SK67596A3 - Hirudin conjugates from hirudine and lipophilic compounds - Google Patents
Hirudin conjugates from hirudine and lipophilic compounds Download PDFInfo
- Publication number
- SK67596A3 SK67596A3 SK675-96A SK67596A SK67596A3 SK 67596 A3 SK67596 A3 SK 67596A3 SK 67596 A SK67596 A SK 67596A SK 67596 A3 SK67596 A3 SK 67596A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- hirudin
- acid
- lipophilic
- compounds
- lipophilic compounds
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/545—Heterocyclic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka nových hirudínových konjugátov, ktoré sú vytvorené z hirudínu a lipofilných zlúčenín, ich výroby i ich použitia.
Doterajší stav techniky
Hirudín je už dlho známy, prirodzene sa vyskytujúci proteín s vlastnosťami, potláčajúcimi zrážanie krvi. Je najsilnejším a najselektívnejším doteraz známym inhibítorom trombínu (Naturwissenschaften, 41, 537 (1955); Hoppe-Seylers Z.fúr Biol.Chemie 366, 379 (1985)). Prirodzený hirudín je zmes chemicky zmenených peptidov s molekulovou hmotnosťou 6900-7000 Dalton a s 64-66 aminokyselinami. Doteraz bíolo popísaných asi 20 prirodzene sa vyskytujúcich variantov hirudínu (Scharf a spol., FEBS-Letters 255, 105-110 (1989)).
V EP 345616 sú popísané kopulačné produkty hirudínu a polymérnych nosičov. Ako nosiče sú uvádzané rozpustné a nerozpustné polyméry ako dextran, sepharóza, heparín, leavan a čiastočný hydrolyzát želatíny. Nosičom modifikované hirudíny by mali mať zlepšené farmakologické vlastnosti, ako je o niečo predĺžený polčas účinnosti.
V oboch vyššie uvedených zverejnených publikáciách sú popisované hirudínové deriváty s predĺženou účinnosťou, ktorá bola dosiahnutá modifikáciou hirudínu s vysokomolekulárnymi polymérmi. Molekulová hmotnosť polymérov je pritom niekoíko kilodaltonov, takže sa molekulová hmotnosť polypeptidu hirudínu výrazne zväčšila. Takéto vysokomolekulárne polyméry nie sú však chemicky exaktne definované; tvoria ich väčšinou populácie rôznych molekúl, ktoré sú rozložené v oblasti molekulových hmotností. Preto sa tiež takto vytvorené hirudínové kopulačné produkty neskladajú z jednotlivej chemickej zlúčeniny, ale z molekulových populácii, ktoré sa od seba odlišujú svojimi molekulovými hmotnosťami.
Je však žiadúce, aby účinné látky, ktoré sa používajú ako liečivá, boli chemicky čo najpresnejšie definované, aby bolo možné čo najlepšie kontrolovať ich chovanie v organizme.
Vyvstáva tak úloha pripraviť hirudínové deriváty s farmakologickými vlastnosťami zlepšenými voči normálnemu hirudínu, ktoré by nevykazovali vyššie uvedené nevýhody hirudínu modifikovaného vysokomolekulárnymi polymérmi.
Podstata vynálezu
Táto úloha je riešená hirudínovými konjugátmi, vytvorenými z hirudínu a jednej alebo viac lipofilných zlúčenín, pričom lipofilná zlúčenina vykazuje rozdeľovači koeficient oktanol-voda väčší ako 1,8 a je chemicky kovalentne naviazaná na hyrudín.
Na hirudínové konjugáty podľa vynálezu sú vhodné všetky prirodzene sa vyskytujúce hirudíny a tiež z nich odvodené varianty, takzvané hirudín-muteíny a fragmenty s trombín inhibujúcou účinnnosťou.
Takéto hirudíny a ich výroba sú napríklad známe z EP 171024, EP 158986, DE 38055406, WO 91/1712, GB 2247239, EP 557199, WO 92/5748, DE 4014260.
Ďalej sú na výrobu hirudín-konjugátov podľa vynálezu vhodné od hirudínu štrukturálne odvoditeľné peptidy alebo peptidové deriváty s hirudínovou aktivitou, ako sú napríklad popísané V EP 333356.
Výhodne sa používajú také hirudíny, pri ktorých nevedie naviazanie lipofilnej zlúčeniny k žiadnej strate aktivity. Tak je to napríklad v prípade, keď sa naviazanie uskutočňuje cez postranné reťazce aminokyselín 27 až 37. Mimoriadne výhodné na naviazanie sú aminokyselinové polohy 27 a 33 (vztiahnuté na prírodný hirudín HVI), pretože tieto zlúčeniny ležia na konci prstom podobného regiónu a nerušia interakcie hirudínu s trombínom.
Väzba lipofilných zlúčenín, prípadne spaceru s lipofilnými zlúčeninami, môže prebiehať na aminoskupinách hirudínu, napríklad na volnej N-koncovej aminoskupine, aminoskupinách postranných reťazcov lyzínu, aminoskupinách histidínu, amidinoskupinách arginínu alebo na hydroxyskupinách hirudínu, napríklad ty- x rozi-, serín- alebo threonín-postranných reťazcoch.
Mimoriadne vhodné na naviazanie lipofilných zlúčenín sú aminoskupiny lyzínových postranných reťazcov.
Prípadne je možná väzba lipofilnej zlúčeniny na modifikovaný tyrozín hirudínu, ktorý je dostupný nitráciou a redukciou (Meth.Enzymol. 25, 515-521 (1972)). Na vytvorený arylaminotyrozín môže potom byť naviazaná lipofilná zlúčeniana známymi kopulačnými metódami.
Ako lipofilná zlúčenina sú vhodné zlúčeniny, ktoré obsahujú jednu alebo viac funkčných skupín ako amino-, hydroxy-, karboxyskupiny alebo skupiny sulfónových kyslín a ktoré vykazujú rozdeíovací koeficient oktanol-voda väčší ako 1,8.
Lipofilné zlúčeniny môžu byť prírodné látky, napríklad nasýtené alebo nenasýtené mastné kyseliny, terpény, prostaglandíny, v tukoch rozpustné vitamíny, karotenoidy alebo steroidy ale i syntetické karboxylové kyseliny, alkoholy, amíny a sulfónové kyseliny s jedným alebo viac alkyl-, aryl-, alkenylmi alebo tiež viacnásobne nenasýtené zlúčeniny ako lineárne taktiež rozvetvené a prípadne substituované halogén-, nitro-, kyano-, alkoxy-, alkyltio- alebo hylogénalkylskupinami.
Príklady lipofilných zlúčenín sú nasýtené mastné kyseliny - kyselina kaprónová, kaprylová kaprínová, laurová, myristová, palmitová, stearová, arachová a behenová a nenasýtené mastné kyseliny - kyselina palmitoolejová, olejová, linolová, linolénová, ricínová, oktadecéntetraenová, eikozanová, eikozadienová, arachidonová, eikosapentaenová alebo eruková ako i z nich pripraviteľné mastné alkoholy a mastné amíny.
Vhodné sú tiež zmesi mastných kyselín, ktoré sa získajú pri zmydelnení prírodných tukov ako je kokosový tuk, tuk palmových jadier, repkový olej, olivový olej, slnečnicový olej, vysoko olejnatý slnečnicový olej, ricínový olej alebo hovädzí loj .
Ďalšími príkladmi lipofilných zlúčenín sú karotenoidy zeaxantín, rodovibrín alebo astaxantín, steroid cholesterín desmosterol, coprosterol, cerebrosterol, latosterol, ergestervol, sitosterol, stigmasterol, kyselina cholová, kyselina cholínová, dehydrokortikosterol, aldostearón, androsterón, testosterón, tachysterol, lanosterol alebo lumisterol, terpény geraniol, nerol, linalool, metol, karveol, borneol, farnezol, nerolidol alebo sclareol, prostaglandíny brefeldín, PGE2 alebo PGF2, vitamín A-^ alebo D, ale tiež syntetické zlúčeniny ako oxoalkoholy, hexylamín, kyselina etylhexánová, etylhexanol, etylhexylamín alebo kyseliny alkylbenzénsulfónové.
