JPH09169664A - 分化誘導作用を有する薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】 グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤、
特に当該阻害活性を有する、一般式〔１〕で示される２
−アシルアミノプロパノール誘導体または薬学的に許容
されるその塩、を有効成分とする分化誘導作用を有する
薬剤。 〔式中、Ｒ^１は置換されていてもよいフェニル基を表
し、ｎは２〜１６の整数を表す。〕 【効果】 一般式〔１〕に示した、Ｄ−トレオ−ＰＤＭ
Ｐに代表される２−アシルアミノプロパノール誘導体
は、未分化な状態で異常な細胞増殖を呈する細胞の分化
を誘導し、一定の寿命を持つ終未分化細胞へと分化させ
て、異常増殖状態から離脱させ、もって該細胞を正常な
状態へと取り戻すことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グルコスフィンゴ
糖脂質生合成阻害物質を有効成分とする分化誘導剤に関
する。詳細には本発明は、上記阻害物質を投与すること
によって未分化な状態で異常増殖する細胞の分化を誘導
し、一定の寿命を持つ終末分化細胞に分化させて、異常
増殖状態からの離脱をはかることを目的とした分化誘導
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】動物細胞の表面に存在する糖鎖は、構造
化学的に多様であるばかりでなく、動物種・臓器種・細
胞種によって高い構造特異性がみられる。細胞は、細胞
社会における多様な生物学的情報をそれらに対応する特
異的なアンテナ分子である糖鎖を介して識別している。
しかし、糖鎖構造は、必ずしも静的なものではなく、細
胞の発生・分化や、癌化の過程で劇的に変動する。すな
わち、動的な側面を持つ。

【０００３】最近、分化の過程で発現してくる糖鎖が細
胞の増殖・分化のシグナルを制御したり、あるいはそれ
自身が直接シグナルを形成して細胞の次の運命を決定し
ている可能性が示されてきている。しかも、このような
分化段階特異的な糖鎖発現は、サイトカインによって制
御されている可能性がある。このことは、細胞は遺伝子
の二次的産物（一次産物は糖鎖合成酵素）である糖鎖を
介して自分の細胞社会における運命（次の遺伝子発現）
を決定していることになる。したがって、糖鎖の発現機
構の異常は細胞社会学的統制からの逸脱を誘発すること
になり、さまざまな疾患の原因を構成することになる。
しかし、糖鎖の発現機構の詳細はいぜんとして不明のま
まである。

【０００４】最近まで単なる生体膜構造体のひとつと考
えられてきたグルコスフィンゴ糖脂質（以下「糖脂質」
ということもある。）分子そのものに分化誘導活性など
の生物活性が発見されるに及んで「情報伝達系における
機能性膜分子」としての姿が明らかになってきた。この
ような活性は特異的糖鎖構造を介して発揮される。糖鎖
は糖転移酵素群やその糖鎖に対応する糖分解酵素のバラ
ンスにより作り出される遺伝子の二次的産物で、分子生
物学的アプローチが困難であるため直接的な機能解明が
遅れていた。糖転移酵素（遺伝子）の発現の変化によっ
てもたらされる糖鎖構造の変化が細胞の増殖・分化の制
御機構に「直接的に」関与しているという知見は、外来
性の分子（相手の細胞も含む）が認識する細胞マーカー
や分化抗原といったどちらかといえば静的な観点より捉
えられてきた糖鎖の持つ生理的意義に、新たな見地を提
供することになるだろう。しかし、糖鎖を介するシグナ
ル伝達機構の分子レベルでの研究は端緒についたばかり
であり、糖鎖の作用ははたして直接的なものか、あるい
は間接的なものかは不明であり、その解明が待たれてい
る。

