CZ157096A3

CZ157096A3 - Hirudin conjugates from hirudin and lipophilic compounds

Info

Publication number: CZ157096A3
Application number: CZ961570A
Authority: CZ
Inventors: Jurgen Dr Schweden; Peter Dr Eckes; Wilfried Dr Hornberger; Thomas Dr Subkowski
Original assignee: Basf Ag
Priority date: 1993-12-02
Filing date: 1994-11-25
Publication date: 1996-09-11
Also published as: AU1067095A; WO1995015183A1; SK67596A3; EP0730473B1; FI962299A; US5919762A; EP0730473A1; ES2163487T3; BR9408195A; SG49156A1; DK0730473T3; NZ276410A; NO962261D0; DE59409847D1; FI962299A0; HRP940968A2; HU9601471D0; CA2176967A1; JPH09505810A; CN1142776A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových hirudinových konjugátú, které jsou vytvořeny z hirudinu a lipofilnich sloučenin, jejich výroby i jejich použití,

Dosavadní stav techniky

Hirudin je již dlouho známý, přirozeně se vyskytující protein s vlastnostmi, potlačujícími srážení krve. Je nejsilnějším a nejselektivnějším dosud známým inhibitorem trombinu (Naturwissenschaften, 42, 537 (1955); Hoppe-Seylers Z.fur Biol.Chemie 366, 379 (1985)). Přirozený hirudin je směs chemicky změněných peptidu s molekulovou hmotností 6900 - 7000 Dalton a o 64 - 66 aminokyselinách. Dosud bylo popsáno asi 20 přirozeně se vyskytujících variant hirudinu (Scharf a spol., FEBS-Letters 255, 105-110 (1989)).

V EP 345616 jsou popsány kopulační produkty hirudinu a polymerních nosičů. Jako nosiče jsou uváděny rozpustné a nerozpustné polymery jako dextran, sepharoza, heparin, laevan a částečný hydrolyzát želatiny. Nosičem modifikované hirudiny by měly mít zlepšené farmakologické vlastnosti, jako je o něco prodloužený poločas účinnosti.

V obou výše uvedených zveřejněných publikacích jsou popisovány hirudinové deriváty s prodlouženou účinností, která byla dosažena modifikaci hirudinu s vysokomolekulárními polymery. Molekulová hmotnost polymerů činí přitom několik kilodaltonů, takže se molekulová hmotnost polypeptidu hirudinu výrazně zvětšila. Takové vysokomolekulární polymery nejsou však chemicky exaktně definovány; tvoří je většinou populace.. různých molekul, které jsou rozloženy v oblasti molekulových hmotností. Proto se také takto vytvořené hirudinové kopulační produkty nesestávají z jednotlivé chemické sloučeniny, ale z molekulových populací, které se od sebe odlišují svými molekulovými hmotnostmi.

Je však žádoucí, aby účinné látky,· které se používají jako léčiva, byly chemicky čo možná nejpřesněji definovány, aby bylo možno co nejlépe kontrolovat jejich chování v organismu.

Vyvstává tak úloha připravit hirudinové deriváty s farmakologickými vlastnostmi zlepšenými proti normálnímu hirudinu, které by nevykazovaly výše uvedené nevýhody hirudinu modifikovaného vysokomo1ekulárními polymery.

Podstata vynálezu

Tato úloha je řešena hirudinovými konjugáty, vytvořenými z hirudinu a jedné nebo více lipofilních sloučenin, přičemž lipofilní sloučenina vykazuje rozdělovači koeficient oktanol-voda větší než 1,8 a je chemicky kovalentně navázána k hirudinu.

* ^k

Pro hirudinové konjugáty podle vynálezu jsou vhodné všechny přirozeně se vyskytující hirudiny a také z nich odvozené varianty, takzvané hirudin-muteiny a fragmenty s trombin inhibující účinností.

Takové hirudiny a jejich výroba jsou například známy z EP 171024, EP 158986, DE 38055406, WO 91/1712, GB 2247239, EP 557199, WO 92/5748, DE 4014260.

Dále jsou pro výrobu hirudin-konjugátú podle vynálezu vhodné od hirudinu strukturně odvoditelné peptidy nebo peptidové deriváty s hirudinovou aktivitou, jako jsou například popsány v EP 333356.

Výhodné se používají takové hirudiny, u kterých nevede navázání lipofilní sloučeniny k žádné ztrátě aktivity. Tak tomu je například v případe, kdy se navázání provádí přes postranní řetězce aminokyselin 27 až 37. Zvláště výhodné pro navázání jsou aminokyselinové polohy 27 a.33 (vztaženo na přírodní hirudin HVI), protože tyto sloučeniny leží na konci prstům podobného regionu a neruší interakce hirudinu s trombinem.

Vazba lipofilních sloučenin, popřípadě spaceru s

-¾ lipofilními sloučeninami, může probíhat na aminoskupinách «. _:i hirudinu, například volné N-koncové aminoskupině, aminoskupinách postranních řetězců lysinu, aminoskupinách histidinu, amidínskupinách argininu nebo na hydroxyskupinách hirudinu, například tyrosi-, serin- nebo threonin-postranních řetězcích. ,

Zvláště vhodné pro navázání lipofilních sloučenin jsou áminoskupiny lysinových postranních řetězců.

Popřípadě je možná vazba lipofilní sloučeniny na modifikovaný tyrosin hirudinu, který je dostupný nit-rací a redukcí (Meth.Enzymol. 25, 515-521 (1972)). Na vytvořený arylaminotyrosin může pak být navázána lipofilní sloučenina známými kopulačními metodami.

Jako lipofilní sloučenina jsou vhodné sloučeniny, které obsahují jednu nebo více funkčních skupin jako amino-, hydroxy-, karboxyskupiny-nebo skupiny sulfonových kyselin a které vykazují rozdělovači koeficient oktanol-voda větší než

1,8.

Lipofilní sloučeniny mohou být přírodní látky, například nasycené nebo nenasycené mastné kyseliny, terpeny, prostaglandiny, v tucích rozpustné vitaminy, karotinoidy nebo steroidy ale i syntetické karboxylové kyseliny, alkoholy, aminy a sulfonové kyseliny s jedním nebo více alkyl-, aryl-, alkenyly nebo také vícenásobně nenasycené sloučeniny jak lineární tak také rozvětvené a popřípadě substituované halogen-, nitro-, kyano-, alkoxy-, alkylthío- nebo halogenalkylskupinamí.

