JP6991569B2 - 長時間作用型アドレノメデュリン誘導体 - Google Patents
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Description
(1) 式(I):
A-CH2-B (I)
[式中、
Aは、1個以上のポリエチレングリコール基を含む修飾基であり、
Bは、アドレノメデュリン又はアドレノメデュリン活性を有するその修飾体から誘導されるペプチド部分であり、
但し、ペプチド部分Bは、そのN末端のαアミノ基の窒素原子がメチレン基の炭素原子と共有結合することによって残部分と連結されている。]
で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの水和物。
(2) Aが、以下の式(II):
aは、1以上の整数であり、
mは、1以上の整数であり、
L1は、m+1価の直鎖状又は分岐鎖状の連結基であり、但し、L1が複数の場合、該複数のL1は互いに同一又は異なっていてもよく、
L2及びL2’は、互いに独立して、結合又は2価の連結基であり、但し、L2’が複数の場合、該複数のL2’は互いに同一又は異なっていてもよく、
M1は、式(III):
#-(CH2CH2O)n-** (III)
[式中、
nは、1以上の整数であり、
**は、L1との結合位置であり、
#は、O又はL2’との結合位置である。]
で表されるポリエチレングリコール基であり、但し、M1が複数の場合、該複数のM1は互いに同一又は異なっていてもよく、
M2は、結合又は式(III)で表されるポリエチレングリコール基であり、但し、M2が複数の場合、該複数のM2は互いに同一又は異なっていてもよく、
R1は、水素、置換若しくは非置換のC1~C20アルキル、置換若しくは非置換のC2~C20アルケニル、置換若しくは非置換のC2~C20アルキニル、置換若しくは非置換のC3~C20シクロアルキル、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルケニル、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルキニル、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のC7~C20シクロアルキルアルキル、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキル-C1~C20アルキル、置換若しくは非置換のC4~C20アリール、置換若しくは非置換のC5~C20アリールアルキル、置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリール、置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリール-C1~C20アルキル、又は置換若しくは非置換のアシルであり、
*は、残部分との結合位置である。]
で表される修飾基である、前記実施形態(1)に記載の化合物。
(3) Aが、以下の式(V)、(VI)、(VII)又は(VIII):
aは、1以上の整数であり、
M3、M3’、M3’’、M3’’’及びM3’’’’は、互いに独立して、結合又は式(III):
#-(CH2CH2O)n-** (III)
[式中、
nは、1以上の整数であり、
**は、R3、R3’又はCHとの結合位置であり、
#は、Oとの結合位置である。]
で表されるポリエチレングリコール基であり、但し、M3、M3’、M3’’、M3’’’及びM3’’’’が複数の場合、該複数のM3、M3’、M3’’、M3’’’及びM3’’’’は互いに同一又は異なっていてもよく、且つM3、M3’、M3’’、M3’’’及びM3’’’’のうち少なくとも1個は式(III)で表されるポリエチレングリコール基であり、
R1、R1’、R1’’及びR1’’’は、互いに独立して、水素、置換若しくは非置換のC1~C20アルキル、置換若しくは非置換のC2~C20アルケニル、置換若しくは非置換のC2~C20アルキニル、置換若しくは非置換のC3~C20シクロアルキル、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルケニル、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルキニル、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のC7~C20シクロアルキルアルキル、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキル-C1~C20アルキル、置換若しくは非置換のC4~C20アリール、置換若しくは非置換のC5~C20アリールアルキル、置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリール、置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリール-C1~C20アルキル、又は置換若しくは非置換のアシルであり、
R2は、結合、置換若しくは非置換のC1~C20アルキレン、置換若しくは非置換のC2~C20アルケニレン、置換若しくは非置換のC2~C20アルキニレン、置換若しくは非置換のC3~C20シクロアルキレン、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルケニレン、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルキニレン、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換のC7~C20シクロアルキルアルキレン、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキル-C1~C20アルキレン、置換若しくは非置換のC4~C20アリーレン、置換若しくは非置換のC5~C20アリールアルキレン、置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリーレン、若しくは置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリール-C1~C20アルキレン(前記の基は、1個以上の複素原子、アミド基(-CO-NH-)、エステル基(-CO-O-)、又はウレタン基(-O-CO-NH-)を含んでもよい)、アミド基(-CO-NH-)、エステル基(-CO-O-)、又はウレタン基(-O-CO-NH-)であり、
R3、R3’及びR3’’は、互いに独立して、結合、置換若しくは非置換のC1~C20アルキレン、置換若しくは非置換のC2~C20アルケニレン、置換若しくは非置換のC2~C20アルキニレン、置換若しくは非置換のC3~C20シクロアルキレン、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルケニレン、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルキニレン、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換のC7~C20シクロアルキルアルキレン、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキル-C1~C20アルキレン、置換若しくは非置換のC4~C20アリーレン、置換若しくは非置換のC5~C20アリールアルキレン、置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリーレン、若しくは置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリール-C1~C20アルキレン(前記の基は、1個以上の複素原子、アミド基(-CO-NH-)、エステル基(-CO-O-)、又はウレタン基(-O-CO-NH-)を含んでもよい)、アミド基(-CO-NH-)、エステル基(-CO-O-)、又はウレタン基(-O-CO-NH-)であり、但し、R3、R3’及びR3’’が複数の場合、該複数のR3、R3’及びR3’’は互いに同一又は異なっていてもよく、
*は、残部分との結合位置である。]
で表される修飾基である、前記実施形態(1)又は(2)に記載の化合物。
(4) 式(III)で表されるポリエチレングリコール基が、合計で1~100 kDaの範囲の重量平均分子量を有する、前記実施形態(1)~(3)のいずれかに記載の化合物。
(5) 前記アドレノメデュリン又はアドレノメデュリン活性を有するその修飾体が、下記:
(i)アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなるペプチド、
(ii)アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなり、且つ該アミノ酸配列中の2個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しているペプチド、
(iii)(ii)のペプチドにおいて、前記ジスルフィド結合が、エチレン基によって置換されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド、
(iv)(i)~(iii)のいずれかのペプチドにおいて、1~15個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド、
(v)(i)~(iv)のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド、並びに
(vi)(i)~(iv)のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド
からなる群より選択されるペプチドである、前記実施形態(1)~(4)のいずれかに記載の化合物。
(6) 前記アドレノメデュリン又はその修飾体が、下記:
(i)アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなるペプチド、
