HUT74390A - Hirudin conjugates from hirudin and lipophilic compounds - Google Patents
Hirudin conjugates from hirudin and lipophilic compounds Download PDFInfo
- Publication number
- HUT74390A HUT74390A HU9601471A HU9601471A HUT74390A HU T74390 A HUT74390 A HU T74390A HU 9601471 A HU9601471 A HU 9601471A HU 9601471 A HU9601471 A HU 9601471A HU T74390 A HUT74390 A HU T74390A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- hirudin
- acid
- reaction mixture
- lipophilic
- conjugates
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/545—Heterocyclic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Extrusion Moulding Of Plastics Or The Like (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Ink Jet (AREA)
- Silicon Polymers (AREA)
Description
A találmány tárgyát hirudinból és lipofil vegyületekből képződő új hirudin-konjugátumok, előállításuk és gyógyszerhatóanyagként való felhasználásuk képezik.
A hirudin régóta ismert, a természetben létező protein, aminek a véralvadást gátló hatása van. Ez az eddig ismert legerősebb és legszelektívebb trombin-inhibitor. [Lásd: Naturwissenschaften 42, 537 (1955) és Hoppe-Seylers, Zeitschrift für Bioi. Chemie 366, 379 (1985).] A természetes hirudin olyan kémiailag rokon peptidek elegye, amelyek molekulatömege 6900 és 7000 között van, és amelyek 64-66 aminosavból épülnek fel. Körülbelül húsz, a természetben létező hirudinváltozatot írtak le eddig. [ Scharf et al., FEBS-Letters 255, 105-110 (1989)] .
Az EP 345 616 számú szabadalmi irat hirudinból és polimer hordozókból, kapcsolási reakcióval képződő termékeket ismertet. Ez a szabadalmi irat hordozóanyagokként oldható és oldhatatlan polimereket ismertet, ilyenek a dextrán, Sepharose, heparin, laevan és a zselatin részleges hidrolizátumai. A hordozóanyaggal módosított hirudinnak jobb farmakológiai tulajdonságai vannak, így például hosszabb a félértékideje.
A DE 40 14 260 számú szabadalmi irat olyan hirudin-polialkilénglikol-konjugátumokat ismertet, amelyeknek a természetes hirudinhoz képest kedvezőbb a farmakológiai hatásprofiljuk, így hosszabb biológiai hatásuk és jobb biológiai hozzáférhetőségük van.
A fenti két nyilvánosságrahozatali iratban olyan hirudin-származékokat ismertetnek, amelyekben a hosszabb biológiai hatást a hirudinnak egy nagy molekulatömegű polimerrel való módo-
sításával érik el. Ennél, a polimer molekulatömege néhány ezer lehet, úgy hogy a hirudin polipeptid molekulatömege jelentősen nagyobb lesz. Az ilyen nagy molekulatömegű polimereket azonban kémiailag nem lehet pontosan definiálni; ezek gyakran olyan különböző molekulák sokaságát alkotják, amelyek egy molekulatömegtartományon belül oszlanak el. Ennek következtében, a hirudinnak az így nyert kapcsolási termékei nem egy egységes kémiai vegyületből állnak, hanem olyan molekulák sokaságából, amelyek molekulatömegben egymástól különböznek.
Elvárható azonban, hogy az olyan hatóanyagokat, amelyek gyógyszerkészítményekben lesznek alkalmazva, kémiailag a lehető legpontosabban definiálni, és ezáltal átalakulásukat az élő szervezetben jobban ellenőrizni tudjuk.
A találmány célja az volt, hogy olyan hirudin-származékokat állítsunk elő, amelyeknek a normális hirudinhoz képest jobb farmakológiái tulajdonságaik vannak, és amelyeknek nincsenek meg a nagy molekulatömegű polimerekkel módosított hirudin fenti hátrányai .
Ezt a feladatot megoldják a találmány szerinti hirudin-konjugátumok, amelyek hirudinból és egy vagy több olyan lipofil vegyületből képződnek, amely lipofil vegyületnek az oktanol/víz rendszerben mért megoszlási hányadosa 1,8-nél nagyobb, és ez a lipofil vegyület kovalens kémiai kötéssel kapcsolódik a hirudinhoz .
A találmány szerinti hirudin-konjugátumok előállítására valamennyi, a természetben létező hirudin és az ezekből leszármaztatható variánsok, az úgynevezett hirudin-mutánsok, valamint a • · trombint inhibitáló hatású molekulatöredékek is alkalmasak.
Ezeket a hirudinokat és előállításukat például az alábbi szabadalmi iratok ismertetik:
EP 171 024, EP 158 986, DE 38 055 406, WO 92/1712, GB 2 247 239, EP 557 199, WO 92/5748 és DE 40 14 260.
Továbbá a hirudin hatását mutató, a hirudinból leszármaztatható peptidek és peptidszármazékok, mint amilyeneket például az EP 333 356 számú szabadalmi irat ismertet, jól használhatók a találmány szerinti hirudin-konjugátumok előállítására.
A találmány szerinti konjugátumokhoz előnyösen olyan hirudinokat használunk, amelyeknek a lipofil vegyülethez való kapcsolódása nem okoz aktivitáscsökkenést. Ez a helyzet például azoknál a hirudinoknál, amelyeknél a kapcsolódás a 27-37. aminosavból álló oldalláncon keresztül történik. Különösen előnyös a kapcsolódás a 27. és 33. aminosavhelyzetben (a természetes HVI hirudinra vonatkoztatva), mivel ezek a vegyületek egy ujj szerű régió csúcsán vannak, és a hirudin és trombin közötti reakciót nem zavarják.
A lipofil vegyületek kötődése, adott esetben a spacer-hez való kötődése a hirudin aminocsoportjain, így például a szabad N-terminális aminocsoportokon, a lizinoldalláncok aminocsoportjain, a hisztidinek aminocsoportjain, az argininek amidincsoportjain, vagy a hirudin hidroxicsoportjain, így például a tirozin-, szerin- vagy a treoninoldalláncok hidroxicsoportjain keresztül történhet.
A lipofil vegyületek kapcsolódásához különösen alkalmasak a lizinoldalláncok aminocsoportjai.
Ugyanígy lehetséges a lipofil vegyületnek a hirudin egyik módosított tirozinjához való kötődése, amit nitrálással és az ezt követő redukcióval nyerhetünk [Meth. Enzymol. 25, 512-521, (1972)] . A képződött aril-amino-tirozinhoz a lipofil vegyületet ismert kapcsolási módszerek segítségével csatlakoztathatjuk.
A reakcióhoz alkalmas lipofil vegyületek azok, amelyek egy vagy több funkciós csoporttal, igy amino-, hidroxi-, karboxivagy szulfonsavcsoporttal rendelkeznek, és amelyeknek az oktanol/víz rendszerben mért megoszlási hányadosa nagyobb, mint 1,8.
A lipofil vegyületek természetes anyagok is lehetnek, például telített vagy telítetlen zsírsavak, terpének, prosztaglandinok, zsíroldható vitaminok, karotinoidok vagy a szteroidok, de akár olyan szintetikus karbonsavak, alkoholok, aminok és szulfonsavak is, amelyek egy vagy több alkil-, aril-, alkenilcsoportot vagy akár többszörösen telítetlen csoportokat tartalmaznak, amelyek egyenes vagy elágazó szénláncúak lehetnek, és amelyeket adott esetben halogénatomok, nitro-, ciano-, alkoxi-, alkil-tiovagy halogén-alkilcsoportok szubsztituálnak.
Lipofil vegyületek például a következők: telített zsírsavak, így a kapronsav, kaprilsav, kaprinsav, laurinsav, mirisztinsav, palmitinsav, sztearinsav, arachinsav és a behénsav, a telítetlen zsírsavak, így a palmitoleinsav, olajsav, linolsav, linolénsav, ricinolsav, oktadekatetraénsav, ejkozénsav, ejkozadiénsav, arachidonsav, ejkozapentaénsav és az erukasav, valamint az ezekből nyerhető zsíralkoholok és zsíralkil-aminok.
Alkalmas lipofil vegyületek a zsírsavak elegyei is, amiket a természetes zsírok, így a kókuszzsír, pálmamagolaj, repceolaj, olívaolaj, napraforgóolaj, „high oleic napraforgóolaj, ricinusolaj vagy a marhafaggyú elszappanosításával nyerünk.
További példák a lipofil vegyületekre a karótinoidok, igy a zeaxantin, rodovibrin és az asztaxantin, a szteroidok, így a koleszterin, dezmoszterol, koproszterol, cerebroszterol, latoszterol, eregeszterol, szitoszterol, sztigmaszterol, kolánsav, kolinsav, dehidrokortikoszterol, aldoszteron, androszteron, tesztoszteron, tachiszterol, lanoszterol vagy a lumiszterol, a terpének, így a geraniol, nerol, linalool, mentol, karveol, borneol, farnezol, nerolidol és a szklareol, a prosztaglandinok, így a PGE2 vagy a PGF2, a vitaminok, így az A2 vagy a D vitamin, vagy akár szintetikus vegyületek is, így az oxo-alkoholok, hexil-amin, etil-hexánsav, etil-hexanol, etil-hexil-amin és az alkil-benzolszulfonsavak.
