MX2014013915A - Portadores para el suministro mejorado de farmaco. - Google Patents

Portadores para el suministro mejorado de farmaco.

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Abstract

La invención proporciona portadores que mejoran absorción, vida media o biodisponibilidad de compuestos terapéuticos. Los portadores comprenden grupos de enfoque que unen la proteína de unión de Vitamina D (DBP), grupos de conjugación para acoplar los grupos de enfoque a los compuestos terapéuticos, y opcionalmente porciones de andamiaje.

Description

PORTADORES PARA EL SUMINISTRO MEJORADO DE FARMACO CAMPO DE LA INVENCION El campo de la invención proporciona la composición y uso general de portadores, conjugados, fusiones o formulaciones de compuestos terapéuticos para el propósito de aumentar la potencia, absorción, biodisponibilidad o vida media en circulación de los compuestos al mejorar propiedades farmacocinéticas in vivo .
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La invención se refiere a mejorar la potencia, absorción o propiedades farmacocinéticas de compuestos terapéuticos. La adición de poli(etilenglicol) o (PEG) es un método conocido para aumentar la vida media de algunos compuestos al reducir eliminación renal, reducir agregación , y disminuir reconocimiento inmune potencialmente no deseado (Jain, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 25:403-447 (2008)). El PEG típicamente se utiliza en un tamaño considerablemente grande (20-40 Da) para maximizar la vida media en circulación. Esto puede lograrse al utilizar cualquiera de un PEG grande individual o múltiples PEG más pequeños fijados al compuesto. Clark y otros J. Biol. Chem . 271 : 21969-21977 (1996); Fishburn, J . Pharm. Sci . 97:4167-4183 (2008)).
La absorción es un enfoque primario en el desarrollo de fármaco y química medicinal ya que un fármaco debe ser absorbido antes que pueda llevarse a cabo cualquiera de los efectos medicinales. El perfil farmacocinetico del fármaco puede ser afectado por muchos factores. Adicionalmente, las propiedades de absorción de compuestos terapéuticos varían significativamente de compuesto a compuesto. Algunos compuestos terapéuticos son absorbidos de manera deficiente después de administración oral o dérmica. Otros compuestos terapéuticos tales como la mayoría de los terapéuticos basados en péptido y proteína, no pueden administrarse oralmente. Rutas alternas de administración tales como inyecciones intravenosas, subcutáneas, o intramusculares se utilizan comúnmente para algunos de los compuestos; sin embargo, estas rutas frecuentemente resultan en absorción y exposición lentas de los compuestos terapéuticos a enzimas que pueden degradarlos, requiriendo de esa forma dosis muy superiores para lograr eficacia.
Se ha identificado un número de péptidos como terapéuticamente prometedores. Las propiedades químicas y biológicas de péptidos y proteína los hacen candidatos atractivos para uso como compuestos terapéuticos. Péptidos y proteínas son moléculas que ocurren naturalmente compuestos de aminoácidos y están involucrados en numerosos procesos fisiológicos. Los péptidos y proteínas presentan un alto grado de selectividad y potencia, y pueden no sufrir de interacciones fármaco-fármaco adversas potenciales u otros efectos secundarios negativos. De esa forma los péptidos y proteínas mantienen una gran promesa como una clase altamente diversa, altamente potente, y altamente selectiva de compuestos terapéuticos con baja toxicidad. Sin embargo, los péptidos y proteínas pueden tener vidas medias in vivo cortas. Para tales péptidos, estos pueden ser algunos minutos. Esto puede hacerlos imprácticos, en su forma nativa, para administración terapéutica. Adicionalmente, los péptidos pueden tener una duración corta de acción o biodisponibilidad pobre.
El factor de crecimiento de fibroblasto 21 (SEC I D NO: 2) es una proteína que circula en suero. Codificado por el gen FGF21 , es un miembro de una familia de factores de crecimiento de fibroblasto atípicos (FGF), que incluyen FGF 19 y FGF23. Carece del dominio de enlace de heparina de FGF convencional. Los miembros de familia de FGF poseen actividades mitogénicas amplias y de supervivencia de célula y están involucradas en una variedad de procesos biológicos incluyendo desarrollo embrionario, crecimiento celular, morfogénesis, reparación de tejido, crecimiento de tumor e invasión. FGF21 es inducido específicamente por actividad de HMGC2. FGF21 simula la captación de glucosa en adipocitos pero no en otros tipos de célula. Este efecto es aditivo a la actividad de insulina.
Estudios in vitro indican que FGF21 prefiere enlace al complejo receptor de FGFR1 c/b-Klotho sobre aquellos que contienen otros isotipos de FGFR (Kliewe y Mangelsdorf, Am . J. Clin. Nutr. 91 :254S-257S (2010)). FGF21 promueve captación de glucosa para adipocitos in vitro. La administración de FGF21 a animales diabéticos reduce niveles de glucosa circulantes mientras FGF21 excedente no induce hipoglucemia como se observa con la administración excesiva de insulina (Kharitonenkov y Shanafelt, Curr. Opin. I nvestig, Drugs 10: 359-364 (2009)). Por lo tanto, FGF21 es una proteína terapéutica prometedora para el tratamiento de diabetes. FGF21 , sin embargo, se administró frecuentemente para ver beneficios terapéuticos en un modelo animal (Kharitonenkov y otros, J. Clin. I nvest. 1 15: 1627-1635 (2005)). FGF21 en su estado natural tiene una vida media extremadamente corta en suero (1.1 horas) haciendo la adición exógena de FGF21 en su estado natural no clínicamente práctica como un tratamiento (ver WO03/01 1213). Adicionalmente, FGF21 exhibe biodisponibilidad deficiente cuando se inyecta subcutáneamente. En un estudio farmacocinético comparativo, se inyectó 1 mg/kg de FGF21 ya sea intravenosamente (IV) o subcutáneamente (SC) y la concentración de FGF21 se analizó con el tiempo. Los resultados mostraron una reducción significativa en biodisponibilidad utilizando una ruta de administración subcutánea (Cmax 73 nM) comparada con la ruta de intravenosa (Cmax de 1890 nM; ver Cuadro 1 en Xu J y otros, 2009. Am J Physiol Endocrinol Metab 297: E1 105-E 1 1 14). Las referencias anteriores se incorporan aquí por referencia en su totalidad.
El péptido de ghrelina (SEC I D NO: 5) es secretado naturalmente del estómago en mamíferos en circulación para estimular apetito y liberación de hormona de crecimiento. La ghrelina estimula la liberación de hormona de crecimiento (GH) de la glándula pituitaria a través del receptor celular GHS-R y juega papeles importantes en homeostasis de energía. Además, la ghrelina actúa directamente sobre el sistema nervioso central para disminuir actividad de nervios simpáticos. Los receptores de ghrelina (GHS-R) están concentrados en la unidad de hipotálamo-pituitaria. GHS-R está distribuido en tejidos periféricos, incluyendo el primer corazón, pulmón, hígado, riñón, páncreas, estómago, intestinos delgado y grueso, células adiposas e inmunes.
La ghrelina se ha utilizado terapéuticamente para aumentar peso y masa corporal magra en pacientes que sufren de caquexia o pérdida de presión voluntaria resultante de una enfermedad crónica tal como cáncer (Hiura y otros, Cáncer Enero 26, 2012, http://onlinelibrary.wilcy.eom/10, 1002/encr.2740/anstract) . Ghrelina, sin embargo, tiene una vida media naturalmente corta de 1 1 minutos en seres humanos (Akamizu y otros, Eur J Endocrinol 150:447-55 (2004)) y de esa forma debe dosificarse frecuentemente para ver efectos terapéuticos.
Infliximab (Remicade®, Janssem Biotech Inc. , patente de E. U.A. No. US 5,919,452 y US 2002/0141996, incorporadas aquí por referencia en su totalidad) es un anticuerpo monoclonal que une factor de necrosis de tumor alfa (TNF-a, SEC I D NO: 10) que se utiliza para tratar enfermedades autommunes. Infliximab se aprobó por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de E. U.A. para el tratamiento de psoriasis, enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, artritis psoriática, artritis reumatoide, y colitis ulcerante. TNF-a es un mensajero químico (citosina) y una parte clave de la región autommune. Inflixímab se administra intravenosamente por un profesional de cuidado de la salud y no se prueba para dosificación subcutánea.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención proporciona portadores que mejoran la absorción, estabilidad, vida media, duración de efecto, potencia, o biodisponibilidad de compuestos terapéuticos. Los portadores comprenden grupos de enfoque que unen la proteína de unión de Vitamina D (DBP) , grupos de conjugación para acoplar los grupos de enfoque a los compuestos terapéuticos, y porciones de andamiaje opcionales. En una modalidad de la invención, el grupo de enfoque es vitamina D, un análogo de vitamina D, un metabolitos relacionado con vitamina D, un análogo de un metabolito relacionado con vitamina D, un péptido que une DBP, un anticuerpo anti-DBP, un derivado de anticuerpo anti-DBP, un aptámero de nucleótido que une DBP, o una molécula basada en carbono pequeña que une DBP.
En otra modalidad, el grupo de acoplamiento es un grupo reactivo a amina, un grupo reactivo a tiol, un grupo de maleimida, un grupo tiol, un grupo aldehido, un grupo NHS-éster, un éster 4-nitrofenilo, un acilimidazol, un grupo haloacetilo, un grupo yodoacetilo, un grupo bromoacetilo, un grupo de SMCC , un grupo sulfo SMCC , un grupo carbodiimida y entrelazadores bifuncionales tal como NHS-Maleimido o combinaciones de los mismos. Los grupos de acoplamiento de la invención pueden promover enlaces de tiol, enlaces de amida, enlaces de oxíma, enlaces de hidrazona, enlaces de tiazolidinona o utiliza reacciones de ciclo-adición (por ejemplo, química de clic) para acoplar el portador o grupo de enfoque a un compuesto terapéutico.
En otra modalidad, el portador farmacéutico además comprende una porción de andamiaje, que comprende poli(etilenglicol), polilisina, polietilenimina, poli(propilenglicol), un péptido, albúmina de suero, tiorredoxina, una inmunoglobulina, un aminoácido, un ácido nucleico, un glicano, un grupo modificador que contiene un enlace alternativo, un polímero soluble en agua, un enlazador de cadena de carbono pequeño, o una porción terapéutica adicional.
En otra modalidad, la porción de andamiaje esta entre aproximadamente 100 Da. y 200,000 Da. En modalidades preferidas, la porción de andamiaje está entre aproximadamente 100 Da. y 20.000 Da. , 200 Da. y 15,000 Da. , 300 Da. y 10,000 Da. , 400 Da. y 9.000 Da. , 500 Da. y 5,000 Da. , 600 Da. y 2,000 Da., 1000 Da. y 200.000 Da. , 5000 Da. y 100,000 Da. , 10,000 Da. y 80,000 Da., 20.000 Da. y 60,000 Da. , o 20,000 Da y 40,000 Da.
La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto terapéutico conjugado para fusionarse a, o formularse con un portador. El portador comprende un grupo de enfoque que une DBP y aumenta la absorción, biodisponibilidad, o vida media del compuesto terapéutico en circulación. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender dos o más compuestos terapéuticos conjugados a un portador individual. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender dos o más portadores conjugados a un compuesto terapéutico.
En una modalidad, el grupo de enfoque en la composición farmacéutica es vitamina D, análogo de vitamina D, metabolito relacionado con vitamina D, un análogo de un metabolito relacionado con vitamina D, un péptido que une DBP, un anticuerpo anti-DBP, un derivado de anticuerpo anti-DBP, un aptámero de nucleótido que une DBP, o una molécula basada en carbono, pequeña que une DBP.
En otra modalidad, la composición farmacéutica además comprende una porción de andamiaje. En una modalidad preferida, la porción de andamiaje es poli(etilenglicol), polilisina, polietilenimina, poli(propilenglicol), un péptido, albúmina de suero, tiorredoxina, una inmunoglobulina, un aminoácido, un ácido nucleico, un glicano, un grupo modificador que contiene un enlazador reactivo, un polímero soluble en agua, un enlazador de cadena de carbono pequeño, o un compuesto terapéutico adicional.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender moléculas pequeñas, entidades químicas, ácidos nucleicos, derivados de ácido nucleico, péptidos, derivados de péptido, proteínas que ocurren naturalmente, proteínas que no ocurren naturalmente, ácidos nucleicos de péptido (PNA), péptidos engrapados, morfolinos, fosforodiamidato morfollnos, fármacos antisentido, fármacos silenciadores basados en ARN, aptámeros glicoproteínas, enzimas, hormonas, citocinas, interferones, factores de crecimiento, factores de coagulación de sangre, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, derivados de anticuerpo, anticuerpos conjugados por toxina, efectores metabólicos, analgésicos, antipiréticos, agentes antiinflamatorios, antibióticos, agentes antimicrobianos, agentes antivirales, fármacos antifúngicos, fármacos músculo-esqueléticos, fármacos cardiovasculares, fármacos renales, fármacos pulmonares, fármacos de enfermedad digestiva, fármacos hematológicos, fármacos urológicos, fármacos de metabolismo, fármacos hepáticos, fármacos neurológicos, fármacos antidiabéticos, fármacos anti-cancerígenos, fármacos para tratar condiciones de estómago, fármacos para tratar condiciones de colon, fármacos para tratar condiciones de piel, o fármacos para tratar condiciones linfáticas.
En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende una proteína que tiene actividad de FGF21 que comprende una secuencia de aminoácido con al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC ID NO: 2. En otra modalidad preferida, el grupo de enfoque es vitamina D. En otra modalidad preferida, la porción andamiaje es poli(etilenglicol).
En una modalidad muy preferida, la invención contempla una composición farmacéutica que comprende una proteína que tiene actividad FGF21 que comprende una secuencia aminoácido con al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC I D NO: 2, una porción de andamiaje que es poli(etilenglicol), y un grupo de enfoque que es Vitamina D. En esta modalidad , el grupo de enfoque aumenta la absorción, biodisponibilidad, o la vida media del compuesto terapéutico en recirculación. En otra modalidad muy preferida, la invención contempla una composición farmacéutica que comprende una proteína que tiene actividad FGF21 y la secuencia de aminoácido de SEC I D NO: 2.
En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende una proteína que tiene actividad de ghrelina que comprende una secuencia de aminoácido con al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC I D NO: 5. En otra modalidad preferida, el grupo de enfoque es vitamina D. En otra modalidad preferida, la porción de andamiaje es poli(etilenglicol).
En una modalidad muy preferida, la invención contempla la composición farmacéutica que comprende una prote i na que tiene actividad de ghrelina que comprende una secuencia de aminoácido con al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC ID NO: 5, una porción de andamiaje que es poli(etilenglicol), y un grupo de enfoque que es Vitamina D. En esta modalidad, el grupo de enfoque aumenta la absorción, biodisponibilidad, o la vida media del compuesto terapéutico en circulación. En otra modalidad muy preferida, la invención contempla una composición farmacéutica que comprende proteína que tiene actividad de ghrelina y la secuencia aminoácido de SEC I D NO: 5.
En una modalidad, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo anti-TNF-a que une específicamente una proteina que tiene una secuencia de aminoácido de al menos una secuencia de 90% a SEC ID NO: 10. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-TNF-a específicamente enlaza una proteína que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 10. En otra modalidad preferida, el grupo de enfoque es vitamina D. En otra modalidad preferida, la porción de andamiaje es poli(etilenglicol).
En una modalidad muy preferida, la invención comprende un anticuerpo anti-TNF- que une específicamente una proteína que tiene una secuencia de aminoácido con al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC ID NO: 10, una porción de andamiaje que es poli(etilenglicol), y un grupo de enfoque que es Vitamina D. En esta modalidad, el grupo de enfoque aumenta la absorción, biodisponibilidad, o la vida media del compuesto terapéutico en circulación.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona portadores que incluyen aquellos de la Fórmula I: B— L1— S— L2— L3— C I en donde: B es un grupo de enfoque seleccionado de vitamina D, un análogo de vitamina D, un metabolito relacionado con vitamina D, un análogo de un metabolito relacionado con vitamina D, un péptido que une DBP, un anticuerpo anti-DBP, un derivado de anticuerpo anti-DBP, un aptámero de nucleótido que une DBP, o una molécula basada en carbono pequeña que une DBP; S es una porción de andamiaje, que comprende poli(etilenglicol), polilisina, polietilenimina, poli(propilenglicol), un péptido, albúmina de suero, tiorredoxina, una inmunoglobulina, un aminoácido, un ácido nucleico, un glicano, un grupo modificador que contiene un enlazador reactivo, ácido poliláctico, un polímero soluble en agua, un enlazador de cadena de carbono pequeña, o una porción terapéutico adicional; C es un grupo reactivo a amina, un grupo reactivo a tiol, un grupo de maleimida, un grupo de tiol, un grupo de disulfuro, un grupo aldehido, un grupo NHS-éster, un éster 4-nitrofenilo, una acilimidazol, un grupo haloacetilo, un grupo yodoacetilo, un grupo bromoacetilo, un grupo SMCC, un grupo sulfo SMCC, un grupo carbodiimida y entrelazadores bifuncionales tal como NHS-maleimido o combinaciones de los mismos; L1 y L2 son enlazadores independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -C(O)NH-, -HNC(O)-, -C(O)0-, -OC(O)-, -O-, -S-S-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- y -NH-. n es un número entero de 0-3; y o es un número entero de 0-3.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir un portador de la fórmula I: B— L1— S— L2— L3— C I que comprende el paso de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula la: B — COOH Ia con un compuesto de la fórmula Ib: Ib La presencia de un agente de acoplamiento de amida, en donde B, S, C, L2 y L3 se definen como anteriormente y L1 es -C(O) N H-.
En ciertas otras modalidades, la presente invención proporciona un método para producir un portador de la fórmula I: B— L1— S— L2— L3-C I que comprende el paso de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula la: B— COOH la con un compuesto de la fórmula le: H2N-S— L2-L3-COOR1 Ic La presencia de un agente de acoplamiento de amida, Hidrolizar una éster a un ácido carboxílico y, Convertir un ácido carboxílico a un éster interactivo, en donde B, S, L2, L3 y n y o se definen como anteriormente, L1 es -C(O)NH- y, R1 es alquiló de 1 a 6 átomos de carbono La invención proporciona un método para tratar a un paciente que necesita un compuesto terapéutico, que comprende administrar una cantidad efectiva de una o más de las composiciones farmacéuticas aquí descritas. Los compuestos terapéuticos ilustrativos incluyen moléculas pequeñas, entidades químicas, ácidos nucleicos, derivados de ácido nucleico, péptidos, derivados de péptido, proteínas que ocurren naturalmente, proteínas que no ocurren naturalmente, ácidos nucleicos de péptido (PNA), péptidos engrapados, morfolinos, fosforodiamidato morfolinos, fármacos antisentido, fármacos silenciadores basados en ARN , aptámeros, glicoproteínas, enzimas, hormonas, citocinas, interferones, factores de crecimiento, factores de coagulación de sangre, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, derivados de anticuerpo, anticuerpos conjugados por toxina, efectores metabólicos, analgésicos, antipiréticos, agentes anti-inflamatorios, antibióticos, agentes antimicrobianos, agentes antivirales, agentes antifúngicos, fármacos músculo-esqueléticos, fármacos cardiovasculares, fármacos renales, fármacos pulmonares, fármacos de enfermedad digestiva, fármacos hematológicos, fármacos urológicos, fármacos de metabolismo, fármacos hepáticos, fármacos neurológicos, fármacos antidiabéticos, fármacos anti-cancerígenos, fármacos para tratar condiciones de estómago, fármacos para tratar condiciones de colon, fármacos para tratar condiciones de piel, y fármacos para tratar condiciones linfáticas.
En métodos preferidos, el compuesto terapéutico es una proteína que tiene actividad de FGF21 que comprende una secuencia de aminoácido con al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC ID NO: 2. En otros métodos preferidos, el compuesto terapéutico es una proteína que tiene actividad de ghrelina que comprende una secuencia aminoácido con al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC ID NO: 5. En otros métodos preferidos, el compuesto terapéutico es un anticuerpo anti-TNF-a que une específicamente una proteína que tiene al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC I D NO: 10. En otros métodos preferidos, el grupo de enfoque es Vitamina D o el andamiaje es poli(etilenglicol) .
En otras modalidades y métodos, las composiciones farmacéuticas de la invención están en formulaciones farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse a pacientes mediante un modo transdérmico, oral, parenteral, subcutánea, intercutáneo, intravenoso, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intra-esternón, intratecal, intra-lesional, inyección intracraneal, infusión, inhalación, ocular, tópico, rectal, nasal, bucal, sublingual, vaginal, o depósito implantado.
La invención proporciona el uso de composiciones farmacéuticas descritas para la fabricación de medicamentos para el tratamiento de pacientes que necesitan los medicamentos.
La invención proporciona métodos de fabricación de las composiciones farmacéuticas aquí descritas que comprenden conjugar un grupo de enfoque y un fármaco en un compuesto de fármaco portador que utiliza grupos de acoplamiento. Los grupos de acoplamiento pueden ser grupos de acoplamiento reactivos a amina, grupos de acoplamiento de maleimida, grupos de acoplamiento de cisteína, grupos de acoplamiento de aldehido, o grupos de acoplamiento reactivos a tiol. La maleimida es un grupo de acoplamiento útil para uso en acoplamiento a grupos sulfhidrilo tal como un residuo de cisteína libre que puede ser diseñado específicamente de sitio en un péptido o proteína en una posición deseada. Otros grupos de acoplamiento tal como NHS que enfocan a grupos amina o aldehido que pueden utilizarse para fijar específicamente al sitio al término N de un compuesto terapéutico son bien conocidos por aquellos expertos en la téenica. Otros grupos de acoplamiento más especializado se contemplan y podrían sustituirse por un experto en la técnica.
En algunos métodos, el grupo de enfoque es vitamina D, un análogo de vitamina D, un metabolíto relacionado con vitamina D, un análogo de un metabolíto relacionado con vitamina D, un péptido que une DBP, un anticuerpo anti-DBP, un derivado de anticuerpo anti-DBP, un aptámero de nucleótido que une DBP, o una molécula basada en carbono pequeño que une DBP.
