CZ200114A3 - Process for preparing transgenic organism with exception of human being and characterization of gene function by making use double stranded RNA inhibition - Google Patents
Process for preparing transgenic organism with exception of human being and characterization of gene function by making use double stranded RNA inhibition Download PDFInfo
- Publication number
- CZ200114A3 CZ200114A3 CZ200114A CZ200114A CZ200114A3 CZ 200114 A3 CZ200114 A3 CZ 200114A3 CZ 200114 A CZ200114 A CZ 200114A CZ 200114 A CZ200114 A CZ 200114A CZ 200114 A3 CZ200114 A3 CZ 200114A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- promoter
- dna
- organism
- elegans
- transcription factor
- Prior art date
Links
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 title claims abstract description 77
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 title claims abstract description 76
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 97
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 title description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 80
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 54
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 22
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 69
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 55
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 45
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 32
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 32
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 25
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 claims description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 9
- 101150015886 nuc-1 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 7
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 3
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 claims description 3
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 claims description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 108
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 37
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 25
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 25
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 20
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 14
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 11
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 10
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 7
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 101000936911 Chionoecetes opilio Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase Proteins 0.000 description 6
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 210000000754 myometrium Anatomy 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 101100459320 Caenorhabditis elegans myo-2 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100353517 Caenorhabditis elegans pas-2 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100528916 Caenorhabditis elegans rol-6 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 101150110777 let-858 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 4
- 101100048437 Caenorhabditis elegans unc-22 gene Proteins 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 3
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 3
- 101150117157 MYO3 gene Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 101100011366 Caenorhabditis elegans egl-15 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100071585 Caenorhabditis elegans hsp-16.2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100074836 Caenorhabditis elegans lin-22 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100243717 Cochliobolus carbonum PGN1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 2
- 206010028347 Muscle twitching Diseases 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 2
- 101150086731 ges-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000010196 hermaphroditism Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 101150114748 unc-119 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000380490 Anguina Species 0.000 description 1
- 241000294569 Aphelenchoides Species 0.000 description 1
- 241000580217 Belonolaimus Species 0.000 description 1
- 241000243770 Bursaphelenchus Species 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 101100064098 Caenorhabditis elegans dpy-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100347613 Caenorhabditis elegans unc-54 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 1
- 241000399934 Ditylenchus Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100031690 Erythroid transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 241001442498 Globodera Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001480224 Heterodera Species 0.000 description 1
- 101001066268 Homo sapiens Erythroid transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 101000740205 Homo sapiens Sal-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000201433 Nacobbus Species 0.000 description 1
- 241001220391 Paratrichodorus Species 0.000 description 1
- 241001674048 Phthiraptera Species 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000193943 Pratylenchus Species 0.000 description 1
- 102100029812 Protein S100-A12 Human genes 0.000 description 1
- 101710110949 Protein S100-A12 Proteins 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241001540480 Rotylenchulus Species 0.000 description 1
- 102100037204 Sal-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 1
- 235000005764 Theobroma cacao ssp. cacao Nutrition 0.000 description 1
- 235000005767 Theobroma cacao ssp. sphaerocarpum Nutrition 0.000 description 1
- 241001220308 Trichodorus Species 0.000 description 1
- 241001267618 Tylenchulus Species 0.000 description 1
- 101150033660 UL6 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000201423 Xiphinema Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 235000001046 cacaotero Nutrition 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 101150097231 eg gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150034492 gdhA-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010379 pull-down assay Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1079—Screening libraries by altering the phenotype or phenotypic trait of the host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10211—Podoviridae
- C12N2795/10241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2795/10243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká charakterizace nebo identifikace genové funkce pomocí inhibice dvouřetězcové RNA (dsRNAi) a způsobu identifikace DNA zodpovědné za indukci specifického fenotypu v buňce, a dále se týká způsobu přiřazení určité funkce známé genové sekvenci. Dále se vynález také týká způsobu přípravy transgenního organismu s výjimkou člověka.
Dosavadní stav techniky
Nedávno bylo popsáno (Nátuře 391: 806-811, únor 1998), že vnesení dvouřetězcové RNA do buňky vede k silnému a specifickému ovlivnění exprese endogenních genů v buňce a tento vliv je podstatně účinnější než vnesení každého z řetězců RNA jednotlivě, jak se provádí při tzv. anti-sense technikách. Bylo zjištěno, že k tomuto specifickému snížení aktivity genu dohází u červa, resp. hlístice Caenorhabditis elegans (C. elegans) po vnesení RNA do genomu nebo do tělní dutiny.
Předkládaný vynález užívá této techniky pro novou metodu přiřazení funkce genům nebo DNA fragmentům, které byly sekvencovány v různých programech, např. v projektu sekvencování lidského genomu, a kterým nebyla dosud přiřazena žádná specifická funkce, a dále metodu identifikace DNA zodpovědné za vznik konkrétního fenotypu.
• · · · • · • · ·
- 2 Podstata vynálezu
První aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu identifikace DNA zodpovědné za vznik určitého, fenotypu buňky, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se a) připraví cDNA nebo genomová knihovna z DNA dané buňky v takové orientaci vzhledem k promotoru (promotorům), aby po navázání vhodného transkripčního faktoru k promotoru (promotorům) byla možná transkripce dané cDNA nebo DNA do dvouřetězcové RNA (dsRNA) a b). tato,, knihovna se vnese do jedné nebo několika buněk obsahujících vhodný transkripční faktor, a c) identifikuje se a izoluje se požadovaný fenotyp buněk obsahujících knihovnu a identifikuje se fragment cDNA nebo DNA z této knihovny zodpovědný za vznik takového fenotypu.
Ve výhodném provedení vynálezu je ještě před krokem b) knihovna organizována do hierarchických skupin1 (poolů), jak je podrobněji popsáno v příkladech, zahrnujících např. genové rodiny.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu přiřazeni funkce známé sekvenci DNA, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se a) identifikuje homolog (homology) DNA v buňce, b) z buňky se izoluje relevantní homolog (homology) nebo jeho (jejich) fragment, c) homolog nebo fragment se klonuje do vhodného vektoru v takové orientaci vzhledem k promotoru (promotorům), aby po navázání vhodného transkripčního faktoru k promotoru (promotorům) byla možná transkripce dané cDNA nebo DNA do dsRNA a d) tento vektor se vnese do jedné nebo několika buněk z kroku a) obsahujících transkripční faktor a e) srovnáním s buňkami divokého typu se identifikuje fenotyp buněk.
V každém aspektu vynálezu nukleotidová nebo DNA sekvence je jak v „sense (souhlasně se směrem transkripce) tak i v „anti-sense (proti směru transkripce) orientaci vzhledem k jednotlivému promotoru s vlastnostmi popsanými výše, nebo
alternativně je mezi dvěma identickými promotory.. Oba případy provedení vynálezu poskytují dsRNA transkripcí iniciovanou z promotoru po navázání vhodného transkripčního faktoru.
Buňky podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány z organismu nebo mohou být součástí organismu. Pokud jsou buňky součástí organismu (jsou obsaženy v organismu), organismus může být adaptován tak, aby exprimoval- vhodný transkripční faktor. Organismu může být jakýkoliv organismus jako je rostlina, živočich, houba nebo kvasinka, ale výhodně je to hlístice C. elegans, a sice divoký typ nebo mutanta C. elegans obsahující mutaci nuc-1 nebo pha-ts nebo kombinaci těchto mutaci. V alternativním provedeni vynálezu je DNA nebo cDNA knihovna nebo DNA fragment nebo jeho fragment vnesen, výhodně transfekcí nebo transformací, do mikroorganismu, jako je např. buňky bakterie nebo kvasinky, kterými je pak výhodně krmena hlístice C. elegans. V tomto provedení předkládaného vynálezu je mikroorganismus adaptován tak, vhodný transkripční faktor. Výhodně je E. coli.
aby exprimoval mikroorganismus
V každém aspektu předkládaného vynálezu DNA homolog nebo jeho fragment konstruován vektoru, který obsahuje nukleotidovou sekvenci transkripční faktor. Alternativně faktor kódován dalším vektorem.
je DNA knihovna, ve vhodném DNA je tento
V dalším kódující daný transkripční alternativním nebo j sou aby exprimovaly daný transkripční faktor. Výhodně vektor použitý ve způsobu podle vynálezu což může být např. nukleotidová buňka nebo organismus exprimuj i, provedení adaptovány, kterýkoliv selekční markér, kódující gen sup-35 nebo jeho fragment. Nukleotidová je orientována vzhledem transkripčního faktoru na. do dvouřetězcové RNA. Obr.
obsahuj e sekvence sekvence navázání k promotoru tak, že promotor iniciuje transkripci DNA ilustruje vektory a orientaci sekvencí DNA, které umožňují
V jednom provedení vynález je tvorbu dsRNA v
DNA lokalizována
C. elegans.
mezi dvěma .
promotory ve vektoru schopném exprimovat dsRNA po navázáni transkripčniho faktoru na tyto promotory. Alternativně obsahuje vektor dvě kopie sekvence DNA uspořádané v sense a anti-sense orientaci vzhledem k promotoru, přičemž jeho markér je selektovatelný, jeli obsažen v mutantě C. elegans pha-1. Výhodně je promotor kterýkoliv z promotorů T7, T3 nebo SP6 a transkripčni faktor obsahuje příslušnou polymerázu.
Selekční markér výhodně obsahuje nukleotidovou sekvenci schopnou inhibovat expresi nebo zabránit expresi genu v dané buňce, přičemž jde o gen, který poskytuje známý fenotyp. Tato nukleotidová sekvence je součástí genu nebo je identická s genem poskytujícím tento fenotyp, přičemž sama tato sekvence je orientována vzhledem k vhodnému promotoru (promotorům)
RNA po navázání (promotory) genu nebo přičemž integraci rekombinací do genomu dané buňky, schopnému iniciovat transkripci dvouřetě.zcové vhodného transkripčniho faktoru na Alternativně nukleotidová sekvence je poskytujícím daný je taková, že dalšího vektoru je identická s genem nukleotidová sekvence tohoto vektoru nebo přičemž po této promotor součástí fenotyp, . umožňuj e homologní integraci je nukleotidová sekvence schopná inhibovat expresi genové sekvence poskytující daný fenotyp. V takovém provedení vynálezu nukleotidová sekvence obsahuje stop kodony vhodné k zabránění translace nukleotidové sekvence po její integraci do genomu.
Výhodně lze ve způsobech podle vynálezu přidat k buňkám nebo organismům sloučeniny s cílem vyhledávat daný fenotyp (screening), např. fenotyp rezistence nebo vnímavosti ke sloučenině ve srovnání s divokým typem. Promotory jsou výhodně indukovatelné promotory. Transkripčni faktory jsou v některých provedeních vynálezu odvozeny z fágů, jako je např. T7 polymeráza řízená fágovým promotorem. Avšak pokud je užit C. Elegans, je výhodný promotor specifický pro červy nebo tkáňově specifický promotor jako jsou např. Iet858,
SERCA, UL6, myo-2 nebo myo-3. Výhodně je užit kmen E. coli negativní na RNázu III nebo výhodněji kmen negativní na RNázu.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob přípravy t.ransgenního organismu, s výjimkou člověka, obsahujícího exogenní transkripční faktor a transgen, který obsahuje promotor operativně spojený s fragmentem DNA, který je exprimován po navázání transkripčního faktoru, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se a) připraví první transgenní organismus obsahující první konstrukt obsahující DNA kódující exogenní transkripční faktor a druhý transgenní organismus obsahující druhý konstrukt obsahující alespoň jeden promotor operativně spojený s požadovanou sekvencí DNA, která je exprimována po navázání transkripčního faktoru prvního transgenního organismu, a b) kříží první a druhý transgenní organismus a vybere se potomstvo exprimující požadovanou sekvenci . DNA. V jednom, provedení vynálezu první a druhý transgenní organismus jsou připraveny vnesením prvního a druhého konstruktu transformací do mikroorganismů, které jsou užity jako potrava pro požadovaný organismus. Výhodně druhý konstrukt' obsahuje požadovanou sekvenci DNA v takové orientaci vzhledem k promotoru, která umožňuje iniciaci transkripce DNA na dsRNA po navázání transkripčního faktoru. V tomto provedení vynálezu druhý konstrukt obsahuje dva promotory obklopující požadovanou sekvenci DNA, přičemž tyto promotory mohou iniciovat transkripci sekvence DNA do dsRNA po navázání transkripčního faktoru na dané promotory.
Alternativně je sekvence DNA jak v sense. tak i v anti-sense orientaci vzhledem k promotorům, takže poskytuje dsRNA po navázání transkripčního faktoru na promotory. V každém z těchto provedení vynálezu první a/nebo druhý konstrukt výhodně obsahuje reportérový gen operativně spojený s promotorem, který je schopen iniciovat transkripci reportérového genu po navázání transkripčního faktoru.
- β
Výhodně reportérový . gen kóduje některý z genů jako je luciferáza, zelený fluorescenční protein,, β-galaktosidáza nebo β-laktamáza.
Předkládaný vynález se také týká způsobu ověření klonů identifikovaných ve kvasinkovém dvouhybridnim vektorovém experimentu, kteréžto experimenty jsou odborníkovi dobře známy a byly poprvé navrženy v publikaci Chien et al., 1991 pro detekci interakce protein-protein. Způsob podle vynálezu obsahuje kroky, kdy se poskytne konstrukt obsahující DNA kódující protein identifikovaný v kvasinkovém dvouhybridnim vektorovém experimentu, kterýžto konstrukt je takový, že DNA je ve vhodné orientaci vzhledem k jednomu .nebo více promotorům schopným zahájit transkripci dané .DNA do dsRNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na dané promotory, konstruktem se transformuje buňka, jako je např. bakteriální buňka, nebo alternativně organismus obsahující požadovaný transkripční. faktor, a identifikují se fenotypové změny v dané buňce nebo organismu, přičemž organismem může být C. elegans nebo podobný organismus, a srovnají se s divokým typem. Výhodně transkripční faktor je indukovatelný v buňce nebo organismu. Sekvence DNA může být lokalizovaná mezi dvěma promotory, a to jak v sense tak i v anti-sense orientaci vzhledem k jednotlivému promotoru, jak bylo již popsáno výše. Výhodně je promotorem fágový promotor polymerázy a transkripčnim faktorem je RNA polymeráza, výhodně T7 RNA polymeráza. Předmětem předkládaného vynálezu jsou' také vektory vhodné pro transformaci buněk nebo, organismů a pak samotné buňky nebo organismy.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob snížení zamoření rostlin škůdci, kterýžto způsob spočívá v tom, že obsahuje kroky, kdy se a) identifikuje sekvence DNA z daného škůdce, která je kritická pro jeho přežití., růst, proliferaci nebo reprodukci, b) sekvence z kroku a) nebo její fragment se klonuje do vhodném vektoru vzhledem k jednomu • · · · ·· ·· · • · · · · · ·· ··· ·· · ♦ ·4 · <
♦ · · 4 · · ·· ··· 4 · ··· nebo několika promotorům schopným transkripce dané sekvence do RNA nebo dsRNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na dané promotory a c) vektor se vnese do rostliny.
Takže výhodný způsob podle vynálezu poskytuje zvláště selektivní mechanismus pro snížení zamoření škůdcem, v některých případech zamoření rostliny parazitem, kdy škůdce tím, že cizopasí na rostlině, pozře také exprimovanou dsRNA v rostlině, a tím inhibuje expresi DNA, která je kritická pro jeho přežití, růst, proliferaci nebo reprodukci. Ve výhodném provedení vynálezu je škůdce' kterýkoliv škůdce patřící do skupiny obsahující Tylenchulus ssp., Radophulus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp. , Belonolaimus ssp., Canjanus ssp. ,
Meloidygne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp. ,, Hirscmenniella ssp., Anguina ssp., Haplolaimus, ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemalla ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Paratrichodorus ssp., Aphelenches ssp. Sekvence DNA nebo její fragment podle tohoto aspektu vynálezu je klonována mezi dva tkáňově specifické promotory, jako jsou např. kořenově specifické promotory.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká vektorů užitých ve způsobech podle vynálezu pro konstrukci požadované knihovny. Tyto vektory podle vynálezu obsahují dva shodné promotory orientované tak, že jsou schopné iniciovat transkripci sekvence DNA lokalizované mezi nimi na dsRNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na tyto promotory. Sekvence DNA např. obsahuje vícečetné klonovací místo. Výhodně expresní vektor obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující selekční markér. V jednom provedení vynálezu je nukleotidové sekvence kódující selekční markér lokalizována mezi dva shodné promotory orientované tak, že jsou schopné iniciovat transkripci sekvence DNA lokalizované mezi nimi na dsRNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na tyto • ·
- 8 promotory. Výhodně selekční markér obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující sup-35, pro vnesení do C. elegans nesoucí mutaci pha-1.
Výhodně transkripční faktory obsahují buďto fágovou polymerázu, která se váže na svůj odpovídající promotor, nebo C. elegans specifický promotor, ještě výhodněji T7 polymerázu. Výhodně vektor obsahuje vícečetné klonovací místo ležící mezi dvěma uvedenými promotory.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje expresní vektor pro expresi vhodného transkripčního faktoru pro použití při způsobech podle vynálezu. Tento vektor obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující vhodný transkripční faktor operativně spojenou s vhodnou sekvencí kontrolující expresi. Výhodně sekvence kontrolující expresi obsahuje promotor, který je indukovatelný, konstitutivní, obecný nebo tkáňově specifický, nebo jejich kombinaci. Výhodně transkripční faktor obsahuje fágovou polymerázu, výhodně T7, T3 nebo SP6 RNA polymerázu.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje selekční systém pro identifikaci transformace buněk nebo organismů vektorem podle vynálezu, kterýžto systém obsahuje vektor podle vynálezu, kde selekční markér . sekvenci schopnou inhibovat nebo v buňce nebo organismu, kterýžto
Výhodně je celá přitom je mezi obsahuj e zabránit nukleotidovou vytvoření známého sekvence odpovídá vytvářejícím známý sekvence sama fenotypu.
části nebo fenotyp, lokalizována orientované tak, že jsou sekvence DNA lokalizované vhodného transkripčního Alternativně nukleotidová gen j e tato expresi genu zodpovědný za nukleotidová shodná s genem tato nukleotidová schopné nimi mezi faktoru shodné promotory iniciovat dva na dsRNA transkripci po navázání promotory. která na tyto sekvence obsahuje sekvenci, je částí nebo je zcela shodná se sekvencí genu, který vytváří daný fenotyp buňky nebo organismu, a která je taková, Že po
φ φφφ integraci vektoru homologní rekombinací v chromosomu dané buňky nebo organismu inhibuje expresi dané genové sekvence vytvářející uvedený známý fenotyp. Výhodně podle tohoto provedení vynálezu nukleotidová sekvence obsahuje stop kodony dostatečné k tomu, aby zabránily translaci nukleotidové sekvence po integraci do chromosomu. Výhodně sekvence známého genu obsahuje gen sup-35 nebo jeho fragment, který je selektovatelný identifikací potomstva rostoucího při teplotě vyšší než 25°C po vneseni do mutanty C. elegans pha-1 a 123ts.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje známou genovou sekvenci obsahující gen sup-35 nebo jeho fragment, který je selektovatelný identifikací potomstva rostoucího při teplotě vyšší než 25°C po vnesení do mutanty C. elegans pha-1 a 123ts.
Ještě další aspekt vynálezu poskytuje způsob přiřazení funkce sekvenci DNA v mnohabuněčném organismu, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se a) se konstrukt obsahující daný fragment DNA klonovaný mezi dva promotory schopné iniciovat transkripci v daném mnohabuněčném organismu se vnese do mnohabuněčného organismu schopného iniciovat transkripci z daného promotoru a b) identifikuje se fenotyp mnohabuněčného organismu ve srovnání s divokým typem.
Předkládaný vynález je dále vysvětlen formou příkladů, které mají pouze ilustrativní funkci, a připojených obrázků.
Popis obrázků
Obr. 1 je nukleotidová sekvence' plazmidů PGN1 podle předkládaného vynálezu.
Obr. 2 je nukleotidová sekvence plazmidů PGN100 podle předkládaného vynálezu.
• · ·· ·· · · · * ♦ · * · · · ♦ φφ * · · · φ φ «φ • · φ · · φ«φ
4Φ ···· ΦΦ φφ* φφ
- 10 Obr. 3 je schematické znázornění vektorů a transformačních režimů použitých ve způsobech podle vynálezu.
Obr. 4 je schéma expresního vektoru použitého podle vynálezu.
Obr. 5 je schematické znázornění expresního vektoru T7 RNA polymerázy pro transkripci C. elegans.
Obr. 6 je schéma plazmidů PGN1.
Obr. 7 je schematické znázornění zlepšeného vektoru pro inhibici dsRNA kódujícího sup-35 dsRNA.
Obr. | 8 | je | schéma | expresního vektoru | použitého | k integraci do |
genomu | C. | elegans | • | |||
Obr. | 9 | je | schéma | znázorňující pozici | sekvence | (sekvencí) DNA |
vzhledem k vhodnému promotoru schopnému iniciovat z dané sekvence DNA expresi dsRNA.
Obr. 10 znázorňuje plazmid pGN108.
Obr. 11 znázorňuje plazmid pGN105.
Obr. 12 znázorňuje plazmid pGN400.
Obr. 13 znázorňuje plazmid pGN401.
Obr. 14 znázorňuje plazmid pGNUO.
Obr. 15 je schéma plazmidů pAS2 s přímým a zpětným promotorem
T7/T3/SP6.
• ·
Obr. 16 je schéma plazmidu pGAD424 s promotorem T7/T3/SP6.
přímým a zpětným
Obr. 17 je schéma plazmidu „pAS2-cyh2-HA+,both T7-final.
Obr. 18 je schéma plazmidu „pGAD424-without-FULL-ICE-BOTHT7.,
Obr. 19 a) je schéma plazmidu pGN205 a b) je schéma plazmidu pGN207.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad A
Konstrukce uspořádané a hierarchicky seskupené cDNA knihovny a její použití
Použitý vektor byl vektor pro E. coli nesoucí dva promotory T7 s vícečetným. klonovacím místem (MCS) ležícím mezi nimi. Promotory byly orientovány navzájem směrem proti sobě v blízkosti MCS. V přítomnosti T7 RNA -polymerázy, exprimované v E. coli, C. elegans nebo jiném organismu, dochází k produkci RNA z obou T7 promotorů. Jelikož jsou promotory orientovány navzájem opačně, z DNA vložené (klonované) do MCS mezi oba promotory se tvoří RNA a vzniká tak dvouřetězcová RNA (dsRNA) po navázání T7 polymerázy.
cDNA knihovna C. elegans byla připravena odborníkovi známým standardním způsobem a vložena do MCS.. Pak byla transformací vnesena do E. coli a výsledné E. coli byly kultivovány a uschovány na 96jamkových destičkách. V tomto stadiu může být plazmidová DNA isolována a uskladněna také na
96jamkových destičkách organizovaných odpovídajícím způsobem jako kolonie E. coli. Přibližně 100 000 kolonie E. coli bylo testováno. Při tomto postupu knihovna obsahuje 5 x celkovou exprimovanou cDNA z C. elegans, což poskytuje značnou možnost, že v knihovně jsou přítomny i sekvence s nízkou hladinou exprese. Výsledkem bylo 1041 destiček s 96 jamkami. Destičky byly hierarchicky seskupeny podle potřeby. Pro seskupení klonů byly uspořádány do matice 10 x 100. Jestliže hierarchické seskupování je po 8 nebo 12 (což je nejpohodlnější, neboť destička představuje mřížku 8 x 12), pak dostaneme asi 87 destiček čili 83.52 jamek. Jestliže hierarchické seskupování je po. 96 jamkách, což je právě plná destička, pak to vede k 11 destičkám a tudíž 1041 jamkám. V kterémkoliv.stádiu hierarchického seskupování lze izolovat plazmidovou DNA, což je méně pracné a spotřebuje se méně destiček, ale na druhé straně to vede ke ztrátě komplexity, ačkoliv to neplatí pro případ seskupování po 12. Seskupování lze také provádět s původní DNA. Následující pokusy ukazují, jak bylo provedeno seskupování jak DNA tak E. coli knihovny.
Uspořádaná knihovna pro RNAi technologii nesoucí všechny geny z genomu C. elegans a její použiti
Jelikož už je dokončován projekt sekvencování celého genomu, lze využít tyto informace při aplikacích T7 RNA inhibiční technologie. Každý gen z genomu C. elegans může být tudíž klován pomocí PCR techniky. Výhodně lze klonovat exony s nejmenší délkou 500 bp. Pokud jsou exony příliš malé, menší fragmenty lze izolovat pomocí PCR, nebo dokonce i částí intronů a sousední exony lze izolovat užitím PCR, takže, je klonována alespoň dostatečná část translatovaného úseku. Pro tento účel bylo potřeba provést alespoň 1700 jednotlivých PCR reakcí. Tato kolekce PCR produktů pak byla klonována do T7 vektoru jak byl popsán (obsahuje 2 promotory orientované navzájem proti sobě a mezi nimi vicečetné klonovaci místo). Každý PCR produkt byl klonován nezávisle, nebo byl využit ke generování náhodné knihovny, analogické popsané cDNA knihovně. Když se každý PCR produkt klonoval jednotlivě, je možné pak seskupovat výsledné bakterie a plazmidovou DNA různými způsoby. Za prvé, kolekci jednotlivě klonovaných PCR produktů ve vektoru T7 je možné seskupit náhodně, jak je popsáno pro náhodnou knihovnu. Seskupení je také možné provést racionálnějším způsobem. Tak např. je možné geny C. elegans analyzovat moderními nástroji bioinformatiky (tzv. biologie in silico) . Různé geny z genomu patří do nějaké genové rodiny nebo mají v genomu homology. Takže se seskupí členy genové rodiny nebo homologní členové. Tímto způsobem se počet 1700 klonů zredukoval na podstatně přijatelnější počet. Taková, knihovna se pak může užít pro screening· fenotypu způsobem podle vynálezu. Výsledný fenotyp poskytuje funkční popis genu nebo genové rodiny nebo homolognich genů z genomu. C. elegans. Jelikož knihovna sestává z alespoň . části každého genu, tento způsob umožňuje popis celého genomu ve funkčněfenotypových termínech. Pro tento účel je třeba do červa, resp. hlístice vnést dvou.řetězcovou RNA (dsRNA) . Toto vnesení klonů ať už samotných nebo seskupených klonů,, ať už náhodným nebo racionálním způsobem, lze provést několika různými způsoby, jak je zde popsáno.