A találmány szerinti hirudin-konjugátumokhoz különösen előnyös lipofil vegyületek az olyan (I) általános képletű vegyületek, amelyek képletében
R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül (CH2)m-C(R3) (R4)-(CH2)n-(CH=CH-CH2)o-CH3 általános képletű csoport, a képletben m értéke 0-tól 28-ig terjed, n értéke 3-tól 6-ig terjed, o értéke 0-tól 6-ig terjed, z 4
R es R jelentese egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-6 szenatomos alkil-, 3-5 szénatomos cikloalkil-, aril- vagy benzilcsoport, amelyet adott esetben halogénatomok, nitro-, ciano-, alkil-, alkoxi-, alkil-tio-, halogén-alkilcsoportok szubsztituál• · ···· ··· ··· nak.
Különösen előnyösek azok az (I) általános képletű vegyületek, amelyek képletében Rx és R olyan 4-16 szenatomos csoportot jelent, amelyek telítettek vagy egyszer-háromszor telítetlenek.
Lipofil vegyületekként alkalmasak továbbá az olyan (II) általános képletű vegyületek, amelyek képletében
R* jelentése (CH2) m-C (R3) (R4) - (CH2) n~ (CH=CH-CH2) Q-CH3 általános képletű csoport,
Y jelentése oxigénatom, karbonilcsoport vagy -N(R'')- általános képletű csoport, a képletben
R5 jelentése hidrogénatom, 1-18 szénatomos alkil-, 3-18 szénatomos alkenil-, 3-6 szénatomos cikloalkil-, aril- vagy benzilcsoport, amelyet adott esetben halogénatomok, nitro-, ciano-, alkil-, alkoxi-, alkil-tio-, halogén-alkilcsoportok szubsztituálnak.
A találmány szerinti hirudin-konjugátumok előállítása úgy történik, hogy egy hirudint vagy közvetlenül, vagy egy spacer segítségével egy vagy több lipofil vegyülettel, kapcsolási reakcióban reagáltatunk.
Spacer-ként minden olyan két vagy több funkciós csoportot tartalmazó molekula alkalmas, amely funkciós csoportjai révén, adott esetben aktiválás után, lehetővé teszi a hirudinnak a lipofil vegyülethez való kapcsolódását.
Spacer-ként különösen alkalmasak az aminosavak, oligopeptidek, mono-, di- vagy oligoszacharidok, amino- és hidroxi-karbonsavak, és ezek közül is főleg a 2-10 szénatomos lánchosszúságúak, amelyek adott esetben a hidrofil tulajdonság fokozása céljá• · ·· ···· · ·· • · · · · ·· · ♦ * ........
···♦ ·· ···* ·· *»»* ból további szubsztituenseket tartalmazhatnak, ilyenek például az alkiléncsoportonként 1-4 szénatomos oligoalkilénglikolok.
A lipofil vegyületeknek a hirudinhoz való kapcsolására például a következő spacer-eket alkalmazhatjuk:
-X-CO-, -X-CO-NH-Z-NH-CO-, -X-CH2-Q-N2-, -X-CH2-CH (OH)-CH2-Q-N2-,
-X-CO-CH2-CH2-CO-, -X-CH2-CO- vagy (a) általános képletü csoport, a képletekben
X jelentése kénatom, oxigénatom, imino-, metil-imino- vagy etil-imino-csoport,
W jelentése hidrogén-, klóratom, hidroxicsoport,
Z jelentése 2-6 szénatomos alkilén- vagy p-feniléncsoport, és
Q jelentése p-feniléncsoport.
A felületeken, így a sejtmembránokon vagy a szintetikus felületeken való megkötődés után, a hirudin-konjugátumok biológiai aktivitásának megtartása céljából, szükséges lehet a közvetítő spacer távolságának a felhasználása.
A találmány szerinti hirudin-konjugátumokhoz alkalmas minden olyan lipofil vegyület, amelynek egy vagy több funkciós csoportja, így például amino-, hidroxi-, karboxi- vagy szülionsavcsoportja van, mivel ezek a funkciós csoportok, aktiválásuk után, a hirudin reakcióképes csoportjaival reagálhatnak.
A lipofil vegyület aktiválásának a fajtája, adott esetben egy spacer-en keresztül történő kapcsolódás, a funkciós csoporttól függ, és ezt a szakember által ismert módon hajthatjuk végre .
Ha a lipofil vegyületnek vagy a spacer és a lipofil vegyület konjugátumának karboxicsoportja van, úgy az aktiválás ennek pél dául alkenil-észterré, aril-észterré, O-félacetállá, O-acil-fél(amino-acetál)-Iá, O-acil-félketállá, O-acil-fél(amino-ketál) Iá, O-acil-laktimmá, szimmetrikus vagy aszimmetrikus karbonsavanhidriddé, karbonsav-karbaminsavanhidriddé, O-acil-izoureiddé, O-acil-N-alkil-hidroxilaminná, O-acil-hidroxámsavvá, O-acil-N,N-diacil-hidroxilaminná, O-acil-oximmá, O-acil-N-azo-N-acil-hid roxilaminná, O-acil-N-azo-N-aril-hidroxilaminná, karbonsav-kénessavanhidriddé, karbonsav-kénsavanhidriddé, karbonsav-foszfo rossavanhidriddé, fóniumvegyületté, sav-fluoriddá vagy karbonsav-foszforsavamid-anhidriddé, karbon karbonsav-kloriddá való átalakításával történik, mint ezt az alábbi szakirodalmi források ismertetik:
Müllertől, Houben-Weyl: „Methoden dér organischen Chemie és 15/2 kötet, Thieme Verlag, Stuttgart (1974); Bodanszky, usner, Ondetti: „Peptide Synthesis 85.-128. oldal, John lásd
15/1
KlaWiley and Sons, New York, 1976; vagy a peptidkémia más standard művei.
A reakcióhoz különösen alkalmas reakcióképes csoportú vegyületek a karbonsav-kloridok, adott esetben 1, 2, 3 vagy 5 szubsztituált aril-észterek, a szimmetrikus savanhidridek, az halogénatommal vagy nitrocsoporttal az N-hidroxi-s zukcinimid-és zterek, az N-hidroxi-ftálimid-észterek vagy az N-hidroxi-benzotriazol
-észterek.
Analóg módon aktiválhatjuk a szulfonsavcsoportokat is.
Ha a lipofil vegyület funkciós csoportként amino- vagy hidroxicsoportokat tartalmaz, úgy a lipofil vegyületnek a hirudinhoz való kapcsolódása előnyösen olyan spacer-en keresztül történik, amelyik második funkciós csoportként egy karboxi- vagy • · szulfonsavcsoportot tartalmaz, amit a hirudinhoz való kapcsolási reakcióhoz a fent leirt módon aktiválunk.
Lipofil vegyületként jól használhatók az alkil-diketének is, amiket a kapcsolási reakcióban, minden külön aktiválás nélkül, közvetlenül reagáltathatunk a hirudinnal.
Alkil-diketénekként előnyösen a (III) általános képletű vegyületeket használjuk, a képletben
R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül (CH2)m-C(R3) (R4)-(CH2)n-(CH=CH-CH2)o-CH3 általános képletű csoport, a képletben m értéke 0-tól 28-ig terjed, n értéke 3-tól β-ig terjed, o értéke 0-tól β-ig terjed,
R3 és R4 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkil-, 3-6 szénatomos cikloalkil-, aril- vagy benzilcsoport, amelyet adott esetben halogénatomok, nitro-, ciano-, alkil-, alkoxi-, alkil-tio-, halogén-alkilcsoportok szubsztituálnak.
Különösen előnyös (III) általános képletű vegyületek a zsiralkil-diketének, amelyek a telített zsírsavakból, így a kapronsavból, kaprilsavból, kaprinsavból, laurinsavból, mirisztinsavból, palmitinsavból, sztearinsavból, arachinsavból és a behénsavból valamint a telítetlen zsírsavakból, így a palmitoleinsavból, olajsavból, linolsavból, linolénsavból, ricinolsavból, ok tadekatetraénsavból, ej kozénsavból, savból, ejkozapentaénsavból és az le, mint ezt például a DE 2 927 118 ej kozadiénsavból, arachidonerukasavból származtathatók számú szabadalmi irat ismerteti .
Továbbá olyan zsíralkil-diketéneket is használhatunk, amelyeket zsírsavak elegyeiből származtathatunk le; ilyen zsirsavelegyeket nyerünk például a természetes zsírok, így a kókuszzsír, pálmamagolaj, repceolaj, olívaolaj, napraforgóolaj, „high oleic napraforgóolaj, ricinusolaj és a marhafaggyú elszappanos ífásával.
A találmány szerinti hirudin-konjugátumok kémiailag pontosan definiálhatók, és ezeknek, a hirudinhoz képest kedvezőbb farmakológiái hatásprofiljuk, így többek között jelentősen hosszabb biológiai hatásuk és jobb biológiai hozzáférhetőségük van. Ezenkívül a hidrofób hirudinok lehetővé teszik a hatóanyagnak célzottan a vérsejtek és a véredények felületére való juttatását is .
