PT730473E - Conjugados de hirudina compreendendo hirudina e compostos lipofilos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO “CONJUGADOS DE HIRUDINA COMPREENDENDO HIRUDINA E COMPOSTOS LIPÓFILOS” A invenção referc-$e a novos conjugados dc hirudina que são formados a partir dc uma hirudina e compostos lipófilos, à sua preparação assim como à sua utilização como medicamentos. A hirudina é uma proteína de origem natural conhecida desde há muito tempo com propriedades de inibição da coagulação do sangue. É o inibidor da trombina mais enérgico e mais selectivo conhecido até agora (Naturwissenschaften, 42,537 (1995); Hoppe-Seylers Z. fiir Biol. Chemie 366, 379 (1985)). A hirudina natural é uma mistura de péptidos quimicamente aparentados com uma massa molecular de 6900 - 7000 dalton e 64 - 65 aminoácidos. Até agora já se descreveram cerca de 20 variantes de hirudina existentes na natureza (Scharf et al., FEBS-Letters 255,105-110, (1989)).

Na EP 345616 descrevem-se produtos de acoplamento de hirudina e suportes poliméricos. Como suportes mencionam-se polímeros solúveis e insolúveis como dextrano, sefarose, levano e hidrolisados parciais de gelatina. As hirudinas modificadas com materiais de suporte devem possuir propriedades farmacológicas melhoradas como um valor do tempo de semitransformação prolongado.

Em DE 40 14 260 descrevem-se conjugados hirudina-polialquilenoglicol que, em comparação com hirudina natural possuem um perfil de actividade farmacológica favorável, por exemplo uma actividade biológica prolongada e uma melhor biodisponibilidade.

Nas duas memórias descrilivas publicadas acima mencionadas, descrcvem-se derivados de hirudina com actividade prolongada que se obtêm por modificação da hirudina com um polímero de elevado peso molecular. Nestes casos, a massa molecular de polímero monta a alguns quilodalton de modo que a massa molecular do polipéptido hirudina é consideravelmente aumentada. Esses polímeros de elevada massa molecular no entanto não são quimicamente definidos com exactidão; constituem mais uma população de diferentes moléculas que se distribuem por uma gama de massas moleculares. Por consequência, os produtos de acoplamento da hirudina preparados com elas não consistem num único composto químico mas sim em populações de moléculas que são diferentes umas das outras relativamente à sua massa molecular.

No entanto, pretende-se que as substâncias activas que são utilizadas como medicamento sejam definidas quimicamente da maneira mais exacta possível para o seu comportamento no organismo poder ser melhor controlado.

Existia portanto a necessidade de proporcionar derivados da hirudina com propriedades farmacológicas melhoradas em relação à hirudina e que não possuam os inconvenientes acima mencionados das hirudinas modificadas com polímeros de elevado peso molecular. A satisfação desta necessidade é resolvida por meio de conjugados de hirudina formados a partir duma hirudina e de um ou mais compostos lipófilos em que o composto lipófilo possui um coeficiente de repartição octanol-água maior que 1,8 e está acoplado com a hirudina por ligação química covalente.

Para os conjugados de hirudina de acordo com a invenção são apropriadas todas as hirudinas que aparecem naturalmente e também as variantes delas derivadas, as chamadas muteínas e fragmentos com inibição da trombina.

Essas hirudinas e a sua preparação são por exemplo conhecidos por meio de EP 171024, EP 158 986, DE 38 055 406, WO 92/1712, GB 2 247 239, EP 557199, WO 92/5748, DE 40 14 260.

Além disso, são também apropriados para a preparação dos conjugados da hirudina de acordo com a presente invenção os peptidos e derivados de peptidos cstruturalmente derivados de hirudina como por exemplo se descreve em EP 333 356.

Preferivelmente utilizam-se as hirudinas em que o acoplamento do composto lipófilo não origina perda de actividade. Isto é por exemplo o caso de hirudinas em que o acoplamento 3 Ί !· ι

se realiza sobre cadeias laterais dos aminoácidos 27 a 37. São especialmente apropriadas para o acoplamento as posições dos aminoacidos 27 e 33 (em relação à hirudina natural HV1) porque estes compostos ficam no topo duma região de forma semelhante a dedo e não perturbam a interacção da hirudina com trombina. A ligação dos compostos lipófilos, eventualmente do espaçador, com os compostos lipófilos, pode realizar-se em grupos amino da hirudina, por exemplo o grupo amino N-terminal livre, grupos amino das cadeias laterais da lisina, grupos amino da histidina, grupos amidino de arginina, ou em grupos hidroxi da hirudina por exemplo de cadeias laterais de tirosina, serina ou treonina. São especialmente apropriados para o acoplamento dos compostos lipófilos os grupos amino das cadeias laterais de lisina. É igualmente possível a ligação do composto lipófilo a uma tirosina modificada da hirudina que se pode obter por nitração e redução (Meth. Enzymol. 25, 515-521, (1972)). A arilaminotirosina assim formada pode então acoplar-se o composto lipófilo com métodos de acoplamento conhecidos.

Como composto lipófilo são apropriados compostos que dispõem de um ou mais grupos funcionais tais como grupos amino, hidroxi, carboxi ou ácido sulfónico e que possuem um coeficiente de repartição octanol-água maior que 1,8.

Os compostos lipófilos podem ser substâncias naturais, por exemplo, ácidos gordos saturados ou insaturados, terpenos, prostaglandinas, vitaminas lipossolúveis, carotenóides ou esteróides mas também ácidos carboxílicos sintéticos, álcoois, aminas e ácidos sulfónicos com um ou mais compostos de alquilo, arilo, alcenilo ou também compostos várias vezes insaturados que podem ser não só lineares mas também ramificados e eventualmente substituídos por halogéneo ou grupos nitro, ciano, alcoxi, alquiltio ou halogenoalquilo. São exemplos de compostos lipófilos os ácidos gordos ácido capróico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirlstico, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido t

araquídico e ácido beénico e os ácidos gordos insaturados ácido palmitoleico, ácido oleico, ácido línoleico, ácido linolénico, ácido ricinoleico, ácido octadecatraenóico, ácido icosaenóico, ácido icosadienóico, ácido araquidónico, ácido icosapentaenóico ou ácido erúcico assim como álcoois gordos e aminas gordas que se podem obter a partir deles. São também apropriadas misturas de ácidos gordos tal como se obtêm por saponificação de óleos gordos naturais como óleo de coco, óleo de palmiste, óleo de colza, azeite, óleo de semente de girassol, óleo de semente de girassol com elevado teor de ácido oleico, óleo de rícino ou sebo de vaca.