Otras modalidades, los métodos para fabricar composiciones farmacéuticas además comprenden conjugar una porción de andamiaje al grupo de enfoque o fármaco. La porción de andamiaje puede ser pol i (etileng I icol) , polilisina, polietilenimina, poli(propilenglicol), un péptido, albúmina de suero, tiorredoxina, una inmunoglobulina, un aminoácido, un ácido nucleico, un glicano, un grupo modificador que contiene un enlazador activo, un polímero soluble en agua, un enlazador de cadena de carbono pequeño, o un compuesto terapéutico adicional.
DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1 : Diagrama esquemático que muestra la estructura general de un portador acoplado a un fármaco. El portador comprende un grupo de enfoque, un andamiaje, y opcionalmente un grupo de acoplamiento.
Figura 2: Esquema de reacción que muestra las estructuras químicas y síntesis utilizadas para generar un portador, un aducto de Vitamina D3-PEG-Maleimida. El portador se generó al conjugar 1 ) un análogo de Vitamina D (el grupo de enfoque), 2) un andamiaje de PEG, y 3) un grupo de acoplamiento de maleimida.
Figura 3: Biodisponibilidad y farmacocinética de un conjugado de portador FGF21. FGF21 solo (SEC ID NO: 3) o conjugado para el portador de Vitamina D3-PEG-Maleimida se inyectó subcutáneamente en ratas Sprague Dawlcy a 0.1 mg/kg. Se analizaron muestras de plasma para concentración de FGF21 por ELISA por duplicado y un promedio de 3-5 animales por punto de tiempo se gráfico en la gráfica de trazo de semi-logaritmo.
Figura 4: Farmacocinética de conjugado de portador de ghrelina. Ghrelina (SEC ID NO: 6) sola o conjugada con el portador de Vitamina D3-PEG-Maleimida se inyectó intravenosamente en ratas Sprague Dawlcy a 0.1 mg/kg . Se analizaron muestras de plasma para concentración de ghrelina por ELI SA en duplicado en un promedio de 3-5 animales por punto de tiempo se graficaron en la gráfica de retraso de semi-logaritmo.
Figura 5: Esquema de reacción que muestra las estructuras y síntesis químicas utilizadas para generar otro portador, un aducto de Vitamina D3-PEG-NHS. El portador se generó al conjugar 1 ) un análogo de Vitamina D (el grupo de enfoque), 2) un andamiaje de PEG, y 3) un grupo de acoplamiento NHS.
Figura 6: Biodisponibilidad y farmacocinética de un conjugado de portador de infliximab. Infliximab sólo o conjugado con el portador de Vitamina D3-PEG-NHS se inyectó subcutáneamente en ratas Sprague Dawley a 1 mg/kg . Se analizaron muestras de plasma por concentración de infliximab por un Elisa específico de infliximab y se gráfico un promedio de tres animales por punto de tiempo en una gráfica de trazo lineal.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención proporciona moléculas que están unidas covalentemente a, fusionadas a o formuladas con proteínas terapéuticas, péptidos, ácidos nucleicos o moléculas pequeñas para el propósito de mejorar la potencia, absorción, biodisponibilidad, vida media circulante o propiedades farmacocinéticas de los compuestos terapéuticos. En ciertas modalidades, los portadores comprenden un grupo de enfoque, un andamiaje, y un grupo de acoplamiento. En otras modalidades, los portadores carecen de un andamiaje, que actúa, entre otras cosas, como un “separador” entre el grupo de enfoque y el compuesto terapéutico.
Los portadores están diseñados para ser adecuados para usarse en seres humanos y animales. Los portadores sirven para el propósito de mejorar las propiedades farmacocinéticas de una entidad biológica o química que está acoplada a, conjugada para, fusionada a, o formulada con el portador. Esto ocurre a través de la interacción del grupo de enfoque con proteína de unión de vitamina D (DBP), que pueden transportar activamente molécula rápida y efectivamente desde el sitio de administración hacia el plasma de circulación, reduciendo con ello exposición el fármaco a enzimas degradantes. Los portadores, al enlazarse a DBP, también mejoran la vida media de circulación del fármaco, aumentando de esa forma la potencia y eficacia terapéutica del fármaco al prevenir filtración renal. Métodos para conjugar el portador a compuestos terapéuticos aquí descritos son conocidos en la téenica. A manera de ejemplo, la conjugación utilizando los grupos de acoplamiento de la invención puede llevarse a cabo utilizando las composiciones y métodos descritos en WO93/012145 (Atassi y otros) y 7,803,777 (Defrees y otros), cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.
Describir y reclamar una o más modalidades de la presente invención, se utilizará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones descritas a continuación.
El término “absorción” es el movimiento de un fármaco en la corriente sanguínea. Un fármaco necesita introducirse a través de alguna ruta de administración (por ejemplo oral, tópica o dérmica) o en una forma de dosificación específica tal como una tableta, cápsula o líquido. Terapia intravenosa, inyección intramuscular, y nutrición enteral proporciona al menos variabilidad en absorción y biodisponibilidad que frecuentemente está cerca de 100%. La ruta más rápida de absorción es inhalación.
Un “antagonista” se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, revocar, reducir o interferir con las actividades de una proteína particular o especificada, incluyendo su enlace de uno o más receptores en el caso de un ligando, o enlace a uno o más lejanos en el caso de un receptor. Los antagonistas incluyen anticuerpos y fragmentos de enlace antígeno de los mismos, proteínas, péptidos, glicoproteínas, glicopéptidos, glicolípidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, moléculas bio-orgánicas, péptidos mimétícos, agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control de transcripción y traslación, y similares. Los antagonistas también incluyen inhibidores de molécula pequeños de proteínas, hormonas, u otras moléculas bioactivas. Antagonistas pueden ser proteína de fusión, moléculas de receptor, moléculas antisentido, aptámeros, ribozimas, y derivados que se enlazan específicamente a las proteínas, hormonas, u otras moléculas bioactivas y con ello secuestran su enlace a su objetivo.
“Anticuerpos” (Abs) e “inmunoglobulinas” (Igs) se refieren a glicoproteínas que tienen características estructurales similares. Aunque los anticuerpos exhiben especificidad de enlace a un antígeno específico, inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpo que generalmente carecen de especificidad de antígeno. Polipéptidos del último tipo son, por ejemplo, producidos a bajos niveles por el sistema linfático y a niveles aumentados por mielomas.
“Aptámeros” son compuestos basados en ácido nucleico que han sido seleccionados para enlazarse a un objetivo específico. Un ejemplo de un compuesto terapéutico basado en el aptámero puede encontrarse en WO07/035922, incorporado aquí por referencia en su totalidad.
El término “biodisponibilidad” se refiere a la fracción de una dosis administrada de fármaco no cambiado que alcanza la circulación sistémica, una de las propias farmacocinéticas principales de fármacos. Cuando se administra un medicamento intravenosamente, su biodisponibilidad es 100%. Cuando se administra un medicamento a través de otras frutas (tal como oralmente), su biodisponibilidad generalmente disminuye (debido a absorción incompleta y metabolismo de primer paso) o puede variar de paciente a paciente. La biodisponibilidad es un parámetro importante en farmacocinetica que se considera cuando se calculan dosificaciones para rutas no intravenosas de administración.
“Portadores” son compuestos que pueden ser conjugados a, fusionados a, acoplados a o formulados con compuestos terapéuticos para mejorar la absorción, vida media, biodisponibilidad, propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas de los fármacos. Comprenden un grupo de enfoque, un grupo de acoplamiento, y opcionalmente, una porción de andamiaje.
Una “cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un compuesto terapéutico que es efectivo, en dosis y por períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una “cantidad terapéuticamente efectiva” de un compuesto terapéutico puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad de que el anticuerpo obtenga una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede medirse, por ejemplo, por índice de supervivencia mejorado, recuperación más rápida, mejora o eliminación de síntomas, u otros biomarcadores aceptables o marcadores sustitutos. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del compuesto terapéutico es sobrepasado por los efectos terapéuticamente benéficos. Una “cantidad profilácticamente efectiva” se refiere a una cantidad de compuesto terapéutico que es efectiva, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típica pero no necesariamente, ya que se utiliza una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa temprana de enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.
“Vida media” es un término científico conocido en la téenica que se refiere a la cantidad de tiempo que transcurre cuando ya no se detecta la mitad de la cantidad de una molécula de prueba. Una vida media in vivo se refiere al tiempo transcurrido cuando ya no se puede detectar la mitad de la molécula de prueba en suero en circulación o tejidos de un ser humano o animal.
Una “hormona” es un mensajero biológico o químico desde una célula (o grupo de célula) a otra célula que tiene capacidad de señalización. Como se describe aquí, las hormonas para uso en la invención pueden ser péptidos con esferoides, fero onas, interleucinas, linfocinas, cito ciñas, o miembros de otras clases de hormona conocidas en la técnica.
“Homólogos” o moléculas bioactivas que son similares a una molécula de referencia en la secuencia de nucleótido, secuencia de péptido, nivel funcional, o estructural. Los homólogos pueden incluir derivados de secuencia que comparten cierta identidad de porcentaje con la secuencia de referencia. De esa forma, en una modalidad, secuencias de homólogos o derivados comparten al menos 70% de identidad de secuencia. En una modalidad preferida, secuencias homologas o derivadas comparten al menos 80% u 85% de identidad de secuencia. En una modalidad preferida, secuencias homologas o derivadas comparten al menos una identidad de secuencia de 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99%. Secuencias de ácido nucleico homologas o derivadas también pueden definirse por su capacidad para permanecer unidas a una secuencia de ácido nucleico de referencia bajo condiciones de hibridización de alto rigor. Los homólogos que tienen una similitud estructural o funcional a una molécula de referencia pueden ser derivados químicos de la molécula de referencia. En la téenica se conocen métodos para detectar, generar, y filtrar homólogos estructurales y funcionales así como derivados.
“Hibridización” generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para recocerse cuando están presentes cadenas complementarias en un ambiente bajo su temperatura de fusión. Entre mayor sea el grado de homología deseada entre la sonda y secuencia que se puede hibridizar, mayor será la temperatura relativa que puede utilizarse. Como un resultado, continúa que temperaturas relativas superiores tenderán hacer las condiciones de reacción más estrictas, mientras temperaturas inferiores las disminuyen. Para detalles adicionales y explicación de rigor de reacciones de hibridización, ver Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, Wilcy Interscience Publishers, (1995).
Un “individuo”, “sujeto” o “paciente” es un vertebrado. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero. Mamíferos incluyen, pero no están limitados a, primates (incluyendo primates humanos y no humanos) y roedores (por ejemplo, ratones, hámsteres, conejillos de indias, y rata). En ciertas modalidades un mam ífero es un humano. Un “sujeto de control” se refiere a un sujeto saludable que no se ha diagnosticado como teniendo una enfermedad, disfunción, o condición que se haya identificado en un individuo, sujeto, o paciente. Un sujeto de control no sufre ningún signo o síntoma asociado con la enfermedad, disfunción, o condición.
Un “medicamento" es un fármaco activo que ha sido fabricado para el tratamiento de una enfermedad, trastorno, o condición.
“Morfolinos” son moléculas sintéticas que son variantes no naturales de ácidos nucleicos naturales que utilizan un enlace de fosforodiamidato, descrito en la patente de E. U.A. No. 8,076,476 incorporada aquí por referencia en su totalidad. “Ácidos nucleicos” son cualquiera de un grupo de macromoléculas, ya se ADN, ARN, o variantes de las mismas, que transportan información genética que pueden dirigir funciones celulares. Los ácidos nucleicos pueden tener actividad similar a enzima (por ejemplo ribozimas) o pueden utilizarse para inhibir expresión de gen en un sujeto (por ejemplo ARNi). Los ácidos nucleicos utilizados en las invenciones aquí descritas pueden ser de cadena individual, cadena doble, lineal o circular. Las invenciones además incorporan el uso de las variantes de ácido nucleico incluyendo pero no limitadas a, aptámeros, PNA, morfolina u otros variantes no naturales de ácidos nucleicos. A manera de ejemplo, los ácidos nucleicos útiles para la invención se describen en la Patente de E. U.A. No. 8,076,476, incorporados aquí por referencia en su totalidad.
“Respuesta de paciente” o “respuesta" puede evaluarse utilizando cualquier punto final que indica un beneficio al paciente, incluyendo, sin limitación, (1 ) inhibición, a cierto grado del progreso de enfermedad, incluyendo y desaceleración y paro completo; (2) reducir el número de episodios de enfermedad y/o síntomas, (3) inhibición (es decir, reducción, desaceleración o paro completo) de una infiltración de célula de enfermedad dentro de órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (4) inhibición (es decir, reducción, desaceleración o parada completa) de dispersión de enfermedad; (5) disminución de una condición autommune; (6) cambio favorable en la expresión de un biomarcador asociado con el trastorno, (7) alivio, cierto grado de uno o más síntomas asociados con un trastorno; (8) aumento en la longitud de presentación y de una enfermedad después de tratamiento; o (9) mortalidad disminuida en un punto de tiempo dado después de tratamiento.
Como se utiliza aquí, el término “péptido” es cualquier péptido que comprende dos o más aminoácidos. El término péptido incluye péptidos cortos (por ejemplo, péptidos que comprenden entre 2-14 aminoácidos), péptidos de longitud media (15-50) o péptidos de cadena larga (por ejemplo, proteínas). Los términos péptido, péptido de longitud media y proteína pueden utilizarse aquí intercambiablemente. Como se utiliza aquí, el término “péptido” es interpretado para significar un polímero compuesto de residuos de aminoácido, variantes estructurales que ocurren naturalmente relacionadas, y análogos que no ocurren naturalmente sintéticos de los mismos enlazados a través de enlace de péptido, variantes estructurales que ocurren naturalmente relacionadas, y análogos que no ocurren naturalmente sintéticos de los mismos. Pueden sintetizarse péptidos sintéticos, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptido automatizado. También pueden sintetizarse péptidos por otros medios tal como por células, bacterias, levaduras, u otros organismos vivos. Péptidos pueden contener aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos codificados por gen. Los péptidos incluyen aquellos modificados ya sea por procesos naturales, tal como procesamiento y otras modificaciones pos-traslación, pero también por téenicas de modificación química. Tales modificaciones son bien descritas en textos básicos y en monográficos más detallados, y son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las modificaciones ocurren en cualquier lugar en un péptido incluyendo la estructura de péptido, las cadenas laterales de aminoácido, y los términos amino o carboxilo.
Como se utiliza aquí, un “portador farmacéuticamente aceptable" o “portador terapéutico efectivo” es acuoso o no acuoso (sólido), por ejemplo alcohólico u oleaginoso, una mezcla de los mismos, y puede contener un tensoactivo, emoliente, lubricante, estabilizador, tinte, perfume, conservador, ácido o base para ajuste de pH, solvente, emulsionante, agente gelificante, humectante, estabilizador, agente humectante, agente de liberación de tiempo, humectante, u otro compuesto comúnmente incluido en una forma particular de composición farmacéutica. Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la téenica e incluyen, por ejemplo soluciones acuosas tales como agua o solución salina fisiológicamente regulada en su pH u otros solventes o vehículos tal como glicoles, glicerol, y aceites tal como aceite de olivo u esteres orgánicos inyectables. Un portador farmacéuticamente aceptable puede contener compuestos fisiológicamente aceptables que actúan, por ejemplo, para estabilizar o para aumentar la absorción de inhibidor específico, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa o dextranas, antioxidantes tales como ácidos ascórbico o glutatión, agentes quelatadores, proteínas de bajo peso molecular u otros estabilizadores o excipientes.
El término “farmacocinética” actualmente se define como el curso de tiempo de la absorción, distribución, metabolismo, excreción de un compuesto terapéutico. “propiedades farmacocinéticas” mejoradas se definen como: mejorando una o más de las propiedades farmacocinéticas como se desee para un compuesto terapéutico particular. Ejemplos incluyen pero están limitados a: reducir eliminación a través de metabolismo o secreción , aumentar absorción de fármaco, aumentar vida media, y/o aumentar biodisp o oibilidad.
“PN A” se refiere a ácidos nucleicos de péptido con una estructura química similar a ADN o ARN. Los enlaces de péptido se utilizan para enlazar los nucleótidos o nucleósidos juntos.
“Andamiajes” son moléculas a las cuales otras moléculas pueden unirse o formularse covalente o no covalentemente. Los andamiajes de la invención pueden actuar como “separadores” o “enlazadores” entre el grupo de enfoque y el fármaco. Los andamiajes también pueden contener un enlazador reactivo o pueden tener propiedades terapéuticas benéficas además del fármaco. De esa forma, los andamiajes de la invención pueden ser, por ejemplo, PEG, albúmina de suero, tiorredoxina, una inmunoglobulina, un grupo modificador que contiene un enlazar reactivo, un polímero soluble en agua, o un compuesto terapéutico.
“Rigor o severidad” de reacciones de hibridización se puede determinar fácilmente por un experto en la téenica, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de longitud de sonda, temperatura de lavado, y concentración de sal. En general , sondas más largas requieren temperaturas superiores para recocido apropiado, mientras sondas más cortas necesitan temperaturas inferiores “Condiciones estrictas o severas” o “condiciones de alto rigor” como se definen aquí, pueden identificarse por aquellos que: ( 1 ) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo. 0.015 M de cloruro de sodio/0.0015 M de citrato de sodio/0.1 % de dodecilsulfato de sodio a 50°C; (2) emplean durante hibridización un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50% (p/v) de formamida con 0.1 % de albúmina de suero bovino/0.1 % de Ficoll/0.1 % de polivinilpirrolidona/50 mM de amortiguador de fosfato de sodio a pH 6.5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42°C; o (3) hibridización durante la noche en una solución que emplea 30% de formamida, 5 x SSC (0.75 M NaCI, 0.075 M de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6.8), 0.1 % de pirofosfato de sodio, solución 5 x Denhardt, ADN de esperma de saimón sonicado (50 mI/ml), 0.1 % de SDS, y 10% de sulfato de dextrana a 42°C, con un lavado de 10 minutos a 42°C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) seguido por un lavado de alto rigor de 10 minutos que consiste de 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55°C.
Los “compuestos terapéuticos” aquí descritos se refieren a moléculas pequeñas, entidades químicas, ácidos nucleicos, derivados de ácido nucleico, péptidos, derivados de péptido, proteínas que ocurren naturalmente, proteínas que no ocurren naturalmente, glicoproteínas, y esteroides que se administran a sujetos para tratar una enfermedad o disfunciones o de otra forma afectan la salud de individuos. Ejemplos no limitantes de compuestos terapéuticos incluyen polipéptidos tales como enzimas, hormonas, citocinas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, derivados de anticuerpo, fármacos que afectan función etabólica, así como compuestos orgánicos tales como analgésicos, antipiréticos, agentes anti-inflamatorios, antibióticos, compuestos antivirales, compuestos antifúngicos, fármacos cardiovasculares, fármacos que afectan función renal, metabolismo de electrólito, fármacos que actúan sobre el sistema nervioso central, compuestos quimioterapéuticos, agonistas receptores y antagonistas receptores. Los compuestos terapeuticos incluyen, por ejemplo, moléculas extracelulares tal como factores de suero incluyendo, pero no limitados a, proteínas de plasma tal como albúmina de suero, inmunoglobulinas, proteínas o transferrina, o proteínas encontradas sobre la superficie de eritrocitos o linfocitos. De esa forma, los compuestos terapéuticos ilustrativos incluyen moléculas pequeñas, entidades químicas, ácidos nucleicos, derivados de ácido nucleico, péptidos, derivados de péptido, proteínas que ocurren naturalmente, proteínas que no ocurren naturalmente, ácidos nucleicos de péptido (PNA), péptidos engrapados, fosforodiamidato morfolinos, fármacos antisentido, fármacos silenciadores basados en ARN, aptámeros, glicoproteínas, enzimas, hormonas, citocinas, interferones, factores de crecimiento, factor de coagulación de sangre, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, derivados de anticuerpo, anticuerpos conjugados de toxina, efectores metabólicos, analgésicos, antipiréticos, agentes antiinflamatorios, antibióticos, agentes antimicrobianos, agentes antivirales, fármacos antifúngicos, fármacos músculo-esqueléticos, fármacos cardiovasculares, fármacos renales, fármacos pulmonares, fármacos de liberación digestiva, fármacos hematológicos, fármacos urológicos, fármacos de metabolismo, fármacos hepáticos, fármacos neurológicos, fármacos antidiabéticos, fármacos anti-cancerígenos, fármacos para tratar condiciones de estómago, fármacos para tratar condiciones de colon, fármacos para tratar condiciones de piel, y fármacos para tratar condiciones linfáticas. El término “compuesto terapéutico” como se utiliza aquí tiene esencialmente el mismo significado que los términos “fármaco” o “agente terapéutico”.
Como se utiliza aquí, “tratamiento” se refiere a intervención química en un intento por alterar el curso natural del individuo o célula que se trata, y puede realizarse antes o durante el curso de patología clínica. Efectos deseables de tratamiento incluyen prevenir la ocurrencia o recurrencia de una enfermedad o una condición o síntoma de la misma, aliviar una condición o síntoma de la enfermedad, disminuir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, disminuir el índice de progreso de enfermedad, mejorar o mitigar el estado de enfermedad, y lograr remisión o pronóstico mejorado. En algunas modalidades, los métodos y composiciones de la invención son útiles en intentos para retrasar desarrollo de una enfermedad o trastorno.
Una “vitamina” es un término reconocido en la téenica y se define como una sustancia orgánica soluble en grasa o soluble en agua esencial en cantidades de minuto para crecimiento y actividad normal del cuerpo y se obtiene naturalmente de alimentos o complementos de planta y animal.
“Vitamina D” es un grupo de secoesteroides solubles en grasa. Existen varias formas (vitámeros) de vitamina D. Las dos formas principales son vitamina D2 o ergocalciferol, y vitamina D3 o colecalciferol. Vitamina D con un subíndice se refiere a cualquiera de D2 O D3 O ambos. En seres humanos, la vitamina D puede ingerirse como colecalciferol (vitamina D3) o ergocalciferol (vitamina D2).
Adicionalmente, los seres humanos pueden sintetizarla a partir de colesterol cuando la exposición al sol es adecuada.
