | AU689047B2 (cs) |
| BR (1) | BR9603563A (cs) |
| CA (1) | CA2184105C (cs) |
| CZ (1) | CZ289237B6 (cs) |
| DE (2) | DE69601488T2 (cs) |
| DK (1) | DK0771870T3 (cs) |
| ES (1) | ES2101668T3 (cs) |
| HU (1) | HU221750B1 (cs) |
| IL (1) | IL119088A (cs) |
| MX (1) | MX9603608A (cs) |
| NO (1) | NO323552B1 (cs) |
| PL (1) | PL185711B1 (cs) |
| RU (1) | RU2174556C2 (cs) |
Families Citing this family (272)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6096499A (en) * | 1996-03-22 | 2000-08-01 | Geron Corporation | Mammalian DNA primase screen and activity modulating agents |
| US6399304B1 (en) * | 1996-12-20 | 2002-06-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Sequential activation of one or more enzymatic activities within a thermocycling reaction for synthesizing DNA molecules |
| US6605428B2 (en) * | 1996-12-20 | 2003-08-12 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for the direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules and its application |
| US6828094B2 (en) * | 1996-12-20 | 2004-12-07 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for the uncoupled, direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules with the addition of a second thermostable DNA polymerase and its application |
| US6482590B1 (en) | 1996-12-20 | 2002-11-19 | Aventis Behring Gmbh | Method for polynucleotide amplification |
| US20030215857A1 (en) * | 1996-12-20 | 2003-11-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for the direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules and its application |
| JPH10276776A (ja) * | 1997-04-07 | 1998-10-20 | Toyobo Co Ltd | 可逆的に不活化された耐熱性ｄｎａポリメラーゼ |
| US6183998B1 (en) * | 1998-05-29 | 2001-02-06 | Qiagen Gmbh Max-Volmer-Strasse 4 | Method for reversible modification of thermostable enzymes |
| US6132416A (en) * | 1998-09-01 | 2000-10-17 | Broselow; James B. | Universal medication dosing system |
| US6440706B1 (en) | 1999-08-02 | 2002-08-27 | Johns Hopkins University | Digital amplification |
| GB9920194D0 (en) * | 1999-08-27 | 1999-10-27 | Advanced Biotech Ltd | A heat-stable thermostable DNA polymerase for use in nucleic acid amplification |
| WO2001075139A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-11 | Biolink Partners, Inc. | Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization |
| US7923205B2 (en) * | 2000-08-25 | 2011-04-12 | Toshikazu Shiba | Method for protecting personal information |
| EP1334113A4 (en) * | 2000-10-20 | 2007-08-08 | Expression Diagnostics Inc | EVALUATION OF LEUCOCYTAIRE EXPRESSION LEVEL |
| JP2002199877A (ja) * | 2000-11-30 | 2002-07-16 | Advanced Biotechnologies Ltd | 酵素の可逆的な不活性化およびその酵素を含むキット |
| GB0110501D0 (en) * | 2001-04-30 | 2001-06-20 | Secr Defence Brit | Amplification process |
| US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US6905827B2 (en) * | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
| US7026121B1 (en) | 2001-06-08 | 2006-04-11 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| EP1275735A1 (en) * | 2001-07-11 | 2003-01-15 | Roche Diagnostics GmbH | Composition and method for hot start nucleic acid amplification |
| EP1452593B1 (en) * | 2001-11-14 | 2009-04-08 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Dna synthesis promoters, dna polymerase-associated factors and utilization thereof |
| CA2409775C (en) * | 2001-12-03 | 2010-07-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Reversibly modified thermostable enzymes for dna synthesis and amplification in vitro |
| CN100429307C (zh) * | 2002-01-09 | 2008-10-29 | 希森美康株式会社 | 核酸检测方法及其系统 |
| US20050221349A1 (en) * | 2002-05-30 | 2005-10-06 | Stuart Wilson | Methods of detecting target molecules and molecular interactions |
| US6896727B2 (en) * | 2002-06-28 | 2005-05-24 | Seh America, Inc. | Method of determining nitrogen concentration within a wafer |
| EP1403379A1 (en) * | 2002-09-24 | 2004-03-31 | QIAGEN GmbH | Enhanced coamplification of nucleic acids |
| CA2519309A1 (en) | 2003-03-25 | 2004-10-14 | Stratagene California | Dna polymerase fusions and uses thereof |
| DE10315640A1 (de) * | 2003-04-04 | 2004-10-14 | Ignatov, Konstantin | Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung |
| US7892745B2 (en) * | 2003-04-24 | 2011-02-22 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| AU2004203649B2 (en) | 2003-08-12 | 2006-01-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Thermostable Taq polymerase fragment |
| EP2208797A3 (en) | 2004-03-01 | 2010-11-24 | Applied Biosystems, LLC | Methods, compositions and kits for use in polynucleotide amplification |
| KR100624490B1 (ko) | 2004-05-27 | 2006-09-20 | 바이오퀘스트(주) | 화학변형 열안정성 ｄｎａ 중합효소 |
| EP1758981A4 (en) | 2004-05-28 | 2013-01-16 | Wafergen Inc | APPARATUS AND METHODS FOR PERFORMING MULTIPLEX ANALYZES |