Outros exemplos de compostos lipófilos são os carotenóides zeaxantina, rodovibrinaou astaxantina, os esteróides colesterol, desmosterol, coprosterol, cerebroesterol, ácido colânico, ácido eólico, desidrocorticosterol, aldosterona, androsterona, testoterona, taquisterol, lanosterol ou lumisterol, os terpenos geraniol, nerol, linalool, mentol, carveol, bomeol, farnesol, nerolidol ou esclareol, as prostaglandinas brefeldina, PGI^ ou PGF2, as vitaminas Al ou D mas também compostos sintéticos como oxoálcoois, hexilamina, ácido etil-hexanóico, etil-hexanol, etil-hexilamina ou ácidos alquilbenzenossulfónicos.

Compostos lipófilos especialmente apropriados para a invenção são os compostos da fórmula geral I

Rl na qual os símbolos significam R1 e R2, independentemente um do outro, (CH^-CCR3) (R4) - (CH2)n-(CH=CH-CH2)0-CH3, m, os números 0 a 28, n, os números 3 a 6, o, os números 0 a 6, R3 e R4, independentemente um do outro H, Cw-alquilo > cicloalquilo, arilo ou benzilo, eventualmente substituído por halogéneo, grupos nitro, ciano, alquilo, alcoxi, alquiltio, halogenoalquilo.

Compostos especialmente preferidos da fórmula I são aqueles em que os radicais R1 é R2 consistem em 4 a 16 átomos de C e que são saturados ou mono-insaturados, diinsaturados ou triinsaturados.

Como compostos lipófilos, são ainda também apropriados os da fórmula geral Π H-Y-R1 II em que os símbolos significam R1 (CH^-CfR3) (R4) - (CH^CH- CH-CH2)0-CH3 e Y -C(0)-, -NÇR5)-, -O- com R5, H, Q.jg-alquilo, C^g-alcenilo, CM-cicloalquilo, arilo ou benzilo, eventualmente substituído por halogéneo ou grupos nitro, ciano, alquilo, alcoxi, alquiltio, halogenoalquilo. A preparação dos conjugados de hirudina de acordo com a invenção realiza-se de forma tal que se efectua o acoplamento de uma hirudina ou directamente ou por meio de um espaçador com um ou vários compostos lipófilos.

Como espaçadores são apropriadas todas as moléculas bifuncionais ou polifuncionais que baseando-se nos seus grupos polifuncionais, permitem um acoplamento - eventualmente depois da activação - de hirudina com um composto lipófilo.

Como espaçadores são especialmente apropriados aminoácidos, oligopéptidos. monossacáridos, dissacáridos ou oligossacáridos, ácidos aminocarboxílicos ou hidroxicarboxílicos, especialmente os que têm um comprimento da cadeia de 2 a 10 átomos de C que, para aumentar a hidrofilia, podem possuir mais outros substituintes por exemplo C,-C4-oligoalquileno-glicóis.

Para o acoplamento de compostos lipófilos com hirudina, podem-se utilizar por exemplo os seguintes espaçadores: 6 -X—CHo -X—CH2—CK (OH)—CH2 —x—co—CH2—CH2—co—, —X—CH2—co—,

“XW w em que X significa S,, NH, N(CH3), N(C2H5) W significa H, OH, Cl Z significa um grupo C2-C6-alquileno ou um grupo p-fenileno.

Para a obtenção da actividade biológica dos conjugados de hirudina depois da ligação a superfícies tais como membranas de células ou superfícies sintéticas pode ser necessária a utilização dum espaçador que origina uma distância.

Para os conjugados de hirudina de acordo com a presente invenção são apropriados todos aqueles compostos que possuem um ou mais grupos funcionais como por exemplo grupos amino, hidroxi, carboxi ou de ácido sulfónico porque estes grupos funcionais, depois da activação, podem reagir com os grupos reactivos da hirudina. O tipo da activação dos compostos lipófilos, eventualmente o acoplamento por intermédio de um espaçador, depende do grupo funcional e pode realizar-se de maneira conhecida pelos especialistas no assunto.

Se o composto lipófilo ou o espaçador com o composto lipófilo possuir um grupo carboxilo, então a activação pode efectuar-se por exemplo por transformação num éster de alcenilo, éster de arilo, O-semiacetal, O-acil-semiaminoacetil, O-acil-semicetal, O-acil-semiaminocetal, O-acil-lactina, anidrido de ácido carboxílico simétrico ou assimétrico, anidrido de ácido carboxílico-ácido carbâmico, O-acil-iso-ureído, O-acil-N-alquil-hidroxilamina, um ácido O-acil-hidroxâmico, uma O-acil-N,JN-diacil-hidroxilamina, O- 7 .-t> *. Μ

aciloxima, O-acil-N-azo-N-acil-hidroxilamína, O-acil-N-azo-N-aril-hidroxilamina, anidrido de ácido carboxílico-ácido sulfuroso, anidrido de ácido carboxílico-ácido sulfúrico, anidrido de ácido carboxílico-ácido fosforoso, anidrido de ácido carboxílico-ácido fosfórico, um composto de aciloxifosfónio, anidrido de ácido carboxílico, um composto de aciloxifosfónico, um anidrido de ácido carboxílico-fosforamida, fluoreto de ácido carboxílico ou cloreto de ácido carboxílico como se descreve cm Miillcr, Houbcn-Weyl, “Methoden der organischen Chemie”, Vol. 15/1 e 15/2, Thieme Verlag, Estugarda (1974) ou Bodanszky, Klausner, Ondetti, “Peptide Systhesis”, páginas 85-128, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1976 ou noutros tratados fundamentais conhecidos da química dos péptidos.

Grupos reactivos especialmente apropriados são cloretos de ácidos carboxílicos, anidridos simétricos, ésteres de arilo substituídos por 1,2,3 ou 5 átomos de halogéneo ou grupos nitro, ésteres de N-hidroxissuccinimida, ésteres de N-hidroxiftalimida ou ésteres de N-hidroxibenzotriazol.

De maneira análoga podem-se activar grupos de ácido sulfónico.

Se nos compostos lipófilos, como grupos funcionais existirem grupos amino ou hidroxi, então o acoplamento dos compostos lipófilos com a hirudina realiza-se preferivelmente por meio de um espaçador que, como segundo grupo funcional, possui um grupo de ácido carboxílico ou um grupo de ácido sulfónico e é activado de acordo com a maneira acima descrita para o acoplamento à hirudina.

Como compostos lipófilos, são apropriados também alquildicetenos que podem ser acoplados com a hirudina directamènte sem activação.