【０００５】現在、糖脂質の機能を探る手法として最も
多く使われているものは、実験系に外から糖脂質を添加
するというタイプのものであるが、その場合内因性糖脂
質との関連が問題となる。つまり、細胞膜に存在する内
因性糖脂質が種々の細胞表面受容体等と既に複合体を形
成している中に、さらに糖脂質を添加して導きだされる
結果は、内因性糖脂質の真の細胞生理学的意義を常に反
映しているとは限らないと考えられる。従って、糖脂質
の細胞生理学上に於ける本来の役割を知るためには、内
因性糖脂質の生合成を特異的に阻害する方法が必要であ
った。本発明者等は先に、セラミドのアナログである２
−アシルアミノプロパノール誘導体を種々合成しそれら
の糖脂質生合成阻害活性を検討した結果、１−フェニル
−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパ
ノール（ＰＤＭＰ）の立体異性体の中でＤ−、またはＤ
Ｌ−トレオ体がグルコシルセラミド生合成酵素を特異的
に阻害し、グルコシルセラミドを出発物質とする全ての
糖脂質の細胞内含量を著しく減少させることを証明した
（Ａｄｖ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，２６，１８３−２１
３，１９９３）。また、ＰＤＭＰはグルコシルセラミド
合成阻害により、グルコシルセラミドの生合成前駆体で
あるセラミドの細胞内含量を増加させる効果を有する
が、近年セラミド分子は、分化、アポトーシスや細胞増
殖の抑制に関与している細胞内シグナル伝達系における
重要な細胞内情報伝達分子としての証拠が数多く報告さ
れてきている（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１
６，２９４−２９５，１９９５）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】細胞が未分化の状態で
異常増殖を呈する病態において、その細胞中には特定の
糖脂質分子が正常細胞に比べて異常に発現している。本
発明はこのような糖脂質の発現を特異的な生合成阻害剤
により抑制することで異常増殖状態から離脱させ、細胞
を正常な状態に分化させて細胞の異常増殖に基づく疾患
を処置する薬剤を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記の理由から、固形腫
瘍等の異常増殖を示す細胞の糖脂質の発現を阻害するこ
と、特に特異的なグルコシルセラミド生合成酵素の阻害
剤、例えば特定の２−アシルアミノプロパノール誘導体
で抑制することにより、異常増殖細胞の分化を誘導し正
常化できるのではないかという仮説を立て、鋭意研究を
進めついに本発明を完成した。本発明は、グルコスフィ
ンゴ糖脂質生合成阻害剤を有効成分とする分化誘導作用
を有する薬剤を提供する。また、上記において、グルコ
スフィンゴ糖脂質生合成阻害剤が、一般式〔１〕

【化２】 〔式中、Ｒ^１はアルキル、アルコキシ、ヒドロキシおよ
びニトロからなる群から選ばれる同一または異なる１〜
３個の置換基で置換されていてもよいフェニル基を表
し、ｎは２〜１６の整数を表す。〕で示される２−アシ
ルアミノプロパノール誘導体または薬学的に許容される
その塩である薬剤を提供する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明はグルコスフィンゴ糖脂質
生合成阻害剤を有効成分とする分化誘導作用を有する薬
剤（以下、単に「本発明の分化誘導剤」ともいう。）で
ある。ここで「グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤」
とはグルコスフィンゴ糖脂質の生体内での合成を阻害す
る機能を有する物質を全て包含する。また、「グルコス
フィンゴ糖脂質」とはグルコシルセラミドとそれを出発
物質として生合成されるスフィンゴ糖脂質を意味する。
グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤としては、グルコ
シルセラミド生合成酵素阻害活性を有する一般式〔１〕
で示される２−アシルアミノプロパノール誘導体、好ま
しくは一般式〔１〕においてＲ^１がフェニル基であり、
ｎが８である化合物、すなわち１−フェニル−２−デカ
ノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（以
下、ＰＤＭＰという。）が挙げられる。ＰＤＭＰには立
体異性体が４種類あるが、上記酵素阻害活性を有するＤ
−トレオ−ＰＤＭＰおよびＤＬ−トレオ−ＰＤＭＰが好
ましい。また、Ｎ−ブチルガラクトノジリマイシン、Ｎ
−ブチルデオキシノジリマイシンなどのアザ糖誘導体も
グルコシルセラミド生合成阻害活性を有しているので本
発明のグルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤として使用
することができる。上記一般式〔１〕で示される化合物
の薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、硫
酸、硝酸、蟻酸等の無機酸塩；酢酸、クエン酸、乳酸、
リンゴ酸、シュウ酸、マレイン酸、フマール酸、コハク
酸、トリフロオロ酢酸、メタンスルホン酸、ρ−トルエ
ンスルホン酸等の有機酸の塩を挙げることができる。