| US20060019366A1 (en) * | 2004-06-09 | 2006-01-26 | Wanli Bi | Reversibly modified thermostable enzyme compositions and methods of making and using the same |
| JP2008502352A (ja) * | 2004-06-30 | 2008-01-31 | アプレラ コーポレイション | ポリヌクレオチドをライゲーションするための、方法、反応混合物およびキット |
| US7700281B2 (en) * | 2004-06-30 | 2010-04-20 | Usb Corporation | Hot start nucleic acid amplification |
| WO2006029184A2 (en) * | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Expression Diagnostics, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
| EP1634965B1 (en) | 2004-09-09 | 2010-01-20 | Roche Diagnostics GmbH | Real time PCR with the addition of pyrophosphatase |
| US20060051796A1 (en) * | 2004-09-09 | 2006-03-09 | Inga Boell | Real time PCR with the addition of pyrophosphatase |
| JP2008513028A (ja) | 2004-09-21 | 2008-05-01 | アプレラ コーポレイション | マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の二色リアルタイム／エンドポイント定量化 |
| CA2584576C (en) * | 2004-10-18 | 2015-12-08 | Brandeis University | Reagents and methods for improving reproducibility and reducing mispriming in pcr amplification |
| EP2208796B1 (en) * | 2005-01-06 | 2014-06-18 | Applied Biosystems, LLC | Polypeptides having nucleic acid binding activity and compositions and methods for nucleic acid amplification |
| WO2006076650A2 (en) * | 2005-01-12 | 2006-07-20 | Applera Corporation | Compositions, methods, and kits for selective amplification of nucleic acids |
| WO2006122295A2 (en) * | 2005-05-11 | 2006-11-16 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods of monitoring functional status of transplants using gene panels |
| EP2308990B1 (en) | 2005-07-15 | 2012-09-26 | Life Technologies Corporation | Analyzing messenger RNA and micro RNA in the same reaction mixture |
| EP1910397A4 (en) | 2005-07-15 | 2009-07-01 | Applera Corp | DESIGNED A HOT START TRANSFER THROUGH PRIMER |
| US20070059713A1 (en) | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Lee Jun E | SSB-DNA polymerase fusion proteins |
| CA2624634A1 (en) | 2005-10-03 | 2007-04-12 | Applera Corporation | Compositions, methods, and kits for amplifying nucleic acids |
| DE102005047617A1 (de) * | 2005-10-05 | 2007-04-19 | Qiagen Gmbh | Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren unter Einsatz einer DNA-Polymerase mit Proofreading-Eigenschaft |
| GB0600228D0 (en) | 2006-01-06 | 2006-02-15 | Fermentas Uab | Inactivation method |
| EP1989324B1 (en) * | 2006-02-27 | 2011-05-18 | Roche Diagnostics GmbH | Pcr hot start by magnesium sequestration |
| DE102006015960A1 (de) * | 2006-04-04 | 2007-10-11 | Qiagen Gmbh | Gemisch reversibel inhibierter Enzyme |
| CA2648580A1 (en) * | 2006-04-07 | 2008-05-02 | Xdx, Inc. | Steroid responsive nucleic acid expression and prediction of disease activity |
| US8232091B2 (en) | 2006-05-17 | 2012-07-31 | California Institute Of Technology | Thermal cycling system |
| EP2032714B1 (en) * | 2006-06-01 | 2011-03-16 | TriLink BioTechnologies | Chemically modified oligonucleotide primers for nucleic acid amplification |
| US11001881B2 (en) | 2006-08-24 | 2021-05-11 | California Institute Of Technology | Methods for detecting analytes |
| US8435774B2 (en) * | 2006-06-28 | 2013-05-07 | Qiagen Gmbh | Enhancing reactivation of thermostable reversibly inactivated enzymes |
| EP2546364A1 (en) * | 2006-07-17 | 2013-01-16 | Brandeis University | Specialized oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification and detection |
| US11525156B2 (en) | 2006-07-28 | 2022-12-13 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| US8048626B2 (en) | 2006-07-28 | 2011-11-01 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| ATE538216T1 (de) * | 2006-07-31 | 2012-01-15 | Wanli Bi | Nukleinsäureverstärkung mithilfe eines reversibel modifizierten oligonukleotids |
| US9045522B2 (en) | 2006-07-31 | 2015-06-02 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
| US7993832B2 (en) * | 2006-08-14 | 2011-08-09 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
| US11560588B2 (en) | 2006-08-24 | 2023-01-24 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| WO2008140484A2 (en) * | 2006-11-09 | 2008-11-20 | Xdx, Inc. | Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus |
| KR100825279B1 (ko) * | 2006-11-30 | 2008-04-25 | 한국해양연구원 | Ｄｎα 중합효소 활성 증가 단백질 및 이를 암호화 하는유전자 |
| US7902345B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-03-08 | Sequenom, Inc. | Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry |
| CA2677833C (en) | 2007-01-22 | 2016-05-03 | Wafergen, Inc. | Apparatus for high throughput chemical reactions |
| US20090036325A1 (en) * | 2007-05-25 | 2009-02-05 | Applera Corporation | Directed assembly of amplicons to enhance read pairing signature with massively parallel short read sequencers |
| GB0711683D0 (en) * | 2007-06-16 | 2007-07-25 | Enigma Diagnostics Ltd | Compositions |
| JP2010529850A (ja) * | 2007-06-16 | 2010-09-02 | エニグマ ディアグノスティックス リミテッド | 組成物 |