(ii)アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなり、且つ該アミノ酸配列中の2個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しているペプチド、
(v)(i)又は(ii)のペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド、並びに
(vi)(i)又は(ii)ペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド
からなる群より選択されるペプチドである、前記実施形態(5)に記載の化合物。
(7) 前記アドレノメデュリン又はその修飾体が、下記:
(iv’)(i)~(iii)のいずれかのペプチドにおいて、N末端側から1~15位、1~10位又は1~5位のアミノ酸残基が欠失されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド、
(v)(iv’)のペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド、並びに
(vi)(iv’)のペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド
からなる群より選択されるペプチドである、前記実施形態(5)に記載の化合物。
(8) 前記アドレノメデュリン又はその修飾体が、下記:
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号1のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(b)配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号3のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(c)配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号5のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(d)配列番号7のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号7のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(e)配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号9のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(f)配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号11のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(g)(a)~(f)のいずれかのペプチドにおいて、前記ジスルフィド結合が、エチレン基によって置換されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド;
(h)(a)~(g)のいずれかのペプチドにおいて、1~15個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド;
(i)(a)~(h)のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド;並びに
(j)(a)~(h)のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド;
からなる群より選択されるペプチドである、前記実施形態(1)~(5)のいずれかに記載の化合物。
(9) 前記アドレノメデュリン又はその修飾体が、下記:
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号1のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(b)配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号3のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(c)配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号5のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(d)配列番号7のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号7のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(e)配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号9のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(f)配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号11のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(i)(a)~(f)のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド;並びに
(j)(a)~(f)のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド;
からなる群より選択されるペプチドである、前記実施形態(8)に記載の化合物。
(10) 前記アドレノメデュリン又はその修飾体が、下記:
(h’)(a)~(d)のいずれかのペプチドにおいて、N末端側から1~15位、1~10位又は1~5位のアミノ酸残基が欠失されており、且つアドレノメデュリン活性を有する、或いは、(e)又は(f)のペプチドにおいて、N末端側から1~13位、1~8位又は1~5位のアミノ酸残基が欠失されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド;
(i)(h’)のペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド;並びに
(j)(h’)のペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド;
からなる群より選択されるペプチドである、前記実施形態(8)に記載の化合物。
(11) アドレノメデュリン又はその修飾体から誘導されるペプチド部分Bの前駆体と、式(I-1):
A-CHO (I-1)
で表される1個以上のポリエチレングリコール基を含む修飾基Aの前駆体アルデヒドとを還元剤存在下で反応させて、式(I)で表される化合物を得る、連結工程を含む、前記実施形態(1)~(10)のいずれかに記載の化合物若しくはその塩、又はそれらの水和物の製造方法。
(12) 式(X):
A’-CO-B (X)
[式中、
A’は、1個以上のポリエチレングリコール基を含む修飾基であり、
Bは、アドレノメデュリン又はアドレノメデュリン活性を有するその修飾体から誘導されるペプチド部分であり、
但し、ペプチド部分Bは、そのN末端のαアミノ基の窒素原子がカルボニル基の炭素原子と共有結合することによって残部分と連結されており、
A’が、以下の式(XI)、(XI’)又は(XII):
R1-O-M1-* (XI)
aは、1以上の整数であり、
M1は、式(III):
#-(CH2CH2O)n-** (III)
[式中、
nは、1以上の整数であり、
**は、*との結合位置であり、
#は、Oとの結合位置である。]
で表されるポリエチレングリコール基であり、
M3、M3’及びM3’’は、互いに独立して、結合又は式(III):
#-(CH2CH2O)n-** (III)
[式中、
nは、1以上の整数であり、
**は、R3、R3’又はCHとの結合位置であり、
#は、Oとの結合位置である。]
で表されるポリエチレングリコール基であり、但し、M3、M3’及びM3’’が複数の場合、該複数のM3、M3’及びM3’’は互いに同一又は異なっていてもよく、且つM3、M3’及びM3’’のうち少なくとも1個は式(III)で表されるポリエチレングリコール基であり、
R1及びR1’は、互いに独立して、水素、置換若しくは非置換のC1~C20アルキル、置換若しくは非置換のC2~C20アルケニル、置換若しくは非置換のC2~C20アルキニル、置換若しくは非置換のC3~C20シクロアルキル、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルケニル、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルキニル、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のC7~C20シクロアルキルアルキル、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキル-C1~C20アルキル、置換若しくは非置換のC4~C20アリール、置換若しくは非置換のC5~C20アリールアルキル、置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリール、又は置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリール-C1~C20アルキル、又は置換若しくは非置換のアシルであり、