Como alquildicetenos, preferivelmente utilizam-se compostos da fórmula geral ΙΠ

na qual os símbolos significam R1 e R2, independentemente um do outro, 8 'Vj

(CH^-CCR3) (R4) - (CH2)n-(CH=CH-CH2)0-CH3) m, os números 0 a 28, n, os números 3 a 6, o, os números 0 a 6, R3 e R4, independentemente um do outro H, C^-alquilo, C^-cicloalquilo, arilo ou benzilo, eventualmente substituído por halogénco ou grupos nitro, ciano, alquilo, alcoxi, alquiltio, halogenoalquilo.

Compostos da fórmula geral ΠΙ especialmente preferidos são alquildicetenos gordos que por exemplo são descritos em DE 2927118 derivados dos ácidos gordos saturados ácido capróico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico e ácido beénico e os ácidos gordos insaturados ácido palmitoleico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido ricinoleico, ácido octadecatraenóico, ácido icosaenóico, ácido icosadienóico, ácido araquidónico, ácido icosapentaenóico ou ácido erúcico.

Ainda se podem usar alquildicetenos gordos que derivam de misturas de ácidos gordos como se obtêm na saponificação de gorduras naturais como óleo de coco, óleo de palmiste, óleo de colza, azeite, óleo de semente de girassol, óleo de semente de girassol com elevado teor de ácido oleico, óleo de rícino ou sebo de vaca.

Os conjugados de hirudina descritos de acordo com a presente invenção são quimicamente definidos exactamente e possuem, em comparação com a hirudina, um perfil de actividade biológica consideravelmente mais alargado e tuna melhor biodisponibilidade. Além disso, as hirudinas hidrófobas permitem uma etiquetagem da substância activa sobre as superfícies de células sanguíneas e superfícies de vasos sanguíneos.

Em virtude destas propriedades, os conjugados de hirudina de acordo com a presente invenção são medicamentos valiosos para o tratamento e a profilaxia de perturbações tromboembólicas dependentes da trombina como trombose das veias profundas, embolias dos pulmões, enfartes do miocárdio ou cerebrais e angina instável e ainda para a terapia da coagulação intravasal disseminada (DIC) bem como na comedicação com trombolíticos como por exemplo estrcptoquinase, uroquinase, pro-uroquinase, t-PA, APSAC, activadores 9 de plasminogénio das glândulas salivares de animais assim como as formas recombinantes e mutantes de todas estas substências para encurtar o tempo de reperfusão e prolongar o tempo de reoclusão.

Um outro campo de utilização é o impedimento da reoclusão prematura dependente da trombina e a restcnosação posterior depois de PTCA, o impedimento da proliferação das células dos músculos lisos provocada por trombina, o impedimento da acumulação de trombina no Sistema Nervoso Central (ZNS) (por exemplo, na doença de Alzheimer), o combate a tumores e o impedimento de mecanismos que originam a adesão e a metastasição de células de tumores.

Os novos compostos podem ser usados nas formas de aplicação galénicas usuais sólidas ou líquidas, por exemplo, sob a forma de soluções, pomadas, cremes ou “sprays”. Estas são preparadas de acordo com a maneira de proceder usual. Neste caso, as substâncias activas podem ser processadas com os agentes auxiliares galénicos usuais como cargas, agentes conservantes, agentes de regulação do escoamento, agentes molhantes, agentes dispersantes, agentes emulsionantes, dissolventes e/ou gases de arrastamento (vidè H. Sucker et al: Pharmazeutische Technologie, Thieme-Verlag, Estugarda, 1978).

As propriedades hidrófobas possibilitam também uma aplicação transdérmica dos novos derivados de hirudina especialmente em ligação com reforçadores da penetração como por exemplo sulfóxido de dimetilo, álcoois ou também azonas ou por exemplo iontoforese. A dosagem depende da idade, estado e peso do paciente assim como do tipo de aplicação. De acordo com a forma de administração e a indicação, a dose diária de substância activa está em geral compreendida entre 20 e 40 000 ATU/kg de peso corporal.

Os conjugados de hirudina podem também ser utilizados com êxito para o revestimento antitrombogcnico de superfícies artificiais como por exemplo membranas de hemodiálise e os sistemas de tubos flexíveis necessários, na substituição de vasos sanguíneos ou em máquinas de coração-pulmões.

Os seguintes exemplos servem para o esclarecimento da invenção. 10

Exemplo 1

Octildiceteno

Dissolveram-se 400,1 g de Ν,Ν-dimetilciclo-hexilamina em 2 litros de tolueno a 50 até 60°C e, a esta temperatura, adicionaram-se gota a gota 487,5 g de cloreto de ácido octanóico durante 2,5 horas. Depois agitou-se a 50 até 60°C durante duas horas e arrefeceu-se até à temperatura ambiente.

Lavou-se a mistura reaccional com ácido sulíurico 1N arrefecido com gelo, água e solução saturada de cloreto de sódio e secou-se a fase orgânica sobre sulfato de magnésio. Purificou-se o produto bruto por . destilação fraccionada. Como fracção principal, obtiveram-se 317,3 g de um líquido incolor a uma temperatura da cabeça de 135°C e uma pressão de 0,3 mbar. De acordo com a análise por GC, o produto consiste em 97% de octildiceteno. Os espectros de IV, 'H-RMN e 13C-RMN concordam com a estrutura reivindicada.

Exemplo 2

Acoplamento de octildiceteno a hirudina

Como hirudina utilizou-se uma muteína de hirudina que se diferencia de hirudina HV1 natural por meio da troca dos seguintes aminoácidos: Pos. 27: Lys; Pos. 33:Lys; Pos. 36:Arg; Pos. 47:Arg. A preparação de uma tal muteína de hirudina é descrita em DE 4014 260.

Dissolveram-se 20 mg de muteína de hirudina em 1 ml de tampão de borato de sódio de pH 9,0 100 mM e misturou-se com 1 ml de n-propanol e 1,5 mg de octildiceteno e, em seguida, incubou-se a 4°C sob intensa agitação.