| EP2183380B1 (en) * | 2007-08-27 | 2014-11-26 | Life Technologies Corporation | Methods and compositions for pcr |
| ATE549419T1 (de) | 2007-08-29 | 2012-03-15 | Sequenom Inc | Verfahren und zusammensetzungen für die universelle grössenspezifische polymerasekettenreaktion |
| WO2009087394A1 (en) * | 2008-01-11 | 2009-07-16 | Genesys Ltd | Cren7 chimeric protein |
| GB0803628D0 (en) * | 2008-02-28 | 2008-04-02 | Genesys Ltd | Enzyme |
| GB0804721D0 (en) * | 2008-03-14 | 2008-04-16 | Genesys Ltd | Enzyme |
| GB0804722D0 (en) * | 2008-03-14 | 2008-04-16 | Genesys Ltd | Enzyme |
| CA2658520C (en) | 2008-03-19 | 2016-11-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleic acid amplification in the presence of modified randomers |
| EP2113574A1 (en) | 2008-04-28 | 2009-11-04 | Biotype AG | Substances and methods for a DNA based profiling assay |
| EP2644707B1 (en) * | 2008-04-30 | 2015-06-03 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase-H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| US8911948B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-12-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| US10227641B2 (en) | 2008-04-30 | 2019-03-12 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| US8133669B2 (en) | 2008-05-27 | 2012-03-13 | Trilink Biotechnologies | Chemically modified nucleoside 5′-triphosphates for thermally initiated amplification of nucleic acid |
| WO2009155464A2 (en) * | 2008-06-18 | 2009-12-23 | Life Technologies Corporation | Mutated and chemically modified thermally stable dna polymerases |
| BRPI0915886A2 (pt) | 2008-06-30 | 2015-11-03 | Life Technologies Corp | método para amplificação direta a partir de amostras brutas de ácido nucléico |
| EP2307558A4 (en) * | 2008-07-03 | 2012-08-08 | Allelogic Biosciences Corp | COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR THE PROTECTION OF NUCLEOPHILER GROUPS |
| US8583380B2 (en) | 2008-09-05 | 2013-11-12 | Aueon, Inc. | Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options |
| US7910720B2 (en) | 2008-09-09 | 2011-03-22 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Polyanion for improved nucleic acid amplification |
| US8206929B2 (en) | 2009-01-07 | 2012-06-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants |
| EP2382321A4 (en) | 2009-01-08 | 2012-12-19 | Bio Rad Laboratories | METHODS AND COMPOSITIONS FOR ENHANCING THE EFFICACY OF NUCLEIC ACID AMPLIFICATION REACTIONS |
| US9347092B2 (en) * | 2009-02-25 | 2016-05-24 | Roche Molecular System, Inc. | Solid support for high-throughput nucleic acid analysis |
| JP5457222B2 (ja) * | 2009-02-25 | 2014-04-02 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 小型化ハイスループット核酸分析 |
| DE102009010639B4 (de) * | 2009-02-26 | 2020-07-02 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Verfahren und Anordnung zur Inhibierung einer chemischen Reaktion von Substanzen in einer Flüssigkeit vor einer Messung |
| US8039215B2 (en) | 2009-03-10 | 2011-10-18 | Roche Molecular Systems, Inc. | Multiplex quantitative nucleic acid amplification and melting assay |
| EP2406394B1 (en) | 2009-03-12 | 2014-01-08 | Brandeis University | Reagents and methods for pcr |
| US9464319B2 (en) | 2009-03-24 | 2016-10-11 | California Institute Of Technology | Multivolume devices, kits and related methods for quantification of nucleic acids and other analytes |
| US9447461B2 (en) | 2009-03-24 | 2016-09-20 | California Institute Of Technology | Analysis devices, kits, and related methods for digital quantification of nucleic acids and other analytes |
| EP2412020B1 (en) | 2009-03-24 | 2020-09-30 | University Of Chicago | Slip chip device and methods |
| US10196700B2 (en) | 2009-03-24 | 2019-02-05 | University Of Chicago | Multivolume devices, kits and related methods for quantification and detection of nucleic acids and other analytes |
| EP2411539B1 (en) | 2009-03-25 | 2018-10-03 | Life Technologies Corporation | Discriminatory positive/extraction control dna |
| CN202830041U (zh) * | 2009-04-03 | 2013-03-27 | Illumina公司 | 用于加热生物样本的设备 |
| US8987685B2 (en) * | 2009-09-09 | 2015-03-24 | Pcr Max Limited | Optical system for multiple reactions |
| WO2011044444A2 (en) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Life Technologies Corporation | cDNA SYNTHESIS USING A REVERSIBLY INACTIVATED REVERSE TRANSCRIPTASE |
| WO2011060014A1 (en) * | 2009-11-13 | 2011-05-19 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Small rna detection assays |
| IN2012DN05145A (cs) | 2009-11-19 | 2015-10-23 | Solis Biodyne | |
| WO2011068569A1 (en) | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Biotium, Inc. | Heterocycle-substituted xanthene dyes |
| US9238832B2 (en) | 2009-12-11 | 2016-01-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids |
| US8614071B2 (en) | 2009-12-11 | 2013-12-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers |
| WO2011119934A2 (en) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and materials for detecting colorectal neoplasm |
| US9068017B2 (en) | 2010-04-08 | 2015-06-30 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions and methods for inhibiting terminal transferase activity |
| US20110250598A1 (en) | 2010-04-12 | 2011-10-13 | Ulrike Fischer | Detergent free polymerases |
| WO2011143611A2 (en) | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Life Technologies Corporation | Karyotyping assay |
| US8618253B2 (en) * | 2010-05-25 | 2013-12-31 | Samsung Techwin Co., Ltd. | Modified RNAse H and detection of nucleic acid amplification |
| US8658776B2 (en) | 2010-05-28 | 2014-02-25 | Life Technologies Corporation | Synthesis of 2′,3′-dideoxynucleosides for automated DNA synthesis and pyrophosphorolysis activated polymerization |
| JP5876478B2 (ja) | 2010-06-18 | 2016-03-02 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するｄｎａポリメラーゼ |
| CN103025870B (zh) | 2010-06-18 | 2015-07-01 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 具有增强的3’-错配辨别力的dna聚合酶 |
| WO2011157433A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| US8735121B2 (en) | 2010-06-18 | 2014-05-27 | Roche Molecular Systems, Inc. | DNA polymerases with increased 3′-match discrimination |
| EP2582807B1 (en) | 2010-06-18 | 2015-03-18 | Roche Diagnostics GmbH | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| US8722378B2 (en) | 2010-06-18 | 2014-05-13 | Roche Molecular Systems, Inc. | DNA polymerases with increased 3′-mismatch discrimination |
| WO2011157438A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Dna polymerases with increasesed 3'-mismatch discrimination |
| CN103025869B (zh) | 2010-06-18 | 2015-07-01 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 具有增强的3’-错配辨别力的dna聚合酶 |
| EP3502272A1 (en) | 2010-06-21 | 2019-06-26 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for synthesis and/or detection of nucleic acids |
| WO2012038049A2 (en) | 2010-09-22 | 2012-03-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers |
| US9309556B2 (en) | 2010-09-24 | 2016-04-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Direct capture, amplification and sequencing of target DNA using immobilized primers |
| WO2012045670A1 (en) | 2010-10-04 | 2012-04-12 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for cell lysis in a pcr reaction buffer |
| JP5798631B2 (ja) | 2010-10-04 | 2015-10-21 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | Ｒｔ−ｐｃｒ反応緩衝液中での細胞溶解のための方法 |
| CN103124797B (zh) | 2010-10-04 | 2015-04-22 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于在相同反应容器内的细胞裂解和pcr的方法 |
| US9677128B2 (en) | 2010-10-22 | 2017-06-13 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and kits for detection of 5-hydroxymethylcytosine |
| JP5907990B2 (ja) * | 2010-12-17 | 2016-05-11 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 核酸増幅のための方法、組成物、システム、装置およびキット |
| WO2012125220A2 (en) | 2011-01-14 | 2012-09-20 | Life Technologies Corporation | Methods for isolation, identification, and quantification of mirnas |
| ES2728743T3 (es) | 2011-01-17 | 2019-10-28 | Life Technologies Corp | Flujo de trabajo para la detección de ligandos utilizando ácidos nucleicos |
| CA2826696C (en) | 2011-02-02 | 2019-12-03 | Exact Sciences Corporation | Digital sequence analysis of dna methylation |
| WO2012110061A1 (en) | 2011-02-15 | 2012-08-23 | Roche Diagnostics Gmbh | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| US20140031257A1 (en) | 2011-03-10 | 2014-01-30 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection of gastrointestinal cancers |
| WO2012135053A2 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers |
| ES2561885T3 (es) | 2011-04-11 | 2016-03-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | ADN polimerasas de actividad mejorada |
| US8993341B2 (en) | 2011-05-12 | 2015-03-31 | Exact Sciences Corporation | Removal of PCR inhibitors |
| WO2012155072A2 (en) | 2011-05-12 | 2012-11-15 | Exact Sciences Corporation | Isolation of nucleic acids |
| US8808990B2 (en) | 2011-05-12 | 2014-08-19 | Exact Sciences Corporation | Serial isolation of multiple DNA targets from stool |
| US9567628B2 (en) | 2011-06-08 | 2017-02-14 | Life Technologies Corporation | Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points |
| ES2692894T3 (es) | 2011-06-08 | 2018-12-05 | Life Technologies Corporation | Diseño y desarrollo de nuevos detergentes para su uso en sistemas de PCR |
| WO2013013822A1 (en) | 2011-07-28 | 2013-01-31 | Roche Diagnostics Gmbh | Dna polymerases with improved activity |
| US9758837B2 (en) | 2011-08-02 | 2017-09-12 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Sensitive and rapid method for Candidatus Liberibacter species detection |
| SG11201400724SA (en) | 2011-09-19 | 2014-04-28 | Genentech Inc | Combination treatments comprising c-met antagonists and b-raf antagonists |