Ezeknek a tulajdonságaiknak az alapján, a találmány szerinti hirudin-konjugátumok értékes gyógyszerhatóanyagok a trombintól függő thromboembóliás megbetegedések, így a mély vénás trombózis, a tüdőembólia, a szívizom- vagy az agyi infarktus és az instabil angina megelőzésére és kezelésére, továbbá a szétszórt (disseminatus) intravazális koaguláció kezelésére, valamint a thrombolytika, így a sztreptokináz urokináz prourokináz t-PA,
APSAC, az állati nyálmirigyből nyert plazminogénaktivátorok ko medikamentumaként, valamint ezek rekombináns és mutáns formái a reperfúziós idő megrövidítésére és a reoklúziós idő meghosszabbítására .
További alkalmazási terület a PTCA utáni trombinfüggő reoklúzió majd a restenosis megakadályozása, a sima izomsejtek trombin által indukált burjánzásának a megakadályozása, a központi idegrendszerben (például az Alzheimer kórnál) az aktív trombin felszaporodásának a megakadályozása, a tumor leküzdése és annak a mechanizmusnak a megakadályozása, ami a tumorsejtek adhézióját és áttételét okozza.
Az új vegyületeket a szokásos galenikus alkalmazási formákban, szilárd vagy folyékony állapotban alkalmazhatjuk, például mint oldatokat, kenőcsöket, krémeket vagy spray-ket. Ezeket a szokásos módon állítjuk elő. Ennek során a hatóanyagokat a szokásos galenikus segédanyagokkal, így töltőanyagokkal, konzerválószerekkel, a viszkozitást szabályzó szerekkel, nedvesítőszerekkel, diszpergálószerekkel, emulgeátorokkal, oldószerekkel és/vagy hajtógázokkal· együtt kikészítjük (lásd H. Sucker és társai: „Pharmazeutische Technologie Thieme Verlag, Stuttgart, 1978).
A hidrofób tulajdonságok lehetővé teszik az új hirudin-származékok transzdermális alkalmazását is, ezt főleg a penetrációt fokozó szerek illetve eljárások, így például a dimetil-szulfoxid, az alkoholok, az azonok illetve az iontoforézis alkalmazásával összekötve.
A gyógyszerhatóanyag adagolása függ a páciens életkorától, egé.szségi állapotától és a testsúlyától valamint az alkalmazás módjától. Az alkalmazás formájától és a javallattól függően a napi hatóanyagdózis általában 20-40.000 ATU/kg testsúly. (ATU = antitrombin egység)
A hirudin-konjugátumokat sikerrel alkalmazhatjuk a mesterséges felületeknek antithrombotikus réteggel való bevonására;
ilyen mesterséges felületek például a haemodialysis-membránok és az ehhez szükséges csőkígyó-rendszer felülete, a véredények cseréjénél beépített műanyag erek felületei vagy a szív-tüdő gépekben levő mesterséges felületek.
Példák:
1. példa
Oktil-diketén
400,1 g N,N-dimetil-ciklohexil-amint 2 1 toluolban, 50-60 °C-on feloldunk, és ezen a hőmérsékleten 2,5 órán belül az oldatba becsepegtetünk 487,5 g oktánsav-kloridot. A reakcióelegyet ezen a hőmérsékleten még két órán át keverjük, majd szobahőmérsékletűre lehűtjük.
A reakcióelegyet jéghideg 0,5 M kénsavval, vízzel és telített nátrium-klorid oldattal mossuk, és a szerves fázist magnézium-szulfáttal megszárítjuk. A kapott nyers terméket frakcionált desztillációval tisztítjuk. 135 °C fej hőmérsékleten és 0,3 mbar nyomáson főfrakcióként nyerünk 317,3 g színtelen folyadékot. A kapott termék, GC-analízis alapján, 97 %-ban oktil-diketénből áll. A termék IR-, 1H-NMR- és 13C-NMR-spektruma egybevág a feltételezett kémiai szerkezetével.
2. példa
Az oktil-diketénnek a hirudinhoz való kapcsolása
Hirudinként egy hirudin-mutánst alkalmazunk, ami a HV1 természetes hirudintól a következő aminosavcserékben különbözik:
27. helyzet: Lys.; 33. helyzet: Lys.; 36. helyzet: Arg.; 47.
helyzet: Arg. A DE 40 14 260 számú szabadalmi irat ismerteti az ilyen hirudin-mutáns előállítását.
·» * · · · .· .··» ··« ···· ».
* k» ·· » • · • · ·> ·* mg hirudin-mutánst feloldunk 1 ml 100 mM nátrium-borát pufferben (pH= 9,0), és az oldathoz adunk 1 ml propanolt és 1,5 mg oktil-diketént, majd a reakcióelegyet 4 °C-on intenziven keverjük .
Fél órás reakció után a reakcióelegyet vele azonos térfogatú hexánnal extraháljuk, az el nem reagált oktil-diketén eltávolítása céljából. A keletkezett termékelegyet 0,1 % trifluor-ecetsav/viz eleggyel ötvenszeresére meghígítjuk, és ezt egy Hi-Pore RP 304 oszlopra (250x4,6 cm, Biorad, Nr. 125-0550) visszük fel, és a kromatogrammot a következő gradiensek mellett fejlesztjük ki:
A oldat: 0,1 % trifluor-ecetsav/víz
B oldat: 0,1 % trifluor-ecetsav/acetonitril
Áramlási sebesség: 1 ml/perc
Detektálás: 216 nm
| Idő (perc) | 0 | 40 | 40,5 | 45 | 45,5 |
| Hányad; B(%) | 0 | 50 | 100 | 100 | 0 |
A hirudin-diketén-komplexek a következő feltételek mellett eluálnak:
| B (%) | |
| 1 diketén-egység/hirudin (oktil-diketénx-hirudin) | 56 |
| 2 diketén-egység/hirudin (oktil-diketén2~hirudin) | 60 |
| 3 diketén-egység/hirudin (oktil-diketén3-hirudin) | 68 |
A kapcsolási reakciótermékből elkülönített származékok specifikus aktivitása a következő volt:
| ATU/mg | |
| 0kti1-dikétén:-hirudin | 7000 |
| 0kti1-diketén2-hirudin | 8000 |
| Oktil-diketén3-hirudin | 4900 |
A fenti értékek az S 2238 jelű kromogén szubsztráttal (Kabi-Pharmacia termék) végzett, a trombint inhibitáló teszt segítségével lettek meghatározva, lásd FEBS-Letters (1983) 164, 307; a protein meghatározása az UV-extinkció mérésével történt.
( ^moláris = 3148 mól'1 cm’1; λ = 278 nm )
3. példa
Hexil-diketén
1 toluolban 272,2 g N,N-dimetil-ciklohexil-amint vízleválasztóval ellátott visszafolyató hűtő alatt két órán át forralunk, és a vizet leválasztjuk. A reakcióelegyet hagyjuk 50-60 °C-ra lehűlni, majd a reakcióelegybe becsepegtetünk 269 g hexánsav-kloridot, és a reakcióelegyet 55 °C-on még két órán át keverjük .
A reakcióelegyet 0,5 M kénsavval, vízzel és telített konyhasó oldattal mossuk, és a szerves fázist magnézium-szulfáttal megszárítjuk. A kapott nyers terméket frakcionált desztillációval tisztítjuk. Színtelen folyadékként, 0,1 mbar nyomáson, 95 °C és 100 °C párahőmérséklet között 172,8 g főpárlat megy át a szedőbe. A kapott termék, GC-analízis alapján, 98 %-ban hexil-diketénből áll. A termék IR-, 1H-NMR- és 13C-NMR-spektruma egybevág a feltételezett kémiai szerkezetével.
4. példa
A hexil-diketénnek a hirudinhoz való kapcsolása • · ·· · · · · · · · ····· · · · · • ····· · · ·
A hexil-diketénnek a hirudinhoz való kapcsolása a 2 . példával analóg módon történik. A reakcióhoz 20 mg hirudin-mutánst oldunk 2 ml 50 %-os propanolban, és az oldathoz adunk 50 mM nátrium-karbonát oldatot (pH=9,5). A reakció leállítása után (lásd a 2. példát) a reakciótermék szétválasztása a következő gradiensekkel történt az RP 304 jelű HPLC-oszlopon (Biorad; Nr. 1250550) :
A oldószer: 5 mM ammónium-acetát oldat (pH=6,5)
B oldószer: metanol
Áramlási sebesség: 1 ml/perc
Detektálás: 216 nm
| Idő (perc) | 0 | 5 | 30 | 30, 1 | 35,0 | 35, 1 |
| Hányad; B (%) | 0 | 30 | 70 | 100 | 100 | 0 |
A hexil-diketén1-hirudin, a hexil-diketén2-hirudin és a hexil-diketén3-hirudin kapcsolási termék 42,5, 44 és 50 % metanolnál eluálnak. A specifikus aktivitást a 2. példában leírtak szerint határoztuk meg, és a hexil-diketén3-hirudinnál ennek az értéke 5700 ATU/mg volt.