【０００９】薬剤 本発明の分化誘導剤は、ヒトを含む哺乳動物の、細胞が
未分化な状態で異常増殖を呈することに基づく各種疾患
の処置、すなわちこのような疾患の治療、軽減（症状の
改善）、維持（悪化防止）または予防を目的とする医薬
品として使用することができる。このような疾患として
は、良性腫瘍（子宮筋腫など）、悪性固形腫瘍（食道
癌、大腸癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、肝癌等の扁平上皮癌
や腺癌など）、脳腫瘍、神経膠腫、腎炎（糸球体腎炎な
ど）、ヒト自己免疫性リンパ球増殖性症候群、リンパ球
増殖性疾患、血管免疫芽細胞性リンパ節症、免疫芽細胞
性リンパ節症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患
（クローン病、潰瘍性大腸炎等）、進行性全身性硬化
症、多発性筋炎（皮膚筋炎）、シェーグレン症候群、白
血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、強皮症、リウマ
チ、乾癬、創傷の過形成（肉芽等）などの異常増殖性疾
患が例示されるが、本発明はグルコスフィンゴ糖脂質の
生合成を阻害することによって細胞の分化を誘導し、処
置できる全ての疾患を対象とすることができる。

【００１０】本発明の分化誘導剤は、グルコスフィンゴ
糖脂質生合成阻害剤、例えば一般式〔１〕で示される２
−アシルアミノプロパノール誘導体または薬学的に許容
されるその塩、あるいは必要により薬学的に許容される
公知の担体、賦形剤、その他の添加物とともに、目的に
応じて経口的あるいは非経口的投与に適した製剤とする
ことができる。さらに公知の技術により持続性製剤とす
ることも可能である。

【００１１】経口製剤としては、散剤、顆粒剤、カプセ
ル剤、錠剤等の固形製剤；シロップ剤、エリキシル剤、
乳剤等の液状製剤を挙げることができる。散剤は、例え
ば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウ
ム、リン酸水素カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグ
ネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤と混合して得ることが
できる。顆粒剤は、上記賦形剤のほか、必要に応じ、例
えば白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニル
ピロリドン、デンプン等の結合剤や、カルボキシメチル
セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、
デンプン等の崩壊剤をさらに加え、湿式又は乾式で造粒
して得ることができる。錠剤は、上記散剤又は顆粒剤を
そのまま、又はステアリン酸マグネシウム、タルク等の
滑沢剤を加えて打錠して得ることができる。また、ヒド
ロキシプロピルセルロース、酸化チタン、ゼラチン、白
糖等を用いて糖衣錠とすることもできる。さらに、上記
錠剤又は顆粒剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロー
スフタレート、メタアクリル酸メチルコポリマー、ヒド
ロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネー
ト、酢酸フタル酸セルロース等の腸溶性基剤で被覆し、
或いはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油等で
被覆し、これらを腸溶性或いは持続性製剤にすることが
できる。硬カプセル剤は、上記散剤又は顆粒剤を硬カプ
セルに充填して得ることができる。また軟カプセル剤
は、グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤を、グリセリ
ン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油等に
溶解し、これをゼラチン膜で被覆して得ることができ
る。シロップ剤は、白糖、ソルビトール、グリセリン等
の甘味剤とグルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤とを、
水に溶解して得ることができる。また、甘味剤及び水の
ほかに、精油、エタノール等を加えてエリキシル剤とす
るか、或いはアラビヤゴム、トラガカント、ポリソルベ
ート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウム、レ
シチン、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、マ
クロゴール、ポリエチレングリコール等を加えて乳剤又
は懸濁剤にすることもできる。またこれらの液状製剤に
は必要に応じ、矯味剤、着色剤、保存剤等を加えること
ができる。

【００１２】非経口製剤としては、注射剤、直腸投与
剤、ペッサリー、皮膚外用剤、吸入剤、エアゾール剤、
点眼剤等を挙げることができる。注射剤は、グルコスフ
ィンゴ糖脂質生合成阻害剤に、必要に応じ、塩酸、水酸
化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナト
リウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリ
ウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム等
のｐＨ調整剤；塩化ナトリウム、ブドウ糖等の等張化
剤；及び注射用蒸留水を加え、滅菌濾過または加熱蒸気
滅菌（オートクレーブ）した後、アンプルに充填して得
ることができる。また、更にマンニトール等の糖アルコ
ール、デキストラン、ゼラチン等を加えて真空凍結乾燥
し、用時溶解型の注射剤とすることができる。またグル
コスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤に、レシチン、ポリソ
ルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、マク
ロゴール等の乳化剤、可溶化剤または溶解補助剤を加え
た後、水中で乳化させた注射用乳剤にすることもでき
る。