Pre vynález sú mimoriadne vhodné tie lipofilné zlúčeniny, ktoré majú všeobecný vzorec I
(I) kde
R1 a R2 nezávisle na sebe sú (CH2)mc(R3) (R4 )“(CH2)n-(CH=CH-CH2)o-CH3 , m je číslo 0 až28, n je číslo 3 až6, o je číslo 0 až6,
R3 a R4 nezávisle sú H, C^g- alkyl, C3_g-cykloalkyl, aral alebo benzyl, prípadne substituované halogén-, nitro-, kyano-, alkyl-, alkoxy-, alkyltio-, halogénalkylskupinami.
Mimoriadne výhodné sú tie zlúčeniny vzorca I, kde zvyšky R1 a R2 sú tvorené 4 až 16 C-atómami a sú nasýtené alebo raz, dvakrát alebo trikrát nenasýtené.
Ako lipofilné zlúčeniny sú vhodné takéto zlúčeniny všeobecného vzorca II
H-Y-R1 (II) kde
R1 znamená (CH2)m-C(R3)(R4)-(CH2)n-(CH=CH-CH2)o-CH3 a
Y znamená -C(0)~, -N(R5)-, -0- kde r5 znamená H, Cy_-^g-alkyl, C3_18-alkenyl, C3_g-cykloalkyl, aryl alebo benzyl, prípadne substituovaný halogén-, nitro-, kyano-, alkyl-, alkoxy-, alkyltio-, halogénalkylskupinami.
Výroba hirudín-konjugátov podľa vynálezu sa uskutočňuje tak, že sa hirudín budf priamo alebo pomocou spaceru spojí s jednou alebo viacerými lipofilnými zlúčeninami.
Ako spacer sú vhodné všetky bi- alebo viacfunkčné molekuly, ktoré na základe svojich viacfunkčných skupín umožňujú spojenie - prípadne po aktivácii - hirudínu a lipofilnej zlúčeniny.
Ako spacer sú vhodné najmä aminokyseliny, oligopeptidy, mono, di- alebo oligosacharidy, amino- alebo hydroxykarboxylové kyseliny, najmä tie, ktoré majú dĺžku raťazca od 2 do 10 C-atómov, ktoré prípadne na zvýšenie hydrofilnosti môžu niesť dalšie substituenty, napríklad C1-C4-oligoalkylénglykoly.
Na naviazanie lipofilných zlúčenín na hirudín môžu byť napríklad použité nasledujúce spacery:
W kde X
W
Z
| znamená S, 0, NH, N(CH3), N(C2H5) | ||
| znamená | H, OH, C1 | |
| znamená | Cj-Cg-alkylénovú skupinu | skupinu alebo p-fenylénovú |
Na zachovanie biologickej aktivity hirudín-konjugátu po naviazaní na povrchy ako bunkovej membrány alebo syntetické povrchy môže byť výhodné použitie spaceru, sprostredkujúceho odstup.
Pre hirudín-konjugáty podľa vynálezu sú vhodné všetky tie lipofilné zlúčeniny, ktoré nesú jednu alebo viac funkčných skupín ako napríklad skupiny amino-, hydroxy-, karboxy- alebo sulfónových kyselín, pretože tieto funkčné skupiny môžu po aktivácii reagovať s reaktívnymi skupinami hirudínu.
Typ aktivácie lipofilných zlúčenín, prípadne naviazanie cez spacer, závisí na funkčnej skupine a môže byť stanovené odborníkom v odbore známym spôsobom.
Ak nesie lipofilná zlúčenina alebo spacer s lipofilnou zlúčeninou karboxylovú skupinu, je možné uskutočniť aktiváciu napríklad prevedením na alkenylester, arylester, O-poloacetál, O-acylpoloaminoacetál, O-acylpoloketál, O-acylpoloaminoketál, O-acyllaktim, symetrický alebo nesymetrický anhydrid kyseliny karboxylovej, anhydrid kyseliny karboxylovej-kyseliny karbamínovej, O-acylizoureid, O-acyl-N-hydroxylamín, O-acylhydroxámovú kyselinu, 0-acyl-N,N~diacylhydroxylamín, O-acyloxím, O-acyl-N-azo-N-acylhydroxylamín, O-acyl-N-azo-N-arylhydroxylamín, anhydrid kyseliny karboxylovej-siričitej , anhydrid kyseliny karboxylovej-kyseliny sírovej, anhydrid kyseliny karboxylovejkyseliny fosforitej, anhydrid kyseliny karboxylovej-kyseliny fosforečnej, acylfosfóniová zlúčenina, anhydrid kyseliny karboxylovej-amidu kyseliny fosforečnej, fluorid kyseliny karboxylovej alebo chlorid karboxylovej kyseliny ako je popísané v Muller, Houben-Weyl, methoden der organischen Chemie, zv. 15/1 a 15/2,. Thieme Verlag, Stuttgart (1974) alebo Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, str. 85-128, John Wiley & Sons, New York, 1976 alebo ináých základných dieloch peptidovej chémie.
Mimoriadne vhodnými reaktívnymi skupinami sú chloridy karboxylových kyselín, symetrické anhydridy, prípadne 1, 2, 3 alebo 5 halogén- alebo nitroskupinami substituovaný arylester, N-hydroxysukcínimidester, N-hydroxyftalimidester alebo N-hydroxybenzotriazolester.
Analogickým spôsobom je možné aktivovať skupiny sulfónových kyselín.
Ak sú ako funkčné skupiny v lipofilných zlúčeninách prítomné amino-alebo hydroxyskupiny, uskutočňuje sa naviazanie lipofilných zlúčenín an hirudín výhodne cez spacer, ktorý ako druhú funkčnú skupinu nesie karboxylovú skupinu alebo skupinu kyseliny sulfónovej a aktivuje sa vyššie popísaným spôsobom pre kopuláciu na hirudín.
Ako lipofilné zlúčeniny sú vhodné tiež alkyldiketény, ktoré bez ďalšieho spracovania môžu byť priamo spojené s hirudínom.
Ako alkyldiketény sa výhodne používajú zlúčeniny všeobecného vzorca III
(III) kde
R1 a R2 nezávisle na sebe sú
| m | (CH2) m-C(R3)(R4)-(CH2)n-(CH=CH-CH2)Q-CH3, je číslo 0 až 28, |
| n | je číslo 3 až 6, |
| o | je číslo 0 až 6, |
R3 a R4 nezávisle sú H, C^g- alkyl, C3_6-cykloalkyl, aryl alebo benzyl, prípadne substituované halogén-, nitro, kyano-, alkyl-, alkoxy-, alkyltio-, halogénalkylskupinami.
Mimoriadne výhodné sú ako zlúčeniny všeobecného vzorca III mastné alkyldiketény, ktoré sú napríklad popísané v DE 2927118, odvodené od nasýtenej mastnej kyseliny - kyseliny kaprónovej, kyseliny kaprylovej, kaseliny kaprínovej, kyseliny laurovej, kyseliny myristovej, kyseliny palmitovej, kyseliny stearovej, kyseliny arachovej a kyseliny behenovej a nenasýtené mastné kyseliny - kyseliny palmitoolejovej, kyseliny olejovej, kyseliny linolovej, kyseliny linolénovej, kyseliny ricínovej, oktadekatetraénovej kyseliny, eikozanovej, kyseliny eikozandiénovej, kyseliny arachovej, kyseliny eikozanpentaénovej alebo kyseliny erukovej.
Ďalej môžu byť tiež použité mastné-alkyldiketény, ktoré sa získajú zo zmesí mastných kyselín, pri zmydelnení prírodných tukov ako je kokosový tuk, tuk palmových jadier, repkový olej olivový olej, slnečnicový olej, vysoko olejnatý slnečnicový olej , ricínový olej alebo hovädzí tuk.
Podlá vynálezu popísané hirudín-konjugáty sú chemicky exaktne definované a vykazujú v porovnaní s hirudínom vynikajúci farmakologický profil účinnosti. Vykazujú medzi iným výrazne predĺženú biologickú účinnosť a lepšiu biovyužitelnosť. Preto umožňujú hydrofóbne hirudíny cielenie účinnej látky z povrchu krvných buniek a povrchov ciev.