Příklady lipofilních sloučeniny jsou nasycené mastné' kyseliny - kyselina kapronová, kaprylová, kaprinová, laurová, myr.istová, pálmitová, stearová, arachová^-a behenová a' ♦

nenasycených mastných kyselin kyselina paímitoolejová, olejová, linolová, linolenová, ricinová, oktadecentetraěnová, eikosanová, eikosadienová, arachidonová, eikosapentaenová nebo eruková jakož i z nich připravítelné mastné alkoholy a mastné aminy. . .... ... ..........

Vhodné jsou také směsi mastných kyselin, které se získají při zmýdelnění přírodních tuků jako je kokosový tuk, tuk palmových jader, řepkový olej, olivový olej, slunečnicový olej, high oleic slunečnicový olej, ricinový olej nebo hovězí lůj.

Dalšími příklady lipofilních sloučenin jsou karotino.idy zeaxanthin, rhódovibrin nebo astaxanthin, steroid cholesterin desmosterol, coprosterol, cerebrosterol, lathosterol, ergesterol, sitosterol, stigmasterol, kyselina cholová, •J kyselina cholinová, dehydrokortikosterol-, aldosteron, androsteron, testosteron, tachysterol, lanosterol nebo lumisterol, terpeny geraniol, nerol, linalool, metol, karveol, borneol, farnesol, nerolidol nebo sclareol, prostaglandiny brefeldin, PGEz nebo PGF₂, vitamin Ai nebo D, ale také syntetické sloučeniny jako oxoalkoholy, hexylamin, kyselina ethylhexanová, ethylhexano1, ethylhexylamin nebo kyseliny alkylbenzensulfonové.

Pro vynález jsou zvláště vhodné ty lipofilní sloučeniny, které mají obecný vzorec I

.i kde

R¹ a R² nezávisle na sobě jsou (CH₂)_a-C(R³)(R⁴)-(CH₂)n-(CH=CH-CH₂)₀-CH₃, m je číslo 0 až 28,

I * n je Číslo 3 až 6, o je číslo 0 až 6,

R³ a R⁴ nezávisle jsou H, Ci-6-alkyl, C3-6-cykloalkyl, aral nebo benzyl, popřípadě substituované haloge-, nitro-ř, •kyano-, alkyl-, alkoxy-, alkylthio-, halogenalkylskupinami.

Zvláště výhodné jsou ty sloučeniny vzorce I, kde zbytky

R¹ a R² jsou tvořeny 4 až 16 C-atomy a jsou nasycené nebo jednou, dvakrát nebo třikrát nenasycené.

Jako lipofilní sloučeniny jsou vhodné takové sloučeniny e>

obecného vzorce...II

H-Y-Ri (ID kde

Ri znamená (CH2) .~C(R3) (R<)-(CH₂)n-(CH=CH-CH₂) ₀-CHs a Y znamená -C(0)-, -N(R⁵)-, -0- kde

R⁵ znamená H, Ci - 1 β-alkylCj-re-alkenyl', Cý-e-cykloalkyl, aryl nebo benzyl, popřípadě substituovaný halogen-, nitro-, kyano-, alkyl-, alkoxy-, alkylthio-, halogenalkyískupinami.

Výroba hirudin-konjugátů podle vynálezu se provádí tak,

Že se hirudin.bud. přímo nebo pomocí spaceru spojí s jednou nebo více lipofilnírai sloučeninami.

Jako spacer jsou vhodné všechny bi- nebo vícefunkční molekuly, které na základě svých vícefunkčních skupin umožňují spojení - pprípadě po aktivaci - hirudinu a lipofiiní sloučeniny.

Jako spacer jsou vhodné zejména aminokyseliny, oligopeptidy, mono-, di- nebo oligosacharidy, amino- nebo hydroxykarboxylové kyseliny, zejména ty, které-mají délku řetězce od 2 do 10 C-atomů, které popřípadě pro zvýšeni hydrofilnosti mohou nést další substituenty, například Ci-C4-0Iigoalkylenglykoly.

Pro navázání lipofilních sloučenin na hirudin mohou být například použity následující spacery:

χ—CO—NH—Z—Ntv :0— —X—CH₂—<0

W₂—·,

X-CH₂—CH (OH)—LH₂—/0H^N2‘ _x—co—ch₂—CH2 -O '

-sv w

•'lifc kde X znamená S, O, NH, N(CHj), N(C₂Hs)

W znamená H, OH, Cl

Z znamená C₂-C6-alkylenovou skupinu nebo p-fenylenovou skupinu.

Pro zachování biologické aktivity hirudin-konjugátu po navázání na povrchy jako buněčné membrány nebo syntetické povrchy může být výhodné použití spaceru, zprostředkujícího odstup.

Pro hirudin-konjugáty podle vynálezu jsou vhodné všechny ty lipofilní sloučeniny, které nesou jednu nebo více funkčních skupin jako například skupiny amino-, hydroxy-, karboxy- nebo sulfonových kyselin, protože tyto funkční skupiny mohou po aktivaci reagovat s reaktivními skupinami hirudinu.

Typ aktivace lipofolních sloučenin, popřípadě navázání přes spacer, závisí na. funkční skupině a může být stanoveno odborníkem v oboru známým způsobem.

Jestliže nese lipofilní sloučenina nebo spacer s lipofilní sloučeninou karboxylovou skupinu, je možno provést aktivaci například převedením na alkenylester, arylester, O-poloacetal, O-acylpoloaminoacetal, O-acylpoloketal, O-acylpoloaminoketal, O-acy1laktím, symetrický nebo nesymetrický anhydrid kyseliny karboxylové, anhydrid kyseliny karboxylové-kyseliny karbaminové, O-acylisoureid,

O-acyl-N-hydroxylamin, O-acylhydroxamovou kyselinu,

O-acy1-N,N-diacylhydroxy1amiη, O-acyloxim,

O-acyl-N-azo-N-acy1hydroxylamin,

O-acy1-N-azo-N-arylhydroxylamin, anhydrid kyseliny karboxylové-siřičité, anhydrid kyseliny karboxylové-kyseliny sírové, anhydrid kyseliny karboxylové-kyseliny fosforité, anhydrid. kysel iny .karb.oxylové-kyseliny fosf orečné, .....

acylfosfoniová sloučenina, anhydrid kyseliny karboxylové-amidu kyseliny fosforečné, fluorid kyseliny karboxylové nebo chlorid karboxylové kyseliny jak je popsáno v Miiller, Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, sv.15/1 a 15/2, Thieme Verl.ag,. Stuttgart (1974) nebo Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, str. 85-128, John Wiley & Sons, New York, 1976 nebo jiných základních dílech peptidové chemie.