Příklad vektoru pro expresi dvouřetězcové RNAi
Pro tento účel se může užít jakýkoliv vektor obsahující promotor T7 a vicečetné klonovaci místo (existuje' mnoho komerčně dostupných vektorů těchto vlastností). Byly navrženy oligonukleotidové primery obsahujíc T7 promotor a reverzní komplementární řetězec, oba s vhodným zakončením. Tyto primery mohou být hybridizovány, a pokud byly dobře navrženy, *· ·· ·· · ·· • · * · · ♦ ·· · ··
9 9 9 9 9 99 .9 9 9 9 9 9 99
9999 99 999 99999 klonovány do vybraného vektoru. Minimální sekvence promotoru T7 je následující:
TAATACGACTCACTATAGGGCGA
Ačkoliv může být pro konstrukci T7 expresního vektoru užit jakýkoliv vektor, následující příklady ukazují, jak lze dojit k tomuto cíli s vektorem pGEM-3zf(+).
- vektor pGEM-3zf(+) (Promega) byl naštěpen restrikčnimi enzymy HindlII a Sáli, primery oGNl a oGN2 byly smíchány ve finální koncentraci 1 pg/30 μΐ, přivedeny do varu a ponechány zchladnout na teplotu místnosti,
- primery byly ligovány do vektoru standardním postupem ligace. Výsledným vektorem byl pGFNl (uvedený na obr. 1), který obsahuje dva promotory T7 orientované proti sobě navzájem a mezi nimi .leží vícečetné klonovací místo.
Sekvence oligonukleotidových primerů oGNl a oGN2 byly následující:
oGNl: AGC TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG AGA AGC TT oGN2: TCG AAA GCT TCT CGC ΑΤΑ ATA GTG AGT CGT ATT AC
Příklad konstrukce knihovny
RNA může být izolována z každého organismu, který je vnímavý na RNAi. Obecně shrnuto, izolovaná RNA se kopíruje do dvouřetězcové cDNA a poté se připraví vhodný vektor pro klonování. Existuje řada postupů a také souprav pro molekulární biologii, které jsou komerčně dostupné' od mnohých firem, jako je např. Promega, Clontech, Boehringer Mannheim, BRL atd., které umožňují:
- 'izolovat RNA, případně izolovat polyA RNA (několik souprav je k dispozici), ·· ·· fcfc ··· ♦ · · · 4 ♦ ·· · ·· • · · ·· · • · · «··««· ·· ···♦ ·· «·· «· ···
- syntetizovat první řetězce cDNA pomocí AMV reverzní transkriptázy, náhodných hexamerů jako primerů a/nebo oligo(dT) primerů,
- syntetizovat druhý řetězce cDNA pomocí Rnázy H, DNA polymerázy I,
- zarovnat konce pomocí T4 DNA polymerázy,
- připojit adaptor pomocí T4 DNA ligázy,
- případně ošetřit produkt T5 polynukleotidylkinázou a
- klonovat DNA do vektoru.
Výsledná ligační směs je považována za cDNA knihovnu. Ligační směs obsahuje všechny cDNA vzniklé v proceduře ligované do požadovaného vektoru. Pro uspořádání knihovny je' potřeba ji transformací vnést do buněk E. coli.
Aplikace E. coli knihovny nebo DNA. knihovny
T7 RNA produkční kmen:
- standardním kmenem je BL21· (DE3) : F-ompT (Ion) hsds (r-m) a kmen Β E. coli λ (DE3) . Případně lze užit variantu BL21 (DE3), např. byla užita BL21 (DE3)pLysS.
- kterýkoliv jiný kmen E. coli, který tvoři T7 RNA polymerátu, který lze podle potřeby zkonstruovat. Připraví se snadno užitím fága, který je komerčně dostupný, v tomto případě byl užit vektor λΟΕβ (dostupný od firmy Promega). Téměř každý kmen E. coli může být transfekován. tímto fágem a vytváří pak T7 RNA polymerázu.
- mutanta RnázalII E. coli:
v principu jsou dostupné různé kmeny, pro první experimenty byl vybrán kmen AB3.01-105: rna-19, suc-11, bio-3, gdhA2, his95, rnc-105, relAl, spoTl, metBl (Kinder et al., Mol. Gen. Genet. 126: 53), ale existují i vhodnější kmeny.
Tento kmen byl infikován λΟΕβ a byla tak zkonstruována varianta produkující T7.
4
- 16 Hlístice C. elegans divokého typu lze pěstovat na shlucích bakterii. Bakterie exprimují T7 RNA polymerázu. To vede k tomu, že ve střevu C. elegans se nachází velké množství dsRNA, která difunduje· do celého organismu a vede k inhibici exprese. ; Tato knihovna se pak může užít pro screening několika fenotypu. Tato technika má výhodu, že detekovat relevantní . geny v určité metabolické dráze je mnohém rychlejší než užitím dosud známé technologie užívající C. elegans. navíc, pokud se najde zajímavý fenotyp, geny za něj zodpovědně se mohou snadno klonovat.
Pomocí hierarchického seskupování je možné snadno najít při druhém screeningu relevantní klon ve shluku (poolu). DNA inzert v tomto klonu se pak sekvencuje. poskytuje současně jak biochemické tak i
Kmen s různými k léčivům divokého typu C. elegans sloučeninami pro screening
Tento experiment tak genetické informace.
se může kombinovat fenotypu, rezistence a vnímavosti k léčivům. Kmen C. elegans může být mutovaný kmen a screening může být ,na zlepšený fenotyp, redukovaný fenotyp nebo nový fenotyp. Kmen C. elegans může být mutovaný kmen a screening knihovny se může kombinovat se sloučeninami.. Takže se může screenovat na rezistenci k léčivům, vnímavost k léčivům, zlepšený fenotyp, redukovaný fenotyp nebo nový fenotyp. Kmen E. coli může být jakýkoliv kmen exprimující T7 RNA polymerázu, např. kmen BL21 (DE3), ale tvorba dsRNA může být zvýšena užitím zvláštního kmenu E. coli, který je negativní na Rnázu III. Rnáza III rozpoznává specifickou kličku ve struktuře dsRNA. Může být také užit kmen E. coli, kde jsou odstraněny jiné Rnázy než Rnáza III nebo kmen E. coli, kde je odstraněna jedna nebo více Rnáz. Exprese T7 RNA polymerázyv nejznámějšleh kmenech E. coli a konstrukty, které jsou k dispozici pro vytvoření kmenů E. coli produkujících T7 RNA polymerázu, obecně obsahují indukovatelný promotor. Tímto způsobem je tvorba T7 ·· <· ·· • · · · · · · • ♦ · · ·
RNA polymerázy regulována, a tudíž je' regulována i produkce dsRNA. Výhodně je možné tuto vlastnost využit k pulznímu nakrmeni hlístic C. elegans ve specifickém růstovém stadiu. Hlístice se pěstují na ne neindukovaných, kmenech E. coli. Když dosáhnou požadovaného stadia, indukuje se v bakteriích tvorba T7 RNA. To dovoluje zkoumat funkce jakéhokoliv genu v libovolném okamžiku životního cyklu živočicha.
Prohledávání knihovny na existenci homologních nebo domněle zajímavých'lidských genů a přiřazení funkce těmto genům
Stovky genů byly . izolovány v různých projektech sekvencování genomů, expresních studiích, hybridizačních studiích' a pod. Popsaná cDNA knihovna poskytuje způsob, jak ověřit nebo vůbec přiřadit funkci těmto genům rychlým a účinným způsobem. Tak nejdříve je třeba pomocí bioinformatických nástrojů (in silico biologie) identifikovat homolog nebo homology genu v C. elegans. Připraví se PCR primery a pomocí PCR se pak izolují fragmenty DNA. PCR se může provádět po hierarchickém seskupení. Pozitivní shluk nebo jednotlivá jamka obsahující bakterie poskytující pozitivní signál se pak poskytne jako potrava C. elegans a vyhodnocuje se požadovaný fenotyp.
PCR se také může provádět na DNA izolované z C. elegans. Výsledná DNA se může klonovat do T7 vektoru a transformaci vnést do kmenu E. coli produkujícího T7 RNA polymerázu, který , je pak jako potrava poskytnut C. elegans. V závislosti na tom, co je rychlejší a spolehlivější se vybere vhodný způsob.
» Pokud gen patří do genové rodiny, poskytne se směs bakterií jako potrava C. elegans. Každá z bakterií nese část člena genové rodiny, přitom kmeny E. coli, růstové podmínky, kombinace sloučenin jsou stejné jak byly popsány výše.
Pokud se užije racionálně uspořádaná knihovna, kde jsou klonovány všechny geny C. elegans a organizovány
44 44 · 4··
4444 44444
4 4 44 4 4 44 ♦ 4 4 4 4 4444
4444 ·· 444 44444 . . - 18 strukturovaným způsobem, homology C. elegans a případně další homology, ortology a členy genové rodiny lze vystopovat snadno v této knihovně užitím přístupu biologie in silico. V takovém kroku se neužívá PCR a izolují se bakterie nebo přímo DNA, na kterých se pak pěstuje C. elegans.
Následující série experimentů byla provedena k otestování RNAi vektorů a různých kmenů E. coli, které byly připraveny
1. Konstrukce testovacího plazmidu
Lze použít jakoukoliv cDNA, která poskytuje jasný fenotyp, když je vyřazena u C. elegans nebo použita při RNAi experimentu. Je známo, že např. unc-22 je dobrý kandidát, ale mnoho dalších genů je také vhodných. V tomto pokusu byl vybrán citlivý systém, který je možné užít ještě v pozdějších stadiích. Systém byl testován se sup-35 na pozadí pha-1. Exon 5 genu sup-35 byl izolován pomocí PCR a byl klonován do vektoru pGNl a promotorem T7. Výsledný vektor byl označen pGN2. Mutanta pha-1 (e2Í23) C. elegans netvoří potomstvo při teplotě vyšší než 25 °C, což je způsobeno vývojovou poruchou v embryogenezi. Když je vyřazen (systémem „knock-out) nebo inhibován gen sup-35 u tohoto kmenu, vytváří se potomstvo i v této teplotě. Kombinace mutanty pha-1 a sup-35 RNAi je tedy dobrý testovací systém.
2. Testování RNAi pomoci kmenu E. coli produkujícího.dsRNA pGN2 byl vnesen do E. coli BL21 (,DE3) a byla indukována T7 RNA polymeráza pomocí IPTG. Kmen C. elegans phal (e2123) byl inokulován na tyto bakterie a pěstován při teplotě 25 °C. Jelikož jde o mutantu s embryonální poruchou při této teplotě, nedochází ke vzniku potomstva. Když je gen
·· ·· • · · · | • · · • · ·· | • · · • · · · |
• · · | e · * | « « « |
·· ···· | ·· ·♦ · | ·· ··· |
sup-35 účinně inhibován dsRNA přítomnou v E. coli, potomstvo vzniká.
- pGN2 byl vnesen do E. coli kmenu AB301-105 (DE3) a byla indukována T7 RNA polymeráza pomocí IPTG. C. elegans kmen pha-1 (e2123) byl inokulován na tyto bakterie a pěstován při teplotě 25 °C. Jelikož jde o mutantu s embryonální poruchou při této teplotě, nedochází ke vzniku potomstva. Když je gen sup-35 účinně ' inhibován dsRNA přítomnou v E. coli, potomstvo vzniká.
3. Zlepšení kmenu C. elegans, aby lépe přijímal dsRNA
Před inokulací C. elegans na bakterie E. coli, které produkují dvouřetězcovou sup-35 RNA, byla provedena mutageneze C. elegans pomocí EMS (ethylmethylsulfonová kyselina) a potomstvo takto mutovaných C. elegans bylo inokulováno na bakterie. C. elegans živené těmito bakteriemi poskytly větší potomstvo, které obsahovalo mutaci, vedoucí ke zlepšenému příjmu dsRNA, a které bylo vhodné pro použití .v dalších experimentech.
Trvalá integrace vektoru produkujícího dsRNA do genomu C. elegans tvořící T7 RNA polymerázu
Byl zkonstruován vektor pro E. coli nesoucí následující znaky: dva promotory T7 orientované proti sobě navzájem, a restrikční místo nebo vícečetné klonovací místo ležící mezi těmito promotory. Navíc tento vektor může obsahovat genomovou DNA sup35 z C. elegans upravenou tak, že obsahuje několik stop kodonů v různých intervalech, takže ze sup35 genomového fragmentu nemůže být tvořen protein plné délky, jak je znázorněno na obr. 8. Jakákoliv cDNA nebo fragment cDNA mohou být klonovány do vícečetného klonovacího místa mezi dva
promotory T7. Když je tento vektor vnesen do kmenu C. elegans, který exprimuje T7 RNA polymerázu, cDNA nebo její fragment se transkribuje a vytváří dsRNA.
Tento vektor je navržen pro použití s mutantou C. elegans pha-1 (e2123), která exprimuje T7 RNA polymerázu. Exprese T7 RNA polymerázy může být konstitutivní, regulovaná, všeobecná nebo tkáňově specifická. Tyto mutanty C. elegans pha-1 (e2123) netvoří potomstvo při teplotě vyšší než-25 °C vzhledem k vývojovým problémů v embryogenezi. Když je gen sup-35 účinně inhibován nebo vyřazena jeho funkce („knock-out) , pak potomstvo vzniká.
Když se vektor vnese do C. elegans, integruje se homologní rekombinací (integrací Campbellova typu). Bylo prokázáno, že k homologní rekombinací u C. elegans dochází, i když s nízkou frekvencí (Plasterk a Gronen, EMBO J. 11: 287-290, 1992). Homologní rekombinace v genu sup35 povede k vyřazení funkce genu, neboť dva vzniklé geny sup35 ponesou stopkodony. Výsledné organismy C. elegans a jejich potomstvo, pokud k této rekombinací dojde ve vajíčku, budou mít kopii vektoru integrovanou ve svém genomu. Selekce se provádí tím, že pouze organismy s vyřazenou funkcí sup35 mají potomstvo při teplotě vyšší než 25 °C. Kromě toho výsledné C. elegans trvale produkují dsRNA z fragmentu DNA klonovaného mezi dva promotory T7. Tento kmen C. elegans lze považovat za transgenní kmen s redukovanou funkcí genu, jehož fragment byl klonován mezi dva promotory T7.
. . DNA lze přenést do C. elegans různými způsoby, včetně injekce, balistickou transformací, inkubací v roztoku DNA » nebo podáváním bakterií v potravě. Také lze uvažovat o nových metodách, které zvyšují účinnost transformace.
Cílový kmen C. elegans může navíc obsahovat i další mutace kromě pha-1 mutace (e2123) a exprimovat i jiné geny než T7 RNA polymerázu.
Příklad B ·· ·· ·· · ·· • · · · · · ·· · · · • · ···· · · • · · ··· ·· ·· ···· ·· ··· ··
Kvasinkový dvouhybridní vektor pro RNAi
Může být zkonstruován kvasinkový dvouhybridní RNAi vektor nesoucí dva promotory T7. Takové vektory jsou určeny pro replikaci jak v kvasinkách tak v E. coli. Obecně cDNA knihovny pro kvasinkový dvouhybridní systém se připravují ve vektorech Gal4 nebo LexA. Knihovna se konstruuje ve vektoru, který · má aktivační doménu jednoho z těchto genů. Může se zkonstruovat takový vektor, který je vhodný pro dvouhybridní screening a který také obsahuje, dva promotor T7 orientované proti sobě s vícečetným klonovacím místem mezi nimi. Uspořádání sekvencí v plazmidu pak bude „kostra plazmidu, (Gal4-T7), MCS, T7, kostra. cDNA knihovna C. elegans konstruovaná s tímto vektorem může být . použita jako standardní kvasinková dvouhybridní knihovna v experimentu, jehož cílem je izolovat protein interagující s daným proteinem. Jakmile je jednou klon izolován, plazmid může být vnesen do buněk kmenu E. coli produkujícího T7 RNA polymerázu, a který tudíž bude produkovat dsRNA z klonovaného fragmentu. Bakterie produkující dsRNA se pak podá jako potrava C. elegans a vyhodnotí se výsledný fenotyp. Stejně jako v předchozích příkladech, tato ověřovací procedura pro nově izolovaný dvouhybridní kvasinkový klon je podstatně kratší .než standardní postup,, který vyžaduje PCR a/nebo klonovací kroky, experimenty s RNA a/nebo „knock-out experimenty. Ve většině případů jsou izolované klony nejdříve sekvencovány, a na základě sekvence se rozhodne, zda se bude pokračovat s dalšími experimenty. Každý klon izolovaný v popisovaném experimentu může být snadno vnesen do vhodných buněk E. coli a pak podán jako potrava C. elegans. Ověřeni se pak provede analýzou fenotypu.
- 22 Pro aplikaci tohoto postupu byl připraven kvasinkový dvouhybrid se známým genem jako „návnada a nově konstruovaná knihovna jako „cíl. Proteiny kódované cílovými klony (tj. klony z knihovny), které interagují s návnadovým proteinem, vedly k pozitivním kvasinkovým klonům exprimujícím reportérovou molekulu, jako je např. LacZ pozorovatelná po obarveni X-gal. Plazmid kódující cílový protein je izolován přímo z kvasinkového kmenu a vnesen do E. coli'. E. coli je přitom ken E. coli produkující T7 RNA polymerázu. V takovém případě se pak z DNA klonované do klonovacího místa ve vektoru tvoří dsRNA. Pokud se tato dsRNA jako potrava poskytne C. elegans způsobem popsaným výše, dojde k inhibici genu C. elegans a výsledkem je určitý fenotyp.
- Tento kvasinkový dvouhybridní vektor se může výhodně použít ke konstrukci uspořádané a hierarchicky seskupené knihovny, jak bylo popsáno v předchozím příkladu.
- Může být zkonstruován kvasinkový kmen, který podmíněně produkuje T7 RNA polymerázu. Po experimentech s kvasinkovým dvouhybridním systémem může být indukována exprese T7 RNA polymerázy, což vede k produkci dsRNA v kvasinkách. Následně pak lze podat kvasinky jako potravu pro C. elegans. Bylo prokázáno, že C. elegans se může živit kvasinkami.
Konstrukce kmenu produkujícího T7 RNA polymerázu a jeho aplikace
Může být připraven kmen C. elegans exprimující T7 RNA polymerázu. Exprese může být všeobecná a konstitutivní, ale také může být regulovaná tkáňově specifickým promotorem, indukovatelným promotorem nebo časově specifickým promotorem, a nebo promotorem, který nese jednu z těchto charakteristik a nebo kombinuje více těchto charakteristik. DNA se vnese do kmen C. elegans. To se provede buďto injekcí, vstřelením mikročástic, elektroporací nebo jak bylo popsáno výše ···
- 23 ·· ·· ·· • · · · »· • · · ·· φ · · · ·· • · · · · ·· ···· ·· zkrmenim vhodných bakterií nebo kvasinek. Pokud je DNA plazmid, jaký byl popsán v předchozích příkladech, tj. plazmid nesoucí klonovaný fragment DNA nebo PCR fragment mezi dvěma promotory T7, pak se v buňce nebo celém organismu tvoří dsRNA z této DNA nebo PCR fragmentu, což vede k utlumení odpovídajícího genu. Vnesená DNA se může projevit dočasným utlumením genu. Vnesená DNA může vytvořit extrachromosomální strukturu, která může vést ke katalytickému vyřazení genu nebo redukci funkčního fenotypu. Plazmid se také může integrovat do genomu organismu, což vede ke stejnému vyřazení genu nebo redukci funkčního fenotypu, ale tyto změny jsou trvale přenosné.
- Plazmidová DNA nesoucí cDNA nebo její část nebo EST fragment nebo PCR fragment, z C. elegans klonovaný mezí dva promotory T7, jak bylo popsáno v příkladech A a B, může být vnesena standardním způsobem do C. elegans bez T7 RNA polymerázy a pak se analyzují fenotypy.
DNA z uspořádané nebo seskupené knihovny jako v příkladu A může být vnesena standardním způsobem (injekcí, vstřelením mikoročástic) do C. elegans bez T7 RNA polymerázy a pak se analyzují fenotypy. S hierarchickým uspořádáním lze snadno najít původní klon.
Stejný postup lze užít s mutantou C. elegans exprimující T7' RNA polymerázu. Pak se provádí screening na rozšířený, redukovaný nebo nový fenoťyp.
Postup lze užít k provádění screeningu sloučenin. Screening se provádí buďto s kmenem divokého typu nebo s mutovaným kmenem na rozšířený nebo nový fenotyp.
- DNA lze vnést do C. elegans novým způsobem. Jedním z nich je vnesení prostřednictvím E. coli. V takovém případě je jako potrava pro C. elegans podána hierarchicky uspořádaná knihovna. Aby se zabránilo strávení E. coli DNA ve střevu hlístice, je výhodné užít kmen C. elegans deficitní na Dnázu, jako jé např. kmen nuc-1 (el392). Tato metoda se jeví jako • ·
velmi zajímavá, neboť je nezávislá na transformační účinnosti jiných metod a je obecně rychlejší a méně pracná.
2) Předpokládané zlepšení metody
- Byl navržen vektor nesoucí cDNA sup-35 nebo její část, klonovanou mezi dva T7 promotory sup-35 nebo její část, klonovanou mezi dva T7 promotory, přičemž zbytek vektoru je stejný jak byl popsán v příkladech A a B. Tento vektor může být vnesen do mutanty C. elegans phalts. V takovém případě pak existuje teplotní selekční systém a jedině ty C. elegans, které přijaly cDNA a tudíž exprimují dsRNA sup35, přežívají za restriktivní teploty. Hierarchicky uspořádaná knihovna je vnesena kterýmkoliv z.výše popsaných způsobů.
- Vektor může být užit ke konstrukci knihovny, které je pak vnesena do E. coli exprimujici T7 RNA polymerázu. V tomto případě jde o stejný screening jako v příkladu A s dodatečným screeningem na C. elegans, kde dsRNA sup-35 je aktivní.
- DNA a/nebo dsRNA sup-35 mohou být vneseny na různých plazmidech. Jak při krmení DNA (příklad C) tak i při krmeni dsRNA (příklady A a B) , tyto dva plazmidy jsou přítomny v jedné bakterii nebo se C. elegans krmí směsi bakterií, z nichž jedna nese konstrukt sup-35.
Přiklad konstrukce C. elegans produkující T7 RNA polymerázu
Existuje několik možností přípravy T7 RNA polymerázy v C.. elegans. T7 RNA polymeráza může být exprimována pomoc různých promotorů, ať už konstitutivních, indukovatelných, všeobecných, tkáňově specifických nebo jejich kombinací. K příkladům takových promotorů patří promotor proteinu tepelného šoku hsp-16, střevní promotor gesl, promotor cet858, ale také promotor dpy7 a promotorový element GATA1. V tomto příkladu je T7 RNA polymeráza exprimována pod «' · t · e ·· • · ·
- 25 kontrolou promotoru hsp-16, který je dostupný ve vektoru pPD49.78. T7 polymeráza je izolována pomoci PCR užitím oligonukleotidových primerů GN3 a GN4.
Výsledný PCR produkt je štěpen restrikčními enzymy Nhel a Ncol stejně jako vektor, do kterého se má klonovat, což je vektor Fire pPD49.78. Vzniklý vektor je pGNIOO ilustrovaný na obr. 2. Sekvence primerů byly následující: oGN3: CAT GGC AGG ATG AAC ACG ATT AAC ATC GC, 0gn4: ATG GCC CCA TGG TTA CGG GAA CGC GAA GTC CG.
Vektor byl vnesen do C. elegans standardním postupem, tj. mikroinjekcí.
Takto byly připraveny následující kmeny:
- divoký typ (pGNIOO)
- nuc-1 (el392) (pGNIOO)
- pha-1 (e2123) (pGNIOO).
- pha-1,nuc-1 (pGNIOO)
Všechny tyto kmeny jsou schopny produkovat T7 RNA polymerázu po teplotní indukci nebo alternativně po indukci těžkými kovy jako např. po aplikaci těžkého kadmia nebo rtuti. Procedura teplotní indukce je jednoduše přenesení C. elegans do teploty 30 až 33 °C alespoň na 1 hodinu a pak zpět do standardní teploty (15 až 25 °C).
Kmen divokého typu produkující T7 RNA polymerázu může být použit k produkci jakékoliv RNA v C. elegans. Konkrétně řečeno, plazmidy z výše popsaných knihoven se vnesou do C. elegans a pak se vyhodnotí fenotypy.
Mutanta nuc-1 C. elegans se užívá tak, že se DNA vnáší prostřednictvím bakterií, které jsou potravou pro C. elegans. Jelikož mutanta nuc-1 neštěpí DNA, plazmid může projít střevní stěnou. Pokud se dostane do buněk, které tvoří T7 RNA polymerázu, produkuje se dsRNA, která inhibuje gen, z něhož je RNA transkribována.
Mutantní kmen pha-1 C. elegans, který tvoří T7 RNA polymerázu, může být použit ke zlepšení postupů popsaných • · · · · · • · · · ♦ • · · • · · · • · · výše. DNA může být vnesena vstřelenim, injekcí nebo ;
Konkrétně se tento kmen užívá s vektory, podáním v potravě. Konkrétně se tento kmen užívá s vektory, které tvoří dsRNA z genu sup-35 a požadovaného genu, kterým je PCR produkt, cDNA nebo knihovna, jak byla výše popsána.
Mutanta pha-1, nuc-.l produkující T7
DNA prostřednictvím produkuj e kmen tvoří užívá pro vnášení výhodně plazmid, a požadovaného genu, především v trávicím když se C. elegans uvedený plazmid.
který
Tento traktu.
podává
Aplikace RNAi
Hlistice rostlinách a . technologie aby se hlísticemi.
RNA polymerázu se bakterií. .DNA je dsRNA ze sup-35 T7 RNA polymerázu
K.přenosu DNA výhodně jako potrava bakterie technologie na rostlinách (nematoda) zodpovídají zejména na zemědělských podle vynálezu mohou být zabránilo poškozování V prvním kroku rostlině izoluje fragment DNA, ' nebo růst červa nebo pro za značnou část dochází, nesoucí
Jakýkoliv gen, .jehož tento účel.
. Část tohoto genu, DNA se klonuje tak, promotorem, výhodně Klonovaná DNA řízená i exprese škod na plodinách. Postupy RNAi využity, na rostlinách, rostlin parazitickými se z hlistice parazitující na který je kritický pro přežití jeho výživu či proliferaci. je esenciální, je vhodný pro exon nebo vnese do požadované transgenních rostlin, může užít jiný úsek DNA potřebný jiný promotor.