Na základe týchto vlastností sú hirudín-konjugáty podlá vynálezu cenným liečivom na liečenie a profylaxiu na trombíne závislých tromboembolických príhod ako hlboké cievne trombózy, plúcne embólie, infarktov myokardu a mozgového a nestabilnej angíny, d’alej k terapii rozosiatej intravazálnej koagulácie (DIC) ako i komedikácie k trombolytikom ako je streptokináza, urokináza, prourokináza, t-PA, APSAC, aktivátory plasminogénu zo slinných žliaz zvierat ako i rekombinantné a mutované formy všetkých týchto substancií na skrátenie doby reperfúzie a predĺženie doby reoklúzie.
Ďalšou oblasťou použitia je zabránenie na trombíne závislej skoršej reoklúzii a neskoršej restenózy po PTCA, zabránenie trombínom indukovanej proliferácii buniek hladkých svalov, zabránenie akumulácii aktívnych trombínov v CNS (napr. pri Alzheimerovej chorobe a zabránenie mechanizmom, ktoré vedú k adhézii a metastázovaniu nádorových buniek.
Nové zlúčeniny môžu byť použité v bežných galenických formách pevných alebo kvapalných, napr. ako roztoky, soli, krémy alebo spreje. Tieto sa vyrobia zvyčajným spôsobom. Účinné látky pritom môžu byť spracované s bežnými galenickými pomocnými látkami ako sú plnivá, konzervačné činidlá, činidlá regulujúce tok, zosieťovacie činidlá, dispergačné činidlá, emulgátory, rozpúšťadlá a/alebo nosné plyny (porov. H.Sucker a spol: Pharmazeutische Technológie, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1978).
Hydrofóbne vlastnosti umožňujú tiež transdermálnu aplikáciu nových hirudínových derivátov najmä v spojení s činidlami, posilňujúcimi penetráciu ako je napr. dimetylsulfoxid, alkoholy alebo tiež azóny, prípadne iónoforézou.
Dávkovanie závisí na veku, stave a hmotnosti pacientov ako i spôsobe podania. Podľa aplikačnej formy a indikácie je denná účinná dávka zvyčajne v rozsahu od 20 do 40000 ATU/kg hmotnosti.
Hirudín-konjugáty môžu tiež byť úspešne použité na antitrombotické povrstvenie umelých povrchov ako napríklad hemodialyzačných membrán a k tomu patriacich hadičkových systémov alebo prístrojov srdce-pľúca.
Nasledujúce príklady slúžia k ďalšiemu popisu vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Oktyldiketén
400,1 g Ν,Ν-dimetylcyklohexylamínu sa rozpustí v 2 1 toluénu pri 50 až 60 ’C a pri tejto teplote sa prikvapká 487,5 g chloridu kyseliny oktánovej počas 2,5 h. Mieša sa ďalej pri 50 až 60 ’C dve hodiny a ochladí sa na teplotu miestnosti.
Reakčná zmes sa premyje ľadovo studenou IN kyselinou sírovou, vodou a nasýteným roztokom chloridu sodného a organická fáza sa suší nad síranom horečnatým. Surový produkt sa čistí frakčnou destiláciou. Ako hlavná frakcia sa získa 317,43 g bezfarebnej kvapaliny pri teplote hlavy 135 ’C a tlaku 0,3 mbar. Produk sa podľa GC-analýzy skladá z 97 % z oktyldiketénov. IR-^H- a 13C-NMR-spektrá sú v súlade s navrhnutou štruktúrou.
Príklad 2
Kopulácia oktyl-diketénu na hirudíne
Ako hirudín sa použije hirudínmuteín, ktorý sa od prirodzeného hirudínu HV1 odlišuje nasledujúcimi aminokyselinovými výmenami: pol.27:Lys; pol.33:Lys; pol.36:Arg; pol.47:Arg. Výroba takéhoto hirudinmuteinu je popísaná v DE 4014260.
mg hirudinmuteinu sa rozpustí v 1 ml 100 mM natriumborátového pufra pH 9,0 a zmieša s 1 ml n-propanolu a 1,5 mg oktyldiketénu a potom sa inkubuje za intenzívneho miešania pri 4 ’C.
Po 30 minútach reakcie sa nezreagovaný oktyldiketén oddelí extrakciou s n-hexánom (1 obj./obj.). Vzniknutá zmes produktov sa po 50-násobnom zriedení 0,1 % TFA/H2 nanesie na Hi-Pore RP 304 stĺpec (250 x 4,6 cm, Biorad, č. 125-0550) a vyvíja sa s nasledujúcimi gradientami:
roztok A: 0,1 % TFA/H2O roztok B: 0,1 % TFA/acetonitlil, prietoková rýchlosť: 1 ml/min detekcia: 216 nm čas podiel (min) B (%)
40.5
45.5
100
100
Komplexy hirudín-diketén eluujú za nasledujúcich podmienok:
diketén-jednotka na hirudín (oktyl-diketén-^-hirudín) 56 % diketén-jednotky na hirudín (oktyl-diketén2-hirudín) 60 % diketén-jednotky na hirudín (oktyl-diketén3-hirudín) 68 %
Špecifická aktivita derivátov z kopulačnej reakcie izolovaných derivátov činí pre oktyl-diketénj-hirudín oktyl-diketén2-hirudín oktyl-diketén3-hirudín
ATU/mg
7000
8000
4900 (stanovené trombín inhibičným testom s chromogénnym substrátom S 2238 (Kabi-Pharmacia), FEBS-Lett. (1983) 164, 307, stanovenie proteínu pomocou UV-extinkcie ÍEmola= 3148> 1/mol.cm2; lambda= , 278 nm).
Príklad 3
Hexyldiketén
272,2 g N-dimetylcyklohexylamínu sa vloží do 11 toluénu a 2 hodiny sa zbavuje vody na odlučovači vody. Nechá sa vychladnúť na 50 až 60 °C, prikvapká sa 269 g chloridu kyseliny hexánovej a dve hodiny sa potom mieša pri 55 ’C.
• Reakčná zmes sa premyje IN kyselinou sírovou, vodou a nasýteným roztokom chloridu sodného a organická fáza sa suší nad síranom horečnatým. Surový produkt sa pričistí frakčnou destiláciou. Ako hlavná frakcia sa získa 172 g bezfarebnej kvapaliny pri prechodovej teplote 95 až 100 eC a tlaku 0,15 mbar. Produkt je podlá GC-analýzy tvorený z 98 % z hexyldiketénu. IR-, 1Ha 13C-NMR-spektrá sú v súlade s predpokladanou štruktúrou.
Príklad 4
Kopulácia hexyl-diketénu na hirudín
Kopulácia hexyl-diketénu na hirudín sa uskutočňuje analogicky príkladu 2. Na reakaciu sa rozpustí 20 mg hirudínmuteínu vo 2 ml 50 % n-propanolu, 50 mM Na-uhličitanu o pH 9,5. Delenie zmesi produktu sa uskutočňuje po ukončení (pozri pr. 2) na RP 304 HPLC-stĺpca (biorad č. 125-0550) s cas (min)
30.1
35,0
35.1
Kopulačné nasledujúcimi gradientmi: rozpúšťadlo A: 5nM octan amónny pH 6,5 rozpúšťadlo B: metanol prietoková rýchlosť: 1 ml/min detekcia: 216 nm podiel B (%)
100
100 produkty hexy 1-diketén-^-hirudín, hexyl-diketén2~ hirudín a hexyl-diketén3-hirudín sa eluujú v gradientoch pri 42,5, 44 a 50 % rozpúšťadla B. Špecifická aktivita sa stanoví ako je popísané v príklade 2 a je pre hexyl-diketén3-hirudín 5700 ATU/mg.
Príklad 5
Chlorid kyseliny slnečnicového tuku
70,5 g kyseliny slnečnicového tuku z High Oleic Sunflower Oil s obsahom oleja 89 % a číslom kyslosti 219 sa rozpustí v 250 ml toluénu a ohreje sa na 40 C. Pri tejto teplote sa prikvapká 41,2 g oxalylchloridu a ďalej sa mieša dve hodiny.