Zvláště vhodnými reaktivními skupinami jsou chloridy karboxylových kyselin, -symetrické anhydridy, popřípadě 1,2,3 nebo 5 halogen- nebo nitroskupinami substituovaný arylester, N-hydroxysukcinimidester, N-hydroxyftalimidester nebo N-hydroxybenzotriazolester.

Analogickým způsobem je možno aktivovat skupiny . sulfonoých kyselin. _ . . .

Jsou-li jako funkční skupiny v lipofilních sloučeninách přítomny amino- nebo hydroxyskupiny, provádí se navázání lipofilních sloučenin na hirudin výhodně přes spacer, který jako druhou funkční skupinu nese karboxylovou skupinu nebo skupinu kyseliny sulfonové a aktivuje se výše popsaným způsobem pro kopulaci na hirudin.

Jako lipofilní sloučeniny jsou vhodné také alkyldiketeny, které bez dalšího zpracování mohou být přímo spojeny s hirudinem.

Jako alkyldiketeny se výhodně používají sloučeniny obecného vzorce III •v „,'jv

J, -

III kde

R¹ a R² nezávisle na sobě jsou (CH₂)m-C(R³)(R⁴)-(CH₂)n-(CH=CH-CH2)o“CH3, „ m je číslo 0 až 28, n je číslo 3 až 6, o je číslo 0 až 6,

R³ a R⁴ nezávisle jsou H, Ct-e-alkyl, C3-6~cykloalkyl, aral nebo benzyl, popřípadě substituované haloge-, nitro-, kyano-, alkyl-, alkoxy-, alkylthio-, halogenalkylskupinami.

ÍU

Zvláště výhodné jsou jako sloučeniny obecného vzorce III mastnéalkyldiketeny, které jsou například popsány v DĚ 2927118, odvozené od nasycené mastné kyseliny kyseliny kapronové, kyseliny kaprylové, kyseliny kaprinové, kyseliny laurové, kyseliny myristové, kyseliny palmitové, kyseliny stearové, kyseliny arachové a kyseliny behenové a nenasycené mastné kyseliny - kyseliny palmitoolejové, kyseliny olejové, kyseliny linolové, kyseliny linolenové, kyseliny ricinové, oktadekatetraenové kyseliny, kyseliny eikosanové', kyseliny eikosandienové, kyseliny arachové, kyseliny eikosanpentaenové nebo kyseliny erukové.

Dále mohou být také použity mastný-alkyldiketeny, které se získají ze směsí mastných kyselin, při zmýdelnění přírodních tuku jako je kokosovýtuk, tuk palmových jader, řepkový olej, olivový olej, slunečnicový olej, high oleic slunečnicový olej, ricinový olej nebo hovězí tuk.

'4?

Podle vynálezu popsané hirudin-konjugáty jsou chemicky exaktně definovány a vykazují ve srovnání s hirudinem vynikající farmakologický profil účinnosti. Vykazují mezi jiným výrazně prodlouženou biologickou účinnost a lepší biovyužitelnost. Proto umožňují hydrofobní hirudiny cílení účinné látky z povrchu krevních buněk a povrchů cév.

Na základě těchto vlastností jsou hirudin-konjugáty podle vynálezu cenným léčivem pro léčbu a profylaxi na trombinu závislých tromboembolických příhod jak hluboké cévní trombózy, plicní embolie, infarktů myokardu a mozkového a nestabilní angíny, dále k terapii rozeseté intravasální koagulace (DIC) jakož i komedikace k trombolytikúm jako je streptokinása, urokinasa, prourokinasa, t-PA, APSAC, aktivátory plasminogenu ze slinných žláz zvířat jakož i rekombinantní a mutované formy všech těchto substancí ke zkrácení doby reperfuze.a .

prodloužení doby reokluze.

Další oblastí použití je zabránění na trombinu závislé dřívější reokluzi a pozdější restenoze po PTCA, zabránění trombinem indukované proliferaci buněk hladkých svalů, zabránění akumulaci aktivních trombinu v CNS (např. u Alzheimerovy choroby a zabránění mechanismům, které vedou k adhezi a metastázování nádorových buněk.

Nové sloučeniny mohou být použity v běžných galenických formách pevných nebo kapalných, např. jako roztoky, soli, krémy nebo spreje. Tyto se vyrobí obvyklým způsobem. Účinné látky přitom mohou být zpracovány s běžnými galenickými pomocnými látkami jako jsou plniva, konzervační činidla, činidla, regulující tok, zesíťovací činidla, dispergační činidla, emulgátory, rozpouštědla a/nebo nosné plyny (srov. , H.Sucker a spól: Pharmazeutische Technologie, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1978).

Hydrofobní vlastnosti umožňují také transdermální <ř aplikaci nových hirudinových derivátů zejména ve spojení s činidly, posilujícími penetraci jako je např. dimethylsulfoxid, alkoholy nebo také azony popř. iontoforézou.

Dávkování závisí na věku, stavu a hmotnosti pacientů jakož i způsobu podání. Podle aplikační formy a indikace činí denní účinná dávka obvykle mezi asi 20 až 40000 ATU/kg hmotnosti.

Hirudin-konjugáty mohou také být úspěšně použity k antitrombotickému povrstvení umělých povrchů jako například hemodialyzačních membrán a k tomu patřících hadičkových systémů nebo u přístrojů srdce-plíce.

Siř.

£

Následující příklady slouží k dalšímu popisu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 * ·’ * .

Oktyldiketen

400,1 g Ν,Ν-dimethylcyklohexylaminu se rozpustí ve 2 1 toluenu při 50 až 60 ⁰C a. při této teplotě se přikape 487,5 g chloridu kyseliny oktanové během 2,5 h. Míchá se dále při 50 až 60 °C dvě hodiny a ochladí na teplotu místnosti.

Reakční směs se promyje ledově studenou IN kyselinou sírovou, vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a organická fáze se suší nad síranem hořečnatým. Surový produkt se Čistí frakční destilací. Jako hlavní frakce se'získá 317,3 g bezbarvé kapaliny při teplotě hlavy 135 °C a tlaku .0,3 mbar. Produkt se podle GC-analýzy skládá z 97 % z oktyldiketenů. IR^lH— a ¹³C-NMR-spektra jsou v souladu s navrženou strukturou.

