DE4014260A1 - Hirudinpolyalkylenglykolkonjugate - Google Patents

Hirudinpolyalkylenglykolkonjugate

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DE4014260A1
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hirudin
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desulfatohirudin
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Manfred Dr Kurfuerst
Klaus Dr Ruebsamen
Bernhard Dr Schmied
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

Die Erfindung betrifft neue Hirudinpolyalkylenglykolkonjugate, deren Herstellung und Verwendung zur Bekämpfung von Krankheiten.
Hirudin ist ein Naturstoff mit blutgerinnungshemmenden Eigenschaften (Naturwissenschaften 42, 537 (1955), Hoppe-Seylers Z. Biol. Chem. 366, 379 (1985)). Das natürlich vorkommende Hirudin ist an der Aminosäure Tyrosin in Position 63 sulfatiert, was für das rekombinant hergestellte Hirudin nicht gilt. Hirudin wird relativ rasch (t1/2∼50 min) aus dem Blut eliminiert (Thromb. Haemost. 47, 226 (1982), Pharmazie 43, 202 (1988)). Die Halbwertszeit des Hirudins läßt sich durch Bindung an Dextran auf über 7 Stunden verlängern (Parmazie 44, 72 (1989).
Es ist weiter bekannt, daß sich die Halbwertszeiten im Blut von einer Reihe von Proteinen durch Bindung an Polyethylenglykol verlängern lassen (Polymer Reprints 20, 357 (1979); Enzyms as Drugs 1981, Seiten 367-383; US 41 79 337).
Es wurde gefunden, daß Konjugate der Formel I aus Polyalkylenglykol oder Polyalkylenglykolderivaten mit Hirudin, Desulfatohirudin oder blutgerinnungshemmenden Hirudin-Muteinen
[A-(CH₂)n-[O-(CH₂)n]m-B-pHir I,
worin
A einen der Reste -OH, -NH₂, -NH-CO-CH₃, -COOH, -COOR oder -OR (mit R in der Bedeutung einer C1-4-Alkylgruppe),
n die Zahl 2, 3, 4 oder 5
m eine Zahl von 100 bis 1000
B eine direkte Bindung, eine reaktive Gruppe oder einen Linker,
p die Zahl 1, 2, 3 oder 4 und
Hir einen über die Serin-, Threonin- oder Lysin-Seitenkette(n) an den (die) A-(CH₂)n-[O-(CH₂)n]m-B-Rest(e) gebundenen Hirudin-, Desulfatohirudin- oder Hirudin-Mutein-Rest
bedeuten, bessere Eigenschaften besitzen.
Hirudin-, Desulfatohirudin- oder Hirudin-Mutein-Reste sind vorzugsweise über die Lysin-Seitenketten an die A-(CH₂)n-[O-(CH₂)n]m-B- Reste gekoppelt. Besonders bevorzugt sind solche Verbindungen, die nur einen Lysinrest durch einen A-(CH₂)n-[O-(CH₂)n]m-B-Rest derivatisiert haben.
Der Ausdruck Hirudin bedeutet natürliches oder rekombinentes Hirudin, ein Polypeptid bestehend aus 65 Aminosäuren mit der von Dodt (Hirudine, die Thrombininhibitoren des Blutegels Hirudo medicinals. Dissertation, Ludwig-Maximilian-Universität, München 1984) publizierten Sequenz oder eines der natürlichen oder rekombinanten Isohirudine (Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 803 (1986); Folia Haematol. 115, 30 (1988)). Hirudin-Muteine sind die daraus durch Deletion, Addition oder Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren des Hirudins erhaltenen Polypeptide mit Hirudin-Wirkung.
Hirudin-Fusionsproteine bestehen aus mindestens 2 Proteinen, die als ein Genprodukt exprimiert werden. Mindestens bei einem der Proteinbestandteile des Fusionsproteins handelt es sich um Hirudin, Desulfatohirudin oder ein Hirudin-Mutein. Bevorzugt sind lysinarme Fusionsproteine, besonders bevorzugt sind Fusionsproteine, die ein Hirudin-Mutein mit nur einem Lysin-Rest enthalten.
Als Linker vom Typ a sind für B vorzugsweise die Gruppen -O-(CH₂)n1-CH= und -O-(CH₂)n-1-CO- zu nennen. Als Linker vom Typ b kommen für B insbesondere folgende Gruppen in Betracht:
(mit X in der Bedeutung von -S-, -O-, -NH-, -(N(CH₃)- oder -N(C₂H₅)- und Z in der Bedeutung einer C2-6-Alkylengruppe oder einer p-Phenylengruppe).
Die neuen Konjugate lassen sich herstellen, indem man
a) - falls B für eine direkte Bindung oder einen Linker vom Typ a steht -
eine Verbindung der Formel II
A-(CH₂)n-[O-(CH₂)n]m-E II,
worin
A, m und n die angegebene Bedeutung besitzen und
E einen der Reste -Cl, -Br, -J, -O-(CH₂)n-1-CHO oder -O-(CH₂)n-1-CO-Y (mit Y in der Bedeutung einer Abgangsgruppe) darstellt, direkt oder
- falls B für einen Linker vom Typ b steht -
eine Verbindung der Formel III
A-(CH₂)n-[O-(CH₂)n]m-T III,
worin A, m und n die angegebenen Bedeutungen besitzen und T für einen der Reste -SH, -OH, -NH₂, -NHCH₃ oder -NHC₂H₅ steht, nach Umsetzen mit einer Linker-Verbindung der Formel