Kořen rostliny pak klonovaného úseku DNA, cDNA se klonují. Fragment řízen tkáňově specifickým specifickým promotorem, kořenově 1 specifickým promotorem se pak rostliny, a sice postupy
Pro každou paraziťickou a podobně pro každý druh aby byl kořenově technologie hlístici se rostliny je produkuje RNA nebo dsRNA pokud byl užit kořenově z vneseného specifický promotor.. Jelikož hlistice parazituje na rostlině, RNA nebo dsRNA je spolknuta a/nebo strávena hlistici. RNA nebo dsRNA se pak dostane do buněk hlistice, kde zahájí své inhibični působení na cílové DNA. V závislosti na povaze klonovaného úseku DNA z hlistice, hlistice buď není schopna přežití, výživy, množeni atd., což zabrání dalšímu parazitování hlistice na rostlině a ochrání rostlinu.
Konstrukce C. elegans produkující T7 RNA polymerázu
Aby bylo dosaženo produkce T7 RNA polymerázy nebo jiné RNA polymerázy u živočicha, případně hlistice, a konkrétně C. elegans, je možné zvolit několik přístupů. T7 RNA polymerázy může být exprimována pomocí, různých promotorů. K takovým
promotorům všeobecné kombinace. | patří indukovatelné a tkáňově specifické | promotory, promotory | konstitutivní, nebo jejich |
Příklad 1 | |||
Konstrukce | základního vektoru pro | expresi T7 | RNA polymerázy |
v C. elegans
Kódující sekvence T7 RNA polymerázy byla amplifikována pomocí PCR z kCE6 (Novagen, Madison, USA) užitím oligonukleotidových primerů:
OGN25 (ATGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG) a
OGN46 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC) standardním postupem PCR (viz „PCR, A Practical Approach, Ed.
J. McPherson et al., IRL Press, 1993). Výsledný fragment DNA kódující T7 RNA polymerátu byl štěpen restrikčními enzymy Agel a EcoRI a vložen do vektoru Fire pPD97.82 naštěpeného před tím také Agel a EcoRI. Výsledný konstrukt kódující otevřený čtecí rámec pro T7 RNA polymerázu fúzovaný ·· ·· · · · • · · · · · ·· • · v · ·· • 9 9 '·· • · ·«·999 s jaderným lokalizačním signálem (NLS) velkého T antigenu SV40 s aminokyselinovou sekvencí MTAPKKKRKVPV. Sekvence jaderného lokalizačního signálu je potřebná pro přemístění T7 RNA polymerázy z cytoplazmy do jádra, kde je pak schopna vázat se na svůj specifický promotor, tj. T7 promotor. Směrem „upstream (proti směru transkripce) od kódující sekvence fúzniho proteinu T7 polymerázy leží minimální promotor (myo-2) , před kterým je' ještě vicečetné klonovaci místo (MCS) , do kterého lze vložit promotory pro C. elegans. Tento plazmid (pGN105 uvedený na obr. 11) je základní plazmid s T7 RNA polymerázou, který umožňuje expresi T7 RNA polymerázy v C. elegans. Různé deriváty tohoto plazmidu, kde do vícečetného klonovaciho místa jsou vloženy promotory, dovolují indukovatelnou, konstitutivní, všeobecnou nebo tkáňově specifickou expresi T7 RNA polymerázy v C. elegans, neboť exprese je pak regulována promotorem klonovaným do vícečetného klonovaciho místa.
Následující promotor jsou známy tím, že indukují expresi v uvedených tkáních (přičemž tento výčet rozsah předkládaného vynálezu nijak neomezuje):
let-858 (všudepřítomná exprese), myo-2 (exprese v hltanu), myo-3 (exprese ve svalovině tělní stěny), egl-15 (exprese v děložním svalu) a unc-119 (ve všech neuronech). ' Příklad 2
Konstrukce vektoru pro expresi T.7 RNA polymerázy ve svalové tkáni C. elegans
Kódující sekvence T7 RNA polymerázy byla amplifikována pomocí PCR z ÁCE6 užitím oligonukleotidových primerů:
OGN43 (GCCACCGGTGCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGC) a
OGN44 (CACTAGTGGGCCCTTACGCGAACGCGAAGTCCG)
a pak naštěpen restriktázami Agel/Spel a vložen do vektoru pGK13 předem naštěpeného také Agel/Spel. Tento vektor obsahuje silný promotor SERCA, který řídí expresi v hltanu, děložním svalu, ocasu a svalovině tělní stěny. Jaderný lokalizační signál (NLS) z velkého T antigenu SV40 byl vložen před kódující sekvenci T7 RNA polymerázy . vložením dvou překrývajících se oligonukleotidů:
OGN45 (CCGGATGACTGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGCT) a
OGN4 6 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACAT.CGC) do restrikčních míst Sacl/Agel. Výsledný konstrukt byl označen pGN108 a je uveden na obr. 10. Vnesení tohoto plazmidu do C. elegans vedlo k expresi T7 RNA polymerázy v hltanu, děložním svalu, ocasu a svalovině tělní stěny.
Pro otestování exprese a funkčnosti T7 RNA polymerázy v C. elegans řízené promotorem SERCA, byl plazmid pGN108 kódující T7 RNA polymerázu pod kontrolou SERCA promotoru injikován do
C. elegans.
Současně byl injikován testovací vektor. Tento testovací promotorem (vektor pGN401 zkonstruován vložením dvou vektor kódoval GFP řízenou T7 na obr. .13) . Plazmid pGN401 byl překrývajících se oligonukleotidů:
OGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) a
OGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT) do vektoru Fire pPD97.82 naštěpeného Sacl/Agel, čímž se vytvořil T7 promotor. Dále byl současně vnesen selekční markér pro selekci transformant (rol6, pRF4). Tento selekční vektor je odborníkům dobře znám. Transgenní rostliny generace F1 pak mohou být snadno selektovány, neboť projevují fenotyp rol6. Transgenní C. elegans· exprimují GFP v hltanu, děložním svalu, ocasu a svalovině tělní stěny. tyto údaje jasně ukázaly, že T7 RNA polymeráza byla funkčně exprimována z promotoru SERCA a že exprimovaná T7 RNA polymeráza se vázala na T7 promotor přítomný ve vektoru pGN401 a iniciovala tak transkripci genu GFP, který byl funkčně exprimován, což vedlo k fluorescenci ve svalové tkáni, kde promotor SERCA indukoval expresi T7 RNA polymerázy.
Přiklad 3
Konstrukce vektoru pro všudypřítomnou expresi T7 RNA polymerázy v C. elegans
Fúzní gen NLS-T7 RNA polymeráza byl izolován z pGN108 vyštěpením XmaI/Bspl201 a klonován do vektoru Fire pPD103.05 naštěpeného také XmaI/Bspl201. Tím byl připraven vektor, kde T7 RNA polymeráza byla klonována tak,, že její exprese je řízena promotorem let858. Tento specifický promotor umožňuje expresi T7 RNA polymerázy ve všech tkáních. Výsledný plazmid byl pojmenován pGNl10 (je uveden.na. obr. 14) .
Příklad 4
Konstrukce vektoru pro expresi DNA fragmentů, genů a cDNA řízenou T7 promotorem a zprostředkovanou T7 RNA polymerážou
Vektor Fire pPD97.82 byl štěpen restriktázami Sacl/Agel a sekvence T7 promotoru byla vytvořena vložením překrývajících se oligonukleotidů:
OGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) a
OGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT) do restrikčního místa Sacl/Agel.· Konstrukt (pGN400 na obr. 12) obsahuje otevřený čtecí rámec pro GFP klonovaný mezi mezi restrikční místa Sací a EcoRI, řízený promotor T7. Do místa vzniklého vyjmutím genu GFP jakožto Agel/SacI fragment lze klonovat do vektoru jakýkoliv požadovaný fragment DNA nebo cDNA. Výhodně -je požadovaný fragment DNA připraven
- 31 pomoci amplifikace v PCR, kdy jsou místa Sacl/Afel vložena do oligonukleotidových primerů. Fragment po PCR je naštěpen a gen GFP z pGN400 je nahrazen amplifikovaným fragmentem, jakýkoliv vektor, který obsahuje T7 promotor, může být použit pro expresi indukovanou T7 RNA polymerázou v C. elegans, např. komerčně dostupné vektory pGEM a pBluescript. To bylo demonstrováno pomocí vektoru pGN401, který vedl k expresi GFP pod kontrolou T7 promotoru v transgenní C. elegans exprimující T7 RNA polymerázu.
Použití vektoru pGN400 mělo tu výhodu, že vektor obsahuje 3'UTR fragment (netranslatovaný fragment 3'-konce) z unc-54, který zvyšuje transkripční stabilitu RNA.
Příprava permanentní tkáňově specifické „pseudo knock-out RNAi linie C. elegans
V současnosti se linie s vyřazenou funkcí genu, tzv. knock-out u C. elegans získávají po náhodné mutagenzi ve velkém rozsahu a následnou selekcí pomocí PCR. tato metoda je velmi rozsáhlá, časové náročná a zdlouhavá. Bylo popsáno, že vnesení dvouřetězcové RNA do buňky vede k silnému a specifickému narušení exprese endogenního genu. U C. elegans může být exprese potlačena injekcí RNA do tělní dutiny, nebo inkubací C. elegans v roztoku obsahujícím dsRNA nebo tak, že se jako potrava pro C. elegans podává E. coli exprimující dsRNA odpovídající požadované DNA. Buňky C. elegans mají schopnost přijímat dsRNA z extracelulárního prostředí. Bylo popsáno, že mRNA je cílem tohoto genetického zásahu, zprostředkovaného dsRNA (Montgomery a Fire, 1998). Bylo také navrženo, že cílová RNA je degradována v jádru ještě před tím, než dojde k translaci. Ačkoliv snížení genové exprese zprostředkované RNAi. se může přenášet na následující generace, dědičnost je špatná a účinek se rychle ztrácí v průběhu dalších generací. To je způsobeno pravděpodobně »· ···· * · · · · 4 44,4
4 4 4 4 4·
9 · · · ·♦··
4 4 4 4 4 4 44
4444 44 44444 44
- 32 postupným snižováním zásoby dsRNA. V popisovaném experimentu je navržena metoda, jak zkonstruovat linii C. elegans s permanentním dědičným RNAi fenotypem. Tato metoda obsáhuje vytvoření transgenní linie C. elegans vnesením plazmidu obsahujících fragmenty cDNA cílového genu v sense a antisense orientaci pod kontrolou promotoru C. elegans nebo transkripční invertované repetice cDNA z jediného konstruktu. Alternativně je dsRNA transkribována z vektor nesoucího cDNA obklopenou dvěma T7 promotory v kmenu C. elegans,· který exprimuje T7 polymerázu. Výsledkem je transgenní C. elegans se stálým dědičným „pseudo knock-out fenotypem. Exprese cDNA nebo T7 RNA polymerázy může být všeobecná, a konstitutivní nebo může být regulovaná tkáňově specifickým promotorem. Proti RNAi indukované externí dsRNA (vnesené injekcí, inkubaci v roztoku nebo potravou) tato metoda umožňuje získat podmíněnou, tkáňově specifickou inhibici genové exprese.
Inhibice exprese unc-22 pomocí. RNA vede ke „škubajícímu („twitching) fenotypu
Unc22 cDNA (exon 22) byla klonována v sense a antisense orientaci do vektoru pPD103.05 (A.Fire č. L2865) obsahujícího promotor let858, který je schopen exprimovat sekvence RNA ve všech tkáních. Výsledné plazmidy byly označeny pGN205 (viz obr. 19a) a pGN207 (viz obr. 19b) . Tyto konstrukty byly vneseny do C. elegans společně se selekčním markérem (rol6,GFP). Transgenní jedinci generace F1 (exprimující rol-6 nebo.‘GFP) projevovali „škubající („twitching) fenotyp, což ukazuje, že RNAi může být zprostředkována endogenní transkripcí RNA z transgenní DNA. Fenotyp RNAi kosegregoval se selekčním, markérem v dalších generacích. Tak byla vytvořena linie C. elegans s permanentním RNAi fenotypem.
- 33 • 9 · · · ·· • ♦ · · ♦ * · · • · · . · · · • « » · « · · • · 9 + 99 9 99
9999 99 999 *·999
Příprava stabilní linie s T7 RNA polymerážou a dvojitě transgenní C. elegans
Expresní systém v C. elegans založený na exogenní RNA polymeráze vyžaduje dva plazmidy. Jeden kóduje RNA polymerázu pod kontrolou specifického promotoru, zatímco, druhý kóduje fragment DNA, který má být exprimován, pod kontrolou T7 promotoru.
V případě semistabilní RNAi nazývané také „pseudostabilní knock-out je požadovaná DNA klonována mezi dva T7 promotory, takže je pak produkována dsRNA.
Jelikož expresní systém T7 RNA polymerázy je znám tím, že jde o systémem s vysokou expresí, vznikají problémy při vytváření dvojitě transgenních organismů. Když je gen, který má být exprimován v hlístici C. elegans toxický, má letálni účinek a důsledkem je konstrukce C. elegans bez vysoce regulované stabilní exprese požadovaného genu. Pokud je požadovaný gen esenciální pro ' přežití organismu, RNAi s fragmentem DNA z tohoto genu vede také k letálnímu účinku, takže pseudostabilní knock-out není možný.
K překonání uvedeného problému původci předkládaného vynálezu navrhli systém sestávající ze dvou transgenních organismů. První organismus je transgenní na T7 RNA polymerázu, přičemž tato T7 RNA polymerázy může být exprimována ve všech buňkách nebo jen ve specifických buňkách nebo tkáních, jak bylo ukázáno v předchozích příkladech. Druhý transgenní organismus je transgenní na požadovaný fragment DNA. To může být cDNA spojená s T7 promotorem, nebo pokud je cílem provedení RNAi, pak DNA fragment příslušného genu klonovaný mezi dva T7 promotory.
Oba dva transgenní organismy byly životaschopné a neprojevovaly žádné aberantni. fenotypy. A to proto, že T7 RNA polymeráza exprimovaná v prvním organismu není toxická pro tento organismus, dokonce ani tehdy, je-li exprimována ve vysoké hladině. V druhém transgenním organismu požadovaný gen
4 4 | • 4 | • · | 4 | 4 4 | |||
4 | 9 | « 4 | 4 | 4 | • 4 | • | 4 · |
• | 4 | • | 4 | • | 4 | • | e |
4 | |||||||
4 | 4 | • | • | 4 | 4 | 4 | 4 |
• 9 | ·♦·· | 4 · | 999 | 4 4 | 4 |
není exprímován nebo dsRNA není produkována, jelikož tento organismus neobsahuje T7 polymerázu.
Exprese, požadovaného genu nebo cDNA nebo RNAi s fragmentem DNA může pak být dosaženo spářením dvou transgenních organismů. Takové potomstvo je pak dvojitě transgenní a exprimuje požadovaný gen nebo exprimuje dsRNA z fragmentu požadované DNA.
Pro vytvoření dostatečného počtu samců pro takové páření,, jeden z transgenních organismů je samčí mutanta' C. elegans s fenotypem . upřednostňujícím vznik samců. Příkladem takové mutanty je mutanta him-5. Výhodně je tato mutanta užita k přípravě transgenní C. elegans s T7 RNA polymerázou, . zatímco hermafrodiťní C. elegans nese DNA fragment kontrolovaný T7 promotorem.
Pro účinnou selekci dvojitě transgenního potomstva může být do druhého organismu vnesen druhý transgen. Tento transgen obsahuje reportérový gen pod kontrolou T7 promotoru. Reportérovým genem může být GFP, luciferáza, β-galaktozidáza nebo β-laktamáza. Příkladem takových trarisgenů jsou vektory pGN400 a pGN401.
Pro získáni indukovatelné, tkáňově specifické exprese transgenu v C. elegans byla připravena zásoba samců (tj. him-5) nesoucích konstrukt T7 ΈΝΑ polymerázy pod kontrolou různých promotorů C. elegans, které umožňují tkáňově specifickou expresi. Tito samci pak byly pářeni s hermafrodity nesoucími požadovaný gen pod kontrolou T7 promotoru.
Dále mohou být transgeny integrovány organismu. V. odborné literatuře byly popsány dosažení stabilní integrace plazmidu do genomu do genomu metody pro (Methods in
Cell Biology, Vol. 48, 1995, ed. Epstein a Shake, Academie Press) a jejich součástí je ozařování organismů. Tak lze ošetřit oba typy organismů, ale výhodně se ošetřuji organismy
- 35 exprimující T7 RNA polymerázu. Tím se připraví kolekce hlístic C. elegans, které trvale exprimují T7 RNA polymerázu pod kontrolou různých promotorů. K příkladům takových promotorů patří myo-2 (exprese v hltanu), .myo-3 (exprese ve svalovině tělní stěny), egl-15 (exprese v děložním svalu), unc-119 (ve všech neuronech), let-858 (všechny buňky) a ges-1 (střevo).
Konstrukce kvasinkového dvouhybridního vektoru s promotorem
T7 pro RNAi pGAD424 s přímým'a zpětným promotorem T7/T3 a/nebo Sp6
Ve většině dvouhybridních experimentů je cDNA knihovna klonována do plazmidů pGAD424 (viz obr. 16) , který byl opatřen dalšími restrikčními místy ve vícečetném klonovacím místě ..(polylinkeru) jako je např. Ncol (Clontech) .. Tato knihovna pak umožňuje· screening vazebných proteinů v kvasinkovém dvouhybridním experimentu. Byl zkonstruován nový kvasinkový dvouhybridní vektor se stejnými možnostmi pro provádění dvouhybridního- experimentu, který navíc obsahuje dva dodatečné T7 promotory, takže teto vektor může být použit pro pseudostabilní knock-out indukovaný T7 RNA polymerázou. Ppo tento účel byl vložen přímý T7 promotor pomocí T7-linkeru (obsahujícího následující oligonukleotidové primery:
aattcttaatacgactcactatagggcc a catgggccctatagtgagtcgtattaag) do místa EcoRI-NcoI v pGAD424. Výsledný vektor byl označen pGAD424-without-FULL-ICE-both-T7. Pečlivě byly eliminovány stop kodony a byly ' užity maximálně kompatibilní aminokyseliny. Stejná strategie byla použita pro zpětný T7 (sestávající ze dvou oligonukleotidových primerů:
gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgca a gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg)
4
4 ····,·· • · · 4 4 · · ♦ ·· • · 4 44 4··
4444 ·· 444 44·
- 36 s místem BamHI a Pstl. Aby se zabránilo ztrátě míst Sáli, bylo toto místo vloženo do primerů.
Místo Sáli je důležité, neboť většina knihoven se klonuje právě do tohoto místa a adaptery jsou dostupné. To činí nově zkonstruovaný vektor kompatibilním s již existujícími vektory.
pAS2 s přímým a zpětným promotorem T7/T3 a/nebo Sp6
Analogický kvasinkový dvouhybridní vektor byl zkonstruován na základě pAS2 (Clontech). Parciálním štěpením EcoRV bylo možné odstranit značnou část genu cyh2. Správný konstrukt byl izolován a ověřen restrikčním štěpením .BglII. Toto restrikční místo je přítomno ve fragmentu EcoRV, k.terý bylo třeba z pAS2 eliminovat. Tím byl odstraněn gen cyh2, který je slabě toxický a podílí se na růstové retardaci. Tento gen není esenciální k provádění RNAi a kvasinkového dvouhybridního experimentu. Po eliminaci EcoRV fragmentu se restrikční místo EcoRI lokalizované mezi DNA sekvencí kódující GA.L4DB a HA (epitop) stalo jedinečným místem v plazmidu a lze ho užít k substituci HA linkerem obsahujícím T7 promotor. Tím je zajištěno setrvání všech restrikčních míst, dovolujících klonování ve shodě se čtecím rámcem a kompatibilitu s předchozími vektory a pGAD424. Byl použit linker ( oligonukleotidové primery:
gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgcacatgggccctatag tgagtcgtattaag a gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg) s místy BamHI a Pstl. Aby se zabránilo ztrátě místa Sáli, bylo vloženo do primerů. Výsledný vektor byl nazván „pAS2cyh2-HA+both T7-final.
Přítomnost T7 promotoru (nebo alternativního T3 nebo SP6 promotoru) v pGAD424 dovoluje rychlý přechod od interagujícího proteinu k RNAi a přiřazeni funkce izolovanému ·· ·♦ • · · • ·
9 ·
• · . · • · 9
9999
999 fragmentu DNA. Další výhodou je schopnost dosáhnout in vitro transkripce svázané s in vitro translací (ATG je v souhlasném čtecím rámci jak s GAL4DB tak i GAL4AD) značeného proteinu, který může být užit pro in vitro kontroly (např. testy „pulldown) interakcí protein-protein.
Sekvence plazmidů a polymerázy T3 a SP6 jsou uvedeny v následujícím seznamu sekvencí.
9
- 38 · ·
SEZNAM SEKVENCÍ
SP6 DNA-dependentni RNA polymeráza: SEKVENCE ID. Č. 1
Přístupové č. v databázi SWISPROT: P06221
Sekvence proteinu:
taqdlhaiqlq leeemfnggi rrfeadqqrq iaagsesdta wnrrllseli apmaegiqay keeyegkkgr apralaflqc veneváayit mkvvmdmlnt datlqaiams vaeriedqvr 121 fskleghaak yfekvkkslk asrtksyrha hnvawaeks vaekdadfdr weawpketql 181 qigttlleil egsvfyngep vfiuramrtyg gktiyylqts esvgqwisa'f kehvaqlspa 241 yapcvipprp wrtpfnggfh tekvasrirl vkgnrehvrk ltqkqmpkvy kainalqntq 301 wqinkdvlav ieevirldlg ygvpsfkpli dkenkpanpv pvefqhlrgr elkemlspeq 361 wqqfinwkge carlytaetk rgsksaavvr mvgqarkysa fesiyfvyam dsrsrvyvqs 421 stlspqsndl gkallrfteg rpvngvealk wfcinganlw gwdkktfdvr vsnvldeefq 481 dmcrdiaadp ltftqwakad apyeflawcf eyaqyldlvd egradefrth lpvhqdgscs 541 giqhysamlr devgakavnl kpsdápqdiy gavaqvvikk nalymdadda ttftsgsvtl 601 sgtelramas awdsigitrs ltkkpvmtlp ygstrltcre svidyivdle ekeaqkavae 661 grtankvhpf eddrqdyltp gaaynymtal iwpsisevvk apivamkmir qlarfaakrn 721 eglmytlptg fileqkimat emlrvrtclm gdikmslqve tdivdeaamm gaaapnfvhg 781 hdashliltv celvdkgvts iavihdsfgt hadntl-tlrv alkgqmvamy idgnalqkll 841 eehevrwmvd tgievpeqge.fdlneimdse yvfa
T3 DNA-dependentni RNA polymeráza: SEKVENCE ID. Č. 2
Přístupové č. v databázi SWISPROT: P07659
Sekvence proteinu:
mniieniekn dfseielaai pfntladhyg salakeqlal ehesyelger rflkmlerqa kageiadnaa akpllatllp klttrivewi eeyaskkgrk psayaplqll kpeasafitl 121 kvilasltst nmttiqaaag mlgkaiedea rfgrirdlea khfkkhveeq lnkrhgqvyk 181 kafmqvvead migrgllgge awsswdkett jnhvgirliem liestglvel qrhnagnags 241 dhealqlaqe yvdvlakrag alagispmfq pcvvppkpwv aitgggywan grrplalvrt 301 hskkglmrye dvywpevyka vnlaqntawk inkkvlavvn eivnwkncpv adipslerqe 361 lppkpddidc neaalkewkk aaagiyrldk arvsrrisle fmleqankfa skkaiwfpyn 421 mdwrgrvyav pmfnpqgndm tkglltlakg kpigeegfyw Ikihgancag vdkvpfperi 481 afiekhvddi lacakdpinn twwaeqdspf cflafcfeya gvthhglsyn csiplafdgs 541 csgiqhfsam lrdevggrav nllpsetvqd iygivaqkvn eilkqdaing tpnemi-vtd 601 kdtgeisekl klgtstlaqq wlaygvtrsv tkrsvmtlay gskefgfrqq vlddtiqpai 661 dsgkglmftq pnqaagymak liwdavsvtv vaaveamnwl ksaakllaae vkdkktkeil 721 rhrcavhwtt pdgfpvwqey rkplqkrldm iflgqfrlqp tintlkdsgi dahkqesgia 781 pnfvhsqdgs hlrmtvvyah ekygiesfal ihdsfgtipa dagklfkavr etmvityenn 841 dvladfysqf adqlhetqld kmpplpkkgn lnlqdilksd fafa ♦
ft • · ft · • · • · • *
9 pGN108:
ft • · ft
99
99
999999
SEKVENCE • 9 •
.
999
ID.
