JP2002338469A - Ｖｄａｃ機能阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 アミノアルコール誘導体を有効成分とするＶ
ＤＡＣの機能阻害剤を提供する。 【解決手段】 式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘
導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含
有する、電位依存性陰イオンチャネルの機能阻害剤。 【化１】 式（Ｉ） 式中、Ｒ^１は置換基を有することもあるアリール基若し
くはシクロアルキル基、アルキル基、又はアルケニル基
を表し、Ｒ^２は水素原子又はアシル基を表し、Ｒ ^３はア
シル基、アルキル基、アラルキルオキシカルボニル基、
アルコキシカルボニル基、アルケニルオキシカルボニル
基、ヒドロキシアルキルカルボニル基、又はカルボキシ
アルキルカルボニル基を表す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アミノアルコール
誘導体及びそれを含有する薬剤、特に電位依存性陰イオ
ンチャネルの機能阻害剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】電位依存性陰イオンチャネル（voltage-
dependent anion channel；「ＶＤＡＣ」ともいう）
は、ミトコンドリア外膜に存在するチャネルタンパク質
であり、ミトコンドリアと細胞質間のＡＴＰや呼吸基質
などの物質輸送を行っていることが知られている。また
ＶＤＡＣは、ミトコンドリア膜電位の消失やチトクロー
ムＣ等の放出にも関与していると考えられている（細胞
工学 Vol.18, No.12, p1765-1772, 1999）。またアポト
ーシスにおいてミトコンドリアが重要な役割を果たして
いることが示唆されており、実際、アポトーシスに先行
してミトコンドリア膜電位が低下したり、チトクローム
Ｃなどのミトコンドリアタンパク質が細胞質に放出され
る現象が観察されている。（細胞工学 Vol.18, No.12,
p1765-1772, 1999）。

【０００３】これらのことから、ＶＤＡＣの機能を阻害
することによりアポトーシスを防止することができると
考えられる。一方、糖脂質生合成促進作用を有する種々
のアミノアルコール誘導体が知られている。このような
公知のアミノアルコール誘導体の一例としてＬ−スレオ
−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリ
ノ−１−プロパノール（（１Ｓ，２Ｓ）−１−フェニル
−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ１−プロパノ
ール）（以下、単に「Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ」という）
を挙げることができ、神経疾患治療剤、抗ウイルス剤、
抗腫瘍剤、ガン転移抑制剤等としての用途が知られてい
る（ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／０５１７７、同ＷＯ９５
／３４５３０、特開平９−２１６８５６、特開平１０−
３２４６７１、特開平１０−３３８６３６等）。

【０００４】しかし、このようなアミノアルコール誘導
体がＶＤＡＣの機能を阻害する作用を有することは知ら
れていなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｌ−スレオ
−ＰＤＭＰやその誘導体をはじめとするアミノアルコー
ル誘導体を有効成分とするＶＤＡＣの機能阻害剤を提供
することを目的とする。また本発明は、このようなアミ
ノアルコール誘導体を用いて、精製されたＶＤＡＣ画分
の製造方法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｌ−スレ
オ−ＰＤＭＰやこの誘導体をはじめとするアミノアルコ
ール誘導体が、(1)ＶＤＡＣと結合性を有すること、お
よび(2)ＶＤＡＣの機能を阻害する作用（ミトコンドリ
ア膜電位の低下を抑制する作用、チトクロームＣの放出
を抑制する作用）を有することを見出し、これを薬剤や
製造方法に応用することにより本発明を完成した。

【０００７】すなわち本発明は、式（Ｉ）で示されるア
ミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容される塩を
有効成分として含有する、ＶＤＡＣの機能阻害剤（以
下、「本発明阻害剤」ともいう）を提供する。

【０００８】

【化３】 式（Ｉ）

【０００９】上記式中、Ｒ^１は置換基を有することもあ
るアリール基若しくはシクロアルキル基、アルキル基、
又はアルケニル基を表し、Ｒ^２は水素原子又はアシル基
を表し、Ｒ^３はアシル基、アルキル基、アラルキルオキ
シカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルケニル
オキシカルボニル基、ヒドロキシアルキルカルボニル
基、又はカルボキシアルキルカルボニル基を表す。また
本発明は、このようなＶＤＡＣの機能阻害剤からなる、
ミトコンドリアからのチトクロームＣの放出抑制剤（以
下、「本発明抑制剤」ともいう）を提供する。以下、本
発明阻害剤と本発明抑制剤をまとめて「本発明の剤」と
もいう。さらに本発明は、以下の工程を少なくとも含
む、精製されたＶＤＡＣ画分の製造方法（以下、本発明
製造方法ともいう）をも提供する。工程１：ＶＤＡＣを
含有する液相と、前記式（Ｉ）で示されるアミノアルコ
ール誘導体が固着した固相とを接触させ、ＶＤＡＣを当
該固相に結合させる工程。工程２：固相に固着したＶＤ
ＡＣを固相から解離させ、固相と分離する工程。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。 ＜１＞アミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容さ
れる塩 本発明において用いることができるアミノアルコール誘
導体は、下記式（Ｉ）で示される化合物である。

【００１１】

【化４】 式（Ｉ）

【００１２】上記式中、Ｒ^１は置換基を有することもあ
るアリール基若しくはシクロアルキル基、アルキル基、
又はアルケニル基を表し、Ｒ^２は水素原子又はアシル基
を表し、Ｒ^３はアシル基、アルキル基、アラルキルオキ
シカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルケニル
オキシカルボニル基、ヒドロキシアルキルカルボニル
基、又はカルボキシアルキルカルボニル基を表す。式
（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体には、以下の
ような光学対掌体が存在する。カッコ内はＲＳ表記であ
る。 Ｌ−スレオ体 （１Ｓ，２Ｓ） Ｌ−エリトロ体（１Ｒ，２Ｓ） Ｄ−エリトロ体（１Ｓ，２Ｒ） Ｄ−スレオ体 （１Ｒ，２Ｒ） また本明細書中で、「ＤＬ−スレオ体」とはＬ−スレオ
体とＤ−スレオ体の混合物を、「ＤＬ−エリトロ体」と
はＬ−エリトロ体とＤ−エリトロ体との混合物を意味す
る。

【００１３】これらの光学対掌体の中でも、本発明にお
いてはＬ−スレオ体、ＤＬ−スレオ体、Ｌ−エリトロ体
およびＤＬ−エリトロ体を用いることが好ましい。

【００１４】またＲ^１はアリール基であるものが好まし
く、なかでもアルキル、アルコキシ、ヒドロキシおよび
ニトロからなる群から選ばれる同一又は異なる１〜３個
の置換基で置換されていてもよいフェニル基であるもの
がより好ましい。

【００１５】またＲ^３はアシル基であるものが好まし
く、なかでも炭素数１０〜１６のアシル基であるものが
より好ましい。またＲ^２は水素原子であるものが好まし
い。このようなアミノアルコール誘導体の中でも、下記
のアミノアルコール誘導体が好ましい。 Ｌ−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３
−モルホリノ−１−プロパノール（Ｌ−スレオ−ＰＤＭ
Ｐ） Ｌ−スレオ−１−フェニル−２−テトラデカノイルアミ
ノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（以下、単に
「Ｌ−スレオ−ＰＭＭＰ」という） Ｌ−スレオ−１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミ
ノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（以下、単に
「Ｌ−スレオ−ＰＰＭＰ」という） これらの中でも、特にＬ−スレオ−ＰＰＭＰおよびＬ−
スレオ−ＰＭＭＰが好ましい。