mit Hirudin, Desulfatohirudin, einem Hirudin-Mutein in freier Form oder als Fusionsprotein reagieren läßt.
Die Umsetzung von II mit Hirudin, Desulfatohirudin, einem Hirudin-Mutein oder Fusionsprotein geschieht wie folgt:
Die Verbindung der Formel II wird in stöchiometrischen Mengen oder mit einem Überschuß in einem geeigneten Puffer (pH 7-10), in Wasser, ggf. unter Zusatz einer Hilfsbase wie Natrium- oder Kalium-carbonat oder -hydrogencarbonat, Alkalihydroxid, Triethylamin, N-Methylmorpholin, Diisopropylamin oder Pyridin in einem organischen Lösungsmittel (Methanol, Ethanol, Isopropanol, Acetonitril, Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon, Dichlormethan, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan, Toluol) oder in Gemischen der genannten Lösungsmittel bei Temperaturen zwischen -20°C und +100°C, bevorzugt bei Temperaturen zwischen 0°C und +60°C, mit Hirudin, Desulfatohirudin, einem Hirudin-Mutein oder einem Fusionsprotein zur Reaktion gebracht. Die entstandenen Konjugate werden isoliert und mit den in der Proteinchemie üblichen Methoden gereinigt und charakterisiert. Bei Fusionsproteinen wird der hirudinfremde Fusionspartner anschließend abgespalten und das so erhaltene konjugierte Hirudin, Desulfatohirudin oder Hirudin-Mutein erneut gereinigt und charakterisiert.
Zur Umsetzung der Polyalkylenglykolcarbonsäure A-(CH₂)n-[O-(CH₂)n]m-O-)(CH₂)n-1-COOH mit der (den) Lysin-Seitenkette(n) des Hirudins, Desulfatohirudin, eines Hirudin-Muteins oder Fusionsproteins kann eine der in der Peptidchemie üblichen Methoden zur Knüpfung einer Amidbindung herangezogen werden, wobei die aktivierte Polyalkylenglykolcarbonsäure A-(CH₂)n-[O-(CH₂)n]m-O-(CH₂)n-1-CO-Y isoliert oder in situ erzeugt werden kann.
Chemische Methoden zur Amidbindungsbildung sind ausführlich behandelt bei Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/2, pp 1-364, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp 31-34, 71-82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszy, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, pp 85-128, John Wiley & Sons, New York, 1976 und anderen Standardwerken der Peptidchemie. Besonders bevorzugt sind die Azidmethode, die symmetrische und gemischte Anhydridmethode, in situ erzeugte oder präformierte Aktivester und die Amidbindungsbildung mit Hilfe von Kupplungsreagenzien (Aktivatoren), insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid (DDC), Diisopropylcardodiimid (DIC), 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (EDCI), n-Propanphosphonsäureanhydrid (PPA), N,N-Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)amidophosphorsäurechlorid (BOP-Cl), Diphenylphosphorylazid (DPPA), Castro′s Reagenz (BOP), O-Benzotriazolyl-N,N,N′,N′-tetramethyluronium-Salze (HBTU), 2,5-Diphenyl-2,3-dihydro-3-oxo-4-hydroxythiophendioxid (Steglichs Reagenz; HOTDO) und 1,1′-Carbonyl-diimidazol (CDI). Die Kupplungsreagenzien können allein oder in Kombination mit Additiven wie N,N′-Dimethyl-4-aminopyridin (DMAP), N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxybenzotriazin (HOOBt), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) oder 2-Hydroxypyridin eingesetzt werden.
Die Umsetzung von III mit Hirudin, Desulfatohirudin, einem Hirudinmutein oder Fusionsprotein unter Zwischenschaltung eines Linkers wird folgendermaßen durchgeführt:
Die Verbindung der Formel III wird mit der stöchiometrischen Menge oder mit einem Überschuß der Linker-Verbindung umgesetzt, ggf. unter Zusatz einer Base wie z. B. Natrium- oder Kalium-carbonat oder -hydrocarbonat, Alkalihydroxid, Triethylamin, N-Methylmorpholin, Diisopropylethylamin oder Pyridin bei Temperaturen zwischen -20°C und +160°C, bevorzugt aber bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt Wasser, Methanol, Ethanol, Isoproanol, Acetonitril, Dichlormethan, Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan, Toluol oder in Gemischen dieser Lösungsmittel, und das Reaktionsprodukt in Wasser oder einem geeigneten Puffer (z. B. 0,1 M Borax pH 9, 4, 0,1 M Phosphat pH 8 oder 0,1 Tris pH 8) ggf. unter Zusatz eines der obengenannten organischen Lösungsmittel in stöchimetrischen Mengen oder