5. példa
Napraforgóolaj sav-klorid % ólajsavtartalmú és 219 savszámú „high oleic napraforgóolajból 70,5 grammot 250 ml toluolban oldunk, és az oldatot 40 °C-ra felmelegítjük. Ezen a hőmérsékleten az oldatba becsepegtetünk 41,2 g oxalil-dikloridot, és a reakcióelegyet még két órán át keverjük.
A reakcióelegyből az oldószert 60 °C-on, vákuumban kidesztilláljuk, és így sárga olajként nyerünk 75 g cím szerinti ve • · · gyületet, aminek 12,0 a kloridszáma.
6. példa
Alkil-diketén, napraforgóolajsav-kloridból (Sunnyldiketén) g 12,0 kloridszámú napraforgóolajsav-klorid és 400 ml toluol elegyét 50 °C-ra melegítjük. Ezen a hőmérsékleten az elegybe 25 percen belül becsepegtetünk 33,7 g N,N-dimetil-ciklohexil-amint. A reakcióelegy hőmérsékletét két órán át 50 °C-on tartjuk, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékletűre hűtjük le.
A kivált szilárd anyagot nyomószűrővel kiszűrjük a reakcióelegyből, a szűrletet 1 M kénsavval, telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal majd telített nátrium-klorid oldattal mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáttal megszárítjuk, és az oldószert vákuumban lehajtjuk. így gyengén sárga olajos folyadékként
51,8 g bepárlási maradékot nyerünk, ami 1H- és 13C-NMR-spektruma alapján 95 %-ban a cím szerinti alkil-diketénből áll.
7. példa
Sunnyldiketén-hirudin előállítása mg hirudin-mutánst (mint a 2. példában) 2 ml 50 %-os propanolban, 50 mM kálium-karbonát pufferben (pH=9,5) oldunk, és az oldathoz hozzáadunk 8,5 mg sunnyldiketént, majd a reakcióelegyet 20 °C-on, 60 percig intenzíven keverjük. A reakció lefutása után a diketén feleslegét a reakcióelegyből úgy távolítjuk el, hogy a reakcióelegyet vele azonos térfogatú hexánnal extraháljuk. A termékelegyet, szétválasztása céljából, egy RP-304 jelű HPLC-oszlopra (Biorad, Nr. 125-0550; 250x4,6 cm) felvisszük, és az oszlopot a következő gradiensekkel eluáljuk:
A oldószer: 5 mM ammónium-acetát oldat (pH=6,5)
B oldószer: metanol
Áramlási sebesség: 1 ml/perc
Detektálás: 216 nm
| Idő (perc) | 0 | 5 | 30 | 30, 1 | 35,0 | 35, 1 |
| Hányad; B (%) | 0 | 70 | 95 | 100 | 100 | 0 |
A sunnyldiketén-hirudin-konjugátumok, azaz a sunnyl^hirudin, a sunnyl2-hirudin és a sunnyl3-hirudin 77, 80 és 90 % metanolnál eluálnak.
A specifikus aktivitásokat a 2. példában leírtak szerint meghatározva, a következő értékeket kapjuk:
Sunnyl·-hirudin aktivitása 7700 ATU/mg
Sunnyl2-hirudin aktivitása 7100 ATU/mg
Sunnyl3-hirudin aktivitása 6100 ATU/mg
8. példa
A palmitinsav-N-hidroxi-szukcinimid-észternek a hirudinnal való reakciój a mg hirudin-mutánst (mint a 2. példában) feloldunk 1 ml 100 mM nátrium-karbonát oldatban (pH=9,5), és az oldathoz hozzáadunk 1,5 mg palmitinsav-N-hidroxi-szukcinimid-észter (Sigma cég) 1,4-dioxános oldatából 1 ml-t, és a reakcióelegyet 20 °C-on keverjük. Négy órás reakció után a hirudinnal való reakciót leállítjuk, a reakcióelegyhez ötszörös moláris feleslegű butilamint adva (egy óra szobahőmérsékleten).
Az RP-304 jelű HPLC-oszlopon (Biorad 125-0550) a termékelegy szétválasztása a következő gradienseknél történt:
A oldószer: 5 mM ammónium-acetát oldat (pH=6,5)
B oldószer: 100 %-os metanol
Áramlási sebesség: 1 ml/perc
Detektálás: 216 nm
| Idő (perc) | 0 | 5 | 30 | 30,1 | 35 | 35, 1 |
| Hányad; B (%) | 0 | 40 | 90 | 100 | 100 | 0 |
A palmitins-av1-hirudin 57 %, a palmitinsav2-hirudin 62 % és a palmitinsav3-hirudin pedig 76 % metanolnál eluál.
9. példa
Olajsav-hirudin előállítása g ólajsavanhidridet oldunk 4 ml dioxánban, az oldathoz adunk 460 mg N-hidroxi-szukcinimidet, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten két órán át keverjük. Az aktivált olajsavnak ebből az oldatából 200 μΐ -hez hozzáadunk 20 ml propanolt és 0,1 M nátrium-karbonát vagy nátrium-borát oldattal (pH=9) készült hirudin oldatból (20 mg/ml) 20 ml-t, és a reakcióelegyet 4 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. Ezután a reakciót leállítjuk, az olajsavra vonatkoztatott kétszeres moláris feleslegű etanol-amint a reakcióelegyhez adva.
A kapcsolási reakcióelegyből 2 ml-t 40 ml 20 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH=7,0), 3,5 M nátrium-klorid oldattal (A futtatószer) meghígítunk, és ezt egy TSK-Butyl-oszlopra (1x28 cm, térfogat: 22 ml, terhelés: 2 mg/ml gél) visszük fel, az oszlopot 2 ml/perc áramlási sebességű és 6 oszloptérfogat (OT) mennyiségű A futtatószerrel mossuk, és a kromatogrammot a következő gradiensek mellett fejlesztjük ki (B futtatószer: 20 mM nátrium-foszfát oldat, pH=7,0):
. 2,5 OT 70 % B . 2,5 OT % B
| 3 . | 2,5 OT | 90 % B | ||
| 4 . | 2,5 OT | 100 % B | ||
| 5 . | 2,5 OT | 30 % metanol | a | B-ben |
| 6. | 2,5 OT | 40 % metanol | a | B-ben |
| A | hirudin- | származékok 100 | o o | B-nél (ólajsavL-hirudin és |
sav2-hirudin) és 30 % metanolnál (olaj sav3-hirudin) eluálnak. A specifikus aktivitások a következő értékűek voltak:
olaj savx-hirudin:
11000 egység/mg olaj sav2-hirudin:
6200 egység/mg olaj sav3-hirudin:
6600 egység/mg
10. példa
Koleszterin-hirudin előállítása ml hirudin oldathoz (20 mg/ml, 0,1 M nátrium-karbonát vagy nátrium-borát oldatban; pH=9,5) hozzáadjuk 3,2 mg N-hidroxi-szukcinimiddel aktivált koleszterinnek 1,2 ml tetrahidrofuránnal készült oldatát, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 órán át állni hagyjuk. Ezután a reakciót leállítjuk, a koleszterinre vonatkoztatott kétszeres moláris feleslegű etanol-amint a reakcióelegyhez adva, majd a reakcióelegy pH-ját 7,0-re állítjuk be.
ml kapcsolási reakcióelegyet 8 ml ammónium-acetát oldattal (2 mM, pH=6,0, A futtatószer) meghigitjuk, majd 2,5 ml/perc áramlási sebességgel egy HiPore Biorad RP 304 oszlopra (10x250 mm) visszük fel, és a kromatogrammot a következő gradiensek mellett fejlesztjük ki:
| Perc | 0 | 10 | 60 |
| B % | 0 | 40 | 90 |
A koleszterin-hirudin 38 percnél eluálódik. A származék specifikus aktivitása: 16000 egység/mg volt.
Az aktív koleszterint a következőképpen állítjuk elő:
15,0 g 23~koleszterolt és 5,2 g borostyánkősavanhidridet 40 ml piridinben 22 órán át visszafolyató hűtő alatt forralunk, majd a reakcióelegyet 250 ml metil-terc-butil-éterben oldjuk. Az oldatot 200 ml 1 M sósavval, 200 ml vízzel és 200 ml telített nátrium-klorid oldattal extraháljuk és magnézium-szulfáttal majd aktívszénnel keverjük. A szűrletet vákuumban bepárolva 18,1 g borostyánkősav-köleszt-5-én-3β-ί1-észtért nyerünk.
Az így nyert észter 1,94 grammjából, 0,55 g N-hidroxi-szukcinimidből és 12 ml metilén-dikloridból álló 4 °C-os elegybe beadunk 1,01 g N,N-diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletűre felmelegedni, egy éjjelen át keverjük, és a reakcióelegyből a szilárd anyagot kiszűrjük. A szerves fázisban kapott nyers terméket 80 g Kieselgél tölteten kromatografáljuk (metilén-diklorid/etil-acetát = 2:1) . így 1,7 g N-hidroxi-szukcinimiddel aktivált koleszterint ( N-[ 3-(köleszt-5-én-3P~il-oxi-karbonil)-propionil-oxi] -szukcinimidet ) nyerünk.