【００１６】このようなアミノアルコール誘導体は、例
えば出発物質として下記式（II）で示される化合物（２
−アミノ−３−モルホリノ−１−フェニル−１−プロパ
ノール）を用いて、公知の方法（例えば、特開平９−２
１６８５６号公報等）で製造することができる。また、
Ｌ−スレオ体、ＤＬ−スレオ体、Ｌ−エリトロ体、又は
ＤＬ−エリトロ体等、所望の光学対掌体を得るために
は、下記式（II）で示される化合物のこれに対応する光
学対掌体を用いれば良い。

【００１７】

【化５】 式（II）

【００１８】（式中、*は不斉炭素を示す）

【００１９】例えば、式（Ｉ）中のＲ^１及び／又はＲ^２
が所望の基であるアミノアルコール誘導体は、J. Lipid
Research 28, p565〜571（1987）、J. Biochem. 111,
p191-196（1992）、ＷＯ９５／３４５３０号国際公開パ
ンフレット、特開平９−２１６８５６号公報、特開平１
０−３２４６７１号公報、特開平１０−３３８６３６号
公報等に記載の方法で製造することができる。

【００２０】式（Ｉ）中のＲ^３がカルボニル基を有する
所望の基である誘導体は、式（II）で示される化合物の
アミノ基と、置換基Ｒ^３に対応するカルボン酸又はその
反応性誘導体とを酸アミド結合させることによって製造
することができる。酸アミド結合生成反応は自体既知の
方法により行うことができ、特に限定されない。

【００２１】Ｒ^３に対応するカルボン酸誘導体に、反応
性の高い官能基が含まれる場合は、この官能基をあらか
じめ適当な保護基で保護し、所望の酸アミド結合生成反
応を行った後、脱保護させてもよい。また、脱保護によ
り得られた反応性官能基（例えばアミノ基、カルボキシ
ル基）に対して自体既知の方法である酸アミド結合生成
反応又はエステル化反応を繰り返すことによって、さら
に修飾を重ねてもよい。

【００２２】酸アミド結合生成方法としては、上記Ｒ^３
に対応するカルボン酸と縮合剤を用いる方法、酸無水物
を用いる方法、酸ハロゲン化物を用いる方法等が例示さ
れる。具体的には、式（II）で示されるアミノアルコー
ル誘導体又はその酸付加塩（例、塩酸塩）を水、塩化メ
チレン、ピリジン、エタノール等の溶媒中、上記カルボ
ン酸と縮合剤［例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（ＤＣＣ）や水溶性カルボジイミド(WSC)、より具体
的には1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボ
ジイミド塩酸塩（EDC）］と必要に応じてN-ヒドロキシ
スクシンイミド等の活性化剤を用いて反応させる方法、
酸無水物又は酸ハロゲン化物（例えば、酸塩化物）と塩
基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロ
ピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等の有機塩
基、炭酸水素ナトリウムのような無機塩基）を用いて反
応させる方法等が例示される。なお、反応の際に使用す
る溶媒は、酸アミド結合生成反応を阻害せず、上記アミ
ノアルコール誘導体およびカルボン酸誘導体を溶解する
ものであれば、特に限定されるものではない。

【００２３】酸アミド結合生成反応は、通常約０〜５０
℃、好ましくは室温下（５〜３５℃（ＪＩＳ Ｋ００５
０））、数時間〜数日間、好ましくは１０時間〜２日間
行われるが、反応条件は当業者であれば予備実験によっ
て適宜に設定することができる。

【００２４】酸アミド結合生成反応の後、酢酸エチル、
クロロホルム等による溶媒抽出、各種クロマトグラフィ
ー（吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー等）、結晶化等の自体既知の精製手段を適宜に組
み合わせて式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体
を精製・単離することができる。

【００２５】本発明化合物の出発物質である式（II）の
化合物の製造方法としては、特開平９−２１６８５６号
公報に記載されているような公知の方法を適宜採用する
ことができる。具体的には次に例示するように、式（II
I）で表されるキラル化合物を出発物質として使用し、
下記工程の反応式に従い順次反応させることにより所望
の立体配置を有する化合物として得られる。

【００２６】

【化６】

【００２７】（工程式中、*は不斉炭素を表し、Ｐ₁ は
アミノ基の保護基であり、例えばベンジルオキシカルボ
ニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゼンスルホニ
ル基、フルオレニルメトキシカルボニル基等が挙げられ
る。Ｙはメタンスルホニル、トリハロゲノメタンスルホ
ニル、Ｐ−トルエンスルホニル、ベンゼンスルホニル、
Ｐ−ブロモベンゼンスルホニル基等の脱離基を表す）

【００２８】このように、式（III）で示されるアミノ
アルコール誘導体の１級水酸基のみに脱離基（Ｙ）を導
入して式（IV）で示される化合物とした後、該化合物に
モルホリンを反応させて式（V）で示されるアミノアル
コール誘導体となし、該化合物よりＰ₁を脱離させるこ
とにより、式（II）で示されるキラルなアミノアルコー
ル誘導体を得ることができる。

【００２９】このようにして得られた式（II）の化合物
を前記の反応に付すことにより、式（Ｉ）で示されるア
ミノアルコール誘導体において，Ｒ^１がフェニル基、Ｒ
^２が水素原子かつＲ^３がカルボニル基を有する基である
化合物が得られる。

【００３０】また本発明においては、式（Ｉ）で示され
るアミノアルコール誘導体の薬学的に許容される塩を用
いることもできる。アミノアルコール誘導体の薬学的に
許容される塩としては、例えば、塩酸、リン酸、硫酸、
硝酸等の無機酸塩、ギ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リン
ゴ酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、ト
リフルオロ酢酸、メタンスルホン酸（メシル酸）、Ｐ−
トルエンスルホン酸（トシル酸）等の有機酸塩を挙げる
ことができる。このような塩の製造は、それ自体既知の
方法によって行うことができる。例えば式（Ｉ）で示さ
れる化合物（遊離型）をアルコール等の適宜な溶媒に溶
解し、等モル程度の上記の酸を添加して反応させ、所望
により溶媒を留去することにより製造することができ
る。上記のようなアミノアルコール誘導体又はその薬学
的に許容される塩は、優れたＶＤＡＣ機能阻害作用およ
びミトコンドリアからのチトクロームＣの放出抑制作用
を有することから、これを用いることにより、優れた作
用を有する本発明の剤とすることができる。

【００３１】＜２＞本発明の剤 本発明の剤は、式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘
導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含
有するＶＤＡＣの機能阻害剤（本発明阻害剤）、および
本発明阻害剤からなるミトコンドリアからのチトクロー
ムＣの放出抑制剤（本発明抑制剤）である。

【００３２】本明細書における「ＶＤＡＣの機能」と
は、「ミトコンドリア膜電位を消失（低下）させる機能
や、チトクロームＣ等を放出させる機能をはじめとした
ＶＤＡＣが有する諸機能」を意味する。したがって、本
明細書において「ＶＤＡＣの機能阻害剤」とは、これら
の機能を阻害（抑制）する剤を意味するものである。