Depois de 30 minutos de tempo de reacção, separou-se o octildiceteno que não reagiu por extracção com n-hexano (1 volume/volume). Aplicou-se a mistura de produto assim obtida, depois de diluir 50 vezes com 0,1 % de TFA/HzO numa coluna Hi-Pore RP 304 (250 x 4,6 cm, Biorad, No. 125-0550) e separou-se com o seguinte gradiente:

Solução A: 0,1 % TEA/HjO Solução B: 0,1 % TFA/Acetonitrilo Caudal: 1 ml/min Detecção: 216 nm Tempo (min) Proporção de B (%) 0 0 40 50 40,5 100 45 100 45,5 0

Os complexos de hirudina-diceteno foram eluídos sob as seguintes condições: % deB 1 Unidade de diceteno por grupo hirudina (Octil-dicetenoj-hirudina) 56% 2 Unidadesde diceteno por grupo hirudina (Octil-diceteno2-hirudina) 60% 3 Unidades de diceteno por grupo hirudina (Octil-diceteno3-hirudina) 68% A actividade específica dos derivados isolados a partir da mistura de acoplamento montou a ATU/mg Octil-diceteno^hirudina 7000 Octil-diceteno2-hirudina 8000 Octil-diceteno3-hirudina 4900 (determinada por meio do ensaio de inibição da trombina com o substrato cromogénico S 2238 (Kabi-Pharmacia), FEBS-Lett. (1983) 164,307, determinação da proteína por meio da extinção de UV (£molar = 3148, VMolxm; λ = 278 nm)

Exemplo 3

Hexildiceteno 12

Colocaram-se 272,2 g de Ν,Ν-dimetildclo-hexilamina em 1 litro de tolueno e fez-se circular água num separador de água. Deixou-se arrefecer a 50 até 60°C, adicionaram-se gota a gota 269 g de cloreto de ácido hexanóico e depois agitou-se a 55°C durante duas horas a 55°C.

Lavou-se a mistura reaccional com ácido sulfúrico 1N, água e solução saturada de cloreto de sódio e secou-se a fase orgânica sobre sulfato de magnésio. Purificou-se o produto bruto por destilação fraccionada. Como fracção principal, obtêm-se 172,8 g de um líquido incolor a uma temperatura de transição de fase de 95 a 100°C e uma pressão de 0,15 mbar. De acordo com a análise por GC, o produto consiste em 98 % de hexildiceteno. Os espectros de IV, ‘H-NMR e 13C-NMR concordam com a estrutura reivindicada.

Exemplo 4

Acoplamento de hexildiceteno com hirudina O acoplamento de hexildiceteno com hirudina realizou-ser analogamente ao Exemplo 2. Para a reacção, utilizam-se 20 mg da muteína de hirudina dissolvidos em 2 ml de n-propanol, carbonato de Na de pH 9,5 50 mM. A separação da mistura de produtos realiza-se depois de interromper a reacção (veja-se Exemplo 2) numa coluna de HPCL RP 304 (Biorad No. 125-0550) com o seguinte gradiente:

Solvente A: Solvente B: Caudal: Detecção:

Acetato de amónio 5 mM de pH 6,5 Metanol 1 ml/min 216 nm

Tempo (min) Proporção de B (%) 0 3 5 30 30 70 30,1 100 35,0 100 13 Ί

35,1 Ο

Os produtos de acoplamento hexil-diceteno,-hirudina, hexil-diceteno2-hirudina e hexil-dicetenoj-hirudina são eluídos em gradiente com 42,5, 44 e 55% de solvente B. A actividade foi determinada como se descreve no Exemplo 2 e para a hexil-diceteno3-hirudina foi igual a 5700 ATU/mg.

Exemplo 5

Cloreto dos ácidos gordos de óleo de girassol

Dissolveram-se 70,5 g de ácido gordo de óleo de girassol de elevado teor oleico contendo 89% de ácido oleico e o índice de ácido igual a 219 em 250 ml de tolueno e aqueceu-se a 40°C. A esta temperatura adicionaram-se gota a gota 41,2 g de cloreto de oxalilo e agitou-se durante duas horas.

Eliminou-se o solvente por destilação a 60°C e sob pressão reduzida. Obtiveram-se 75 g de cloreto de ácido gordo de óleo de girassol sob a forma de óleo amarelo com o índice de cloreto igual a 12,0.

Exemplo 6

Alquildiceteno a partir de cloreto de ácido gordo de óleo de girassol (Sunildiceteno)

Colocaram-se 65 g de cloreto de ácido gordo de óleo de girassol com o índice de cloreto igual a 12,0 e aqueceu-se a 50°C. A esta temperatura adicionaram-se gota a gota durante 285 minutos 33,7 g de Ν,Ν-dimetilciclo-hexilamina. Manteve-se seguidamente a mistura reaccional a 50°C durante duas horas e depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente.

Separou-se o sólido por filtração sob pressão e lavou-se a fase orgânica com ácido sulíurico 1 M, solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio e solução saturada de cloreto de sódio. Depois da secagem da fase orgânica sobre sulfato de magnésio, eliminou-se o solvente por destilação sob pressão reduzida. Obtém-se um resíduo de 51,8 g de um líquido oleoso ligeiramente amarelo que, de acordo com ‘H-NMR e UC-NMR, consistia em 95% do alquildiceteno.

Exemplo 7

Preparação de sunildiceteno-hirudina

Dissolveram-se 20 mg de hirudinomuteína (como no Exemplo 2) em 2 ml de 50% de n-propanol, tampão de carbonato de potássio de pH 9,5 50 mM, misturou-sc com 8,5 g dc sunildiceteno e incubou-se a 20°C sob intensa agitação. Extraíu-se o diceteno em excesso com n-hexano (1 volume/volume) depois de decorrido o tempo de reacção. Para a separação, a mistura obtida como produto foi aplicada numa coluna de HPLC RP-304 (Bio-Rad. No. 125-0550; 250 x 4,6 cm) e eluíu-se em seguida a coluna com o seguinte gradiente:

Solvente A: Solvente B: Caudal: Detecção:

Acetato de amónio 5 mM de pH 6,5 Metanol 1 ml/min 216 nm

Tempo (min) Proporção de B (%) 0 0 5 70 30 95 30,1 100 35,0 100 35,1 0

Os conjugados de sunildiceteno-hirudina sunilrhirudina, sunil2-hirudina e sunil3-hirudina são eluídos a 77%, 80% e 90% de metanol.

As actividades específicas foram determinadas como no Exemplo 2 e montaram a 7700 ATU/mg para sunilrhirudina 7100 ATU/mg para sunil2-hirudina 6100 ATU/mg para suml3-hirudina 15 ί

Exemplo 8

Reacção de palmitato de N-hidroxissuccinimida com hirudina

Dissolveram-se 20 mg de hirudinomuteína (como no Exemplo 2) em 1 ml de carbonato de sódio 100 mM de pH 9,5 e misturou-se com 1 ml de uma solução de 1,5 mg de palmitato de N-hidroxissuccinimida (Sigma) em 1,4-dioxano e fez-se reagir a 20°C sob agitação. Depois de um tempo de reacção de 4 h, interrompeu-se a reacção com a hirudina por agitação de um excesso 5 vezes molar de butilamina (uma hora à temperatura ambiente). A separação da mistura dos produtos da reacção realizou-se numa coluna de HPLC RP-304 (Biorad 125-0550) com o seguinte gradiente:

Solvente A: Acetato de amónio 5 mM de pH 6,5

Solvente B: Metanol a 100%

Caudal: 1 ml/min

Detecção: 216 nm

Tempo (min) Proporção de B (%) 0 0 5 40 30 90 30,1 100 35 100 35,1 0 A ácido palmíticOi-hirudina é eluída a 57%, a ácido palmitico2-hirudina a 62% e a ácido palmítico3-hirudina a 76% de dissolvente B.