mit 0,1 bis 10 Äquivalenten Überschuß an Hirudin, Desulfatohirudin, einem Hirudin-Mutein oder Fusionsprotein zur Reaktion gebracht. Die entstandenen Konjugate werden isoliert und mit den in der Proteinchemie üblichen Methoden gereinigt und charakterisiert. Bei Fusionsproteinen wird das durch eine Verbindung der Formel III konjugierte Hirudin, Desulfatohirudin oder Hirudin-Mutein erst nach Abspaltung des Fusionspartners und erneuter Reinigung gewonnen. Das Reaktionsprodukt aus der Verbindung der Formel III und Chlor-, Brom-, Jodessigsäure, Bernsteinsäureanhydrid oder einer der beiden Nitroverbindungen muß vor der Umsetzung mit Hirudin, Desulfatohirudin, einem Hirudin-Mutein oder Fusionsprotein erneut aktiviert werden, was bei den Carbonsäuren in Analogie zu den weiter oben beschriebenen Polyalkylenglykolcarbonsäuren geschehen kann und bei den Nitroverbindungen durch Reaktion zum Amin und Diazotierung erfolgt.
Die neuen Verbindungen besitzen eine verlängerte Halbwertszeit bei hoher blutgerinnungshemmender Aktivität und zeigen eine sehr geringe Antigenität. Die Halbwertszeit läßt sich über das Molekulargewicht der konjugierten Polyalkylenglykol- oder Polyalkylenglykolderivat-Reste zwischen 1 und 100 Stunden gezielt einstellen.
Die neuen Verbindungen lassen sich in der Human- und Veterinärmedizin zur Behandlung und Prophylaxe folgender Krankheiten verwenden: thromo-embolische Erkrankungen, wie Myokardinfarkt, periphere arterielle Verschlußkrankheit, tiefe Venenthrombose und Lungenembolie. Darüber hinaus können sie zur Verhinderung der Reocclusion nach Wiedereröffnung arterieller Gefäße durch mechanische Methoden oder Lyse verwendet werden. Sie werden in der Regel i. v. oder i. m. in den hierfür üblichen Applikationsformen angewendet.
Beispiel 1 a) Reaktion von Polyethylenglykol 40.000 (PEG 40.000) mit Cyanurchlorid
Zu 50 ml Toluol wurden 2,5 g wasserfreies Na₂CO₃ gegeben. Es wurde 5 min bei 55°C gerührt. Danach wurden unter Rühren bei 55°C 500 mg Cyanurchlorid und 5 g PEG 40.000 hinzugegeben. Die Temperatur wurde unter Rühren auf 70°C erhöht. Nach 4 h weiterem Rühren wurde auf 30 bis 35°C abgekühlt und nicht gelöster Na₂CO₃ abgesaugt. Nach Zugabe von 50 ml n-Hexan wurde 15 min bei Raumtemperatur gerührt und das ausgefallene Reaktionsprodukt abgesaugt. Der filtrierte Feststoff wurde in 50 ml Toluol unter Erwärmen und Rühren gelöst. Nach Abkühlen auf 30 bis 35°C wurde das PEG 40.000-Cyanurchlorid-Addukt mit n-Hexan bei 25°C erneut ausgefällt und im Vakuum getrocknet.
b) Umsetzung von PEG 40.000-Cyanurchlorid-Addukt mit Desulfatohirudin
125 g Desulfatohirudin und 2,75 g PEG 40.000-Cyanurchlorid-Addukt (vgl. 1a) wurden in 25 ml 0,1 M Boraxpuffer pH 9,4 aufgenommen und 3 h bei 4 bis 6°C stehen gelassen. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde 12 h bei 4 bis 6°C gegen 20 mM PO₄-Puffer pH 8,0 dialysiert und anschließend auf einer Q-Sepharose®-Säule, die mit 10 mM PO₄-Puffer pH 8,0 äqulibriert war, aufgetragen und in Stufen mit NaCl eluiert. Zwischen 80 und 200 mM NaCl wurde das aktive PEG 40.000-Desulfato- Konjugat eluiert.
Auf einer Superose® (Pharmacia) Säule konnte ein Molekulargewicht für dieses Konjugat von Mw=48.000 ermittelt werden. Die spezifische Aktivität des Komplexes wurde mit dem chromogenen Substrat S 2238 im Thrombininbitionstest gemessen und betrug ca. 1500 U/mg.
Beispiel 2 a) Reaktion von PEG 10.000 mit "Diphosgen"
Zu 50 ml Toluol wurden 2,5 g wasserfreies Na₂CO₃ gegeben. Es wurde 5 min bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurden 5 g PEG 10.000 (Polyethylenglykol 10.000) bei 4°C unter Rühren zugegeben. Nach weiteren 5 min wurden 1,1 g "Diphosgen" (Chlorameisensäuretrichlormethylester) zugegeben, innerhalb von 30 min auf 50°C erhitzt und 1 Stunde gerührt. Danach wurde das nicht gelöste Na₂CO₃ heiß abfiltriert und das Filtrat auf Raumtemperatur abgekühlt.
Die Fällung des PEG 10.000-Phosgen-Adduktes mit n-Hexan, sowie dessen Reinigung und Trocknung erfolgte wie in Beispiel 1a beschrieben.
b) Umsetzung des PEG 10.000-Phosgen-Adduktes mit Desulfatohirudin
Die Umsetzung sowie die Reinigung des Konjugats erfolgte analog Beispiel 1b.
Das Konjugat besaß das Molekulargewicht Mw=17.000 und die spezifische Aktivität 1000 U/mg.