【００３３】本発明阻害剤はＶＤＡＣの機能の阻害が求
められている細胞や組織等に、本発明抑制剤はミトコン
ドリアからのチトクロームＣの放出抑制が望まれている
細胞や組織等に、それぞれ適用することができる。

【００３４】これらの細胞や組織への本発明の剤の適用
方法は、本発明阻害剤によるＶＤＡＣ機能の阻害作用、
又は本発明抑制剤によるミトコンドリアからのチトクロ
ームＣの放出抑制作用が発揮される限りにおいて特に限
定されず、本発明の剤の具体的用途等に応じて適宜選択
することができる。例えば、細胞や組織等の実験用試薬
として用いる場合には、培養液等に本発明の剤を添加し
てこれを用いて細胞や組織等を培養してもよいし、細胞
や組織等に本発明抑制剤を直接添加してもよい。

【００３５】また、医薬として用いる場合には、例えば
注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、点
眼、経鼻、経口、経皮、経直腸、経肺、吸入等の方法に
より投与することができる。このような投与方法に応じ
て、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤
等）、点眼剤、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散
剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ
剤、ペッサリー、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、ス
プレー剤、吸入散剤等として製剤化することができる。

【００３６】本発明の剤の製剤化には公知の方法を用い
ることができる。また製剤化にあたり、アミノアルコー
ル誘導体又はその薬学的に許容される塩に悪影響を与え
ず、かつ本発明阻害剤や本発明抑制剤の効果に影響を与
えない限りにおいて、他の医薬活性成分や、慣用の安定
化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存
剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊
剤、矯味剤等、通常医薬に用いられる成分を使用でき
る。

【００３７】本発明の剤を医薬として用いる場合、その
有効成分であるアミノアルコール誘導体又はその薬学的
に許容される塩は、高純度に精製され、医薬として混入
が許されない物質を実質的に含まないものが好ましい。

【００３８】また本発明の剤中のアミノアルコール誘導
体又はその薬学的に許容される塩の含量も特に限定され
ず、後述の投与量等に応じて適宜設定することができ
る。なお本明細書中で「医薬」とは、医療に用いられる
薬品を意味する。従って、医療に用いられる薬品である
限りにおいては、名称の如何にかかわらず、ここでいう
「医薬」に包含される。

【００３９】＜３＞本発明の剤を医療用途に用いる場合
の投与対象等 本発明の剤が投与される動物は、脊椎動物、特に哺乳動
物が好ましく、とりわけヒトが好ましい。本発明阻害剤
および本発明抑制剤は、それぞれ、これらの動物におけ
るＶＤＡＣ機能の阻害を目的とした医薬およびミトコン
ドリアからのチトクロームＣ放出の抑制を目的とした医
薬として投与することができる。このような阻害ないし
抑制を目的とする限りにおいて適用可能な症状や疾患等
は限定されず、例えばＶＤＡＣ機能の促進及び/又はミ
トコンドリアからのチトクロームＣ放出の増加が一因と
なる症状や疾患等が例示される。例えばアポトーシス
は、前記の通りＶＤＡＣ機能やミトコンドリアからのチ
トクロームＣ放出がその一因となっていると考えられる
ことから、本発明の剤はアポトーシスの阻害・抑制や、
アポトーシスに起因する疾患等の処置に好ましく適用さ
れる。アポトーシスに起因する疾患としては、例えば、
急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎炎、糸球
体硬化症、狼瘡等に分類される糸球体腎炎；腎芽細胞
腫；中毒や虚血による尿細管障害；エイズ（ＡＩＤ
Ｓ）、免疫抑制剤や抗ガン剤の投与による胸腺細胞の障
害、末梢Ｔ細胞の減少、免疫不全症等の免疫関連疾患；
血管狭窄、虚血等の循環器疾患；薬剤やウイルス感染に
よる肝障害等の肝臓疾患；消化器疾患；脳虚血による神
経細胞の障害、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー
病、ハンチントン舞踏病やパーキンソン病等の神経細胞
の変性性疾患、神経細胞発達性疾患（精神病）等の神経
疾患；扁平苔癬；扁平疣贅；臓器移植や組織移植に伴う
拒絶反応；細菌毒素，植物毒素や動物毒素による障害；
萎縮性脱毛症；形態異常；組織形成不全；組織の萎縮等
が例示される。本発明阻害剤および本発明抑制剤は、そ
れぞれ、このような疾患におけるＶＤＡＣ機能の阻害
や、ミトコンドリアからのチトクロームＣ放出の抑制を
目的として投与することができる。

【００４０】本発明抑制剤を医薬として用いる場合、そ
の投与は純然とした治療目的のみならず、疾患の予防、
進行抑制（悪化防止）、軽減（症状の改善）等を目的と
することもできる。

【００４１】本発明抑制剤におけるアミノアルコール誘
導体又はその薬学的に許容される塩の配合量、１回あた
りの投与量、投与間隔等は、本発明抑制剤の投与方法、
投与形態、使用目的等、患者の具体的症状、年齢、性
別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり特
に限定されないが、アミノアルコール誘導体又はその薬
学的に許容される塩の臨床量として０．２５〜２００mg
/kg程度 、好ましくは０．５〜１００mg/kg 程度を、１
日１回あるいはそれ以上に分けて投与することができ
る。

【００４２】＜本発明製造方法＞本発明製造方法は、以
下の工程を少なくとも含む、精製されたＶＤＡＣ画分の
製造方法である。 工程１：ＶＤＡＣを含有する液相と、式（Ｉ）で示され
るアミノアルコール誘導体が固着した固相とを接触さ
せ、ＶＤＡＣを当該固相に結合させる工程。 工程２：固相に固着したＶＤＡＣを、固相から解離さ
せ、固相と分離する工程。ＶＤＡＣを含有する液相の種
類は特に限定されず、例えば細胞抽出液等を例示するこ
とができる。

【００４３】ＶＤＡＣを含有する液相として細胞抽出液
を用いる場合には、ＶＤＡＣを比較的多く含む画分を含
有する液相を用いることが好ましい。ＶＤＡＣはミトコ
ンドリア外膜に存在するチャネルタンパク質であること
から、界面活性剤により可溶化したミトコンドリア膜画
分を含有する液相を用いることがより好ましい。また、
式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体の説明は前
記の通りであるが、本発明製造方法においてはＬ−スレ
オ体、特にＬ−スレオ-2-(9-カルボキシノナノイル)ア
ミノ-3-モルホリノ-1-フェニル-1-プロパノールを用い
ることが好ましい。このアミノアルコール誘導体は公知
の方法によって固相に固着させることができる。

【００４４】固相に式（Ｉ）で示されるアミノアルコー
ル誘導体を固着（結合）させる方法は特に限定されず、
例えば共有結合させることにより固着させてもよく、共
有結合以外の結合（例えば、疎水結合等）により固着さ
せてもよいが、安定に固着できる点で共有結合させるこ
とにより固着することが好ましい。

【００４５】共有結合の様式も特に限定されず、例えば
酸アミド結合、エステル結合、アミノアルキル結合等が
例示されるが、簡便性・容易性等の点で酸アミド結合が
好ましい。酸アミド結合による固着は、例えば以下の通
り行うことができる。