Exemplo 9

Preparação de ácido oleico-hirudina

1C

Dissolveram-se 2 g de anidrido oleico em 4 ml de dioxano, misturou-se com 460 mg de N-hidroxissuccinimida e agitou-se à temperatura ambiente durante 2 h. Misturaram-se então 200 μΐ desta solução do ácido oleico activado com 20 ml de n-propanol e 20 ml de uma solução de hirudina (20 mg/ml) em carbonato de Na 0,1 M ou borato de Na a pH 9 e incubou-se à temperatura ambiente durante 4 h. Interrompeu-se a reacção por adição de etanolamina (excesso molar duplo em relação ao ácido oleico). 2 ml da mistura de acoplamento foram diluídos com 40 ml de tampão de fosfato de Na de pH 7,0 20 mM, Na Cl 3,5 M (agente eluente A) e aplicados numa coluna TSK-butilo (1 cm x 28 cm, Vol: 22 ml, carregamento 2 mg/ml de gel) e lavou-se a coluna com um caudal de 2 ml/min com 6 volumes da coluna (SV) do agente eluente A e separou-se com o seguinte gradiente (agente eluente: fosfato de Na de pH 7,0 20 mM):

1. 2,5 SV 70 % B 2. 2,5 SV 80 % B 3. 2,5 SV 90 % B 4. 2,5 SV 100 % B 5. 2,5 SV 30 % Metanol em B 6. 2,5 SV 40 % Metanol em B

Os derivados de hirudina foram eluídos com 100% de B (ácido oleico,-hirudina e ácido oleico2-hirudina) e 30% de metanol (ácido oleico3-hirudina). As actividades específicas montaram a 11000 U/mg para ácido oleico,-hirudina, 6200 U/mg para ácido oleico2-hirudina e 6600 U/mg para ácido oleico3-hirudina.

Exemplo 10

Preparação de colesterina-hirudina

Misturou-se 1 ml de solução de hirudina (20 mg/ml em carbonato de Na ou borato de Na de pH 9,5 0,1 M) com uma solução de colesterina activada com 3,2 mg de N-hidroxissuccinimida em 1,2 ml de THF e incubou-se por adição de etanolamina (excesso molar duplo em relação à colesterina) e regulou-se o pH para 7,0. 17

2 ml da solução de acoplamento foram diluídos com 8 ml de solução de acetato de amonio (2 mM, pH 6,0, agente eluente (A) e, com um caudal de 2,5 ml/min aplicou-se numa coluna HiPore BioRad RP 304 (10 x 250 mm) e separou-se com o seguinte gradiente:

Minutos % de B 0 0 10 40 60 90 A colesterina-hirudina é eluída em 38 minutos. A actividade específica do derivado montou a 16000 U/mg.

Preparou-se a colesterina activada da seguinte maneira:

Aqueceram-se a refluxo 15,0 g de 2|3-colesterol e 5,2 g de anidrido succínico em 40 ml de piridina durante 22 horas e em seguida retomou-se em 250 ml de MTBE. Extraíu-se a fase orgânica com 200 ml de ácido clorídico 1N, 200 ml de água e 200 ml de solução saturada de cloreto de sódio e agitou-se com sulfato de sódio e carvão activo. O filtrado foi isentado do dissolvente. Resultaram 18,1 g de succinato de colest-5-en-3β-ilo.

Colocaram-se 1,94 g do éster assim obtido e 0,55 g de N-hidroxissuccinimida em 12 ml de diclorometano a 4°C e adicionaram-se 1,01 g de Ν,Ν-diciclo-hexilcarbodiimida. Deixou-se aquecer até à temperatura ambiente, agitou-se durante a noite e separou-se o sólido por filtração. Cromatografou-se o produto bruto contido na fase orgânica em 80 g de gel de sílica (diclorometano + acetato de etilo = 2+1). Obtiveram-se 1,7 g de colesterina activada com N-hidroxissuccinimida (N-[3-(colest-5-en-3P-iloxicarbonil)-propioniloxi]-succinimida).

Exemplo 11

Preparação de farnesil-hirudina

Diluíram-se 5,6 ml de uma solução de hirudina (21 mg/ml em carbonato de Na de pH 9 0,1 M com 5,5 ml de n-propanol, misturou-se com 32 mg de álcool famesílico e carbonato de p-nitrofenilo e incubou-se à temperatura ambiente sob agitação durante 12 h. Diluíu-se então a mistura reaccional com 150 ml de NaCl 2 M, fosfato de Na de pfi 7 20 mM e separou-se numa coluna de t-butilo (carregamento 2 mg de proteína/ml de gel, altura da coluna 25 cm). Em seguida, lavou-se a coluna com um gradiente linear de NaCl 2 M, fosfato de Na de pH 7 20 mM (25 volumes da coluna). A famesil-hirudina foi eluída no fim do gradiente com fosfato de Na 20 mM. Determinou-se a actividade específica como no Exemplo 2 e esta montou a 11300 U/mg.

Preparou-se o álcool famesílico-carbonato de p-nitrofenilo de acordo com a seguinte maneira:

Dissolveram-se 1,40 g de famesol e 10,1 g de diazo-[2,2,2]-biciclo-octano em 20 ml de diclorometano e adicionaram-se gota a gota 3,63 g de cloroformiato de p-nitrofenilo em 10 ml de diclorometano. Agitou-se durante 1,5 horas, eliminou-se o dissolvente em vácuo e cromatografou-se o produto bruto em 150 g de gel de sílica (hexano + acetato de etilo = 20+1). Obtiveram-se 2,2 g de álcool famesílico-carbonato de p-nitrofenilo.

Exemplo 12

Preparação de ácido esteárico-hirudina

Dissolveu-se 0,5 g de cloreto de estearoilo em 2 ml de 1,4-dioxano, misturou-se com 0,29 g de N-hidroxissuccinimida assim como 0,1 ml de trietilamina e agitou-se à temperatura ambiente durante 3 h. A mistura reaccional foi misturada com 1 ml de água e regulou-se o pH a 5 por adição de lixívia. Misturaram-se 60 μΐ da solução de ácido esteárico activado com succinimida com 2,5 ml de solução de hirudina (21 mg/ml) em carbonato de Na de pH 9 0,1M) e 2,5 ml de dioxano e incubou-se sob agitação à temperatura ambiente durante 12 h. Em seguida, purificou-se a mistura reaccional por RP-HPLC preparativa (veja-se Exemplo 2). Os derivados foram eluídos a 48% de B, 54% de B, 62% de B e 74% de B. As actividades específicas montaram a 9600 U/mg, 12400 U/mg, 12800 U/mg assim como 840 U/ mg.