11. példa
Farnezil-hirudin előállítása
5,6 ml hirudin oldatot (21 mg/ml, 0,1 M nátrium-karbonát oldatban (pH=9)) 5,5 ml propanollal meghígitunk, az oldathoz adunk mg farnezilalkohol-p-nitro-fenil-karbonátot, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 12 órán át keverjük. Ezután a reakcióelegyet 150 ml 2M nátrium-klorid és 20 mM nátrium-foszfát oldattal (pH=7) meghígítjuk és egy t-Butyl-oszlopra (terhelés: 2 mg
protein/ml gél; oszlop magassága: 25 cm) felvisszük. Végül az oszlopot a felvitelre használt puffér 2,2 oszloptérfogatnyi mennyiségével mossuk, majd 20 mM nátrium-foszfát (pH=7) oldat (25 oszloptérfogat) után 2 M nátrium-klorid és 20 mM nátriumfoszfát oldat (pH=7) lineáris gradiensével a kromatogrammot kifejlesztjük. A farnezil-hirudin 20 mM nátrium-foszfát oldatnál, a gradiens végén eluál. Specifikus aktivitását a 2. példában leírtak szerint határoztuk meg, és ennek értéke 11300 egység/mg volt.
A farnezilalkohol-p-nitro-fenil-karbonátot a következőképpen állítjuk elő:
1,40 g farnezolt és 1,01 g diazo-biciklo [ 2.2.2] oktánt 20 ml metilén-dikloridban oldunk, és az oldatba 15 percen belül becsepegtetjük 3, 63 g p-nitro-fenil-klór-formiátnak 10 ml metilén-dikloriddal készült oldatát. A reakcióelegyet 1,5 óráig keverjük, majd az oldószert vákuumban lehajtjuk. A nyers terméket 150 g Kieselgél tölteten (hexán/etil-acetát = 20:1) kromatografalva
2,2 g farnezilalkohol-p-nitro-fenil-karbonátot nyerünk.
12. példa
Sztearinsav-hirudin előállítása
0,5 g sztearoil-kloridot feloldunk 2 ml 1,4-dioxánban, az oldathoz adunk 0,29 g N-hidroxi-szukcinimidet valamint 0,1 ml trietil-amint, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük. Ezután a reakcióelegyhez 1 ml vizet adunk, és az oldat pH-ját lúg hozzáadásával 5-re állítjuk be. A szukcinimiddel aktivált sztearinsav oldat 60 mikroliterét 2,5 ml hirudin oldattal (21 mg/ml, 0,1 M nátrium-karbonát oldatban (pH=9)) és 2,5 ml
• · dioxánnal elkeverjük, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 12 órán át keverjük. Végül a reakcióelegyet preparativ RP-HPLC segítségével (lásd a 2. példát) tisztítjuk meg. A származékok a következő értékeknél eluálnak: 48 % B, 54 % B, 62 % B és 74 % B. A specifikus aktivitások értékei a következők voltak: 9600 egység/mg, 12400 egység/mg, 12800 egység/mg és 840 egység/mg.
13. példa
Lutensol TO3-hirudin előállítása
0,5 ml hirudin oldatot (21 mg/ml, 0,1 M nátrium-karbonát vagy nátrium-borát oldatban (pH=9) 0,5 ml tetrahidrofuránnal hígítunk, és az oldathoz adunk 1,2 mg Lutensol T03-N-hidroxiszukcinimid-karbonátot (lásd a 12. példát), és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 12 órán át keverjük. Ezután a reakciót leállítjuk, az aktív Lutensol-ra vonatkoztatott kétszeres moláris feleslegű etanol-amint adva a reakcióelegyhez, és a reakcióelegyet kromatográfiás úton (mint ez a 10. példában van leírva) szétválasztjuk. A hirudin-Lutensol származékok a 45 % B összetételű eluálószernél eluálnak. Az aktivitások értékei a következők voltak: 1. származék: 11300 egység/mg, 2. származék: 29700 egység/mg és a 3. származék: 440 egység/mg.
A kiindulási vegyületet a következőképpen állítjuk elő:
g foszgén gázt kondenzáltatunk 100 ml 0 °C-os toluolban, és az oldatba tíz percen belül becsepegtetjük 34,0 g Lutensol
TO3-nak (OH-szám: 165) 50 ml toluollal készült oldatát. A reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletűre felmelegedni, majd a reakcióelegyből 35 °C-on, olaj szivattyúval létesített vákuumban kihajtjuk az oldószert. így 40,3 g tömegű termékként nyerjük a
• · · ·
Lutensol T03 klór-karbonátját.
1,2 g N-hidroxi-szukcinimidet és 1,0 g trietil-amint 20 ml metilén-dikloridban oldunk, és az oldatba 5 percen belül becsepegtetjük 3,92 g Lutensol T03-klór-karbonátnak 10 ml metilén-dikloriddal készült oldatát. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten két órán át keverjük, a reakcióelegyből az oldószert vákuumban lehajtjuk, és a bepárlási maradékot etil-acetáttal felveszszük. Az oldhatatlan szilárd részt kiszűrjük, és a szűrletet vákuumban oldószermentesitve 4,3 g tömegű termékként nyerjük a Lutensol TO3-nak N-hidroxi-szukcinimid-karbonátját.
14. példa
Okti1-dikefén-fenil-alanin-hirudin előállítása
0,5 ml hirudin oldatot (21 mg/ml, 0,1 M nátrium-karbonát vagy nátrium-borát oldatban (pH=9)) 0,5 ml tetrahidrofuránnal meghigitunk, az oldathoz adunk 4 mg N-(2-hexil-3-oxo-dekanoil)fenil-alanin-N-hidroxi-szukcinimid-észtert, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 12 órán át keverjük. Ezután a reakciót leállítjuk, az aktivált fenil-alaninra vonatkoztatott kétszeres moláris feleslegű etanol-amint a reakcióelegyhez adva, és a reakcióelegyet (mint ezt a 10. példa ismerteti) RP-HPLC-vel választjuk szét. A hirudin- -diketén-származékok a következő összetételű eluálószereknél eluálnak: 1. származék 43 % B-nél, 2. származék 48 % B-nél és a 3. származék 58 % B-nél. A specifikus aktivitásokat a 2. példában leírtak szerint határoztuk meg, és értékeik a következők voltak: az 1. származéknál 930 egység/mg, a 2. származéknál 2800 egység/mg és a 3. származéknál pedig 135 egység/mg.
» ·· ··· · · • · « ♦ · · • ·» · 4 ·· · · · * < * ·
A kiindulási vegyületet a következőképpen állítjuk elő:
500 ml vízben (pH=13,5) 82,5 g fenil-alaninhoz 1,25 órán belül hozzácsepegtetjük 145,9 g oktil-diketén és 50 ml metilén-diklorid elegyét. A szuszpenziót 5 órán át intenzíven keverjük, majd a reakcióelegyhez adunk 2,5 1 vizet, és a reakcióelegy pH-ját tömény sósavval 1-re állítjuk be. A vizes fázist összesen
2,5 1 metilén-dikloriddal extraháljuk, az egyesített szerves fázist magnézium-szulfáttal megszárítjuk, és az oldószert vákuumban lehajtjuk. A fehér, szilárd anyagként kapott bepárlási maradékot 1000 ml pentánnal kikeverjük, a szilárd anyagot kiszűrjük és 60 °C-on vákuumban megszárítjuk. így 190 g N-(2-hexil-3-oxo-dekanoil)-fenil-alanint nyerünk.
Az N-(2-hexil-3-oxo-dekanoil)-fenil-alanin, 0,55 g N-hidroxi-szukcinimid és 10 ml metilén-diklorid 4 °C-os elegyébe beadunk 1,01 g N,N-diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletűre felmelegedni, a kivált szilárd anyagot a reakcióelegyből kiszűrjük, és a szűrletben levő nyers terméket 80 g Kieselgél tölteten kromatografáljuk (metilén-diklorid és hexán 3:1 arányú elegye + 1 % jégecet). így 2,0 g N-(2-hexil-3-oxo-dekanoil)-fenil-alanin-N-hidroxi-s zukcinimid-és ztért nyerünk .
15. példa
Oktil-diketén-kapronsav-hirudin előállítása
1,0 ml hirudin oldatot (21 mg/ml, 0,1 M nátrium-karbonát vagy nátrium-borát oldatban (pH=9)) 1,0 ml tetrahidrofúránnal meghígítunk, az oldathoz adunk 7 mg N-[ 6-(2-hexil-3-oxo-dekanoil-amino)-hexanoil-oxi] -szukcinimidet, és a reakcióelegyet szó26 bahőmérsékleten 12 órán át keverjük. Ezután a reakciót leállítjuk, az aktív diketénre vonatkoztatott kétszeres moláris feleslegű etanol-amint a reakcióelegyhez adva, és a reakcióterméket (mint ezt a 10. példa ismerteti) RP-kromatográfiával választjuk szét. A hirudin-diketén-származékok a következő összetételű eluálószereknél eluáltak: az 1. származék 48 % B-nél, a 2. származék 52 % B-nél és a 3. származék 63 % B-nél. A specifikus aktivitásokat a 2. példában ismertettek szerint határoztuk meg, és értékeik a következők voltak: az 1. származék: 7500 egység/mg, a 2. származék: 3400 egység/mg és a 3. származék: 80 egység/mg.