R2は、結合、置換若しくは非置換のC1~C20アルキレン、置換若しくは非置換のC2~C20アルケニレン、置換若しくは非置換のC2~C20アルキニレン、置換若しくは非置換のC3~C20シクロアルキレン、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルケニレン、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルキニレン、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換のC7~C20シクロアルキルアルキレン、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキル-C1~C20アルキレン、置換若しくは非置換のC4~C20アリーレン、置換若しくは非置換のC5~C20アリールアルキレン、置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリーレン、若しくは置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリール-C1~C20アルキレン(前記の基は、1個以上の複素原子、アミド基(-CO-NH-)、エステル基(-CO-O-)、又はウレタン基(-O-CO-NH-)を含んでもよい)、アミド基(-CO-NH-)、エステル基(-CO-O-)、又はウレタン基(-O-CO-NH-)であり、
R3、R3’及びR3’’は、互いに独立して、結合、置換若しくは非置換のC1~C20アルキレン、置換若しくは非置換のC2~C20アルケニレン、置換若しくは非置換のC2~C20アルキニレン、置換若しくは非置換のC3~C20シクロアルキレン、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルケニレン、置換若しくは非置換のC4~C20シクロアルキニレン、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換のC7~C20シクロアルキルアルキレン、置換若しくは非置換の3~6員のヘテロシクロアルキル-C1~C20アルキレン、置換若しくは非置換のC4~C20アリーレン、置換若しくは非置換のC5~C20アリールアルキレン、置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリーレン、若しくは置換若しくは非置換の5~15員のヘテロアリール-C1~C20アルキレン(前記の基は、1個以上の複素原子、アミド基(-CO-NH-)、エステル基(-CO-O-)、又はウレタン基(-O-CO-NH-)を含んでもよい)、アミド基(-CO-NH-)、エステル基(-CO-O-)、又はウレタン基(-O-CO-NH-)であり、但し、R3、R3’及びR3’’が複数の場合、該複数のR3、R3’及びR3’’は互いに同一又は異なっていてもよく、
*は、残部分との結合位置である。]
で表される修飾基である。]
で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの水和物。
(13) 前記実施形態(1)~(10)及び(12)のいずれかに記載の化合物若しくはその製薬上許容される塩、又はそれらの製薬上許容される水和物を有効成分として含有する医薬。
(14) 循環器疾患、炎症性疾患又は末梢血管疾患の予防又は治療に使用するための、前記実施形態(13)に記載の医薬。
(15)前記実施形態(1)~(10)及び(12)のいずれかに記載の化合物若しくはその製薬上許容される塩、又はそれらの製薬上許容される水和物を有効成分として含有する、循環器疾患、炎症性疾患又は末梢血管疾患の予防又は治療剤。
(16) 前記実施形態(1)~(10)及び(12)のいずれかに記載の化合物若しくはその製薬上許容される塩、又はそれらの製薬上許容される水和物と、1種以上の薬学的に許容し得る担体とを含有する医薬組成物。
(17) 循環器疾患、炎症性疾患又は末梢血管疾患の予防又は治療に使用するための、前記実施形態(16)に記載の医薬組成物。
(18) 症状、疾患及び/若しくは障害の予防又は治療を必要とする対象に、有効量の前記実施形態(1)~(10)及び(12)のいずれかに記載の化合物若しくはその製薬上許容される塩、又はそれらの製薬上許容される水和物を投与することを含む、前記症状、疾患及び/若しくは障害の予防又は治療方法。
(19) 前記症状、疾患及び/若しくは障害が、循環器疾患、炎症性疾患又は末梢血管疾患である、前記実施形態(18)に記載の方法。
(20) 症状、疾患及び/若しくは障害の予防又は治療に使用するための、前記実施形態(1)~(10)及び(12)のいずれかに記載の化合物若しくはその製薬上許容される塩、又はそれらの製薬上許容される水和物。
(21) 前記症状、疾患及び/若しくは障害が、循環器疾患、炎症性疾患又は末梢血管疾患である、前記実施形態(20)に記載の化合物。
(22) 症状、疾患及び/若しくは障害の予防又は治療に用いるための医薬の製造のための、前記実施形態(1)~(10)及び(12)のいずれかに記載の化合物若しくはその製薬上許容される塩、又はそれらの製薬上許容される水和物の使用。
(23) 前記症状、疾患及び/若しくは障害が、循環器疾患、炎症性疾患又は末梢血管疾患である、前記実施形態(22)に記載の使用。
本発明の一態様は、式(I):
A-CH2-B (I)
で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの水和物に関する。本明細書において、式(I)で表される化合物を、「アドレノメデュリン誘導体」と記載する場合がある。
(2)腎臓・水電解質系:利尿作用、ナトリウム利尿作用、抗利尿ホルモン抑制作用、アルドステロン低下作用、腎保護作用(例えば、高血圧又は虚血再灌流障害における腎保護作用)、飲水行動抑制作用、及び食塩要求抑制作用。
(3)脳・神経系:神経保護・脳障害抑制作用、抗炎症作用、アポトーシス抑制作用(例えば、虚血再灌流障害又は炎症におけるアポトーシス抑制作用)、自動調節能維持作用、酸化ストレス抑制作用、認知症改善作用、及び交感神経抑制作用。
(4)泌尿生殖器:勃起改善作用、血流改善作用、及び着床促進作用。
(5)消化器系:抗潰瘍作用、組織修復作用、粘膜新生作用、血流改善作用、抗炎症作用、及び肝機能改善作用。
(6)整形外科系:骨芽細胞刺激作用、及び関節炎改善作用。
(7)内分泌代謝系:脂肪細胞分化作用、脂肪分解制御作用、インスリン感受性改善作用、インスリン分泌制御作用、抗利尿ホルモン分泌抑制作用、及びアルドステロン分泌抑制作用。
(8)その他:循環改善作用、抗炎症作用、サイトカイン制御作用、臓器保護作用、酸化ストレス抑制作用、組織修復作用(例えば、抗褥瘡作用)、敗血症性ショックの改善作用、多臓器不全の抑制作用、自己免疫疾患の抑制作用、抗菌作用、育毛作用、及び養毛作用。
(i)アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなるペプチド、
(ii)アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなり、且つ該アミノ酸配列中の2個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しているペプチド、
(iii)(ii)のペプチドにおいて、前記ジスルフィド結合が、エチレン基によって置換されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド、
(iv)(i)~(iii)のいずれかのペプチドにおいて、1~15個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド、
(v)(i)~(iv)のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド、並びに
(vi)(i)~(iv)のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド
からなる群より選択されるペプチドであることが好ましい。
(i)アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなるペプチド、
(ii)アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなり、且つ該アミノ酸配列中の2個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しているペプチド、
(v)(i)又は(ii)のペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド、並びに
(vi)(i)又は(ii)ペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド
からなる群より選択されるペプチドであることがより好ましい。
(iv’)(i)~(iii)のいずれかのペプチドにおいて、N末端側から1~15位、1~10位又は1~5位のアミノ酸残基が欠失されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド、
(v)(iv’)のペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド、並びに
(vi)(iv’)のペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド
からなる群より選択されるペプチドであることがより好ましい。