Příklad 2

Kopulace okty1-diketenu na hirudinu

Jako hirudin se použije hirudinmutein, který se od přirozeného hirudinu HV1 odlišuje následujícími aminokyselinovými výměnami: pol.27:Lys; pol. 33:Lys; pol.'36:Arg; pol.47:Arg. Výroba takového hirudinmuteinu je popsána v DE 4014260.

mg hirudinmuteinu se rozpustí v 1 ml 100 mM natriumborátového pufru pH 9,0 a smísí s 1 ml n-propanolu a

1,5 mg oktyldiketenu a pak se inkubuje za intenzivního míchání při 4 °C.

podíl B (%) *7*

100

Po 30 minutách reakce se nezreagovaný oktyldiketen oddělí extrakcí s n-hexanem (1 obj./obj.). Vzniklá směs produktů se po 50-násobném zředění 0,1 % TFA/H2 nanese na Hi-Pore RP 304 sloupec (250 x 4,6 cm, Biorad, č. 125-0550) a vyvíjí se s následujícími gradienty:

roztok A: 0,1 % TFA/H2O roztok B: 0,1 % TFA/acetonitri1 průtoková rychlost: 1 ml/min detekce: 216 nm čas (min)

40.5

45.5

Komplexy hirudin-diketen eluují za následujících podmínek:

% B diketen-jednotka na hirudin (oktyl-diketeni-hirudin) 56 % diketen-jednotky na hirudin (oktyl-diketen2~hirudin) 60 % diketen-jednotky na hirudin (oktyl-diketen3^_hirudin) 68 %

Specifická aktivita derivátů z kopulační reakce izolovaných derivátů činí pro

ATU/mg oktyl-diketem-hirudin oktyl-diketen2-hirudin oktyl-diketen3~hi rudin

7000

8000

4900 (stanoveno trombin inhibíčním testem s chromogenním substrátem S 2238 .(Kabi-Pharmaciay, FEBS-Lett. (1983) 164, 307', stanovení proteinu pomocí UV-extinkce (e_Boiar= 3148, 1/mol.cm²; lambda= 278 nm).

Příklad 3

Hexyldiketen

272,2 g N-dimethylcyklohexylaminu se vloží do 1 1 toluenu a 2-hodiny se zbavuje vody na odlučovači vody. Nechá sé vychladnout na 50 až 60 ’C, přikape se 269 g chloridu kyseliny hexanové a dvě hodiny se pak míchá při 55 *'C.

Reakční směs se promyje IN kyselinou sírovou, vodou-a nasyceným roztokem chloridu sodného a organická fáze se suší nad síranem hořečnatým. Surový produkt se přečistí frakční destilací. Jako hlavní frakce se získá 172 g bezbarvé kapaliny při přechodové teplotě 95 až 100 °C a tlaku 0,15 mbar. Produkt je podle GC-analýzy tvořen z 98 % z hexyIdiketenu. IR-, IH- a ¹³C-NMR-spektra jsou v souladu s předpokládanou strukturou.

Příklad 4

Kopulace hexy1-diketenu na hirudin

Kopulace hexyl-díketenu na hirudin se provádí analogicky příkladu 2. Pro reakci se rozpustí 20 mg hirudinmuteinu ve 2 ml 50% n-propanolu, 50 mM Na-uhliči tanu o pH 9,5. Dělení směsi produktu se provádí po ukončení (viz pr. 2) na RP 304 HPLC-sloupci (Biorad č. 125-0550) s následujícími gradienty: rozpouštědlo A: 5 mM octan amonný pH 6,5 rozpouštědlo B: methanol průtoková rychlost: 1 ml/min detekce: 216 nm čas podíl (min) B(%)

0

30

70

30.1 100

35,0 100

35.1 0

Kopulační produkty hexyl-diketem-hirudin, hexyl-diketen2-hirudin a hexyl-diketen3-hirudin se eluují v gradientech při 42,5, 44 a 50 % rozpouštědla B. Specifická aktivita se stanoví jak je popsáno v příkladu 2 a činí pro. hexyl-diketen3-hirudin 5700 ATU/mg.

Příklad 5 «

Chlorid kyseliny slunečnicového tuku

70,5 g kyseliny slunečnicového tuku z High Oleic Sunflower Oil s obsahem oleje 89 % a číslem kyselosti 219 se rozpustí ve 250 ml toluenu a ohřeje na 40 °C. Při této teplotě se přikape 41,2 g oxalylchloridu a dále se míchá dvě hodiny.

& v

Rozpouštědlo se odstraní při_60 ’C a za sníženého tlaku destilací. Získá se 75 g chloridu kyseliny slunečnicového tuku jako žlutého oleje s chloridovým číslem 12,0.

Příklad 6

Alkyldiketen z chloridu kyseliny slunečnicového oleje (sunnyldiketen) g chloridu kyseliny slunečnicového tuku s chloridovým číslem 12,0 se vloží do 400 ml toluenu a zahřeje se na 50 °C. Při této teplotě se přikape během 25 min 33,7 g

Ν,Ν-dimethylcyklohexylaminu. Reakční směs se po dvě hodiny udržuje na 50 °C a pak se ochladí na teplotu místnosti.

Pevná látka se oddělí tlakovou filtrací a organická fáze se promyje 1M kyselinou sírovou, nasyceným hydrogenuhl i č i t-anem sodným a nasyceným roztokem chloridu sodného. Po sušeni⁵' ,*W ‘ organické fáze nad síranem hořečnatým se rozpouštědlo oddělí destilací za sníženého tlaku. Zbyde 51,8 g slabě žluté olejovité kapaliny, která podle·IH- a ¹³C-NMR je složena z 95 % z alkýldiketenu.

Příklad 7

Výroba sunnyldiketen-hirudinu mg hirudinmuteinu (jako v příkladu 2) se rozpustí ve 2 ml 50% -n-propanolu, ‘50 mM pufru uhličitanu draselného pH 9,5 smísí s 8,5 mg sunnyldiketenu a inkubuje 60 min při 20 °C za intenzivního míchání. Přebytek diketenu se po uplynutí reakční doby extrahuje s n-hexanem (1 obj./obj.). Směs produktů se nanese na RP-304 HPLC-sloupec (Bio-Rad.č.

125-0550; 250 x 4,6 cm) a sloupec se eluuje následujícími gradienty:

rozpouštědlo A: 5 mM octan amonný pH 6,5 rozpouštědlo B: methanol průtoková rychlost: 1 ml/roin detekce: 216 nm čas podíl (min) B(%)

0

70

95

30.1 100

35,0 100

35.1 0

Sunnyldiketen-hirudin-konjugáty sunny1i-hirudin, sunnyl2-hirudin a sunnyl3-hirudin eluují při 77 %, 80 % a methanolú.