A kiindulási vegyületet a következőképpen állítjuk elő:
6,55 g 6-amino-kapronsavat 100 ml vízben (pH=9) oldunk, és az oldatba 20 perc alatt becsepegtetünk 14,24 g oktil-diketént. A reakcióelegyet egy éjjelen át keverjük, a reakcióelegy pH-ját tömény sósavval 1-re állítjuk be, és a vizes oldatot 100 ml metil-terc-butil-éterrel extraháljuk. A szerves fázist magnézium-szulfáttal megszárítjuk, az oldószert vákuumban lehajtjuk, és a bepárlási maradékot 150 ml pentánnal kikeverjük. Az így kapott szilárd anyagot kiszűrve és 60 °C-on, vákuumban megszárítva 5,9 g 6-(2-hexil-3-oxo-dekanoil-amino)-hexánsavat nyerünk.
Az igy kapott termék 1,53 grammjából, 0,55 g N-hidroxi-szukcinimidből és 10 ml metilén-dikloridból álló 4 °C-os elegyhez hozzáadunk 1,01 g N,N-diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletűre felmelegedni, és egy éjjelen át keverjük, majd a kivált szilárd anyagot kiszűrjük a reakcióelegyből. Az oldatban levő nyers terméket 80 g Kieselgél tölteten kromatografalva (etil-acetát és hexán 3:5 arányú elegye +
% jégecet) 1,7 g N-[ 6-(2-hexil-3-oxo-dekanoil-amino)-hexanoil-oxi] -szukcinimidet nyerünk.
16. példa
Az anti-IIa-faktor aktivitás kinetikája, a kutyákból és patkányokból nyert plazmapróbákban
Módszer: A hirudin-konjugátumokat vagy a placebót intravénásán adtuk narkotizált patkányoknak vagy éber állapotú kutyáknak. Citrátplazma nyerése céljából, meghatározott időpontokban vérmintákat vettünk az állatok vénájából. A plazmában a hirudin-konjugátumok szabad anti-IIa-faktor aktivitását kromogén minta segítségével határoztuk meg, a rekombináns hirudin standard függvénye alapján.
A vizsgálat elve:
trombin kromogén szubsztrát -----------------> peptid + p-nitro-anilin (S-2238) (sárga)
Mikrotiterlemezeken 100 μΐ trisz-pufferhez (trisz 200 mmól/1 NaCl 25 mmól/1, pH=8,l) 10 μΐ plazmapróbát és 100 μΐ trombint (0,3 NIH-egység/ml) pipettáztunk hozzá. Egy perc múlva 50 μΐ szubsztrát oldatot (S-2238, 1,34 mmól/1) az elegyhez adva, elindítottuk a reakciót. A reakcióelegyet 25 °C-on rövid ideig kevertük, majd 5 perc múlva a reakcióelegyhez 100 μΐ 30 %-os ecetsavat adva, a reakciót leállítottuk. A 630 nm-nél mért értékkel szemben, a 405 nm-nél mért extinkció fordítottan arányos a plazmapróbában az anti-IIa-faktor aktivitással. A plazmapróbákban részben az alvadási paramétereket, így a trombinidőt (TT) és a részleges trombokinázidőt (APTT) is mértük.
• · · · · · · • · · · · ···· ·· ··· ··
Eredmények:
Megfigyelhető, hogy körülbelül azonos specifikus aktivitás esetén, a narkotizált patkányokon a lipofil hirudin-származékoknak 1 mg/kg i.v. dózisban való alkalmazása után a szabad anti-Ila-faktor aktivitás lényegesen lassabban csökken, mint az r-hirudin alkalmazása után (lásd az 1. ábrát). Kutyáknál, az oktil-diketén3-hirudinnak 5000 antitrombin egység (ATU)/kg i.v. dózisban való alkalmazása után szintén azt lehetett észlelni, hogy a hatás szintje jóval magasabb volt, és ez jóval lassabban csökkent le, mint az r-hirudin alkalmazása után ( lásd a 2 . ábrát) . Kutyákon, a farnezil-hirudinnak 1 mg/kg i.v. dózisban való alkalmazása után a szabad anti-IIa-faktor aktivitásnak csak nagyon lassú csökkenését lehetett megfigyelni (lásd a 3. ábrát).
17. példa
Humán és patkányvérből származó mosott vérlemezkéknek a trombin által indukált ex vivő és in vitro aggregációja, a vérlemezkéknek a lipofil hirudin-származékokkal való előinkubációja után
Módszer: A vérlemezkékben dús plazma (VDP, felülúszó) nyerése céljából, friss citrátvért (9 rész vér + 1 rész nátrium-citrát oldat, 0,11 mól/l, patkánynál: 8,5 + 1,5) 250 g centripetális gyorsuláson 16 percig centrifugáltunk. A VDP-ból, Patscheke és társainak módszere [ lásd Haemostasis 10, 14-27 (1981)] segítségével, a mosott vérlemezkék koncentrátumát nyertük. Ennek során 330 g gyorsuláson végzett és 7 percig tartó centrifugálással kiülepítettük a VDP-ból a vérlemezkéket. A hirudin-származékokkal való kezelés esetén, ennél a műveletnél az üledéket feliszapoljuk, annyi mosóoldathoz (120 mmól/1 NaCl, 5 mmól/1 KC1, 2
mmól/1 CaCl2, 1 mmól/1 MgCl2, 5 mmól/1 glükóz, 2 g/1 albumin, 50 mg/1 apyrase enzim 30 mmól/1 nátrium-foszfát pufferben (pH=6,5)) adva 200 μΐ hirudin-származékot, hogy a származék végkoncentrációja 0,125 mg/1 legyen, és a szuszpenziót szobahőmérsékleten 10 percig inkubáljuk. Ezt követi ezzel a mosóoldattal való kétszeri mosás és a vérlemezkéknek a teszt-folyadékban (120 mmól/1 NaCl, 5 mmól/1 KC1, 1 mmól/1 CaCl2, 0,1 mmól/1 MgCl2, 5 mmól/1 glükóz, 0,5 g/1 albumin, 50 mg/1 apyrase enzim, 1 mmól/1 nátrium-foszfát, TES/NaOH, pH=7,4) való újbóli felszuszpendálása. A vérlemezkeszámot 2χ103/μ1 (a patkányoknál 8χ10°/μ1) koncentrációra állítottuk be. A vérlemezkeaggregáció meghatározására a vérlemezkekoncentrátum 218 mikroliterét egy aggregométerben (PAP-4 Bio Data Corporation) 37 °C-on 3 percig inkubáltuk, majd 1000 perc fordulatszámon 1 percig kevertük és újból egy percig inkubáltuk.
Ezután 2 μΐ trombin oldat beadásával megindítottuk az aggregációt. A mintában a vérlemezkék aggregációját a mért fényáteresztőképességnek az időegység alatti megváltozásából határoztuk meg (Slope-módszer). A hirudin-származékok relatív hatásának és affinitásának a mértékeként az EC 50-vel jelzett és NIH-egység/mlben megadott trombinkoncentráció szolgált, amivel a maximális vérlemezkeaggregáció félértékét értük el. Ebből az EC 50 értékből és a hirudin nélkül előinkubált minta EC 50 értékéből számítottuk ki a neutralizációs indexet (NI). NI = EC 50 származék/EC 50 kontroll. Ez az érték a hirudin-származékra jellemző, és megadja azt a faktort, amivel a trombin, mint az agonista koncentrációját meg kell emelni ahhoz, hogy újra ugyanazt az aggregációt (félérték) érjük el, mint a kontrollcsoportban.
Eredmények:
A különböző fajok vérlemezkéinek a 21,5 gg/ml koncentrációjú lipofil hirudin-származékokkal való előinkubációja után részben a kontrollcsoportban használt trombinkoncentráció sokszorosát kell alkalmazni ahhoz, hogy újra aggregációt kapjunk (lásd a 4. ábrát). Ezt a gátlást a lipofil hirudin-származékoknak a vérlemezkékre való, immunológiailag kimutatható rátapadása okozza. A humán vérlemezkéknél az NI-értékek elérik a 25-t is (lásd az 1. táblázatot). Patkányoknál, 24 órával a koleszterin-hirudinnak 10 mg/kg dózisú alkalmazása után az NI értéke ex vivő még mindig 5,4 volt (lásd a 2. táblázatot).