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号1のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(b)配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号3のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(c)配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号5のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(d)配列番号7のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号7のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(e)配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号9のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(f)配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号11のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(g)(a)~(f)のいずれかのペプチドにおいて、前記ジスルフィド結合が、エチレン基によって置換されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド;
(h)(a)~(g)のいずれかのペプチドにおいて、1~15個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド;
(i)(a)~(h)のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド;並びに
(j)(a)~(h)のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド;
からなる群より選択されるペプチドであることがより好ましい。
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号1のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(b)配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号3のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(c)配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号5のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(d)配列番号7のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号7のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(e)配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号9のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(f)配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号11のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(i)(a)~(f)のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド;並びに
(j)(a)~(f)のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド;
からなる群より選択されるペプチドであることがさらに好ましい。
(h’)(a)~(d)のいずれかのペプチドにおいて、N末端側から1~15位、1~10位又は1~5位のアミノ酸残基が欠失されており、且つアドレノメデュリン活性を有する、或いは、(e)又は(f)のペプチドにおいて、N末端側から1~13位、1~8位又は1~5位のアミノ酸残基が欠失されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド;
(i)(h’)のペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド;並びに
(j)(h’)のペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド;
からなる群より選択されるペプチドであることがさらに好ましい。
aは、1以上の整数であり、
mは、1以上の整数であり、
L1は、m+1価の直鎖状又は分岐鎖状の連結基であり、但し、L1が複数の場合、該複数のL1は互いに同一又は異なっていてもよく、
L2及びL2’は、互いに独立して、結合又は2価の連結基であり、但し、L2’が複数の場合、該複数のL2’は互いに同一又は異なっていてもよく、
M1は、PEG基であり、但し、M1が複数の場合、該複数のM1は互いに同一又は異なっていてもよく、
M2は、結合又はPEG基であり、但し、M2が複数の場合、該複数のM2は互いに同一又は異なっていてもよく、
R1は、水素又は1価の基であり、
*は、残部分との結合位置である。
#-(CH2CH2O)n-** (III)
で表される基である。式(III)において、**は、L1との結合位置であり、#は、O又はL2’との結合位置である。式(III)で表されるPEG基の重量平均分子量は、修飾基Aにおける合計として、通常は1 kDa以上、好ましくは5 kDa以上、より好ましくは10 kDa以上、さらに好ましくは20 kDa以上であり、通常は2000 kDa以下、好ましくは1000 kDa以下、より好ましくは100 kDa以下、さらに好ましくは80 kDa以下であり、特に好ましくは60 kDa以下である。式(III)で表されるPEG基は、修飾基Aにおける合計として、通常は1~2000 kDaの範囲、例えば1~1000 kDaの範囲の重量平均分子量を有し、1~100 kDaの範囲の重量平均分子量を有することが好ましく、5~80 kDaの範囲の重量平均分子量を有することがより好ましく、10~60 kDaの範囲の重量平均分子量を有することがさらに好ましく、20~60 kDaの範囲の重量平均分子量を有することが特に好ましい。修飾基Aにおける式(III)で表されるPEG基の合計の重量平均分子量が前記範囲の場合、式(I)で表される化合物のアドレノメデュリン活性を、天然型アドレノメデュリンと実質的に略同等のものとすることができる。また、式(I)で表される化合物は、望ましくない副反応を実質的に抑制しつつ、生体内において、持続的にアドレノメデュリン活性を発現することができる。
aは、1以上の整数であり、
M3、M3’、M3’’、M3’’’及びM3’’’’は、互いに独立して、結合又はPEG基であり、但し、M3、M3’、M3’’、M3’’’及びM3’’’’が複数の場合、該複数のM3、M3’、M3’’、M3’’’及びM3’’’’は互いに同一又は異なっていてもよく、且つM3、M3’、M3’’、M3’’’及びM3’’’’のうち少なくとも1個はPEG基であり、
R1、R1’、R1’’及びR1’’’は、互いに独立して、水素又は1価の基であり、
R2は、結合又は2価の基であり、
R3、R3’及びR3’’は、互いに独立して、結合又は2価の基であり、但し、R3、R3’及びR3’’が複数の場合、該複数のR3、R3’及びR3’’は互いに同一又は異なっていてもよく、
*は、残部分との結合位置である。
nは、前記定義と同様の意味を有し、
n’は、nに関する前記定義と同様の意味を有し、
*は、残部分との結合位置である。]
で表される修飾基である。
Aが、式(V-1-1)、(VI-1-1)、(VII-1-1)、(VII-1-2)、(VII-2-1)、又は(VIII-1-1)で表される、PEG基を含む修飾基であり、
Bが、下記:
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号1のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(b)配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号3のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(c)配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号5のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(d)配列番号7のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号7のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(e)配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号9のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(f)配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号11のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(i)(a)~(f)のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド;並びに
(j)(a)~(f)のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド;
からなる群より選択されるペプチドであるか、或いは、
下記:
(h’)(a)~(d)のいずれかのペプチドにおいて、N末端側から1~15位、1~10位又は1~5位のアミノ酸残基が欠失されており、且つアドレノメデュリン活性を有する、或いは、(e)又は(f)のペプチドにおいて、N末端側から1~13位、1~8位又は1~5位のアミノ酸残基が欠失されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド;
(i)(h’)のペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド;並びに