Specifické aktivity se stanoví jako v příkladu 2 a č

7700 ATU/mg pro sunnylí-hirudin

7100 ATU/mg pro sunny12-hirudin

6100 ATU/mg pro sunny13-hirudin.

Příklad 8

Reakce N-hydroxysukcinimidesteru kyseliny palmitové s hirudinem %

ní 20 mg hirudinmuteinu (jako v příkladu 2) se rozpustí v.l ml uhličitanu sodného pH 9,5 a smísí s l ml roztoku 1,5 mg N-hydroxysukcinimidesteru kyseliny pálmitové (Sigma) v 1,4 dioxanu a při 20 °C za mícháni uvede do reakce. Po reakční době 4 h se reakce ukončí přídavkem 5násobného molárního přebytku butylaminu (hodina při teplotě místnosti).

Rozdělení směsi produktu se provede .na RP-304.. HPLC-sloupci (Biorad 125-0550) v následujících gradientech:

rozpouštědlo A: 5 mM octan amonný pH 6,5 rozpouštědlo B: 100% methanol průtoková rychlost: 1 ml/min detekce: 216 nra

čas	podí 1
(min)	B(%)
0	0
5	40
30	90
30,1	100
35	100 .
35,1	0

Kyselina palmitovái-hírudin se eluuje při 57 %, kyselina palmitová2~hirudin při 62 % a kyselina palmitová3~hirudin při 76 % rozpouštědla B.

Příklad 9

Výroba kyseliny olejové-hirudinu g anhydridu kyseliny olejové se rozpustí ve 4 ml dioxanu, smísí se 460 mg N-hydroxysukcinimidu a 2 h míchá při teplotě místnosti. 200 μΐ tohoto roztoku aktivované kyseliny olejové se pak smísí s 20 ml n-propanolu a 20 ml roztoku hirudinu (20 mg/ml) v 0,lM Na-uhli či tanu nebo boritanu o pH 9 a 4 h se inkubuje pří teplotě místnosti. Reakce se po přídavku ethanolaminu (2násobný molární přebytek vztaženo na kyselinu olejovou) ukončí.

v ’ ml kopulační vsádky se zředí 40 ml 20 mM Na-fosfátového pfru pH 7,3, zředí 3,5M NaCI (eluční činidlo A) a nanese' na TSK-butyl-sloupec (1 cm x 28 cm, obj. 22 ml, zatížení 2 mg/ml gelu)' a sloupec se promyje průtokem 2 ml/rain 6 objemy sloupce (OS) elučním činidlem A a vyvíjí s následujícími gradienty (eluční činidlo B: 20 mM Na-fosforečnan pH 7,0):

1.	2,5	OS	70 % B
2.	2,5	OS	80 % B
3.	2,5	os	90 % B
4.	2,5	os	100 % B
5.	2,5	os	30 % methanolu v	B
6.	2,5	os	40 % methanolu v	B

Hirudinové deriváty se eluují při 100 % B (olejová kyselinai-hirudin a olejová kyselinaa-hirudin) a 30% methanolu (olejová kyselina3^-hirudin). Specifické aktivity činí 11000 U/mg u olejové kyseliny i-hirudinu,. 6200 U/mg u olejové kyselinyz-hirudinu a 6600 U/mg u olejové kyseliny3-hirudinu.

Příklad 10

Výroba cholesterol-hirudinu ml roztoku hirudinu (20 mg/ml v 0,lM Na-uhličitanu nebo zu

Na-boritanu pH 9,5) se smísí s roztokem 3,2 mg

N-hydroXysukčinimidem aktivovaným cholesterolem v 1,2 ml THF a inkubuje se při 4 h při teplotě místností. Reakce se ukončí přídavkem ethanolaminu (2násobný molární přebytek vztaženo na cholesterol) a nastaví se na pH 7,0.

ml kopulační vsádky se zředí s 8 ml roztoku octanu amonného (2 mM, pH 6,0, eluční činidlo A) a při průtokové * rychlosti 2,5 m.l/min se nanese na HiPore BioRád RP 304-sl'oupec (10 x 250 mm) a vyvíjí se s následujícími gradienty:

minuty X B

0

40

90

Cholesterol-hirudin eiuuje.pri 38 minutách.' Specifická

..... reaktivita derivátu činí 16000 U/mg.

‘ s r > t

Aktivovaný cholesterol byl vyroben následovně:

15,0 g 28-cholesterolu a 5,2. g anhydridukyseliny jantarové se zahřívá ve 40 ml pyridinu 22 h pod refluxem a pak se vyjme do 250 ml MTBE. Organická fáze se extrahuje 200 ml IN kyseliny chlorovodíkové, 200 ml vody a 200 ml nasyceného roztoku chloridu sodného a rozmíchá se se síranem hořečnatým a aktivním uhlím. Filtrát se zbaví rozpouštědla ve vakuu. Získá se 18,1 g kyseliny jantarové-cholest-5-en-3|3-yl-esteru.

1,94 g takto získaného esteru a 0,55 g N-hydroxysukcinimidu se vloží do 12 ml dichlormethanu při 4 °C a přidá se 1,01 g Ν,Ν-dicyklohexylkarbodíimidu. Nechá se ohřát na teplotu místnosti a pevná látka se odfiltruje. V organické fázi obsažený surový produkt se chromatografuje na 80 g silikagelu (dichlormethan + ethylester kyseliny octové= 2+1). Získá se 1,7 g N-hydroxysukcinimidem aktivovaného cholesterolu CN—3—[cholest-5-en-3P-yloxykarbonyl)-propi onyloxy]-suke inimid).

Příklad 11

Výroba farnesyl-hirudinu

5,6 ml roztoku hirudinu (21 mg/ml v 0,1M Na-uhliči tanu pH 9) se zředí s 5,5 ml n-propanolu a smísí se 32 mg farnesylalkohol-p-nitrofenylkarboňátu a inkubuje sě 12 h při teplotě místnosti za míchání. Eeakční vsádka se pak zředí se 150 ml 2M NaCI, 20 mM Na-fosforečnanu pH 7 a nanese se na terč.butyl-sloupec (zatížení 2 mg proteinu/ml gelu, výška sloupce 25 cm). Potom se sloupec promyje 2,2 objemy sloupce nanášecího pufru a pak se vyvíjí lineárními gradienty 2M NaCI, 20 mM Na-fosforečnanu pH 7, potom 20 mM Na-fosforečnanu pH 7 (25 objemů sloupce). Farnesyl-hirudin se eluuje na konci gradientů při 20 mM Na-fosforečnanu. Specifická aktivita byla stanovena jako v příkladu 2 a činí 11300 U/mg.

Farnesylalkohol-p-nitrofenylkarbonát byl vyroben následovně:

i .1,40 g farnesolu a 1,01 g diazo-[2.2.2]-bicyklooktanu se rozpustí ve 20 ml dichlormethanu a během 15 minut se přikape 3,63 g p-nitrofenylchlorformíátu v 10 ml dichlormethanu. Míchá se 1,5 h, rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a surový produkt se chromatografuje na 150 g silikagelu (hexan + ethylester kyseliny octové= 20+1). Získá se 2,2 g farnesylalkoho1-p-nitrofenylkarbonátu.