【００４６】まず、式（Ｉ）で示されるアミノアルコー
ル誘導体にカルボキシル基等を有する化合物を用意す
る。このような化合物として、例えば式（Ｉ）中のＲ^３
で示される基の末端にカルボキシル基を有する化合物を
挙げることができる。Ｒ^３で示される基の末端にカルボ
キシル基を有する化合物は、例えばＬ−スレオ−２−ア
ミノ−３−モルホリノ−１−フェニル−１−プロパノー
ル（前記式（II）で示される化合物のＬ−スレオ体）の
アミノ基に、カルボン酸又はその反応性誘導体を酸アミ
ド結合させることにより製造することができる。例えば
この化合物にカルボン酸の一種である無水セバシン酸を
反応させると、カルボキシル基等を有する化合物Ｌ−ス
レオ２−(9-カルボキシノナノイル)アミノ−３−モルホ
リノ１−フェニル−１−プロパノールを製造することが
できる。

【００４７】このようなカルボキシル基を有する化合物
を用い、固相として遊離のアミノ基を有する固相を採用
することによって、簡便かつ容易に両者を結合させるこ
とができ、両者間に安定な酸アミド結合（共有結合）を
形成させることによって固相に固着させることができ
る。

【００４８】このような固相としては、例えばスペーサ
ーを介して遊離の第１級アミノ基が結合したゲル等が挙
げられる。このようなゲルは、例えばCNBr法やエポキシ
活性化法等によってアガロースゲルに1,6-ジアミノヘキ
サンを結合させることにより調製することもできるし、
例えばファルマシア(Pharmacia)社から商品名「ＥＡＨ
−セファロース４Ｂ(EAH-Sepharose 4B)」、「ＡＨ−セ
ファロース４Ｂ(AH-Sepharose 4B)」として市販されて
いるもの等をそのまま利用することもできる。

【００４９】上記のようなカルボキシル基を有する化合
物を上記のようなアミノ基を有する固相に結合させる方
法も特に限定されず、カルボジイミドカップリング法等
の公知の方法を採用することができる。

【００５０】固相の形状はゲルに限定されず、ビーズ、
メンブレン等を用いることもできる。また固相の材質も
アガロースに限定されず、他の材質のものを用いること
もできる。

【００５１】本発明製造方法の工程１は、前記した液相
と、上記のように調製された固相（式（Ｉ）で示される
アミノアルコール誘導体が固着した固相）とを接触させ
ることにより、当該液相中のＶＤＡＣを、固相に固着し
たアミノアルコール誘導体に結合させることによって固
相に結合させる工程である。これは、式(Ｉ)で示される
アミノアルコール誘導体とＶＤＡＣとの特異的親和性を
利用したものである。固相と液相との接触方法は、固相
に固着した式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体
の分子と、液相中のＶＤＡＣ分子とが接触して、ＶＤＡ
Ｃ分子が固相に捕捉される限りにおいて特に限定され
ず、バッチ法、カラム法のいずれをも用いることができ
る。このような方法で固相と液相とを接触させることに
より、液相中のＶＤＡＣが固相に固着したアミノアルコ
ール誘導体に特異的に結合する。この後、固相を洗浄し
て、アミノアルコール誘導体に吸着しなかった物質を除
去することが好ましい。

【００５２】工程２は、固相に固着したアミノアルコー
ル誘導体を介して固相に結合したＶＤＡＣを、当該アミ
ノアルコール誘導体から解離させることによって固相か
ら解離させ、固相と分離する工程である。

【００５３】ＶＤＡＣをアミノアルコール誘導体から解
離させる方法は、本製造方法によって得られるＶＤＡＣ
の使用目的等に応じて適宜選択することができる。製造
されるＶＤＡＣが変性していても良い場合には、尿素、
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)等の溶液をＶＤＡＣが結
合した固相に接触させればよく、製造されるＶＤＡＣを
変性させずに得たい場合には、１M程度のNaCl溶液やpH
2.5程度の酸性溶液等の溶液をＶＤＡＣが結合した固相
に接触させればよい。このような溶液を固相に接触させ
ることにより、ＶＤＡＣがアミノアルコール誘導体から
解離する。

【００５４】解離したＶＤＡＣを固相と分離する方法
は、通常の固液分離手段により行うことができる。例え
ば、固相と液相との接触をバッチ法によって行った場合
には、沈殿、遠心、ろ過等により固相と液相とを分離し
て、当該液相を回収することによりＶＤＡＣを固相から
分離することができる。固相と液相の接触をカラム法に
よって行った場合には、カラムから溶出してくる液相を
回収するだけでよいことから、簡便・迅速に操作するこ
とができる。この点で、固相と液相との接触は、カラム
法により行うことが好ましい。

【００５５】このようにして得られた液相をさらに本発
明製造方法や他の公知の精製方法に付してもよく、これ
によってより高純度のＶＤＡＣを製造することができ
る。

【００５６】また本発明製造方法の出発物となる液相
（ＶＤＡＣを含有する液相）がＶＤＡＣ以外の不純物を
比較的多く含有するものである場合には、当該液相を予
めＤ−スレオ−２−(9-カルボキシノナノイル)アミノ−
３−モルホリノ−１−フェニル−１−プロパノール等を
用いて上記の要領で固着させた固相に接触させ、接触後
に得られる液相を用いることが好ましい。なお、Ｄ−ス
レオ−２−(9-カルボキシノナノイル)アミノ−３−モル
ホリノ−１−フェニル−１−プロパノールは、Ｄ−スレ
オ−２−アミノ−３−モルホリノ１−フェニル−１−プ
ロパノールを用いて前記と同様に製造することができ
る。この接触後、当該固相から分離した液相を出発物
（ＶＤＡＣを含有する液相）として用いることにより、
Ｄ−スレオ体のアミノアルコール誘導体に結合する物質
や、固相に非特異的に結合する物質を予め除去すること
ができる。

【００５７】

【実施例】以下、実施例によって本発明をより具体的に
説明するが、これらによって本発明の技術的範囲が限定
されるものではない。 ＜アミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容される
塩＞本実施例では以下のアミノアルコール誘導体を用い
た。これらはJ. Lipid Research 28, p565〜571（198
7）およびJ. Biochem. 111, p191-196（1992）に記載さ
れた方法によって製造した。 Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ Ｌ−スレオ−ＰＭＭＰ Ｌ−スレオ−ＰＰＭＰ

【００５８】＜薬効薬理試験＞ １．Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰに結合する細胞内タンパク質
の探索 (1)実験材料及び方法 (1−1)細胞の培養 Ｈ１２細胞（マウスニューロブラストーマ・ラットグリ
オーマ雑種細胞株NG-108-15細胞のサブクローン）は、1
0％仔ウシ胎仔血清（FCS）を含むダルベッコの改変イー
グル培地（DMEM培地）を使用し、37℃、5％CO₂の条件下
で培養した。 (1−2)各種緩衝液の組成 リン酸緩衝生理食塩水（PBS） : 137 mM NaCl、2.68 mM
KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.76 mM KH₂PO₄ 緩衝液１： 20 mM Tris HCl (pH 7.5)、20 mM β-グリ
セロリン酸、5 mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1
mM ピロリン酸ナトリウム, 1 mM バナジン酸、2 mM ジ
チオトレイトール（DTT）、0.5％ アプロチニン、1mM
フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF） 緩衝液２： 1 M NaClを含有する緩衝液１ 緩衝液３： 1 ％ Triton X-100（商品名）を含有する
緩衝液１ SDS-PAGE用サンプルバッファー： 0.05M Tris-HCl (pH
6.8)、1.6％ ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、８％
グリセロール、0.0008％ ブロモフェノールブルー（BP
B）、5％ β-メルカプトエタノール 泳動用緩衝液： 25mM Tris、192 mM グリシン、0.1 ％
SDS TBS-T： 137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) , 0.
05 ％ Tween 20（商品名） ブロッキング用緩衝液： ５％スキムミルク／TBS-T 転写用緩衝液： 25mM Tris、192 mM グリシン、20 ％
メタノール