“Proteína de unión de vitamina D” o “DBP” es una proteína de suero que circula naturalmente encontrada en todos los mamíferos que, entre otras actividades, pueden enlazarse a y transportar vitamina D y sus análogos a sitios en el hígado y riñón en donde se modifica la vitamina a su activa, y retiene vitamina D en sus varias formas de circulación para, en promedio, 30 días en seres humanos. Una secuencia de proteína DBP se describe en SEC I D NO: 7 y una secuencia de acción nucleico ilustrativa que codifica la secuencia de proteína DBP se describe en SEC I D NO: 8. DBP tiene múltiples isoformas que ocurren naturalmente. Las isoformas ilustrativas están disponibles en las bases de datos de secuencia pública (por ejemplo Acceso No. NM 001204306.1 , NM_001204307.1 , NM_000583.3, BC036003.1 , M 12654.1 , X03178.1 , AK223458, P_001 191235.1 , NP_000574.2, AAA61704.1 , AAD13872.1 , N P_001 191236.1 , AAA19662.2, 154269, P02774.1 , EAX05645.1 , AAH57228.1 , AAA52173.1 , AAB29423.1 , AAD 14249.1 , AAD14250.1 , y BAD97178.1 ) La invención contempla el uso de variantes y homólogos de DBP que contienen sustitutos de aminoácidos conservadores o no conservadores que retienen sustancialmente actividad DBP. Moleculas de enlace DBP o variantes DBP funcionales pueden identificarse utilizando téenicas conocidas y caracterizarse utilizando métodos conocidos (Bouillon y otros, J Bone Miner Res. 6(10): 1051 -7 (1991 ), Teegarden y otros, Anal. Biochemistry 199(2) :293-299 (1991 ), McLeod y otros, J Biol Chem. 264(2): 1260-7 (1989), Revelle y otros, J. Steroid Biochem. 22:469-474 ( 1985)). Las secuencias anteriores se incorporan aquí por referencia en su totalidad.
El término “soluble en agua” se refiere a porciones que tienen algún grado detectable de solubilidad en agua. Métodos para detectar y/o cuantificar solubilidad en agua son bien conocidos en la téenica. Polímeros solubles en agua ilustrativos incluyen péptidos, sacáridos, poli(ésteres), poli(aminas), ácidos poli(carboxílicos), y similares.
La invención proporciona rutas efectivas para administración de proteínas, péptidos, otros biológicos, ácidos nucleicos, y fármaco de molécula pequeña. La invención además proporciona rutas efectivas de administración de fármaco a través de modos transdérmicos, orales, parenterales, subcutáneos, intracutáneos, intravenosos, intramusculares, intra-articulares, intrasinoviales, intra-esternón, intratecal, ¡ntra-lesional, inyección intracraneal, infusión, inhalación, ocular, tópico, rectal, nasal, bucal, sublingual, vaginal, o de depósito implantado.
Además, las invenciones aquí descritas proporcionan composiciones y métodos para mantener actividad de enlace objetivo, es decir fármaco dinámica (PD), para compuestos terapéuticos. Además proporciona composiciones y métodos para mejorar los perfiles farmacocinéticos (PK) de compuestos terapéuticos como se describe aquí. La invención además proporciona composiciones y métodos para perfiles de absorción de fármaco mejorados cuando se compara con los perfiles- de absorción de fármaco para los fármacos que utilizan las mismas rutas de administración o diferentes rutas de administración pero sin las invenciones aquí descritas. La invención además proporciona composiciones y métodos para perfiles de biodisponibilidad de fármaco mejorados cuando se comparan con los perfiles de biodisponibilidad de fármaco para los fármacos que utilizan las mismas rutas de administración o diferentes rutas de administración pero sin las invenciones aquí descritas. La invención además proporciona composiciones y métodos para perfiles de vida media de fármaco mejorados cuando se comparan con los perfiles de vida media de fármaco para los fármacos que utilizan las mismas rutas de administración o diferentes rutas de administración pero sin las invenciones aquí descritas.
La invención también proporciona rutas alternativas de administración de fármaco que son más económicas y favorables para los pacientes cuando se comparan con los fármacos en las invenciones aquí descritas.
La invención proporciona composiciones y métodos para utilizar moléculas que sirven como portadores que pueden ser conjugados a, fusionados a, o formulados con compuestos terapéuticos activos para el propósito de mejorar la absorción, vida media, y biodisponibilidad, o propiedades fa-rmacocinéticas de los fármacos. Los portadores tienen las propiedades de enlace al DBP natural del cuerpo. Un aspecto de la invención proporciona uso del DBP natural para transportar el complejo de portador-fármaco desde el sitio de administración hacia el suero de circulación. Otro aspecto de la invención es el uso del DBP natural para retener un fármaco en circulación durante un periodo de tiempo extendido. Esto puede prevenir su extensión del cuerpo y aumentar la exposición del compuesto terapéutico en el cuerpo para lograr un efecto terapéutico más duradero. En otro aspecto de la invención, se requiere una dosis más pequeña de fármaco cuando se conjuga a, fusiona a, o formula con el portador, cuando se compara con el fármaco no conjugado, no fusionado o no formulado. Otro aspecto de la invención es el uso de un portador para reemplazar la función de un compuesto PEG mucho más grande cuando se compara con un compuesto terapéutico. Esto puede mejorar el perfil farmacocinético y eficiencia del compuesto conjugado, fusionado o formulado.
La invención proporciona una molécula portadora que preferiblemente está compuesta de uno o más partes de componentes. En una modalidad, el portador comprende un grupo de enfoque y un grupo de acoplamiento para unir el grupo de enfoque al compuesto terapéutico. En otra modalidad, el portador comprende una porción de andamiaje que está enlazada al grupo de enfoque y al compuesto terapéutico El grupo de enfoque es vitamina D, un análogo de vitamina D, un metabolito relacionado con vitamina D, un análogo de metabolito relacionado con vitamina D, u otra molécula que puede enlazarse a o interactuar con la proteína de unión de vitamina D (DBP). En una modalidad, el grupo de enfoque es un anticuerpo o derivado de anticuerpo, un péptido diseñado para enlazar DBP o un fragmento del mismo, un péptido derivado de una presentación de fago, u otra biblioteca de péptido seleccionada contra DBP o un fragmento del mismo, un aptámero de nucleótido que une DBP, una molécula pequeña diseñada para enlazar DBP o derivado de una biblioteca química seleccionada contra DBP, o un fragmento del mismo.
Los conjugados de portador de compuesto terapéutico de la invención típicamente tienen aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 grupos de enfoque unidos individualmente a un compuesto terapéutico. En una modalidad, el conjugado portador de la invención comprenderá aproximadamente cuatro grupos de enfoque unidos individualmente a un compuesto terapéutico, o aproximadamente tres grupos de enfoque unidos individualmente a un compuesto terapéutico, o aproximadamente dos grupos de enfoque unidos individualmente a un compuesto terapéutico, o aproximadamente un grupo de enfoque unido a un compuesto terapéutico. La estructura de cada uno de los grupos de enfoque unidos al compuesto terapéutico pueden ser los mismos o diferentes. En una modalidad preferida, uno o más grupos de enfoque se unen de manera estable al compuesto terapéutico en el término N de una proteína terapéutica. En otra modalidad preferida, uno o más grupos de enfoque se unen de manera estable a la proteína terapéutica en el término C de una proteína terapéutica. En otras modalidades preferidas, uno o más grupos de enfoque pueden unirse establemente a otros sitios sobre la proteína terapéutica. Por ejemplo, un conjugado de portador de compuesto terapéutico puede comprender un grupo de enfoque unido al término N y adicionalmente un grupo de enfoque unido a un residuo de lisina. En otra modalidad, un conjugado de portador de compuesto terapéutico tiene un grupo de enfoque unido a una proteína terapéutica a través de una modificación tal como un residuo de azúcar como parte de un sitio de glicosilación, o en un sitio de aislación de un péptido unido a un sitio de fosforilación u otras modificaciones naturales o no naturales que son familiares para un experto en la téenica. También se contemplan sitios de unión que utilizan una combinación de sitios mencionados anteriormente. Una modalidad preferida de la presente invención comprende un grupo de enfoque que está unido al compuesto terapéutico en un sitio específico en un compuesto terapéutico. En otra modalidad preferida, el sitio de unión sobre una proteína puede ser cisteína, lisina, el término N o término C.
En otra modalidad, el andamiaje es un portador farmacéuticamente aceptable. En modalidades preferidas, el andamiaje es poli(etilenglicol), polilisina, polietilenimina, poli(propilenglicol), un péptido, albúmina de suero, tiorredoxina, inmunoglobulina, un aminoácido, un ácido nucleico, un glicano, un grupo modificador que contiene un enlazador reactivo, un polímero soluble en agua, un enlazador de cadena de carbono pequeño, o una porción terapéutica adicional.
En una modalidad, porciones de andamiaje solubles en agua tiene algún grado detector de solubilidad en agua. Métodos para detectar y/o cuantificar solubilidad en agua son bien conocidos en la téenica. Polímeros solubles en agua ilustrativos incluyen péptidos, sacáridos, poli(éteres), poli(amina), ácidos poli(carboxílicos) y similares.
Los péptidos pueden tener secuencias mezcladas o estar compuestos de aminoácidos individuales, por ejemplo, poli(lisina), un polisacárido ilustrativo es ácido poli(siálico). Un poli(éter) ilustrativo es poli(etilenglicol), por ejemplo m-PEG. Poli(etilenimina) es una poliamida ilustrativa, y ácido poli(acrílico) es un ácido poli(carboxílico) representativo. La estructura de polímero del polímero soluble en agua puede ser poli(etilenglicol) (es decir PEG). Sin embargo, se debe entender que otros polímeros relacionados también son adecuados para uso en la práctica de esta invención y que el uso del término PEG o poli(etilenglicol) pretende ser inclusivo y no exclusivo con respecto a esto. El término PEG incluye poli(etilenglicol) en cualquiera de sus formas, incluyendo PEG alcoxi, PEG disfuncional , PEG de brazos múltiples, PEG en horquilla, PEG ramificado, PEG colgante (es decir PEG o polímeros relacionados que tienen uno o más grupos funcionales pendientes a la estructura de polímero), o PEG con enlaces degradables ahí. La estructura de polímero puede ser la línea modificada o ramificada.
Generalmente se conocen en la técnica estructuras de polímero ramificadas. Típicamente, un polímero ramificado tiene una porción de núcleo de rama central y una pluralidad de cadenas de polímeros lineales enlazadas al núcleo de ramificación central. PEG se utiliza comúnmente en formas ramificadas que se preparan por adición de óxido de etileno a varios polioles, tal como glicerol, pentaeritritol y sorbitol. La porción de rama central puede derivarse también de varios aminoácidos, tal como lisina. El poli(etilenglicol) ramificado puede representarse en forma general como R(-PEG-OH)m en donde R representa la porción de núcleo, tal como glicerol o pentaeritritol, y m representa el número de brazos. Moléculas de PEG de brazos múltiples, tales como aquellas descritas en la Patente de E. U.A. No. 5, 932,462, que se incorpora por referencia aquí en su totalidad, también puede utilizarse como la estructura de polímero.
Muchos otros polímeros también son adecuados para la invención. Las estructuras de polímero que no son peptídicas y solubles en agua, con desde 2 hasta aproximadamente 300 términos, son particularmente útiles en la invención. Ejemplos de polímeros adecuados incluyen, pero no están limitados a, otros poli(alquilenglicoles), tal como poli(propilenglicol) (“PPG”), copolímero de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli(poliol oxietilado), poli(alcohol olefínico), polivinilpirrolidona), polilisina, polietilenimina, poli(hidroxipropilmetacrilamida), poli(ácido a-hidroxi), poli(alcohol vinílico), polifosfaseno, polioxasolina, p o I i ( N -acriloilmorfolina), tal como se describe en la Patente de E. U.A. No. 5,629,384, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad, y colorímetros, terpolímeros, y mezclas de los mismos. Aunque el peso molecular de cada cadena de la estructura de polímero puede variar, típicamente está en el rango de aproximadamente 100 Da hasta aproximadamente 100,000 Da.
En otras modalidades, la porción de andamiaje puede ser un péptido, alúmina de suero, tiorredoxina, una inmunoglobulina, un aminoácido, un ácido nucleico, un glicano, un grupo modificador que contiene un enlazador reactivo, un polímero soluble en agua, un enlazador de carbono pequeño, o un compuesto terapéutico adicional. En una modalidad, las porciones de andamiaje, son no tóxicas para humanos y animales. En otra modalidad, los andamiajes son proteínas de suero endógenas. En otra modalidad, las porciones de andamiaje son polímeros solubles en agua. En otra modalidad, los andamiajes son polímeros que no ocurren naturalmente. En otra modalidad, los andamiaje son porciones que ocurren naturalmente que se modifican por fijación covalente a porciones adicionales (por ejemplo, PEG, poli(propilenglicol), poli(aspartato), biomoléculas terapéuticas, o porciones de diagnóstico).
El conjugado de polímeros hidrófilos, tal como PEG es conocido en la téenica. En su forma más común, PEG es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo: H0-CH2CH2O-(CH2CH20)n-CH2CH2— OH en donde n es típicamente varía desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 4000. En una modalidad preferida, el PEG tiene una distribución de peso molecular que es esencialmente homodispersa en otra modalidad preferida, el PEG es un polímero lineal. En otra modalidad preferida el PEG es un polímero ramificado.
Muchos derivados funcionalizados o ramificados de extremo de varios tamaños son conocidos en la téenica y comercialmente disponibles. A manera de ejemplo, el conjugado de PEG o PEO puede llevarse a cabo utilizando las composiciones y métodos aquí descritos y en la Patente de E. U.A. No. 7, 803, 777 Defrees y otros) y 4, 179,337 (Davis y otros), cada uno de los cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad.
En algunas modalidades, compuestos terapéuticos más pequeños son emparejados con porciones de andamiaje más pequeñas y compuestos terapéuticos más grandes son emparejados con porciones de andamiaje más grandes. Sin embargo, se contempla, que compuestos terapéuticos más pequeños podrían emparejarse con una porción de andamiaje más grande y viceversa. Compuestos terapéuticos más pequeños se definen como teniendo un peso molecular de 1 Da a 10kDa. Compuestos terapéuticos más grandes se definen como teniendo un peso molecular de 10kDa a 10OOkDa.
Los andamiaje de la presente invención, por ejemplo, podrían tener un peso molecular de Daltons (Da. ), 500 Da. , 1000 Da., 2000 Da. , 5000 Da. , 10, 000 Da. , 15,000 Da. , 20,000 Da. , 30,000 Da. , 40.000 Da. o 60,000 Da En una modalidad de la invención , porciones de andamiaje “pequeñas” pueden estar entre aproximadamente 100 Da. y 20,000 Da. En otra modalidad, porciones de andamiaje “grande” pueden ser mayores que aproximadamente 20.000 Da. a aproximadamente 200,000 Da. En modalidades preferidas, la porción de andamiaje está entre aproximadamente 100 Da. y 200,000 Da. En modalidades más preferidas, la porción de andamiaje está entre aproximadamente 100 Da. y 20,000 Da. , 200 Da. y 15,000 Da. , 300 Da. y 10,000 Da. , 400 Da. y 9,000 Da. , 500 Da. y 5,000 Da., 600 Da. y 2,000 Da. , 1000 Da. y 200,000 Da. , 20,00 Da. y 200,000 Da. , 100,000 y 200,000 Da. , 5000 Da. y 100,000 Da. , 10.000 Da. y 80,000 Da., 20,000 Da. y 60,000 Da. , o 20,000 Da. y 40.000 Da.
Otro componente de la molécula portadora preferiblemente comprende un grupo de acoplamiento que se utiliza para unir de manera covalente el fármaco para el andamiaje o el portador. Los grupos de acoplamiento de la invención incluyen un grupo reactivo a amina, un grupo reactivo a tiol, un grupo de maleimida, un grupo de tiol, un grupo aldehido, un grupo de éster NHS, un grupo acetilo, un grupo yodoacetílo, o grupos bromoacetilo, un grupo SMCC, un grupo sulfo SMCC, un grupo carbodiimida y entrelazadores disfuncionales tal como NHS-Maleimido combinaciones de los mismos, y otros grupos de acoplamiento familiares para aquellos expertos en la téenica. Los grupos de acoplamiento de la invención pueden promover enlaces de tiol, enlaces de amida, enlaces de oxina, enlaces de hidrazona, enlaces de tiazolidinona o utiliza reacciones de ciclo-adición también denominada química de clic para acoplar al portador a un compuesto terapéutico. En otra modalidad, la composición preferiblemente incluye una combinación de uno o más compuestos terapéuticos unidos al grupo de acoplamiento de la molécula de andamiaje.
Los grupos NHS son conocidos por aquellos expertos en la téenica como siendo útiles para acoplamiento a péptidos nativos y proteínas sin tener que diseñar en un sitio de fijación. Los grupos NHS permiten unión a la mayoría de las proteínas y péptidos que contienen aminoácidos y grupos amino tal como un residuo de lisina. La utilización de grupos NHS permite flexibilidad en el sitio de conjugado de portador como estructura de proteína de tiempo de reacción que pueden influenciar el sitio de unión y número de moléculas portadoras conjugadas para el compuesto terapéutico. A manera de ejemplo, controlar la relación molar de portador NHS a compuesto terapéutico, un experto en la técnica puede tener algún control sobre el número de moléculas portadoras unidas al compuesto terapéutico permitiendo de esa forma que se conjugue más de un portador a un compuesto terapéutico dado, si se desea.
La conjugación del portador a un compuesto terapéutico se logra al mezclar una solución de moléculas juntas en una relación molar específica utilizando soluciones compatibles, reguladores de pH o solventes. Por ejemplo, una relación molar de: 1, 2:1, 4:1, 5:1, 10: 1, 20:1, 25:1, 50:1, 100:1, 1000:1, o 1:2, 1:4, 1:5, 1:10, 1:20 1:25, 1:50, 1:100 o 1:1000 de portador a compuesto terapéutico podría utilizarse. En ciertas modalidades, una relación molar de: 1:1, 2:1, 4:1, 5:1, 10:1, 20:1, 25:1 o 1:2, 1:4, 1:5, 1:10, 1:20 1:25, 1:50 de portador de compuesto terapéutico podría utilizarse. En modalidades preferidas, una relación molar de 1:1, 2:1, 4:1, 5 1, 10:1 o 1 :2, 1 :4, 1 :5, 1 : 10 de portador a compuesto terapéutico podría utilizarse. Al variar la relación con esto podría resultar en diferentes números de portadores individuales unidos al compuesto terapéutico, o podría ayudar a seleccionar un sitio específico de unión. La unión de los portadores también es pH, amortiguador, sal y temperatura dependientes y variar estos parámetros entre otros parámetros que influencian el sitio de unión, el número de portadores unidos y la velocidad de la reacción. Por ejemplo, al seleccionar un pH para la reacción en o por abajo de pH 6 podría ayudar a conjugar selectivamente una versión de aldehido del portador al término N de la proteína péptido terapéutico.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona portadores que incluyen aquellos de la fórmula I: B— L1— S— L2— L3— C I en donde: B es un grupo de enfoque seleccionado de vitamina D, un análogo de vitamina D, un metabolito relacionado con vitamina D, un análogo de un metabolito relacionado con vitamina D, un péptido que une DBP, un anticuerpo anti-DBP, un derivado de anticuerpo anti-DBP, un aptámero de nucleótido que une DBP, o una molécula basada en carbono pequeña que une DBP; S es una porción de andamiaje, que comprende poli(etilenglicol), polilisina, polietileni ina, poli(propilenglicol), un péptido, albúmina de suero, tiorredoxina, una inmunoglobulina, un aminoácido, un ácido nucleico, un glicano, un grupo modificador que contiene un enlazador reactivo, ácido poliláctico, un polímero soluble en agua, un enlazador de cadena de carbono pequeña, o un compuesto terapéutico adicional; C es un grupo reactivo a amina, un grupo reactivo a tiol, un grupo de maleimida, un grupo de tiol, un grupo de disulfuro, un grupo aldehido, un grupo NHS-éster, un éster 4-nitrofenilo, una acilimidazol, un grupo haloacetilo, un grupo yodoacetilo, un grupo bromoacetilo, un grupo SMCC , un grupo sulfo SMCC, un grupo carbodiimida y entrelazadores bifunclonales tal como NHS-maleimido o combinaciones de los mismos; L1 y L2 son enlazadores independientemente seleccionados de -(CH2)„-, -C(O)NH-, -HNC(O)-, -C(O)0-, - OC(O)-, -O-, -S-S-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- y -NH-. n es un número entero de 0-3; y o es un número entero de 0-3.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir un portador de la fórmula l : B— L1— S— L2— L3-C I en donde: B es un grupo de enfoque seleccionado de vitamina D, un análogo de vitamina D, un metabolito relacionado con vitamina D, un análogo de un metabolito relacionado con vitamina D, o una molécula basada en carbono pequeña que une DBP; S es una porción de andamiaje, que comprende poli(etilenglicol), polilisina, poli(propilenglicol), un péptido, albúmina, albúmina de suero, un aminoácido, un ácido nucleico, un glicano, un grupo modificador que contiene un enlazador reactivo, ácido poliláctico, un polímero soluble en agua, un enlazador de cadena de carbono pequeña; C es un grupo de maleimida, un grupo de tiol, un grupo de disulfuro, un grupo aldehido, un grupo NHS-éster, un grupo yodoacetilo, o un grupo bromoacetilo; L1 y L2 son enlazadores independientemente seleccionados de -(CH2)„-, -C(O)NH-, -HNC(O)-, -C(O)0-, -OC(O)-, -O-, -S-, y -NH-; L3 es -(CH2)O-; n es un número entero de 0-3; y o es un número entero de 0-3.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir un portador de la fórmula I: B— L1— S— L2— L3— C I en donde: B es un grupo de enfoque seleccionado de vitamina D, un análogo de vitamina D, un metabolito relacionado con vitamina D; S es una porción de andamiaje, que comprende poli(etilenglicol), polilisina, polietilenimina, poli(propilenglicol); C es un grupo de maleimida, un grupo de tiol, un grupo de disulfuro, un grupo aldehido, un grupo NHS-éster, o un grupo yodoacetilo; L1 y L2 son enlazadores independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -C(O)NH-, -HNC(O)-, -C(O)0-, y -OC(O)-; L3 es -(CHZ)0-; n es un número entero de 0-3; y o es un número entero de 0-3.