1. táblázat
A különböző vegyületek neutralizációs indexei (NI) a humán vérlemezkéken.
| Vegyület | NI |
| Kontroll (placebóval kezelt) | 1 |
| r-Hirudin | 1,21 |
| Sztearoil-hirudin | 5, 42 |
| Palmitoil-hirudin | 4,71 |
| Kölesztéril-hirudin | 21,2 |
| Lutensol TO3-hirudin | 15, 1 |
| Farnezil-hirudin | 24,3 |
18. példa
Az antitrombotikus hatás vizsgálata, a patkányban kialakított arteriovenózus söntön
Módszer: Ebben a kísérletben egy arteriovenózus söntben levő • · · · · · · ···· ·· ··· 99 üvegkapilláris trombózist okozó, mesterséges trombogén felületként szolgált. Narkotizált (uretán 25%, 2x8 mg/kg i.p.) patkányokat, 37 °C-on temperált felületen, a hátukra fektetve rögzítettünk. A szabaddá preparált jobboldali Aorta carotis-ba és a Véna jugularis-ba rövid polietilén katétereket (Portex, PE 50) kötöttünk be, a katétereket fiziológiás konyhasó oldattal töltöttük fel és csíptetővel zártuk le. A katéterek szabad végeit egy 20,0 mm hosszú és 1,0 mm belső átmérőjű üvegkapillárissal kötöttük össze, ami trombogén felületként szolgált. A vizsgálni kívánt vegyületeket intravénásán, sub cutan, per os vagy infúzióban adtuk a kísérleti állatoknak. A hatóanyaggal vagy az oldószerrel (a kontrollcsoportnál) való szükséges inkubációs idő (5, 60 vagy 360 perc) eltelte után a söntöt a csíptető eltávolításával megnyitottuk. A söntön keresztüli véráramlás a sönt hőmérsékletének gyors emelkedését okozta, amit az üvegkapilláris közepén mértünk. A szobahőmérsékletről a testhőmérsékletre való emelkedés sebessége a sönt átjárhatóságának a mértéke. A hőmérsékletet a sönt elzáródásáig, legfeljebb azonban 30 percig folyamatosan regisztráltuk. A különböző hirudin-származékok hatásának az összehasonlítására az ED15perc dózis szolgált, ami annak a mértéke, hogy mekkora dózis szükséges az elzáródási időnek a kontrollcsoporthoz képest 15 perccel való meghosszabbodásához. A sönt nyitásakor és a kísérlet végén ezenkívül még vérmintákat is vettünk, hogy a plazmában az anti-IIa-faktor aktivitást meghatározhassuk .
Eredmények:
Az oktil-diketén2-hirudin és az oktil-diketén3-hirudin, a
hosszabb hatástartamuk alapján, már csekély dózisokban is antitrombotikus hatást mutatnak, és hosszabb ideig hatnak, mint az r-hirudin (lásd az 5. ábrát).
19. példa
Az elektromos árammal indukált trombózisra kifejtett antitrombotikus hatás vizsgálata, patkányokon
Módszer: Ebben a kísérletben az Aorta carotis-ba beültetett két elektródon át vezetett rövid elektromos árammal endotélkárosodást váltottunk ki, ami ezáltal a véredény trombotikus elzáródását okozta. Narkotizált (uretán 25%, 2x8 mg/kg i.p.) patkányokat, 37 °C-on temperált felületen, a hátukra fektetve rögzítettünk. A jobboldali Aorta carotis-nak egy 20 mm hosszú szegmensét szabaddá preparáltuk, és a szegmens proximális felére egy ultrahangos tranzit-idő áramlásmérőfejet helyeztünk el. A 30 perces megfigyelési idő alatt egy ultrahangos áramlásmérő készülékkel (T206, Transonic Systems Inc. USA) folyamatosan regisztráltuk a térfogatáram értékét. A trombus képződését állandó intenzitású elektromos árammal (3 mA, 1 perc) váltottuk ki, amit egy olyan horogalakú elektródapáron vezettünk át, amelyet a mérőfejtől distalisan 1 cm-re, a véredény felületén rögzítettünk. Az érelzáródást úgy definiáltuk, mint a térfogatáramnak a 0,3 ml/perc érték alá történő és több mint 3 percig tartó csökkenését. A hirudin-származékok antitrombotikus hatását a 10 állatból álló csoportban a 30 percen belül bekövetkező trombózisok gyakoriságával jellemeztük. A különböző hirudin-származékok hatásának összehasonlítására az ED50-vel jelzett dózis szolgált, ami azt a dózist jelenti, aminek a hatására a trombózis gyakorisága a
kontrollcsoporthoz képest 50 %-kal csökken. A feszültség ráadása előtt és a kísérlet végén ezenkívül még vérmintákat is vettünk, hogy a plazmában az anti-IIa-faktor aktivitást meghatározhassuk.
Eredmények:
A palmitoil2-hirudinra, az intravénás alkalmazását követő öt perc múlva, 0,24 mg/kg ED50 értéket határoztunk meg, míg az r-hirudin ennek megfelelő ED50 értéke már 0,47 mg/kg volt. A koleszteril-hirudinnak patkányokon való intravénás alkalmazása után még 24 óra múlva is, a hosszú hatástartam alapján, az ex vivő mosott vérlemezkék aggregációjának gátlását és jó antitrombotikus hatást lehetett kimutatni (lásd a 2. táblázatot).
2. táblázat
Az intravénás alkalmazását (n = 9-10) követő 24 óra múlva, a koleszteril-hirudinnak antitrombotikus és a vérlemezkék aggregációját gátló hatása.
| Kezelés | in vitro | placebo | 1,0 mg/kg | 10 mg/kg |
| A trombózis gyakorisága (%) | - | 100 | 50 | 11 |
| Neutralizációs index (NI) , mosott vérlemezkékben | 18,3 + 6,1 | 1 | 1,5 + 0,02 | 5,39 + 0,74 |
| anti-IIa-faktor aktivitás a plazmában (ATU/ml) | - | 0 | 5,7 + 0,6 | 61, 0 + 3,8 |
| TT (szék) | - | 41 + 1 | 267 + 15 | >300 |
| APTT (szék) | - | 29 + 4 | 30 + 3 | 52 + 4 |
• ·
Claims (7)
- Szabadalmi igénypontok1. Hirudinból és egy vagy több lipofil vegyületből képződő olyan hirudin-konjugátumok, amelyekben a lipofil vegyületnek az oktanol/viz rendszerben mért megoszlási hányadosa 1,8-nél nagyobb, és ez a lipofil vegyület kovalens kémiai kötéssel kapcsolódik a hirudinhoz.
- 2. Az 1. igénypont szerinti hirudin-konjugátumok, azzal jellemezve, hogy a lipofil vegyületnek a hirudinhoz való kapcsolódása a hirudin 27.-37. helyzetű aminosavján keresztül történik.
- 3. Az 1. és 2. igénypont szerinti hirudin-konjugátumok, azzal jellemezve, hogy a lipofil vegyületnek a hirudinhoz való kapcsolódása a hirudin lizinoldalláncának aminocsoportján keresztül történik.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti hirudin-konjugátumok, azzal jellemezve, hogy a hirudinhoz egy-három lipofil vegyület kapcsolódik.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti hirudin-konjugátumok, azzal jellemezve, hogy legalább egy lipofil vegyület kapcsolódik a hirudinhoz, a hirudin 27. vagy 33. helyzetű aminosavján keresztül.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti hirudin-konjugátumoknak a betegségek leküzdésére való felhasználása.