Příklad 12

Výroba kyseliny stearové-hirudinu

0,5 g stearoylchloridu se rozpustí ve 2 ml 1,4-dioxanu a smísí s 0,29 g N-hydroxysukciniraidu i 0,1 ml triethylaminu a míchá se 3 h při teplotě místnosti. Reakční směs se smísí s 1 ml vody a pH se nastaví přídavkem hydroxidu na 5. 60 μΐ sukcinimidem aktivovaného roztoku kyseliny stearové se smísí se 2,5 ml roztoku hirudinu (21 mg/ml v O,1M Na-uhličitanu pH 9) a 2,5 ml dioxanu a 12 h se za míchání inkubuje při teplotě místnosti. Reakční vsádka se pak přečistí preparativní RP-HPLC (viz příklad 2). Deriváty eluují při 48 % B, 54 % B, 62 % B a 74 % B. Specifické aktivity činí 9600 U/mg, 12400 U/mg, 12800 U/mg a 840 U/mg.

Příklad 13 .<·,

Výroba lutensol T03-hirudinu ‘^í:

0,5 ml roztoku hirudinu (21 mg/ml v 0,1M Na-uhličitanu nebo Na-boritanu pH 9) se zředí 0,5 ml tetrahydrofuranu a .. smísí s 1,2 mg lutensol TO3-N-hydroxysukcinimidkarbonátu (příklad 12) a inkubuje 12 h při teplotě místnosti. Reakce se přídavkem et.hanolaminu (2násobný molární přebytek vztaženo ná aktivovaný lutensol) ukončí a rozdělí chromatografií - jak je popsáno v příkladu 10. Deriváty hirudin-lutenso1 eluují při 45 % B (derivát 1 11300 U/mg, pro derivát 2 9700 U/mg a 440 U/mg pro derivát 3),

Výchozí materiál se vyrobí následovně:

g fosgenu se při 0 °C nakondenzuje do 100 ml toluenu a během 10 min se přikape 34,0 g lutensolu T03 (OH-číslo= 165) v 50 ml toluenu. Nechá se ohřát na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odstraní při 35 °C při vakuu olejové pumpy.

Získá se 40,3 g chlorkarbonátu lutensolu T03.

1,2 g N-hydroxysukcinimidu a 1,0 g triethylaminu se rozpustí ve 20 ml dichlormethanu a během 5 min se přikape 3,92 g chlorkarbonátu lutensolu ΊΌ3 v 10 ml dichlormethanu. Dále se 2 h míchá při teplotě místnosti, rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a zbytek se vyjme do ethylacetátu. Zbylá pevná látka se oddělí a filtrát se zbaví rozpouštědla ve vakuu. Získá se 4,3 g N-hydroxysukcinimidkarbonátu lutensolu T03.

Příklad 14

Výroba okty1-diketen-fenylalanin-hirudinu

0,5 ml roztoku hirudinu (21 mg/ml v 0,lM Na-uhličitanu nebo Na-boritanu-pH 9) se zředí 0,5 ml tetrahydrofuranu a smísí se 4 mg

N-(2-hexyl-3-oxo-dekanoyl)-fenylalanin-N-hydroxysukeinimidesteru a 12 h inkubuje za míchání při teplotě místnosti. Reakce se ... ukončí přídavkem ethanolaminu (2násobný molekulární přebytek vztaženo na aktivovaný fenylalanin) a rozdělí pomocí RP-HPLC jak je popsáno v příkladu 10. Deriváty hírudin-diketen eluují při 43 % B (derivát 1), 48 % B (derivát 2) a 58 % B (derivát 3). Specifické aktivity se stanoví jako v příkladu 2 a Činí pro derivát 1 930 U/mg, pro derivát 2 2800 U/rog a 135 U/mg pro derivát 3.

Výchozí materiál se vyrobí následovně:

82,5 g fenylalaninu se předloží do 500 ml vody při pH í, w

13.5 a během 1,25 h se přikape 145,9 g oktyldiketenů v 50 ml dichlormethanu. Suspenze se 5 h intenzivně míchá, smísí se se

2.5 1 vody a pH se nastaví na 1 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Vodná fáze se extrahuje celkem 2,5 1 dichlormethanu, spojené organické fáze se suší nad síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Výsledná bílá pevná látka se vyjme do 1000 ml pentanu, pevná látka se odfiltruje a suší se ve vakuu při 60 °C. Získá se 190 g N-(2-hexyl-3-oxo-dekanoyl)-f.enylalaninu. N-(2-Hexyl-3-oxo-dekanoy1)-fenylalanin a 0,55 g N-hydroxysukcinimidu se předloží do 10 ml dichlormethanu a při 4 °C se přidá 1,01 g Ν,Ν-dicyklohexylkarbodiimidu. Nechá se ohřát na teplotu místnosti, vytvořená pevná látka se oddělí a ve fázi získaný surový produkt se chromatografuje na 80 g silikagelu (dichlorhexan + hexan = 3+1, 1% ledová kyselina octová). Získá se 2,0 g N-(2-hexyl-3-oxp-dekanoyl)-fenylalanin-N-hydroxysuke i nimidesteru

Příklad 15

Výroba oktylketen-kapronová kyselina-hirudinu ' .............

1,0 ml roztoku hirudinu (21 mg/ml v 0,1M Na-uhličitanu nebo Na-boritanu pH 9) se zředí 1,0 ml tetrahydrofuranu a smísí se 7 mg

N-(6-(2-hexyl-3-oxo-dekanoylamino)-hexanoyloxy)-sukcinimidu a 12 h se za míchání inkubuje při teplotě místnosti. Reakce se ukončí, přídavkem ethanolaminu (2násobňý molární přebytek vztaženo na aktivovaný diketen) a rozdělí pomocí

RP-chromatografie - jak je popsáno v příkladu 10.

Hirudin-diketen deriváty eluují při 48 % B (derivát 1), 52 % B (derivát 2) a 63 % B (derivát 3). Specifické aktivity byly stanoveny jako v příkladu 2 a činí pro derivát 1 7500 U/mg, pro derivát 2 3400 U/mg a 80 U/mg pro derivát 3.