Exemplo 13

Preparação de lutensol T03-hirudina 19

Diluíu-se 0,5 ml duma solução de hirudina (21 mg/ml em carbonato de Na ou borato de Na 0,1 M de pH 9) com 0,5 ml de tetra-hidrofurano e misturou-se com 1,2 mg de lutensol T03-carbonato de N-hidroxissuccinimida e incubou-se sob agitação à temperatura ambiente durante 12 horas. Interrompeu-se a reacção por adição de etanolamina (excesso molar duplo em relação a lutensol activado) e separou-se por cromatografia - como se descreve no Exemplo 10. Os derivados de hirudina - lutensol foram eluídos a 45% de B (derivado 1 11300 U/mg, para derivado 2 9700 U/mg e 440 U/mg para derivado 3).

Preparou-se o material de partida da seguinte maneira:

Condensaram-se 20 g de fosgénio a 0°C em 100 ml de tolueno e adicionaram-se gota a gota 34,0 g de lutensol T03 (índice de OH = 165) em 50 ml de tolueno durante 10 minutos. Deixou-se arrefecer à temperatura ambiente e eliminou-se o dissolvente a 35°C em vácuo produzido por bomba de óleo. Obtiveram-se 40,3 g de clorocarbonato de lutensol T03.

Dissolveram-se 1,2 g de N-hidroxissuccinimida e 1,0 g de trietilamina em 20 ml de diclorometano e adicionaram-se gota a gota 3,92 g de clorocarbonato de lutensol T03 em 10 ml de diclorometano durante 5 minutos. Agitou-se à temperatura ambiente durante 2 h, eliminou-se em vácuo e retomou-se o resíduo assim obtido em acetato de etilo. Separou-se o sólido e o filtrado foi isentado do solvente. Obtiveram-se 4,3 g do N-hidroxissuccinimidocarbonato de lutensol T03.

Exemplo 14

Preparação de octil-diceteno-fenilalanina-hirudina

Diluíu-se 0,5 ml duma solução de hirudina (21 mg/ml em carbonato de Na ou borato de Na de pH 9 0,1 M) com 0,5 ml de tetra-hidrofurano e misturou-se com 4 mg de éster de N-hidroxissuccinimida de N-(2-hexil-3-oxo-decanoil)-fenilalanina e incubou-se sob agitação à temperatura ambiente durante 12 h. Interrompeu-se a reacção por adição de etanolamina (excesso bimolar em relação a fenilalanina activada) e separou-se por RP-HPLC como se descreveu no Exemplo 10. Os derivados de hirudina-diceteno foram eluídos a 43% de B (derivado 1), 48% dc B (derivado 2) c 58% dc B (derivado 3). As 20 actividades específicas foram determinadas como no Exemplo 2 e montaram para o derivado 1 a 930 U/mg, para o derivado 2 a 2800 U/mg e a 135 U/mg para o derivado 3.

Preparou-se o material de partida da seguinte maneira:

Colocaram-se 82,5 g de fenilalanina em 500 ml de água a pH 13,5 e durante 1,25 h adicionaram-se gota a gota 145,9 g de octildiceteno em 50 ml de diclorometano. Agitou-se intensamente a suspensão durante 5 horas, misturou-se com 2,5 litros de água e regulou-se a pH 1 com ácido clorídrico concentrado. Extraíu-se a fase aquosa com o total de 2,5 litros de diclorometano, secaram-se sobre sulfato de magnésio as fases orgânicas depois de reunidas e eliminou-se o dissolvente em vácuo. Agitou-se o sólido branco resultante em 1000 ml de pentano, separou-se o sólido por filtração e secou-se a 60°C em vácuo. Resultaram 190 g de N-(2-hexil-3-oxo-decanoil)-fenilalanina.

Em 10 ml de diclorometano colocaram-se N-(2-hexil-3-oxo-decanoil)-fenilalanina e 0,55 g de N-hidroxissuccinimida e a 4°C adicionaram-se 1,01 g de Ν,Ν-diciclo-hexilcarbodiimida. Deixou-se aquecer até à temperatura ambiente, separou-se o sólido formado e cromatografou-se o produto contido na fase em 80 g de gel de sílica (dicloro-hexano + hexano = 3 + 1; 1% de ácido acético glacial). Obtiveram-se 2 g de éster de N-hidroxissuccinimida da N-(2-hexil-3-oxo-decanoil)-fenilalanina.

Exemplo 15

Preparação de octildiceteno-ácido capróico-hirudina

Diluíu-se 1,0 ml de uma solução de hirudina (21 mg/ml em carbonato de Na ou borato de Na de pH 9 0,1 M) e misturou-se com 7 mg de N-(6-(2-hexil-3-oxo-decanoilamino)-hexanoiloxí)-succinimida e incubou-se sob agitação à temperatura ambiente durante 12 h. A reacção foi interrompida por adição de etanolamina (excesso molar duplo em relação a diceteno activado) e o produto da reacção separado por cromatografia RP como se descreveu no Exemplo 10. Os derivados de hirudina-diceteno foram eluídos a 48% de B (derivado 1), 52% de B (derivado 2) e 63% de B (derivado 3). As actividades específicas foram determinadas como no Exemplo 2 e montaram, para o derivado 1 a 7500 U/mg, para o derivado 2 a 3400 U/mg e a 80 U/mg para o derivado 3. 21

O material de partida foi preparado da seguinte maneira:

Dissolveram-se 6,55 g de ácido 6-aminocapróico em 100 ml de águaapH 9 e adicionaram-se gota a gota 14,24 g de octildiceteno no decurso de 20 minutos. Agitou-se durante a noite, regulou-se o valor de pH para 1 com ácido clorídrico concentrado e extraíu-se a fase aquosa com 100 ml de MTBE. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de magnésio, eliminou-se o dissolvente em vácuo e agitou-se o produto bruto em 150 ml de pentano. Separou-se por filtração o sólido resultante e secou-se a 60°C em vácuo. Obtiveram-se 5,9 g de ácido 6-(2-hexil-3-oxo-decanoilamino)-hexanóico.

Colocaram-se 1,53 g do produto assim obtido e 0,55 g de N-hidroxissuccinimida em 10 ml de diclorometano a 4°C e misturaram-se com 1,01 g de N,N-diciclo-hexilcarbodiimida. Deixou-se aquecer até à temperatura ambiente, agitou-se durante a noite e separou-se o sólido por filtração. Cromatografou-se o produto bruto contido na fase orgânica sobre 80 g de gel de sílica (acetato de etilo + hexano = 3 + 5; 1% de ácido acético glacial). Obtivera-se 1,7 g de N-[6-(2-hexil-3-oxo-decanoilamina)-hexanoiloxi]-succmimida.