【００１３】また、注射剤としては、溶解性、目標臓器
への移行速度の改善が可能なリポソーム製剤が挙げられ
る。特に、ナノスフェアーリポソーム（脂質超微粒子）
は網内系組織に取り込まれることなく血中濃度を高め、
薬効発現に必要な最小有効投与量を低下させることがで
きる。リポソーム製剤は公知のリポソーム調製法（Ｃ．
Ｇ．Ｋｎｉｇｈｔ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｐ
ｈｙｓｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５
１−８２，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１
９８１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．７５，４１９４（１９７８））
に従って調製することができる。

【００１４】すなわち、リポソーム膜を形成する両親媒
性物質としては、天然リン脂質（卵黄レシチン、大豆レ
シチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、
ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシト
ール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジル
エタノールアミン、カルジオリピン等）、合成リン脂質
（ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイ
ルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジ
ルエタノールアミン等）等のリン脂質が使用される。

【００１５】また、膜の安定性、流動性、薬剤の膜透過
性を改善するために、コレステロール類（コレステロー
ル、エルゴステロール、フィトステロール、シトステロ
ール、スチグマステロール等）、リポソームに負荷電を
付与することが知られている物質（ホスファチジン酸、
ジセチルホスフェート等）、正荷電を付与することが知
られている物質（ステアリルアミン、ステアリルアミン
アセテート等）、酸化防止剤（トコフェロール等）、油
性物質（大豆油、綿実油、ゴマ油、肝油等）等、公知の
種々の添加剤を使用してもよい。

【００１６】リポソームの製造は、例えば、以下の方法
で行うことができる。上記両親媒性物質及び添加剤と、
グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤を、有機溶媒（ク
ロロホルム、ジクロロメタン、エタノール、メタノー
ル、ヘキサン等の単独又は混合溶媒）にそれぞれ溶解
し、両溶液を混合し、フラスコ等の容器中において不活
性ガス（窒素ガス、アルゴンガス等）の存在下で有機溶
媒を除去し、器壁に薄膜を付着させる。次いで、この薄
膜を適当な水性媒体（生理食塩水、緩衝液、リン酸緩衝
生理食塩水等）に加え、撹拌機で撹拌する。小粒径のリ
ポソームを得るためには、超音波乳化機、加圧型乳化
機、フレンチプレス細胞破砕機等を用いて更に分散させ
る。このようにリポソーム化に必要な両親媒性物質等に
よってリポソーム化が進行し、粒径分布が制御されたナ
ノスフェアーリポソーム（脂質超微粒子；粒子径２５〜
５０ｎｍ程度）を得ることができる。また、リポソーム
を限外濾過、遠心分離、ゲル濾過等の分画処理に付し、
担持されなかった薬剤を除去してもよい。また、膜形成
物質として、上記両親媒性物質、添加剤の他に、β−オ
クチルグルコシド、Ｌ−チロシン−７−アミド−４−メ
チルクマリン、フェニルアミノマンノシドまたはスルフ
ァチドを添加することによって得られる、グルコース残
基、チロシン残基、マンノース残基又はスルファチドを
膜上に有するリポソームにグルコスフィンゴ糖脂質生合
成阻害剤を担持させることもできる。

【００１７】直腸投与剤は、グルコスフィンゴ糖脂質生
合成阻害剤に、カカオ脂肪酸のモノ、ジ又はトリグリセ
リド、ポリエチレングリコール等の坐剤用基剤を加えた
後、加温して溶融し、これを型に流し込んで冷却する
か、或いはグルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤を、ポ
リエチレングリコール、大豆油等に溶解した後、ソフト
レクタルカプセル、ゼラチン膜等で被覆して得ることが
できる。

【００１８】皮膚外用剤は、グルコスフィンゴ糖脂質生
合成阻害剤に、白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィ
ン、ポリエチレングリコール等を加え、必要に応じ加温
し、混練して得ることができる。パップ剤またはテープ
剤は、グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤を、ロジ
ン、アクリル酸アルキルエステル重合体等の粘着剤と混
練し、これを不織布等に展延して得ることができる。吸
入剤は、例えば薬学的に許容される不活性ガス（窒素ガ
ス、炭酸ガス等）等の噴霧剤に、グルコスフィンゴ糖脂
質生合成阻害剤を溶解又は分散し、これを耐圧容器に充
填して得ることができる。

【００１９】投与方法 本発明の薬剤の投与方法は、特に限定されず、対象疾患
および上記の剤型に応じた投与方法が用いられる。例え
ば、悪性腫瘍を処置するための分化誘導剤（脱癌剤）と
して使用する場合、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射
等の注射または経口投与が好ましい。特に神経膠腫（グ
リオーマ）等の脳の疾患の処置に使用する場合、リポソ
ーム製剤または脂質エマルジョン製剤を注射する方法が
好ましい。