Výchozí materiál se vyrobí následovně:

6,55 g kyseliny 6-aminokapronové se rozpustí při pH 9 ve 100 ml vody a během 20 min se přikape 14,24 g oktyldiketenu. Míchá se přes noc, pH se upraví koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na 1 a vodná fáze se extrahuje 100 ml MTBE. Organická fáze se suší nad síranem horečnatým, rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a surový produukt se převede do 150 ml pentanu. Výsledná pevná látka se odfiltruje a suší se ve vakuu při 60 °C. Získá se 5,9 g

6-(2-hexyl-3-oxo-dekanoylamino)-hexanové kyseliny.

1,53 g takto získaného produktu a 0,55 g N-hydroxysukc'inimidu se předloží při 4 ⁰C do 10 ml dichlormethanu a smísí s 1,01 g Ν,Ν-dicyklohexylkarbodiimidu. Nechá se ohřát na teplotu místnosti a pevná látka se odfiltruje. Surový produkt obsažený v organické fázi se chromatografuje přes 80 g silikagelu (ethylacetát + hexan = 3+5; 1 % ledová kyselina octová). Získá se 1,7 g ' *

N-[6-(2-hexy1-3-oxo-dekanoy1amino)-hexanoyIoxy]-suke inimidu.

Příklad 16

Kinetika anti-faktor Ila aktivity ve vzorcích plasmy psu a krys

Metoda: Hirudin-konjugáty nebo placebo se intravenozně aplikují narkotizovaným krysám nebo bdícím psúm. V definovaném čase se zvířatům odeberou vzorky venozní krve pro získání citrátové plasmy. Volná anti-faktor Ila aktivita hirudin-konjugátu v plasmě se stanoví pomocí chromogenní eseje pomocí standardní křivky s rekombinantním hirudinem.

Princip testu:

trombin chromogenní substrát (S-2238) > peptid + p-nitroani1in (Žlutá)

Do mikroploten se odpipetuje ke vždy 100 μΐ tris-pufríi (Tris 200 mmol/1, NaCI 25 mmol/1, pH 8,1) vždy 10 μΐ vzorku plasmy a 100 μΐ trombinu (0,3 NIH-jednotky/ml). Po 1 min se reakce nastartuje přídavkem 50 μΐ substrátového roztoku (S-2238, 1,34 mmol/1. Vsádka se po krátkém promísení inkubuje při 25 °C a reakce se přídavkem 100 μΐ 30% kyseliny octové ukončí. Extinkce vzorku, měřené při 405 nm proti 630 nm; je nepřímo úměrná anti-faktor Ila aktivitě v plasmovém vzorku. V plasmových vzorcích se částečně také měří parametr srážení trombinový čas (TT) a parciální tromboplastinový čas (APTT)\

Výsledky: .....

U přibližně stejné specifické aktivity je po i.v. aplikaci 1 mg/kg lipofilního hirudin-derivátu narkotizovaným krysám proti r-hirudinu zaznamenán významně zpomalený návrat volné anti-faktor II aktivity (obr.l). U psu se po i.v. aplikaci 5000 antitrombin-jednotek/kg (ATU/kg) okt.yldikete-n3-hirudinu naměří rovněž proti r-hirudinu významně zvýšená účinná hladina se zpomalenou eliminací (obr.2). Velmi pomalý pokles volné anti-faktor Ila aktivity je také pozorován u i.v. aplikace 1 mg/kg farnesyl-hirudinu (obr.3).

Příklad 17

Trombinem. vyvolaná agregace promytých trombocytů z krve člověka a krys ex vivo a in vitro po předchozí inkubaci trombocytů s lipofilními hirudin-deri váty

Metoda: Čerstvá citrátová krev (9 dílů krve + 1 díl citrátu sodného 0,11 mol/1, krysy: 8,5+1,5) se odstředuje pro získání plasmy bohaté na destičky (PRP, supernatant) 16 min při 250 x g. Z PRP se metodou podle Patscheke-a a spol. (Haemostasis 10, 14-27, 1981) získá koncentrát promytých trombocytů. Přirom se trombocyty nejprve z PRP 7minutovým odstředováním při 330 x g odsedimentují. Provádí-li se. takové zpracování s hirudin-deriváty, na tomto místě po přídavku 200 μΐ derivátu v promývacím roztoku (120 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 KC1, 2 mmol/1 _ CaCH, 1 mmol/1 MgCl2, 5 mmol/1 glukózy, 2 g/1 albuminu, 50 mg/1 apyrasy ve 30 mmol/1 fosforečnanu sodného, pH 6,5) pro konečnou koncentraci derivátu 0,215 mg/1 rozvíří peleta a 10 min se při teplotě místnosti inkubuje. Následují dva stupně promývání v tomto promývacím roztoku a pak konečná resuspenze trombocytů v testovém mediu se 120 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 KC1, mmol/1 CaCl2, 0,1 mmol/1 MgCla, 5 mmol/1 glukózy, 0,5 g/1 albuminu, 50 mg/1 apyrasy, 1 mmol/1 fosforečnanu sodného, TES/NaOH, pH 7,4. Počet trombocytů se nastaví na 2 x 10⁵/μ1 (krysy 8 x 10⁶/μ1). Pro stanovení agregace trombocytů se 218 μΐ trombocytového koncentrátu 3 min při 37 °C inkubuje v agregometru (PAP-4 Bio Data Corporation), 1 min se míchá při 1000 RPM a ještě 1 min inkubuje. Potom se agregace nastartuje přídavkem 2 μΐ roztoku trombinu. Agregace trombocytů se provádí přes změnu měřené transmise ve vzorku za časovou jednotku (Slope-metoda). Jako měřítko relativní účinnosti a afinity hirudin-derivátu se stanoví EC50 trombinová koncentrace v NIH-jednotkách/ml, s níž se dosáhne poloviny maximálního vzrůstu trombocytové agregace, Z této EC50. a .ECSO — vzorku inkubováného béz hirůdinu se vypočte neutralizační index (NI) s NI= ECSO derivát/EC50 kontrola. Tato hodnota je specifická pro derivát a poskytuje faktor, o který musí být koncentrace trombinu jako agonisty zvýšena, aby bylo dosaženo stejné agregace (polovina maximálního vzrůstu) jako u kontroly,

Výsledky: ...... - Po předcházející inkubaci trombocytú rozdílných druhů se

21,5 pg/ml lipofilních hirudin-derivátú se muší částečně použít mnohonásobek v kontrole použité koncentrace trombinu, aby se opět dosáhlo agregace (obr.4). Toto potlačení se uskuteční imunologicky prokazatelným nalepením lipofilních hirudin-derivátú na trombocyty. Neutralizační indexy dosahují hodnot až 25 u lidských trombocytú (tabulka 1). U-.krys byl 24 h po aplikaci 10 mg/kg cholesterol-hirudinu ještě stanoven NI' 5,4 na promytých trombocytech ex vivo (viz příklad 20: tabulka 2).