| EP2758546B1 (en) | 2011-09-23 | 2017-11-22 | Roche Diagnostics GmbH | Use of g-clamp for improved allele-specific pcr |
| JP2014533100A (ja) | 2011-11-04 | 2014-12-11 | オスロ ウニヴェルスィテーツスィーケフース ハーエフＯｓｌｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔｓｓｙｋｅｈｕｓ Ｈｆ | 結腸直腸癌の分析のための方法およびバイオマーカー |
| US9260714B2 (en) * | 2011-12-02 | 2016-02-16 | Roche Molecular Systems, Inc. | Suppression of non-specific amplification with high-homology oligonucleotides |
| JP6224613B2 (ja) | 2011-12-08 | 2017-11-01 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 改善された活性を有するｄｎａポリメラーゼ |
| JP6144697B2 (ja) | 2011-12-08 | 2017-06-07 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 改善された活性を有するｄｎａポリメラーゼ |
| EP2788479B1 (en) | 2011-12-08 | 2016-02-10 | Roche Diagnostics GmbH | Dna polymerases with improved activity |
| ES2669214T3 (es) | 2011-12-13 | 2018-05-24 | Oslo Universitetssykehus Hf | Procedimientos y kits para la detección de estado de metilación |
| US9115394B2 (en) | 2011-12-22 | 2015-08-25 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and reagents for reducing non-specific amplification |
| JP2015503923A (ja) | 2012-01-09 | 2015-02-05 | オスロ ウニヴェルスィテーツスィーケフース ハーエフＯｓｌｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔｓｓｙｋｅｈｕｓ Ｈｆ | 結腸直腸癌の解析のための方法およびバイオマーカー |
| GB201201547D0 (en) * | 2012-01-30 | 2012-03-14 | Olink Ab | Method and product |
| EP2809377A4 (en) | 2012-02-01 | 2015-08-19 | Certa Dose Inc | DRUG DELIVERY SYSTEM |
| US11617835B2 (en) | 2012-02-01 | 2023-04-04 | Cd Acquisitions, Llc | Apparatuses, methods, and systems for delivering measured doses of medication |
| EP4361606A2 (en) | 2012-02-03 | 2024-05-01 | California Institute of Technology | Signal encoding and decoding in multiplexed biochemical assays |
| CN104220876A (zh) | 2012-02-21 | 2014-12-17 | 奥斯陆大学医院 | 用于宫颈癌的检测和预后的方法和生物标志物 |
| US9085761B1 (en) | 2012-06-14 | 2015-07-21 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for amplification of nucleic acids |
| CN110343673B (zh) | 2012-06-14 | 2024-04-05 | 生命技术公司 | 用于聚合酶链式反应(pcr)的新型组合物、方法和试剂盒 |
| IN2015DN01609A (cs) | 2012-08-03 | 2015-07-03 | California Inst Of Techn | |
| US9212392B2 (en) | 2012-09-25 | 2015-12-15 | Exact Sciences Corporation | Normalization of polymerase activity |
| GB201217405D0 (en) * | 2012-09-28 | 2012-11-14 | Fermentas Uab | Protein removal agent |
| CN111793621A (zh) | 2012-11-02 | 2020-10-20 | 生命技术公司 | 用于增强pcr特异性的新颖组合物、方法和试剂盒 |
| US9710596B2 (en) | 2012-11-21 | 2017-07-18 | Exact Sciences Corporation | Methods for quantifying nucleic acid variations |
| US20140178911A1 (en) * | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Characterization of thermostable dna polymerase |
| GB201301457D0 (en) | 2013-01-28 | 2013-03-13 | Fluorogenics Ltd | Freeze-dried composition |
| CN105339505B (zh) | 2013-03-12 | 2021-08-10 | 生命技术公司 | 基于通用报告体的基因分型方法和材料 |
| ES2859645T3 (es) | 2013-03-14 | 2021-10-04 | Mayo Found Medical Education & Res | Detección de neoplasia |
| CN105378109B (zh) | 2013-03-14 | 2019-06-14 | 雅培分子公司 | 使用尿嘧啶-dna-n-糖基化酶使错误最小化 |
| WO2014184684A2 (en) | 2013-05-16 | 2014-11-20 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection of hematological cancers |
| US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
| US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
| US20150232931A1 (en) | 2013-09-20 | 2015-08-20 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for the analysis of radiosensitivity |
| EP3063129B1 (en) | 2013-10-25 | 2019-04-17 | Life Technologies Corporation | Novel compounds for use in pcr systems and applications thereof |
| WO2015066695A1 (en) | 2013-11-04 | 2015-05-07 | Exact Sciences Corporation | Multiple-control calibrators for dna quantitation |
| KR101488110B1 (ko) | 2013-11-29 | 2015-01-29 | 성균관대학교산학협력단 | 나노아케움 이퀴탄스 유래의 Neq HS DNA 중합효소의 돌연변이체 제조 및 이를 이용한 hot-start PCR 응용 |
| WO2015085230A1 (en) | 2013-12-06 | 2015-06-11 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Fusion polymerases |
| WO2015095689A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Exact Sciences Corporation | Synthetic nucleic acid control molecules |
| WO2015107430A2 (en) | 2014-01-16 | 2015-07-23 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| EP3097190A2 (en) | 2014-01-22 | 2016-11-30 | Life Technologies Corporation | Novel reverse transcriptases for use in high temperature nucleic acid synthesis |
| EP4234722A3 (en) | 2014-03-31 | 2023-09-20 | Mayo Foundation for Medical Education and Research | Detecting colorectal neoplasm |
| US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
| WO2016061111A1 (en) | 2014-10-13 | 2016-04-21 | Life Technologies Corporation | Methods, kits & compositions for determining gene copy numbers |
| CN113981057A (zh) | 2014-12-12 | 2022-01-28 | 精密科学公司 | 用于进行甲基化检测测定的组合物和方法 |