• · ··· ft
Č. 3 gttgtcgtaaagagatgtttttattttacmacaccgggtcctctctctctgccagcacagctcagtgttggctgtgtgctcgggctcctgccaccggcgg cctcatcttcttcttcttcttctctcctgctctcgcttatcacttcťtcattcattcnattccttttcatcatcaaactagcatttcttactttatttarnttttcaatrttca atrttcagataaaaccaaactacttgggttacagccgtcaacagatccccgggattggccaaaggacccaaaggtatgtttcgaatgauctaacataa catagaacattttcaggaggacccngcttggagggtaccggatgactgctccaaagaagaagcgtaagctcatgaacacgattaacatcgctaagaa cgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccatiacggtgagcgmagctcgcgaacagttggcccíxgagcatgag tcKacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcact accctactccctaagatgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagncctgcaag aaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgc aatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaag cgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcttcgtggca taaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtagg tcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggfgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttg cgtagttčctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagc actgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcg gtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgac atgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaagacaaggctcgcaagtctcgccgtatcagccttgagttcatg cttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggčcatctggttcccttacaacatggactggcgcggttcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgc aaggtaacgatatgaccaaaggacgtcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactg tgcgggtgtcgataaggtttcgrttcctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacac ttggtgggctgagcaagattctccgttctgcttccttgcgttctgctttgagtacgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgcrcccnccgc tggcgtttgacgggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgaaaccgt tcaggacatctacgggattgttgctaagaaagtcaacgagattctgcaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgat gagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggcttacggtgttactcgcagtgtgactaagc gttcagtcatgacgctggcttacgggtccaaagagttcggcttccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtc tgatgttcactcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatccgtgagcgtgacggtggtagctgcggngaagcaatgaac tggcttaagtctgctgctaagctgctggcťgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgttgcgctgtgcangggtaactcct gatggtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttccgcttacagcctaccattaacacca acaaagatagcgagangatgcacacaaacaggagtctggtategctcctaactttgtacacagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtg t8ggcacaegagaagíacggaatcgaatcmtgcactgancacgactccncggtaccattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgc gaaactatggttgacacatatgagtctigtgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaanggacaaaatgccagc acttccggctaaaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaagggcccactagtcggccgtacgggcccmcgtct cgcgcgrttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagc CCgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatargcggtgt gaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaaraccgcatcaggcggccttaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataat ggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaat aaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacaíttccgtgtcgcccttattccctmiigcggcatrttgccncctgtttt tgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatc cttgagagttttcgčcccgaagaacgtntccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagca actcggtcgccgcatacactanctcagaatgacttggtrgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatg cagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgctraxtgcacaacatgg gggatcatgtaactcgccttgatcgngggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaa caacgttgcgcaaactattaa’ctggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagngcaggaccacttc tgcgctcggcccttccggctggctggraattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggt aagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaacratggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaa gcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgattuaaacttcatttttaatnaaaaggatctaggtgaagatcctttngataatctca tgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttmtctgcgcgtaatctg ctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctmtccgaaggtaactggcttcagcagagc gcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccactrcaagaactctgtagcaccgcctacataccKgctctgctaatcctgttac cagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggg gttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacgccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaaggg agaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatcKtatagtc ctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttac ggttcctggccttttgctggcctmgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctc gccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccg attcattaatgcagctggcacgacaggrncccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcacccca ggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctgt aagtttaaacatgatcttactaactaactattctcátttaaattttcagagcttaaaaatggctgaaatcactcacaacgatggatacgctaacaácttggaa atgaaataagcttgcatgcctgcagagcaaaaaaatactgcttttccrtgcaaaattcggtgcmcncaaagagaaacttttgaagtcggcgcgagcat
- 40 ttccttctttgacttctctctttccgccaaaaagcctagcatttttattgataatrtgattacacacactcagagttcttcgacatgataaagtgtttcatiggcac tcgccctaacagtacatgacaagggcggattattatcgatcgatattgaagacaaactccaaatgtgtgctcattttggagccccgtgtggggcagctg ctctcaatatattactagggagacgaggagggggaccttatcgaacgtcgcatgagccattctttcttctttatgcactctcttcactctctcacacattaat cgattcatagactcccatattccttgatgaaggtgtgggtttttagctttttttcccgatttgtaaaaggaagaggctgacgatgttaggaaaaagagaacg gagccgaaaaaacatccgtaguagtcttccttttaagccgacactttnagacagcattcgccgctagttttgaagtttaaattttaaaaaataaaaattag tttcaattttttttaattactaaataggcaaaagtttmcaagaactctagaaaaactagcttaattcatgggtactagaaaaattcttgttttaaatttaatattta tcttaagatgtaattacgagaagcrrmtgaaaattctcaattaaaagaatttgccgatttagaataaaagtcttcagaaatgagtaaaagctcaaattaga agtngtttttaaaggaaaaacacgaaaaaagaacactatttatcttttcctccccgcgtaaaattagttgttgtgataatagtgatccgctgtctatttgcact cggctcttcacaccgtgcttcctctcacttgacccaacaggaaaaaaaaacatcacgtctgagacggtgaattgccttatcaagagcgtcgtctctttca cccagtaacaaaaaaaatttggrncmactttatatttatgtaggtcacaaaaaaaaagtgatgcagtmgtgggtcggttgtctccacaccacctccgc ctccagcagcacacaatcatcncgtgtgttctcgacgattccttgtatgccgcggtcgtgaatgcaccacattcgacgcgcaactacacaccacactc actttcggtggtattactacacgtcatcgttgttcgtagtctcccgctctttcgtccccactcactcctcattattccccttggtgtangattttttttaaatggta caccactcctgacgracuccncngmtccgtccamagatmatctggaaatttnnaaaaittxaggccagagagttctagncttgttcuaaagtcta ggtcagacatacatrttctatttctcatcaaaaaaaaagttgataaagaaaactggttattcagaaagagtgtgtctcgttgaaattgattcaaaaaaaaatt cccacccctcgcttgmctcaaaautgagatcaacggattttttccttctcgattcaamtrtgctgcgctctgtctgccaaagtgtgtgtgtccgagcaaa agatgagagaarttacaaacagaaatgaaaaaaagttggccaaataatgaagttttatccgagattgatgggaaagatattaatgttctttacggtttgga ggggagagagagatagamtcgcatcaaactccgcctttxacatgtcttttagaatctaaaatagatttxtctcatcatttttaatagaaaatcgagaaatta cagtaatttcgcaattttcttgccaaaaatacacgaaatttgtgggtctcgccacgatctcggtcttagtggKcatttggtttaaaagtttataaaatttcaaa ttctagtgrttaatttccgcataanggacctaaaatgggtttttgtcatcattttcaacaagaaatcgtgaaaatcctgttgtttcgcaattttcttttcaaaaata cacgaaatatatggtaatrtcccgaaatangagggtctcgccacgatttcagtcacagtggccaggatttatcacgaaaaaagttcgcctagtctcacat ttccggaaaaccgaatctaaanagtttmgtcatcattttgaacaaaaaatcgagacatccctatagtttcgcaattttcgtcgctrrtctctccaaaaatga cagtctagaattaaaattcgciggaactgggaccatgaiatcttttctccccgtttttcatmattttttattacactggattgactaaaggtcaccaccaccg ccagtgtgtgccatatcacacacacacacacacacaatgtcgagattttatgtgttatccctgcttgatttcgttccgttgtctctctctctctattcatcttttg agccgagaagctccagagaatggagcacacaggatcccggcgcgcgatgtcgtcgggagatggcgccgcctgggaagccgccgagagautca gggaagatcgtctgatnctcctcegatgccacctcatctctcgagtttctccgcctgttactccctgccgaacctgatatttccc • · • · • · pGN105:
SEKVENCE ID. Č. 4 aagcttgcatgcctgcaggccnggtcgactctagacacmtcagctacctagatacatggatatccccgcctcccaatccacccacccagggaaaaa gaagggctcgccgaaaaatcaaagttatctccaggctcgcgcatcccaccgagcggttgacttctctccaccacttttcattttaaccctcggggtacg ggattggccaaaggacccaaaggtargtttcgaatgatactaacataacatagaacattttcaggaggacccttgcttggagggtaccgagctcagaa aaaatgactgctccaaagaagaagcgtaaggtaccggiaatgaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatccc gttcaacactctggctgaccartacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgagtcrtacgagatgggtgaagcacgcttccgcaa gatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaa cgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatca ccattaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcg cttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcattta tgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgct gcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacct gaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgrtccaaccttgcgtagttcčtcctaagccgtggactggcatt actggtggtggctangggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggígc.gtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgccť gaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcat tgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaa cgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacagggctcgcaagtctcgccgtatcagccttgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgcraaccat aaggccatctggttcccttacaacatggactggcgcggtcgtgtttacgccgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggactgctt acgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggttccgttccctg agcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacacttggtgggctgagcaagattctccgttct gcnccttgcgtictgctttgagtacgctggggtacagc2ccacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgacgggtcrtgctctggcatc cagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggrcgcgcggtiaacttgcttcctagtgagáccgttcaggacatctacgggattgtigctaag aaagtcaacgaganctacaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaa gtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggctcacggtgrtactcgcagtgtgactaagcgttcagtcatgacgctggcttacgggtc caaagagttcggcnccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtccgatgttcactcagccgaatcaggctg ctggaucatggctaagctgatttgggaatctgtgagcgtgacggrggtagctgcggttgaagcaatgaactggcttaagtctgctgctaagctgctgg ctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgrtgcgctgtgcattgggtaactcctgatggtttccctgtgtggcaggaataca agaagcctattcagacgcgcngaacctgatgttcctcggtcagttccgcnacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagatTgatgcacaca aacaggagtcíggtatcgctcctaacmgtacacagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatega atcrtttgcactgattcacgactccncggtaccattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtctt gtgatgtactggctgatnctacgaccagncgctgaccagttgcacgagtctcaaítggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacttgaacct ccgtgacatcttagagtcggacncgcgttcgcgtaagaattccaactgagcgccggtcgctaccattaccaacttgtctggtgtcaaaaataataggg gccgctgtcatcagagtaagmaaacígagttctactaactaacgagtaatatttaaattttcagcatctcgcgcccgtgcCtctgacttctaagtccaatt actcticaacatccctacatgctctnctccctgtgctcccaccccctatttttgttattatcaaaaaaacttcttcttaatttctttgttnttagcnctmaagtca cctctaacaatgaaattgtgtagattcaaaaatagaattaattcgtaataaaaagtcgaaaaaaartgtgctccctccccccattaataataattctatccca aaatctacacaatgttctgtgtacacncnatgmtmtacttctgataaattttttttgaaacatcatagaaaaaaccgcacacaaaataccttatcatatgtt acgtncagtttatgaccgcaatmtamcncgcacgtctgggcctctcatgacgtcaaatcatgctcatcgtgaaaaagmtggagtarmtggaattttt caatcaagtgaaagtttatgaaattaatmcctgcttttgctttttgggggtttcccctattgtttgtcaagagtttcgaggacggcgttmcttgctaaaatca caagtattgatgagcacgatgcaagaaagatcggaagaaggtttgggtttgaggctcagtggaaggtgagtagaagttgataatttgaaagtggagta gtgtctatggggtttttgccttaaatgacagaatacattcccaatataccaaacataactgtttcctactagtcggccgtacgggcccíttcgtctcgcgcg tttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtca gggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaata ccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcggccttaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttctt agacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccct gataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccncctgtttttgctca cccagaáacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgag agttttcgccccgaagaacgmtccaatgatgagcacttrtaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcg gtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaartatgcagtg ctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggat catgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacg ttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaačaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttcígcgct cggcccttccggctggctggtttangctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccc tcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactganaagcattg gtaactgtcagaccaagtttactcatatatacrttagattgatttaaaacttcantttaatnaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgacca aaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgctt gcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcncagcagagcgcaga taccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtg gctgctgccagtggcgataagtcgtgtcnaccgggnggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcg
·· ·4 • 9 · « ·
9 9 9
9 9 9 9 • 99 9
999 tgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaa aggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtc gggtttcgccacctctgacKgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttc ctggccttttgctggccttttgctcacatgttcmcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccg cagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattca ttaatgcagctggcacgacaggtncccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaartaaígtgagttagctcactcattaggcaccccaggctt tacactttatgcttccggctcgtatgngtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctgtaagttt aáacatgatcttactaactaactattctcatttaaattttcagagcttaaaaaíggctgaaatcactcacaacgatggatacgctaacaacttggaaatgaa at
- 43 pGN400:
SEKVENCE ID. Č. 5 aagcttgcatgcctgcaggccnggtcgactctagacacttttcagctacctagatacatggatatccccgcctcccaatccacccacccagggaaaaa gaagggcicgccgaaaaatcaaagttatctccaggctcgcgcatcccaccgagcggttgacrtctctccaccacttttcattttaaccctcggggtacg ggattggccaaaggacccaaaggtatgtttcgaatgatactaacataacatagaacattttcaggaggacccttgcttggagggtaccgagctcccgg gattaatacgactcactataccggtagaaaaaatgagtaaaggagaagaactntcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatg ggcacaaamtctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttamgcactactggaaaactacctgttccatgg gtaagtttaaacatatatatactaactaaccctgattatrtaaamtcagccaacacttgtcactacrnctgttatggtgttcaatgcttctcgagatacccag atcatatgaaacggcatgactttrtcaagagtgccatgcccgaagg'ttatgtacaggaaagaactatattntcaaagatgacgggaactacaagacac gtaagtttaaácagttcggtactaactaaccatacatatnaaatrrtcaggtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaa aggtattgattttaaagaagatggaaačattcttggacacaaanggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaat ggaatcaaagttgtaagtttaaacatgattttactaactaactaatctgamaaattttcagaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttca actagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatc ccaacgaaaagágagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaatagcattcgtagaattc caactgagcgccggtcgctaccattaccaacttgtctggtgtcaaaaataataggggccgctgtcatcagagtaagtrtaaactgagttctactaactaa cgagtaatatttaaattrtcagcatctcgcgcccgtgcctctgacttctaagtccaattactcttcaacatccctacatgctctttctccctgtgctcccaccc cctatmtgttattatcaaaaaaacttcttcttaatttctttgttmtagcttctmaagtcacctctaacaatgaaattgtgtagatícaaaaatagaattaancg taataaaaagtcgaaaaaaattgtgctccctccccccattaataataattctaícccaaaatctaCacaatgttctgtgtacacttcttatgttttttttacttctg ataaattttttttgaaacatcatagaaaaaacčgcacacaaaataccttatcatatgttacgtttcagtttatgaccgcaatttttatttcttcgcacgtctgggc ctctcatgacgtcaaatcatgctcatcgtgaaaaagtntggagtatttttggaatrtncaatcaagtgaaagtttatgaaattaattttcctgcttngctttttg ggggtttcccctattgmgtcaagagmcgaggacggcgrmtcttgctaaaatcacaagtattgatgagcacgatgcaagaaagatcggaagaagg mgggtttgaggctcagtggaaggtgagtagaagtrgataatngaaagtggagtagtgtcutggggmttgccttaaatgacagaatacattcccaat ataccaaacataactgtttcctactagtcggccgtacgggccctttcgtcícgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccg gagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggctta actatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcggc cnaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacc cctatttgtttatttttctaaatacancaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatangaaaaaggaagagtatgagtatt caacatrtccgtgtcgcccttattcccttnttgcggcattrtgccttcctgtttngctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagtx gggtgcacgagtgggttacatcgaáctggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaa gnctgctatgtggcgcggtatiatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcac cagtcacagaaaagcatcttaczgatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacnctga caacgatcggaggaccgaaggagctaaccgctttmgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagc cataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgrtgcgcaaactattaastggcgaactacttactctagcttcccggc aacaanaatagactggatggaggcggataaagngcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatcrggagccg gtgagcgtgggtctcgcggtatcangcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttarctacacgacggggagtcaggcaactat ggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatacmagattgatttaaa acrtcamttaarnaaaaggatctaggtgaagatccmttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccg tagaaaagatcaaaggatcncngagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgmgccgg atcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccactt caagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactca agacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgrgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactga gatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggag agcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgrcgggtttcgccacctcígacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtc aggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttrtacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgnatccc ctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaag cggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggc agtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacacmatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcgg ataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctgtaagtttaaacatgatcnactaactaactattctcattuaattticagagcrt aaaaatggctgaaatcactcacaacgatggatacgctaacaacttggaaatgaaat
·· ·· t · • · • · • · ·· • · ···
ID.
·· «· •· · · •· · •· · • ·· ·· ♦ ··· ·· « pGN401
SEKVENCE
Č.
gatcccggcgcgcgatgtcgtcgggagatggcgccgcctgggaagccgccgagagatatcagggaagatcgtctgatttctcctcggatgccacct catctctcgagtnctccgcctgttactccctgccgaacctgatamcccgttgtcgtaaagagatgmttattttactttacaccgggtcctctctctctgcc agcacagctcagtgttggctgtgtgctcgggctcctgccaccggcggcctcatcttcncncrtcttctctcctgctctcgcttatcacttcttcattcattctt attccmtcatcatcaaactagcamcttactttatttatttttttcaattttcaattncagataaaaccaaactacttgggttacagccgtcaacagatccccg ggattggccaaaggacccaaaggtatgtttcgaatgatactaacataacatagaacattttcaggaggacccttgcttggaggguccggtagaaaaa atgagtaaaggagaagaacmtcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtga aggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatgggtaagtttaaacatatatatactaactaaccct. gattamaaattttcagccaacacrtgtcactactttctgttatggtgttcaatgcttctcgagaťacccagatcatatgaaacggcatgactttrtcaagagt gccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatattxttcaaagatgacgggaactacaagacacgtaagtttaaacagttcggtactaactaaccat acatatttaaattttcaggtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattctt • ggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttgtaagtttaaacttggacttac taactaacggattatamaaatmcagaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgncaactagcagaccattatcaacaaaatactccaa ttggcgátggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttct tgagtttgtaacagctgctggganacacatggcatggatgaactatacaaatagcattcgtagaattccaactgagcgccggtcgctaccattaccaac ttgtctggtgtcaaaaataataggggccgctgtcatcagagtaagmaaactgagttctactaacÍaacgagtaatatttaaattncagcatctcgcgccc gtgcctctgacttctaagtccaanactcttcaacatccctacatgctcmctccctgtgctcccaccccctattmgrtattatcaaaaaaacttcttcttaatt tctttgttttttagcttcttttaagtcacctctaacaatgaaattgtgtagattcaaaaatagaattaancgtaataaaaagtcgaaaaaaattgtgctčcctcc ccccattaataataattctatcccaaaatctacacaatgttctgtgtacacttcttatgttttratacttctgataaattttttttgaaacatcatagaaaaaaccg cacacaaaataccttatcatatgtucgtttcagtttatgaccgcaatttttatttcttcgcacgtctgggcctctcatgacgtcaaatcatgctcatcgtgaaa aagtmggagtatttttggaatttncaatcaagtgaaagmatgaaattaattttcctgcttttgctttttgggggtttcccctattgtttgtcaagagtttcgag gacggcgtttttcttgctaaaatcacaagtangatgagcacgatgcaagaaagatcggaagaaggttrgggtttgaggctcagtggaaggtgagtag aagtrgataatttgaaagtggagtagtgtctatggggtttttgccttaaatgacagaatacattcccaatataccaaacataactgtttcctactagtcggcc gtacgggcccggtacccagctmgnccctttagtgagggttaangcgcgcnggcgtaatcatggtcatagctgmcctgtgtgaaattgttatccgct cacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgc ccgctnccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttcCgcttcc tcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggata acgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtnttccataggctccgcccccct gacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtg cgcíctcctgttccgacccigccgcttaccggatacctgtccgcctrtctcccttcgggaagcgtggcgcmcícatagctcacgctgtaggtatcscag ttcggtgtaggtcgttcgctccaagcígggctgtgtgcacgaaccccccgncagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaa cccggtaagacacgacnatcgccactggcagqagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtg gtggcctaactacggetacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctettgatccgg caaacaaaccaccgctggtagcggtggtttnttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacg gggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattrtggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaag ttttaaatcaatctaaagtatatatgagiaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcaiccat agngcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccg gctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgc cgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccartgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttc attcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcčcccatgttgtgcaaaaaagcggttagctcéttcggtcčtccgatcgttgtcagaagt aagttggccgcagtgttatcactcatggtxatggcagcactgcataatxctcrtactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaa ccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtg ctcatcattggaaaacgttctťcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttc agcatcttttáctttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaata ctcatactcttcctttttcaatattangaagcátttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttc cgcgcacatttccccgaaaagtgccacctaaattgtaagcgttaatatmgnaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggc cgaaatcggcaaaatcccnataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtgga ctccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagtttmggggtcgaggtgccgtaaa gcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaa aggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtc ccattcgccattcaggctgcgcaacrgngggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaag gcgattaagttgggtaacgccagegmtcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattg gagctccaccgcggtggcggccgcíctagaactagtg • ·
- 45 pGNllO:
SEKVENCE ID, Č. 7 • ·· gatcctccaaaatcgtcttccgctctgaaaaacgaaagtggacctttgacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatgaaattgagctttttgggtcgaaaa aaatgtttttagaatgctgagaacacgnaaacacgaagatcatatttamtgagacccggatgctctgaaaatgtctgacatagatnaaaaaagcatat atatatttttcattttcaacgtgaaagmtgtgcaactttatagaatctcctattggcacangttttttatttaactgaggcagtttttgaacacctttttgaaactt tgaatctctttgaagtatactgtcgaaaagactgacttgagcgttcgaaatgccagaagaaaactatatrtgaatctcgcgctaaattgagaaatgcaacc gcgctccactggacaattggaaaaaaaamattcggaggcgacaacggtattttcgaaattgattttctgtgtattttctcattttttataaattcttctttgattt atcgttcgtttgtgagaaantaangtattcaaacttttttatagtaagataccggtggtaccgctagccgtacgaacccggganggccaaaggaccca aaggtatgtttcgaatgatactaacataacatagaacaxtttcaggaggacccttgcttggagggtaccggatgactgctccaaagaagaagcgtaagc tcatgaacacgattaacatcgcuagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccattacggtgagcgtttagct cgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcgga taacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagcíaagcgcggcaag cgcccgacagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaagaccactctggcttg.cctaaccagtgctgaca atacaaccgttcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtátccgtgacčttgaagctaagcacttcaa gaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtcta ctcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggttag cttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcg ctggctggcatctctccgatgnccaaccttgcgtágttcctcčUagccgtggačtggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctct ggcgctggtgcgtactcacagiaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacacc gcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaatcaccaagíggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaa gaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaagacaaggctc gcaagtctcgccgtatcagccrtgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctggtícccttacaacatggactggcgcg gttcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggacgtcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaagg ttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggtttcgmcctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacat catggcttgcgctaagtctccactggagaacacttggtgggctgagcaagattctccgttctgcttccngcgttctgctttgagtacgctggggtacagc accacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgacgggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtg gtcgcgcggrtaacttgcttcctagtgaaaccgttcaggacatctacgggattgttgctaagaaagtcaacgagattctgcaagcagacgcaatcaatg ggaccgataacgaagtagttaccgrgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggct ggcttacggtgttacrcgcagtgtgactaagcgttcagtcatgacgctggcttacgggtccaaagagttcggcnccgtcaacaagtgctggaagatac cattcagccagctattgaKccggcaagggtcrgatgttcactcagCCgaatcaggctgctggatacatggctaagcxgatttgggaatccgtgagcgt gacggtggtagctgcggttgaagcaatgaactggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagacíggagagartcttc gcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatggtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcgg tcagttccgcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactttgtacacagcca agacggtagccaccncgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttgcactgattcacgactccttcggtaccattccggc tgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcttgtgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccag ttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggctaaaggxaacttgaacctccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaaggg ccctcgtcgagtcggtcacaatcacctgaaacíccaaaggcagccagtgaggaacgtgaagaagaagaaaaagagtcatctgaacaggtttgatrtt cmctggtcaaaaagatgaaatungamtcagccagatactcccaaaactagcagcgagaagtctgcaagtcgttcacagtcgcccagagaatcgc gggaagtgagccaagaggtatgmttcaaaaatcaataactgatcataamttattgtttggtgaatttaagaaaataatattcgaaaattcctctgaattat caagattgcagtatiaatttcgagaaaaartgagatattcatagagctattgtaaanttcttgatttcagactgaaacncggaaaatcaagagaaaatcaa agaaaaggatgacggggatgatcagcctggcacaccgaacagctatagaagccgggaaacttcaccagctccaaaaaggtccaaggagaccag grttgtcaaaagcttcctgcgattaattctcatttcaatttttcagagaatcagagtctcctgaaaaatccccggttcgttcaagatctcccagaaggtcttca gcacgttccccgtcacgatctcctagacggcgccgagaaagaagctcagaaagaaagcaatccgaagagccagcaccgctaccagagaaaaaga agaaagagccgctggatattctacgaacaagaaccggaggagcatatattccacccgccaaacttcgacttatgcaacaacagaKagtgataagca aagtgaacagtatcagagaatgaattgggaaagaatgaagaaaaagattcacggattggttaacagagtcaacgcgaagaatcttgttcaaattgtca gagaacttcttcaagagaatgtgattcgttcaaagtgagtgagaaaatcgaaggaaaaggaaagaattaatttaatttttcaggggacttctctgccgtg acattattcaagcicaggctnctcaccaggattctctaacgtctatgcagctttggcggcagttatcaactcgaaattccctcatgtcggtgaacttcttctc cgtcgtctgattgtacagttcaaaagaagtttccgtagaaatgacagaggcgtcacggtgaacgtgatcaaattcatcgcacatttgatraatcaacaag Ctgctcacgaagttcttgcgctggaaatcatgartctgatgcttgaagaaccaactgatgancagrtgaagtcgccangcgttcctgaaagagtgtgga gcaaagcttctggagattgctccaecagctcttaacagtgtctacgaccgtcttcgtgcaattctcatggaaactgaaagatcggaaaatgcactggatc gacgtancagtatatgangagactgcaatgcagattcgaaaggačaaamgcggtaaggtagaatatataaatagtttattagaaaaaaataaattag aataatttaaattcctactagccaatcaggcgacctttttgcgcatagttctattattgaaaaatttggagaattictcatattctcgctcggaaatctggaatt cgacgagatcttctggcttctgtgcagctgcatcgctttgtgctccctttctcgcttgtcttctgtgtacaccaagaaccttgttgagttcatcaactgaatct gtgactggcngttgctcactggatgcactagacgactgattctcgagaaatcagattgagngcgattagggtgaccugaaattgggaataatacgaa cttngaaaatattcaggaggattaaaaaaattattctcgacaatcctacaaatttacttattgcaccatgttgctccaacattmcattaaaagttaatgaaaa aatgtagaaaatcggaaattggcaattttcagaccatttttaagcattttcaaaaaaaaattgcagctgaaataaatgtcattttcagataaatcgagc^att ttctgttgtctgacactagtttttagtmaaaaaatgttggaagaacatggtgcaataggtaantcatagaatnccatgtgmnrttcaanaaccaattatc caaatcttccaaactcacatmgcegagctgggctatcaagaatctgctgcagttttataagacgagcatctctgatatcactgaaaattaaffittaatca aaacttgaatatcaactaaacccacnanaactttctcgatcttctgtcgttcggtacgatgacggtgaagaagccaattgtagtagttgatttggttcaagt • ·
- 46 cctttcggtgttgtacgtcagtgtcctgcaatgctatttagttataacttaggcctaagattcaatttaatgaagtgattaaatttgttctctgaacctcttaaga tgatcttttggattagaaacatataagacaggtttacctatctattaaaaaacagatcaaaatagatacgaccaaatcggataatccatgcctacctggcat ctaggaacgtgttcttagaagatncttacgtaatcgtatgaagaaataacaatttgalcgttggccagcaaaaatagggttttaagtgggatagtgtttttat tagctaaccggaaaattttatagtrnntttgcaagaaaccactgaaaaccccctaattgutacattttttggagcagcttctggtctttttgagcaataaaat tcgataaaacagaatttaagtgtaaangncacatttagmctattttatcaaattttgHgctcaaaaacattcgaagctgctctaaaaaaatgcattaaaaa aggggttttcagtggtttttcacattaaaaaagctaattttaactaaaaatccatcatatttccaactttgtcacaacaataaaatgctggtcaaaatgtgttcg aaaaaatgtttttttttttaatttttataamaaaaatagttttctttcgctgggacacatacatttttgggcgtaaattttcagttcaaatttccamttacaaccat aatcataaagctacgtctgatctctctcgcacttacctgcgcctgattcgaaagaacaaccgtagccaaaagaacaagaagaacaagcacgtagttgt ggtagtggacgttcatcacgcaatactgaccaatggtcgtggggtctcactttccgtactattgagagaggggagactgaagatggcaattgaggaca gtgtcttcgacgcacgcatgcatccataagcataatccaggagggatggagagaaaaatcttgtttctaagcccctccctttgtaatacatacacatatct aataccgaagaatggctaattgaatggacgtcagctgngctgtagttgccaaggcatcatcgatgaaataactgaaagaaagaattaaataattattgc aggcgtatccggcggtcattgaagacttggacttgattgaggaggaggatcagatcatccatacacttaatttggaggatgcggttgatccggaaaatg ggcttagtaagtgactgaccacacgcggggggcattaatnaataaattgaattccatttcagatgtgttcaaactagatccagaartcgaaaagaacga ggaggtttatgaggagatccgtaaggaaatcattggaaacgccgatatttcggatgaggatggtggcgacgagttggatgatgaagaagagggtagt gatgtggaagaggctcčgaagaagactacagagattattgataatactgatcagaattgactgctttcagaaggtattcattttgagttttgggccggcaa atctgtaagttgccggttgccgaaaatttgctgaarttgccggaaaaaaaaattccggaatttatttaaaaactttttgtaaaaattaaattaaatttgcaactt ttcagagaagtctacctgacaatgcaatcatctttggactaccaagaagctgctcacaaattgctgaaaatgaagattccagacagcatgcaggtcagč gatgttgcaaagaaaaattttcgaccaaaaaaaccaaccaatcataaaatttaaaaaaaaactccgttrnttctttttttttatacgagaaaaaccaaaaaa atgtatttttgccaaattctaaaatactatccccgaáattttcaatattttctctttcagaacgaactctgcgcgatgcttgtcgattgttgtgctcaacagcgta cctacgagcgattctacggaatgctcatcgaacgtttctgccgacttcgcctcgaataccagcaatactttgaaaagctctgccaggacacgtattccac gattcaccgaattgacatcacaaaactgcggaatttggctcgccttattgctcatttgctctcgacggatgctattgactggaagattttggccgatatgaa aatgaccgáagaggacacaacttcttctggcagaatctatattaaatatatatttaatgaacttgtggaggcgatgggaatggttaaacttcattcgagag rcactgatccgtgagtttcctagagagagttgttttcgtattcaattttccctattncagaactttggctcattgctttgttggattattcccacgaactaatccg aacagcgcacgartttcgatcaacttcncacaatgattggangggtggtttgacgttggaacttcgtgaatggctggcaaagggtctcaagaagaaga agggaatgctggatcagttgaaggccgaatcaagctcagattcatcgtcgtcttcggattcgtcagactcgtctgattcttcggattctgacgattcatcc gactcgtcttcagattcctcatcttcttcagaatcagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaagaagaacagtgaagagagrtccaaaaagaag gaaaaagagaatattggtcgacgggatcgtggagacaagagagctgaacgtcaícgtgatcaaagtgtggagaacaaggacaaggatcgtcgacg tcgccaggattetgacgaaaatcgtcggccagaacgaggagatgaccgcaaggatcggagtaaagatcgtcgtcgtcaagactcggatgatgagg atcggaaaggtcgtgaacgttgggaagartcaggggaaagacgtcgcggagatcgggatcgacgtgatcgaaacaaggatcaggaggatcaccg tgaagatcgccgtgaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgccgtcgtcatgactctgatgatgatcgtaaaactcgtcgggatagaagt gaagagcgaggaggacgtcgTcgtgaagtggaatcggatgatcgacgccgacgtcgttgaatrttcaaatmaaatactgaatatttgtttrattcctatt atttatttattctctttgtgttttttttcttgctttctaaaaaattaattcaatccaaatctaaacatgagcggttttttttctctttccgtctcccaattcgtattccgct cctctcatctgaacacaatgtgcaagtttamatcttctcgctttcatttcattaggacgtggggggaattggtggaagggggaaacacacaaaaggatg atggaaatgaaataaggacacacaatatgcaacaacattcaattcagaaatatggaggaaggtrtaaaagaaaacataaaaatatatagaggaggaa ggaaaactagtaaaaaataagcaaagaaattaggcgaacgatgagaattgtcctcgcttggcaaatgcgaatccgtatggagaggcacgtttggcga aggcaaatgttcggtatggagatctgtaaaaatttttaagttgaaatttggtgttgctcttttacaaaattttccgattttcgcttgaaartacggtgccaggtct cgacacgtcttccaatttttcaaattcaaaagagcctttaatgggctgtagttgctaatttctcgtttttgaaaarattcttccgtttaatcgaaatttgatgtatn tatttatgattticaataaatticaaagaaactggtgaaaactcggaaaattgtgaactacagtaatccaatccttaaaggcgcacacctrttaaatgtčcgc cccaatacgatatttnttaagattcgctagagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccctatagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgt macaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccccttcgccagctggcgtaatagcgaagaggccc gcaccgatcgcccttcccaacagttgcgtagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggnacgc gcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcrtcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctcta aatcgggggctccctttagggnccgaraagtgčtttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccct gatagacggtttttcgccčttfgacgttggagtccacgttcmaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattctttt gatttataagggattttgccgatttcggcctaríggrtaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgttfacaatttca ggrggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaauaccctgataaatgc ttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacamccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaac gctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcc ccgaagaacgmtccaatgatgagcacnnaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcat acactattctcagaatgacttggttgagtáctcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataag catgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttrttttcacaacatgggggatcatgtaactcg ccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaact attaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttcc ggctggctggtRactgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgt agttatctacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcag accaagtttactcatatatactttagartgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaa cgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaa aaaccaccgctaccagcggtggtngmgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatact gtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccag tggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcc • · cagctiggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacagg tatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccaggggggaacgcctggtatctrtatagtcctgtcgggtttcgccac ctctgacttgagcgtcgatmtgtgatgctcgtcaggggggccgagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttCctggccttttgct ggccttttgctcacatgttctttcctgcgnatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacga ccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctg gcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttacctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgct tccggctcctatgttgtgtggaattgtgagcggataacaantcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctcggaattaacccícactaa agggaacaaaagctgggggg • · • ·
- 48 ID.