【００５９】(1-3)ＶＤＡＣを含有する液相（細胞画
分）の調製 PBSで洗浄した１ｘ10^８個のＨ１２細胞を、5mL の緩衝
液１に懸濁し、ポリトロン（キネティクス社）でホモジ
ナイズした。その細胞破砕液を２℃下、100,000ｘｇで
１時間遠心分離し、得られた液相を上清１（細胞質画
分）とした。上清１を除去して残った沈殿に5 mLの緩衝
液２を加え、ポリトロンでホモジナイズした後に同様に
遠心分離を行い、得られた液相を上清２（膜結合画分）
とした。上清２を除去して残った沈殿に5 mLの緩衝液３
を加え、ポリトロンでホモジナイズした後同様に遠心分
離を行い、得られた液相を上清３（膜画分）とした。

【００６０】(1-4)Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰが固着した固
相（ビーズ）の調製 (1-4-1)Ｌ−スレオ−２−(9-カルボキシノナノイル)ア
ミノ−３−モルホリノ−１−フェニル−１−プロパノー
ルの合成 Ｌ−スレオ−２−アミノ−３−モルホリノ−１−フェニ
ル−１−プロパノール（前記式（II）で示される化合物
のＬ−スレオ体）316.2mg（1.34mmol）に塩化メチレン
10ml、トリエチルアミン 190μl（1.37mmol）、無水セ
バシン酸 292.4mg（1.59mmol）を加え5時間攪拌した
後、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノー
ル＝20：1およびクロロホルム：メタノール＝9：1）で
精製し、無色油状の標記物質 171.1mg（収率30.4％）を
得た。¹ H-NMR(CDCl₃) δ: 7.36-7.25(5H,m,aromatic)，6.50(1
H,d,J=7.82Hz,NH), 4.94(1H,d,J=3.91Hz,H-1),4.37(1H,
m,H-2)，3.80-3.69(4H,m,(CH₂)₂O), 2.77-2.63(6H,m,CH
₂N(CH₂)₂), 2.30(2H,m,COCH₂), 2.09(2H,m,COCH₂), 1.6
1(2H,m,COCH₂-CH₂ ), 1.48(2H,m,COCH₂-CH₂ ), 1.30-1.16
(8H,m,CH₂(CH₂ )₄CH₂)¹³ C-NMR(CDCl₃)δ: 178.3, 174.1, 140.7, 128.4, 127.
7, 126.0, 75.1, 66.2, 59.3, 53.9, 51.0, 36.5, 34.
4, 28.9, 28.8, 25.4, 24.9, 24.8 (1-4-2) EAH-セファロース４B(ファルマシア社；ゲル
体積50 mL)をグラスフィルター上に移し、0.5 M NaCl
で洗浄後(100 mL×4)、ビーカーに移し、ゲル込みで液
量150 mLの懸濁液とした。このものに上記で製造したＬ
−スレオ2-(9-カルボキシノナノイル)アミノ-3-モルホ
リノ-1-フェニル-1-プロパノールの水溶液50mL(505mg,
1.2mmol, 0.5 M NaCl 含有)を加え、振盪撹拌した。次
に、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジ
イミド塩酸塩1.9g (10 mmol)を加え、室温下にて24時間
振盪撹拌した。反応開始24時間後、ゲルをグラスフィル
ター上に移し、脱イオン水、酢酸緩衝液(pH 4)、トリス
緩衝液(pH 8.6)、それぞれ100mLで順次洗浄し、酢酸緩
衝液とトリス緩衝液による洗浄をさらに2回繰り返し
た。最後に、ゲルを脱イオン水200 mLで洗浄した後、20
％エタノール70 mLに懸濁し、4℃で保存した。これによ
り、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰが直接固着したに等しい固相
を得ることができる。

【００６１】(1-5)Ｄ−スレオ−ＰＤＭＰが固着した固
相（ビーズ）の調製 EAH-セファロース４B(ファルマシア社；ゲル体積50 mL)
をグラスフィルター上に移し、0.5 M NaCl で洗浄後(10
0 mL×4)、ビーカーに移して0.5 M NaCl 30 mLの懸濁液
とした。このものに上記と同様に調製したＤ−スレオ2-
(9-カルボキシノナノイル)アミノ-3-モルホリノ-1-フェ
ニル-1-プロパノールの水溶液70 mL(682.2 mg, 1.62mmo
l, 0.5 M NaCl 含有)を加え、振盪撹拌した。次に、N-
エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
塩酸塩1.946g (10.15 mmol) を加え、室温下にて24時間
振盪撹拌した。反応開始24時間後、ゲルをグラスフィル
ター上に移し、脱イオン水、酢酸緩衝液(pH 4)、トリス
緩衝液(pH 8.6)それぞれ100 mLで順次洗浄し、酢酸緩衝
液とトリス緩衝液の洗浄をさらに2回繰り返した。最後
に、ゲルを脱イオン水200 mLで洗浄した後、20％エタノ
ール70 mLに懸濁し、4℃で保存した。これにより、Ｄ−
スレオ−ＰＤＭＰが直接固着したに等しい固相を得るこ
とができる。

【００６２】(1-6)Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク
質の調製 前記の上清１〜３のそれぞれから、Ｄ−スレオ−ＰＤＭ
ＰやEAH-セファロース4B自体に結合するタンパク質等を
除くために、まず以下の操作を行った。１mLの上清１〜
３それぞれ1mLに対して、予めPBSで洗浄したＤ−スレオ
−ＰＤＭＰビーズをゲル体積としてそれぞれ60μL加
え、4℃で2時間インキュベートした。その後遠心分離し
て上清を回収した。同様の操作をさらに4回繰り返し
た。回収された上清１〜３のそれぞれに、あらかじめPB
Sで洗浄した60μLのＬ−スレオ−ＰＤＭＰビーズを加
え、4℃で一晩インキュベートした。その後遠心分離し
てビーズを回収した。タンパク質が結合したビーズは、
上清１〜３に対応してそれぞれ1 mLの緩衝液１〜３で３
回洗浄し、200μL の8M 尿素 を含んだ緩衝液１〜３ を
加え、４℃で２時間溶出した。その後遠心分離して上清
（Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質溶液）を回収
し、SDS-PAGEに付した。またアミノ酸配列決定のため、
同様の方法でＬ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質溶液
を1 mL調製した。溶液を限外ろ過フィルターで100μLに
濃縮し、33μLのSDS-PAGE用サンプルバッファーを加え2
分間煮沸して加熱変性処理を行った。その後後述の方法
でSDS-PAGEを行い、クマシーブリリアントブルー（CB
B）染色した。アミノ酸配列決定に付する目的のタンパ
ク質のバンド(Ｌ３)をゲルから切り出した。

【００６３】(1-7)ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 試料の加熱変性は、SDS-PAGE用サンプルバッファーを試
料の１/３量加え２分間煮沸することによって行った。4
％ポリアクリルアミドの濃縮ゲルおよび10％ポリアクリ
ルアミドの分離ゲルを用い、緩衝液として泳動用緩衝液
を使用した。