【００２０】投与量 投与量は、対象とする疾患、患者の年齢、体重、健康状
態、および病態等に応じ適宜決定されるが、一般には
０．２５〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．５〜１０
０ｍｇ／ｋｇを一日一回あるいはそれ以上に分けて投与
する。

【００２１】毒性 本発明の薬剤の有効成分である一般式〔１〕で示される
２−アシルアミノプロパノール誘導体又はその塩は、薬
理活性を示す投与量において、ほとんどもしくは全く細
胞毒性を示さない。特に、Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰは、２
０μＭで食道癌細胞の分化を誘導したが、後述の実施例
４に示すように、この濃度において細胞毒性が全く認め
られなかった。また、マウス（雄）の腹腔内投与におけ
る急性毒性、ＬＤ_５０値は約２５０ｍｇ／ｋｇであっ
た。

【００２２】

【実施例】

実施例１ ヒト培養食道癌細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養系を
用いてＰＤＭＰの分化誘導能に対して検討を行った。

【００２３】細胞培養 ヒト培養食道癌細胞株は、リンパ節転移巣由来中分化型
偏平上皮癌細胞株ＥＳ−２、原発巣由来中分化型偏平上
皮細胞株ＥＳ−６の２種を用いた。培養は、５％牛胎児
血清（ＦＣＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）添加ダル
ベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，日水製薬）中で、
３７℃、５％ＣＯ_２条件下で行った。培養フラスコは、
Ｆａｌｃｏｎ ３０８２および３０８４組織培養フラス
コ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒ
ｅ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用い
た。細胞数は、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌ
ａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）により細胞を遊離させた後、直
ちにダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬）で洗浄しヘモ
サイトメーターにより計数した。細胞の生存率は、エリ
スロシンＢによる色素排除試験（ｄｙｅ−ｅｘｃｌｕｓ
ｉｏｎ ｔｅｓｔ）法により算出した。

【００２４】ＥＳ−２またはＥＳ−６細胞（２×１０^５
細胞個数／ｍｌ）にグルコシルセラミド合成酵素阻害
剤、Ｄ−トレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ
−３−モルホリノ−１−プロパノール（Ｄ−トレオ−Ｐ
ＤＭＰ）、またはその光学対掌体であるＬ−トレオ−１
−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−
１−プロパノール（Ｌ−トレオ−ＰＤＭＰ）を２０μＭ
の濃度になるように添加し、１日または２日培養後、細
胞の分化誘導を形態学的に観察した。

【００２５】また、糖脂質生合成に対する効果を検討す
るため、ＥＳ−２細胞にＬ−〔３−^１４Ｃ〕セリン（５
０μＣｉ／ｍｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ ＬＩＦＥ ＳＣＩ
ＥＮＣＥ，Ｂｕｃｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａ
ｎｄ）を３００ｎＣｉ／ｍｌとなるように添加（阻害剤
を用いる場合は同時に添加）し、同様にＰＤＭＰで処理
した。指定時間培養後、細胞を回収し、クロロホルム／
メタノール（２：１，Ｖ／Ｖ）混合液を用いて総脂質を
抽出した。得られた総脂質画分をクロロホルム／メタノ
ール／水（３０：６０：８，Ｖ／Ｖ／Ｖ）混合液に溶解
し、同混合液で平衡化したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ａ２５（ファルマシア）カラムにアプライし、過剰の
上記混合液で中性糖脂質を溶出後、ガングリオシドを含
む酸性糖脂質画分をクロロホルム／メタノール／０．８
Ｍ酢酸ナトリウム（３０：６０：８，Ｖ／Ｖ／Ｖ）によ
り溶出させた。さらに、酸性脂質画分を分離し、脱塩
後、３×１０^６個相当量をＨＰＴＬＣプレートにアプラ
イし、展開した。

【００２６】ＨＰＴＬＣプレートをＦｕｊｉｘ ｉｍａ
ｇｉｎｇ ｐｌａｔｅ２０４０（富士写真フィルム）に
１４時間露光し、ｉｍａｇｉｎｇ ａｎａｌｙｚｅｒＢ
ＡＳ−２０００（富士写真フィルム）により検出、定量
した。スタンダードは同一プレート上で展開後切り離
し、オルシノール・硫酸スプレー試薬による発色で検出
した。