Č. 8 • · · · · • · · · · · • · · · · • · ···· · · pAS2-cyh2-HA+bothT7-final
SEKVENCE gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgcagccaagctaattccgggcgaatttcttatgatttatgatmtattanaaataagnataaaaaaa ataagtgtatacaaannaaagtgactcraggtmaaaacgaaaattcttgncrtgagtaactcmcctgtaggtcaggttgctttctcaggtaugcatgaggt cgctcttangaccacacctctaccggcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgmcctgtgtgaaangttatccgctcacaanccacacaacatac gagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgaggtaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgcmccagtcgggaaacctgt cgtgccagctggattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcncctcgctcactgactcgctgcgcttggtcg ttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggnatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggcc agcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtmtccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagag gtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgnccgaccctgccgcttaccggatacctgtc cgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatcÍcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaac cccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaaca ggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgct gaagccagttaccncggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtnttttgtttgcaagcagcagattacgcgc agaaaaaaaggatctcaagaagatccmgatctntctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaa aaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagmtaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacnggtctgacagnaccaatgcttaatcagtgaggc acctatctcagcgatctgtctamcgncatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgc aatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatcc gcctccatccagtctattaartgngccgggaagcúgagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtca cgctcgtcgraggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcct ccgatcgttgtcagaagtaagnggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcmtctgtgac tggtgagtactcaaccaagtcanctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcngcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaac tttaaaagtgctcaicanggaaaacgncncggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatcčagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactg atcttcagcatctntacmcaccagcgmctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgngaat actcatactcttccmncaauttangaagcamatcagggttattgtctcatgagcggatacatamgaatgtatnagaaaaataaacaaataggggnccgc gcacamccccgaaaagtgccaccrgaacgaagcaKtgtgcttcatmgtagaacaaaaatgcaacgcgagagcgciaantncaaacaaagaatctga gctgcatmtacagaacagaaatgcaacgcgaaagcgctattttaccaacgaagaatctgtgcrtcatttngtaaaacaaaaatgcaacgcgagagcgctaa ttntcaaacaaagaatctgagctgcatmtacagaacagaaatgcaacgcgagagcgctamtaccaacaaagaatcíatacttcnttngrtctacaaaaatg catcccgagagcgctaKmcuacaaagcatcnaganactTOrtctcctrtgtgcgctctataargcagtctcttgataactttttgcactgtaggtccgttaag gttagaagaaggctacmggtgtctattnctcnccataaaaaaagcctgactccacttcccgcgtttactgarřactagcgaagctgcgggtgcacttmcaag ataaaggcatccccganataKctataccgatgtggattgcgcatactngtgaacagaaagtgatagcgttgatgattctXcanggtcagaaaanaigaacg gtttcttctattttgtctctatatactacgtataggaaatgtnacarrncgtattgttncgattcactctatgaatagttcttactacaatttttttgtctaaagagtaatac tagagataaacataaaaaatgtagaggtcgagtrtagatgcaagncaaggagcgaaaggtggatgggtaggttatatagggatatagcacagagatatata gcaaagagatacmtgagcaatgmgtggaagcggtattcgcaatattttagtagctcgttacagtccggtgcgrnttggrtttttgaaagtgcgtcttcagagc gcrrttggtntcaaaagcgctctgaagncctatacmctagagaataggaacttcggaataggaacncaaagcgtítccgaaaacgagcgcnccgaaaat gcaacgcgagctgcgcacatacagctcactgttcacgtcgcacctatatctgcgtgttgcctgtatatatatatacatgagaagaacggcatagrgcgtgtnat gcnaaafgcgtacrtatatgcgtcuntatgtaggatgaaaggtagtctagtacctcctgtgatattatcccančcatgcggggtatcgtatgcttccttcagca c:acccmagctgncíatatgctgccactcctcaanggattagtctcatccncaatgctatcatnccrngatanggatcatattaagaaaccattattatcatga cattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgmcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtca cagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgTcagcgggtgttggcgggtgtcggggciggcnaactatgcggcatcag agcagattgtactgagagtgcaccatagatcaacgacattactatatatataatataggaagcatttaatagacagcatcgtaatatatgtgtactttgcagttatg acgccagatggcagtagtggaagatattcnattgaaaaatagcttgtcaccttacgtacaatcttgatccggagcttttctttttrtgccgattaagaattaattcg gtcgaaaaaagaaaaggagagggccaagagggagggcattggtgactattgagcacgtgagíatacgtgattaagcacacaaaggcagcttggagtatg tctgttattaatttcacaggtagttctggtccattggtgaaagtttgcggcttgcagagcacagaggccgcagaatgtgctctagattccgatgctgacngctg ggtattatatgtgtgcccaatagaaagagaacaangacccggttangcaaggaaaatttcaagtcttgtaaaagcataíaaaaatagttcaggcacíccgaa atacttggttggcgtgtncgtaatcaacctaaggaggatgttttggctctggtcaatgattacggcattgatatcgtccaacígcatggagatgagtcgtggca agaataccaagagncctcggmgccagnattaaaagactcgtatttccaaaagactgcaacatactactcagtgcagcttcacagaaacctcattcgtnart CCCttgRtgattcagaagcaggtgggacaggtgaactntggartggaactcgatttctgactgggnggaaggcaagagagccccgaaagctucattnat gttagctggtggactgacgccagaaaatgttggtgatgcgcragattaaatggcgttanggtgttgatgtaagcggaggtgtggagacaaatggtgtaaaa gactctaacaaaatagcaaatttcgtcaaaaatgctaagaaataggttattactgagtagtatttatttaagtattgtttgtgcacttgccgatctatgcggtgtgaa ataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggaaartgtaaacgttaatatmgttaaaattcgcgnaaamrtgnaaatcagctcattttttaacc aataggccgaaatcggcaaaatcccnataaatcaaaagaatagaccgagaiagggttgagtgngnccagtnggaacaagagtccactatiaaagaacgt ggacrccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacccxaatcaagmmggggtcgaggtgccgtaaag cactaaatcggaaccctaaagggagcccccgaraagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggag cgggcgcíagggcgctggcaagtgtagcggícacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcgcgccattcg ccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagtt ···· ·« « ·· 0 • 0 0 · · · * · · 0 · · « · 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 · · · 0 0 0 0 0 000 · 0 0 0 · 0 ···· 00 000 00 000 gggtaacgccagggttttcccagtcacgacgngtaaaacgacggccagtcgtccaagctttcgcgagctcgagatcccgagctttgcaaattaaagccttc gagcgtcccaaaaccttctcaagcaaggttttcagtataatgttacatgcgtacacgcgtctgtacagaaaaaaaagaaaaatttgaaatataaataacgttctt aatactaacataactataaaaaaataaatagggacctagacttcaggttgtctaactccttccttttcggttagagcggatgtggggggagggcgtgaatgtaa gcgtgacataactaattacatgatatccttttgttgtttccgggtgtacaatatggacttcctcttttctggcaaccaaacccatacatcgggattcctataatacctt cgttggtctccctaacatgtaggtggcggaggggagatatacaatagaacagataccagacaagacataatgggctaaacaagactacaccaattacactg cctcangatggtggtacataacgaactaatactgtagccctagacttgatagccatcatcatatcgaagmcactaccctttttccatttgccatctattgaagtá ataataggcgcatgcaacttctmcttntttttcttttctctctcccccgttgttgtctcaccatatccgcaatgacaaaaaaaatgatggaagacactaaaggaaa aaattaacgacaaagacagcaccaacagatgtcgttgttccagagctgatgaggggtatcttcgaacacacgaaactttttccttccttcattcacgcacacta ctctctaatgagcaacggtatacggccttccttccagttacttgaatttgaaataaaaaaagtttgccgctttgctatcaagtataaatagacctgcaattattaatc ttttgtttcctcgtcartgttctcgtxcccmcttccttgtttctttttctgcacaatatttcaagctataccaagcatacaatcaactccaagcttgaagcaagcctcct gaaagatgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgactiaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctga agáacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaaca gctatttctactgattmcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattcrttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtg aataaagatgccgtcacagatagartggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagt agtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattctiaatacgacrcactatagggcatatggccatggaggccccggg
9 99 99 999 • · ♦ · 9 9 99 99
9 9 9 9 9 99
9.9 9 9 9 9 9 9 9· • 9 9 9 · · ·· ·· ···· ·· ··· ·· •
pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7
SEKVENCE ID.
Č. 9 gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgcagagatctatgaatcgtagatactgaaaaaccccgcaagrtcacttcaactgtgcatcgtgca ccatctcaatttctttcatttatacatcgttttgccttcttttatgtaactatactcctctaagtttcaatcttggccatgtaacctctgatctatagaartttttaaatgacta gaattaatgcccatcttttttnggacctaaattcttcatgaaaatauttacgagggcttattcagaagctttggacttcttcgccagaggmggtcaagtctccaa tcaaggttgtcggcttgtctaccttgccagaaatttacgaaaagatggaaaagggtcaaatcgttggtagatacgttgttgacacttctaaataagcgaatttctt atgatttatgatttttattattaaauagttauaaaaaaataagtgtatacaaatrttaaagtgactcttaggttttaaaacgaaaancttgttctxgagtaactctttcc· tgtaggtcaggttgctttctcaggtatagcatgaggtcgctcttangaccacacctctaccggcatgcccgaaattcccctaccctatgaacatattccattttgt aatttcgtgtcgtttctattatgaatttcatnataaagtttatgtacaaatatcataaaaaaagagaatctttttaagcaaggattttcttaacttcttcggcgacagca téaccgacttcggtggiactgnggaaccacctaaatcaccagttctgatacctgcatccaaaacctttttaactgcatcttcaatggccttaccttcttcaggcaa gttcaatgacaatttcaacatcattgcagcagacaagatagtggcgatagggtcaaccttattctttggcaaatctggagcagaaccgtggcatggttcgtaca aaccaaatgcggtgttcttgtctggcaaagaggccaaggacgcagatggcaacaaacccaaggaacctgggataacggaggcttcatcggagatgatatc accaaacatgttgctggtgattataataccamaggtgggttgggttcttaactaggatcatggcggcagaatcaatcaattgatgttgaaccttcaatgtagga aattcgttcttgatggtttcctccacagtmtctccataatcttgaagaggccaaaacattagctttatccaaggaccaaataggcaatggtggctcatgttgtag ggccatgaaagcggccattcttgtgattcmgcacttctggaacggtgtattgncactatcccaágcgacaccatcaccatcgtcttcctttctcttaccaaagt aaatacctcccactaattctctgacaacaacgaagtcagtacctttagcaaattgtggcttgattggagataagtctaaaagagagtcggatgcaaagttacat ggtcttaagttggcgtacaattgaagttctttacggatttttagtaaaccttgttcaggtctaacactacctgtaccccatttaggaccacccacagcacctaacaa aacggcatcaaccttcttggaggcttccagcgcctcatctggaagtgggacacctgtagcatcgatagcagcaccaccaattaaatgattttcgaaatcgaac ttgacattggaacgaacatcagaaatagcraaagáaccttaatggcttcggctgtgatttcttgaccaacgtggtcacctggcaaaacgacgatcttcttaggg gcagacattagaatggtatatccngaaatatautatatattgctgaaatgtaaaaggtaagaaaagttagaaagtaagacgattgctaaccacctattggaaa aaacaataggtccttaaataatattgtcaacncaagtattgtgatgcaagcatttagtcatgaacgcttctctattctatatgaaaagccggttccggcctctcac cmccttmctcccaatttttcagttgaaaaaggtatatgcgtcaggcgacctctgaaaKaacaaaaaamccagtcatcgaatttgattctgtgcgatagcgc ccctgtgtgttctcgttatgttgaggaaaaaaataatggttgctaagagattcgaactcttgcatcttacgatacctgagtattcccacagttggggatctcgactc tagctagaggatcaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaangttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaa agcctggggtgcctaatgagtgaggtaacicacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctggattaatgaatc ggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgc.tcnccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatc agctcactcaaaggcggtaatacggtiatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgta aaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaáaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggact ataaagataccaggcgmccccctggaagctccctčgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggataccígtccgccmctcccttcgggaagcg tggcgctttcteatagctcacgctgtaggtaictcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctg cgccttatccggtaacutcgttttgagíccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagčcactggtaacagganagcagagcgaggtatgt aggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaa agagttggtagctcngatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaa gatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggartttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatcctttt aaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctan tcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacg ctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgt tgccgggaagctagagtaagtagtrcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatčgtggtgtcacgctčgtcgtttggtatggcttca ncagctccggttcccaacgatcaaggcgagrtacatgaícccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagtt ggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataaltctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcat tctgagaatagtgtatgcggcgaccgagngctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcácccaactgatcttcagcatcttttactttcacc agcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataágggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatatt attgaagcatttatcagggnattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgcc acctgacgtctaagaaaccananatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtncggtgatgacggtgaaaacct ctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggt gtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccataacgcatttaagcataaacacgcactatgccgttcttctcatgtatat atatatacaggcaacacgcagatataggtgcgacgtgaacagtgagctgtatgtgcgcagctcgcgttgcatmcggaagcgctcgmtcggaaacgcttt gaagttcctattccgaagttcctattctcragctagaaagtataggaacttcagagcgcttttgaaaaccaaaagcgctctgaagacgcactttcaaaaaacca aaaacgcaccggac.tgtaacgagctactaaaatattgcgaataccgcttccacaaacattgctcaaaagtatctctttgctatatatctctgtgctatatccctata taacctecccatccacctttcgctccttgaacttgcatctaaactcgacctctacattttrtatgtttatctctagtattactctttagacaaaaaaattgtagtaagaac tattcatagagtgaatcgaaaacaatacgaaaatgtaaacatttcctatacgtagtatatagagacaaaatagaagaaaccgttcataatmctgaccaatgaa. gaatcatcaacgctatcacrnctgncacaaagtatgcgcaatccacatcggtatagaatataatcggggatgcctttatcttgaaaaaatgcacccgcagctt cgctagtaatcagtaaacgcgggaagtggagtcaggctttttttatggaagagaaaatagacaccaaagtagccttcttctaaccttaacggacctacagtgc aaaaagttatcaagagactgcattatagagcgcacaaaggagaaaaaaagtaatctaagatgctttgttagaaaaatagcgctctcgggatgcatttttgtaga acaaaaaagaagtatagattctttgnggtaaaatagcgctctcgcgttgcatttctgttctgtaaaaatgcagctcagattctrtgtttgaaaaattagcgctctcg • · ·
- 51 cgttgcatttttgttttacaaaaatgaagcacagattcttcgttggtaaaatagcgctttcgcgttgcatttctgttctgtaaaaatgcagctcagattctttgtttgaa aaattagcgctctcgcgttgcatttitgttctacaaaatgaagcacagatgcttcgttgcttgcatgcaacttcttttctttttttttcttttctctctcccccgttgttgtct caccatatccgcaatgacaaaaaaaatgatggaagacactaaaggaaaaaattaacgacaaagacagcaccaacagatgtcgttgttccagagctgatga ggggtatcttcgaacacacgaaactttttccttccttcattcacgcacactactctctaatgagcaacggtatacggccttccttccagttacttgaatttgaaataa aaaaagtttgccgctttgctatcaagtataaatagacctgcaattattaatcttttgtticctcgtcattgttctcgticcctttcttccttgtttctttttctgcacaatattt caagctataccaagcaUcaatcaactccaagctttgcaaagatggataaagcggaattaattcccgagcctccaaaaaagaagagaaaggtcgaattggg taccgccgccaattttaatcaaagtgggaatattgctgatagctcattgtccttcactttcactaacagtagcaácggtccgaacctcataacaactcaaacaaa ttctcaagcgctttcacaaccaattgcctccíctaacgttcatgataacttcatgaataatgaaatcacggctagtaaaattgatgatggtaataattcaaaaccac tgtcacctggttggacggaccaaactgcgtataacgcgtttggaatcactacagggatgtttaataccactacaatggatgatgtatataactatctattcgatga tgaagataccccaccaaacccaaaaaaagagatcgaattcttaatacgactcactatagggcccatggacgaagaatccagttcattcttatgtacctatgctg agaatcgtgccaataagaagccaatacttccttagatgatgcaataaatattaaaataaaacaaaacagaaggctg
Φ φφφ • φ φφφφ φφ φ φ φ φφ φ φ φφ φ φφφ φφ φ φφ φφ φφφφ φφ φφφ φφ ιΛ pGN205:
SEKVENCE ID. Č.
ccggtggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataagctttcgtcáttgaaaagaaggataagaatggacgatgggaagaagctctcgtt gttccaggagatcagaaaacagcaactgttccaaatcttaaggagggagaagaatatcaattcagaatrtctgctcgtaacaaggctggaactggaga tccttctgatccttctgatcgtgttgttgcgaagccaagaaaccttgctccaagaattcatcgtgaagatctttctgatacaactgtcaaggtcggagccac tctcaagttcattgttcatattgarggtgagccagcaccagatgtaacatggtcattcaatggaaaaggaatcggagagagcaaggctcaaattgaaaa tgagccatacatctcgagatttgctttgccaaaggcacttcgtaagcaaagtggaaaatataccatcactgcaaccaacattaatggaactgacagtgtc actatcaatatcaaggtaaaaagcaagccaacgaaaccaaagggaccaatcgaggtaactgatgtcttcgaagatcgtgcaactcttgactggaaac caccagaggatgacggaggagagccaattgagttctatgaaattgaaaagatgaacaccaaggacggaatctgggttccatgtggacgtagtggag atacccacttcacagtcgattcactcaacaagggagatcattacaagttccgtgtcaaggctgtcaacagcgaaggaccttctgatccartggaaactg aaaccgatattttggctaaaaaiccantgatcgtccagatagaccaggtcgtccagagccaactgattgggattctgalcatgttgatctcaagtgggat ccactagttctagaagcgctgctaagggggccctcgtcgagtcggtcacaatcacctgaaactccaaaggcagccagtgaggaacgtgaagaaga agaaLaaagagtcatctgaacaggmgattttctttctggtcaaaaagatgaaattattgattttcagccagatactcccaaaactagcagcgagaagtct gcaagtcgttcacagtcgcccagagaatcgcgggaagtgagccaagaggtatgtttttcaaaaatcaataactgatcataatttttattgtttggtgaam aagaaaataatattcgaaaattcetctgaattatcaagattgcagtattaatttcgagaaaaattgagatatrcatagagctattgtaaattttcttgamcag actgaaacttcggaaaatcaagagaaaatcaaagaaaaggatgacggggatgatcagcctggcacaccgaacagctatagaagccgggaaacttc accagctccaaaaaggtccaaggagaccaggtttgtcaaaagcttcctgcgattaattctcatttcaatttttcagagaatcagagtctcctgaaaaatcc ccggttcgttcaagatctcccagaaggtcttcagcacgttccccgtcacgatctcctagacggcgccgagaaagaagctcagaaagaaagcaatccg aagagccagcaccgctaccagagaaaaagaagaaagagccgctggatattctacgaacaagaaccggaggagcataíattccacccgccaaactt cgacttatgcaacaacagattagtgataagcaaagtgaacagtatcagagaatgaattgggaaagaatgaagaaaaagattcacggattggttaacag agtcaacgcgaagaatcttgttcaaattgtcagágaacttcttcaagagaatgtgattcgttcaaagtgagtgagaaaatcgaaggaaaaggaaagaat taatttaatttttcaggggacttctctgccgtgacattattcaagctcaggctttctcaccaggattctctaacgtctatgcagctttggcggcagttatcaac tcgaaattccctcatgtcggtgaacttcttctccgtcgtctgattgtacagttcaaaagaagrttccgtagaaatgacagaggcgtcacggtgaacgtgat caaattcatcgcacatttgattaatcaacaagttgctcacgaagrtcttgcgctggaaatcatgattctgatgcttgaagaaccaactgatgattcagttga agtcgccattgcgttcctgaaagagtgtggagcaaagcttctggagattgctccagcagctcttaacagtgtctacgaccgtcttcgtgcaattctcatg gaaactgaaagatcggaaaatgcactggatcgacgtattcagtatatgattgagactgcaatgcagancgaaaggacaaatttgcggtaaggtagaa tatataaatagtttattagaaaaaaataaattagaataatttaaattcctactagccaatcaggcgaccrttrtgcgcatagttctattattgaaaaatttggag aatttctcatattctcgctcggaaatctggaattcgacgagatcttctggcttctgtgcagctgcatcgcmgtgctccctttctcgcttgtcttcígtgtaca ccaagaaccttgttgagttcatcaactgaatctgtgactggcttgtTgctcactggatgcactagacgactgattctcgagaaatcagattgagttgcgatt agggtgacctagaaattgggaataatacgaacrtrtgaaaatattcaggaggattaaaaaaattattctcgacaatcctacaaatnacttartgcaccatgt tgctc.caacatttttcattaaaagttaatgaaaaaatgtagaaaatcggaaattggcaattítcagaccatttnaagcattttcaaaaaaaaattgcagctga aataaatgteattttcagataaatcgagcgattttctgttgtctgacactagtttttagttttaaaaaatgttggáagaacatggtgcaataggtaatncatag aatttccatgtgttttttttcaattaaccaattatccaaatcttccaaactcacatmgcggagctgggctatcaagaatctgctgcagtmataagacgagc atctctgatatcactgaaaattaartmaatcaaaacngaatatcaactaaacccacttattaactttctcgatcttctgtcgttcggtacgatgacggtgaa gaagccaattgtagtagttgamggncaagtcctticggtgttgtacgtcagtgtcctgcaatgctatttagttataacttaggcciaagattcaatnaatg aagtgattaaatttgttctctgaacctcttaagatgatcttttggattagaaacatataagacaggtttacctatctattaaaaaacagatcaaaatagatacg accaaatcggataatccatgcctacctggcatctaggaacgtgttcttagaagatttcttacgtaatcgtatgaagaaataacaatttgatcgttggccag caaaaatagggttttaagtgggaagtgtmtattagctaaccggaaaattttatagtttmtttgcaagaaaccactgaaaaccccctaattgtatacatttt nggagcagcttctggtctttttgagcaataaaattcgataaaacagaatrtaagtgtaaattgncacamagtttctattttatcaaattttgttgctcaaaaa cattcgaagctgctctaaaaaaatgcattaaaaaaggggmtcagrggtttttcacattaaaaaagctaatmaactaaaaatccatcatamccaacntg tcacaacaataaaatgctggtcaaaatgtgttcgaaaaaatgmratmtaattmataatttaaaaatagtntctttcgctgggacacatacatttttgggc gtaaattttcagttcaaatttccattmacaaccataatcalaaagctacgtctgatctctctcgcacttacctgcgcctgattcgaaagaacaaccgtagc caaaagaacaagaagaacaagcacgtagrtgtggtagtggacgttcatcacgcaatactgaccaatggtcgtggggtctcactttccgtactattgaga gaggggagactgaagatggcaattgaggacagtgtcttcgacgcacgcatgcatccataagcataatccaggagggatggagagaaaaatcttgttt ctaagcccctccctttgtaatacaucacatatcíaataccgaagaatggctaattgaatggacgtcagctgttgctgtagttgccaaggcatcatcgatg aaataactgaaagaaagaattaaataattattgcaggcgtatccggcggtcattgaagacttggacttgattgaggaggaggatcagatcatccataca cttaatttggaggatgcggttgatccggaaaatgggcttagxaagígactgaccacacgcggggggcattaatttaataaattgaattccatttcagatgt gttcaaactagatccagaattcgaaaagaacgaggaggtttatgaggagatqcgtaaggaaatcattggaaacgccgatatttcggatgaggatggtg gcgacgagttggatgatgaagaagagggtagtgatgtggaagaggctccgaagaagactacagagattattgataatactgatcagaattgactgctt tcagaaggtattcamtgagtrngegccggcaaatctgtaagttgccggttgccgaaaatttgctgaatttgccggaaaaaaaaattccggaatttattta aaaactttttgtaaaaattaaatiaaamgcaacttttcagagaagtctacctgacaatgcaatcatctttggactaccaagaagctgctcacaaattgctg aaaatgaagattccagacagcaigcaggtcagcgatgttgcaaagaaaaattttcgaccaaaaaaaccaaccaatcataaaatttaaaaaaaaactcc gtttxrttcmmntatacgagaaaaaccaaaaaaatgtatttttgccaaattctaaaatactatccccgaaattttcaatattttctctttcagaacgaactctg cgcgatgcttgtcgattgttgtgctcaacagcgtacctacgagcgattctacggaatgctcatcgaacgtttctgccgacttcgcctcgaataccagcaa tactttgaaaagctctgccaggacacgtattccacgattcaccgaattgacatcacaaaactgcggaatttggctcgccttattgctcatttgctctcgacg gatgctattgactggaagattttggccgatatgaaaatgaccgaagaggacacaacttcttctggcagaatctatattaaatatatatttaatgaacttgtg gaggcgatgggaatgg«aaacttcancgagagttactgatccgtgagtttcctagagagagttgttttcgtattcaattttccctattttcagaactttggct cattgctttgttggattattcccacgaactaatccgaacagcgcacgattttcgatcaacttcttcacaatgattggattgggtggtttgacgttggaacnc gtgaatggctggcaaagggtctcaagaagaagaagggaatgctggatcagttgaaggccgaatcaagctcagartcatcgtcgtcttcggattcgtca gactcgtctgattcttcggattctgacgancatccgactcgtcttcagattcctcatcttcttcagaatcagagccagáaccaccgaagaaaaagaagaa • · • · • 4 4 4 · 4 4 4 4 ·· · ·· · · · · 4 44 • · · 4 4 4 · 4 4 4· • · · 4 · · 4 «*
4· 4444 '44 444 44444 gaagaacagtgaagagagttccaaaaagaaggaaaaagagaatattggtcgacgggatcgtggagacaagagagctgaacgtcatcgtgatcaaa gtgtggagaacaaggacaaggatcgtcgacgtcgccaggattctgacgaaaatcgtcggccagaacgaggagatgaccgcaaggatcggagtaa agatcgtcgtcgtcaagactcggatgatgaggatcggaaaggtcgtgaacgtcgggaagattcaggggaaagacgtcgcggagatCgggatcgac gtgatcgaaacaaggatcaggaggatcaccgtgaagatcgccgtgaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgccgtcgtcatgactctg atgatgatcgtaaaactcgtcgggatagaagtgaagagcgaggaggacgtcgtcgtgaagtggaatcggatgatcgacgccgacgtcgttgaatttt caaattttaaatactgaatatttgttttttttcctattatttatttattctctttgtgttttttttcttgctttctaaaaaattaattcaatccaaatctaaacatgagcggtt ttttttctctttccgtctcccaattcgtattccgctcctctcatctgaacacaatgtgcaagtttatttatcttctcgctttcatttcattaggacgtggggggaatt ggtggaagggggaaacacacaaaaggatgatggaaatgaaataaggacacacaatatgcaacaacattcaattcagaaatatggaggaaggtttaa aagaaaacataaaaatatatagaggaggaaggaaaactagtaaaaaataagcaaagaaattaggcgaacgatgagaattgtcctcgcttggcaaatg cgaatccgtatggagaggcacgtttggcgaaggcaaatgttcggtatggagatctgtaaaaatttttaagttgaaatttggtgttgctcttttacaaaatttt ccgattttcgcttgaaattacggtgccaggtctcgacacgtcttccaatttttcaaattcaaaagagcctttaatgggctgtagttgctaatttctcgtttttga aaatttttcttccgtttaatcgaaatttgatgtattttatttatgattttcaataaatttcaaagaaactggtgaaaactcggaaaattgtgaactacagtaatcca atccttaaaggcgcacaccttttaaatgtccgccccaatacgatatttttrtaagattcgctagagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccct atagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccc cttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgtagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcg gcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttct cgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgat tagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaact ggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaa cgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatat gtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttg cggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactgga tctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttnccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtatt gacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggCat gacagtaagagaattatgcagtgctgccataagcatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaacc gctttttttcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgat gcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggata aagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcag cactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagat aggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaa gatccmttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagtxttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcc tttttttctgcgcgtaatctgctgcrtgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggt-ggtttgmgccggatcaagagctaccaacrcttptccgaaggt aactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctaca tacet cgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagc ggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaag cgccacgcťtcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggg aacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgattmgtgatgctcgtcaggggggccgagcctatggaaaaacg ccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcct ttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgc ctctccccgcgcgnggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagtta cctcactcattaggcaccccaggcmacacrttatgcttccggctcctatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatg accatgattacgccaagctcggaattaaccctcactaaagggaacaaaagctgggggggatcctccaaaatcgtcttccgctctgaaaaacgaaagt ggacctttgacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatgaaattgagctttrtgggtcgaaaaaaatgtttttagaatgctgagaacacgttaaacacgaag atcatatttattttgagacccggatgctctgaaaatgtctgacatagatttaaaaaagcatatatatatnttcattttcaacgtgaaagttttgtgcaactttata gaatctcctattggcacattgtttntatttaactgaggcagttntgaacacctttttgaaactttgaatctctttgaagtatactgtCgaaaagactgacttga gcgttcgaaatgccagaagaaaactatatttgaatctcgcgctaaattgagaaatgcaaccgcgctccactggacaattggaaaaaaaatttattcgga ggcgacaacggtattttcgaaattgatntčtgtgtattttctcattttttataaattcttctttgatttatcgttcgtttgtgagaaamaattgtattcaaactttttt atagtaagata • 4 pGN207:
SEKVENCE ID. Č. 11 ccggtggtaccgctagccgtacgaacccgggttctagaactagtggatcccacttgagatcaacatgatcagaatcccaatcagttggctctggacga cctggtctatctggacgatcaaatggattntagccaaaatatcggtttcagtttccaatggatcagaaggtccttcgctgttgacagccttgacacggaa cttgtaatgatctcccttgttgagtgaatcgactgtgaagtgggtatctccactacgtccacatggaacccagattccgtccttggtgttcatcmtcaattt catagaactcaattggctctcctccgtcatcctctggtggtttccagtcaagagttgcacgatcttcgaagacatcagttacctcgattggtccctttggttt . cgttggcttgctttttaccttgatattgatagtgacactgtcagttccattaatgttggttgcagigatggtatattttccactttgcttacgaagtgcctttggca aagcaaatctcgagatgtatggctcattttcaatttgagccttgctctctccgattcctntccattgaatgaccatgttacatctggtgctggctcaccatca atatgaacaatgaacttgagagtggctccgaccttgacagttgtatcagaaagatcttcacgatgaattcttggagcaaggtttcttggcttcgcaacaac acgatcagaaggatcagaaggatcTccagttccagccttgKacgagcagaaattctgaattgatattcttctccctccttaagatttggaacagttgctgt tttctgatctcctggaacaacgagagcttcttcccatcgtccattcttatccttcttttcaatgacgaaagcttatcgataccgtcgacctcgagggggggc cctcgtcgagtcggtcacaatcacctgaaactccaaaggcagccagtgaggaacgtgaagaagaagaaaaagagtcatctgaacaggmgattttct ttctggtcaaaaagatgaaattangattttcagccagatactcccaaaactagcagcgagaagtctgcaagtcgttcacagtcgcccagagaatcgcg ggaa.gtgagccaagaggtatgtmtcaaaaatcaataactgatcataattntartgmggtgaamaagaaaataa£ancgaaaattcctctgaattatc aagattgcagtattaatttcgagaaaaattgagatattcatagagctattgtaaattttcngatttcagacťgaaacttcggaaaatcaagagaaaatcaaa gaaaaggatgacggggatgatcagcctggcacaccgaacagctatagaagccgggaaacttcaccagctccaaaaaggtccaaggagaccaggt ttgtcaaaagcttcctgcgattaattctcamcaatttttcagagaatcagagtctcctgaaaaatccccggttcgttcaagatctcccagaaggtcttcag cacgttccccgtcacgatctcctagacggcgccgagaaagaagctcagaaagaaagcaatccgaagagccagcaccgctaccagagaaaaagaa. gaaagagccgctggatattctacgaacaagaacčggaggagcatatattccacccgccaaacttcgacttatgcaacaacagattagtgataagcaa agtgaacagtatcagagaatgaattgggaaagaatgaagaaaaagattcacggattggttaacagagtcaacgcgaagaaíctigttcaaattgtcag agaacttcttcaagagaatgtgattcgttcaaagtgagtgagaaaatcgaaggaaaaggaaagaattaatttaatttttcaggggacttctctgccgtgac attattcaagctcaggctttctcaccaggattctctaacgtctatgcagctttggcggcagttatcaactcgaaattccctcatgtcggtgaactrcttctcc gtcgtctgattgtacagttcaaaagaagtttccgtagaaatgacagaggcgtcacggtgaacgtgatcaaattcatcgcacatttgattaatcaacaagtt gctcacgaagttcttgcgctggaaatcatgattctgatgcttgaagaaccaactgaťgattcagttgaagtcgccattgcgttcctgaaagagtgtggag caaagcttctggagattgctccagcagctcttaacagtgtctacgaccgtcttcgtgcaattctcatggaaactgaaagatcggaaaatgcactggatcg acgtattcagtatatgattgagactgcaatgcagattcgaaaggacaaatttgcggtaaggtagaatatataaatagmattagaaaaaaaLaaattaga ataarttaaattcctactagccaatcaggcgacctttttgcgcatagttctattattgaaaaatttggagaatttctcatattctcgctcggaaatctggaattc gacgagatcttctggcttctgtgcagctgcatcgctttgtgctccctttctcgcttgtcttctgtgtacaccaagaaccttgttgagttcatcaactgaatctgt gactggcttgttgctcactggatgcactagacgactgattctcgagaaatcagattgagttgcgattagggtgacctagaaattgggaataatacgaact tttgaaaatattcaggaggattaaaaaaattattctcgacaatcctacaaatnacttattgcaccatgttgctccaacatOTcattaaaagttaatgaaaaa atgtagaaaatcggaaatíggcaattncagaccatttttaagcattttcaaaaaaaaattgcagctgaaataaatgttanncagataaatcgagcgatttt ctgttgtctgacactagtttttagttttaaaaaatgttggaagaacatggtgcaataggtaatttcatagaatttccatgtgtmmtcaattaaccaattatcc aaatcttccaaactcacatrttgcggagctgggctatcaagaatctgctgcagttttataagacgagcatctctgatatcactgaaaattaatrauatcaa aacttgaatatcaactaaacccacnattaacmctcgatcttctgtcgttcggtacgatgacggtgaagaagccaattgtagtagttgatttggttcaagtc ctttcggtgttgtacgtcagtgtcctgcaatgctatttagttataacttaggcctaagattcaatttaatgaagtgattaaatttgttctctgaacctcttaagat gatcttttggattagaaacatataagacaggtttacctatctattaaaaaacagatcaaaatagatacgaccaaatcggataatccatgcctacctggcat ctaggaacgtgttcttagaagatttcttacgtaatcgtatgaagaaataacaatttgatcgttggccagcaaaaatagggttttaagtgggatagtgtttttat tagctaaccggaaaattttaragmmtttgcaagaaaccactgaaaaccecctaangtatacattttnggagcagcttciggtctttttgagcaataaaat tcgataaaacagaatttaagtgtaaattgttcacatttagtttctattttatcaaattttgngctcaaaaacattcgaagctgctctaaaaaaatgcattaaaaa aggggttttcagtggtttttcacattaaaaaagctaattttaactaaaaatccatcatatttccaactttgtcacaacaataaaatgctggtcaaaatgtgttcg aaaaaatgtttttttttttaatttttataantaaaaatagttttctttcgctgggacacatacatnttgggcgtaaattttcagttcaaatttccatttttacaáccat aatcataaagctacgtctgatctctctcgcacttacctgcgcctgattcgaaagaacaaccgtagccaaaagaacaagaagaacaagcacgtagttgt. ggtagtggacgttcatcacgcaatactgaccaatggtcgtggggtctcactttccgtactattgagagaggggagactgaagatggcaattgaggaca gtgtcttcgacgcacgcatgeatccataagcataatccaggagggatggagagaaaaatcttgtttctaagcccctccctttgtaatacatacacatatct aataccgaagaatggctaattgaatggacgtcagctgttgctgtagttgccaaggcatcatcgatgaaaraactgaaagaaagaattaaataattattgc aggcgtatccggcggtcattgaagacttggacttgattgaggaggaggatcagatcatccatacacttaatttggaggatgcggttgatccggaaaatg ggcttagtaagtgactgaccacacgCggggggcattaatttaataaattgaatíccatttcagatgtgttcaaactagatccagaattcgaaaagaacga ggaggtttatgaggagatccgtaaggaaatcattggaaacgccgatatttcggatgaggatggtggcgacgagttggatgatgaagaagagggtagt gatgtggaagaggctccgaagaagactacagagattattgataatactgatcagaattgactgctttcagaaggtattcatmgagttttgggccggcaa atctgtaagttgccggttgccgaaaatttgctgaatttgccggaaaaaaaaattccggaatttatttaaaaactrtttgtaaaaattaaattaaatttgcaactt ttcagagaagtctacctgacaatgcaatcatctttggactaccaagaagctgctcacaaattgctgaaaatgaagattccagacagcatgcaggtcagc gatgttgcaáagaaaaatmcgaccaaaaaaaccaaccaatcataaaatttaaaaaaaaactccgtttmtctttttmtatacgagaaaaaccaaaaaa atgtatttttgccaaattctaaaatactatccccgaaattttcaatamtctcmcagaacgaactctgcgcgatgcttgtcgattgttgtgctcaácagcgta cctacgagcgattctacggaatgcteatcgaacgtttctgccgacttcgcctcgaataccagcaatacmgaaaagctctgccaggacacgtattccaq gattcaccgaattgacatcacaaaactgcggaatttggctcgccttattgctcatttgctctcgacggatgctattgactggaagattttggccgatatgaa aatgaccgaagaggacacaacttcttctggcagaatctatattaaatatatatttaatgaacttgtggaggcgatgggaatggttaaacttcancgagag ttactgatccgtgagtttcctagagagagttgttttcgtattcaattttccctatntcagaactttggctcattgctttgttggatuncccacgaactaatccg aacagcgcacgattttcgatcaacttcncacaatgattggattgggtggtngacgttggaacttcgtgaatggctggcaaagggtctcaagaagaaga agggaatgctggatcagttgaaggccgaatcaagctcagattcatcgtcgtcttcggattcgtcagactcgtctgattcttcggattctgacgattcatcc gactcgtcttcagattcctcatcncncagaatcagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaagaagaacagtgaagagagttccaaaaagaag gaaaaagagaatattggtcgacgggatcgtggagacaagagagctgaacgtcatcgtgatcaaagtgtggagaacaaggacaaggatcgtcgacg tcgccaggattctgacgaaaatcgtcggccagaacgaggagatgaccgcaaggatcggagtaaagatcgtcgxcgtcaagactcggatgatgagg atcggaaaggtcgtgaacgicgggaagattcaggggaaagacgtcgcggagatcgggatcgacglgatcgaaacaaggatcaggaggatcaccg tgaagatcgccgtgaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgccgtcgtcatgactctgatgatgatcgtaaaactcgtcgggatagaagt gaagagcgaggaggacgtcgtcgtgaagxggaatcggatgatcgacgccgacgtcgttgaatxttcaaatxttaaatacxgaatattxgtxtttlttcctatt atttatttattctctttgtgttttnncrtgctttctaaaaaattaattcaatccaaatctaaacatgagcggttttttttctctttccgtctcccaattcgtattccgct cctctcatctgaacacaatgtgcaagtttatttatcttctcgctttcatncattaggacgtggggggaattggtggaagggggaaacacacaaaaggatg atggaaatgaaataaggacacacaatatgcaacaacatXcaattcagaaalatggaggaaggtttaaaagaaaacataaaaatatatagaggaggaa ggaaaactaglaaaaaataagcaaagaaatxaggcgaacgatgagaattglcctcgcttggcaaatgcgaatccgtatggagaggcacgtxxggcga aggcaaatgttcggtatggagatctgtaaaaatttttaagttgaaatttggtgttgctcttttacaaaattttccgattttcgcttgaaattacggtgccaggtct cgacacgtcttccaatttttcaaattcaaaagagcctttaatgggctgtagttgctaatttctcgtttttgaaaatttttcttccgtttaatcgaaatttgatgtattt tatttatgattttcaataaarttcaaagaaactggtgaaaactcggaaaattgtgaactacagtaatccaatccttaaaggcgcacaccttttaaatgtccgc cccaatacgatatttttnaagattcgctagagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccctatagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgt tttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccccttcgccagctggčgtaatagcgaagaggccc gcaccgatcgcccttcccaacagttgcgtagcctgaatggcgaatgggacgcgcčctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgc gcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttc.ctnctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctcta aatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccct gatagacggtttttcgccctngacgttggagtccacgttcmaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctateícggtctattctttt gatttataagggattttgccgamcggcctatiggttaaaaaatgagctgatnaacaaaaamaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttca ggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatngtttatttnctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgc ttcaataaxattgaaaaaggaagagtatgagxatxcaacatixccgtgxcgccctxatxcccxxixixgcggcatxttgcctxcctgttragctcacccagaaac gctggtgaaagtaaaagatgcxgaagatcagttgggtgcacgagtgggitacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcc ccgaagaacgttnccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcat acactatxctcagaaxgactxggtxgagxactcaccagtcacagaaaagcatctxacggatggcatgacagxaagagaatxatgcagxgcxgccaxaag catgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgctmrncacaacatgggggatcatgtaactcg ccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaact aRaactggcgaactactxactctagctxcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccactlctgcgctcggcccttcc ggctggctggtttatlgctgaiaaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcangcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgt agttatctacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcag accaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatccttnxgataatctcatgaccaaaatcccttaa cglgagXtttcgttccactgagcgxcagaccccgxagaaaagatcaaaggatcttcttgagatccrtttttxctgcgcgTaatcxgctgcttgcaaacaaaa aaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatact gtccttctagtgtagccgtagttaggcčaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgcíaatcctgrtaccagtggctgctgccag tggcgataágtcgtgtcttaccgggnggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcc cagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttčccgaagggagaaaggcggacagg tatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccaggggggaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccac ctctgacttgagcgtcgatnngtgatgctcgtcaggggggccgagcctatggaaaaacgccagcaacgcggccnntacggttcctggccttttgct ggcctntgctcacatgnctncctgcgnatcccctgattctgtggataaccgtartaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaaqga ccgagcgcagcgagxcagxgagcgaggaagcggaagagcgcccaaxacgcaaaccgccxcxccccgcgcgxiggccgatxcatxaatgcagcxg gcacgacaggmcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttacctcactcattággcaccccaggctrtacactnatgct tccggctcctatgttgtgtggaatigtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctcggaattaaccctcactaa agggaacaaaagctgggggggatcctccaaaatcgtcttccgctctgaaaaacgaaagtggacctttgacatccgaaaaáatgggcgaaaaaatga aattgagctxxrtgggxcgaaaaaaatgttxxxagaatgcxgagaacacgtiaaacacgaagaicatatxtatrttgagacccggatgctcxgaaaatgxctg acatagatxxaaaaaagcafatatatarxmcatxxtcaacgigaaagxtxtgigcaactxxatagaatclcctaxtggcacattgtttxxtaxttaactgaggcag tttttgaacacctttttgaaactttgaatctctxxgaagtalactgtcgaaaagactgacttgagcgtxcgaaatgccagaagaaaacxaxatngaatctcgc gctaaattgagaaatgcaaccgcgctccactggacaaňggaaaaaaaatttattcggaggcgacaacggtattttcgaaattgattttctgtgtattttct catrnxxataaatxctxctixgatxtatcgtxcgmgtgagaaatxxaatigtaticaaacrtxmatagtaagata • 9
999999
9999 9 9 999999
9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 9 9 9 99
9999 99 999 99 999
Claims (18)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob přípravy transgenniho organismu, s výjimkou člověka, obsahujícího exogenni transkripční faktor a transgen obsahující promotor operativně spojený s fragmentem DNA, který je exprimován po navázání transkripčního faktoru na tento promotor, kterýžto . způsob se vyznačuje t i m, že obsahuje kroky, kdy se .a) připraví I) první transgenní organismus tím, že se organismu jako potrava podá mikroorganismus obsahující první konstrukt, který obsahuje DNA kódující exogenni transkripční faktor a II) druhý transgenní organismus tím, že se organismu jako potrava podá mikroorganismus obsahující druhý konstrukt, který obsahuje alespoň jeden promotor operativně spojený s požadovanou sekvencí DNA, která je exprimována po navázání transkripčního· ' faktoru prvního transgenniho organismu na tento promotor, ab) první a druhý organismus se kříží a selektuje se potomstvo exprimující požadovanou sekvenci DNA.
- 2. Způsob- podle nároku 1 vyznačující se tím, že druhý konstrukt obsahuje požadovanou sekvenci. DNA v takové orientaci vzhledem k promotoru, že je promotor schopen iniciovat transkripci DNA na dsRNA po navázání transkripčního faktoru na promotor.
- 3. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že druhý konstrukt obsahuje dva promotory lemující požadovanou sekvenci DNA, přičemž promotory jsou schopny iniciovat transkripci DNA na dsRNA po navázání transkripčního faktoru na promotory.- .57 -
- 4. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že sekvence DNA je v sense i antisense orientaci vzhledem k promotoru, takže po navázání transkripčního faktoru na promotor se vytváří dsRNA.
- 5.Způsob a č u j dále v y z n organismus s promotorem, reportérového podle i c i obsahuj e který genu po kteréhokoliv tím, nároků 1 až 4 druhý operativně iniciovat že gen reportérový je schopen navázání transkripčního transgenni spoj ený transkripci faktoru na promotor.
- 6. ' Způsob podle vyznačuj ící obsahuj e kteréhokoliv z tím, že nároků transkripční až 5 faktor tím, že polymerázu.Způsob podle nároku polymeráza obsahuje kteroukoliv cl u u j i c polymerázT7,T3 a SP6.Způsob podle a č u j i .c i kteréhokoliv z nároků až v y z n kterýkoliv z promotorů tím, že promotory obsahuj íT3, T7 a SP6.
- 9. Způsob podle tím, že reportérový gen obsahuje kódujících . luciferázu, zelený nároku y z n kteroukoliv ze fluorescenční.i se sekvencí protein, β-galaktosidázu a β-laktamázu.
- 10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že organismus je druh hlistice (Nematoda) .