Rozpúšťadlo sa odstráni pri 60 C za zníženého tlaku destiláciou. Získa sa 75 g chloridu kyseliny slnečnicového tuku ako žltého oleja s chloridovým číslom 12,0.
Príklad 6
Alkyldiketén z chloridu kyseliny slnečnicového oleja (sunnyldiketén) g chloridu kyseliny slnečnicového tuku s chlóridovým číslom 12,0 sa vloží do 400 ml toluénu a zahreje sa na 50 ’C. Pri tejto teplote sa prikvapká v priebehu 25 min 33,7 g Ν,Ν-dimetylcyklohexylamínu. Reakčná zmes sa 2 hodiny udržiava na 50 ’C a potom sa ochladí na teplotu miestnosti.
k
Pevná látka sa oddelí tlakovou filtráciou a organická fáza sa premyje IM kyselinou sírovou, nasýteným hydrogénuhličitanom sodným a nasýteným roztokom chloridu sodného. Po sušení organickej fázy nad síranom horečnatým sa rozpúšťadlo oddelí destiláciou za zníženého tlaku. Zostane 51,8 g slabo žltej olejovitej kvapaliny, ktorá podľa 1H- a 13C-NMR je zložená z 95 % z alkyldiketénu.
Príklad 7 • Výroba sunnyldiketén-hirudínu • 20 mg hirudínmuteínu (ako v príklade 2) sa rozpustí vo ml 50 % n-propanolu, 50 mM pufra uhličitanu draselného pH 9,5 zmieša s 8,5 mg sunnyldiketénu a inkubuje 60 min pri 20 ’C za intenzívneho miešania. Zvyšok diketénu sa po uplynutí reakčnej doby extrahuj e s n-hexánom (1 obj./obj.). Zmes produktov sa nanesie na RP-304 HPLC-stípec (Bio-Rad.č.125-0550; 250 x
4,6 cm) a stĺpec sa eluuje nasledujúcimi gradientmi:
rozpúšťadlo A: 5 mM octan amónny pH 6,5 rozpúšťadlo B: metanol prietoková rýchlosť: 1 ml/min detekcia: 216 nm čas (min) o podiel B (%)
30.1
35,0
35.1
100
100
Sunnyldiketén-hirudín-konjugáry sunnylj-hirudín, sunnyl2-hirudín a sunnyl3-hirudín eluujú pri 77 %, 80 % a 90 % metanolu.
Špecifické aktivity sa tanovia ako v príklade 2a sú v gradientoch pri
7700 ATU/mg pre sunnyl-j^-hirudín
7100 ATU/mg pre sunnyl2-hirudín
6100 ATU/mg pre sunnyl3-hirudín
Príklad 8
Reakcie N-hydroxysukcínimidesteru kyseliny palmitovej s hirudínom mg hirudínmuteínu (ako v príklade 2) sa rozpustí v 1 ml uhličitanu sodného pH 9,5 a zmieša s 1 ml roztoku
1,5 mg N-hydroxysukcínimidesteru kyseliny palmitovej (Sigma) v 1,4 dioxánu a pri 20 ’C za miešania sa uvedie do reakcie. Po reakčnej dobe 4 h sa reakcia ukončí pridaním 5-násobného molárneho zvyšku butylamínu (hodina pri teplote miestnosti).
Rozdelenie zmesi produktov sa uskutoční na RP-304 HPLC-stĺpci (Biorad 125-0550) v nasledujúcich gradientoch:
rozpúšťadlo A: 5 mM octan amónny pH 6,5 rozpúšťadlo B: 100 % metanol prietoková rýchlosť: 1 ml/min detekcia: 216 nm čas podiel (min) B (%)
540
3090
30.1100
35100
35.10
Kyselina palmitová^hirudín sa eluuje pri 57 %, kyselina plamitová2-hirudin pri 62 % a kyslina palmitováj-hirudín pri 76 % rozpúšťadla B.
Príklad 9
Výroba kyseliny olejovej-hirudínu g anhydridu kyseliny olejovej sa rozpustí v 4 ml dioxanu, zmieša sa 460 mg N-hydroxysukcínimidu a 2 h mieša pri teplote miestnosti. 200 μπι tohoto roztoku aktivovanej kyseliny olejovej sa potom zmieša s 20 ml n-propanolu a 20 ml roztoku hirudínu (20 mg/ml) v 0,lM Na-uhličitanu alebo boritanu o pH 9 a 4 h sa inkubuje pri teplote miestnosti. Reakcie sa po prídavku etanolamínu (2-násobný molárny zvyšok vztiahnuté na kyselinu olejovú) ukončí.
ml kopulačnej vsádzky sa zriedi 40 ml 20 mM Na-fosfátového pufra pH 7,3, zriedi 3,5M NaCI (elučné činidlo
A) a nanesie na TSK-butyl-stípec (1 cm x 28 cm, obj. 22 ml, zaťaženie 2 mg/ml gélu) a stĺpec sa premyje prietokom 2 ml/min 6 objemami stĺpca (OS) elučným činidlom A a vyvíja s nasledujúcimi gradientami (elučné činidlo B: 20 mM Na-fosforenčnan pH 7,0):
| 2,5 | OS | 70 | % | B | |
| 2,5 | OS | 80 | % | B | |
| 2,5 | OS | 90 | % | B | |
| 2,5 | OS | 100 | % | B | |
| 2,5 | OS | 30 | % | metanolu v | B |
| 2,5 | OS | 40 | % | metanolu v | B |
Hirudínové deriváty sa eluujú pri 100 % B (olejová kyselina-^-hirudín a olejová kyselina2~ hirudín) a 30 % metanolu (olejová kyselina3-hirudín). Špecifické aktivity činia 11000 U/mg u olejovej kyseliny^-hirudínu, 6200 U/mg u olejovej kyseliny2-hyridínu a 6600 U/mg u olejovej kyseliny3-hirudínu.
Príklad 10
Výroba cholesterol-hirudínu ml roztoku hirudínu (20 mg/ml v 0,lM Na-uhličitanu alebo Na-boritanu pH 9,5) sa zmieša s roztokom 3,2 mg N-hydroxysukcínimidom aktivovaným cholesterolom v 1,2 ml THF a inkubuje sa pri 4 h pri teplote miestnosti. Reakcia sa ukončí prídavkom etanolamínu (2-násobný molárny zvyšok vztiahnuté na cholesterol) a nastaví sa na pH 7,0.
ml kopulačnej vsázky sa zriedi s 8 ml roztoku octanu amónneho (2 mM, pH 6,0, elučné činidlo A) a pri prietokovej rýchlosti 2,5 ml/min sa nanesie na HiPore BioRad RP 304-stípec (10 x 250 mm) a vyvíja sa s nasledujúcimi gradientmi:
minúty % B oo
1040
6090
Cholesterol-hirudín eluuje pri 38 minútach. Špecifrická aktivita derivátov činí 16000 U/mg.
Aktivovaný cholesterol bol vyrobený nasledovne:
15,0 g 2p-cholesterolu a 5,2 g anhydridu kyseliny jantárovej sa zahrieva v 40 ml pyridínu 22 h pod refluxom a potom sa vloží do 250 ml MTBE. Organická fáza sa extrahuje 200 ml IN kyseliny chlorovodíkovej, 200 ml vody a 200 ml nasýteného roztoku chloridu sodného a rozmieša sa so síranom horečnatým a aktívnym uhlím. Filtrát sa zbaví rozpúšťadla vo vákuu. Získa sa 18,1 g kyseliny jantárovej-cholest-5-en-3p-yl-esteru.
1,94 g takto získaného esteru a 0,55 g N-hydroxysukcínimidu sa vloží do 12 ml dichlórmetánu pri 4 C a pridá sa 1,01 g Ν,Ν-dicyklohexylkarbodiimidu. Nechá sa ohriať na teplotu miestnosti a pevná látka sa odfiltruje. V organickej fáze obsiahnutý surový produkt sa chromatografuje na 80 g silikagélu (dichlórmetán + etylester kyseliny octovej 2+1). Získa sa 1,7 g N-hydroxysukcínimidom aktivivovaného cholesterolu (N-3-[cholest-5-en-3p-yloxykarbonyl)-propionyloxy]-sukcínimid).