(j)(h’)のペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド;
からなる群より選択されるペプチドである、アドレノメデュリン又はアドレノメデュリン活性を有するその修飾体から誘導されるペプチド部分である。前記特徴を有する式(I)で表される化合物は、天然型アドレノメデュリンの薬理作用を維持しつつ且つ望ましくない副反応を実質的に抑制して、生体内において、持続的にアドレノメデュリン活性を発現することができる。
A’-CO-B (X)
で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの水和物に関する。本明細書において、式(X)で表される化合物を、「ウレタン連結型アドレノメデュリン誘導体」と記載する場合がある。
CH3O-(CH2CH2O)n-* (XI-1-1)
nは、前記定義と同様の意味を有し、
n’は、nに関する前記定義と同様の意味を有し、
*は、残部分との結合位置である。]
で表される修飾基である。
A’が、式(XI-1-1)、(XII-1-1)又は(XII-2-1)で表される、PEG基を含む修飾基であり、
Bが、下記:
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号1のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(b)配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号3のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(c)配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号5のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(d)配列番号7のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号7のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(e)配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号9のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(f)配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号11のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(i)(a)~(f)のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド;並びに
(j)(a)~(f)のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド;
からなる群より選択されるペプチドであるか、或いは、
下記:
(h’)(a)~(d)のいずれかのペプチドにおいて、N末端側から1~15位、1~10位又は1~5位のアミノ酸残基が欠失されており、且つアドレノメデュリン活性を有する、或いは、(e)又は(f)のペプチドにおいて、N末端側から1~13位、1~8位又は1~5位のアミノ酸残基が欠失されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド;
(i)(h’)のペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド;並びに
(j)(h’)のペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド;
からなる群より選択されるペプチドである、アドレノメデュリン又はアドレノメデュリン活性を有するその修飾体から誘導されるペプチド部分である。前記特徴を有する式(X)で表される化合物は、公知のアドレノメデュリン誘導体と比較してより高いアドレノメデュリン活性を、生体内において持続的に発現することができる。
本発明の式(I)及び(X)で表される化合物は、生体内において、親分子であるアドレノメデュリンと実質的に略同等の生物活性(すなわちアドレノメデュリン活性)を、持続的に発現することができる。それ故、本発明は、本発明の式(I)及び(X)で表される化合物若しくはその製薬上許容される塩、又はそれらの製薬上許容される水和物を有効成分として含有する医薬に関する。
(2)腎臓・水電解質系疾患:腎不全、及び腎炎。
(3)脳・神経疾患:脳梗塞、認知症、及び脳炎。
(4)泌尿生殖器疾患:勃起不全(ED)。
(5)消化器疾患:炎症性腸疾患、潰瘍性疾患、腸管ベーチェット、及び肝不全。
(6)整形外科疾患:関節炎。
(7)内分泌代謝疾患:糖尿病及び糖尿病による臓器障害、並びに原発性アルドステロン症。
(8)その他:敗血症性ショック、自己免疫疾患、多臓器不全、褥瘡、創傷治癒、及び脱毛症。
本発明はまた、本発明の式(I)及び(X)で表される化合物の製造方法に関する。
本発明の方法は、アドレノメデュリン又はその修飾体から誘導されるペプチド部分Bの前駆体、1個以上のポリエチレングリコール基を含む修飾基A又はA’の前駆体の少なくともいずれかを準備する工程を含んでもよい。
A-CHO (I-1)
で表される1個以上のポリエチレングリコール基を含む修飾基Aの前駆体アルデヒドである。本工程において、前記の特徴を有する前駆体を準備することにより、以下で説明する連結工程における各前駆体の連結反応を実施して、式(I)で表される化合物を高収率で得ることができる。
A’-CO-O-C6H4-p-NO2 (X-1)
で表される1個以上のポリエチレングリコール基を含む修飾基A’の前駆体p-ニトロフェニル炭酸エステルである。或いは、修飾基A’の前駆体は、式(X-2):
A’-CO-O-C4H4NO2 (X-2)
で表される1個以上のポリエチレングリコール基を含む修飾基A’の前駆体N-ヒドロキシスクシンイミジル炭酸エステルであってもよい。本工程において、前記の特徴を有する前駆体を準備することにより、以下で説明する連結工程における各前駆体の連結反応を実施して、式(X)で表される化合物を高収率で得ることができる。
本発明の方法は、アドレノメデュリン又はその修飾体から誘導されるペプチド部分Bの前駆体と、修飾基A又はA’の前駆体とを連結させて、式(I)又は(X)で表される化合物を得る、連結工程を含むことが必要である。
〔実験I-1:全長アドレノメデュリン誘導体の合成〕
[実験I-1-1:CH3O-PEG(5k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM(1-52))(化合物(1))の合成]
公知文献(Kubo, Kら, “Biological properties of adrenomedullin conjugated with polyethylene glycol.”, Peptides, 2014年, 第57巻, p. 118-21)に記載の方法に基づき、N-ヒドロキシコハク酸イミド活性エステル型の5 kDaのCH3O-PEG化試薬(PEG-1)(CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)5-CO-O-NHS)を用いて、ヒトアドレノメデュリンの1~52アミノ酸残基(配列番号1)に対応するペプチドである、H-Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2のアミノ酸配列を有するペプチドのCys16-Cys21ジスルフィド架橋体(以下、「h.AM(1-52)」とも記載する)のN末端アミノ基に、アミド結合を介して5 kDaの重量平均分子量のポリエチレングリコール基(以下、「PEG(5k)」とも記載する)を連結して、アミド連結型PEG(5k)アドレノメデュリン誘導体(CH3O-PEG(5k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM(1-52)))(1)を合成した。
実験I-1-1と同様の方法に基づき、N-ヒドロキシコハク酸イミド活性エステル型の20 kDaのCH3O-PEG化試薬(PEG-1)(CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)5-CO-O-NHS)を用いて、h.AM(1-52)ペプチドのN末端アミノ基に、アミド結合を介して20 kDaの重量平均分子量のポリエチレングリコール基(以下、「PEG(20k)」とも記載する)を連結して、アミド連結型PEG(20k)アドレノメデュリン誘導体(CH3O-PEG(20k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM(1-52)))(2)を合成した。