Tabulka 1 ... .......

Neutralizační indexy (NI) pro zvolené sloučeniny na lidských trombocytech

Substance NI kontrola (ošetřeno placebem) 1 r-hirudin 1,21 stearoyl-hirudin 5,42 paÍmitoyl~hirudin 4,71 cholesteryl-hirudin '21,2 lutensol T03-hirudin . 15,1 farnesyl-hirudin 24,3

Příklad 18

Antitrombocytová účinnost na arteriovenozní odbočce na krysách

Metoda: V tomto experimentu slouží skleněná kapilára v arteriovenozní odbočce jako umělý trombogenní povrch a vyvolává dojem trombózy. Narkotizované krysy (urethan 25%, 2 x mg/kg i.p.) se v poloze na zádech fixují na temperovanou (37 °C) otápěnou lavici. Do volně vypreparované pravé A.carotis a

V. jugularis se implantují krátké polyethylenové katetry (Portex, PE 50), naplní se fyziologickým NaCl-roztokem a uzavřou svorkami. Volné konce katetrů se spojí 20,0 mm dlouhou skleněnou kapilárou (vnitřní průměr 1,0 mm), která působí jako trombogenní povrch. Aplikace zkoušené substance může být provedena i.v., s.c., p.o. nebo infuzí. Po požadované době inkubace (5, 60 nebo 360 min) s testovanou sloučeninou nebo rozpouštědlem (kontrola) se odbočka otevře odstraněním svorek. i

Krevní proud se vede přes odbočku pro rychlý vzestup odbočkové teploty, která se měří ve středu skleněné kapiláry. Zvýšení z teploty okolí na tělesnou teplotu je indikátorem pro průchodnost odbočky. Teplota se až do uzavření odbočky zaznamenává kontinuálně každých 30 minut. Pro srovnání účinnosti různých hirudin-derivátu je vypočítá EDISmin jako dávka, která vztaženo na kontrolní skupinu vede k prodloužení doby uzavření o 15 minut. Při otevření odbočky a na konci pokusu se odeberou další krevní vzorky pro stanovení anti-FIIa-aktivity v plasmě.

Výsledky:

Oktyldiketen3-hirudin a oktyldiketen3~hirudin vykazují na základě jejich delší doby působení antitrombotickou účinnost již v nižších dávkách a po delší dobu ve srovnání s r-hirudinem (obr. 5)

Příklad 19

Ant itrombotické působení na proudem vyvolanou trombózu u krys

Metoda: V tomto pokuse se krátkám tokem proudu dvěma na A.carotis vloženými elektrodami vyvolá poškození endothelu a tím trombotický uzávěr cév. Narkotizované (urethan 25%, 2x8 mg/kg i.p.) krysy se fixují v poloze na zádech na temperovanou (37 °C) otopnou lavici. 20 mm dlouhý segment pravé A.carotis se vypreparuje a ultrazvuková transit-time fluxmetrová hlavice se umístí na proximální záchyt segmentu. Objemový tok se snímá během doby sledování 30 min pomocí ultrazvukového fluxmetrového přístroje (T206, Transonic Systems lne., USA). Tvorba trombu se vyvolá konstatním tokem proudu (3 mA, 1 min) hákovitě tvarovaným párem elektrod, který se vnese 1 cm distálně od fluxmetrové hlavice na povrch cévy. Cévní.okluze se definuje jako snížení objemového toku na < 0,3 ml/minr-po.....

více než tři minuty. Antitrombotická účinnost hirudin-derivátů se kvantifikuje jako četnost trombózy béhem 30 min ve skupině 10 zvířat. Pro srovnání účinnosti různých hirudin-derivátů se vypočte ED50 jako dávka, která vztaženo na kontrolní skupinu redukuje četnost trombózy o 50 %. Před vložením napětí a na konci pokusu se navíc odeberou další krevní vzorky pro stanovení anti-FIIa-aktivity v plasmě.

Výsledky:

Pro palmito.yl z-hirudin bylá stanovena ED50 0,24 mg/kg,' měřeno 5 minut po intravenozní aplikaci. Odpovídající ED50 pro r-hirudin činí 0,47 mg/kg. Také 24 h po intravenozní aplikaci cholesterol-hirudinu mohlo být na krysách na základě dlouhé doby účinnosti prokázáno ještě potlačení agregace promytých trombocytu ex vivo a dobá antitrombotická účinnost (tabulka 2) .

Tabulka 2

Antitrombotícký účinek	a potlačení	agregace	trombocytu
cholesterol	-hirudinem	24 h po i.v.	aplikaci	(n=9-10)
Ošetře-	trombo-	neutra-	plasmová	TT	APTT
ní	bozová četnost (%)	1izační index v promy- tých trom- bocytech	anti-FIIa aktivita (ATU/ml)	(s)	(s)
in vitro	-	18» 3+6,1	-	-	-
placebo	100	1	0	41 + 1 ·	29+4
1,0 mg/kg	50	1,5+0,02	5,7+0,6	267+15	30±3
10 mg/kg .	11	5,39+0,74	61,0+3,8	> 300	52 + 4

Ρ A τ. Ε - NT Ο V É

Claims

1. Hirudin-konjugát vytvořený z hirudinu a jedné nebo více lipofilních sloučenin, kde lipofilní sloučenina vykazuje rozdělovači koeficienty oktanol-voda -větší než 1,8 achemicky je kovalentně navázána k hirudinu.

2. Hirudin-konjugát podle nároku 1,vyznačuj ící se t í m, že navázání lipofilní sloučeniny je provedeno v oblasti aminokyselin 27 až 37.

3. Hirudin-konjugát podle nároku la 2, vyznačuj ící se t í m, že navázání hirudinu a lipofilními sloučeninami je provedeno přes aminopostranní řetězce lysinových zbytků hirudinu.

4. Hirudin-konjugát podle nároku 1 až 3, vyznačuj ící se t í m, že s hirudinem jsou navázány 1 až 3 lipofilní sloučeniny.

5. Hirudin-konjugát podle nároku 1 až 4, v y z n a č u j ící se t í m, že nejméně jedna lipofilní sloučenina je navázána s aminokyselinou 27 nebo 33.

6. Hirudin-konjugát podle nároku 1 až 5 pro použití při potírání chorob.

7. Způsob výroby hirudin-konjugátů, vyznačující se tím, Že se hirudin nechá reagovat s jedním nebo více molárními ekvivalenty lipofilní sloučeniny, popřípadě po chemické aktivaci lipofilní sloučeniny.