En modalidades muy preferidas, la presente invención proporciona portadores que incluyen aquellos de las fórmulas l ia y II b: O O B X N-S-N A L3-C H H y Ha Hb en donde: B es un grupo de enfoque seleccionado de vitamina D, un análogo de vitamina D, o un metabolito relacionado con vitamina D; S es una porción de andamiaje, que comprende poli(etilenglicol), o poli(propilenglicol); y C es un grupo de maleimida, un grupo de bisulfuro, un grupo aldehido, un grupo NHS-éster o un grupo yodoacetilo; L2 es -<CH2)„-; L3 es -(CH2)0-; n es 1 ; y 0 es 2.
En ciertas modalidades muy preferidas de la fórmula l ia, B se representa por la fórmula ll l , S es poli(etilenglicol) y L3-C se representa por la fórmula IVa.
En ciertas modalidades muy preferidas de la fórmula l lb, B se representa por la fórmula III, S es poli(etilenglicol) y L2-C se representa por la fórmula IVb.
En ciertas modalidades muy preferidas, S está entre aproximadamente 100 Da. y 200,000 Da. En otras modalidades muy preferidas, la porción de andamiaje está entre aproximadamente 100 Da. y 20,000 Da. , 200 Da. y 15,000 Da. , 300 Da. y 10,000 Da. , 400 Da. y 9,000 Da. , 500 Da. y 5,000 Da. , 600 Da. y 2,000 Da. , 1000 Da. y 200,000 Da. , 5000 Da. y 100,000 Da., 10,000 Da. y 80,000 Da. , 20,000 Da. y 60,000 Da. , o 20,000 Da. y 40,000 Da.
En una modalidad específica, la presente invención proporción un portador representado por la fórmula V.
En otra modalidad específica, la presente invención proporciona un portador representado por la fórmula VI.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir un portador de la fórmula I : B — L1— S— L2— L3— C I que comprende el paso de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula la: B— COOH la con un compuesto de la fórmula I b: H2N— S— L2-L3-C Ib en presencia de un agente de acoplamiento de amida, en donde B, S, C y L2 se definen como anteriormente y L1 es -C(O)NH-.
Un experto en la téenica reconocerá que puede utilizarse un compuesto de la fórmula Ib como cualquiera de una base libre o como una forma de sal adecuada. Formas de sal adecuadas incluyen, pero no están limitadas a TFA, HCI, HBr, MsOH, TfOH y AcOH.
Cualquier agente de acoplamiento de amida adecuado puede utilizarse para formar un compuesto de la fórmula I. Los agentes de acoplamiento de amida adecuados incluyen, pero no están limitados a yoduro 2-clorometilpiridinio, BOP, PyBOP, HBTU, HATU, DCC, EDCI , TBTU y T3P. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza sólo. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza con un co-reactivo tal como HOBT o DMAP. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza como una base tal como trietilamina o diisopropiletilamina. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza tanto con un co-reactivo tal como HOBT o DMAP y una base tal como trietilamina o diisopropiletilamina. Un experto en la técnica reconocerá que pueden utilizarse co-reactivos diferentes a HOBT o DMAP. Además, un experto en la técnica reconocerá que pueden utilizarse bases diferentes a trietilamina o diisopropiletilamina.
En ciertas modalidades, el componente de ácido carboxílico de la fórmula la se produce al tratar un éster de la fórmula Id con un agente de hidrolización: B— COOR Id en donde, B se define como anteriormente y R es un grupo alquilo ramificado o no ramificado de 1 a 6 átomos de carbono.
Cualquier agente de hidrolización adecuado puede utilizarse para preparar un compuesto de la fórmula la de un compuesto de la fórmula Id.
En ciertas otras modalidades, la presente invención proporciona un método para producir un portador de la fórmula Ig: que comprende los pasos de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula la: B— COOH la con un compuesto de la fórmula le: H2N— s— L2— L3— COOR1 Ic en presencia de un agente de acoplamiento de amida que forma un compuesto de la fórmula I ; La hidrolización de un éster de la fórmula le a un ácido carboxílico de la fórmula If; y — — Convertir un ácido carboxílico en la forma le a un éster activo de la fórmula I ; — en donde B, S, C, R1 , L2, L3, n y o se definen como anteriormente y L1 es -C(O)NH-.
Un experto en la téenica reconocerá que un compuesto de la fórmula le puede utilizarse ya sea como una base libre o una forma de sal adecuada. Formas de sal adecuadas incluyen, pero no están limitadas a TFA, HCI , HBr, MsOH, TfOH y AcOH.
Cualquier agente de acoplamiento de amida adecuado puede utilizarse para formar un compuesto de la fórmula I . Los agentes de acoplamiento de amida adecuados incluyen, pero no están limitados a yoduro 2-clorometilpiridinio, BOP, PyBOP, HBTU, HATU , DCC, EDCI , TBTU y T3P. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza sólo. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza con un co-reactivo tal como HOBT o DMAP. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza como una base tal como trietilamina o diisopropiletilamina. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza tanto con un co-reactivo tal como HOBT o DMAP y una base tal como trietilamina o diisopropiletilamina. Un experto en la téenica reconocerá que pueden utilizarse co-reactivos diferentes a HOBT o DMAP. Además, un experto en la técnica reconocerá que pueden utilizarse bases diferentes a trietilamina o diisopropiletilamina.
En otras modalidades, el componente de ácido carboxílico de la fórmula la se produce ai tratar un éster de la fórmula Id con un agente de hidrolización: B— COOR Id en donde B se define como anteriormente y R es un grupo alquilo ramificado o no ramificado de 1 a 6 átomos de carbono.
Cualquier agente de hidrolización adecuado puede utilizarse para preparar un compuesto de la fórmula la de un compuesto de la fórmula Id. Los agentes de hidrolización adecuados incluyen, pero no están limitados a hidróxido de litio, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio.
Cualquier agente de hidrolización adecuado puede utilizarse para tratar un compuesto de la fórmula If de un compuesto de la fórmula le. Los agentes de hidrolización adecuados incluyen, pero no están limitados a hidróxido de litio, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio.
Cualquier grupo de partida adecuado puede acoplarse con un ácido carboxílico de la fórmula If en la presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado para formar un éster activo de la fórmula l . Grupos de partida adecuados incluyen, pero no están limitados a imidazol, HOBT, NHS y 4-nitrofenol. Los reactivos de acoplamiento adecuados incluyen, pero no están limitados a yoduro 2-clorometilpiridinio, BOP, PyBOP, HBTU , HATU, DCC, EDCI, TBTU y T3P.
En algunas modalidades, un áster activo de la fórmula I se forma de un ácido carboxílico de la fórmula If utilizando una combinación de un grupo de partida adecuado y un reactivo de acoplamiento.
En algunas modalidades, un áster activo de la fórmula I se forma de un ácido carboxílico de la fórmula If utilizando un reactivo adecuado un reactivo individual que produce un grupo de partida y también lleva a cabo una reacción de acoplamiento. Tales reactivos incluyen, pero no están limitados a 1 , 1’-carbonildiimidazol, carbonato de N, N’-disuccinimidilo, trifluoroacetato de 4-n itrofen i I o y HBTU . En algunas modalidades, el reactivo individual se utiliza sólo. En otras modalidades, el reactivo individual se utiliza con un catalizador de transferencia de acilo. Tales catalizadores de transferencia de acilo incluyen, pero no están limitados a DMAP y piridina. Un experto en la téenica reconocerá que pueden utilizarse catalizadores de transferencia de acilo adicionales.
En una modalidad específica, la presente invención proporciona un método para producir un portador representado por la fórmula V: que comprende el paso de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula Va: con un compuesto de la fórmula Vb: en la presencia de un agente de acoplamiento de amida. Un experto en la téenica reconocerá que un compuesto de la fórmula Vb puede utilizarse ya sea como una base libre o como una forma de sal adecuada. Las formas de sal adecuadas incluyen, pero no están limitadas a TFA, HCI, HBr, MsOH, TfOH y AcOH.
Cualquier agente de acoplamiento de amida adecuado puede utilizarse para formar un compuesto de la fórmula V. Los agentes de acoplamiento de amida adecuados incluyen, pero no están limitados a yoduro 2-clorometilpiridinio, BOP, PyBOP, HBTU, HATU, DCC, EDCI , TBTU y T3P. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza sólo. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza con un co-reactivo tal como HOBT o DMAP. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza como una base tal como trietilamina o diisopropiletilamina. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza tanto con un co-reactivo tal como HOBT o DMAP y una base tal como trietilamina o diisopropiletilamina. Un experto en la téenica reconocerá que pueden utilizarse co-reactivos diferentes a HOBT o DMAP. Además, un experto en la técnica reconocerá que pueden utilizarse bases diferentes a trietilamina o diisopropiletilamina.
En una modalidad específica, el componente de ácido carboxílico de la fórmula Va se produce al tratar un éster de metilo de la fórmula Ve con un agente de hidrolización: Cualquier agente de hidrolización adecuado puede utilizarse para preparar un compuesto de la fórmula Va de un compuesto de la fórmula Ve. Los agentes de hidrolización adecuados incluyen, pero no están limitados a hidróxido de litio, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio.
En otra modalidad específica, la presente invención proporciona un método para producir un portador representado por la fórmula VI : que comprende los pasos de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula Va: con un compuesto la fórmula Via: Via en la presencia de un agente de acoplamiento de amida que forma un compuesto de la fórmula Vlb; la hidrolización de un éster de la fórmula Vlb o un ácido carboxílico de la fórmula Vlc; y Convertir un ácido carboxílico de la fórmula Vlc a un éster activo de la fórmula VI; ' Un experto en la téenica reconocerá que un compuesto de la fórmula Vía puede utilizarse ya sea como una base libre o como una forma de sal adecuada. Formas de sal adecuadas incluyen, pero no están limitadas a TFA, HCI, HBr, MsOH , TfOH y AcOH.
Cualquier agente de acoplamiento de amida adecuado puede utilizarse para formar un compuesto de la fórmula Vlb. Los agentes de acoplamiento de amida adecuados incluyen, pero no están limitados a yoduro 2-clorometilpiridinio, BOP, PyBOP, HBTU, HATU , DCC, EDCI , TBTU y T3P. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza sólo. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza con un co-reactivo tal como HOBT o DMAP. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza como una base tal como trietilamina o diisopropiletilamina. En ciertas modalidades, el agente de acoplamiento de amida se utiliza tanto con un co-reactivo tal como HOBT o DMAP y una base tal como trietilamina o diisopropiletilamina. Un experto en la téenica reconocerá que pueden utilizarse co-reactivos diferentes a HOBT o DMAP. Además, un experto en la técnica reconocerá que pueden utilizarse bases diferentes a trietilamina o diisopropiletilamina.
Cualquier agente de hidrolización adecuado puede utilizarse para preparar un compuesto de la fórmula Vlc de un compuesto de la fórmula Vlb. Los agentes de hidrolización adecuados incluyen, pero no están limitados a hidróxido de litio, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio.
NHS puede acoplarse con un ácido carboxílico de la fórmula Vlc en la presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado para formar un éster activo de la fórmula VI. Los reactivos de acoplamiento adecuados incluyen, pero no están limitados a yoduro 2-clorometilpiridinio, BOP, PyBOP, HBTU , HATU, DCC, EDCI, TBTU y T3P.
En algunas modalidades, un éster activo de la fórmula VI se forma a partir de un ácido carboxílico de la fórmula Vlc utilizando una combinación de NHS y un reactivo de acoplamiento En algunas modalidades, un éster activo de la fórmula VI se forma de un ácido carboxílico de la fórmula Vlc utilizando un reactivo individual que produce un grupo de partida y también lleva a cabo una reacción de acoplamiento. Tales reactivos incluyen, pero no están limitados a carbonato de N , N’-disuccinimidilo. En algunas modalidades, el reactivo individual se utiliza sólo. En otras modalidades, el reactivo individual se utiliza con un catalizador de transferencia de acilo. Tales catalizadores de transferencia de acilo incluyen, pero no están limitados a DMAP y piridina. Un experto en la téenica reconocerá que catalizadores de transferencia de acilo adicionales pueden utilizarse.
En una modalidad específica, el componente de ácido carboxílico de la fórmula Va se produce al tratar un éster de metilo de la fórmula Ve con un agente de hidrolización: Cualquier agente de hidrolización adecuado puede utilizarse para preparar un compuesto de la fórmula Va de un compuesto de la fórmula Ve. Los agentes de hidrolización adecuados incluyen, pero no están limitados a hidróxido de litio, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio.
Si se desea, conjugados de portador de compuesto terapéutico que tienen diferentes pesos moleculares pueden aislarse utilizando cromatografía de filtración de gel y/o cromatografía de intercambio de ion. Puede utilizarse cromatografía de filtración de gel para fraccionar diferentes conjugados de portador de compuesto terapéutico (por ejemplo, 1 -mer, 2-mer, 3-mer, y así sucesivamente, en donde “1 -mer” indica una molécula de grupo de enfoque por compuesto terapéutico, “2-mer” indica dos grupos de enfoque unidos a compuesto terapéutico, y así sucesivamente) sobre la base de sus pesos moleculares diferentes (en donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio del grupo de enfoque).
Las columnas de filtración de gel adecuadas para llevar a cabo este tipo de preparación incluyen columnas de Superdex y Sephadex disponibles de Amersham Biosciences (Piscataway, N.J.). La selección de una columna particular dependerá del rango de fraccionamiento deseado. Generalmente se lleva a cabo elusión utilizando un regulador de pH adecuado, tal como fosfato, acetato, o similares. Las fracciones recolectadas pueden analizarse por un número de diferentes métodos, por ejemplo, (i) densidad óptica (OD) 280 nM para el contenido de proteína, (ii) análisis de proteína de albúmina de suero bovino (BSA), y (iii) electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS PAGE).
La separación de conjugados de portador de compuesto terapéutico también pueden llevarse a cabo por cromatografía de fase inversa utilizando una columna de cromatografía líquida de desempeño alto de fase inversa (RP-HPLC) C 18 (Amersham Biosciences o Vydac) o por cromatografía de intercambio de ion utilizando una columna de intercambio de ion, por ejemplo, columna de intercambio de ion de DEAE- o CM-Sefarosa disponible de Amersham Biosciences. Las composiciones purificadas resultantes preferiblemente están sustancialmente libres de compuesto terapéutico o conjugado por grupo sin enfoque. Además, las composiciones preferiblemente están usualmente libres de todos los otros grupos de enfoque unidos de manera no covalente.
La invención proporciona composiciones y métodos para presentar un fármaco más potente al mejorar sus propiedades farmacocinéticas utilizando vitamina D u otra molécula de enlace DBP. La trayectoria natural para la formación de vitamina D en la piel con exposición a luz ultravioleta confía en la interacción con DBP para llevar la vitamina D activada por V en circulación en donde puede utilizarse para procesos celulares (Lips, Prog. Biophys. Molec. Biol. 92:4-8 (2006); DeLuca, Nutr. Rev. 66 (suppl. 2):S73-S78 (2008)). DBP trae vitamina D en circulación rápida y efectivamente. DBP también mantiene vitamina D activa en circulación durante, en promedio, 30 días (Cooke, N. E. , and J.G. Haddad. 1989. Endocr.
Rev. 10:294-307; Haddad, J. G. et al. 1993. J. Clin. Invest. 91 :2552-2555; Haddad, J. G. 1995. J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 53:579-582). La invención proporciona por primera vez que se utiliza DBP para suministrar más efectivamente compuestos terapéuticos al cuerpo. En una modalidad, ei compuesto terapéutico es enlazado de manera covalente o fusionado con un portador. En otra modalidad, el compuesto terapéutico es formulado con el portador pero no es enlazado de manera covalente. En una modalidad, el portador interactúa con DBP para el propósito de transportar el fármaco dentro del cuerpo a manera más efectiva desde el sitio de administración. En otra modalidad, el portador mantiene el fármaco en circulación durante un periodo de tiempo extendido.
En una modalidad, el portador comprende un grupo de enfoque y un grupo de acoplamiento para unir el grupo de enfoque al compuesto terapéutico. En otra modalidad, el portador comprende una porción de andamiaje que está enlazada al grupo de enfoque y el compuesto terapéutico. El grupo de enfoque es vitamina D, un análogo de vitamina D, metabolito relacionado con vitamina D, un análogo de metabolito relacionado con vitamina D, u otra molécula que puede enlazarse a o interactuar con la proteína de unión de vitamina D (DBP). En una modalidad, el grupo de enfoque es un anticuerpo derivado de anticuerpo, un péptido diseñado para enlazar DBP o un fragmento del mismo, un péptido derivado de una presentación de fago u otra biblioteca de péptido seleccionada contra DBP o un fragmento de la misma, un aptámero de nucleótido que une DBP, una molécula pequeña diseñada para enlazar DBP o derivada de una biblioteca química seleccionada contra DBP, un fragmento del mismo o porción que puede enlazarse DBP como se describe aquí. En otra modalidad, el portador comprende el mismo DBP o un derivado de DBP.
Vitamina D es un grupo de secoesteroides solubles en grasa. Varias formas (vitámeros) de vitamina D existen. Las dos formas principales son vitamina D2 o ergocalciferol, y vitamina D3 o colecalciferol, vitamina D sin un subíndice se refiere a cualquiera de D2 O D3 O ambos. En humanos, la vitamina D puede ingerirse como colecalciferol (vitamina D3) o el ergocalciferol (vitamina D2). Adicionalmente, humanos pueden sintetizarlo de colesterol cuando la exposición al sol es adecuada.
La vitamina D además es modificada por enzimas encontradas en varios órganos para una familia de “metabolitos de vitamina D” que también son capaces de enlazar DBP. Por ejemplo, la vitamina D es convertida a calcidiol (250H hidroxi-Vitamina D) en el hígado. Parte del calcidiol se convierte por los riñones a calcitriol (1 , 25 (OH)2 di hidroxi-Vitamina D). Calcidiol se convierte a calcitriol fuera de los riñones para otros propósitos. También encontrado en el cuerpo está 24, 25(OH)2 dihidroxi-Vitamina D. De esa forma, en una modalidad, el grupo de enfoque es un metabolito de vitamina D.
En otra modalidad, el grupo de enfoque es un “análogo de Vitamina D". Estos compuestos se basan en la estructura de vitamina D y retienen función parcial de vitamina D. Interactúan con algunas de las mismas proteínas como Vitamina D (por ejemplo DBP y el receptor de Vitamina D) , a pesar de estar en afinidades variables. Análogos ilustrativos incluyen: OCT, un análogo químicamente sintetizado de 1 ,25(OH)2D3 con un átomo de oxígeno en la posición 22 en la cadena lateral (Abe y otros, FEB S Lett. 226: 58-62 (1987)); análogo de Vitamina D Gemini, 1 a-dihidroxi-20R-21 (3-hidroxi-3-deuterometil-4,4,4-trideuterobutil)-23-in-26,27-hexafluoro-colecalciferol (BXL0124) (So y otros, Mol Pharmacol. 79(3):360-7 (201 1 )); paricalcitol, un esterol derivado de vitamina D2 que carece del grupo carbono-19 metileno encontrado en todos los metabolitos de vitamina D naturales (Slatopolsky y otros, Am J. Kidncy Dis. 26: 852 ( 1995)); Doxercalciferol ( 1 a,-hidroxivitamina D2), como alfacalcidol (1 a-hidroxivitamina D3), es un profármaco que es hidroxilado en el hígado a 1 a25(OH)2D2. Diferente a alfacalcidol, doxecalciferol también es 24-hidroxilado para producir 1 a, 24(S)-(OH)2D2 (Knutson y otros, Biochem Pharmacol 53: 829 ( 1997)); Dihidrotaquisterol2 (DHT2) hidroxilado in vivo a 25(OH)DHT2 y l ,25(OH)2DHT2 (Mclntyre y otros, Kidney Int. 55: 500 ( 1999)) . Ver también Erben y Musculoskel, Neuron Interact. 2 ( I ) : 59-69 (2001 ) y Steddon y otros Nephrol. Dial. Transplant. 16 (10): 1965-1967 (2001 ) . Las referencias anteriores se incorporan por referencia en su totalidad.
En otra modalidad, el portador además comprende una porción de andamiaje farmacéuticamente aceptable unida de manera covalente al grupo de enfoque y al compuesto terapéutico. La porción de andamiaje de los portadores de la invención no necesariamente participa pero puede contribuir a la función o mejorar las propiedades farmacocinéticas del compuesto terapéutico. Los andamiajes de la invención no interfieren sustancialmente con el enlace del grupo de enfoque a DBP. De forma similar, los andamiajes de la invención no interfieren sustancialmente con estructura o función del compuesto terapéutico. La longitud de la porción de andamiaje depende del carácter del grupo de enfoque y el compuesto terapéutico. Un experto en la téenica reconocerá que varias combinaciones de átomos proporcionan moléculas de longitud variable basándose en distancias conocidas entre varios enlaces (Morrison, y Boyd, Química orgánica, 3era edición, Allyn y Bacon, Inc. , Boston , Mass. (1977), incorporados aquí por referencia) . Otros andamiajes contemplados por la invención incluyen enlazadores de péptido, enlazadores de proteína tal como albúmina de suero humana, un anticuerpo o fragmento del mismo, enlazadores de ácido nucleico, enlazadores de cadena de carbono pequeños, enlazadores de carbono con oxigeno o nitrógeno ¡nter-dispersados, también se contemplan combinaciones de estos ejemplos.
En otra modalidad, puede seleccionarse un péptido como el grupo de enfoque que une DBP. Métodos para filtrar bibliotecas de péptido de proteína para péptidos de enlace DBP se conocen en la técnica. En una modalidad preferida, un método de dos híbridos para identificar péptidos de enlace DBP se utiliza. En otra modalidad preferida, se utiliza un filtro in vitro para enlace DBP. Este péptido de enfoque puede unirse de manera covalente a o formularse alternativamente con un fármaco. En una modalidad preferida, se utiliza una porción de andamiaje. En otra modalidad, el grupo de enfoque es un aptámero que se seleccionó debido a que se enlaza a DBP. Dicho aptámero entonces puede unirse covalentemente a o formularse con un fármaco ya sea a través de un andamiaje o fusionarse directamente al fármaco.