Príklad 11
Výroba farnezyl-hirudínu
5,6 ml roztoku hirudínu (21 mg/ml v 0,lM Na-uhličitanu pH 9) sa zriedu s 5,5 ml n-propanolu a zmieša sa 32 mg farnezylalkohol-p-nitrofenylkarbonátu a inkubuje sa 12 h pri teplote miestnosti za miešania. Reakčná vsádzka sa potom zriedi so 150 ml 2M NaCl, 20 mM Na-fosforečnanu pH 7 a nanesie sa na terc.butyl-stípec (zaťaženie 2 mg proteínu/ml gélu, výška stĺpca 25 cm). Potom sa stĺpec premyje 2,2 objemami stĺpca nanášacieho pufra a potom sa vyvíja lineárnymi gradientami 2M NaCl, 20 mM Na-fosforečnanu pH 7, potom 20 mM Na-fosforečnanu pH 7 (25 objemov stĺpca). Farnezyl-hirudín sa eluuje na konci gradientov pri 20 mM Na-fosforečnanu. Špecifická aktivita bola stanovená ako v príklade 2 a činí 11300 U/mg.
Farnezylalkohol-p-nitrofenylkarbonát bol vyrobený nasledovne :
1,40 g farnezolu a 1,01 g diazo-[2.2.2]-bicyklooktánu sa rozpustí v 20 ml dichlórmetánu a v priebehu 15 minút sa prikvapká 3,63 g p-nitrofenylchlórformiátu v 10 ml dichlórmetánu. Mieša sa 1,5 h, rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu a surový produkt sa chromatografuje na 150 g silikagélu (hexán + etylester kyseliny octovej = 20 + 1). Získa sa 2,2 g farnezylalkohol-p-nitrofenylkarbonátu.
Príklad 12
Výroba kyseliny stearovej-hirudínu
0,5 g stearoylchloridu sa rozpustí v 2 ml 1,4-dioxánu a zmieša sa s 0,29 g N-hydroxysukcínimidu i 0,1 ml trietylamínu a mieša sa 3 h pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa zmieša s 1 ml vody a pH sa nastaví prídavkom hydroxidu na 5. 60 μιη sukcínimidom aktivovaného roztoku kyseliny stearovej sa zmieša s 2,5 ml roztoku hirudínu (21 mg/ml v 0,lM Na-uhličitanu pH 9) a 2,5 ml dioxánu 12 h sa za miešania inkubuje pri teplote miestnosti. Reakčná vsádzka sa potom prečistí preparatívnou RP-HPLC (pozri príklad 2). Deriváty eluujú pri 48 % B, 62 % B a 74 % B. Špecifické aktivity tvoria 9600 U/mg, 12400 U/mg, 12800 U/mg a 840 U/mg.
Príklad 13
Výroba lutensol TO3-hirudínu
0,5 ml roztoku hirudínu (21 mg/ml v 0,lM Na uhličitanu alebo Na-boritanu pH 9) sa zriedi 0,5 ml tetrahydrofuránu a zmieša sa s 1,2 mg lutensol T03-N-hydroxysukcínimidkarbonátu (príklad 12) a inkubuje 12 h pri teplote miestnosti. Reakcia sa prídavkom etanolamínu (2-násobný molárny zvyšok vztiahnuté na aktivovaný lutensol) ukončí a rozdelí chromatografiou - ako je popísané v príklade 10. Deriváty hirudín-lutensol eluujú pri % B (derivát 1 11300 U/mg, pro derivát 2 9700 U/mg a 440 U/mg pro derivát 3).
Východiskový materiál sa vyrobí nasledovne:
g fosgénu sa pri 0 ’C nakondenzuje do 100 ml toluénu a počas 10 min sa prikvapká 34,0 g lutensolu T03 (OH-číslo=165) v 50 ml toluénu. Nechá sa ohriať na teplotu miestnosti a rozpúšťadlo sa odstráni pri 35 ’C pri vákuu olejovej pumpy. Získa sa 40,3 g chlórkarbonátu lutensolu T03.
1,2 g N-hydroxysukcínimidu a 1,0 g trietylamínu sa rozpustí v 20 ml dichlórmetánu a v priebehu 5 min sa prikvapká 3,92 g chlórkarbonátu lutensolu TO3 v 10 ml dichlórmetánu. Ďalej sa 2 h mieša pri teplote miestnosti, rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu a zvyšok sa vyberie do etylacetátu. Zvyšná pevná látka sa oddelí a filtrát sa zbaví rozpúšťadla vo vákuu. Získa sa 4,3 g N-hydroxysukcínimidkarbonátu lutensolu TO3.
Príklad 14
Výroba oktyl-diketén-fenylalanín-hirudínu
0,5 ml roztoku hirudínu (21 mg/ml v 0,lM Na-uhličitanu alebo Na-boritanu pH 9) sa zriedi 0,5 ml tetrahydrofuránu a zmieša sa so 4 mg N-(2-hexyl-3-oxo-dekanoyl)-fenylalanín-N-hydroxysukcínimidesteru a 12 h inkubuje za miešania pri teplote miestnosti. Reakcia sa ukončí pridaním etanolamínu (2-násobný molárny zvyšok vztiahnuté na aktivovaný fenylalanín) a rozdelí sa pomocou RP-HPLC ako je popísané v príklade 10. Deriváty hirudín-diketén eluujú pri 43 % B (derivát 1), 48 %
B (derivát 2) a 58 % B (derivát 3). Špecifické aktivity sa stanovia ako v príklade 2 sú pre derivát 1 930 U/mg, pre derivát
2800 U/mg a 135 U/mg pre derivát 3).
Východiskový materiál sa vyrobí nasledovne:
82,5 g fenylalanínu sa predloží do 500 ml vody pri pH
13,5 a počas 1,25 h sa prikvapká 145,9 g oktyldiketénu v 50 ml dichlórmetánu. Suspenzia sa 5 h intenzívne mieša, zmieša sa s 2,5 1 vody a pH sa nastaví na 1 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Vodná fáza sa extrahuje celkom 2,5 1 dichlórmetánu, spojené organické fázy sa sušia nad síranom horečnatým a rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu. Výsledná biela pevná látka sa vyberie do 1000 ml pentánu, pevná látka sa odfiltruje a suší sa vo vákuu pri 60 C. Získa sa 190 g N-(2-hexyl-3-oxo-dekanoyl)-fenylalanínu.
N-(2-Hexyl-3-oxo-dekanoyl)-fenylalanín a 0,55 g N-hydroxysukcíimidu sa predloží do 10 ml dichlórmetánu a pri 4 C sa pridá 1,01 g Ν,Ν-dicyklohexylkarbodiimidu. Nechá sa ohriať na teplotu miestnosti, vytvorená pevná látka sa oddelí a vo fáze získaný surový produkt sa chromátografuje na 80 g silikagélu (dichlórhexán + hexán = 3+1, 1 % íadová kyselina octová). Získa sa 2,0 g N-(2-hexyl-3-oxo-dekanoyl)-fenylalanín-N-hydroxysukcínimidesteru.
Príklad 15
Výroba oktylketén-kaprónová kyselina-hirudínu
1,0 ml roztoku hirudínu (21 mg/ml v 0,lM Na-uhličitanu alebo Na-boritanu pH 9) sa zriedi 1,0 ml tetrahydrofuránu a zmieša sa so 7 mg N-(6-(2-hexyl-3-oxo-dekanoylamino)-hexanoyloxy)sukcínimidu a 12 h sa za miešania inkubuje pri teplote miestnosti. Reakcia sa ukončí pridaním etanolamínu (2-násobný molárny zvyšok vztiahnuté na aktivovaný diketén) a rozdelí sa pomocou RP-chromatograf ie - ako je popísané v príklade 10. Hirudín-diketén deriváty eluujú pri 48 % B (derivát 1), 52 %
B (derivát 2) a 63 % B (derivát 3). Špecifické aktivity boli stanovené ako v príklade 2 a činia pre derivát 1 7500 U/mg, pre derivát 2 3400 U/mg a 80 U/mg pre derivát 3).