- 11. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím; že druh hlístice je C. elegans.
- 12. Způsob vnesení dsRNA nebo DNA schopné produkovat dsRNA do organismu vyznačující se tím, že obsahuje krmení organismu vhodným mikroorganismem· obsahujícím kterýkoliv z následujících expresních vektorů a) až h):a) expresní vektor obsahující promotor nebo promotory orientované vzhledem k sekvenci DNA tak, že jsou po navázání vhodného transkripčního faktoru na promotor nebo promotory schopné iniciovat transkripci DNA do dvouřetězcové RNA,b) expresní vektor podle a) obsahující dva identické promotory lemující sekvenci DNA,c) expresní vektor podle a) obsahující sekvenci DNA. v sense a antisense orientaci vzhledem k promotoru, d) expresní vektor podle a), b) nebo c) dále obsahující nukleotidovou sekvenci kódující selekční, markér,e) expresní vektor podle d) kde nukleotidová sekvence kódující' selekční markér je orientovaná vzhledem k promotoru (promotorům) tak, že po navázání vhodného transkripčního faktoru na promotor (promotory) dojde k transkripci nukleotidové sekvence na dvouřetězcovou RNA,f) expresní vektor podle e), kde nukleotidová sekvence kódující selekční markér leží mezi dvěma identickými promotory schopnými iniciovat po navázání vhodného transkripčního faktoru na promotory transkripci nukleotidové sekvence na dsRNA,g) expresní vektor podle e) kde nukleotidová sekvence kódující selekční markér je v sense a antisense orientaci vzhledem k promotoru, takže po navázání vhodného transkripčního faktoru na promotor dojde k transkripci nukleotidové sekvence na dsRNA,h) expresní vektor podle.d) nebo e) kde selekční markér obsahuje nuk-leotidovou sekvenci kódující sup-35 pro vnesení ·· ♦·999 9 9 9 .9 999 9 9 999 9 9 9 9999 9999 999999 9 99 99 9 999 99 9 do C.elegans s mutaci pha-1 nebo pro krmeni organismu přímo kterýmkoliv expresním vektorem podle a) až h) .
13. Způsob podle nároku 12 vyznačuj i c i se tím, že mikroorganismus ; nebo organismus je adaptován tak, že exprimuje transkripční faktor. 14. Způsob podle nároku 13 vyznačuj i c i se tím, že buďto organismus nebo mikroorganismus obsahuje kterýkoliv z výše uvedených expresních vektorů a) až h) nebo z následujících expresních vektorů i) až k) :i) expresní vektor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující vhodný transkripční faktor pro použiti při způsobech podle kteréhokoliv z předchozích nároků, který je operativně spojen s vhodnou sekvenci pro řízení exprese,j) expresní vektor podle i) . kde sekvence pro řízení exprese obsahuje promotory, které jsou indukovatelné, konstitutivní, všeobecné nebo tkáňově specifické, nebo jejich kombinaci,k) expresní vektor podle i) nebo j) kde transkripční faktor obsahuje fágovou polymerázu, výhodně T7 RNA polymerázu. - 15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 12 až 14 vyznačující se tím, že organismus je C. elegans a mikroorganimsus je E. coli.
16. tím, že Způsob podle kmen E. coli je nároku 15 vyznačujíc i se kmen negativní na RNázu III. 17 . Způsob podle kteréhokoliv z nároků 12 až 14 v y z n a č u j ící s e tím, že organismus je mutanta C. elegans nuc-1.♦ · ·· ·· · ·· · • · · · · 9 ··44·· • · 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 99'9 9 9 9 9'9 9 9999 9999 99 999 99999 - 18. Způsob vnesení dsRNA nebo DNA schopné produkovat dsRNA do organismu vyznačující se tím, že obsahuje krmení organismu vhodným mikroorganismem obsahujícím kterýkoliv z expresních vektorů a) až h) podle nároku 12 nebo krmení organismu přímo kterýmkoliv z expresních vektorů a) až h) podle nároku 12.
- 19. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že mikroorganismus nebo organismus je adaptován tak, že exprimuje transkripční faktor.
- 20. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že buďto mikroorganismus nebo organismus obsahuje kterýkoliv z expresních vektorů i) až k) podle nároku 14.
- 21. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20 vyznačující se tím, že organismus je C. elegans a mikroorganismus je E. coli.
- 22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že že kmen E. coli je kmen negativní na RNázu III.
- 23. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20 vyznačující se tím, že organismus je mutanta C. elegans nuc-1.
- 24. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že transkripční faktor je T7 RNA polymeráza.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9814536.0A GB9814536D0 (en) | 1998-07-03 | 1998-07-03 | Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition |
GBGB9827152.1A GB9827152D0 (en) | 1998-07-03 | 1998-12-09 | Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ200114A3 true CZ200114A3 (en) | 2001-06-13 |
CZ303494B6 CZ303494B6 (cs) | 2012-10-24 |
Family
ID=26313977
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2012-309A CZ304897B6 (cs) | 1998-07-03 | 1999-07-02 | Způsob vnesení dvouřetězcové RNA nebo DNA schopné produkovat dvouřetězcovou RNA a neterapeutické použití bakteriální nebo kvasinkové buňky |
CZ20010014A CZ303494B6 (cs) | 1998-07-03 | 1999-07-02 | Zpusob omezení zamorení rostlin škudcem, rostlina obsahující sekvenci DNA ze škudce a použití vektoru, ve kterém jsou sekvence DNA ze škudce |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2012-309A CZ304897B6 (cs) | 1998-07-03 | 1999-07-02 | Způsob vnesení dvouřetězcové RNA nebo DNA schopné produkovat dvouřetězcovou RNA a neterapeutické použití bakteriální nebo kvasinkové buňky |
Country Status (28)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20030061626A1 (cs) |
EP (5) | EP2045336A3 (cs) |
JP (3) | JP4353639B2 (cs) |
KR (4) | KR20070041607A (cs) |
CN (3) | CN1657620A (cs) |
AT (2) | ATE433500T1 (cs) |
AU (1) | AU769223B2 (cs) |
BR (1) | BR9911802A (cs) |
CA (2) | CA2789083C (cs) |
CY (2) | CY1108920T1 (cs) |
CZ (2) | CZ304897B6 (cs) |
DE (5) | DE1093526T1 (cs) |
DK (2) | DK1197567T4 (cs) |
ES (2) | ES2320527T5 (cs) |
GB (4) | GB9827152D0 (cs) |
HK (1) | HK1029142A1 (cs) |
HU (1) | HU230602B1 (cs) |
IL (3) | IL140467A0 (cs) |
IN (2) | IN2001DE00006A (cs) |
IS (1) | IS2816B (cs) |
MX (1) | MX234065B (cs) |
NO (1) | NO327729B1 (cs) |
NZ (1) | NZ509182A (cs) |
PL (3) | PL201425B1 (cs) |
PT (2) | PT1197567E (cs) |
RU (1) | RU2240349C2 (cs) |
WO (1) | WO2000001846A2 (cs) |
ZA (1) | ZA200007653B (cs) |
Families Citing this family (253)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6506559B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
AUPP249298A0 (en) * | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
CA2487328A1 (en) * | 1998-03-20 | 1999-09-30 | Benitec Australia Ltd. | Sirna for control of gene expression |
GB9827152D0 (en) | 1998-07-03 | 1999-02-03 | Devgen Nv | Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition |
EP2314700A1 (en) * | 1999-01-28 | 2011-04-27 | Medical College of Georgia Research Institute, Inc | Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded RNA |
DE19956568A1 (de) | 1999-01-30 | 2000-08-17 | Roland Kreutzer | Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens |
US7601494B2 (en) | 1999-03-17 | 2009-10-13 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Method of screening candidate compounds for susceptibility to biliary excretion |
US20040138168A1 (en) * | 1999-04-21 | 2004-07-15 | Wyeth | Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences |
BR0009884A (pt) * | 1999-04-21 | 2002-01-08 | American Home Prod | Processos e composições para a inibição da função das sequências de polinucleotìdeos |
US6924109B2 (en) * | 1999-07-30 | 2005-08-02 | Agy Therapeutics, Inc. | High-throughput transcriptome and functional validation analysis |
US6423885B1 (en) | 1999-08-13 | 2002-07-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) | Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells |
EP1235842A4 (en) | 1999-10-15 | 2003-04-23 | Univ Massachusetts | GENESIS OF THE RNA INTERFERENCE PATH AS AID OF TARGETED GENTIAN INTERFERENCE |
GB9927444D0 (en) * | 1999-11-19 | 2000-01-19 | Cancer Res Campaign Tech | Inhibiting gene expression |
US7829693B2 (en) | 1999-11-24 | 2010-11-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene |
DE10100586C1 (de) | 2001-01-09 | 2002-04-11 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens |
GB9930691D0 (en) * | 1999-12-24 | 2000-02-16 | Devgen Nv | Improvements relating to double-stranded RNA inhibition |
US7491805B2 (en) | 2001-05-18 | 2009-02-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
US8273866B2 (en) | 2002-02-20 | 2012-09-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA) |
US8202979B2 (en) | 2002-02-20 | 2012-06-19 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid |
US7833992B2 (en) | 2001-05-18 | 2010-11-16 | Merck Sharpe & Dohme | Conjugates and compositions for cellular delivery |
AU2001245793A1 (en) | 2000-03-16 | 2001-09-24 | Cold Spring Harbor Laboratory | Methods and compositions for rna interference |
US8202846B2 (en) | 2000-03-16 | 2012-06-19 | Cold Spring Harbor Laboratory | Methods and compositions for RNA interference |
IL151928A0 (en) | 2000-03-30 | 2003-04-10 | Whitehead Biomedical Inst | Rna sequence-specific mediators of rna interference |
US7083947B2 (en) | 2000-05-19 | 2006-08-01 | Devgen Nv | Assay techniques using nematode worms |
GB0012229D0 (en) | 2000-05-19 | 2000-07-12 | Devgen Nv | Lipid uptake assays |
GB0012233D0 (en) | 2000-05-19 | 2000-07-12 | Devgen Nv | Vector constructs |
GB2362383B (en) * | 2000-05-19 | 2003-12-31 | Devgen Nv | Gene expression system |
AU2001275474A1 (en) * | 2000-06-12 | 2001-12-24 | Akkadix Corporation | Materials and methods for the control of nematodes |
US20030190635A1 (en) * | 2002-02-20 | 2003-10-09 | Mcswiggen James A. | RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA |
JP4095895B2 (ja) | 2000-12-01 | 2008-06-04 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フォーデルング デル ヴィッセンシャフテン エー.ヴェー. | Rna干渉を媒介する短鎖rna分子 |
US7423142B2 (en) | 2001-01-09 | 2008-09-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes |
US7767802B2 (en) | 2001-01-09 | 2010-08-03 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes |
US8546143B2 (en) | 2001-01-09 | 2013-10-01 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene |
CA2441209C (en) * | 2001-01-25 | 2012-11-13 | Virxsys Corporation | Methods and compositions for identifying gene function |
WO2002059294A1 (en) | 2001-01-26 | 2002-08-01 | Commonwealth Scientific And Industrial Research O Rganisation | Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning |
CA2369944A1 (en) | 2001-01-31 | 2002-07-31 | Nucleonics Inc. | Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell |
WO2002063037A2 (en) * | 2001-02-02 | 2002-08-15 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Method for identifying functional nucleic acids |
US7109165B2 (en) | 2001-05-18 | 2006-09-19 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
US20050148530A1 (en) | 2002-02-20 | 2005-07-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
WO2003070884A2 (en) * | 2002-02-20 | 2003-08-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MDR P-GLYCOPROTEIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
WO2003102131A2 (en) * | 2002-04-22 | 2003-12-11 | Sirna Therapeutics Inc. | Nucleic acid mediated disruption of hiv fusogenic peptide interactions |
EP1572067A4 (en) | 2001-05-18 | 2009-05-13 | Sirna Therapeutics Inc | CONJUGATES AND COMPOSITIONS FOR CELL DELIVERY |
WO2003070972A2 (en) * | 2002-02-20 | 2003-08-28 | Sirna Therapeutics Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
WO2003070887A2 (en) * | 2002-02-20 | 2003-08-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF POLYCOMB GROUP PROTEIN EZH2 GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
US9994853B2 (en) | 2001-05-18 | 2018-06-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference |
BR0211111A (pt) | 2001-07-12 | 2004-06-22 | Univ Massachusetts | Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, transgene, precursor de rna engenheirado, animal transgênico não humano, e, método de induzir a interferência de ácido ribonucleico de um gene alvo em uma célula |
US7612194B2 (en) * | 2001-07-24 | 2009-11-03 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof |
JP4863602B2 (ja) * | 2001-08-31 | 2012-01-25 | 独立行政法人理化学研究所 | 完全長cDNAを用いた総合的遺伝子機能解析の植物システム |
US7745418B2 (en) | 2001-10-12 | 2010-06-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting viral replication |
DE10163098B4 (de) | 2001-10-12 | 2005-06-02 | Alnylam Europe Ag | Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren |
US20030150017A1 (en) * | 2001-11-07 | 2003-08-07 | Mesa Jose Ramon Botella | Method for facilitating pathogen resistance |
DE10202419A1 (de) | 2002-01-22 | 2003-08-07 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens |
US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
EP2221377B2 (en) | 2002-02-01 | 2017-05-17 | Life Technologies Corporation | Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency |
US20030166282A1 (en) * | 2002-02-01 | 2003-09-04 | David Brown | High potency siRNAS for reducing the expression of target genes |
AU2003207708A1 (en) | 2002-02-20 | 2003-09-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | Rna interference mediated inhibition of map kinase genes |
US7667029B2 (en) | 2002-02-20 | 2010-02-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
EP1474433A4 (en) * | 2002-02-20 | 2005-02-23 | Sirna Therapeutics Inc | TARGET LOCALIZATION TARGETED BY RNA INTERFERENCE AND TARGET VALIDATION WITH SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
EP1465910A4 (en) * | 2002-02-20 | 2005-03-16 | Sirna Therapeutics Inc | INHIBITION OF EXPRESSION OF RNA I-MEDIATED GENE CHECKPOINT KINASE-1 (CHK-1) USING NEAR-INTERFERENCE NUCLEIC ACID |
US9657294B2 (en) | 2002-02-20 | 2017-05-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
US9181551B2 (en) | 2002-02-20 | 2015-11-10 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
US20040180438A1 (en) | 2002-04-26 | 2004-09-16 | Pachuk Catherine J. | Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity |
WO2003095652A2 (de) * | 2002-05-08 | 2003-11-20 | Xantos Biomedicine Ag | EXPRESSIONSKONSTRUKTE ZUR HERSTELLUNG VON DOPPELSTRANG (ds) RNA UND DEREN ANWENDUNG |
AU2003239706A1 (en) * | 2002-05-23 | 2003-12-12 | Devgen Nv | Method for determining the influence of a compound on cholesterol transport |
US20100009856A1 (en) * | 2002-06-21 | 2010-01-14 | Sinogenomax Sompany LTD. | Randomized dna libraries and double-stranded rna libraries, use and method of production thereof |
AU2003247951A1 (en) * | 2002-07-10 | 2004-01-23 | Kansas State University Research Foundation | Compositions and methods for controlling parasitic nematodes |
US7655790B2 (en) | 2002-07-12 | 2010-02-02 | Sirna Therapeutics, Inc. | Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives |
EP2258847B2 (en) | 2002-08-05 | 2020-07-01 | Silence Therapeutics GmbH | Futher novel forms of interfering RNA molecules |
US8729036B2 (en) | 2002-08-07 | 2014-05-20 | University Of Massachusetts | Compositions for RNA interference and methods of use thereof |
EP1534832A2 (en) * | 2002-09-04 | 2005-06-01 | Provost, Fellows and Scholars of the College of the Holy and Undivided Trinity of Queen Elizabeth near Dublin | Compositions and methods for tissue specific or inducible inhibition of gene expression |
US7923547B2 (en) | 2002-09-05 | 2011-04-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
CA2507189C (en) | 2002-11-27 | 2018-06-12 | Sequenom, Inc. | Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery |
EP1597361A2 (en) * | 2002-12-23 | 2005-11-23 | Devgen NV | Kinase sequences useful for developing compounds for the prevention and/or treatment of metabolic diseases and nucleotide sequences encoding such kinase sequences |
EP1622572B1 (en) | 2003-04-30 | 2017-12-20 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
IL155783A (en) | 2003-05-05 | 2010-11-30 | Technion Res & Dev Foundation | Multicellular systems of multi-potential embryonic human stem cells and cancer cells and their use |
ATE516047T1 (de) | 2003-05-09 | 2011-07-15 | Diadexus Inc | Ovr110-antikörperzusammensetzungen und anwendungsverfahren |
AU2005212433B2 (en) | 2003-05-23 | 2010-12-16 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional sINA) |
US20070092910A1 (en) * | 2003-06-17 | 2007-04-26 | Devgen Nv | Alcohol dehydrogenase sequences useful for developing compounds for the prevention and/or treatment of metabolic diseases |
WO2005024068A2 (en) | 2003-09-05 | 2005-03-17 | Sequenom, Inc. | Allele-specific sequence variation analysis |
ATE526407T1 (de) * | 2003-11-17 | 2011-10-15 | Commw Scient Ind Res Org | Insektenresistenz durch inhibierung von genexpression |
JP4682152B2 (ja) | 2003-12-31 | 2011-05-11 | ザ・ペン・ステート・リサーチ・ファンデーション | 卵巣がんの化学療法に対する抵抗性を予測および克服するための方法ならびに結腸がんの発生を予測するための方法 |
US20060019914A1 (en) | 2004-02-11 | 2006-01-26 | University Of Tennessee Research Foundation | Inhibition of tumor growth and invasion by anti-matrix metalloproteinase DNAzymes |
US7622301B2 (en) * | 2004-02-24 | 2009-11-24 | Basf Plant Science Gmbh | Compositions and methods using RNA interference for control of nematodes |
US7608394B2 (en) * | 2004-03-26 | 2009-10-27 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation |
EP2395098B1 (en) | 2004-03-26 | 2015-07-15 | Agena Bioscience, Inc. | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis |
DK1734996T3 (da) | 2004-04-02 | 2013-06-10 | Univ California | Fremgangsmåder og sammensætninger til behandling og forebyggelse af sygdom, der er associeret med alfa v beta 5-integrin |
CA2693280C (en) | 2004-04-09 | 2017-09-12 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
WO2005105157A2 (en) | 2004-04-23 | 2005-11-10 | The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York | INHIBITION OF HAIRLESS PROTEIN mRNA |
US10508277B2 (en) | 2004-05-24 | 2019-12-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference |
WO2006009575A1 (en) | 2004-06-22 | 2006-01-26 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | METHODS OF INHIBITING TUMOR CELL PROLIFERATION WITH FOXM1 siRNA |
US7968762B2 (en) | 2004-07-13 | 2011-06-28 | Van Andel Research Institute | Immune-compromised transgenic mice expressing human hepatocyte growth factor (hHGF) |
EP1782321A4 (en) | 2004-07-23 | 2009-11-04 | Univ North Carolina | METHOD AND MATERIALS FOR DETERMINING PAIN SENSITIVITY AND PREDICTING AND TREATING SUFFERING INTERFERENCE |
WO2006017932A1 (en) | 2004-08-18 | 2006-02-23 | Genesense Technologies Inc. | Small interfering rna molecules against ribonucleotide reductase and uses thereof |
EP2444497B1 (en) | 2004-09-24 | 2015-01-28 | J.R. Simplot Company | Gene silencing |
US20060247197A1 (en) | 2004-10-04 | 2006-11-02 | Van De Craen Marc | Method for down-regulating gene expression in fungi |
EP1799029B1 (en) * | 2004-10-13 | 2012-05-16 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Nematode resistant transgenic plants |
EP2336333A1 (en) | 2004-10-21 | 2011-06-22 | Venganza Inc. | Methods and materials for conferring resistance to pests and pathogens of plants |
EP1807520B1 (en) | 2004-10-25 | 2012-07-25 | Devgen NV | Rna constructs |
WO2006045591A2 (en) * | 2004-10-25 | 2006-05-04 | Devgen N.V. | Method and constructs for delivering double stranded rna to pest organisms |
US7964195B2 (en) | 2005-01-07 | 2011-06-21 | Diadexus, Inc. | Ovr110 antibody compositions and methods of use |
US8088976B2 (en) * | 2005-02-24 | 2012-01-03 | Monsanto Technology Llc | Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof |
DE202005004135U1 (de) * | 2005-03-11 | 2005-05-19 | Klocke Verpackungs-Service Gmbh | Mehrkomponentenverpackung mit Applikator |
DK1866414T3 (da) | 2005-03-31 | 2012-04-23 | Calando Pharmaceuticals Inc | Inhibitorer af ribonukleotidreduktase-underenhed 2 og anvendelser deraf. |
JP2008540571A (ja) | 2005-05-12 | 2008-11-20 | ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション | Pin1の遮断は活性化した免疫細胞によるサイトカイン産生を防ぐ |
CA2610644A1 (en) | 2005-05-31 | 2006-12-07 | Devgen Nv | Rnai for control of insects and arachnids |
WO2007011702A2 (en) | 2005-07-15 | 2007-01-25 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Use of egfr inhibitors to prevent or treat obesity |
US8853489B2 (en) | 2005-09-16 | 2014-10-07 | Devgen Nv | Transgenic plant-based methods for plant pests using RNAi |
BRPI0615792A2 (pt) | 2005-09-16 | 2009-06-16 | Devgen Nv | métodos de controle de pestes com base no uso de rnai |
UA98445C2 (ru) | 2005-09-16 | 2012-05-25 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Способы генетического контроля поражения растений насекомыми и композиции, примененные для этого |
WO2007039454A1 (en) | 2005-09-20 | 2007-04-12 | Basf Plant Science Gmbh | Methods for controlling gene expression using ta-siran |
US9286469B2 (en) * | 2005-12-16 | 2016-03-15 | Cisco Technology, Inc. | Methods and apparatus providing computer and network security utilizing probabilistic signature generation |
CA2636070A1 (en) * | 2006-01-06 | 2007-08-02 | North Carolina State University | Cyst nematode resistant transgenic plants |
WO2007080126A2 (en) | 2006-01-12 | 2007-07-19 | Devgen N.V. | Dsrna as insect control agent |
EP1971688B1 (en) | 2006-01-12 | 2012-03-14 | Devgen NV | Dsrna as insect control agent |
US8906876B2 (en) | 2006-01-12 | 2014-12-09 | Devgen Nv | Methods for controlling pests using RNAi |
US20080022423A1 (en) * | 2006-02-03 | 2008-01-24 | Monsanto Technology Llc | IN PLANTA RNAi CONTROL OF FUNGI |
CN101501199B (zh) * | 2006-02-10 | 2016-11-09 | 孟山都技术有限公司 | 用于控制植物寄生线虫的靶基因的鉴定和用途 |
US20070259785A1 (en) * | 2006-02-13 | 2007-11-08 | Monsanto Technology Llc | SELECTING AND STABILIZING dsRNA CONSTRUCTS |
WO2007104570A2 (en) * | 2006-03-16 | 2007-09-20 | Devgen N.V. | Nematode control |
WO2007123777A2 (en) | 2006-03-30 | 2007-11-01 | Duke University | Inhibition of hif-1 activation for anti-tumor and anti-inflammatory responses |
PL216037B1 (pl) * | 2006-06-09 | 2014-02-28 | Inst Biotechnologii I Antybiotykow | Kaseta ekspresyjna, zastosowanie kasety ekspresyjnej, wektor, komórka gospodarza oraz sposób otrzymywania polipeptydu |
EP2471809B1 (en) | 2006-07-11 | 2015-09-02 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Proteins, nucleic acids encoding the same and associated methods of use |
US7666423B2 (en) | 2006-07-28 | 2010-02-23 | Children's Memorial Hospital | Methods of inhibiting tumor cell aggressiveness using the microenvironment of human embryonic stem cells |
CA2670696A1 (en) | 2006-11-27 | 2008-06-05 | Diadexus, Inc. | Ovr110 antibody compositions and methods of use |
CN101195821A (zh) * | 2006-12-04 | 2008-06-11 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法 |
EP2913341A1 (en) | 2006-12-22 | 2015-09-02 | University of Utah Research Foundation | Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same |
BRPI0806436A2 (pt) | 2007-01-26 | 2011-09-06 | Univ Lousville Res Foundation Inc | modificação de componentes exossomais para uso como uma vacina |
US20080184391A1 (en) * | 2007-01-29 | 2008-07-31 | Kuppuswamy Subramaniam | Pathogen resistant transgenic plants, associated nucleic acids and techniques involving the same |
AU2008218813B2 (en) * | 2007-02-20 | 2014-04-17 | Monsanto Technology, Llc | Invertebrate microRNAs |
CA2681323A1 (en) | 2007-03-21 | 2008-09-25 | Brookhaven Science Associates, Llc | Combined hairpin-antisense compositions and methods for modulating expression |
US20100322949A1 (en) | 2007-04-26 | 2010-12-23 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Methods for diagnosing and treating astrocytomas |
EP2155860B1 (en) | 2007-05-03 | 2014-08-27 | The Brigham and Women's Hospital, Inc. | Multipotent stem cells and uses thereof |
US8097422B2 (en) | 2007-06-20 | 2012-01-17 | Salk Institute For Biological Studies | Kir channel modulators |
EP2173901A4 (en) * | 2007-06-29 | 2011-12-14 | Boston Biomedical Inc | DNA MODULATION INDUCED BY MICRO-RNA BACTERIA |
US9689031B2 (en) | 2007-07-14 | 2017-06-27 | Ionian Technologies, Inc. | Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids |
WO2009012263A2 (en) | 2007-07-18 | 2009-01-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Tissue-specific micrornas and compositions and uses thereof |
WO2009021288A1 (en) | 2007-08-14 | 2009-02-19 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Improved gene silencing methods |
KR101142209B1 (ko) | 2007-09-22 | 2012-05-04 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 섭취 RNAi를 이용한 꼬마선충에서 두 유전자의동시발현 억제방법 |
US7968525B1 (en) | 2007-12-03 | 2011-06-28 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Use of RNA interference to validate new termiticide target sites and a method of termite control |
CN102037123A (zh) | 2008-04-04 | 2011-04-27 | 卡兰多制药股份有限公司 | Epas1抑制剂的组合物和用途 |
US8901373B2 (en) | 2008-04-10 | 2014-12-02 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for root knot nematode control |
GB0807018D0 (en) | 2008-04-17 | 2008-05-21 | Fusion Antibodies Ltd | Antibodies and treatment |
US9289475B2 (en) | 2008-11-06 | 2016-03-22 | The Johns Hopkins University | Treatment of chronic inflammatory respiratory disorders |
EP2687609B1 (en) | 2008-11-10 | 2017-01-04 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Method for treating solid tumor |
DK2379722T3 (da) | 2008-12-16 | 2017-01-02 | C-Lecta Gmbh | Ekspressionsvektor |
EP2379076B1 (en) | 2008-12-23 | 2014-11-12 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Phosphodiesterase inhibitors and uses thereof |
WO2010074783A1 (en) | 2008-12-23 | 2010-07-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Phosphodiesterase inhibitors and uses thereof |
CN102439151A (zh) | 2009-03-19 | 2012-05-02 | 默沙东公司 | 使用短干扰核酸(siNA)的RNA干扰介导的BTB和CNC同系物1,碱性亮氨酸拉链转录因子1(Bach1)基因表达的抑制 |