| WO2016094839A2 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Exact Sciences Corporation | Compositions and methods for performing methylation detection assays |
| CN107208074B (zh) | 2014-12-16 | 2021-06-15 | 生命技术公司 | 聚合酶组合物和制造与使用其的方法 |
| US9909169B2 (en) | 2014-12-17 | 2018-03-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression |
| DK3259602T3 (da) | 2015-02-20 | 2021-02-15 | Takara Bio Usa Inc | Fremgangsmåde til hurtig nøjagtig dispensering, visualisering og analyse af enkeltceller |
| WO2016149021A1 (en) | 2015-03-13 | 2016-09-22 | Life Technologies Corporation | Methods, compositions and kits for small rna capture, detection and quantification |
| EP3274440A4 (en) | 2015-03-27 | 2019-03-06 | Exact Sciences Corporation | PROOF OF DISEASES OF THE DISHES |
| CN104845967B (zh) | 2015-04-15 | 2020-12-11 | 苏州新海生物科技股份有限公司 | 寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用 |
| ES2961374T3 (es) | 2015-04-24 | 2024-03-11 | Atila Biosystems Incorporated | Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada |
| ES2759477T3 (es) | 2015-05-29 | 2020-05-11 | Hoffmann La Roche | Un procedimiento de inactivación de microbios por anhídrido citracónico |
| USD938023S1 (en) | 2015-09-02 | 2021-12-07 | Certa Dose, Inc. | Drug delivery syringe |
| GB201518655D0 (en) | 2015-10-21 | 2015-12-02 | Olink Ab | Method for generating proximity probes |
| EP3365357B1 (en) | 2015-10-23 | 2024-02-14 | President and Fellows of Harvard College | Evolved cas9 proteins for gene editing |
| AU2016343937B2 (en) | 2015-10-30 | 2023-01-19 | Exact Sciences Corporation | Multiplex amplification detection assay and isolation and detection of DNA from plasma |
| CN116144626A (zh) | 2016-01-13 | 2023-05-23 | 新英格兰生物实验室公司 | T7 rna聚合酶的热稳定变体 |
| LT3402880T (lt) | 2016-01-15 | 2024-03-12 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Termofiliniai dnr polimerazės mutantai |
| PL3408408T3 (pl) | 2016-01-27 | 2019-09-30 | Devyser Holding Ab | Selektywna amplifikacja pożądanych regionów kwasów nukleinowych w sekwencji stanowiącej cel |
| WO2017155858A1 (en) | 2016-03-07 | 2017-09-14 | Insilixa, Inc. | Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension |
| EP3440221A1 (en) | 2016-04-06 | 2019-02-13 | Life Technologies Corporation | Compositions, methods, and kits for synthesis and detection of nucleic acids |
| CA3022911A1 (en) | 2016-05-05 | 2017-11-09 | Exact Sciences Development Company, Llc | Detection of lung neoplasia by analysis of methylated dna |
| US20170321286A1 (en) | 2016-05-05 | 2017-11-09 | Exact Sciences Corporation | Detection of lung neoplasia by amplification of rna sequences |
| EP3454924A4 (en) | 2016-05-11 | 2020-04-15 | Certa Dose, Inc. | RADIOLOGICAL DOSING SYSTEM AND METHOD |
| EP3464596A1 (en) | 2016-06-07 | 2019-04-10 | Cepheid | Thermostable polymerase inhibitor compositions and methods |
| WO2017218938A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Life Technologies Corporation | Novel compositions, methods and kits for microorganism detection |
| WO2017218777A1 (en) | 2016-06-17 | 2017-12-21 | California Institute Of Technology | Nucleic acid reactions and related methods and compositions |
| CN109328235A (zh) * | 2016-06-23 | 2019-02-12 | 国立研究开发法人理化学研究所 | 一步逆转录模板转换pcr |
| FR3053968A1 (fr) * | 2016-07-13 | 2018-01-19 | Biomerieux | Reactifs pour la protection reversible de molecules biologiques |
| US11208680B2 (en) | 2016-07-19 | 2021-12-28 | Exact Sciences Development Company, Llc | Nucleic acid control molecules from non-human organisms |
| EP3978624A1 (en) | 2016-07-19 | 2022-04-06 | Exact Sciences Corporation | Methylated control dna |
| US11460405B2 (en) | 2016-07-21 | 2022-10-04 | Takara Bio Usa, Inc. | Multi-Z imaging and dispensing with multi-well devices |
| AU2017306676B2 (en) | 2016-08-03 | 2024-02-22 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| AU2017308889B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-11-09 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| US11613777B2 (en) | 2016-08-26 | 2023-03-28 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid extraction and amplification controls and methods of use thereof |
| US10858699B2 (en) | 2016-08-30 | 2020-12-08 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Cleavable hairpin primers |
| CN116064795A (zh) | 2016-09-02 | 2023-05-05 | 梅约医学教育与研究基金会 | 确定差异甲基化区域的甲基化状态的方法和试剂盒 |
| SG11201903089RA (en) | 2016-10-14 | 2019-05-30 | Harvard College | Aav delivery of nucleobase editors |
| WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
| WO2018127786A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Oslo Universitetssykehus Hf | Compositions and methods for determining a treatment course of action |
| EP3574110A4 (en) | 2017-01-27 | 2021-01-13 | Exact Sciences Development Company, LLC | DETECTION OF COLUMN NEOPLASIA BY ANALYSIS OF METHYLATED DNA |