Východiskový materiál sa vyrobí nasledovne:
6,55 g kyseliny 6-aminokaprónovej sa rospustí pri pH 9 v 100 ml vody a v priebehu 20 min sa prikvapká 14,24 g oktyldiketénu. Mieša sa cez noc, pH sa upraví koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na 1 a vodná fáza sa extrahuje 100 ml MTBE. Organická fáza sa suší nad síranom horečnatým, rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu a surový produkt sa prevedie do 150 ml pentánu. Výsledná pevná látka sa odfiltruje a suší sa vo vákuu pri teplote 60 -C. Získa sa 5,9 g 6-(2-hexyl-3-oxo-dekanoylamino)-hexánovej kyseliny.
1,53 g takto získaného produktu a 0,55 g N-hydroxy-sukcínimidu sa predloží pri 4 'C do 10 ml dichlórmetánu a mieša sa s 1,01 g Ν,Ν-dicyklohexylkarbodiimidu. Nechá sa ohriať na teplotu miestnosti a prvná látka sa odfiltruje. Surový produkt obsiahnutý v organickej fáze sa chromátografuje cez 80 g silikagélu (etylacetát + hexán = 3+5; 1 % ľadová kyselina octová). Získa sa 1,7 g N-[6-(2-hexyl-3-oxo-dekanoylamino)-sukcínimidu.
Príklad 16
Kinetika anti-faktor Ha aktivity vo vzorkách plazmy psov a krýs
Metóda:
Hirudín-konjugáty alebo placebo sa intravenózne aplikujú narkotizovaným krysám alebo bdiacim psom. V definovanom čase sa zvieratám odoberú vzorky venóznej krvi na získanie citrátovej plazmy. Voľná anti-faktor Ha aktivita hirudín-konjugátov v plazme sa stanoví pomocou chromogénnej eseje pomocou štandardnej krivky s rekombinantným hirudínom.
Princíp testu:
trombín chromogénny substrát ---------> peptid + p-nitroanilín (S-2238) (žltá)
Do mikroplatní sa odpipetuje ku vždy 100 μηι tris-pufra (Tris 200 mmol/1, NaCl 25 mmol/1, pH 8,1) vždy 10 μΐ vzorky plazmy a 100 μιη tromvínu (0,3 NIH-jednotky/ml). Po 1 min sa reakcia naštartuje pridaním 50 μΐ substrátového roztoku (S-2238, 1,34 mmol/1. Vsádzka sa po krátkom premiešaní inkubuje pri 25 ’C a reakcia sa prídavkom 100 μΐ 30 % kyseliny octovej ukončí. Extinkcia vzorky, meranej pri 405 nm oproti 630 nm, je nepriamo úmerná anti-faktor Ha aktivite v plazmovej vzorke. V plazmových vzorkách sa čiastočne tiež meria parameter zrážania, trombínový čas (TT) a parciálny trmoboplastínový čas (APTT).
Výsledky:
Pri približne rovnakej špecifickej aktivite je po i.v. aplikácii 1 mg/kg lipofilného hirudín-derivátu narkotizovaným krysám oproti r-hirudínu zaznamenaný významne spomalený návrat voľnej anti-faktor II aktivity (obr.l). U psov sa po i.v. aplikácii 5000 antitrombín-jednotiek/kg (ATU/kg) oktyldiketén3-hirudínu nameria tiež proti r-hirudínu významne zvýšená účinná hladina so spomalenou elimináciou (obr.2.). Veľmi pomalý pokles voľnej anti-faktor Ha aktivity je tiež pozorovaný u i.v. aplikácie 1 mg/kg farnezyl-hirudínu (obr.3).
Príklad 17
Trombínom vyvolaná agregácia premytých trombocytov z krvi človeka a krýs ex vivo a in vitro po predchádzajúcej inkubácii trombocytov s lipofilnými hirudín-derivátmi
Metóda:
Čerstvá citrátová krv (9 dielov krvi + 1 diel citrátu sodného 0,11 mol/1, krysy: 8,5+1,5) sa odstred’uje na získanie plazmy bohatej na doštičky (PRP, supernatant) 16 min pri 250 x g. Z PRP sa metódou podľa Patscheke-a a spol. (Haemostasis 10, 14-27, 1981) získa koncentrát premytých trombocytov. Pritom sa trombocyty najskôr z PRP 7-minútovým odstreďovaním pri 330 x g odsedimentujú. Ak sa uskutočňuje takéto spracovanie s hirudín-derivátmi, na tomto mieste po prídavku 200 ml derivátu v premývacom roztoku (120 mmol/1 NaCI, 5 mmol/1 KC1, 2 mmol/1 CaCl2, 1 mmol/1 MgCl2, 5 mmol/1 glukózy, 2 g/1 albumínu, 50 mg/1 apyrázy v 30 mmol/1 fosforečnanu sodného, pH 6,5) na konečnú koncentráciu derivátu 0,215 mg/1 rozvíri peleta a 10 min sa pri teplote miestnosti inkubuje. Nasledujú dva stupne premývania v tomto premývacom roztoku a potom konečná resuspenzia trombocytov v testovom médiu sa 120 mmol/1 NaCI, 5 mmol/1 KC1, 1 mmol/1 CaCl2, 0,1 mmol/1 MgCl2, 5 mmol/1 glukózy, 0,5 g/1 albumínu, 50 mg/1 apyrázy, 1 mmol/1 fosforečnanu sodného, TES/NaOH, pH 7,4. Počet trombocytov sa nastaví na 2 x 105/μ1 (krysy 8 x 106/μιη). Na stanovenie agregácie trombocytov sa 218 μΐ trombocytového koncentrátu 3 min pri 37 C inkubuje v agregometri (PAP-4 Bio Data Corporation), 1 min sa mieša pri 1000 RPM a ešte 1 min inkubuje. Potom sa agregácia naštartuje pridaním 2 μπι roztoku trombínu. Agregácia trombocytov sa uskutočňuje cez zmenu meranej transmisie vo vzorke za časovú jednotku (Slope-metóda). Ako meradlo relatívnej účinnosti a afinity hirudín-derivátu sa stanoví EC50 trombínová koncentrácia v NIH-jednotkách/ml, s ktorou sa dosiahne polovica maximálneho vzrastu trombocytovej agregácie. Z tejto EC50 a EC50 vzorky inkubovanej bez hirudínu sa vypočíta neutralizačný index (NI) s NI= EC50 derivát/EC50 kontrola. Táto hodnota je špecifická pre derivát a poskytuje faktor, o ktorý musí byť koncentrácia trombínu ako agonistu zvýšená, aby bola dosiahnutá rovnaká agregácia (polovina maximálneho vzrastu) ako pri kontrole.
Výsledky:
Po predchádzajúcej inkubácii trombocytov rozdielnych druhov sa 21,5 μιη/ml lipofilných hirudín-derivátov sa musí čiastočne použiť mnohonásobok v kontrole použitej koncentrácie trombínu, aby sa opäť dosiahla agregácia (obr.4). Toto potlačenie sa uskutoční imunologický preukázateľným nalepením lipofilných hirudín-derivátov na trombocyty. Neutralizačné indexy dosahujú hodnoty až 25 u ľudských trombocytov (tabuľka 1). u krýs bol 24 h po aplikácii 10 mg/kg cholesterol-hirudínu ešte stanovený NI 5,4 na premytých trombocytoch ex vivo (pozri príklad 20 tabuľka 2).