【００２７】結果 Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰまたはＬ−トレオ−ＰＤＭＰを２
０μＭの濃度で、ＥＳ−２細胞を２日間処理し、または
ＥＳ−６細胞を１日間処理した際の細胞の形態学的変化
の顕微鏡写真を、それぞれ図１および図２に示した。Ｄ
−トレオ−ＰＤＭＰで処理した両細胞では明らかに接触
阻害（コンタクトインヒビション）の出現および細胞間
連絡の回復が起こり、正常上皮細胞様の形態に分化して
いることが判明した。一方、グルコシルセラミド生合成
酵素の阻害活性が無いＬ−トレオ−ＰＤＭＰで同様に処
理した場合には、分化誘導活性は認められず、Ｄ−トレ
オ−ＰＤＭＰ処理において観察された分化誘導現象は、
糖脂質の発現を抑制していることによると考えられた。

【００２８】このことを、ＥＳ−２細胞の糖脂質生合成
に及ぼすＤ−トレオ−ＰＤＭＰとＬ−トレオ−ＰＤＭＰ
の効果を解析することにより証明を試みた。図３に示す
ようにＤ−トレオ−ＰＤＭＰ処理では、固形腫瘍ＥＳ−
２に発現している全ての糖脂質、特に癌化した上皮細胞
において発現が増加（平成７年日本癌学会総会講演要旨
集、第１４５頁、演題３７９）しているＳＰＧ（シアリ
ルパラグロボシド）の発現を著しく抑制していることが
判明した。

【００２９】実施例２ ウサギショープ癌細胞株（Ｓｈｏｐｅ ｃａｒｃｉｏｍ
ａ）に対する影響 使用した細胞はＢ／Ｊ系のウサギ皮膚由来で、ワタオノ
ウサギパピローマウイルスにより癌化したウサギ偏平上
皮癌細胞株、二株である（Ｓｅｔｏ Ａ．ｅｔａｌ．，
Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９７，３２７−
３３１，１９９１）。すなわち、形態的に分化型で、Ｂ
／Ｊ系ウサギやヌードマウスに移植されても造腫瘍能を
示さないＳＣＢ−５ａと形態的に未分化型で、Ｂ／Ｊ系
ウサギやヌードマウスに移植されて造腫瘍能を示し、軟
寒天培地中でコロニー形性能を示すＳＣＢ−５ｅの二種
類である。これらの細胞は通常１０％胎児ウシ血清、１
００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌ
のペニシリンを含んだＲＰＭＩ１６４０を含む液体培地
（以下、培地Ａ）で、５％炭酸ガス、９５％空気存在
下、３７℃で培養された。Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰは少量
の無菌水に溶かされ、前述の培地に適宜加えられた。

【００３０】１）液体培地中でのＤ−トレオ−ＰＤＭＰ
の癌細胞の増殖、形態に対する影響 （方法）液体培地中でのＤ−トレオ−ＰＤＭＰの癌細胞
の増殖、形態に対する影響は、２４穴マイクロプレート
（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いて調べられた。ＳＣＢ−
５ｅの場合は、５×１０^４／ｍｌ／穴、ＳＣＢ−５ａの
場合は、１０×１０^４／ｍｌ／穴となるように各穴に蒔
かれた。培地は、各々Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰを含まない
もの（対照群）、１０μＭ，２０μＭ，３０μＭの終濃
度を含むものが各々用いられた。培地は２日ないし３日
ごとに、新たに調製されたものと交換された。観察は位
相差顕微鏡を用いて行われた。

【００３１】（結果）図４に増殖グラフを示す。ＳＣＢ
−５ｅは培養開始２４時間後より濃度依存性に増殖の抑
制が認められた。ＳＣＢ−５ａでは１０μＭ，２０μＭ
の範囲では培養３日目までは明らかな増殖抑制は見られ
なかったが、それ以降では増殖は抑制された。３０μＭ
では常に増殖は抑制された。ＳＣＢ−５ａの５日目の形
態変化を図５に示す。Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ非存在下で
は細胞は紡水形で小さく配列は不規則で接触阻害が見ら
れず、堆積化は顕著である（図５Ａ）。それに対してＤ
−トレオ−ＰＤＭＰ１０μＭ（図５Ｂ）、２０μＭ（図
５Ｃ）および３０μＭ（図５Ｄ）の存在下では細胞は大
きく、配列は規則的で接触阻害は濃度依存性に見られ、
堆積化もやはり濃度依存性に解消されている。こういっ
た形態への影響は、ＳＣＢ−５ｅでも観察された。