Exemplo 16

Cinética da actividade anti-Factor lia em amostras de plasma de cão e ratazana Método: Aplicaram-se intravenosamente conjugados de hirudina ou placebo a ratazanas narcotizadas ou a cães despertos. Em intervalos de tempo definidos, retiraram-se amostras de sangue venoso dos animais para obtenção de plasma com citrato. A actividade livre anti-Factor Ha dos conjugados de hirudina no plasma foi determinada por um ensaio cromogénico com o auxílio de uma curva de calibração com hirudina recombinante.

Princípio do ensaio:

Trombina

Substrato cromogénico (S-2238) > Péptido + p-Nitroanilina (amarelo) 22

Em placas de microtitulação pipetaram-se, para respectivamente 100 μΐ de tampão Tris (Tris 200 mmol/1, NaCl 25 mmol/1, pH 8,1), 10 μΐ de amostra de plasma e 100 μΐ de trombina (0,3 unidades de NIH/nil). Depois de 1 minuto iniciou-se a reacçio por adição de 50 μΐ de solução de substrato (S-2238, 1,34 mmol/1). Depois de uma curta mistura incubou-se a mistura reaccional a 25°C e, ao fim de 5 minutos, interrompeu-se a reacção por adição de 100 μΐ de ácido acético a 30%. A extinção da amostra, medida a 405 nm em comparação com 630 nm é inversamente proporcional à actividade de anti-Factor lia na amostra de plasma. Nas amostras de plasma foram medidos parcialmente também os parâmetros de coagulação tempo de trombina (TT) e tempo parcial de tromboplastina (ΑΡΤΙ).

Resultados: A actividade específica aproximadamente igual, depois da administração i.v. de 1 mg/kg de um derivado de hirudina lipófilo a ratazanas narcotizadas, garante-se um retrocesso nitidamente mais prolongado da actividade anti-Factor Da livre em relação a r-hirudina (Figura 1). Em cães mediu-se, depois da administração i.v. de 5000 unidades antitrombina/kg (ATU/kg) de octil-diceteno3-hirudina, igualmente um teor activo nitidamente maior em relação a r-hirudina com eliminação mais prolongada (Figura 2). Observou-se também uma diminuição muito lenta da actividade anti-Factor lia livre depois da administração i.v. 1 mg/kg de famesil-hirudina (Figura 3).

Exemplo 17

Agregação provocada por trombina de trombócitos lavados provenientes do sangue humano e de ratazana “ex vivo” e “in vitro” depois da pré-incubação de trombócitos com derivados lipófilos de hirudina Método: Sangue tratado com citrato fresco (9 partes de sangue + 1 parte de citrato de sódio 0,11 mole/litro, ratazana: 8,5 + 1,5) é centrifugado para obtenção de plasma rico em plaquetas (PRP, sobrenadante) durante 16 minutos a 250 x g. A partir do PRP obtém-se um concentrado de trombócitos lavados de acordo com um método de Patscheke et al. (Haemostasis 10, 14-27, 1981). Neste método, em primeiro lugar, sedimentam-se os trombócitos a partir de PRP por centrifugação a 330 x g durante 7 minutos. Se for necessário efectuar um tratamento com derivados de hirudina, então neste ponto do 23 processo, depois da adição de 200 μΐ do derivado numa solução de lavagem (120 mmo de NaCl, 5 mmol/1 de KC1,2 mmol/1 de CaG2,1 mmol/1 de MgCl2,5 mmol/1 de glucose, 2 g/1 de albumina, 50 mg/1 de Apirase em 30 mmol/1 de fosfato de sódio, pH 6,5) para se obter uma concentração final do derivado igual a 0,215 mg/1, a pelete é feita redemoinhar e incuba-se durante 10 minutos à temperatura ambiente. Seguem-se duas operações de lavagem nesta solução de lavagem e, em seguida, a ressuspensão definitiva dos trombócitos num meio de ensaio com 120 mmol/1 de NaQ, 5 mmol/1 de KC1,1 mmol/1 de CaCl2,0,1 mmol/1 de MgCl2, 5 mmol/1 de glucose, 0,5 g/1 de albumina, 50 mg/1 de Apirase, 1 mmol/1 de fosfato de sódio, TES/NaOH, pH 7,4.0 número de trombócitos foi regulado para 2 x ΙΟ5 μΐ (ratazanas: 8 x ΙΟ6/μΐ). Para a determinação da agregação de trombócitos, incubam-se 218 μΐ do concentrado de trombócitos durante 3 minutos num agregómetro (PAP-4 Bio Data Corporation), agita-se a 1000 RPM durante 1 minuto e incuba-se mais uma vez durante 1 minuto. Em seguida, inicia-se a agregação de trombócitos por adição de 2 μΐ de solução de trpmbina. A agregação de trombócitos é determinada na amostra por meio da alteração da transmissão medida por unidade de tempo (método de inclinação “Slope-Method”. Como valor da medida da actividade relativa e da afinidade dos derivados de hirudina determina-se CE50, a concentração de trombina em unidades de NIH/ml, com a qual se atinge o semiaumento máximo da agregação de trombócitos. A partir desta CE50 e da CE 50 de uma amostra pré-incubada sem hirudina, calcula-se o índice de neutralização (EN) sendo IN = CE50 com derivado / CE 50 do controlo. Este valor é específico do derivado e dá o valor do factor para o qual se deve aumentar a concentração de trombina como agonista para de novo se atingir a mesma agregação (aumento semimáximo) que no controlo.

Resultados:

Depois da pré-incubação de trombócitos de várias espécies com 21,5 pg/ml lipófilos de hirudina de derivados teve de, em parte, se utilizar um múltiplo da concentração de trombina utilizada no controlo para novamente conseguir uma agregação (Figura 4). Esta inibição é realizada pela adesão detectável imunologicamente do derivado de hirudina lipófilo sobre os trombócitos. Os índices de neutralização atingem valores de até 25 em trombócitos humanos (Tabela 1). Em ratazanas, 24 horas depois da administração de 10 24 24 a 5,4 em mg/kg de colesteril-hirudina foi possível observar ainda um valor de IN igual trombócitos lavados “in vivo” (veja-se Exemplo 20 : Tabela 2).