En una modalidad, el fármaco es una molécula de ADN, una molécula de ARN, un aptámero (de cadena individual o de cadena doble), oligonucleótidos de ADN o de ARN, moléculas de ADN más grandes que son lineales o circulares, oligonucleótidos que se utilizan para interferencia de ARN (ARNi), variaciones de ADN tal como sustitución de moléculas híbridas de ADN/ARN, moléculas similares a ADN sintéticas tal como PNA u otras moléculas derivadas de ácido nucleico (ver WO07/035922, incorporadas por referencia aquí en su totalidad) . En otra modalidad, el compuesto terapéutico está compuesto de oligonucleótidos de ADN o ARN resistentes a nucleasas En una modalidad preferida, oligonucleótidos de ADN resistentes a nucleasa son Morfolinos (es decir, análogos de fosforodiamidato de ácidos nucleicos que se enlazan a ácidos nucleicos en una forma específica a secuencia, AVI BioPharma, Bothell, WA).
En otra modalidad, el fármaco es una molécula pequeña o entidad química. En otra modalidad, el fármaco es un péptido o un derivado de un péptido tal como PNA. En otra modalidad, el fármaco es una proteína compuesta de todo o una parte de un poli péptido , ya sea de longitud completa o un fragmento o versión truncada, ya sea PEG dilatado, glicosilado o de otra forma modificado covalente o no covalentemente o se deja sin modificar.
Los compuestos terapéuticos incluyen proteínas, péptidos, glicoproteínas, glicopéptidos, glicolípidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, y similares. Polipéptidos ilustrativos incluyen factores de crecimiento, tales como factores de crecimiento de hepatocito (HGF) , factores de crecimiento de nervios (NGF), factores de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento de fibroblasto incluyendo FGF21 , factores de coagulación en sangre, hormonas tales como hormonas de crecimiento, hormona estimuladora de folículo (FSH), citocinas, interferones, factores en necrosis de tumor con enzimas, proteínas morfogenéticas óseas, neutrofinas, y factores de diferenciación de crecimiento. Las composiciones y métodos de la invención también incluyen agonistas conjugados, antagonistas, y otros efectores de las proteínas mencionadas anteriormente, glicoproteínas, moléculas pequeñas, hormonas, factores de crecimiento, y otras moléculas encontradas dentro de un paciente o sujeto.
También dentro del alcance de la invención están péptidos terapéuticos. El término péptido pretende incluir una secuencia de aminoácidos. Los aminoácidos en los péptidos de la invención pueden estar ocurriendo naturalmente o no estar ocurriendo naturalmente. Los péptidos de la invención pueden ser sintetizados química o biológicamente, y pueden incluir péptidos ricos en cisteína, péptidos circulares, péptidos engrapados, péptidos que incluyen D- o L- aminoácidos y mezclas de los mismos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos de péptido (PNA), y combinaciones de los mismos. Las modalidades ilustrativas incluyen vacunas para sida, vacunas de alergia, péptidos anti-inflamatorios, péptidos anti-integrina, vacunas anti-TCR, péptidos anti-alergias, péptidos anti-cancerígenos, péptidos antifúngicos, péptidos antibacterianos, péptidos antirreumáticos, péptidos antitrombina, péptidos antivirales, ligandos de Receptor Acoplado a Proteína G (GPCR) y péptidos relacionados (por ejemplo la familia de Secretina), análogos de CGRP, antagonistas de GPCR, péptidos CMV, inhibidores de calpaína, inhibidores de colagenasa, inhibidores DAP, defensinas, oligopéptidos dialíticos, enancinas, endorfinas, antagonistas de endotelina, inhibidores de fibronectina, antagonistas de gastrina, ghrelina. antagonistas de glucagón, análogos de gonadorelina, péptidos de factor de crecimiento, hormonas del hipotálamo, hormonas pituitarias, péptidos que controlan función de aparato digestivo y apetito, productos de tejido adiposo proinflamatorios, péptidos que estimulan proliferación de célula madre, péptidos pro-inflamatorios, productos naturales, vacunas simples de herpes, péptidos de enlace de heparlna, vacunas de hepatitis B, péptidos inmunomoduladores, vacunas de influenza, antagonistas LHRH, derivados de péptido opioide, inhibidores de MMP, vacunas MUC-1 , vacunas de malaria, vacunas de elanoma, vacunas de meningitis, neuropéptidos, péptidos opioides, crecimiento osteogénico de péptidos, péptidos de osteoporosis, vacunas del virus de papiloma, vacunas de cáncer de próstata, péptidos RGD, vacunas RSV, péptidos receptores de célula T y similares. La invención contempla análogos sintéticos del mismo que podrían mejorar como productos químicos a través de modificación adicional por los métodos aquí descritos. Aquellos expertos en la téenica reconocerán muchos péptidos comercialmente importantes adicionales que son sensibles a modificaciones descritas para proporcionar vida media aumentada, duración de acción, absorción y/o biodisponibilidad.
También contemplados dentro del alcance de modalidades aquí descritas están péptidos que son ramificados o cíclicos, con o sin ramificación. Péptidos circulares ramificados cíclicos y ramificados resultan de procesos naturales pos-traslación y también están formados por métodos sintéticos adecuados. En algunas modalidades, cualquier producto de péptido aquí descrito comprende un número de péptido descrito anteriormente que entonces es unido de manera covalente a una porción de tensoactivo de alquil-glucósido.
También contemplados dentro del alcance de las modalidades aquí presentadas están cadenas de péptido que son sustituidas en una posición adecuada por la modificación de los análogos aquí reivindicados. Por ejemplo, la acilación es en un aminoácido del asador, por ejemplo, en la posición e de Lisina, con ácidos grasos tal como ácidos octanóico, decanónico, dodecanoico, tetradecanoico, hexadecanoico, octadecanóico, 3-fenilpropanoico y similares, o con cadenas alquilo saturadas y no saturadas (Zhang , L. y Bulaj, G. (2012) Curr Med Chem 19: 1602-1618, incorporadas aquí por referencia en su totalidad).
También contempladas dentro del alcance de modalidades aquí presentadas están cadenas de péptido que están compuestas de aminoácidos o análogos naturales y no naturales de aminoácidos naturales. Como se utiliza aquí, “análogos” de péptido y/o proteína comprenden aminoácidos no naturales basándose en aminoácidos naturales, tal como análogos de tirosina, que incluyen tirosinas parasustituidas, tirosinas orto-sustituidas, y tirosinas meta-sustituidas, en donde el sustituto en la tirosina comprende un grupo acetilo, un grupo benzoilo, un grupo amino, una hidracina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo metilo, un grupo isopropilo, un hidrocarburo de cadena recta o ramificada de 2 a 20 átomos de carbono, un hidrocarburo saturado o no saturado, un grupo O-metilo, un grupo poliéter, un halógeno, un grupo nitro, y similares. Ejemplos de análogos Tyr incluyen 2,4-dimetil-tirosina (Dmt), 2,4-dietil-tirosina, O-4-alil-tiroxina, 4-propilel-tirosina, Ca-metil-tirosina y similares. Ejemplos de análogos de lisina incluyen ornitina (Orn), homo-lisina, Ca-metil-lisina (CMcLys), y similares. Ejemplos de análogos de fenilalanina incluyen, pero no están limitados a, fenilalaninas meta-sustituidas, en donde el sustituto comprende un grupo metoxi , un grupo alquilo de 1 a 20 átomos de carbono, por ejemplo un grupo metilo, un grupo alilo, un grupo acetilo, o similares. Ejemplos específicos incluyen, pero no están limitados a 2,4,6-trimetil-L-fenílalanina (Tmp), O-metil-tírosina, 3-(2-naftil) alanina ( N a I (2 )) , 3-(1 -naftil)alanína (Na 1 (1 )), 3-metil-fenilalanina, ácido 1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxilico (Tic) , fenilalaninas fluoradas, isopropil-fenialanina, p-ácido fenilalanina, p-acil fenilalanina, p-benzoil-fenilalanina p-yodo-fenilalanina, P-bromo-fenilalanina, p-amino-fenilalanina, e isopropil-fenilalanina, y similares.
También contemplados dentro del alcance de modalidades aquí presentadas están cadenas de péptido que contienen aminoácidos no estándares y no naturales conocidos para la téenica, por ejemplo, aminoácidos C-alfa-disubstituídos tal como Aib, Ca-dietilglícina (Deg), ácido aminociclopentano-1 -carboxílico (Ac4c), ácido aminociclopentano-1 -carboxílico (Ac5c), y similares. Tales aminoácidos frecuentemente llevan a una estructura restringida, frecuentemente desviada hacia una estructura helicoidal alfa (Kaul, R. y Balaram, P. (1999) B100rg Med Chem 7: 105- 1 17, incorporada aquí por referencia en su totalidad). Ejemplos adicionales de tales aminoácidos no naturales útiles en diseño análogos son homo-arginina (Har), y similares. La sustitución de enlaces de amina reducidos en ciertos casos lleva a protección mejorada para destrucción enzimática o altera enlace de receptor. A manera de ejemplo, la incorporación de unidad de dipéptido Tic-Phe con un enlace de amida reducido entre los residuos (designados como Tic-F[CH2-NH] -Phe) reduce la degradación enzimática.
También contemplado dentro del alcance de modalidades aquí presentadas son modificaciones en el término amino o carboxilo que pueden introducirse opcionalmente en péptidos o proteínas presentes (Néstor, J. L. , Jr. (2009) Current Medicinal Chemistry 16: 4399-4418). Por ejemplo, los péptidos o proteínas presentes pueden ser truncados o asilados en el término N (Gourlet, P. , y otros ( 1998) Eur J Pharmacol 354: 105-1 1 1 , Gozes, I . y Furman, S. (2003) Curr Pharm Des 9: 483-494), cuyos contenidos se incorporan aquí por referencia). Otras modificaciones al término N de péptidos o proteínas, tal como eliminaciones o incorporación de aminoácidos D tal como D-Phe también pueden proporcionar agonistas o antagonistas potentes y de larga duración cuando se sustituyen con las modificaciones aquí descritas tal como alquil glucósidos de cadena larga. Tales agonistas y antagonistas también tienen utilidad comercial y están dentro del alcance de modalidades contempladas aquí descritas. Las referencias anteriores se incorporan aquí en su totalidad.
También contemplados dentro del alcance de modalidades es aquí descritas están portadores unidos de manera covalente, fusionados a o formulados con análogos de compuesto terapéutico, en donde el compuesto terapéutico nativo es modificado por acetilación, acilación, PEGilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de un lípido o derivado del lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, cielización, formación de enlace de bisulfuro, desmetilación, formación de formación de formación covalente de cisteína, formación de piroglutamato, formulación, ga a-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristorilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, glicosilación, unión de lípido, sulfatación, carboxilación gama de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación de ADP, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas, tal como arginilación, y ubiquitinación. Ver, por ejemplo, (Nestor, J.J. , Jr. (2007) Comprehensive Medicinal Chemistry II 2: 573-601 , Néstor, J.J., Jr. (2009) Current Medicinal Chemistry 16: 4399 - 4418, Creighton, T. E. ( 1993, Wold, F. (1983) Posttranslational Covalent Modification of Proteins 1-12, Seifter, S. and Englard, S. (1990) Methods Enzymol 182: 626-646, Rattan, S. I., et al. (1992) Ann N Y Acad Sci 663: 48-62). La referencia anterior se incorpora por referencia en su totalidad.
Pueden prepararse péptidos terapéuticos glicosilados utilizando química Fmoc convencional y téenicas de síntesis de péptido de fase sólida, por ejemplo, en resina, en donde los glicoaminoácidos protegidos deseados son preparados antes de síntesis de péptido y entonces introducidos en la cadena de péptido en la posición deseada durante síntesis de péptido. De esa forma, los conjugados de polímero de péptido terapéutico pueden conjugarse in vitro. La glicosilación puede ocurrir antes de desprotección. La preparación de glucósidos de aminoácido se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,767,254, WO 2005/097158, y Doores, K. , y otros, Chem. Commun. , 1401 -1403, 2006, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Por ejemplo, se llevan a cabo glicosilaciones selectivas alfa y beta de residuos de serina y treonina utilizando la reacción de Koenings-Knorr y metodología de anomerización in situ de Lemieux con intermedios de base Schiff. La desprotección del glucósido de base Schiff entonces se lleva a cabo utilizando condiciones moderadamente acidas o hidrogenolisis. Una composición, que comprende conjugado de péptido terapéutico glicosilado se elabora por síntesis de péptido de fase sólida paso a paso que involucra contactar una cadena de péptido en crecimiento con aminoácidos protegidos en una forma paso a paso, en donde al menos uno de los aminoácidos protegidos es glicosilado, seguido por conjugación de polímero soluble en agua. Tales composiciones pueden tener una pureza de al menos 95%, a al menos 97%, o al menos 98%, de una especie individual del péptido terapéutico glicosilado y conjugado.
Monosacáridos que pueden utilizarse para introducción en uno o más residuos de aminoácido de los péptidos terapéuticos definidos y/o descritos aquí incluye glucosa (dextrosa), fructosa, galactosa, y ribosa. Monosacáridos adicionales adecuados para uso incluyen gliceraldehídos, y dihidroxiacetona, eritrosa, treosa, eritrulosa, treosa, arabinosa, lixosa, xilosa, ribulosa, celulosa, alosa, altrosa, mañosa, en ácido N-acetilneuramínico, fucosa, N-acetil galactosamina, y N-acetilglucosamina, así como otros. Los glucósidos, tales como mono-, di-, y trisacáridos para uso al modificar un péptido terapéutico, uno o más residuos de aminoácido de los péptidos terapéuticos definidos y/o descritos aquí incluyen sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa, melibiosa, y celobiosa, entre otros. Polisacáridos incluyen acarbosa, rafinosa, y melezitosa.
En modalidades adicionales de la invención, los compuestos terapéuticos definidos y/o aquí descritos pueden acoplarse químicamente a biotina. El compuesto de biotina/terapéutico entonces puede enlazarse a avidína.
También dentro del alcance de la invención están polipéptidos que son anticuerpos. El término anticuerpo pretende incluir anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos conjugados con toxina, anticuerpos humanizados, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, dominios FC), fragmentos Fab, anticuerpos de cadena individual, anticuerpos bi- o multi-específicos, anticuerpos de llama, nano-cuerpos, diacuerpos, Fv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, scFv-Fc, y similares. También incluidas en el término están proteínas de fusión de anticuerpo, tal como quimeras de Ig. Anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos monoclonales humanizados o completamente humanos o fragmentos de los mismos.
Los términos “anticuerpos" e “¡nmunoglobulina” se utilizan intercambiablemente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, longitud completa o anticuerpos monoclonales intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos específicos siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada) y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpo (como se describe aquí en mayor detalle). Un anticuerpo puede ser quimérico, humano, humanizado y/o madurados por afinidad.
Los términos ‘‘anticuerpo de longitud completa", ‘‘anticuerpo intacto” y‘‘anticuerpo completo” se utilizan intercambiablemente para hacer referencia a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no fragmentos de anticuerpo como se define a continuación. Los términos se refieren particularmente a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen la región Fe. “Fragmento de anticuerpo” comprenden una porción de anticuerpo intacto, preferiblemente que comprende la región de enlace de antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos de Fab, Fab’ F(ab')2, y F v ; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas del anticuerpo de cadena lateral; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. El término “anticuerpo monoclonal” como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para posibles mutaciones, por ejemplo, en mutaciones que ocurren naturalmente, que pueden estar presentes en cantidades menores. De esa forma, el codificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como no siendo una mezcla de anticuerpos discretos.
En ciertas modalidades, cada anticuerpo monoclonal típicamente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia de péptido que une un objetivo, en donde la secuencia del polipéptido de enlace objetivo se obtuvo por un proceso que incluye la selección de una secuencia de polipéptido de enlace objetivo individual de una pluralidad de secuencias de polipéptido. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones de hibridoma, clones de fago, o clones de ADN recombinantes. Se debe entender que una secuencia de enlace objetivo seleccionada además puede alterarse, por ejemplo, para mejorar afinidad para el objetivo, para humanizar la secuencia de enlace objetivo, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad ¡n vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc. , y que un anticuerpo que comprende la secuencia de enlace objetivo alterada es también un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste a preparaciones de anticuerpo policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal está dirigido contra una terminal individual en un antígeno. Además de su especificidad, preparaciones de anticuerpo monoclonales son ventajosas ya que típicamente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas.
Los anticuerpos que se enlazan específicamente a un antígeno tienen una alta afinidad para ese antígeno. Afinidades de anticuerpo puede medirse por una constante de disociación (Kd). En ciertas modalidades, un anticuerpo aquí proporcionado tiene una constante de disociación (Kd) de £ 100 nM, £10 nM, £ 1 nM , £0.1 nM, £0.01 nM, o £0.001 nM (por ejemplo 10-8 M o menor, por ejemplo desde 10-8M a 10-13M , por ejemplo, de 10-9M a 10-13 M).
En una modalidad, Kd se mide por un ensayo de enlace de antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describió por el siguiente ensayo. La afinidad de enlace de solución de Fab para antígenos se mide al equilibrar Fab con una concentración mínima de antígeno ( 125l)-etiquetado en la presencia de una serie de titulación de antígeno no etiquetado, entonces capturando antígeno enlazado con una placa revestida de anticuerpo anti-Fab (ver, por ejemplo, Chen y otros, J. Mol. Biol. 293:865-881 ( 1999)). Para establecer condiciones para el ensayo, placas de cavidades múltiples MICROTITER® (Thermo Scientific) se revisten durante la noche con 5 mg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Lbs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9.6) , y se bloquean subsecuentemente con 2% (p/v) de un albúmina de suero bovino en PBS durante 2 a 5 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C) . En una placa no adsorbente (Nune #269620), se mezclaron 100 mm o 26 pm [1251 ]-antígeno con diluciones en serie Fab de interés (por ejemplo, consistente con evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12 en Presta y otros, Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés entonces es incubado durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar por un periodo más prolongado (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcance equilibrio.
Después de eso, las mezclas son transferidas a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante 1 hora). La solución entonces es removida y la placa lavada ocho veces con 0.1 % de polisorbato 20 (TWEEN-20®) en PBS. Entonces las placas se han secado, se agregan 100 mI/cavidad de cintilación (MICROSCI NT-20™; Packard), y las placas son contadas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante 10 minutos . Se eligen concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a 20% de enlace máximo para uso en ensayos de enlace competitivos.
De acuerdo con otra modalidad, Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmón de superficie utilizando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc. , Piscataway, N.J.) a 25°C, por ejemplo, con chips CM5 de antígeno inmovilizado a 10 unidades de respuesta (Rü) . Brevemente, chips de bio-sensor de dextrana carboximetilada (C 5, BIACORE, Inc.) son activados con clorhidrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones de proveedor. El antígeno es diluido con 10 mM de acetato de sodio, pH 4.8, a 5 mg/ml ( 20 mM) antes de inyección a una velocidad de flujo de 5 mI/min para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta 1 M de etanoiamina para bloquear grupos no reaccionados. Para medidas cinéticas, se inyectan diluciones en serie dobles de Fab (0.78 nM a 500 nM) en PBS con 0.05% de tensoactivo de polisorbato 20 (TWEEN-20™) (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 mI/min. Se calculan velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) utilizando un modelo de enlace de (Langmiur uno a uno simple (software de evaluación BIACORE® versión 3.2) al ajustar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la relación koff/kon ver, por ejemplo, Chen y otros, J. Mol. Biol. 293:365-881 (1999). Si la velocidad encendida excede 106 M-1 s-1 por el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces puede determinarse la velocidad de encendido al utilizar una téenica de templado fluorescente que mide el aumento de disminución y la intensidad de emisión de fluorescencia (estimulación = 292 nm ; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25°C de un anticuerpo de anti-antígeno 20 nM (forma de Fab) en PBS, pH 7.2, en la presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectro fotómetro SLM-AMI NCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. Otras químicas de acoplamiento para el antígeno objetivo a la superficie de chip (por ejemplo, estreptavidina/biotina, interacción hidrófoba, o química de bisulfuro) también están fácilmente disponibles en lugar de la metodología de acoplamiento de amina (chips CM5) descrita anteriormente, como se entenderá por una persona con conocimientos básicos en la técnica.
En modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como siendo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se interpreta como requiriendo producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se van a utilizar de acuerdo con la presente invención y pueden estar hechos por una variedad de téenicas, incluyendo, por ejemplo, el método de hibridoma (por ejemplo, Kohler et al, Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual , (Coid Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al, in: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y. , 1981 )), métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Patente de E. U.A. No. 4, 816,567), tecnologías de presentación de fago (ver, por ejemplo, Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991 ); Marks et al, J. Mol Biol 222: 581 -597 (1992); Sidhu et al, J. Mol Biol 338(2): 299-310 (2004); Lee et al, J. Mol Biol 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati Acad. Sci. USA 101 (34): 12467- 12472 (2004); and Lee et al, J .
Immunol Methods 284( 1 -2): 1 19-132(2004), y Lee y otros, J . Immunol Methods 284( 1 -2): 1 19- 132(2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a humanos en animales que tienen partes o todos los lugares de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, W098/24893; WO96/34096; W096/33735; WO91 /10741 ; Jakobovits y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits y otros, Naturaleza 362: 255-258 ( 1993); Brugge ann y otros, Year in Immunol. 7:33 (1993); Patente de E. U.A. Nos. 5,545,807; 5, 545, 806; 5, 569,825; 5,625, 126; 5,633,425; 5,661 ,016; Marks y otros, Bio. Technology 10: 779-783 ( 1992); Lonberg y otros, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison , Naturaleza 368: 812-813 (1994); Fishwild y otros, Nature Biotechnol. 14: 845-851 ( 1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 ( 1995). Las patentes, publicaciones y referencias anteriores se incorporan por referencia en su totalidad.
Formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En una modalidad, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la cual se reemplazan residuos de una región hipervariable del receptor por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo, o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad, y/o capacidad deseadas. En algunos casos, residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones pueden hacerse para refinar además desempeño de anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos 1 , y típicamente 2, dominios variables , en donde todos o sustancialmente todos los circuitos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana, y todos o sustancialmente todos los FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones y otros, Nature 321 :522-525 (1996), Riechman y otros, Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Ver también en los siguientes artículos de revisión y referencias citadas: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 : 105-115 (1998); Harris, Biochem .
Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op.
Biotech. 5:428-433 (1994). Las siguientes referencias se incorporan por referencia en su totalidad.
Un “anticuerpo humano” es uno que comprende una secuencia aminoácido correspondiente a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o que se ha hecho utilizando cualquiera de las téenicas para elaborar anticuerpos humanos como se describe aquí. Tales técnicas incluyen filtrar bibliotecas de combinación derivadas de humano, tal como bibliotecas de presentación de fago (ver, por ejemplo, Marks y otros, J. Mol. Biol, 222: 581 -597 (1991 ) y Hoogenboom y otros, Nucí. Acids Res. , 19: 4133-4137 (1991 )); utilizando mieloma humano y líneas celulares de heteromieloma humano de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (ver, por ejemplo, Kozbor, J . Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 55-93 (Marcel Dekker, Inc. , Nueva York, 1987); y Boerner y otros, J . Immunol, 147: 86 (1991 )); y generar anticuerpos monoclonales en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena (ver, por ejemplo, Jakobovitis y otros, Proc. Nati. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits y otros, Nature 362: 255 (1993); Bruggermann y otros, Year in Immunol, 7:33 ( 1993)) . Esta definición de un anticuerpo humano específicamente incluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antígeno de un animal no humano.
Todos los tipos conocidos de tales anticuerpos están dentro del alcance de la invención. Anticuerpos ilustrativos incluyen aquellos que se enlazan a factores de crecimiento, citocinas, linfocinas, receptores de superficie celular, enzimas, factores de crecimiento endotelial vascular, factores de crecimiento de fibroblasto, y anticuerpos a sus receptores respectivos. Otros anticuerpos ilustrativos incluyen anticuerpos monoclonales dirigidos a proteínas de fusión IgG Fe receptor, y glicoproteínas. Cualquier versión modificada (por ejemplo, mutada de cualquiera de los polipéptidos listados anteriormente están también dentro del alcance de la invención. Compuestos terapéuticos que se van a utilizar en la invención son conocidos en la téenica y se describen a manera de ejemplo en la Patente de E. U .A. No. 7,608,681 , incorporada aquí por referencia en su totalidad. Adícionalmente, la invención contempla conjugados de inhibidores o antagonistas de anticuerpos que ocurren naturalmente o que no ocurren naturalmente en un sujeto que causa enfermedades autommunes o condiciones inflamatorias no deseadas.
Algunos aspectos del ensamble de portadores utilizan métodos químicos que son bien conocidos en la téenica. Por ejemplo, PEG de Vitamina E fabricada por Eastman Chemical, Biotin-PEG se fabrica por muchos fabricantes de EPG tal como Enzon, Nektar y NOF Corporation . Métodos para producir moléculas de PEG con algunas vitaminas y otros compuestos terapéuticos enlazados a ellas siguen estos ciertos métodos químicos conocidos en la técnica. La unión de PEG a un oligonucleótido o molécula relacionada ocurre, por ejemplo, como el éster de PEG2-N-hidroxisuccinimida al oligonucleótidos a través de la porción amina 5’. Varios métodos de acoplamiento se contemplan e incluyen, por ejemplo, acoplamiento de NHS a grupos amino tal como residuo de lisina en un péptido, acoplamiento de maleimida a grupo sulfhidrilo tal como en un residuo de cisteína, yodoacetilo que se acopla a un grupo de sulfhidrilo, piridilditiol que se acopla a un grupo de sulfhidrilo, hidrazida para acoplarse a un grupo de carbohidrato, aldehido para acoplarse al término N, o acoplamiento de éster de tetrafluorofenilo que es conocido por reaccionar con aminas primarias o secundarias. Otros métodos de acoplamiento químico posible son conocidos por aquellos expertos en la técnica y pueden ser sustituidos. A manera de ejemplo, puede llevarse a cabo conjugación utilizando los grupos de acoplamiento de la invención utilizando las composiciones y métodos descritos en WO93/012145 (Atassi y otros) y también ver 7,803,777 (Defress y otros), incorporados aquí en su totalidad.
En una modalidad, compuestos portadores pueden estar unidos covalente o no covalentemente al fármaco. En otra modalidad, los compuestos portadores están separados de los fármacos pero se mezclan juntos en concentraciones discretas para formularse en unidades funcionales. Formulaciones de fármaco ilustrativas de la invención incluyen soluciones acuosas, soluciones orgánicas, formulaciones en polvo, formulaciones sólidas y una formulación de fase mezclada.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenden cualquiera de los compuestos de la presente invención, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, con cualquier portador farmacéuticamente aceptable, adyuvante o vehículo. Portadores farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y vehículos que pueden utilizarse en las composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen, pero no están limitados a, intercambiadores de ion, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero, tal como alúmina de suero humano, sustancias reguladoras de pH tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tal como sulfato de protamina, fosfato ácido disódico, fosfato ácido de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, tr i s i I i cato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilen glicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, copolímeros de bloque de polietileno-polioxipropilerto, polietilenglicol y lanolina.
Las seles farmacéuticamente aceptables retienen la actividad biológica deseada de la composición terapéutica sin efectos secundarios tóxicos. Ejemplos de tales sales son (a) sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares/y sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalensulfónico, ácido naftalendisulfónico, ácido poligalacturónico y similares; (b) sales de adición base o complejos formados con cationes de metal polivalente tal como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, y similares; o con un catión orgánico formado de N, N’-dibenziletilendiamina o etilenodiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b), por ejemplo una sal de tanato de zinc y similares.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse por o modos transdérmicos, orales, parenterales, de inhalación, oculares, tópico, rectales, nasales, bucales (incluyendo sublinguales), vaginales, o de depósito implantado. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden contener cualquiera de los portadores, adyuvantes o vehículos convencionales, no tóxicos, farmacéuticamente aceptables. El término parenteral como se utiliza aquí incluye téenicas de inyección de infusión subcutánea, intra-cutánea intravenosa, intramuscular intra-articular, intrasinovial, intra-esternón, intratecal, intra-lesional, e intracraneal.
También se contemplan, en algunas modalidades, composiciones farmacéuticas que comprenden un ingrediente activo, compuestos terapéuticos aquí descritos, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en una mezcla con un componente farmacéuticamente aceptable, no tóxico. Como se mencionó anteriormente, tales composiciones pueden prepararse para administración parenteral, particularmente en la forma de soluciones o suspensiones líquidas; de administración oral o bucal , particularmente en la forma de tabletas o cápsulas; para administración intranasal, particularmente en forma de polvos, gotas nasales, soluciones o aerosoles que se evaporan; para inhalación, particularmente en la forma de soluciones líquidas o polvos secos con excipientes, definidos ampliamente; para administración transdérmica, particularmente en la forma de un parche para piel o parche de microaguja; y para administración rectal o vaginal, particularmente en la forma de un supositorio.
Las composiciones pueden administrarse convenientemente en forma de dosificación unidad y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, como se describió en Remington’s Pharmaceuticals Sciences, 17th edición, Mack Publishing Co. , Easton, PA ( 1985), que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Las formulaciones para administración parenteral pueden contener como excipientes agua estéril o alquilenglicoles salinos tal como propilenglicol, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, sacáridos, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados, albúmina de suero u otras nanopartículas (como se utiliza en Abraxane™, American Pharmaceutical Partners, Inc. Schaumburg, I L) ) , y similares. Para administración oral, la formulación puede ser mejorada mediante la adición de sales biliares o acilcarnitinas. Las formulaciones para administración nasal pueden ser sólidas o soluciones adsorbentes que se evaporan tal como hidrofluorocarbonos, o pueden contener excipientes para estabilización, por ejemplo, sacáridos, tensoactivos, alfa-lactosa o dextrana de sub-micra, o pueden ser soluciones acuosas o aceitosas para uso en la forma de gotas nasales o aspersión medida. Para administración bucal, excipientes típicos incluyen azúcares, estearato de calcio, estearato de magnesio, almidón pregelatinizado, y similares.
El suministro de compuestos terapéuticos modificados aquí descritos a un sujeto durante períodos de tiempo prolongados, por ejemplo, durante períodos de una semana a un año, pueden lograrse por una administración individual de un sistema de liberación controlada que contiene suficiente ingrediente activo para el periodo de liberación deseado. Varios sistemas de liberación controlada, tales como microcápsulas monolíticas o tipo depósito, implantes de depósito, hidrogeles poliméricos, bombas osmóticas, vesículas, micelas, liposomas, parches transdérmicos, dispositivos iontoforéticos y formas de dosificación inyectable alternativas pueden utilizarse para este propósito. La ubicación en el sitio en el cual se desea suministro de ingrediente activo es una característica adicional de algunos dispositivos de liberación controlados, que pueden probarse benéficos en el tratamiento de ciertos trastornos.
En ciertas modalidades para administración transdérmica, el suministro a través de la barrera de la piel debe mejorarse utilizando electrodos (por ejemplo, iontoforesis), electroporación, o la aplicación de impulsos eléctricos cortos, de alto voltaje a la piel, radiofrecuencias, ultrasonido (por ejemplo, sonoforesis), micro-proyecciones (por ejemplo, microaguja), inyectores de chorro, ablación térmica, magneto foresis, láseres, velocidad, u ondas fotomecánicas. El fármaco puede ser incluido en un adhesivo de capa individual, fármaco en adhesivo de capas múltiples, depósito, matriz, o parches de estilo vapor, o podrían utilizar teenologías sin parches. El suministro a través de la barrera de la piel también podría mejorarse utilizando encapsulación, un fluidizador de lípido de piel, o un sistema transdérmico micro-estructurado hueco o sólido (MTS, tal como aquel fabricado por 3M), inyectores de chorro. Aditivos para la formulación para ayudar en el paso de compuestos terapéuticos a través de la piel incluyen profármacos, químicos, tensoactivos, péptidos que penetran célula, potenciadores de permeación, tecnologías de encapsulación, enzimas, inhibidores de enzima, geles, nanopartículas y chaperones de péptido y proteína.
Una forma de formulación de liberación controlada contiene el compuesto terapéutico o sus sales dispersadas o encapsuladas en un polímero que se degrada lentamente, no tóxico, no antihigiénico tal como ácido copoli(láctico/glicólico), como se describió en el trabajo pionero de Kent y otros, patente de E. U .A. no. 4,675, 189, incorporado aquí por referencia. Los compuestos, o sus sales, también pueden formularse en colesterol u otras pellas de matriz de lipido, o implantes de matrices silastómero. Una liberación lenta adicional, implantes de depósito o formulaciones inyectables serán evidentes para aquellos expertos en la téenica. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, JR Robinson ed. , Marcel Dekker I n c. , New York, 1978; y Controlled Release of Biologically Active Agents, RW Baker, John Wilcy & Sons, New York, 1987 Los anteriores se incorporan por referencia en su totalidad.
Una forma adicional de formulación de liberación controlada comprende una solución de polímero biodegradable, tal como ácido copolil(láctico/glicólico) o copolímeros de bloque de ácido láctico y PEG, es un solvente bio-aceptable, que es inyectado subcutánea o intramuscularmente para lograr una formulación de depósito. La mezcla de los compuestos terapéuticos aquí descritos con tal formulación polimérica es adecuada para lograr una duración muy prolongada de formulaciones de acción.
Cuando se fórmula para administración nasal, la absorción a través de la membrana mucosa nasal además puede mejorar por tensoactivos, tal como, por ejemplo, ácido g I ¡cocol ico, ácido cólico, ácido taurocólico, etocólico, ácido deoxicólico, ácido quenodeoxicólico, ácido dehidrocólico, ácido glicodeoxicólico, ciclodextrinas y similares en una cantidad en el rango de entre aproximadamente 0.1 y 15% en peso, de entre aproximadamente 0.5 y 4% en peso, o aproximadamente 2% en peso. Una clase adicional de potenciadores de absorción reportados para exhibir mayor eficiencia con irritación disminuida es la clase de alquilmaltosidos, tal como tetradecil aitosido (Arnold, JJ y otros, 2004, J Pharm Sci 93: 2205-13; Ashan , F y otros, 2001 , Pharm Res 18: 1742046) y referencias ahí, de los cuales todos se incorporan por referencia.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en la forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo, una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede ser formulada de acuerdo con téenicas conocidas en la técnica adecuada utilizando agentes dispersiones o metales adecuados (tal como, por ejemplo, Tween 80) y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1 , 3-butanodiol. Entre los vehículos disolventes aceptables que pueden emplearse está el manitol, agua, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónico. Además, aceites estériles, fijos se emplean convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito, cualquier aceite fijo blando puede emplearse incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Ácidos grasos, tal como ácido oleico y sus derivados de glicérido son útiles en la preparación de inyectables, ya que son aceites farmacéuticamente aceptables neutrales, tal como aceite de olivo y aceite de resino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones de aceite también pueden contener un diluyente dispersante de alcohol de cadena larga tal como Ph. Helv o un alcohol similar.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse oralmente en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable incluyendo, pero no limitada a, cápsulas, tabletas, y suspensiones y soluciones acuosas. En el caso de tabletas para uso oral, portadores que se utilizan comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. Agentes lubricantes, tal como estearato de magnesio, también se agregan típicamente. Para administración oral en una forma de cápsula, diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando las suspensiones acuosas se administran oralmente, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, pueden agregarse ciertos agentes endulzantes y/o saborizantes y/o colorantes.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención también pueden administrarse en la forma de supositorios para administración rectal. Estas composiciones pueden prepararse al mezclar un compuesto de esta invención con un excipiente no irritante adecuado, el cual es sólido a temperatura ambiente pero líquido a temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar los componentes activos. Tales materiales incluyen, pero no están limitados a, mantequilla de cacao, cera de abeja y g I icol es de polietileno.
La administración tópica de las composiciones farmacéuticas en esta invención es especialmente útil cuando es tratamiento deseado involucra áreas y órganos fácilmente accesibles por aplicación tópica. Para aplicación tópicamente a la piel, la composición farmacéutica debe ser formulada con un ungüento adecuado que contiene los componentes activos o suspendidos o disueltos en un portador. Portadores para administración tópica de los compuestos de esta invención incluyen, pero no están limitados a, aceite mineral, petróleo líquido, petróleo blanco, propi le ng I icol , compuesto de polioxietilen polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, la composición farmacéutica puede ser formulada con una loción o crema adecuada que contiene el compuesto activo suspendido o disuelto en un portador. Los portadores adecuados incluyen, pero no están limitados a, aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de cetil ésteres, alcohol de cetearilo, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua. Las composiciones farmacéuticas de esta invención también pueden aplicarse tópicamente al tracto intestinal inferior por su formulación de supositorio rectal o en una formulación de enema adecuada. También se incluyen parches transdérmicos tópicos en esta invención.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse por aerosol nasal o inhalación. Tales composiciones son preparadas de acuerdo con téenicas bien conocidas en la técnica de formulación farmacéutica y pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservadores adecuados, promotores de adsorción para mejorar biodisponibilidad, fluorocarbonos, y/u otros agentes de solubilización o dispersantes conocidos en la técnica.
Cuando se formula para suministro por inhalación, un número de formulaciones ofrecen ventajas. La adsorción del compuesto terapéutico a sólidos fácilmente dispersados tales como dicetopiperazinas (por ejemplo, partículas de Technosphere [Pfutzner, A y Forst, T, 2005, Expert Opin Drug Deliv 2: 1097-1106] o estructuras similares de una formulación que resulta en capitación inicial rápida del compuesto terapéutico. Polvos liofilizados, especialmente partículas de vidrio, que contienen el compuesto terapéutico y un excipiente son útiles para suministro al pulmón como la biodisponibilidad, por ejemplo, ver Exúbera® (insulina inhalada por Pfizer y Aventis Pharmaceuticals Inc.).
Los niveles de dosificación entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día, preferiblemente 0.5 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal por día del compuesto de ingrediente activo son útiles en la prevención y tratamiento de enfermedad. Típicamente, las composiciones farmaceuticas de esta invención se administraran desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 veces por día o alternativamente, como una infusión continua. Tal administración puede utilizarse como una terapia crónica o aguda. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con los materiales portadores para producir forma de dosificación similar variarán dependiendo del huésped tratado y el modo particular de administración. Una preparación típica completa desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 95% de compuesto activo (p/p). Preferiblemente, tales operaciones contienen desde aproximadamente 20% hasta aproximadamente 80% del compuesto activo.
Con la mejora de una condición de paciente, se administrará una dosis de mantenimiento de un compuesto, o composición una combinación de esta invención, si es necesario. Subsecuentemente, la dosificación o frecuencia de administración, o ambas, pueden reducirse, como una función de los síntomas, a un nivel al cual se retiene la condición mejorada cuando los síntomas han sido aliviados al nivel deseado, el tratamiento debe cesar. Sin embargo, pacientes pueden requerir tratamiento intermitente en una base a largo plazo con cualquier recurrencia de síntomas de enfermedad.
Como apreciará el experto en la téenica, pueden requerirse dosis inferiores o superiores a aquellas mencionadas anteriormente. La dosificación y regímenes de tratamiento específicos para cualquier paciente particular dependerán de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, edad, peso corporal, estado de salud general, genero, dieta, hora de administración, velocidad de excreción, combinación de fármaco, la severidad y curso de una infección, la disposición de un paciente a la infección y al juicio del médico tratante.
El conjugado de portador-fármaco, fusión o formulación proporciona ventajas al fabricante de fármaco y al paciente sobre el fármaco no conjugado, no fusionado o no formulado. Específicamente, el conjugado o formulación de portador-fármaco será un fármaco más potente o más duradero que requiere dosificación más pequeño y menos frecuente comparada con el fármaco no conjugado, no fusionado o no formulado. Esto se traduce en costos de cuidado de la salud disminuidos y un programa de administración de fármaco más conveniente para el paciente. El conjugado o formulación de portador-fármaco también puede influenciar la ruta de inyección de un fármaco que normalmente es inyectado por inyección intravenosa que se va a administrar ahora a través de inyección subcutánea y en un sistema transdérmico. La ruta de administración a través de inyección subcutánea o suministro transdérmico es muy favorecida debido a que puede ser auto-administrada por pacientes en casa. Esto puede mejorar cumplimiento del paciente.
Incluso en otro aspecto de la invención, los niveles de DBP pueden aumentar como parte de la terapia de portador-fármaco. Se ha reportado que estrógeno puede aumentar niveles de DBP (Speeckaert y otros, Clínica Chimica Acta 371 :33) . Se contempla aquí que niveles de DBP pueden aumentar por administración de estrógeno para suministro más efectivo de conjugados de portador-fármaco.
Incluso en otro aspecto de la invención, se contempla que el portador puede utilizarse para suministrar fármacos térmicamente. Ya que DBP normalmente transporta vitamina D activada por UV en ubicaciones entre la superficie de la piel, el uso del sistema de suministro transdérmico con el portador se vuelve factible.
Con el fin de que la invención aquí descrita pueda entenderse más completamente, se describen los siguientes ejemplos. Se debe entender que estos ejemplos son para propósitos ilustrativos únicamente y no se van a interpretar como limitando esta invención de ninguna forma.
EJEMPLOS Ejemplo 1 : Preparación de un portador reactivo a tiol ilustrativo compuesto de vitamina D3-PEG con un grupo reactivo a maleimida La maleimida en el portador en este ejemplo se utilizó para conjugar a una cisteína libre en una proteina o péptido en los Ejemplos 2 y 3. Se contempló que el tamaño de PEG en los andamiajes de la invención son desde 0.1 kDa a 100kDa. De esa forma, se seleccionó un PEG de 2kDa como un andamiaje para este ejemplo. Los materiales de partida utilizados en este ejemplo fueron comprados de Toronto Research Chemicals para el análogo de Vitamina D (compuesto 1 ) y de Creative Pegworks para 2kDa de mPEG-maleimida (compuesto 4).
De acuerdo con la Figura 2, (R)-metil5-((IR,3aS, 7aR,E)-4-((Z)-2-((S)-5-((ter-butildimetilcilil)oxi)-2-metilenci-clohexiliden)etiliden)-7a-metiloctahidro-1 H-inden-1 -il)hexanoato (compuesto 1 , 7.5 mg, 0.0145 mmoles, un equivalente, comprado en Toronto Research Chemicals) se disolvió en tetrahidrofurano anhídrido (0.4 mi) y se lavó con nitrógeno. Se agregó fluoruro de tetrabutilamonio (2.7 mg , 0.087 mmoles, 6 equiv.) y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas con verificación por cromatografía de capa delgada (TLC, gel de sílice, 30% de acetato de etilo en hexanos, detección UV, tinción de ácido fosfomolíbdico). A la mezcla resultante que contiene compuestos no se agregó monohidrato de hidróxido de litio (4.2 mg, 0.1015 mmoles, 7 equiv.), tetrahidrofurano (0.3 mi) y agua (0.1 5 mi). La región se lavó con nitrógeno y se agitó a temperatura miente durante 18 horas. La evaluación por TLC y espectroscopia de masa (MS) indicaron una reacción completa con la presencia de compuesto 3 esperado. La mezcla de reacción se diluyó con éter (2 x 15 mi) y se lavó con 10% de ácido cítrico acuoso (30 mi), agua (30 mi) y salmuera (30 mi). La tapa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhídrido y se concentró mientras mantiene la temperatura bajo 20° C. La muestra además se secó bajo una corriente de nitrógeno que da ácido ((R)-5-((IR,3aS,7aR, E)-4-((Z)-2-((S)-5-hidroxi-2-metilenciclohexiliden)et¡l-iden)-7a-metilocta¡dro-1 H-inden-1 -il)hexanoico) (compuesto 3, 5.3 mg , rendimiento de 95%) como una goma incolora. Rf 0.2 (gel de sílice, 40% de EtOAc en hexano). El análisis de NMR reveló la presencia de aproximadamente 1.14% de THF y aproximadamente 0.14% de éter.