【００３２】２）軟寒天培地中でのコロニー形成能 軟寒天培地中でのコロニー形成能は、細胞の悪性度の一
つの指標である、造腫瘍能と相関することが知られてい
る（Ｈｏｓｏｉ，ｅｔ ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．
４６，５５８２−５５８６，１９８６）ので、ＳＣＢ−
５ｅ細胞を用いてこれに対する影響を見た。

【００３３】（方法）培地Ａに０．８％（ｗ／ｖ）とな
るようにアガロース（Ｓｅａｐｌａｑｕｅａｇａｒｏｓ
ｅ，ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を加え４５
℃に保温したものを３５ｍｍのプラスチックプレート
（Ｆａｌｃｏｎ社製）に１．５ｍｌ入れゲル化後、培地
Ａに０．６％（ｗ／ｖ）となるように前述のアガロース
を入れ、４５℃に保温したものへ、温度が下がりゲル化
する直前に４×１０^４の細胞を素早く均一に加えたもの
１．５ｍｌを重層した。ＰＤＭＰを入れる場合は各々終
濃度、１０，２０，３０μＭとなるように培地に加え
た。ゲル化後５％炭酸ガス、９５％空気存在下、３７℃
で一週間培養した。その後既報（Ｓｈａｅｆｆｅｒ，
Ｗ．Ｉ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１，２５９−２６
２，１９７６）に従い、２−（ｐ−ヨードフェニル）−
３−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリ
ウムクロリドを用いて生体染色をし、コロニーを可視化
し、その長径が５０μｍ以上のものをコロニーとしてカ
ウントした。

【００３４】（結果）図６に、Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ未
添加時のコロニー形成率を１００％としたとき、各濃度
のＰＤＭＰ添加時におけるコロニー形成率（％）を示
し、図７にコロニーの写真を示す（図７Ａ：Ｄ−トレオ
−ＰＤＭＰ無添加、図７Ｂ：１０μＭＤ−トレオ−ＰＤ
ＭＰ、図７Ｃ：２０μＭ Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ、図７
Ｄ：３０μＭ Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ）。図６、７より
明らかなように、コロニー形成率は濃度依存性に減少し
た。またコロニーの大きさも濃度依存性に減少し、２０
μＭ以上では図７の如く長径が５０μｍに達せず、コロ
ニーとしてカウントできないものが目立った。

【００３５】実施例３ マウスに移植したショープ癌細胞株の増殖に及ぼすＤ−
トレオ−ＰＤＭＰ前処理の効果 ＳＣＢ−５ｅ細胞を３０μＭのＤ−トレオ−ＰＤＭＰ存
在下または非存在下（コントロール）で３日間培養後、
１×１０^６個の細胞を６週令のヌードマウス（雄）の肩
部に皮下移植した。移植６週間後に摘出腫瘍重量を測定
した。

【００３６】（結果）コントロール群（ｎ＝１３）とＤ
−トレオ−ＰＤＭＰ前処理群（ｎ＝１０）の摘出平均腫
瘍重量（Ｔｕｍｏｒ Ｗｅｉｇｈｔ）は、それぞれ６９
２±８３ｍｇおよび５５５±７９ｍｇであり、Ｄ−トレ
オ−ＰＤＭＰ前処理群で減少していた（図８）。また、
ヌードマウスに移植後、両群において一週間以内に全て
のマウスに腫瘍が形成されたが、肉眼的に腫瘍形成が確
認できる日数はＤ−トレオ−ＰＤＭＰでは１〜２日遅か
った。これらの結果は、実施例１および２のｉｎ ｖｉ
ｔｒｏの実験系において確認されたＤ−トレオ−ＰＤＭ
Ｐの脱癌活性がｉｎ ｖｉｖｏにおいても有効性を示す
ことを強く示唆するものである。

【００３７】実施例４ ヒト正常二倍体胎児肺線維芽細胞株（ＭＲＣ−５）に対
するＤ−トレオ−ＰＤＭＰの細胞毒性を測定した。すな
わち、種々の濃度のＤ−トレオ−ＰＤＭＰを添加し、２
４時間後の細胞毒性をＭＴＴ法（Ｔ．Ｍｏｓｍａｎｎ，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，６
５，５５−６３，１９８３）により検討した結果、８０
μＭにおいても細胞毒性を示さないことを確認した。