Tabela 1: índices de neutralização (EN) para compostos escolhidos sobre trombócitos humanos

Substância IN Controlo (tratados com placebo) 1 r-Hirudina 1,21 Estearoil-hirudina 5,42 Palmitoil-hirudina 4,71 Colesteril-hirudina 21,2 Lutensol T03-hirudina 15,1 Famesil-hirudina 24,3

Exemplo 18

Actividade antitrombótica num “shunt” arteriovenoso na ratazana Método: Nesta experiência, um capilar de vidro de um “shunt” arteriovenoso serve como superfície trombogénica artificial e provoca uma trombose. A ratazana narcotizada (uretano a 25%, 2x8 mg/kg (i.p.) é fixada na posição de costas num banco de aquecimento temperado (37°C). Na A. carotis e na V. jugularis direitas livremente preparadas implantam-se curtos catéteres de polietileno (Portex, PE 50), enchem-se com solução de NaCl e fecham-se com pinças. As extremidades livres dos catéteres são ligadas por meio de um capilar de vidro com 20,0 mm de comprimento (diâmetro interno 1,0 mm) que actua como superfície trombogénica. A administração da substância a ensaiar pode realizar-se i.v., s.c., p.a ou como infusão. Depois do tempo de infusão pretendido (5, 60 ou 360 min) com a substância a ensaiar ou com o dissolvente (controlo), abre-se o “shunt” por afastamento das pinças. A corrente sanguínea através do “shunt” origina um rápido aumento da temperatura do “shunt” que é medida no ponto médio do capilar de vidro. O aumento da temperatura até à temperatura do corpo é um indicador da possibilidade de passagem através do “shunt”. A temperatura é anotada continuamente até ao fechamento do “shunt”, no entanto, durante o máximo de 30 minutos. Para a comparação da actividade de diferentes derivados da hirudina calcula-se a DE15min como a dose que, em relaçãç ao grupo de controlo, origina um prolongamento do tempo de obturação igual a 15 minutos. Na abertura do “shunt” e no fim da experiência, retiram-se adicionalmente amostras de sangue para a determinação da actividade anti-FIIa do plasma.

Resultados: Octildiceteno3-hirudina e octildiceteno3-hirudina patenteiam, por causa da sua maior duração da acção, actividade antitrombótica já em menores doses e durante um mais longo intervalo de tempo que r-hirudina (Figura 5).

Exemplo 19

Actividade antitrombótico sobre a trombose induzida por corrente eléctrica na ratazana Método: Nesta experiência produz-se uma lesão do endotélio por meio de uma curta passagem de corrente eléctrica através de dois eléctrodos colocados na A. carotis e provoca-se dessa forma a obturação trombótica do vaso sanguíneo. A ratazana narcotizada (uretano a 25%, 2x8 mg/kg i.p.) é fixada na posição de costas sobre um banco temperado (37°C). Prepara-se livremente um segmento com 20 mm de comprimento da A. carotis e coloca-se um cabeçote de medição do fluxo do tempo de transição de ultra-sons na metade próxima do segmento. O caudal em volume é medido continuamente durante o tempo de observação de 30 minutos por meio de um aparelho de medição do caudal por ultra-sons (Τ206, Transonic Systems Inc., USA). A formação do trombo é provocada por uma intensidade de corrente constante (3 mA, 1 minuto) através de um par de eléctrodos com a forma de gancho que é colocado a 1 cm de distância do cabeçote de medição do caudal sobre a superfície do vaso. A oclusão do vaso é definida como uma diminuição do caudal em volume para um valor < 0,3 ml/min durante mais que três minutos. A actividade antitrombótica de derivados de hirudina é quantificada como a frequência da trombose dentro de 30 minutos num grupo de 30 animais. Para a comparação da actividade de derivados de hirudina, calcula-se a DE50 como a dose que, em relação ao grupo de controlo, reduz a 50% a frequência da trombose. Antes da aplicação da tensão eléctrica e no fim da experiência, retiram-se adicionalmente amostras de sangue para a determinação da actividade anti-FIIa no plasma.

Resultados: ; * --

26

"VA

Para palmitoilj-hirudina, determinou-se uma DE50 igual a 0,24 mg/kg, medida 5 minutos depois da administração intravenosa. A correspondente DE50 de r-hirudina monta a 0,47 mg/kg. Também 24 horas depois da administração intravenosa de colesteril-hirudina foi possível detectar em ratazanas ainda inibição da agregação de trombócitos lavados “ex vivo” em virtude da grande duração da acção e boa actividade antitrombótica (Tabela 2).

Tabela 2:

Efeito antitrombótico e inibição da agregação dos trombócitos por colesteril-hirudina 24 horas depois da administração i.v. (n=9-10)

Tratamento Frequência de trombose (%) índice de neutralização (EN) em trombócitos lavados Actividade abti-Flla do plasma [ATU/ml] TT [s] APTT [s] in vitro “ 18,3 ± 6,1 - - Placebo 100 1 0 41 ± 1 29 ± 4 1,0 mg/kg 50 1,5 ± 0,02 5,7 ± 0,6 267 ± 15 30 ±3 10 mg/kg 11 5,39 ± 0,74 61,0 ± 3,8 > 300 52 ± 4

Lisboa, 2 9 NOV. 2001

Maria Silvina Ferreira ADVOGADA

Agente Oficial de Propriedade Industrial R. Castilho. 50 - 5! - 1250 - 071 LISBOA Tel. 21 381 50 50 - Fax. 21 383 1150

Claims (7)

1

REIVINDICAÇÕES 1. Conjugados da hirudina, formados a partir de uma hirudina e um ou mais compostos lipófilos, em que o composto lipófilo tem um coeficiente de repartição octanol-água maior que 1,8 e está quimicamente acoplado covantemente com a hirudina.

2. Conjugados da hirudina de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo facto de o acoplamento do composto lipófilo se realizar na zona dos aminoácidos 27-37.

3. Conjugados da hirudina de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizados pelo facto de o acoplamento entre hirudina e compostos lipófilos se realizar por meio das cadeias laterais amino de radicais de lisina da hirudina.

4. Conjugados da hirudina de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizados pelo facto de estarem acoplados com a hirudina 1 a 3 compostos lipófilos.

5. Conjugados da hirudina de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizados pelo facto de pelo menos um composto lipófilo ser acoplado com o aminoácido 27 ou 33.

6. Conjugados da hirudina de acordo com as reivindicações 1 a 5 para a utilização no tratamento de doenças.

7. Processo para a preparação de conjugados da hirudina, caracterizado pelo facto de se fazer reagir uma hirudina com um ou mais equivalentes molares dum composto lipófilo, eventualmente depois da activação química do composto lipófilo. Lisboa, 2 9 NOV, 2001 KD Maria Silvina Ferreira ADVOGADA Agente Oficial de Propriedade Industrial R. Castilho, 50 - 5! - 1250 - 071 LISBOA Tel. 21 38150 50 - Fax. 21383 1150