【００６４】(1-8)銀染色 シルバーステインキット(ATTO社) を用いて銀染色を行
った。

【００６５】(1-9)断片ペプチドの調製 アミノ酸配列決定に付するタンパク質の断片化は、in-g
el digestion 法（Rosenfeld J, Capdevielle J, Guill
emot JC, Ferrara P., Anal Biochem 203(1),173-179
(1992)）を一部改変して行った。ゲル片を、50％アセト
ニトリル/200mM 炭酸アンモニウム(pH 8.9)を用いて30
℃、20分間の条件で2回洗浄した後に、室温にて半乾き
にした。ゲル片に200mM 0.02％ Tween-20を含む炭酸ア
ンモニウム(pH 8.9)を加え、0.025％ トリプシンを含む
トリス緩衝液（pH 8.0）を加えて35℃, 20時間の処理を
行った。その後、溶液の全量を逆相ＨＰＬＣに付して、
断片ペプチドを分離した(逆相HPLCカラム: TSKgel ODS-
80TS QA (TOSOH社)、溶媒A: 0.1 ％ TFA（トリフルオロ
酢酸）、溶媒B - 0.09 ％ TFA in 90 ％ アセトニトリ
ル, 検出 : 210 nm、280 nm)。対照としてバンドのな
いゲル部分を切り出し同様に処理を行った。

【００６６】(1-10)アミノ酸配列の決定 Ｎ末端プロテインシークエンサー (G1005A, ヒューレッ
トパッカード) を使用して、分析プログラム Routine
3.1 でアミノ酸配列を分析した。

【００６７】(1-11)ウエスタンブロット SDS-PAGE後のゲルを転写用緩衝液中で５分間振盪して平
衡化した。次にセミドライ型転写用装置(Trans-Blot S
D, BioRad社)を用いて、10 V,30分間の条件でゲル中の
タンパク質をPVDF膜 (MILLIPORE社) 上に転写した。転
写後のPVDF膜をブロッキング用緩衝液中で１時間ブロッ
キングした。次に、１次抗体としてブロッキング用緩衝
液で100倍に希釈した 抗-VDAC1(N18) (sc-8828, Santa
Cruz社) を用いて4℃で一晩反応させた。TBS-Tで洗浄
（５分間ｘ５回）し、２次抗体としてTBS-Tで10000倍に
希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)
標識ロバ 抗-ヤギ IgG (sc-2304, Santa Cruz社) を用
いて室温で45分間反応させた。TBS-Tで洗浄（５分間ｘ
５回）し、ECL Plus ウエスタンブロッティング検出試
薬(Amersham Pharmacia)を用いて抗体の検出を行った。

【００６８】(2)結果 (2-1)Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質の検出 上清１（細胞質画分）、上清２（膜結合画分）および上
清３（膜画分）のそれぞれの細胞画分について、Ｄ−ス
レオ−ＰＤＭＰビーズに結合したタンパク質、Ｌ−スレ
オ−ＰＤＭＰビーズに結合したタンパク質（いずれも8M
尿素で溶出）をSDS-PAGEに付し、銀染色によって検出
した。その結果、上清１（細胞質画分）及び上清２（膜
結合画分）には、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰビーズにのみ特
異的に結合するタンパク質のバンドは確認できなかっ
た。一方、上清３（膜画分）には、約34 kDa付近にＬ−
スレオ−ＰＤＭＰビーズにのみ結合するタンパク質のバ
ンド(以下、「Ｌ３」という)が確認された。

【００６９】(2-2)Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク
質の内部アミノ酸配列の決定 Ｌ３の内部アミノ酸配列を決定するために、(1-6)に記
載の方法でゲルから切り出したＬ３のバンドを、(1-9)
に記載の方法で逆相ＨＰＬＣに付し、精製された４種類
のペプチド断片についてそれぞれアミノ酸配列を決定し
た。決定されたアミノ酸配列（配列１〜４）を以下に示
す。 配列１ WNTDNTLGTE ITVED 配列２ LTFDSSF 配列３ TDEFQLHTNV 配列４ KLETAVNLAW また、マウスのVDAC1のアミノ酸配列（配列５）を以下に示す。配列５中の下 線部は、配列１〜４と一致する部分を示す。 配列５ AVPPTYADLG KSARDVFTKG YGFGLIKLDL KTKSENGLEF TSSGSANTET TKVNGSLETK YRWTEYGLTF TEKWNTDNTL GTEITVEDQL ARGLKLTFDS SFSPNTGKKN AKIKTGYKRE HINLGCDVDF DIAGPSIRGA LVLGYEGWLA GYQMNFETSK SRVTQSNFAV GYKTDEFQLH TNV NDGTEFG GSIYQKVNKK LETAVNLAWT AGNSNTRFGI AAKYQVDPDA CFSAKVNNSS LIGLGYTQTL KPGIKLTLSA LLDGKNVNAG GHKLGLGLEF QA 以上の結果より、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質
から得られた４種類のペプチド断片のアミノ酸配列は、
全てマウスのVDAC1のアミノ酸配列と一致した。また同
様に、ヒトのVDAC1、ウサギのVDAC1、ウシのVDAC1およ
び野生イノシシのVDAC1とも100％一致した。

【００７０】(2-3)ウエスタンブロットによるＬ−スレ
オ−ＰＤＭＰ結合タンパク質の同定 Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質溶液及びＤ−スレ
オ−ＰＤＭＰ結合タンパク質溶液について、抗VDAC1抗
体を用いてウエスタンブロットしたところ、Ｌ−スレオ
−ＰＤＭＰ結合タンパク質溶液にのみVDAC1に相当する
バンドが検出された。以上の結果より、Ｌ−スレオ−Ｐ
ＤＭＰに特異的に結合するタンパク質はVDAC1であるこ
とが示された。

【００７１】２．Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰの作用 (1)実験材料及び方法 (1-1)各種緩衝液の組成 緩衝液Ａ： 0.3 M マンニトール、10 mM Hepes/K⁺ (pH
7.4)、0.2 mM EDTA/K⁺(pH 7.4)、0.1％ ウシ血清アル
ブミン（BSA；脂肪酸フリー） 緩衝液Ｂ：0.3 M マンニトール、10 mM Hepes/K⁺ (pH
7.4)、1mM KPB（リン酸カリウム緩衝液） (pH 7.4)、0.
1％ BSA (脂肪酸フリー) 呼吸用緩衝液：緩衝液Ｂ、0.2 mM EDTA/K⁺ (pH 7.4)、
0.2 mM EGTA/K⁺ (pH 7.4)、1 mM MgCl₂

【００７２】(1-2)ミトコンドリアの精製 ラット(SD系、８週令くらいのオス)をエーテル麻酔後開
腹し、肝臓を摘出した。すみやかに 100 mLの緩衝液Ａ
に入れ、はさみで細切した。その間緩衝液Ａを4回交換
した。テフロン（登録商標）ホモジナイザー（井内）を
用いてホモジナイズした後テフロン製遠沈管に分注し、
750 ×gで10分間遠心分離した。その上清を新しいテフ
ロン製遠沈管に移し、5,000×gで8分間遠心分離し、次
いで10,000×g、5 分間遠心分離を行った。上清を捨
て、沈殿物に緩衝液Ｂを10 mL加えた後脱脂綿でほぐし
た。その後、750×gで10分間遠心分離し、上清を新しい
テフロン製遠沈管に移した。さらに9,000×gで10分間遠
心分離して上清を捨て、沈殿物に緩衝液Ｂを1mL 加えて
脱脂綿でほぐし、精製ミトコンドリア溶液とした。遠心
操作は全て0℃で行った。