El compuesto 3 (5.3 mg, 0.0137 mmoles, 1 equiv.), compuesto 4 (sal TFA de MAL-PEG-amina, 21 .9 mg, 0.0109 mmoles, 0.8 equiv. , comprado de Creative Pegworks) y yoduro de 2-cloro-1 -metilpiridinio (8.7 mg, 0.0342 mmoles, 2.5 equiv.) se disolvieron en diclorometano anhídrido (0.5 mi). Se agregó trietilamina 7.6 m L , 0.058 mmoles, 4 equiv.) y la dispersión se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente bajo nitrógeno. La reacción entonces se diluyó con diclorometano (30 mi) y se lavó con 10% de ácido cítrico acuoso (40 mi), bicarbonato de sodio acuoso saturado (30 mi) y salmuera (30 mi). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhídrido, se filtró y se concentró mientras mantiene la temperatura por abajo de 20°C. La muestra además se secó bajo una corriente de nitrógeno para ofrecer el compuesto objetivo como una bomba café. Rf 0.6 (gel de sílice, 20% de metanol y diclorometano). El análisis de TLC (tinción de ninhidrina) del producto aislado indicó la ausencia de compuesto 4. El análisis de 1 H NMR del material aislado confirmó su identidad y pureza. El análisis de NMR no mostró una cantidad apreciable de cloruro de metileno u otros solventes.
Ejemplo 2: Preparación y caracterización de un conjugado de proteína-portador FGF21 modificados.
Un FGF21 modificado se conjugó al portador de Vitamina D3-PEG-maleimida descrito en el Ejemplo 1 . Como se muestra a continuación, la composición de portador FGF21 proporciona propiedades farmacocinéticas significativamente mejoradas cuando se comparan con un FGF21 que ocurre naturalmente, haciendo con ello la molécula conjugada de portador un compuesto terapéutico importante para el tratamiento de diabetes.
El FGF21 se expresó en E. coli, purificado y conjugado al portador como a continuación. Un FGF21 modificado se diseñó para incorporar un residuo de cisteína libre cerca del término amino de FGF21 para permitir un acoplamiento específico del sitio de la proteína al portador y una etiqueta Hise agregada para facilidad de purificación. La secuencia de codificación FGF21 modificada (SEC ID NO: 4) se optimizó de manera computacional para expresión en E. coli, y el gen se sintetizó químicamente por una organización de investigación de contrato (DNA2.0 Menlo Park, CA) y se clonó en el vector de expresión pJexpress401 que contiene un promotor T5 y un gen de resistencia a canamicina. El plásmido se transformó en células E. coli Origami2 (EMD Biosciences Inc.). La expresión de FGF21 del vector pJexpress401 en la cepa Origami se logró como a continuación. Se inoculó caldo de Luria más 1 % de glucosa con un cultivo durante la noche a una dilución de 1 : 100 y creció para la fase de logaritmo en donde el OD600 fue 0.6. Entonces la temperatura de cultivo se redujo desde 37°C hasta 18°C y el cultivo se indujo utilizando 0.2mM de IPTG y creció durante la noche a 18°C mientras está en agitación a 180 rpm. Se recolectaron células, alisaron y se recolectó el sobrenadante. La proteína fue purificada por afinidad utilizando, resina de cromatografía de afinidad metálica inmovilizada (I MAC) y se pulió por cromatografía de intercambio de ion.
La resina de FGF21 purificada entonces se intercambió por regulador de pH en 10mM de Tris pH 8.0, 50mM de NaCI, 1 mM de EDTA. La conjugación de la molécula portadora de Vitamina D3-PEG-maleimida (Ejemplo 1 ) se logró al mezclar el portador reactivo a tiol disuelto en DMSO a 10 mg/ml con la proteína FGF21 que contiene una cisteína libre (SEC I D NO: 3) a 0.5 mg/ml en una relación molar de 2: 1 portadora proteína. La proteína conjugada fue separada de componentes no reaccionados por cromatografía de intercambio de ion. La conjugación e impureza se confirmó mediante SDS-PAGE.FGF21 sólo y el conjugado de portador FGF21 entonces se intercambió por regulador de pH a PBS y se esterilizó utilizando un filtro de 0.22 mieras para uso en el estudio animal.
La farmacocinética de FGF21 (SEC ID NO: 3) o el conjugado de portador FGF21 se estudió en ratas Sprague Dawlcy. Brevemente, se inyectó 0 1 mg/kg de cada molécula separadamente en las ratas proyecciones SC . Se recolectaron muestras de plasma a 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos, 240 minutos, 360 minutos, 24 horas y 48 horas. Se analizaron muestras utilizando un equipo de ELISA comercial validado para FGF21 (Millipore, Cat. #EZHFGF21 -19K).
Los resultados muestran una diferencia significativa en absorción después de administración de SC entre el FGF21 y el conjugado de portador FGF21 en los siguientes puntos de tiempo (30, 60, 120 y 240 minutos), más allá de lo cual los niveles de FGF21 comenzaron a caer (Figura 3). Estos datos muestran que la conjugación de portadora FGF21 aumentó significativamente la biodisponibilidad de FGF21 después de inyección de SC (aumento de 380 veces, calculado al dividir el Cmax promedio de FGF21 , 376 mg/ l para Cmax promedio del conjugado de portador FGF21 , 143526 pg/ml). El área bajo la curva (AUC) también se calculó como 1047980 h*pg/ml para el conjugado de portador FGF21 y 1551 h*pg/m! para FGF21 sólo. Por lo tanto, hubo un aumento de 675 veces en exposición de fármaco cuando se divide la AUC media de conjugado de portador FGF21 de la AUC media de FGF21. Juntos, los datos demuestran la utilidad de la molécula portadora al aumentar la biodisponibilidad que indica que FGF21 conjugado tiene ventajas farmacocinéticas significativas sobre el FGF21 nativo.
Ejemplo 3: Preparación y caracterización de un conjugado de portador de péptido de ghrelina: En este ejemplo, la conjugación del portador de Vitamina D3-PEG-maleimida generado en el Ejemplo 1 para ghrelina impartió una vida media significativamente más prolongada en ghrelina, haciendo con ello la molécula conjugada un terapéutico potencialmente útil para el tratamiento de caquexia, anorexia y/o debilidad en las personas mayores.
Un péptido de ghrelina de ratas sintético con una cisteína terminal C agregada se compró de Innovagen (Lund, Suecia, SEC ID NO: 6). El portador de Vitamina D3-PEG-maleimida como se describió en el Ejemplo 1 se seleccionó para ser proporcional en tamaño a un péptido 2-3kDa para que la conjugación no pueda afectar significativamente la bioactividad. La conjugación con el portador se llevó a cabo al mezclar un portador reactivo a tiol (ver Ejemplo 1 ) disuelto en DMSO a 10 mg/ml con el péptido de ghrelina que contiene una cisteína libre a una concentración de 1 mg/ml en 15 mM de MES pH 6.0, 1 mM de EDTA en una relación molar de 2: 1 portador a péptido. El péptido conjugado fue separado de componentes no reaccionados por cromatografía de intercambio de ion. La conjugación y pureza se confirmó por SDS-PAGE. El péptido de ghrelina de rata (rGhrelina) y los conjugados de rGhrelina-portador entonces fueron intercambiados mediante regulador de pH a PBS y se esterilizaron por filtro utilizando un filtro de 0.22 mieras para uso en el estudio animal.
Se estudió la farmacocinética de rGhrelina (SEC ID NO: 6) o el conjugado de rGhrelina-portador en ratas Sprague Dawlcy. Brevemente, se inyectó 0.1 mg/kg de cada molécula separadamente en las ratas por inyección intravenosa (IV). Se recolectaron muestras de plasma a 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos, 240 minutos, 360 minutos, 24 horas y 48 horas. Se analizaron muestras utilizando un equipo de ELISA comercial validado para analizar rGhrelina de plasma de rata (Millipore, Cat. #EZRGRT-91 K). Los resultados muestran diferencias significativas en los perfiles farmacocinéticos de rGhrelina y el conjugado de rGhrelina-portador (Figura 4) . El cálculo de la vida media utilizando WinNonLin reveló una vida media de 0.37 horas para rGhrelina y una vida media de 8 horas para el conjugado de rGhrelina-portador, que se calculó para ser una mejora de 22 veces. Los datos demuestran un segundo ejemplo de la utilidad de la molécula portadora al aumentar la vida media . De esa forma, ghrelina en una forma conjugada es un terapéutico útil para el tratamiento de enfermedades en respuesta a ghrelina tal como caquexia, anorexia y debilidad en las personas mayores.
Ejemplo 4. Evaluación de la actividad de unión de receptor de un portador de péptido de ghrelina La actividad del péptido de ghrelina, cuando se conjuga un portador, no se afectó adversamente por la presencia de los grupos de andamiaje y de enfoque. Para mostrar esto, ghrelina (SEC ID NO: 5) y portador de Vitamina D3-PEG-maleimida-ghrel¡na conjugada del Ejemplo 3 se compararon para unión y activación de receptor de un receptor de ghrelina (actividad agonista) utilizado un ensayo de agonista de receptor basado en célula como se describe a continuación .
Los compuestos de prueba se agregaron a cultivos de célula CHO-K1 que expresan GHS-R. Ghrelina se une y activa el receptor GHS-R en respuestas de calcio intracelulares que se evaluaron como un indicador de actividad agonista. La actividad se midió por un ensayo basado en flujo de calcio desarrollado por GenScript USA Inc. para el instrumento de filtración celular de alto rendimiento FLIPR™ (Lector de Placa de Imagenología de Fluorescencia).
Se cultivaron células CHO-K1 que expresan GHS-R en F12 de Ham complementado con 10% de suero bovino fetal, 500 mg/ml de G418 y se pasaron con el fin de mantener salud celular óptima. Las células fueron sembradas en una pared negra de 384 cavidades, placa de fondo transparente a una densidad de 20,000 células por cavidad en 20 mL de medio de crecimiento 18 horas antes del ensayo y se mantuvieron a 37°C/5% de CO2. Al inicio del ensayo, se agregaron 20 pL de regulador de pH llevando calcio-4 en las cavidades. La placa se incubó en la oscuridad a 37°C durante 60 minutos entonces a temperatura ambiente durante 15 minutos. Los artículos de prueba de ghrelina y conjugado de ghrelina estuvieron a una concentración inicial de I mM en DMSO. Los artículos de prueba fueron diluidos en serie 10 veces en una Solución Salina regulada en su pH de Hank (HBSS) con 20mM de regulador de pH HEPES pH 7.4 antes de adición a las placas de prueba. La concentración final de cada artículo de prueba fue 5x la concentración antes de adición a las células. Los niveles de calcio intracelular en las células se midieron durante 20 segundos utilizando un instrumento de FLIPR™ antes de adición de los artículos de prueba. Se agregaron 10 pL de cada artículo de prueba diluido a la placa para ser un volumen final de 50 pL. Se midieron cambios en niveles de calcio intracelular durante 100 segundos adicionales (21 a 120 segundos).
El valor promedio de la lectura de 20 segundos (1 a 20 segundos) se calculó como la lectura de línea base y los valores de intensidad de unidades fluorescentes relativas (ARFU) se calcularon con las unidades fluorescentes máximas (21 a 120 segundos) restando el valor promedio de lectura de línea base. Se realizó adquisición y análisis de datos utilizando ScreenWorks® (versión 3.1 ) y se exportó a Excel.
El % de activación de compuestos se calcula utilizando la siguiente ecuación: % de activación = (ARFUCOmpuesto- A R F U antece d e n tes ( A R F U C On tro I ag on i sta " A R F U a n tece d en tes ) } 1 00% d e activación entonces se gráfico como una función de logaritmo y la dosis acumulativa de compuestos. Los datos representan el promedio de determinaciones duplicadas. La EC50 se determinó utilizando un asistente de análisis de datos escrito por GenScript.
El valor de EC50 de ghrelina sin portador fue de 88.5nM. En comparación, la ghrelina conjugada por portador tuvo un valor EC50 de 85nM, que es casi idéntico al péptido de control. De esa forma, la actividad agonista del péptido se conservó después de conjugación del portador al péptido de ghrelina. Observar que se hicieron los ensayos de la presencia de 10% de suero que contiene DBP. No se observó ninguna interferencia en la unión y activación de receptor para el péptido de conjugado de portador.
Ejemplo 5. Preparación de un portador reactivo a amina ilustrativo compuesto de Vitamina D3-PEG con un grupo reactivo al NHS Se generaron grupos reactivos a NHS en portadores para conjugación a grupos amino en proteínas. Se seleccionó un PEG de 2 kDa con un andamiaje para este ejemplo. Los materiales de partida utilizados en este ejemplo fueron comprados de Toronto Research Chemical para el análogo de Vitamina D (compuesto 1 ) y de Creative Pegworks para el aminoácido 2 kDa mPEG (compuesto 5).
De acuerdo con la Figura 5 (pasos 1 y 2): R)-Metil-5-((IR,3aS,7aR,E)-4-((Z)-2-((S)-5-((ter-butildimetils¡lil)oxi)-2-met¡lenci-clohexiliden)etiliden)-7a-metiloctahidro-1 H-inden-1-il)hexanoato (compuesto 1 , 8.2 mg, 0.0159 mmoles, 1 equivalente) se disolvió en tetrahidrofurano anhídrido (THF, 0.4 mi) y la mezcla se lavó con nitrógeno. Se agregó una solución de cloruro de tetrabutilamonio (25 mg, 0.096 mmoles, 6 equiv.) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas con verificación por cromatografía de capa delgada (TLC, gel de sílice, 30% de acetato de etilo en hexanos, detección UV, tinción de ácido fosfomolíbdico). La mezcla resultante que contiene compuesto 2, se agregaron monohidrato de hidróxido de litio (4.6 mg, 0.109 mmoles, 7 equiv.), THF (0.3 mi) y agua (0.16 mi). La mezcla de reacción se lavó con nitrógeno y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La evaluación por TLC y espectroscopia además (MS) indicó reacción completa con la presencia del compuesto esperado 3. La mezcla de reacción se diluyó con éter (10 mi) y se lavó con 10% de ácido cítrico acuoso (10 mi) , agua ( 10 mi), y salmuera (10 mi). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhídrido y se concentró m ientras mantiene la temperatura por abajo de 20°C. La muestra además se secó bajo una corriente y el nitrógeno dio ácido ((R)-5-((IR, 3aS , 7aR,E)-4-((Z)-2-((S)-5-hidroxi-2-metilenciclohexiliden)etil-inden)-7a-metiloctahidro- 1 H-inden-1 -il) hexanoico (compuesto 3, 6.1 mg , 99% de rendimiento) como una goma incolora. Rf 0.2 (gen de sílice, 40% acetato de etilo (EtOAc) en hexanos) análisis de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR) reveló la presencia de ~7% de éter.
De acuerdo con la Figura 5 (paso 3) : a una solución de PEG-aminoácido 4 (18.5 mg, 0.0092 mmoles comprado de Creative Pegworks) en metanol anhídrido , se agregó HCI en dioxano (4 M, 1 .5 mi), y la mezcla de reacción se calentó a 70°C en un tubo sellado durante 20 horas. La reacción se verificó mediante TLC (tensión de ninhidrina), y con el término de la reacción, se concentró sobre un rotavap. El residuo se evaporó conjuntamente con diclorometano (3 x 5 mi) y éter (3 x 5 mi) a una espuma amarillo pálido, que se suspendió en éter (5 mi). El líquido se decantó y el sólido obtenido se secó para aislar el producto deseado 5 (14 mg, 75%) como un sólido amarillo pálido Rf 0.2 (gen de sílice, 20% en etanol (MeOH)/DCM/0.2% N H40H). El análisis de en NMR no mostró una cantidad apreciable de cloruro de metileno o éter.
De acuerdo con la Fig ura 5 (paso 4): compuesto 3 (3.4 mg , 0.009 mmoles, 1 equiv.), compuesto 6 (metil éster PEG-sal de HCI de amina, 14 mg, 0.007 mmoles, 0.8 equiv.) y yoduro de 2-cloro-1 -metilpiridinio (5.6 mg , 0.022 mmoles, 2.5 equiv.) se disolvieron en diclorometano anhídrido (0.6 mi). Se agregó dietilamina (5 pL, 0.0356 mmoles, 4 equiv. ) y la mezcla de reacción se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente bajo nitrógeno. La reacción fue incompleta en este momento, por lo tanto se agregó una cantidad adicional de compuesto 3 (1 .7 mg , 0.0045 mmoles) y se continuó la región más de 3 horas, entonces se diluyó con diclorometano (10 mi) y se lavó con 10% de ácido cítrico acuoso ( 10 mi), bicarbonato de sodio acuoso saturado (10 mi) y salmuera (10 mi). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhídrido, se filtró y concentró m ientras mantiene la temperatura por abajo de 20°C la muestra se purificó por cromatografía de vaporización instantánea de gel de sílice (2 g). La columna se extrajo primero con acetato de etilo para remover compuesto no reaccionado 3 y entonces con 1 - 10% de MeOH/diclorometano (20 mi cada uno). Se combinaron fracciones que contienen producto puro juntas y se evaporaron sobre un rotavap, mientras mantiene la temperatura por abajo de 20°C. La muestra se secó bajo una corriente de nitrógeno para ofrecer compuesto 7 como una goma café ( 10 mg , 60%). Rf 0.3 (gel de sílice, 5% de MeOH en diclorometano). Análisis TLC (tensión de ninhidrina) del compuesto aislado indicó la ausencia del compuesto 6. El análisis de 1 H NMR del material aislado confirmó su identidad y pureza. El análisis de en NMR reveló la presencia de 1 .1 % de cloruro de metileno.
De acuerdo con la Figura 5 (paso 5): el compuesto 7 (10 mg, 0.0042 mmoles) se disolvió en una mezcla de THF (0.2 mi) y una gota de metanol. Esta solución agregó solución de monohidrato de hidróxido de litio (0.9 mg, 0.021 mmoles, 5 equiv. en 0.1 mi de agua). La mezcla de reacción se lavó con hidrogeno y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La evaluación por TLC indicó reacción completa con la presencia de compuesto 8. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (10 mi) y se lavó con 10% de ácido cítrico acuoso (10 mi) y salmuera (10 mi). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhídrido y se concentró mientras mantiene la temperatura por abajo de 20°C. La muestra además se secó bajo una corriente de nitrógeno dando el ácido de Vitamina D3-PEG deseado (compuesto 8, 7 mg, 71 % de rendimiento) como una goma café Rf 0.2 (gel de sílice, 10% de MeOH/diclorometano). El análisis de en NMR reveló la presencia de ~2% de diclorometano.
Se prepararon soluciones de abastecimiento: 34 g de N-hidroxisuccinimida en 1 mi de dimetilformamida anhídrida (DMF) 61 mg de diciclohexilcarbodiimida (DCC) en 1 mi de diclorometano anhídrido.
De acuerdo con la Figura 5 (paso 6), a una solución del compuesto 8 (7 mg, 0.003 mmoles, 1 equiv.) en diclorometano 0.3 mi) se agregó a una solución de N-hidroxisuccinimida en DMF (10 pL, 0.34 mg, 0.003 mmoles) seguido por una solución de DCC en diclorometano (10 mL, 0.61 mg, 0.003 mmoles) y la mezcla de reacción se lavó con hidrogel y se agitó durante 20 horas. Ya que la reacción fue incompleta como se indicó por TLC, se agregaron cantidades adicionales de N-hidroxisuccinimida en DMF (25 mL, 0.85 mg, 0.0075 mmoles) y DCC en diclorometano (25 pL, 1 .53 mg, 0.0075 mmoles) y la reacción continuó durante otras 20 horas. Se agregó cloroformo (10 mi) a la mezcla de reacción, y se lavó con agua (10 mi). La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio y la remoción de solvente proporcionó el compuesto objetivo deseado vitamina D3 -PEG - NHS (7.0 mg, crudo). 1 H N R y TLC (Rf: 0.3, 10% MeOH/cloroformo) de este material indicó la presencia de material deseado. Entonces se utilizó el portador de vitamina D3 - PEG - NHS en el Ejemplo 6.
Ejemplo 6. Preparación y caracterización de un conjugado de anticuerpo-portador El conjugado de infliximab-portador mostró un aumento en las concentraciones en suero y biodisponibilidad en ratas cuando se compara con infliximab sólo.
Infliximab, vendido como polvo liofilizado con las sales apropiadas (Hannah Pharmaceuticals) , se volvió a suspender a una concentración de 10 mg/ml con agua. El portador de Vitamina D3 -PEG - NHS se volvió a suspender a una concentración de 10 mg/ml en DMSO. El portador de Vitamina D3 - PEG - NHS y el infliximab entonces se mezclaron a una relación molar de 5: 1 y 10: 1 portadora infliximab. Un conjugado de portador de compuesto terapéutico de la invención típicamente tiene al menos 1 y podría estar entre 1 -10 moléculas portadoras individualmente unidas a un compuesto terapéutico. Al utilizar una versión NHS del portador, se puede unir más de un portador a una proteína terapéutica y esto puede controlarse experimentalmente al alterar la relación molar del portador al terapéutico objetivo en la reacción. En este ejemplo, se estableció una distribución objetivo de 2-4 portadores como un parámetro deseado. Al probar dos relaciones molares diferentes y al examinar los conjugados resultantes por espectroscopia de masa, se determinó una relación real.
Se separaron el infliximab y conjugados de infliximab NHS-portador de portador no conjugado por uso de una columna de desolación con un recorte de 40 kDa (Zeba Spin, Thermo Scientific). Se utilizó espectroscopia de masa para calcular la masa intacta de infliximab en la reacción. Los resultados muestran que infliximab no modificado tuvo una masa predominantemente de 149 kDa. La masa del infliximab conjugado por portador tuvo una masa en relaciones crecientes con una unión promedio del portador de 3 kDa de 2-4 portadores por anticuerpo.
El producto de reacción 5: 1 purificado entonces se utilizó en un estudio farmacocinético de rata que compara infliximab con el conjugado de infliximab-portador administrado subcutáneamente (SC) . La dosis fue 1 mg/kg en todos los grupos de prueba con tres ratas por grupo. Las muestras de suero fueron pre-dosificación recolectada y en varios tiempos de 5 a 48 horas después de inyección. Entonces se analizaron muestras de suero por ELISA utilizan un equipo de ELISA específico para determinar los niveles de infliximab en suero (Promonitor™, Progenika™). Se determinaron parámetros farmacocinéticos utilizando WinNonLin. Los resultados mostrados en la Figura 6 demuestran una mejora de 1.5 veces en concentración en suero y área bajo la curva (AUC) cuando el anticuerpo es conjugado al portador de Vitamina D3 - PEG - NHS cuando se compara con el anticuerpo no conjugado. Más específicamente, en los puntos de tiempo de 24 horas y 48 horas, se observó una concentración de 2100 ng/ml y 4800 ng/ l para infliximab. En contraste, en los puntos de tiempo de 24 horas y 48 horas, se observó una concentración de 3200 ng/ml y 7000 ng/ml para infliximab conjugado con un portador. Esto se traduce en una mejora de 50% en biodisponibilidad. El cálculo de AUC mostró una mejora de 50% (Figura 6). De esa forma, este ejemplo muestra la utilidad del portador al mejorar la concentración en suero y biodisponibilidad de infliximab cuando se compara con el anticuerpo no conjugado.