Tabuľka 1
Neutralizačné indexy (NI) pre zvolené zlúčeniny na ľudských trombocytoch
SubstanciaNI kontrola (ošetrené placebom)1 r-hirudín1,21 stearoyl-hirudín5,42 palmitoyl-hirudín4,71 cholesteryl-hirudín21,2 lutensol T03-hirudín15,1 farnezyl-hirudín24,3
Príklad 18
Antitrombocytová účinnosť na arteriovenóznej odbočke na krysách
Metóda:
V tomto experimente slúži sklenená kapilára v arteriovenóznej odbočke ako umelý trombogénny povrch a vyvoláva dojem trombózy. Narkotizované krysy (uretán 25 %, 2 x 8 mg/kg i.p.) sa v polohe na chrbte fixujú na temperovanú (37 eC) vyhrievanú lavicu. Do voľne vypreparovanej pravej A. carotis a V. jugularis sa implantujú krátke polyetylénové katétre (Portex, PE 50), naplnia sa fyziologickým NaCl-roztokom a uzatvoria svorkami. Voľné konce katétrov sa spoja 20,0 mm dlhou sklenenou kapilárou (vnútorný priemer 1,0 mm), ktorá pôsobí ako trombogénny povrch. Aplikácia skúšanej substancie môže byť uskutočnená
i.v., s.c., p.o. alebo infúziou. Po požadovanom čase inkubácie (5, 60 alebo 360 min) s testovanou zlúčeninou alebo rozpúšťadlom (kontrola) sa odbočka otvorí odstránením svoriek. Krvný prúd sa vedie odbočkou pre rýchly vzostup odbočkovej teploty, ktorá sa meria v strede sklenenej kapiláry. Zvýšenie z teploty okolia na telesnú teplotu je indikátorom pre priechodnosť odbočky. Teplota sa až do uzatvorenia odbočky zaznamenáva kontinuálne každých 30 minút. Na porovnanie účinnosti rôznych hirudín-derivátov ich vypočíta ED15min ako dávka, ktorá vztiahnuté na kontrolnú skupinu vedie k predĺženiu času uzatvorenia o 15 minút. Pri otvorení odbočky a na konci pokusu sa odoberú ďalšie krvné vzorky na stanovenie anti-FIIa-aktivity v plazme.
Výsledky:
Oktyldiketén3-hirudín a oktyldiketén3-hirudín vykazujú na základe ich dlhšieho času pôsobenia antitrombitickú účinnosť už v nižších dávkach a po dlhší čas v porovnaní s r-hirudínom (obr.5).
Príklad 19
Antitrombotické pôsobenie na prúdom vyvolanú trombózu u krýs
Metóda:
V tomto pokuse sa krátkym tokom prúdu dvomi na A.carotis vloženými elektródami vyvolá poškodenie endotelu a tým trombotický uzáver ciev. Narkotizované (uretán 25 % 2x8 mg/kg
i.p.) krysy sa fixujú v polohe na chrbte na temperovanú (37 *C) vyhrievanú lavicu. 20 mm dlhý segment pravej A. carotis sa vypreparuje a ultrazvuková transit-time fluxmetrová hlavica sa umiesti na proximálny záchyt segmentu. Objemový tok sa sníma počas doby sledovania 30 min pomocou ultrazvukového fluxmetrového prístroja (T206, Transonic Systems Inc., USA). Tvorba trombu sa vyvolá konštantným tokom prúdu (3 mA, 1 min) hákovíte tvarovaným párom elektród, ktorý sa vnesie 1 cm distálne od fluxmetrovej hlavice na povrch cievy. Cievna oklúzia sa definuje ako zníženie objemového toku na < 0,3 ml/min po viac ako tri minúty. Antitrombotická účinnosť hirudín-derivátov sa kvantifikuje ako početnosť trombózy počas 30 minút v skupine 10 zvierat. Na porovnanie účinnosti rôznych hirudín-derivátov sa vypočíta ED50 ako dávka, ktorá vztiahnuté na kontrolnú skupinu redukuje početnosť trombózy o 50 %. Pred vložením napätí a na konci pokusu sa naviac odoberú ďalšie krvné vzorky na stanovenie anti-Flla-aktivity v plazme.
Výsledky:
Pre palmitoyl3-hirudín bola stanovená ED50 0,24 mg/kg, merané 5 minút po intravenóznej aplikácii. Zodpovedajúcej ED50 pre r-hirudín činí 0,47 mg/kg. Tiež 24 h po intravenóznej aplikácii cholesterol-hirudínu mohlo byť na krysách na základe dlhého času účinnosti preukázané ešte potlačenie agregácie premytých trombocytov ex vivo a dobrá antitrombotická účinnosť (tabuľka 2).
Tabuľka 2
Antitrombotický účinok a potlačenie agregácie trombocytov
| cholesterol-hirudínom 24 h po i.v. aplikácii (n=9-10) | |||||
| Ošetre- | trombo- | neutra- | plazmová | TT | APTT |
| nie | zová | lizačný | anti-FIIa | (S) | (s) |
| počet- | index | aktivita | |||
| nosť % | v premytých trombocytoch | (ATU/ml) | |||
| in vitro | - | 18,3±6,1 | - | - | - |
| placebo | 100 | 1 | 0 | 41±1 | 29±4 |
| 1,0 mg/kg | 50 | 1,5+0,02 | 5,7+0,6 | 267,7±15 | 30±3 |
| 10 mg/kg | 11 | 5,39±0,74 | 61,0±3,8 | > 300 | 52±4 |
t
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Hirudín-konjugát vytvorený z hirudínu a jednej alebo viac lipofilných zlúčenín, kde lipofilná zlúčenina vykazuje rozdeľovacie koeficienty oktanol-voda väčšie ako 1,8 a chemicky je kovalentne naviazaná na hirudín.
- 2. Hirudín-konjugát podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že naviazanie lipofilnej zlúčeniny je uskutočnené v oblasti aminokyselín 27 až 37.
- 3. Hirudín-konjugát podľa nároku la 2, vyznačujúci sa tým, že naviazanie hirudínu a lipofilných zlúčenín je uskutočnené cez aminopostranné reťazce lyžínových zvyškov hirudínu.
- 4. Hirudín-konjugát podľa nároku 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že s hirudínom sú naviazané 1 až 3 lipofilné zlúčeniny.
- 5. Hirudín-konjugát podľa nároku 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že najmenej jedna lipofilná zlúčenina je naviazaná s aminokyselinou 27 alebo 33.
- 6. Hirudín-konjugát podľa nároku 1 až 5 na použitie pri potieraní chorôb.