US20120035247A1 (en) | 2009-03-19 | 2012-02-09 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA Interference Mediated Inhibition of Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA) |
EP2408915A2 (en) | 2009-03-19 | 2012-01-25 | Merck Sharp&Dohme Corp. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GATA BINDING PROTEIN 3 (GATA3) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
US20120016011A1 (en) | 2009-03-19 | 2012-01-19 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA Interference Mediated Inhibition of Connective Tissue Growth Factor (CTGF) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA) |
EP2411019A2 (en) | 2009-03-27 | 2012-02-01 | Merck Sharp&Dohme Corp. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF SIGNAL TRANSDUCER AND ACTIVATOR OF TRANSCRIPTION 1 (STAT1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
WO2010111464A1 (en) | 2009-03-27 | 2010-09-30 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF APOPTOSIS SIGNAL-REGULATING KINASE 1 (ASK1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
SG174581A1 (en) | 2009-03-27 | 2011-10-28 | Merck Sharp & Dohme | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF THE INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE 1 (ICAM-1)GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
JP2012521764A (ja) | 2009-03-27 | 2012-09-20 | メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション | 低分子干渉核酸(siNA)を用いた胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)遺伝子発現のRNA干渉媒介性阻害 |
WO2010111468A2 (en) | 2009-03-27 | 2010-09-30 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF THE NERVE GROWTH FACTOR BETA CHAIN (NGFß) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (SINA) |
US20100257634A1 (en) * | 2009-04-03 | 2010-10-07 | Venganza Inc. | Bioassay for gene silencing constructs |
US8283332B2 (en) | 2009-04-17 | 2012-10-09 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | PFKFB4 inhibitors and methods of using the same |
EP2258858A1 (en) | 2009-06-05 | 2010-12-08 | Universitätsklinikum Freiburg | Transgenic LSD1 animal model for cancer |
EP3000481A3 (en) | 2009-07-14 | 2016-05-11 | Mayo Foundation for Medical Education and Research | Peptide-mediated non-covalent delivery of active agent agents across the blood brain barrier |
KR101752515B1 (ko) | 2009-07-24 | 2017-06-29 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | Avb5 인테그린과 결부된 질환의 치료 및 예방을 위한 방법 및 조성물 |
BR122018067960B8 (pt) | 2009-08-28 | 2022-12-06 | Du Pont | Polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, método para controlar uma praga de plantas do tipo coleoptera e método para obtenção de uma planta |
WO2011071916A2 (en) | 2009-12-07 | 2011-06-16 | The Johns Hopkins University | Sr-bi as a predictor of human female infertility and responsiveness to treatment |
CA2781896C (en) | 2009-12-09 | 2021-03-30 | Nitto Denko Corporation | Modulation of hsp47 expression |
US10640457B2 (en) | 2009-12-10 | 2020-05-05 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Histone acetyltransferase activators and uses thereof |
WO2011072243A1 (en) | 2009-12-10 | 2011-06-16 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Histone acetyltransferase activators and uses thereof |
WO2011073326A2 (en) | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Novartis Ag | Organic compositions to treat hsf1-related diseases |
SG181904A1 (en) | 2009-12-23 | 2012-07-30 | Novartis Ag | Lipids, lipid compositions, and methods of using them |
ES2636671T3 (es) | 2010-01-26 | 2017-10-06 | National Jewish Health | Métodos para predicción del riesgo, diagnóstico, pronóstico de trastornos pulmonares |
KR20120125357A (ko) | 2010-02-10 | 2012-11-14 | 노파르티스 아게 | 근육 성장을 위한 방법 및 화합물 |
AU2011255203B2 (en) | 2010-05-21 | 2016-01-21 | Peptimed, Inc. | Reagents and methods for treating cancer |
GB201009601D0 (en) | 2010-06-08 | 2010-07-21 | Devgen Private Ltd | Method for down-grading gene expression in fungi |
WO2011163466A1 (en) | 2010-06-23 | 2011-12-29 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Regulation of skin pigmentation by neuregulin-1 (nrg-1) |
CN103068980B (zh) | 2010-08-02 | 2017-04-05 | 瑟纳治疗公司 | 使用短干扰核酸(siNA)的RNA干扰介导的联蛋白(钙粘蛋白关联蛋白质),β1(CTNNB1)基因表达的抑制 |
KR102072631B1 (ko) | 2010-08-17 | 2020-02-03 | 시르나 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 | 짧은 간섭 핵산 (siNA)을 사용한 B형 간염 바이러스 (HBV) 유전자 발현의 RNA 간섭 매개 억제 |
EP3372684B1 (en) | 2010-08-24 | 2020-10-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | Single-stranded rnai agents containing an internal, non-nucleic acid spacer |
EP2609106A4 (en) | 2010-08-26 | 2014-03-19 | Merck Sharp & Dohme | RNA INTERFERENCE-MEDIATED INHIBITION OF EXPRESSION OF PHD2 GENE (PROLYL HYDROXYLASE DOMAIN 2) USING SMALL INTERFERING NUCLEIC ACID (PANI) |
US20140134231A1 (en) | 2010-10-11 | 2014-05-15 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Mir-211 expression and related pathways in human melanoma |
ES2564358T3 (es) | 2010-10-15 | 2016-03-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Genes relacionados con la obesidad y sus proteínas y usos de los mismos |
EP3766975A1 (en) | 2010-10-29 | 2021-01-20 | Sirna Therapeutics, Inc. | Rna interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (sina) |
KR20130103562A (ko) | 2010-11-01 | 2013-09-23 | 펩타임드, 인코포레이티드 | 암을 치료하기 위한 펩티드 표적화 시스템의 조성물 |
US9198911B2 (en) | 2010-11-02 | 2015-12-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for treating hair loss disorders |
WO2012061537A2 (en) | 2010-11-02 | 2012-05-10 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for treating hair loss disorders |
AU2011338682B2 (en) | 2010-12-06 | 2017-04-27 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded oligonucleotide compounds comprising threose modifications |
US9150926B2 (en) | 2010-12-06 | 2015-10-06 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Diagnosis and treatment of adrenocortical tumors using human microRNA-483 |
EP3323813B1 (en) | 2010-12-22 | 2020-08-26 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Histone acetyltransferase modulators and uses thereof |
CA2828002A1 (en) | 2011-03-03 | 2012-09-07 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treating lung disease and injury |
US10196637B2 (en) | 2011-06-08 | 2019-02-05 | Nitto Denko Corporation | Retinoid-lipid drug carrier |
TWI658830B (zh) | 2011-06-08 | 2019-05-11 | 日東電工股份有限公司 | Hsp47表現調控強化用類視色素脂質體 |
JP2014531425A (ja) | 2011-09-02 | 2014-11-27 | ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニヴァーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク | 肥満の代謝異常を治療するためのCaMKII、IP3R、カルシニューリン、p38、およびMK2/3阻害剤 |
US9352312B2 (en) | 2011-09-23 | 2016-05-31 | Alere Switzerland Gmbh | System and apparatus for reactions |
BR112014008862A2 (pt) | 2011-10-14 | 2018-08-07 | Genentech Inc | anticorpo isolado que se liga à htra1, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, imunoconjugado, formulação farmacêutica, métodos e usos |
EP3960726A1 (en) | 2011-10-18 | 2022-03-02 | Dicerna Pharmaceuticals, Inc. | Amine cationic lipids and uses thereof |
WO2013067076A2 (en) | 2011-11-03 | 2013-05-10 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for neuroprotection |
SI2830662T1 (sl) | 2012-03-29 | 2019-01-31 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Postopki zdravljenja motenj izgube las |
WO2013158966A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Futuragene Israel Ltd. | Bronze bug control agents |
CN104508134A (zh) | 2012-04-23 | 2015-04-08 | 富优基尼以色列股份有限公司 | 赤桉木虱防治剂 |
US20150299696A1 (en) | 2012-05-02 | 2015-10-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS |
WO2014018554A1 (en) | 2012-07-23 | 2014-01-30 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Ptprs and proteoglycans in autoimmune disease |
UY35064A (es) | 2012-10-03 | 2014-04-30 | Futuragene Israel Ltd | Agentes para el control de la avispa de las agallas |
EP2903692B1 (en) | 2012-10-08 | 2019-12-25 | St. Jude Children's Research Hospital | Therapies based on control of regulatory t cell stability and function via a neuropilin-1:semaphorin axis |
US9920316B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-03-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
JP2016515508A (ja) | 2013-03-15 | 2016-05-30 | ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク | 融合タンパク質及びその方法 |
EP2810952A1 (en) | 2013-06-03 | 2014-12-10 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Novel pest control methods |
CN105407974A (zh) | 2013-07-03 | 2016-03-16 | 希望之城 | 抗癌组合 |
EP3055426B1 (en) | 2013-10-09 | 2019-06-19 | The United States of America as represented by The Secretary Department of Health and Human Services | Detection of hepatitis delta virus (hdv) for the diagnosis and treatment of sjögren's syndrome and lymphoma |
US10004814B2 (en) | 2013-11-11 | 2018-06-26 | Sirna Therapeutics, Inc. | Systemic delivery of myostatin short interfering nucleic acids (siNA) conjugated to a lipophilic moiety |
US9682123B2 (en) | 2013-12-20 | 2017-06-20 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods of treating metabolic disease |
JP6372930B2 (ja) | 2013-12-27 | 2018-08-15 | 国立大学法人高知大学 | 悪性腫瘍の治療薬 |
EP4223285A3 (en) | 2014-07-16 | 2023-11-22 | Novartis AG | Method of encapsulating a nucleic acid in a lipid nanoparticle host |
WO2016059187A1 (en) * | 2014-10-16 | 2016-04-21 | Universite De Strasbourg | Method of capturing and identifying novel rnas |
WO2016077624A1 (en) | 2014-11-12 | 2016-05-19 | Nmc, Inc. | Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same |
EP3778644A3 (en) | 2014-12-23 | 2021-06-02 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Fgfr-tacc fusion proteins and methods thereof |
US10264976B2 (en) | 2014-12-26 | 2019-04-23 | The University Of Akron | Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging |
WO2016145008A2 (en) | 2015-03-09 | 2016-09-15 | University Of Kentucky Research Foundation | Mirna for treatment of breast cancer |
WO2016145005A1 (en) | 2015-03-09 | 2016-09-15 | University Of Kentucky Research Foundation | Rna nanoparticles for brain tumor treatment |
WO2016145003A1 (en) | 2015-03-09 | 2016-09-15 | University Of Kentucky Research Foundation | Rna nanoparticle for treatment of gastric cancer |
US11279768B1 (en) | 2015-04-03 | 2022-03-22 | Precision Biologics, Inc. | Anti-cancer antibodies, combination therapies, and uses thereof |
US10828381B2 (en) | 2015-04-17 | 2020-11-10 | University Of Kentucky Research Foundation | RNA nanoparticles and method of use thereof |
EP3289104B1 (en) | 2015-04-29 | 2020-11-04 | New York University | Method for treating high-grade gliomas |
WO2016210292A1 (en) | 2015-06-25 | 2016-12-29 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance |
US10072065B2 (en) | 2015-08-24 | 2018-09-11 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Peptide-mediated delivery of immunoglobulins across the blood-brain barrier |
AU2016321298A1 (en) | 2015-09-09 | 2018-03-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Reduction of ER-MAM localized APP-C99 and methods of treating Alzheimer's Disease |
US11285142B2 (en) | 2015-09-29 | 2022-03-29 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Compositions and methods for identifying and treating dystonia disorders |
EP3368578B1 (en) | 2015-10-30 | 2021-03-17 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof |
BR112018008344A2 (pt) | 2015-12-13 | 2018-10-30 | Nitto Denko Corp | molécula de ácido nucleico, composição farmacêutica, vetor ou célula, método para prevenir, tratar ou melhorar uma doença, e, uso de uma composição |
EP3423568A4 (en) | 2016-03-04 | 2019-11-13 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | METHOD AND COMPOSITIONS FOR EX-VIVO REPRODUCTION OF VERY SMALL EMBRYONAL STEM CELLS (VSELS) |
US20190119642A1 (en) | 2016-03-15 | 2019-04-25 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion |
WO2017173327A1 (en) | 2016-03-31 | 2017-10-05 | The Schepens Eye Research Institute, Inc. | Endomucin inhibitor as an anti-angiogenic agent |
EP3516062A1 (en) | 2016-09-21 | 2019-07-31 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Myostatin irna compositions and methods of use thereof |
CN107858405B (zh) * | 2017-10-12 | 2021-09-24 | 华南农业大学 | 一种测定外源dsRNA对瓢虫毒性影响的方法 |
WO2019199673A1 (en) | 2018-04-09 | 2019-10-17 | President And Fellows Of Harvard College | Modulating nuclear receptors and methods of using same |
CN109183158B (zh) * | 2018-08-31 | 2021-11-23 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法 |
CN109266677B (zh) * | 2018-08-31 | 2021-11-23 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法 |
EP3853250A4 (en) | 2018-09-19 | 2022-06-08 | La Jolla Institute for Immunology | PTPRS AND PROTEOGLYCANS IN RHEUMATOID ARTHRITIS |
WO2020102668A1 (en) | 2018-11-16 | 2020-05-22 | Nitto Denko Corporation | Rna interference delivery formulation and methods for malignant tumors |
EP3907504A4 (en) * | 2019-01-04 | 2022-11-30 | Kyoto University | TEST PROCEDURE FOR ULCERATIVE COLITIS AND PRIMARY SCLEROTIC CHOLANGITIS |
CN110229839B (zh) * | 2019-06-04 | 2021-06-08 | 中国农业大学 | 一种提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法 |
CN110746497A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-02-04 | 维塔恩(广州)医药有限公司 | 肺炎衣原体相关抗原短肽及其应用 |
CN110804088A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-02-18 | 维塔恩(广州)医药有限公司 | 巨细胞病毒相关抗原短肽及其应用 |
EP3825408A1 (en) | 2019-11-19 | 2021-05-26 | FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Methods of multi-species insect pest control |
AR120773A1 (es) | 2019-12-18 | 2022-03-16 | Novartis Ag | Derivados de 3-(5-metoxi-1-oxoisoindolin-2-il)piperidin-2,6-diona como reductor de la actividad de la proteína wiz |
WO2021123920A1 (en) | 2019-12-18 | 2021-06-24 | Novartis Ag | Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
BR112022013589A2 (pt) | 2020-01-08 | 2022-09-13 | Regeneron Pharma | Tratamento da fibrodisplasia ossificante progressiva |
WO2021150300A1 (en) | 2020-01-22 | 2021-07-29 | Massachusetts Institute Of Technology | Inducible tissue constructs and uses thereof |
WO2021173965A1 (en) | 2020-02-28 | 2021-09-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Identification of variable influenza residues and uses thereof |
CN111560651B (zh) * | 2020-05-22 | 2021-09-07 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 一种制备双链rna测序文库的方法 |
WO2022147481A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-07-07 | Ansun Biopharma Inc. | Combination therapy of an oncolytic virus delivering a foreign antigen and an engineered immune cell expressing a chimeric receptor targeting the foreign antigen |
EP4359527A2 (en) | 2021-06-23 | 2024-05-01 | Novartis AG | Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
WO2023012165A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | Universite De Montpellier | Compositions and methods for treating cmt1a or cmt1e diseases with rnai molecules targeting pmp22 |
CN113533007B (zh) * | 2021-08-06 | 2023-11-24 | 青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司 | 一种抗体染色标记装置及其方法 |
WO2024059618A2 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Arsenal Biosciences, Inc. | Immune cells having co-expressed tgfbr shrnas |
WO2024059824A2 (en) | 2022-09-16 | 2024-03-21 | Arsenal Biosciences, Inc. | Immune cells with combination gene perturbations |
Family Cites Families (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US589801A (en) * | 1897-09-07 | woltereck | ||
DE3650756T2 (de) | 1985-03-21 | 2001-10-04 | Cornell Res Foundation Inc | Vom parasit abgeleiteter widerstand |
US6608241B1 (en) | 1985-10-29 | 2003-08-19 | Monsanto Technology Llc | Protection of plants against viral infection |
IL81737A (en) | 1986-03-28 | 1992-11-15 | Calgene Inc | Regulation of gene expression in plant cells |
US5017488A (en) * | 1986-04-01 | 1991-05-21 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Highly efficient dual T7/T3 promoter vector PJKF16 and dual SP6/T3 promoter vector PJFK15 |
US4970168A (en) * | 1989-01-27 | 1990-11-13 | Monsanto Company | Virus-resistant plants |
EP0473576A4 (en) * | 1989-05-19 | 1993-03-10 | Hem Research, Inc. | Short therapeutic dsrna of defined structure |
HUT57265A (en) | 1989-11-03 | 1991-11-28 | Zaadunie Bv | Process for producing plants of diminished infection-sensitivity |
US5837848A (en) * | 1990-03-16 | 1998-11-17 | Zeneca Limited | Root-specific promoter |
EP0524254A4 (en) * | 1990-03-30 | 1993-04-28 | The President And Fellows Of Harvard College | A binary genetic system to control expression of a transgene in a transgenic animal |
US5831011A (en) * | 1990-07-27 | 1998-11-03 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis genes encoding nematode-active toxins |
US5459252A (en) * | 1991-01-31 | 1995-10-17 | North Carolina State University | Root specific gene promoter |
EP0631629B1 (en) | 1992-03-20 | 2003-12-03 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Fungus-responsive chimaeric gene |
DE4234131C2 (de) * | 1992-10-09 | 1995-08-24 | Max Planck Gesellschaft | Transgener pathogen-resistenter Organismus |
CA2088379A1 (en) * | 1993-01-29 | 1994-07-30 | University Of British Columbia | Biological systems incorporating stress-inducible genes and reporter constructs for environmental biomonitoring and toxicology |
IL104830A (en) * | 1993-02-23 | 2001-01-28 | Yissum Res Dev Co | A chimeric plasmid containing a non-structural gene for the protease of the potato virus and its various uses |
DE4317845A1 (de) | 1993-05-28 | 1994-12-01 | Bayer Ag | Desoxyribonukleinsäuren |
JPH10504448A (ja) * | 1994-06-15 | 1998-05-06 | ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク | 腫瘍抑制遺伝子を同定する方法 |
US5691140A (en) * | 1995-05-18 | 1997-11-25 | New England Biolabs, Inc. | Bidirectional in vitro transcription vectors utilizing a single RNA polymerase for both directions |
GB9510944D0 (en) * | 1995-05-31 | 1995-07-26 | Bogaert Thierry | Assays and processes for the identification of compounds which control cell behaviour,the compounds identified and their use in the control of cell behaviour |
ES2151167T3 (es) * | 1995-06-02 | 2000-12-16 | M & E Biotech As S | Procedimiento para la identificacion de acidos nucleicos y peptidos biologicamente activos. |
US5679551A (en) * | 1995-10-31 | 1997-10-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Unique double-stranded RNAS associated with the Trichomonas vaginalis virus |
US5898031A (en) * | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
DE19631919C2 (de) * | 1996-08-07 | 1998-07-16 | Deutsches Krebsforsch | Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur |
NZ334077A (en) * | 1996-08-09 | 2000-09-29 | Keygene Nv | Genes having resistance against nematodes and/or aphids |
JP2001503972A (ja) * | 1996-09-18 | 2001-03-27 | ユング,クリスチャン | 線虫抵抗性遺伝子 |
AU4470697A (en) | 1996-10-03 | 1998-04-24 | Hajime Kato | Method for hydrocarbon steam reforming |
WO1998027152A1 (en) | 1996-12-18 | 1998-06-25 | Exxon Chemical Patents Inc. | Compatibilized polymer blends formed using a multifunctional agent |
GB9703146D0 (en) | 1997-02-14 | 1997-04-02 | Innes John Centre Innov Ltd | Methods and means for gene silencing in transgenic plants |
US6506559B1 (en) * | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
AUPP249298A0 (en) * | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
CN1202246C (zh) * | 1998-04-08 | 2005-05-18 | 联邦科学和工业研究组织 | 获得修饰表型的方法和措施 |
AR020078A1 (es) * | 1998-05-26 | 2002-04-10 | Syngenta Participations Ag | Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta |
GB9814536D0 (en) | 1998-07-03 | 1998-09-02 | Devgen Nv | Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition |
GB9827152D0 (en) | 1998-07-03 | 1999-02-03 | Devgen Nv | Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition |
AUPR621501A0 (en) | 2001-07-06 | 2001-08-02 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Delivery of ds rna |
UA98445C2 (ru) | 2005-09-16 | 2012-05-25 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Способы генетического контроля поражения растений насекомыми и композиции, примененные для этого |
-
1998
- 1998-12-09 GB GBGB9827152.1A patent/GB9827152D0/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-07-02 GB GB0020485A patent/GB2349885B/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-02 PL PL347978A patent/PL201425B1/pl unknown
- 1999-07-02 IL IL14046799A patent/IL140467A0/xx active IP Right Grant
- 1999-07-02 DK DK01129274.5T patent/DK1197567T4/en active
- 1999-07-02 KR KR1020077005038A patent/KR20070041607A/ko active Search and Examination
- 1999-07-02 WO PCT/EP1999/004718 patent/WO2000001846A2/en active Application Filing
- 1999-07-02 CN CN200510052742XA patent/CN1657620A/zh active Pending
- 1999-07-02 KR KR1020067011420A patent/KR20060071438A/ko active Search and Examination
- 1999-07-02 JP JP2000558236A patent/JP4353639B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-02 DE DE1093526T patent/DE1093526T1/de active Pending
- 1999-07-02 AT AT04011161T patent/ATE433500T1/de active
- 1999-07-02 CZ CZ2012-309A patent/CZ304897B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-07-02 KR KR1020017000068A patent/KR100563295B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-07-02 DE DE69940984T patent/DE69940984D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 ES ES01129274.5T patent/ES2320527T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 GB GB0206600A patent/GB2370275B/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-02 CN CNB998101966A patent/CN1198938C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-02 PT PT01129274T patent/PT1197567E/pt unknown
- 1999-07-02 CA CA2789083A patent/CA2789083C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-02 EP EP08022353A patent/EP2045336A3/en not_active Withdrawn
- 1999-07-02 AT AT01129274T patent/ATE419383T1/de active
- 1999-07-02 PL PL384205A patent/PL213379B1/pl unknown
- 1999-07-02 DE DE29924298U patent/DE29924298U1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 PL PL390495A patent/PL216779B1/pl unknown
- 1999-07-02 CN CNA2006100944808A patent/CN1900319A/zh active Pending
- 1999-07-02 KR KR20047010184A patent/KR20040066200A/ko active Search and Examination
- 1999-07-02 GB GB0118514A patent/GB2362885B/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-02 BR BR9911802-5A patent/BR9911802A/pt active Search and Examination
- 1999-07-02 CA CA2332619A patent/CA2332619C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-02 EP EP10182431A patent/EP2374901A1/en not_active Withdrawn
- 1999-07-02 EP EP04011161A patent/EP1484415B1/en not_active Revoked
- 1999-07-02 AU AU49079/99A patent/AU769223B2/en not_active Ceased
- 1999-07-02 HU HU0103571A patent/HU230602B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-07-02 DK DK04011161T patent/DK1484415T3/da active
- 1999-07-02 MX MXPA00012955 patent/MX234065B/es not_active IP Right Cessation
- 1999-07-02 RU RU2000133315/13A patent/RU2240349C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-07-02 NZ NZ509182A patent/NZ509182A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-07-02 EP EP99932836A patent/EP1093526A2/en not_active Withdrawn
- 1999-07-02 PT PT04011161T patent/PT1484415E/pt unknown
- 1999-07-02 DE DE69940219T patent/DE69940219D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 ES ES04011161T patent/ES2327334T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 EP EP01129274.5A patent/EP1197567B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 CZ CZ20010014A patent/CZ303494B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-07-02 DE DE29924299U patent/DE29924299U1/de not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-12-06 HK HK00107819A patent/HK1029142A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-12-19 ZA ZA200007653A patent/ZA200007653B/en unknown
- 2000-12-21 IL IL140467A patent/IL140467A/en not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-01-02 NO NO20010019A patent/NO327729B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-01-02 IN IN6DE2001 patent/IN2001DE00006A/en unknown
- 2001-01-02 IS IS5802A patent/IS2816B/is unknown
-
2002
- 2002-01-25 US US10/057,108 patent/US20030061626A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-12-17 US US10/738,886 patent/US20040133943A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-04-16 US US10/826,522 patent/US8114980B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-06-20 IN IN3568DE2006 patent/IN2006DE03568A/en unknown
-
2007
- 2007-03-06 IL IL181727A patent/IL181727A/en not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-01-07 JP JP2009001591A patent/JP2009112311A/ja active Pending
- 2009-03-23 CY CY20091100345T patent/CY1108920T1/el unknown
- 2009-08-31 CY CY20091100907T patent/CY1109324T1/el unknown
-
2013
- 2013-09-09 JP JP2013186110A patent/JP5847776B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ200114A3 (en) | Process for preparing transgenic organism with exception of human being and characterization of gene function by making use double stranded RNA inhibition | |
US20050229272A1 (en) | Compositions and methods for gene silencing | |
JP2004033209A (ja) | 人工染色体、該染色体の使用および人工染色体の製造方法 | |
Merritt et al. | Transgenic solutions for the germline | |
Johnson et al. | Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome | |
US7005423B1 (en) | Characterization of gene function using double stranded RNA inhibition | |
AU2004200852B2 (en) | Characterisation of gene function using double stranded RNA inhibition | |
Peng | Understanding the Genetic Basis for piRNA Silencing in the Soma and Germline of Caenorhabditis elegans | |
PONSARD | THESIS/THÈSE |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20170702 |