2 mgのh.AM(1-52)ペプチドを、100 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH5.5に溶解して、2 mLのペプチド溶液を得た。このペプチド溶液に、氷冷下、16 mgのアルデヒド型の10 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-2)(CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)を添加した。さらに、このペプチド溶液に、NaCNBH3を20 mMの最終濃度となるように添加した。反応液を、4℃下、24時間放置した。得られた反応液を、50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0を用いて5倍希釈した。希釈された反応液を、50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0で平衡化されたSP-Sepharose HP (GEヘルスケア社) カラム(2 mL)に、2 mL/hrの流速で通液した。2 mLの50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0を用いてカラムを洗浄した。次いで、5 mLの1 M NaClを含有する50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH5.0をカラムに通液し、溶出画分を得た。溶出画分に、アルキルアミン連結型PEG(10k)アドレノメデュリン誘導体(CH3O-PEG(10k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM(1-52)))(3)、及び未反応のh.AM(1-52)ペプチドが回収された。この溶出画分を、限外濾過膜(アミコンUltra4, ミリポア社)を用いて0.2 mLに濃縮した。得られた濃縮液を、Superdex 200 HR 10/30 (GEヘルスケア社) カラムを接続した高速液体クロマトグラフィー(HPLC)システム (L-2000:日立ハイテクサイエンス社製) を用いて、精製及び分取した (溶出液:80 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH6 + 80 mM Na2SO4を含有する20% CH3CN、流速:0.5 mL/min)。前記分取HPLCにより、1.0 mg(h.AM(1-52)換算)の目的化合物(3)を得た。
1 mgのh.AM(1-52)ペプチドを、100 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH5.5に溶解して、1 mLのペプチド溶液を得た。このペプチド溶液に、氷冷下、32 mgのアルデヒド型の20 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-2)(CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)を添加した。さらに、このペプチド溶液に、NaCNBH3を20 mMの最終濃度となるように添加した。反応液を、4℃下、24時間放置した。得られた反応液を、50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0を用いて5倍希釈した。希釈された反応液を、50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0で平衡化されたSP-Sepharose HP (GEヘルスケア社) カラム(2mL)に、2 mL/hrの流速で通液した。2 mLの50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0を用いてカラムを洗浄した。次いで、5 mLの1 M NaClを含有する50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH5.0をカラムに通液し、溶出画分を得た。溶出画分に、アルキルアミン連結型PEG(20k)アドレノメデュリン誘導体(CH3O-PEG(20k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM(1-52)))(4)、及び未反応のh.AM(1-52)ペプチドが回収された。この溶出画分を、限外濾過膜(アミコンUltra4, ミリポア社)を用いて0.2 mLに濃縮した。得られた濃縮液を、Superdex 200 HR 10/30 (GEヘルスケア社) カラムを接続したHPLCシステム (L-2000:日立ハイテクサイエンス社製) を用いて、精製及び分取した (溶出液:80 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH6 + 80 mM Na2SO4を含有する20% CH3CN、流速:0.5 mL/min)。前記分取HPLCにより、0.3 mg(h.AM(1-52)換算)の目的化合物(4)を得た。
2 mgのh.AM(1-52)ペプチドを、100 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH5.5に溶解して、2 mLのペプチド溶液を得た。このペプチド溶液に、氷冷下、30 mgのアルデヒド型の30 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-2)(CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)を添加した。さらに、このペプチド溶液に、NaCNBH3を20 mMの最終濃度となるように添加した。反応液を、4℃下、24時間放置した。得られた反応液を、50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0を用いて5倍希釈した。希釈された反応液を、50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0で平衡化されたSP-Sepharose HP (GEヘルスケア社) カラム(2mL)に、2 mL/hrの流速で通液した。2 mLの50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0を用いてカラムを洗浄した。次いで、5 mLの1 M NaClを含有する50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH5.0をカラムに通液し、溶出画分を得た。溶出画分に、アルキルアミン連結型PEG(30k)アドレノメデュリン誘導体(CH3O-PEG(30k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM(1-52)))(5)、及び未反応のh.AM(1-52)ペプチドが回収された。この溶出画分を、限外濾過膜(アミコンUltra4, ミリポア社)を用いて0.2 mLに濃縮した。得られた濃縮液を、Superdex 200 HR 10/30 (GEヘルスケア社) カラムを接続したHPLCシステム (L-2000:日立ハイテクサイエンス社製) を用いて、精製及び分取した (溶出液:100 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH6 + 200 mM Na2SO4、流速:0.5 mL/min)。前記分取HPLCにより、0.8 mg(h.AM(1-52)換算)の目的化合物(5)を得た。
実験I-1-5において、CH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、45 mgの式(VII-1-1’):
実験I-1-5において、CH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、80 mgの式(VII-1-1’):
実験I-1-4において、CH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、40 mgの式(VII-1-1’):
実験I-1-5において、CH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、121 mgの式(VII-1-1’):
実験I-1-4において、CH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、42.9 mgの式(VI-1-1’):
実験I-1-3において、CH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、93 mgの式(VII-2-1’):
実験I-1-3において、CH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、94 mgの式(VIII-1-1’):
実験I-1-3において、CH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、94 mgの式(VII-1-2’):
Fmocペプチド合成法を用いて、Fmoc-Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2のアミノ酸配列を有するペプチドのCys16-Cys21ジスルフィド架橋体(以下、「Fmoc-αNH-(h.AM(1-52))」とも記載する)を委託合成した。18 mgのFmoc-αNH-(h.AM(1-52))ぺプチドを、1.8 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した。この溶液に、9 mgの炭酸 t-ブチルスクシンイミジル及び6 μLのジイソプロピルエチルアミンを加えた。反応溶液を、5時間撹拌した。得られた反応溶液に、酢酸水を加えた。その後、この溶液を凍結乾燥した。残渣を、2 mLのDMSOに溶解した。得られた溶液に、0.2 mLのジエチルアミンを加えた。得られた溶液を、70分間攪拌した。反応溶液に、酢酸水を加えて希釈した。得られた溶液を、逆相HPLCを用いて分取して、h.AM(1-52)ペプチドを含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、10 mgのh.AM(1-52)の4個のリジンがBoc基で保護されたペプチドを白色粉末として得た。
実験I-1-3において、アルデヒド型の10 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、5 mgのアルデヒド型の5 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-2)(CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)を用いた他は、前記と同様の手順により、アルキルアミン連結型PEG(5k)アドレノメデュリン誘導体(CH3O-PEG(5k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM(1-52)))(35)を得た。分取HPLCにより、0.8 mg(h.AM(1-52)換算)の目的化合物(35)を得た。