| WO2018148511A1 (en) | 2017-02-10 | 2018-08-16 | Zymergen Inc. | A modular universal plasmid design strategy for the assembly and editing of multiple dna constructs for multiple hosts |
| WO2018162516A1 (en) | 2017-03-08 | 2018-09-13 | Etablissement Francais Du Sang | Rhd gene allele associated with a weak d phenotype and its uses |
| WO2018165504A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| IL306092A (en) | 2017-03-23 | 2023-11-01 | Harvard College | Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins |
| WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| CN107312762B (zh) * | 2017-06-23 | 2020-08-11 | 苏州点晶生物科技有限公司 | 一种化学修饰ung酶及其修饰方法和应用 |
| WO2019002178A1 (en) | 2017-06-26 | 2019-01-03 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | DNA MUTANTS THERMOPHILIC POLYMERASES |
| JP2020534795A (ja) | 2017-07-28 | 2020-12-03 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物 |
| USD846383S1 (en) | 2017-08-10 | 2019-04-23 | Certa Dose, Inc. | Carton |
| WO2019139645A2 (en) | 2017-08-30 | 2019-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
| JP2021502825A (ja) | 2017-11-13 | 2021-02-04 | ライフ テクノロジーズ コーポレイション | 尿路微生物検出のための組成物、方法、およびキット |
| US10648025B2 (en) | 2017-12-13 | 2020-05-12 | Exact Sciences Development Company, Llc | Multiplex amplification detection assay II |
| EP3768832B1 (en) | 2018-03-21 | 2023-11-29 | F. Hoffmann-La Roche AG | Dna polymerases for efficient and effective incorporation of methylated-dntps |
| US11712522B2 (en) | 2018-05-01 | 2023-08-01 | CD Acquistions, LLC | System and method for sequential delivery of measured doses of medication |
| US11679204B2 (en) | 2018-05-17 | 2023-06-20 | Cd Acquisitions, Llc | Syringe holder for medication dosing |
| JP2021533773A (ja) | 2018-08-15 | 2021-12-09 | ザイマージェン インコーポレイテッド | ハイスループット代謝操作におけるＣＲＩＳＰＲｉの適用 |
| US11408030B2 (en) | 2018-09-10 | 2022-08-09 | Andy Madrid | Test for detecting Alzheimer's disease |
| WO2020053327A1 (en) | 2018-09-13 | 2020-03-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Mutant dna polymerase(s) with improved strand displacement ability |
| US20220017966A1 (en) | 2018-11-16 | 2022-01-20 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and compositions for characterizing bladder cancer |
| USD943737S1 (en) | 2019-01-22 | 2022-02-15 | Certa Dose, Inc. | Overdose resistant drug delivery syringe |
| EP3937780A4 (en) | 2019-03-14 | 2022-12-07 | InSilixa, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR TIMED FLUORESCENCE-BASED DETECTION |
| JP2022526908A (ja) | 2019-03-19 | 2022-05-27 | ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド | 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物 |
| CN110283801A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-09-27 | 遵义医科大学珠海校区 | 一种dna聚合酶的化学修饰方法 |
| JP2022553575A (ja) | 2019-10-31 | 2022-12-23 | マヨ ファウンデーション フォア メディカル エデュケーション アンド リサーチ | 卵巣癌の検出 |
| US20220389497A1 (en) | 2019-11-04 | 2022-12-08 | Mirnax Biosens, S.L. | Bivalent reverse primer |
| EP3901286A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-27 | Mirnax Biosens, S.L. | Bivalent reverse primer |
| BR112022016493A2 (pt) | 2020-02-18 | 2022-10-25 | Life Technologies Corp | Composições, kits e métodos para detecção de sequências virais |
| AU2021267940A1 (en) | 2020-05-08 | 2022-12-08 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
| EP4157856A2 (en) | 2020-05-26 | 2023-04-05 | Qiagen Beverly, LLC | Polymerase enzyme |
| JP2023539128A (ja) | 2020-08-19 | 2023-09-13 | マヨ ファウンデーション フォア メディカル エデュケーション アンド リサーチ | 非ホジキンリンパ腫の検出 |
| JP2023543803A (ja) | 2020-09-24 | 2023-10-18 | ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド | プライム編集ガイドｒｎａ、その組成物、及びその使用方法 |
| CN112359031A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-02-12 | 北京丹大生物技术有限公司 | 一种热启动dna聚合酶及其制备方法和应用 |
| JP2024503437A (ja) | 2021-01-11 | 2024-01-25 | ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド | プライム編集効率及び精度を向上させるためのプライム編集因子バリアント、構築物、及び方法 |
| EP4278002A2 (en) | 2021-01-18 | 2023-11-22 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for direct amplification from crude biological samples |
| WO2022159874A1 (en) | 2021-01-25 | 2022-07-28 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences |
| WO2022203748A1 (en) | 2021-03-23 | 2022-09-29 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for variant-resistant detection of target viral sequences |
| WO2023014729A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for detection of nucleic acid sequence loads |
| WO2023021330A1 (en) | 2021-08-16 | 2023-02-23 | University Of Oslo | Compositions and methods for determining a treatment course of action |
| WO2023069604A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for quantification of nucleic acid sequences using an internal quantitative standard |