Claims (3)

1. Konjugate der Formel I aus Polyalkylenglykol oder Polyalkylenglykolderivaten mit Hirudin, Desulfatohirudin oder blutgerinnungshemmenden Hirudin-Muteinen [A-(CH₂)n-[O-(CH₂)n]m-B-]pHir I,worin
A einen der Reste -OH, -NH₂, -NH-CO-CH₃, -COOH, -COOR oder -OR (mit R in der Bedeutung einer C1-4-Alkylgruppe),
n die Zahl 2, 3, 4 oder 5
m eine Zahl von 100 bis 1000
B eine direkte Bindung oder einen Linker vom Typ a oder b
p die Zahl 1, 2, 3 oder 4 und
Hir einen über die Serin-, Threonin- oder Lysin-Seitenkette(n) an den (die) A-(CH₂)n-[O-(CH₂)n]m-B-Rest(e) gebundenen Hirudin-, Desulfatohirudin- oder Hirudin-Mutein-Rest
bedeuten.
2. Konjugate der Formel I gemäß Anspruch 1 zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
3. Verfahren zur Herstellung der Konjugate der Formel I gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) - falls B für eine direkte Bindung oder einen Linker vom Typ a steht -
    eine Verbindung der Formel II A-(CH₂)n-[O-(CH₂)n]m-E II,worin
    A, m und n die angegebene Bedeutung besitzen und
    E einen der Reste -Cl, -Br, -J, -O-(CH₂)n-1-CHO oder -O-(CH₂)n-1-CO-Y (mit Y in der Bedeutung einer Abgangsgruppe) darstellt, direkt oder
  • - falls B für einen Linker vom Typ b steht -
    eine Verbindung der Formel III A-(CH₂)n-[O-(CH₂)n]m-T III,worin A, m und n die angegebenen Bedeutungen besitzen und T für einen der Reste -SH, -OH, -NH₂, -NHCH₃ oder -NHC₂H₅ steht, nach Umsetzen mit einer Linker-Verbindung der Formel mit Hirudin, Desulfatohirudin, einem Hirudin-Mutein in freier Form oder als Fusionsprotein reagieren läßt.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995015183A1 (de) * 1993-12-02 1995-06-08 Basf Aktiengesellschaft Hirudin-konjugate aus hirudin und lipophilen verbindungen

Cited By (2)

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WO1995015183A1 (de) * 1993-12-02 1995-06-08 Basf Aktiengesellschaft Hirudin-konjugate aus hirudin und lipophilen verbindungen
US5919762A (en) * 1993-12-02 1999-07-06 Basf Aktiengesellschaft Conjugates of hirudin and lipophilic compounds

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