実験I-1-3において、アルデヒド型の10 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、40 mgのアルデヒド型の40 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-2)(CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)を用いた他は、前記と同様の手順により、アルキルアミン連結型PEG(40k)アドレノメデュリン誘導体(CH3O-PEG(40k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM(1-52)))(25)を得た。分取HPLCにより、0.6 mg(h.AM(1-52)換算)の目的化合物(25)を得た。
実験I-1-14において、p-ニトロフェニルエステル型の20 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-8)(CH3O-(CH2CH2O)n-CO-O-C6H4-p-NO2)に代えて、25 mgの式(XII-1-1’):
実験I-1-14において、p-ニトロフェニルエステル型の20 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-8)(CH3O-(CH2CH2O)n-CO-O-C6H4-p-NO2)に代えて、35 mgの式(XII-1-1’):
実験I-1-14において、p-ニトロフェニルエステル型の20 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-8)(CH3O-(CH2CH2O)n-CO-O-C6H4-p-NO2)に代えて、40 mgの式(XII-2-1’):
[実験I-2-1:切断ペプチドの質量分析によるPEG基の結合位置の同定(1)]
10 μgの化合物(3)を、70%ギ酸及び600 μgの臭化シアン(BrCN)と混合して合計500 μLにした。この混合物を、室温で一晩反応させた。Sep Pak(ウォーターズ社)カラムに、クロロホルム、メタノール、及び0.1%トリフルオロ酢酸を含有する60%アセトニトリル水溶液を各1 mLずつ順次通液して、カラムを洗浄した。その後、1 mLの超純水を通液して、Sep Pakカラムを平衡化した。一晩反応させた臭化シアン処理後の反応液(500 μL)に、4,500 μLの超純水を加えて5 mLの希釈反応液を得た。希釈反応液をカラムに通液して、切断ペプチドを吸着させた。次に、カラムに、超純水、及び0.1%トリフルオロ酢酸を含有する10%アセトニトリル水溶液を各1 mLずつ順次通液して、カラムを洗浄し、未吸着物質を除去した。最後に、カラムに、1 mLの0.1%トリフルオロ酢酸を含有する60%アセトニトリル水溶液を通液して、切断ペプチドをカラムから溶出した。
10~40 μgの化合物(2)を、2.5 mMエチレンジアミン四酢酸、30%N,N-ジメチルホルムアミド及び250 mM Tris-HCl(pH 8.5)を含む500 μLの溶液に溶解し、ボルテックスミキサー及び超音波処理によって攪拌及び混合した。混合物に2.5 mgの1,4-ジチオトレイトールを加えて、混合物がpH 8.0以上であることを確認した。混合物に窒素ガスを注入し、超音波処理を5分間行った。この混合物を、37℃で2時間反応させた。反応後、反応混合物に、遮光下で6.25 mgのモノヨード酢酸を加えて、25℃で30分間さらに反応させた。その後、反応混合物に、最終濃度が1 Nとなるように酢酸を加えて、反応を停止させた。Sep Pak(ウォーターズ社)カラムに、クロロホルム、メタノール、及び0.1%トリフルオロ酢酸を含有する60%アセトニトリル水溶液を各1 mLずつ順次通液して、カラムを洗浄した。その後、1 mLの1 N酢酸を通液して、Sep Pakカラムを平衡化した。還元アルキル化後の反応液をカラムに通液して、反応ペプチドを吸着させた。次に、カラムに、1N酢酸、及び0.1%トリフルオロ酢酸を含有する10%アセトニトリル水溶液を各1 mLずつ順次通液して、カラムを洗浄し、未吸着物質を除去した。最後に、カラムに、1 mLの0.1%トリフルオロ酢酸を含有する60%アセトニトリル水溶液を通液して、還元アルキル化ペプチドをカラムから溶出した。
化合物(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)及び(13)を、プロテインシーケンサー(Procise 494 HT Protein Sequencing System、アプライドバイオシステムズ社)を用いて、アミノ酸配列分析に供した。その結果、いずれの化合物ともヒトアドレノメデュリンのN末端アミノ酸残基に相当するアミノ酸は検出されなかった。前記結果から、化合物(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)及び(13)におけるPEG基は、いずれもN末端のαアミノ基に結合していることが確認された。
イオン交換カラム(CM-2SW、東ソー社)を用いたイオン交換HPLCにより、h.AM(1-52)ペプチドとヒトアドレノメデュリンの6~52アミノ酸残基に対応するペプチドとを分離した。イオン交換HPLCにおける溶出は、0~40分間に80%のA液(100 mM 酢酸ナトリウム, pH 5.0)、及び20%のB液(1 M 硫酸ナトリウムを含有する100 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0)から20%のA液及び80%のB液まで変化するリニアグラジエントプログラムで行った。
実験書(実験医学別冊「タンパク質実験ハンドブック」羊土社、竹縄忠臣、伊藤俊樹/編)に基づき、実験I-1で得られた化合物(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(25)、(26)、(27)、(28)及び(35)(各200 ng)を、10%~20%の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEによって分離した。結果を図2、3及び4に示す。図2中、レーン0は分子量標準物質を、レーン1は化合物(3)を、レーン2は化合物(4)を、レーン3は化合物(5)を、レーン4は化合物(6)を、レーン5は化合物(7)を、レーン6は化合物(8)を、レーン7は化合物(9)を、レーン8は化合物(10)を、レーン9は化合物(11)を、レーン10は化合物(12)を、それぞれ示す。図3中、レーン0は分子量標準物質を、レーン1は化合物(1)を、レーン2は化合物(2)を、レーン3は化合物(13)を、レーン4は化合物(14)を、レーン5は後述する化合物(15)を、レーン6は後述する化合物(16)を、レーン7は後述する化合物(17)を、それぞれ示す。図4中、レーン0は分子量標準物質を、レーン1は化合物(25)を、レーン2は化合物(26)を、レーン3は化合物(27)を、レーン4は化合物(28)を、レーン5は後述する化合物(29)を、レーン6は後述する化合物(30)を、レーン7は後述する化合物(31)を、レーン8は後述する化合物(32)を、レーン9は後述する化合物(33)を、レーン10は後述する化合物(34)を、レーン11は化合物(35)を、レーン12は後述する化合物(36)を、レーン13は後述する化合物(37)を、それぞれ示す。分子量標準物質は、いずれもPrecision Plus Protein(TM) Dual Xtra Standards(バイオラッド社)を用いた。図2、3及び4に示すように、各化合物は、所望の分子量を有することが確認された。
ゲル濾過カラム(Superdex 200 Increace 10/300 GL、GEヘルスケア社)を用いたゲル濾過HPLCにより、アドレノメデュリン誘導体分子の会合を確認した。実験I-1で得られた化合物(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(25)、(27)、(28)、及び(35)(各50 μg)を、カラムに添加した。溶出液(100 mM 酢酸ナトリウム及び100 mM 硫酸ナトリウム, pH 6.0)を、0.75 mL/分の流速でカラムに通液した。得られたゲル濾過クロマトグラムから、各化合物は、分子量に応じた保持時間を有する単一ピークを示した。前記結果から、各アドレノメデュリン誘導体分子は、会合しておらず、単量体として存在することが確認された。前記ゲル濾過クロマトグラムにおける各化合物の保持時間を、表1に示す。
〔実験II-1:N末端欠失アドレノメデュリン誘導体の合成〕
[実験II-1-1:CH3O-PEG(5k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM(6-52))(化合物(15))の合成]
公知文献(Kubo, Kら, “Biological properties of adrenomedullin conjugated with polyethylene glycol.”, Peptides, 2014年, 第57巻, p. 118-21)に記載の方法に基づき、N-ヒドロキシコハク酸イミド活性エステル型の5 kDaのCH3O-PEG化試薬(PEG-1)(CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)5-CO-O-NHS)を用いて、ヒトアドレノメデュリンの6~52アミノ酸残基に対応するペプチドである、H-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2のアミノ酸配列を有するペプチドのCys16-Cys21ジスルフィド架橋体(以下、「h.AM(6-52)」とも記載する)のN末端アミノ基に、アミド結合を介して5 kDaの重量平均分子量のポリエチレングリコール基(PEG(5k))を連結して、アミド連結型PEG(5k)アドレノメデュリン誘導体(CH3O-PEG(5k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM(6-52)))(15)を合成した。