【００７３】BCA protein assay kit (PIRECE社)を使用
して、精製ミトコンドリア溶液のタンパク質量を測定し
た。精製ミトコンドリアを0.5 N NaOH で10、20、50又
は100倍に希釈し、それぞれ25μLに対してBCA protein
assay kitに添付されている反応溶液を500mL加え、37℃
で30分間インキュベートした後、562 nmの吸光度を測定
した。同時に牛血清アルブミン(BSA)を標準として検量
線を作成し、タンパク質量を定量した。

【００７４】また、精製ミトコンドリア溶液中のミトコ
ンドリアが実験に使用可能なものかどうかを判定するた
めに、ミトコンドリアの酸素消費速度を測定した。酸素
電極としては生物研究用酸素モニターDOE-SET（RANK BR
OTHES 社製）を、解析ソフトとしてはPCカード型データ
収集システムNR110/150（KEYENCE社製）を使用した。

【００７５】酸素電極のベッセルに呼吸用緩衝液を入れ
（精製ミトコンドリア溶液を加えた際に2 mLになるよう
に）、酸素濃度の測定を開始した。波形が安定した事を
確認した後、1 mgのタンパク質(0.5 mgタンパク質/mL)
に相当する精製ミトコンドリア溶液を加えた。約1分
後、10 μL の1 M こはく酸/K⁺ (pH 7.4) (50 mM) を、
さらにその約1分後に 3 μL の0.1 M ADP (アデノシン-
ジ-リン酸；0.15 μM)を加え、波形を観察した。ADPを
加えた後の酸素消費速度を「状態３」、しばらくして波
形が緩やかになった時の酸素消費速度を「状態４」とし
た。呼吸調節率(状態３ / 状態４)を算出した結果、４
以上であったことから、精製ミトコンドリア溶液中のミ
トコンドリアは呼吸作用を保持しており、以下の実験に
使用可能と判断された。

【００７６】(1-3) ミトコンドリア膜電位の測定 キュベットに、7.5μLの 1 Mこはく酸/K⁺(pH 7.4) (50
mM)、15μL の1mMローダミン123、および緩衝液 B (精
製ミトコンドリア溶液を加えた際に1.5 mLになるよう
に)を加えた。キュベットを蛍光光度計にセットし、1.5
mgのタンパク質(1 mgタンパク質/mL)に相当する精製ミ
トコンドリア溶液を加えた後、直ちにこの反応液につい
て励起波長504 nm、測定波長535 nm で測定を開始し
た。約30秒後、75μL の1 mM CaCl₂ (終濃度50μM) を
添加することにより刺激し、経時的に波形の変化を観察
した。

【００７７】ミトコンドリアの膜電位が低下すると、ミ
トコンドリアに取込まれたローダミン123が放出され、
これにより液相中のローダミン123の蛍光強度が増加す
る。よって液相中の蛍光強度の変化は、ミトコンドリア
膜電位の変化の指標とすることができる。 (1-4)ミトコンドリアからのチトクロームＣの放出量の
測定 48穴マルチウェルプレートに反応溶液(緩衝液Ｂ、50 mM
こはく酸、10 mM KPB)を入れ、精製ミトコンドリア溶
液を加え、次いでCaCl₂ (終濃度50μM)を添加すること
により刺激した後、反応液を０分、１５分および３０分
目に80 μLずつチューブに採取した。採取後速やかに4
℃、1500 rpm、2分間遠心分離し、上清と沈澱を回収し
た。上清には20μLのSDS-PAGE用サンプルバッファーを
加え、沈殿物には100μLの4倍に希釈したSDS-PAGE用サ
ンプルバッファーを加え、それぞれをよくピペッティン
グした後５分間煮沸することにより加熱変性を行った。
採取したサンプルは、5％ポリアクリルアミドの濃縮ゲ
ルおよび15％ポリアクリルアミドの分離ゲルを用いて前
記と同様にSDS-PAGEを行った。泳動後のゲルを用いて前
記と同様の方法でウエスタンブロット（１次抗体：抗-
チトクロームＣ (7H8.2C12, PharMingen社)、２次抗
体：ヤギ 抗-マウス IgG HRP (sc-2005, Santa Cruz
社)）を行った。

【００７８】(2)結果 (2-1) ミトコンドリア膜電位の測定 上記(1-3)に記載の方法において、反応液中に20μM 又
は40μMのＬ−スレオ−ＰＤＭＰを存在させたときの、
液相の蛍光強度の結果を図１に示す。図１より、ミトコ
ンドリアにＬ−スレオ−ＰＤＭＰを共存させることによ
り、コントロール（Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ無添加）に比
してミトコンドリア膜電位が消失する時間が顕著に遅延
することが示された。この作用はＬ−スレオ−ＰＤＭＰ
の濃度依存的であった。

【００７９】また、40μMのＬ−スレオ−ＰＭＭＰ、40
μMのＬ−スレオ−ＰＰＭＰについても同様に実験し
た。結果を図２に示す。

【００８０】図２より、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰのみなら
ず、Ｌ−スレオ−ＰＭＭＰやＬ−スレオ−ＰＰＭＰ等の
アミノアルコール誘導体にも、ミトコンドリア膜電位の
消失時間を顕著に遅延させる作用があることが示され
た。この作用は、Ｌ−スレオ−ＰＰＭＰ、Ｌ−スレオ−
ＰＭＭＰ、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰの順に顕著であった。
ガングリオシドＧＤ３は、ミトコンドリアに直接作用し
てアポトーシスをひき起こすことが知られている。そこ
で、ＧＤ３によるミトコンドリアの膜電位消失に対する
Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰの効果を検討した。実験は、上記
(1-3)に記載の方法において、40μMのＧＤ３のみを共存
させたもの、20μMのＧＤ３のみを共存させたもの、20
μMのＧＤ３と20μMのＬ−スレオ−ＰＤＭＰとを共存さ
せたもの、20μMのＧＤ３と40μMのＬ−スレオ−ＰＤＭ
Ｐとを共存させたもの、およびコントロール（ＧＤ３お
よびＬ−スレオ−ＰＤＭＰ無添加）について行った。結
果を図３に示す。

【００８１】図３より、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰを共存さ
せたものは、ＧＤ３によるミトコンドリア膜電位消失の
時間が顕著に延長した。

【００８２】以上の結果から、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰを
はじめとするアミノアルコール誘導体は、ＶＤＡＣの機
能（ミトコンドリア膜電位を低下させる機能）を阻害す
ることが示された。

【００８３】(2-2) ミトコンドリアからのチトクローム
Ｃの放出量の測定 上記(1-4)に記載の方法において、反応溶液中に20μMの
Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰを存在させたときの上清中のチト
クロームＣの量を測定し、これをミトコンドリア外へ放
出されたチトクロームＣの量とした。その結果、コント
ロール（Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ無添加）では経時的にミ
トコンドリア外に放出されたチトクロームＣの量が増加
していったのに対し、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ存在下では
チトクロームの放出は顕著に抑制された。この結果か
ら、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰをはじめとするアミノアルコ
ール誘導体は、ＶＤＡＣの機能（ミトコンドリアからチ
トクロームＣを放出させる機能）を抑制することが示さ
れた。