- 7. Eljárás hirudin-konjugátumok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy hirudint a lipofil vegyület egy vagy több mólekvivalensnyi mennyiségével reagáltatjuk, adott esetben a lipofil vegyület kémiai aktiválása után.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4341115 | 1993-12-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9601471D0 HU9601471D0 (en) | 1996-07-29 |
| HUT74390A true HUT74390A (en) | 1996-12-30 |
Family
ID=6504029
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9601471A HUT74390A (en) | 1993-12-02 | 1994-11-25 | Hirudin conjugates from hirudin and lipophilic compounds |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5919762A (hu) |
| EP (1) | EP0730473B1 (hu) |
| JP (1) | JPH09505810A (hu) |
| CN (1) | CN1142776A (hu) |
| AT (1) | ATE204763T1 (hu) |
| AU (1) | AU679811B2 (hu) |
| BR (1) | BR9408195A (hu) |
| CA (1) | CA2176967A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ157096A3 (hu) |
| DE (2) | DE4437502A1 (hu) |
| DK (1) | DK0730473T3 (hu) |
| ES (1) | ES2163487T3 (hu) |
| FI (1) | FI962299A0 (hu) |
| GR (1) | GR3036938T3 (hu) |
| HR (1) | HRP940968A2 (hu) |
| HU (1) | HUT74390A (hu) |
| IL (1) | IL111811A0 (hu) |
| NO (1) | NO962261L (hu) |
| NZ (1) | NZ276410A (hu) |
| PL (1) | PL314797A1 (hu) |
| PT (1) | PT730473E (hu) |
| SG (1) | SG49156A1 (hu) |
| SK (1) | SK67596A3 (hu) |
| WO (1) | WO1995015183A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA949562B (hu) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4437604A1 (de) * | 1994-10-21 | 1996-04-25 | Basf Ag | Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung |
| US5726168A (en) * | 1995-10-12 | 1998-03-10 | Eli Lilly And Company | Lipophilic benzothiophenes |
| DE19915862A1 (de) * | 1999-04-08 | 2000-10-12 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung von molekulargewichtserweitertem Hirudin als Antikoagulans bei der extrakorporalen Nierenersatztherapie |
| EP1448263B1 (en) * | 2001-10-24 | 2009-01-07 | Power Paper Ltd. | Device for controlled delivery of active substance into the skin |
| US7438925B2 (en) * | 2002-08-26 | 2008-10-21 | Biovention Holdings Ltd. | Drug eluting coatings for medical implants |
| BR102017005783A2 (pt) * | 2017-03-21 | 2018-10-02 | Fund Butantan | processo de obtenção de esculptina e seus fragmentos, esculptina recombinante e seus usos |
| KR102366360B1 (ko) * | 2021-06-29 | 2022-02-23 | (주)네오팜 | 신규한 유사 세라마이드 화합물 및 이를 포함하는 피부 외용제 조성물 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0077529B1 (de) * | 1981-10-16 | 1985-07-17 | Sanol Schwarz GmbH | Arzneimittelformulierung |
| DE3445532A1 (de) * | 1984-12-13 | 1986-06-19 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Hirudin-pa, desulfatohirudine-pa, verfahren zur herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
| US4939174A (en) * | 1988-02-26 | 1990-07-03 | Shashoua Victor E | Appetite suppression with dopamine-fatty acid conjugates |
| DE3819079A1 (de) * | 1988-06-04 | 1989-12-07 | Hoechst Ag | Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung |
| WO1990010448A2 (en) * | 1989-03-07 | 1990-09-20 | Genentech, Inc. | Covalent conjugates of lipid and oligonucleotide |
| DE4014260A1 (de) * | 1989-12-01 | 1991-06-06 | Basf Ag | Hirudinpolyalkylenglykolkonjugate |
| EP0502962B1 (de) * | 1989-12-01 | 1996-03-13 | BASF Aktiengesellschaft | Hirudin-Muteine und deren Polyalkylenglykolkonjugate |
| DE69024230T2 (de) * | 1989-12-22 | 1996-05-02 | Commw Scient Ind Res Org | An fette gebundene aminosäuren, peptide oder deren derivate |
| EP0537299A1 (en) * | 1990-03-29 | 1993-04-21 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide-transport agent disulfide conjugates |
| US5256641A (en) * | 1990-11-01 | 1993-10-26 | State Of Oregon | Covalent polar lipid-peptide conjugates for immunological targeting |
| WO1992019233A2 (en) * | 1991-04-29 | 1992-11-12 | Control Delivery Systems, Inc. | Sustained release composition and methods of use thereof |
| DE69218888D1 (de) * | 1991-05-02 | 1997-05-15 | Pierre Baudet | N-phenyl-cinnamamide, die einen schutz verleihen gegen schädigende effekte ultravioletten lichtes |
| US5359030A (en) * | 1993-05-10 | 1994-10-25 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
-
1994
- 1994-10-20 DE DE4437502A patent/DE4437502A1/de not_active Withdrawn
- 1994-11-25 SG SG1996006978A patent/SG49156A1/en unknown
- 1994-11-25 SK SK675-96A patent/SK67596A3/sk unknown
- 1994-11-25 US US08/652,511 patent/US5919762A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-25 PT PT95901432T patent/PT730473E/pt unknown
- 1994-11-25 CZ CZ961570A patent/CZ157096A3/cs unknown
- 1994-11-25 ES ES95901432T patent/ES2163487T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-25 BR BR9408195A patent/BR9408195A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-11-25 CA CA002176967A patent/CA2176967A1/en not_active Abandoned
- 1994-11-25 DK DK95901432T patent/DK0730473T3/da active
- 1994-11-25 NZ NZ276410A patent/NZ276410A/en unknown
- 1994-11-25 AU AU10670/95A patent/AU679811B2/en not_active Ceased
- 1994-11-25 WO PCT/EP1994/003901 patent/WO1995015183A1/de active IP Right Grant
- 1994-11-25 AT AT95901432T patent/ATE204763T1/de active
- 1994-11-25 JP JP7515283A patent/JPH09505810A/ja not_active Ceased
- 1994-11-25 HU HU9601471A patent/HUT74390A/hu unknown
- 1994-11-25 PL PL94314797A patent/PL314797A1/xx unknown
- 1994-11-25 EP EP95901432A patent/EP0730473B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-25 DE DE59409847T patent/DE59409847D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-25 CN CN94194897A patent/CN1142776A/zh active Pending
- 1994-11-29 IL IL11181194A patent/IL111811A0/xx unknown
- 1994-12-01 HR HRP4341115.0A patent/HRP940968A2/hr not_active Application Discontinuation
- 1994-12-01 ZA ZA949562A patent/ZA949562B/xx unknown
-
1996
- 1996-05-31 NO NO962261A patent/NO962261L/no unknown
- 1996-05-31 FI FI962299A patent/FI962299A0/fi not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-10-18 GR GR20010401806T patent/GR3036938T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5919762A (en) | 1999-07-06 |
| GR3036938T3 (en) | 2002-01-31 |
| AU679811B2 (en) | 1997-07-10 |
| SK67596A3 (en) | 1996-12-04 |
| WO1995015183A1 (de) | 1995-06-08 |
| SG49156A1 (en) | 1998-05-18 |
| NO962261D0 (no) | 1996-05-31 |
| CN1142776A (zh) | 1997-02-12 |
| JPH09505810A (ja) | 1997-06-10 |
| AU1067095A (en) | 1995-06-19 |
| FI962299A (fi) | 1996-05-31 |
| EP0730473B1 (de) | 2001-08-29 |
| DK0730473T3 (da) | 2001-10-08 |
| CA2176967A1 (en) | 1995-06-08 |
| NZ276410A (en) | 1997-03-24 |
| FI962299A0 (fi) | 1996-05-31 |
| DE59409847D1 (de) | 2001-10-04 |
| HU9601471D0 (en) | 1996-07-29 |
| EP0730473A1 (de) | 1996-09-11 |
| ES2163487T3 (es) | 2002-02-01 |
| HRP940968A2 (en) | 1997-08-31 |
| PL314797A1 (en) | 1996-09-30 |
| PT730473E (pt) | 2002-02-28 |
| BR9408195A (pt) | 1997-08-26 |
| NO962261L (no) | 1996-05-31 |
| CZ157096A3 (en) | 1996-09-11 |
| ZA949562B (en) | 1996-06-03 |
| ATE204763T1 (de) | 2001-09-15 |
| IL111811A0 (en) | 1995-01-24 |
| DE4437502A1 (de) | 1995-06-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100438244B1 (ko) | 사이클릭결합저해제 | |
| KR100304201B1 (ko) | 환상의부착저해제 | |
| US5770563A (en) | Heparin- and sulfatide binding peptides from the type I repeats of human thrombospondin and conjugates thereof | |
| JP5134374B2 (ja) | ポリペプチドと五糖の複合物 | |
| MX2014013915A (es) | Portadores para el suministro mejorado de farmaco. | |
| CN101133082A (zh) | 酰化的glp-1化合物 | |
| JPH05500750A (ja) | 血小板凝集阻害剤 | |
| JPH08504823A (ja) | エンドセリン拮抗薬 | |
| CN101005857A (zh) | 多肽延长标记 | |
| EP0298820A1 (fr) | Nouveaux dérivés peptidiques et leur application notamment en thérapeutique | |
| BRPI0721259A2 (pt) | composto, composiÇço farmacÊutica, uso de composto, e, processo para a fabricaÇço de composto | |
| AU2015305299B2 (en) | Disintegrin variants and pharmaceutical uses thereof | |
| US20240124534A1 (en) | Anticoagulant fusion proteins and uses thereof | |
| KR20180050755A (ko) | 사이클릭 폴리펩타이드, 그것의 제조 방법 및 치료학적 용도 | |
| JP2018531284A6 (ja) | 環状ポリペプチド、それらを得る方法、及びその治療的使用 | |
| HUT74390A (en) | Hirudin conjugates from hirudin and lipophilic compounds | |
| JP3537437B2 (ja) | トロンビンインヒビター | |
| US11975040B2 (en) | Plexin binding regulator | |
| JP2009242372A (ja) | 均一な糖鎖構造を有するエリスロポエチン誘導体 | |
| KR102017973B1 (ko) | 항-b형 간염 바이러스 x 단백질 폴리펩티드 약제 | |
| Sidorova et al. | Cystein-containing peptides induce migration of monocytes | |
| JP2023125435A (ja) | 細胞膜非透過性の物質を動物細胞の細胞質に送達する新規キャリア分子 | |
| JPH07309894A (ja) | 新規ペプチド並びにそれを用いた血小板凝集抑制剤、体外循環用血液凝固抑制剤及び輸血用血小板製剤保護剤 | |
| KR20030091739A (ko) | 역순 광학 이성체 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물 | |
| FR2617169A1 (fr) | Nouveaux derives peptidiques et leur application notamment en therapeutique |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFA9 | Temporary protection cancelled due to abandonment |