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば一般式〔１〕に示した、
Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰに代表される２−アシルアミノプ
ロパノール誘導体を有効成分とする、未分化な状態で異
常な細胞増殖を呈することに基づく各種疾患に対する分
化誘導剤（細胞を正常な状態に戻す薬剤）を提供するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト食道癌細胞株ＥＳ−２の形態変化に及ぼす
Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ＰＤＭＰ）またはＬ−トレ
オ−ＰＤＭＰ（Ｌ−ＰＤＭＰ）の効果を表す顕微鏡写真
である。

【図２】ヒト食道癌細胞株ＥＳ−６の形態変化に及ぼす
Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ＰＤＭＰ）またはＬ−トレ
オ−ＰＤＭＰ（Ｌ−ＰＤＭＰ）の効果を表す顕微鏡写真
である。

【図３】ヒト食道癌細胞株ＥＳ−２のガングリオシド生
合成に及ぼすＤ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ＰＤＭＰ）ま
たはＬ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｌ−ＰＤＭＰ）の効果を表
す図面に代わる写真である。

【図４】ウサギショープ癌細胞株ＳＣＢ−５ｅおよびＳ
ＣＢ−５ａの増殖（細胞数）に及ぼすＤ−トレオ−ＰＤ
ＭＰの効果を表す図面である。

【図５】Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰのウサギショープ癌細胞
株ＳＣＢ−５ｅの形態変化（５日目）に及ぼす効果を示
す図面（Ａ：Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ非存在下、Ｂ：Ｄ−
トレオ−ＰＤＭＰ１０μＭ、Ｃ：２０μＭ，Ｄ：３０μ
Ｍ）である。

【図６】Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ未添加時のコロニー形成
率を１００％としたとき、各濃度のＤ−トレオ−ＰＤＭ
Ｐ添加時におけるコロニー形成率（％）を示す図面であ
る。

【図７】コロニーの写真（Ａ：Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ無
添加、Ｂ：１０μＭ Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ、Ｃ：２０
μＭ Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ、Ｄ：３０μＭ Ｄ−トレ
オ−ＰＤＭＰ）である。

【図８】マウスに移植したショープ癌細胞株の増殖に及
ぼすＤ−トレオ−ＰＤＭＰ前処理の効果を示す図面であ
る。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年３月２９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト食道癌細胞株ＥＳ−２の形態変化に及ぼす
Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ＰＤＭＰ）またはＬ−トレ
オ−ＰＤＭＰ（Ｌ−ＰＤＭＰ）の効果を表す顕微鏡写真
である。

【図２】ヒト食道癌細胞株ＥＳ−６の形態変化に及ぼす
Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ＰＤＭＰ）またはＬ−トレ
オ−ＰＤＭＰ（Ｌ−ＰＤＭＰ）の効果を表す顕微鏡写真
である。

【図３】ヒト食道癌細胞株ＥＳ−２のガングリオシド生
合成に及ぼすＤ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ＰＤＭＰ）ま
たはＬ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｌ−ＰＤＭＰ）の効果を表
すクロマトグラフである。

【図４】ウサギショープ癌細胞株ＳＣＢ−５ｅおよびＳ
ＣＢ−５ａの増殖（細胞数）に及ぼすＤ−トレオ−ＰＤ
ＭＰの効果を表す図面である。

【図５】Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰのウサギショープ癌細胞
株ＳＣＢ−５ｅの形態変化（５日目）に及ぼす効果を示
す顕微鏡写真（Ａ：Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ非存在下、
Ｂ：Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ１０μＭ、Ｃ：２０μＭ，
Ｄ：３０μＭ）である。

【図６】Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ未添加時のコロニー形成
率を１００％としたとき、各濃度のＤ−トレオ−ＰＤＭ
Ｐ添加時におけるコロニー形成率（％）を示す図面であ
る。

【図７】コロニーの顕微鏡写真（Ａ：Ｄ−トレオ−ＰＤ
ＭＰ無添加、Ｂ：１０μＭ Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ、
Ｃ：２０μＭ Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ、Ｄ：３０μＭ
Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ）である。

【図８】マウスに移植したショープ癌細胞株の増殖に及
ぼすＤ−トレオ−ＰＤＭＰ前処理の効果を示す図面であ
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤を
   有効成分とする分化誘導作用を有する薬剤。
2. 【請求項２】 グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤
   が、一般式〔１〕 【化１】 〔式中、Ｒ^１はアルキル、アルコキシ、ヒドロキシおよ
   びニトロからなる群から選ばれる同一または異なる１〜
   ３個の置換基で置換されていてもよいフェニル基を表
   し、ｎは２〜１６の整数を表す。〕で示される２−アシ
   ルアミノプロパノール誘導体または薬学的に許容される
   その塩である請求項１の薬剤。