Secuencias Hustrativas SEC ID NO: 1 Secuencia de proteína FGF21 humana MDSDET GFEHSGL WV S VLAGLLLG ACQAHPIPDS SPLLQF GGQVRQRYLYTDDAQQTE AHLEIREDGTV GGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALY GSLHFDP EACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPP GILAPQPPD V GS SDPLSM V GPSQGRSPSY AS SEC ID NO: 2 Secuencia de proteína FGF21 humana madura HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALK PGV1QILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLP GNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYA S SEC ID NO: 3 Secuencia de proteína FGF21 humana madura modificada (etiqueta 6-his N-terminal, sitio de escisión tev, un 182P adicional en el término C, y modificaciones a los siguiente residuos utilizando la numeración de la secuencia de proteína FGF21 humana madura: 13C, y G 170E) MGSHHHHHHSSGENLYFQGHPCPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDG TVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELL LEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPD VGS SDPLSM VEPSQGRSPSY ASP SEC ID NO: 4 Secuencia de codificación optimizada para la expresión de FGF21 en E. coli (ver aminoácidos de SEC ID NO: 3) ATGGGCTCACATCATCACCACCATCATAGCAGCGGAGAGAACTTGTATTTTCAGGG ACATCCGTGCCCTGACAGCAGCCCGCTGCTGCAGTTCGGTGGTCAAGTCCGTCAGCG TTACCTGTACACTGACGACGCGCAACAGACCGAGGCGCACCTGGAAATTCGCGAAG ATGGTACGGTGGGTGGCGCAGCGGACCAAAGCCCGGAGTCCCTGTTGCAGCTGAAG GCCCTGAAGCCGGGTGTCATCCAAATCCTGGGCGTTAAAACCAGCCGTTTTCTGTGC CAACGTCCGGATGGTGCGCTGTACGGTTCCCTGCACTTCGACCCAGAGGCATGTAGC TTTCGTGAACTGCTGCTGGAAGATGGCTATAATGTGTACCAGTCTGAGGCGCACGGT CT GCCGTT GCACTT GCC GGGT AAC AAAAGCCCGCACCGCGACCCAGCACCGCGT GG TCCGGCTCGCTTCCTGCCGCTGCCGGGTCTGCCTCCGGCGCTGCCGGAGCCGCCAGG CATTCTGGCTCCGCAACCGCCGGATGTTGGCAGCAGCGATCCGCTGAGCATGGTTGA ACCGTCGCAGGGCCGCAGCCCGTCTTATGCCAGCCCGTAA SEC ID NO: 5 Secuencia de proteína de Ghrelina humana GS(n-octanoil)-S )FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR SEC ID NO: 6 Ghrelina de rata con cys C-terminal agregada GS(n-octanoil)-S )FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPRC SEC ID NO: 7 Secuencia de proteína DBP MKRVLVLLLAVAFGHALERGRDYEKNKVCKEFSHLGKEDFTSLSLVLYSRKFPSGTFEQ VSQLVKEVVSLTEACCAEGADPDCYDTRTSALSAKSCESNSPFPVHPGTAECCTKEGLE RKLCMAALKHQPQEFPTYVEPTNDEICEAFRKDPKEYANQFMWEYSTNYGQAPLSLLV SYTKSYLSMVGSCCTSASPTVCFLKERLQLKHLSLLTTLSNRVCSQYAAYGEKKSRLSN LIKLAQKVPTADLEDVLPLAEDITNILSKCCESASEDCMAKELPEHTVKLCDNLSTKNSK FEDCCQEKTAMDVFVCTYFMPAAQLPELPDVELPTNKDVCDPGNTKVMDf YTFELSRR THLPEVFLSKVLEPTLKSLGECCDVEDSTTCFNAKGPLLKKELSSFIDKGQELCADYSEN TFTEYKKKLAERLKAKLPDATPTELAKLVNKHSDFASNCCSINSPPLYCDSEIDAELKNI L SEC ID NO: 8 Secuencia de nucleótido DBP TTTAATAATAATTCTGTGTTGCTTCTGAGATTAATAATTGATTAATTCATAGTCAGGA ATCTTTGTAAAAAGGAAACCAATTACTTTTGGCTACCACTTTTACATGGTCACCTAC AGGAGAGAGGAGGTGCTGCAAGACTCTCTGGTAGAAAAATGAAGAGGGTCCTGGT ACTACTGCTTGCTGTGGCATTTGGACATGCTTTAGAGAGAGGCCGGGATTATGAAAA GAATAAAGTCTGCAAGGAATTCTCCCATCTGGGAAAGGAGGACTTCACATCTCTGTC ACTAGTCCTGTACAGTAGAAAATTTCCCAGTGGCACGTTTGAACAGGTCAGCCAACT T GT GAAGG AAGTT GT CT CCTTG ACCG AAGCCTGCTGT GCGGAAGGGGCTG ACCCTG ACT GCT AT G AC ACCAGG ACCT C AGC ACT GTCT GCCAAGT CCT GT G AAAGT A ATTCTC CATTCCCCGTTCACCCAGGCACTGCTGAGTGCTGCACCAAAGAGGGCCTGGAACGA AAGCTCTGCATGGCTGCTCTGAAACACCAGCCACAGGAATTCCCTACCTACGTGGA ACCCACAAATGATGAAATCTGTGAGGCGTTCAGGAAAGATCCAAAGGAATATGCTA ATCAATTTATGTGGGAATATTCCACTAATTACGGACAAGCTCCTCTGTCACTTTTAGT CAGTTACACCAAGAGTTATCTTTCTATGGTAGGGTCCTGCTGTACCTCTGCAAGCCC AACTGTATGCTTTTTGAAAGAGAGACTCCAGCTTAAACATTTATCACTTCTCACCAC TCTGTCAAATAGAGTCTGCTCACAATATGCTGCTTATGGGGAGAAGAAATCAAGGC TCAGCAATCTCATAAAGTTAGCCCAAAAAGTGCCTACTGCTGATCTGGAGGATGTTT TGCCACTAGCTGAAGATATTACTAACATCCTCTCCAAATGCTGTGAGTCTGCCTCTG AAG ATT GCAT GGCC AAAG AGCTGCCTG AACAC AC AGT AAAACT CTGT G AC AATTT A TCCACAAAGAATTCTAAGTTTGAAGACTGTTGTCAAGAAAAAACAGCCATGGACGT TTTTGTGTGCACTTACTTCATGCCAGCTGCCCAACTCCCCGAGCTTCCAGATGTAGA GTTGCCCACAAACAAAGATGTGTGTGATCCAGGAAACACCAAAGTCATGGATAAGT ATACATTTGAACTAAGCAGAAGGACTCATCTTCCGGAAGTATTCCTCAGTAAGGTAC TTGAGCCAACCCTAAAAAGCCTTGGTGAATGCTGTGATGTTGAAGACTCAACTACCT GTTTT AAT GCT AAGGGCCCT CT ACT AAAG A AGG AACT AT CTT CTTT C ATT GAC AAGG GAC AAGAACTAT GT GC AG ATTATTC AG AAAAT AC ATTT ACTG AGT AC AAG AAAAAA CTGGCAGAGCGACTAAAAGCAAAATTGCCTGATGCCACACCCACGGAACTGGCAAA GCTGGTTAACAAGCACTCAGACTTTGCCTCCAACTGCTGTTCCATAAACTCACCTCC TCTTTACTGTGATTCAGAGATTGATGCTGAATTGAAGAATATCCTGTAGTCCTGAAG CATGTTTATTAACTTTGACCAGAGTTGGAGCCACCCAGGGGAATGATCTCTGATGAC CT AACCT AAGC AAAACC ACTG AGCTT CT GGGAAG ACAACT AGG ATACTTT CT ACTTT TTCTAGCTACAATATCTTCATACAATGACAAGTATGATGATTTGCTATCAAAATAAA TTGAAATATAATGCAAACCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEC ID NO: 9 Factor-alfa de necrosis tumoral (TNF-a) ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAA GAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTT CCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGGGTGATCGG CCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGC AGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAA CCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGG CCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGTTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTAC CTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTC CTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTC TCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCC CTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGAC TCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTT GCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGA SEC I D NO: 10 Factor-alfa de necrosis tumoral (TNF-a) MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGV1GPQRE EFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELR DNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSA1KSPCQRET PEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL Todas las publicaciones y documentos de patente descritos e indicados aquí se incorporan por referencia en su totalidad. La descripción anterior ha sido presentada únicamente para propósitos de ilustración y descripción. Esta descripción no pretende limitar la invención a la forma precisa descrita. Se pretende que el alcance de la invención se defina por las reivindicaciones anexas a esto.

Claims (41)

REIVINDICACIONES
1 .- Un portador farmacéutico, que comprende: (a) un grupo de enfoque que une la Proteína de unión de Vitamina D (DBP), y (b) un grupo de acoplamiento para conjugar dicho grupo de enfoque a un compuesto terapéutico, en donde dicho portador terapéutico aumenta la absorción, vida media , potencia o biodísponibilidad de dicho compuesto terapéutico en circulación .
2.- El portador farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde dicho grupo de enfoque se selecciona del grupo que consiste de vitamina D, análogo de vitamina D, metabolito relacionado con vitamina D, un análogo de un metabolito relacionado con vitamina D, un péptido, un anticuerpo anti-DBP, un derivado de anticuerpo anti-DBP, un aptámero de nucleótido, y una molécula basada en carbono pequeño que une DBP.
3.- El portador farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 1 , que además comprende una porción de andamiaje, en donde dicha porción andamiaje se selecciona del grupo que consiste de poli(eti lenglicol), polilisina, polietilenimina, poli(propilenglicol), un péptido, albúmina de suero, tiorredoxina, una inmunoglobulina, un aminoácido, un ácido nucleico, un glicano, un grupo modificador que contiene un enlazador reactivo, un polímero soluble en agua, un enlazador de cadena de carbono pequeño, y una porción terapéutica adicional .
4.- El portador farmaceutico de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde dicho grupo de acoplamiento se selecciona del grupo que consiste de un grupo reactivo amina, un grupo reactivo a tiol, un grupo de aleimida, un grupo tiol, un grupo aldehido, un grupo de NH-éster, un grupo haloacetilo, un grupo yodoacetilo, un grupo bromoacetilo, un grupo SMCC, un grupo sulfo SMCC, un grupo carbodiimida, entrelazadores bifuncionales, NHS-Maleimido, y combinaciones de los mismos.
5.- El portador farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha porción de andamiaje está entre aproximadamente 100 Da. y 200,000 Da.
6.- El portador farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde dicha porción de andamiaje está entre aproximadamente 100 Da. y 20,000 Da. , 200 Da. y 15,000 Da. , 300 Da. y 10,000 Da. , 400 Da. y 9,000 Da. , 500 Da. y 5,000 Da. , 600 Da. y 2,000 Da. , 1000 Da. y 200,000 Da. , 5000 Da. y 100,000 Da., 10,000 Da. y 80,000 Da. , 20,000 Da. y 60,000 Da. , o 20,000 Da. y 40,000 Da.
7.- Una composición farmacéutica, que comprende compuesto terapéutico conjugado a o formulado con un portador, en donde dicho portador comprende un grupo de enfoque que une la Proteína de unión de Vitamina D (DBP) y en donde dicho portador aumenta la absorción, biodisponibilidad, o vida media de dicho compuesto terapéutico y circulación.
8.- La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho grupo de enfoque se selecciona del grupo que consiste de vitamina D, un análogo de vitamina D, metabolito relacionado con vitamina D, un análogo de un metabolito relacionado con vitamina D, un péptido, un anticuerpo anti-DBP, un derivado de anticuerpo anti-DBP, un aptámero de nucleótido, y una molécula basada en carbono pequeño que se une a DBP.
9.- La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, que además comprende una porción de andamiaje, en donde dicha porción de andamiaje se selecciona del grupo que consiste de poli(etilenglicol), polilisina, polietilenimina, poli(propilenglicol), un péptido, albúmina de suero, tiorredoxina, una inmunoglobulina, un aminoácido, un ácido nucleico, un glicano, un grupo modificador que contiene un enlazador reactivo, un polímero soluble en agua común enlazador de cadena de carbono pequeño, y un compuesto terapéutico adicional.
10.- La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde dicho compuesto terapéutico se selecciona grupo que consiste de moléculas pequeñas, entidades químicas, ácidos nucleicos, derivados de ácido nucleico, péptidos, derivados de péptido, proteínas que ocurren naturalmente, proteínas que no ocurren naturalmente, ácidos nucleicos de péptido (PNA), péptidos engrapados, morfolinos, fosforodiamidato morfolinos, fármacos antisentido, fármacos silenciadores basados en ARIM, aptámeros glicoproteínas, enzimas, hormonas, citocinas, interferones, factores de crecimiento, factores de coagulación de sangre, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, derivados de anticuerpo, anticuerpos conjugados por toxina, efectores metabólicos, analgésicos, antipiréticos, agentes anti-inflamatorios, antibióticos, agentes antimicrobianos, agentes antivirales, fármacos antifúngicos, fármacos músculo-esqueléticos, fármacos cardiovasculares, fármacos renales, fármacos pulmonares, fármacos de enfermedad digestiva, fármacos hematológicos, fármacos urológicos, fármacos de metabolismo, fármacos hepáticos, fármacos neurológicos, fármacos a n ti diabéticos, fármacos anti-cancerí genos, fármacos para tratar condiciones del estómago, fármacos para tratar condiciones del colon, fármacos para tratar condiciones de la piel, o fármacos para tratar condiciones linfáticas.
1 1.- La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho compuesto terapéutico es una proteína que tiene actividad de FGF21 que comprende una secuencia de aminoácido con al menos una identidad secuencia de 90% para SEC I D NO: 2.
12.- La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 1 , en donde dicho grupo de enfoque es Vitamina D.
13.- La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 1 , en donde dicha porción de andamiaje es poli(etilenglicol) .
14.- Una composición farmacéutica, que comprende: (a) una proteína que tiene actividad de FGF21 que comprende una secuencia de aminoácido con al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC ID NO: 2, (b) una porción andamiaje que es poli(etilenglicol), y (c) un grupo de enfoque que es Vitamina D, en donde dicho grupo de enfoque aumenta absorción, biodisponibilidad, o la vida media de dicho compuesto terapéutico en circulación.
15.- La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho compuesto terapéutico es una proteína que tiene actividad de ghrelina que comprende una secuencia de aminoácido con al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC ID NO: 5.
16.- La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicho grupo de enfoque es Vitamina D.
17.- La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicha porción de andamiaje es poli(etilenglicol).
18.- Una composición farmacéutica, que comprende: (a) una proteína que tiene actividad de ghrelina que comprende una secuencia de aminoácido con al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC ID NO: 5, (b) una porción andamiaje que es poli(etilenglicol), y (c) un grupo de enfoque que es Vitamina D, en donde dicho grupo de enfoque aumenta la absorción, biodisponibilidad, o la vida media de dicho compuesto terapéutico en circulación.
19.- Un método para tratar un paciente que necesita un compuesto terapeutico, que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición terapéutica de cualquiera de las reivindicaciones 7-9.
20.- El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho compuesto terapéutico se selecciona grupo que consiste de moléculas pequeñas, entidades químicas, ácidos nucleicos, derivados de ácido nucleico, péptidos, derivados de péptido, proteínas que ocurren naturalmente, proteínas que no ocurren naturalmente, ácidos nucleicos de péptido (PNA), péptidos engrapados, morfolinos, fosforodiamidato morfolinos, fármacos antisentido, fármacos silenciadores basados en ARN, aptámeros glicoproteínas, enzimas, hormonas, citocinas, interferones, factores de crecimiento, factores de coagulación de sangre, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, derivados de anticuerpo, anticuerpos conjugados por toxina, efectores metabólicos, analgésicos, antipiréticos, agentes anti-inflamatorios, antibióticos, agentes antimicrobianos, agentes antivirales, fármacos antifúngicos, fármacos músculo-esqueléticos, fármacos cardiovasculares, fármacos renales, fármacos pulmonares, fármacos de enfermedad digestiva, fármacos hematológicos, fármacos urológicos, fármacos de metabolismo, fármacos hepáticos, fármacos neurológicos, fármacos antidiabéticos, fármacos anti-cancerígenos, fármacos para tratar condiciones del estómago, fármacos para tratar condiciones del colon, fármacos para tratar condiciones de piel, o fármacos para tratar condiciones linfáticas.
21.- El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicho compuesto terapéutico es una proteína que tiene actividad de FGF21 que comprende una secuencia de aminoácido con al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC ID NO: 2.
22.- El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicho compuesto terapéutico es una proteína que tiene actividad de ghrelina que comprende una secuencia de aminoácido con al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC ID NO: 5.
23.- El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho grupo de enfoque es Vitamina D.
24.- El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicha porción de andamiaje es poli(etilenglicol).
25.- El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicha composición farmacéutica está en una formulación farmacéuticamente aceptable.
26.- El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicha composición farmacéutica se suministra a dicho paciente mediante un modo transdérmico, oral, parenteral, subcutáneo, intercutáneo, intravenoso, intramuscular, intra-articular intrasinovial, intra-esternón, intratecal, intra-lesional , inyección intracraneal, infusión, inhalación, ocular, tópico, rectal, nasal, bucal, sublingual, vaginal, o de depósito implantado.
27.- El uso de la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, 14 o 18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que necesita de dicho medicamento.
28.- Un método para fabricar la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, 14 o 18, que comprende conjugar un grupo de enfoque y un fármaco en un compuesto de portador-fármaco, en donde dicho paso de conjugación utiliza un grupo de acoplamiento.
29.- El método de acuerdo con la reivindicación 28, que además comprende conjugar una porción de andamiaje a dicho grupo de enfoque o dicho fármaco.
30.- El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde dicho grupo de acoplamiento se selecciona del grupo que consiste de una grupo reactivo a amina, un grupo reactivo a tiol , un grupo de maleimida, un grupo tiol, un grupo aldehido, un grupo NHS-éster, un haloacetilo, un grupo yodoacetilo, un grupo bromoacetilo, un grupo SMCC, un grupo sulfo SMCC, un grupo carbodiimida, entrelazadores bifuncionales, N HS-Maleimido, y combinaciones de los mismos.
31 .- La composición farmacéutica que resulta del método de la reivindicación 28, en donde dicha composición comprende un compuesto de portador-fármaco que contiene un enlace seleccionado del grupo que consiste de un enlace de tiol, un enlace de amida, un enlace oxima, un enlace de hidrazona, y un enlace de tiazolidinona.
32.- El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde dicho paso de conjugación se logra mediante reacciones de ciclo-adición.
33.- El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde dicho grupo de enfoque se selecciona del grupo que consiste de vitamina D, análogo de vitamina D, metabolito relacionado con vitamina D, un análogo de un metabolito relacionado con vitamina D, un péptido, un anticuerpo anti-DBP, un derivado de anticuerpo anti-DBP, un aptámero de nucleótido, y una molécula basada en carbono pequeño que se enlaza a DBP.
34.- El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde dicha porción de andamiaje se selecciona del grupo que consiste de poli(etilenglicol) , polilisina, polietilenimina, poli(propilenglicol), un péptido, albúmina de suero, tiorredoxina, una inmunoglobulina, un aminoácido, un ácido nucleico, un glicano, un grupo modificador que contiene un enlazador reactivo, un polímero soluble en agua, un enlazador de cadena de carbono pequeño, y una porción terapéutica adicional.
35.- La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 0, en donde dicho compuesto terapéutico es un anticuerpo.
36.- La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 35, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo anti-TNFalfa que se enlaza específicamente a una proteína que tiene una secuencia de aminoácido con al menos una identidad de secuencia de 90% para SEC I D NO: 10.
37.- La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 36, en donde dicho anticuerpo anti-TNFalfa se enlaza específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 10.
38.- La composición farmaceutica de acuerdo con la reivindicación 37, en donde dicho grupo de enfoque es Vitamina D y dicha porción de andamiaje es poli(etilenglicol) .
39.- Un portador farmacéutico que comprende una fórmula I : B— L1— S— L2— L3— C I en donde: B es un grupo de enfoque seleccionado de vitamina D, un análogo de vitamina D, un metabolito relacionado con vitamina D, un análogo de un metabolito relacionado con vitamina D, un péptido que une DBP, un anticuerpo anti-DBP, un derivado de anticuerpo anti-DBP, un aptámero de nucleótido que une DBP, o una molécula basada en carbono pequeña que une DBP; S es una porción de andamiaje, que comprende poli(etilenglicol), polilisina, polietilenimina, poli(propilenglicol), un péptido, albúmina de suero, tiorredoxina, una inmunoglobulina, un aminoácido, un ácido nucleico, un glicano, un grupo modificador que contiene un enlazador reactivo, ácido poliláctico, un polímero soluble en agua, un enlazador de cadena de carbono pequeña, o una porción terapéutico adicional; C es un grupo reactivo a amina, un grupo reactivo a tiol, un grupo de maleimida, un grupo de tiol , un grupo de disulfuro, un grupo aldehido, un grupo NHS-éster, un éster 4-nitrofenilo, una acilimidazol, un grupo haloacetilo, un grupo yodoacetilo, un grupo bromoacetilo, un grupo SMCC, un grupo sulfo SMCC, un grupo carbodiimida y entrelazadores bifuncionales tales como NHS-maleimido o combinaciones de los mismos; L1 y L2 son enlazadores independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -C(O)N H-, -HNC(O)-, -C(O)0-, - OC(O)-, -O-, -S-S-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- y -NH-; L3 es -(CH2)0-¡ n es un número entero de 0-3; y o es un número entero de 0-3.
40.- El portador farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 39, que además comprende la fórmula V:
41 .- El portador farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 39, que comprende la fórmula VI :
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