【００８４】

【発明の効果】本発明の剤（本発明阻害剤および本発明
抑制剤）は、優れたＶＤＡＣ機能阻害作用（ミトコンド
リア膜電位の低下を抑制する作用、チトクロームＣの放
出を抑制する作用）を発揮することから、ＶＤＡＣの機
能阻害が望まれている細胞や組織の処置等に極めて有用
である。また本発明製造方法は、簡便・迅速かつ容易に
精製されたＶＤＡＣ画分を製造することができ、極めて
有用である。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 生化学工業株式会社(Seikagaku Corporation) 北海道ティー・エル・オー株式会社(Hokkaido Technology Licensing Off ice Co., Ltd.) <120> ＶＤＡＣ機能阻害剤 <130> J200100800 <140> <141> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> mouse & rat hybrid cell <400> 1 Trp Asn Thr Asp Asn Thr Leu Gly Thr Glu Ile Thr Val Glu Asp 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> mouse & rat hybrid cell <400> 2 Leu Thr Phe Asp Ser Ser Phe 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> mouse & rat hybrid cell <400> 3 Thr Asp Glu Phe Gln Leu His Thr Asn Val 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> mouse & rat hybrid cell <400> 4 Lys Leu Glu Thr Ala Val Asn Leu Ala Trp 1 5 10 <210> 5 <211> 282 <212> PRT <213> mouse <400> 5 Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Lys Ser Ala Arg Asp Val 1 5 10 15 Phe Thr Lys Gly Tyr Gly Phe Gly Leu Ile Lys Leu Asp Leu Lys Thr 20 25 30 Lys Ser Glu Asn Gly Leu Glu Phe Thr Ser Ser Gly Ser Ala Asn Thr 35 40 45 Glu Thr Thr Lys Val Asn Gly Ser Leu Glu Thr Lys Tyr Arg Trp Thr 50 55 60 Glu Tyr Gly Leu Thr Phe Thr Glu Lys Trp Asn Thr Asp Asn Thr Leu 65 70 75 80 Gly Thr Glu Ile Thr Val Glu Asp Gln Leu Ala Arg Gly Leu Lys Leu 85 90 95 Thr Phe Asp Ser Ser Phe Ser Pro Asn Thr Gly Lys Lys Asn Ala Lys 100 105 110 Ile Lys Thr Gly Tyr Lys Arg Glu His Ile Asn Leu Gly Cys Asp Val 115 120 125 Asp Phe Asp Ile Ala Gly Pro Ser Ile Arg Gly Ala Leu Val Leu Gly 130 135 140 Tyr Glu Gly Trp Leu Ala Gly Tyr Gln Met Asn Phe Glu Thr Ser Lys 145 150 155 160 Ser Arg Val Thr Gln Ser Asn Phe Ala Val Gly Tyr Lys Thr Asp Glu 165 170 175 Phe Gln Leu His Thr Asn Val Asn Asp Gly Thr Glu Phe Gly Gly Ser 180 185 190 Ile Tyr Gln Lys Val Asn Lys Lys Leu Glu Thr Ala Val Asn Leu Ala 195 200 205 Trp Thr Ala Gly Asn Ser Asn Thr Arg Phe Gly Ile Ala Ala Lys Tyr 210 215 220 Gln Val Asp Pro Asp Ala Cys Phe Ser Ala Lys Val Asn Asn Ser Ser 225 230 235 240 Leu Ile Gly Leu Gly Tyr Thr Gln Thr Leu Lys Pro Gly Ile Lys Leu 245 250 255 Thr Leu Ser Ala Leu Leu Asp Gly Lys Asn Val Asn Ala Gly Gly His 260 265 270 Lys Leu Gly Leu Gly Leu Glu Phe Gln Ala 275 280

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰによる、ミトコンドリ
ア膜電位の消失時間の遅延を示す図である。

【図２】 各種アミノアルコール誘導体による、ミトコ
ンドリア膜電位の消失時間の遅延を示す図である。

【図３】 Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰによる、ＧＤ３によっ
て起こるミトコンドリア膜電位の消失時間の遅延を示す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 13/02 Ａ６１Ｐ 13/02 13/12 13/12 17/14 17/14 19/04 19/04 25/00 25/00 37/00 37/00 37/06 37/06 39/02 39/02 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｄ 295/12 Ｃ０７Ｄ 295/12 Ｚ (72)発明者 神保 雅之 東京都中野区鷺ノ宮５−２−１ Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 BC73 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA02 ZA15 ZA16 ZA18 ZA36 ZA66 ZA75 ZA81 ZA89 ZA92 ZA94 ZB02 ZB21 ZC02 ZC37

Claims (9)

【整理番号】 Ｊ２００１００８００ 【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘
   導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含
   有する、電位依存性陰イオンチャネルの機能阻害剤。 【化１】 式（Ｉ） 上記式中、Ｒ^１は置換基を有することもあるアリール基
   若しくはシクロアルキル基、アルキル基、又はアルケニ
   ル基を表し、Ｒ^２は水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^３
   はアシル基、アルキル基、アラルキルオキシカルボニル
   基、アルコキシカルボニル基、アルケニルオキシカルボ
   ニル基、ヒドロキシアルキルカルボニル基、又はカルボ
   キシアルキルカルボニル基を表す。
2. 【請求項２】 式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘
   導体が、Ｌ−スレオ体、ＤＬ−スレオ体、Ｌ−エリトロ
   体、又はＤＬ−エリトロ体である、請求項１に記載の機
   能阻害剤。
3. 【請求項３】 Ｒ^１がアリール基である、請求項１又は
   ２に記載の機能阻害剤。
4. 【請求項４】 アリール基が、アルキル、アルコキシ、
   ヒドロキシおよびニトロからなる群から選ばれる同一又
   は異なる１〜３個の置換基で置換されていてもよいフェ
   ニル基である、請求項３に記載の機能阻害剤。
5. 【請求項５】 Ｒ^３がアシル基である、請求項１〜４の
   いずれか１項に記載の機能阻害剤。
6. 【請求項６】 アシル基が、炭素数１０〜１６のアシル
   基である、請求項５に記載の機能阻害剤。
7. 【請求項７】 Ｒ^２が水素原子である、請求項１〜６の
   いずれか１項に記載の機能阻害剤。
8. 【請求項８】 請求項１〜９のいずれか１項記載の機能
   阻害剤からなる、ミトコンドリアからのチトクロームＣ
   の放出抑制剤。
9. 【請求項９】 以下の工程を少なくとも含む、精製され
   た電位依存性陰イオンチャネル画分の製造方法。 工程１：電位依存性陰イオンチャネルを含有する液相
   と、式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体が固着
   した固相とを接触させ、電位依存性陰イオンチャネルを
   当該固相に結合させる工程。 工程２：固相に固着した電位依存性陰イオンチャネルを
   固相から解離させ、固相と分離する工程。 【化２】 式（Ｉ） 上記式中、Ｒ^１は置換基を有することもあるアリール基
   若しくはシクロアルキル基、アルキル基、又はアルケニ
   ル基を表し、Ｒ^２は水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^３
   はアシル基、アルキル基、アラルキルオキシカルボニル
   基、アルコキシカルボニル基、アルケニルオキシカルボ
   ニル基、ヒドロキシアルキルカルボニル基、又はカルボ
   キシアルキルカルボニル基を表す。