| WO2023076898A1 (en) | 2021-10-25 | 2023-05-04 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing a genome with prime editing and a recombinase |
| CN116410951A (zh) * | 2021-12-30 | 2023-07-11 | 广州达安基因股份有限公司 | 一种提高化学修饰的Taq酶的活性的方法和经该方法处理的Taq酶 |
| WO2024006927A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for detecting nucleic acids using intra-channel multiplexing |
| WO2024006924A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Life Technologies Corporation | Systems and methods for analyte detection from multiplexed assays |
| CN116024320A (zh) * | 2022-07-13 | 2023-04-28 | 上海翔琼生物技术有限公司 | 一种用于检测核酸的荧光定量pcr方法 |
| WO2024054925A1 (en) | 2022-09-09 | 2024-03-14 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5374553A (en) * | 1986-08-22 | 1994-12-20 | Hoffmann-La Roche Inc. | DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima |
| WO1989002916A1 (en) * | 1987-09-28 | 1989-04-06 | Novo-Nordisk A/S | Method for immobilizing lipase |
| US5108892A (en) * | 1989-08-03 | 1992-04-28 | Promega Corporation | Method of using a taq dna polymerase without 5'-3'-exonuclease activity |
| AU646430B2 (en) * | 1989-12-22 | 1994-02-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant expression vectors and purification methods for thermus thermophilus DNA polymerase |
| JP2709311B2 (ja) * | 1990-09-28 | 1998-02-04 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アクチェンゲゼルシャフト | 熱安定性ｄｎａポリメラーゼの５→３′のエキソヌクレアーゼ突然変異 |
| FR2674248B1 (fr) * | 1991-03-19 | 1993-06-11 | Elf Aquitaine | Procede de modification chimique des proteines. |
| US5338671A (en) * | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| EP0655506B1 (en) * | 1994-10-17 | 1996-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | DNA polymerases having modified nucleotide binding site for DNA sequencing |
-
1996
- 1996-07-11 US US08/680,283 patent/US5773258A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-19 US US08/684,108 patent/US5677152A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-17 DE DE69601488T patent/DE69601488T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-17 DE DE0771870T patent/DE771870T1/de active Pending
- 1996-08-17 AT AT96113222T patent/ATE176499T1/de active
- 1996-08-17 DK DK96113222T patent/DK0771870T3/da active
- 1996-08-17 EP EP96113222A patent/EP0771870B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-17 ES ES96113222T patent/ES2101668T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-19 IL IL11908896A patent/IL119088A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-08-21 AU AU62179/96A patent/AU689047B2/en not_active Expired
- 1996-08-21 HU HU9602289A patent/HU221750B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-08-23 PL PL96315803A patent/PL185711B1/pl unknown
- 1996-08-23 MX MX9603608A patent/MX9603608A/es unknown
- 1996-08-23 CZ CZ19962495A patent/CZ289237B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-08-23 RU RU96116815/13A patent/RU2174556C2/ru active
- 1996-08-23 CA CA002184105A patent/CA2184105C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-23 NO NO19963541A patent/NO323552B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-08-24 KR KR1019960035291A patent/KR100221097B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-08-25 CN CNB961132191A patent/CN1282741C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-26 BR BR9603563A patent/BR9603563A/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-08-26 JP JP08240996A patent/JP3026554B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ249596A3 (en) | Amplification method of nucleic acids | |
| JP3969581B2 (ja) | インビトロｄｎａ合成および増幅のための可逆的に修飾された熱安定酵素 | |
| US6183998B1 (en) | Method for reversible modification of thermostable enzymes | |
| EP2069487B1 (en) | Zwitterionic detergents for the storage and use of dna polymerases | |
| JP3535812B2 (ja) | Ｄｎａ分子合成を目的とした熱サイクル反応における１種類以上の酵素活性の連続的活性化 | |
| JP5022383B2 (ja) | マグネシウム封鎖によるｐｃｒホットスタート | |
| WO2007123742A2 (en) | Methods and compositions for increasing the fidelity of multiplex nucleic acid assembly | |
| US20160264950A1 (en) | Reversibly inactivated thermostable reverse transcriptases, compositions and methods for use | |
| US9353311B2 (en) | Composite visible colorant and method for quantitative amplification | |
| US6399304B1 (en) | Sequential activation of one or more enzymatic activities within a thermocycling reaction for synthesizing DNA molecules | |
| Gill et al. | Interaction of the family-B DNA polymerase from the archaeon Pyrococcus furiosus with deaminated bases | |
| US8129150B2 (en) | Mixture of reversibly inhibited enzymes | |
| JP2002528121A5 (ja) | 高忠実度の熱安定性リガーゼおよびその使用 | |
| US20160032262A1 (en) | Methods and Compositions for PCR | |
| KR20230124946A (ko) | 고-충실도 DNA 폴리머라아제를 이용한 rhPCR 기반 앰플리콘시퀀싱에서 프라이머 이량체 및 오프-타겟 증폭을 감소시키는 RNAse H2 돌연변이체 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20160823 |