- 7. Spôsob výroby hirudín-konjugátov, vyznačujúci sa tým, že sa hirudín nechá reagovať s jedným alebo viac molárnymi ekvivalentami lipofilnej zlúčeniny, prípadne po chemickej aktivácii lipofilnej zlúčeniny.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4341115 | 1993-12-02 | ||
| PCT/EP1994/003901 WO1995015183A1 (de) | 1993-12-02 | 1994-11-25 | Hirudin-konjugate aus hirudin und lipophilen verbindungen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK67596A3 true SK67596A3 (en) | 1996-12-04 |
Family
ID=6504029
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK675-96A SK67596A3 (en) | 1993-12-02 | 1994-11-25 | Hirudin conjugates from hirudine and lipophilic compounds |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5919762A (sk) |
| EP (1) | EP0730473B1 (sk) |
| JP (1) | JPH09505810A (sk) |
| CN (1) | CN1142776A (sk) |
| AT (1) | ATE204763T1 (sk) |
| AU (1) | AU679811B2 (sk) |
| BR (1) | BR9408195A (sk) |
| CA (1) | CA2176967A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ157096A3 (sk) |
| DE (2) | DE4437502A1 (sk) |
| DK (1) | DK0730473T3 (sk) |
| ES (1) | ES2163487T3 (sk) |
| FI (1) | FI962299A0 (sk) |
| GR (1) | GR3036938T3 (sk) |
| HR (1) | HRP940968A2 (sk) |
| HU (1) | HUT74390A (sk) |
| IL (1) | IL111811A0 (sk) |
| NO (1) | NO962261L (sk) |
| NZ (1) | NZ276410A (sk) |
| PL (1) | PL314797A1 (sk) |
| PT (1) | PT730473E (sk) |
| SG (1) | SG49156A1 (sk) |
| SK (1) | SK67596A3 (sk) |
| WO (1) | WO1995015183A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA949562B (sk) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4437604A1 (de) * | 1994-10-21 | 1996-04-25 | Basf Ag | Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung |
| US5726168A (en) * | 1995-10-12 | 1998-03-10 | Eli Lilly And Company | Lipophilic benzothiophenes |
| DE19915862A1 (de) * | 1999-04-08 | 2000-10-12 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung von molekulargewichtserweitertem Hirudin als Antikoagulans bei der extrakorporalen Nierenersatztherapie |
| JP4394444B2 (ja) * | 2001-10-24 | 2010-01-06 | パワー ペーパー リミティド | 活性物質の制御された皮膚内デリバリーのためのデバイス及び方法 |
| US7438925B2 (en) * | 2002-08-26 | 2008-10-21 | Biovention Holdings Ltd. | Drug eluting coatings for medical implants |
| BR102017005783A2 (pt) * | 2017-03-21 | 2018-10-02 | Fund Butantan | processo de obtenção de esculptina e seus fragmentos, esculptina recombinante e seus usos |
| KR102366360B1 (ko) * | 2021-06-29 | 2022-02-23 | (주)네오팜 | 신규한 유사 세라마이드 화합물 및 이를 포함하는 피부 외용제 조성물 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0077529B1 (de) * | 1981-10-16 | 1985-07-17 | Sanol Schwarz GmbH | Arzneimittelformulierung |
| DE3445532A1 (de) * | 1984-12-13 | 1986-06-19 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Hirudin-pa, desulfatohirudine-pa, verfahren zur herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
| US4939174A (en) * | 1988-02-26 | 1990-07-03 | Shashoua Victor E | Appetite suppression with dopamine-fatty acid conjugates |
| DE3819079A1 (de) * | 1988-06-04 | 1989-12-07 | Hoechst Ag | Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung |
| DE69008521T2 (de) * | 1989-03-07 | 1994-10-20 | Genentech Inc | Kovalente konjugate von lipiden und oligonukleotiden. |
| JP3187044B2 (ja) * | 1989-12-01 | 2001-07-11 | ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト | ヒルジン突然変異蛋白質及びヒルジンポリアルキレングリコール複合体 |
| DE4014260A1 (de) * | 1989-12-01 | 1991-06-06 | Basf Ag | Hirudinpolyalkylenglykolkonjugate |
| EP0506748B1 (en) * | 1989-12-22 | 1995-12-13 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Amino acids, peptides or derivatives thereof coupled to fats |
| AU7759291A (en) * | 1990-03-29 | 1991-10-21 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide-transport agent disulfide conjugates |
| US5256641A (en) * | 1990-11-01 | 1993-10-26 | State Of Oregon | Covalent polar lipid-peptide conjugates for immunological targeting |
| WO1992019233A2 (en) * | 1991-04-29 | 1992-11-12 | Control Delivery Systems, Inc. | Sustained release composition and methods of use thereof |
| AU1664892A (en) * | 1991-05-02 | 1992-12-21 | Pierre Baudet | N-phenyl-cinnamamides providing protection from the harmful effects of ultraviolet light |
| US5359030A (en) * | 1993-05-10 | 1994-10-25 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
-
1994
- 1994-10-20 DE DE4437502A patent/DE4437502A1/de not_active Withdrawn
- 1994-11-25 DE DE59409847T patent/DE59409847D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-25 JP JP7515283A patent/JPH09505810A/ja not_active Ceased
- 1994-11-25 EP EP95901432A patent/EP0730473B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-25 SG SG1996006978A patent/SG49156A1/en unknown
- 1994-11-25 ES ES95901432T patent/ES2163487T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-25 NZ NZ276410A patent/NZ276410A/en unknown
- 1994-11-25 DK DK95901432T patent/DK0730473T3/da active
- 1994-11-25 WO PCT/EP1994/003901 patent/WO1995015183A1/de active IP Right Grant
- 1994-11-25 CN CN94194897A patent/CN1142776A/zh active Pending
- 1994-11-25 US US08/652,511 patent/US5919762A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-25 BR BR9408195A patent/BR9408195A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-11-25 PL PL94314797A patent/PL314797A1/xx unknown
- 1994-11-25 CA CA002176967A patent/CA2176967A1/en not_active Abandoned
- 1994-11-25 AT AT95901432T patent/ATE204763T1/de active
- 1994-11-25 PT PT95901432T patent/PT730473E/pt unknown
- 1994-11-25 HU HU9601471A patent/HUT74390A/hu unknown
- 1994-11-25 CZ CZ961570A patent/CZ157096A3/cs unknown
- 1994-11-25 SK SK675-96A patent/SK67596A3/sk unknown
- 1994-11-25 AU AU10670/95A patent/AU679811B2/en not_active Ceased
- 1994-11-29 IL IL11181194A patent/IL111811A0/xx unknown
- 1994-12-01 HR HRP4341115.0A patent/HRP940968A2/hr not_active Application Discontinuation
- 1994-12-01 ZA ZA949562A patent/ZA949562B/xx unknown
-
1996
- 1996-05-31 FI FI962299A patent/FI962299A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1996-05-31 NO NO962261A patent/NO962261L/no unknown
-
2001
- 2001-10-18 GR GR20010401806T patent/GR3036938T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1067095A (en) | 1995-06-19 |
| WO1995015183A1 (de) | 1995-06-08 |
| EP0730473B1 (de) | 2001-08-29 |
| FI962299A (fi) | 1996-05-31 |
| US5919762A (en) | 1999-07-06 |
| EP0730473A1 (de) | 1996-09-11 |
| ES2163487T3 (es) | 2002-02-01 |
| BR9408195A (pt) | 1997-08-26 |
| SG49156A1 (en) | 1998-05-18 |
| DK0730473T3 (da) | 2001-10-08 |
| NZ276410A (en) | 1997-03-24 |
| NO962261D0 (no) | 1996-05-31 |
| DE59409847D1 (de) | 2001-10-04 |
| FI962299A0 (fi) | 1996-05-31 |
| HRP940968A2 (en) | 1997-08-31 |
| HU9601471D0 (en) | 1996-07-29 |
| CA2176967A1 (en) | 1995-06-08 |
| CZ157096A3 (en) | 1996-09-11 |
| JPH09505810A (ja) | 1997-06-10 |
| CN1142776A (zh) | 1997-02-12 |
| HUT74390A (en) | 1996-12-30 |
| AU679811B2 (en) | 1997-07-10 |
| NO962261L (no) | 1996-05-31 |
| PL314797A1 (en) | 1996-09-30 |
| IL111811A0 (en) | 1995-01-24 |
| GR3036938T3 (en) | 2002-01-31 |
| PT730473E (pt) | 2002-02-28 |
| ATE204763T1 (de) | 2001-09-15 |
| DE4437502A1 (de) | 1995-06-08 |
| ZA949562B (en) | 1996-06-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3466614B2 (ja) | 血栓症のインヒビター | |
| US5990083A (en) | Multicatalytic protease inhibitors | |
| KR100438244B1 (ko) | 사이클릭결합저해제 | |
| EP3405477B1 (en) | Inhibitors of transglutaminases | |
| EP0298820A1 (fr) | Nouveaux dérivés peptidiques et leur application notamment en thérapeutique | |
| US5362491A (en) | Modified biologically active protein composition | |
| US5550262A (en) | Multicatalytic protease inhibitors | |
| SK67596A3 (en) | Hirudin conjugates from hirudine and lipophilic compounds | |
| US6403554B2 (en) | Polyunsaturated fatty acid derivatives and their use | |
| JPH06500073A (ja) | ヒルジンのアミノ酸配列に基づくトロンビン阻害剤 | |
| EP0496013A1 (en) | Synthetic peptide derived from human lipocortin V and use thereof | |
| WO1989005796A1 (en) | Mercapto-acylamino acid antihypertensives | |
| JP2008531482A (ja) | Ｃ末端がｐｅｇ化された成長ホルモン | |
| CA2335079C (en) | Composition for the treatement of immune deficiencies and methods for its preparation and use | |
| EP1414794A1 (en) | Allylmercaptocaptopril compounds and uses thereof | |
| AU765465B2 (en) | Polyunsaturated fatty acid derivatives and their use | |
| AU2002305744A1 (en) | Allylmercaptocaptopril compounds and uses thereof | |
| WO2005085283A1 (ja) | 修飾インターロイキン−１１及びそれを含有する医薬組成物 | |
| JP2002338469A (ja) | Ｖｄａｃ機能阻害剤 | |
| JPH06228192A (ja) | 持続性エンドセリン拮抗剤 | |
| FR2617169A1 (fr) | Nouveaux derives peptidiques et leur application notamment en therapeutique |