0.22 mgのh.AM(11-52)ペプチドを、100 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH5.5に溶解して、0.2 mLのペプチド溶液を得た。このペプチド溶液に、氷冷下、4.6 mgのアルデヒド型の20 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-2)(CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)を添加した。さらに、このペプチド溶液に、NaCNBH3を20 mMの最終濃度となるように添加した。反応液を、4℃下、24時間放置した。得られた反応液を、50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0を用いて5倍希釈した。希釈された反応液を、50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0で平衡化されたSP-Sepharose HP (GEヘルスケア社) カラム(2 mL)に、2 mL/hrの流速で通液した。2 mLの50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0を用いてカラムを洗浄した。次いで、5 mLの1 M NaClを含有する50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH5.0をカラムに通液し、溶出画分を得た。溶出画分に、アルキルアミン連結型PEG(20k)アドレノメデュリン誘導体(CH3O-PEG(20k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM(11-52)))(22)、及び未反応のh.AM(11-52)ペプチドが回収された。この溶出画分を、限外濾過膜(アミコンUltra4, ミリポア社)を用いて0.2 mLに濃縮した。得られた濃縮液を、Tsk gel G2000SWxL (60 cm、東ソー社) カラムを接続したHPLCシステム (L-2000:日立ハイテクサイエンス社製) を用いて、精製及び分取した (溶出液:80 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH6 + 80 mM Na2SO4を含有する20% CH3CN、流速:0.5 mL/min)。前記分取HPLCにより、0.1 mg(h.AM(11-52)換算)の目的化合物(22)を得た。
0.22 mgのh.AM(16-52)ペプチドを、100 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH5.5に溶解して、0.2 mLのペプチド溶液を得た。このペプチド溶液に、氷冷下、5.2 mgのアルデヒド型の20 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-2)(CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)を添加した。さらに、このペプチド溶液に、NaCNBH3を20 mMの最終濃度となるように添加した。反応液を、4℃下、24時間放置した。得られた反応液を、50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0を用いて5倍希釈した。希釈された反応液を、50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0で平衡化されたSP-Sepharose HP (GEヘルスケア社) カラム(2 mL)に、2 mL/hrの流速で通液した。2 mLの50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.0を用いてカラムを洗浄した。次いで、5 mLの1 M NaClを含有する50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH5.0をカラムに通液し、溶出画分を得た。溶出画分に、アルキルアミン連結型PEG(20k)アドレノメデュリン誘導体(CH3O-PEG(20k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM(16-52)))(23)、及び未反応のh.AM(16-52)ペプチドが回収された。この溶出画分を、限外濾過膜(アミコンUltra4, ミリポア社)を用いて0.2 mLに濃縮した。得られた濃縮液を、Tsk gel G2000SWxL (60 cm、東ソー社) カラムを接続したHPLCシステム (L-2000:日立ハイテクサイエンス社製) を用いて、精製及び分取した (溶出液:80 mM 酢酸ナトリウム緩衝液, pH6 + 80 mM Na2SO4を含有する20% CH3CN、流速:0.5 mL/min)。前記分取HPLCにより、0.1 mg(h.AM(16-52)換算)の目的化合物(23)を得た。
実験II-1-6において、CH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、20 mgの式(VII-1-1’):
実験II-1-7において、CH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、20 mgの式(VII-1-1’):
Fmocペプチド合成法を用いて、Fmoc-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2のアミノ酸配列を有するペプチドのCys16-Cys21ジスルフィド架橋体(以下、「Fmoc-αNH-(h.AM(6-52))」とも記載する)を合成した。17 mgのFmoc-αNH-(h.AM(6-52))ぺプチドを、1.8 mLのDMSOに溶解した。この溶液に、9 mgの炭酸 t-ブチルスクシンイミジル及び6 μLのジイソプロピルエチルアミンを加えた。反応溶液を、5時間撹拌した。得られた反応溶液に、酢酸水を加えた。その後、この溶液を凍結乾燥した。残渣を、2 mLのDMSOに溶解した。得られた溶液に、0.2 mLのジエチルアミンを加えた。得られた溶液を、70分間攪拌した。反応溶液に、酢酸水を加えて希釈した。得られた溶液を、逆相HPLCを用いて分取して、h.AM(6-52)ペプチドを含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、9 mgのh.AM(6-52)の4個のリジンがBoc基で保護されたペプチドを白色粉末として得た。
Fmocペプチド合成法を用いて、Fmoc-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2のアミノ酸配列を有するペプチドのCys16-Cys21ジスルフィド架橋体(以下、「Fmoc-αNH-(h.AM(11-52))」とも記載する)を合成した。Fmoc-αNH-(h.AM(11-52))を用いて、実験II-1-12と同様の手順により、6 mgのh.AM(11-52)の4個のリジンがBoc基で保護されたペプチドを白色粉末として得た。
Fmocペプチド合成法を用いて、Fmoc-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2のアミノ酸配列を有するペプチドのCys16-Cys21ジスルフィド架橋体(以下、「Fmoc-αNH-(h.AM(16-52))」とも記載する)を合成した。Fmoc-αNH-(h.AM(16-52))を用いて、実験II-1-12と同様の手順により、6 mgのh.AM(16-52)の4個のリジンがBoc基で保護されたペプチドを白色粉末として得た。
実験II-1-14において、p-ニトロフェニルエステル型の20 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-9)に代えて、32 mgの式(XII-1-1’):
実験II-1-12において、p-ニトロフェニルエステル型の20 kDaの重量平均分子量のCH3O-PEG化試薬(PEG-9)に代えて、20 mgの式(XII-2-1’):
[実験II-2-1:切断ペプチドの質量分析によるPEG基の結合位置の同定]
実験I-2-2と同様の手順で、化合物(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)及び(34)のリシルエンドペプチダーゼによる切断ペプチドを得た。得られた切断ペプチドを、実験I-2-2と同様の手順で、RP-HPLCにより精製及び分取した。その結果、全ての化合物由来の切断ペプチドのRP-HPLCクロマトグラムで、図1に示すピーク(5)、(6)、(7)及び(8)に対応するピークが検出された。実験I-2-2の結果から、ピーク(1)及び(5)はh.AM(39-46)のペプチド断片に、ピーク(2)及び(6)はh.AM(47-52)のペプチド断片に、ピーク(3)及び(7)はh.AM(26-36)のペプチド断片に、ピーク(4)はh.AM(1-25)のペプチド断片に、ピーク(8)はh.AM(1-52)ペプチドのN末端側のペプチド断片にPEG基が結合した化合物に、それぞれ対応することが確認された。それ故、前記結果から、化合物(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)及び(34)におけるPEG基は、いずれもN末端のαアミノ基に結合していることが確認された。
化合物(18)、(21)、(22)、(23)、(24)、(31)、(33)及び(34)を、プロテインシーケンサー(Procise 494 HT Protein Sequencing System、アプライドバイオシステムズ社)を用いて、アミノ酸配列分析に供した。その結果、いずれの化合物ともヒトアドレノメデュリンのN末端アミノ酸残基に相当するアミノ酸は検出されなかった。前記結果から、化合物(18)、(21)、(22)、(23)、(24)、(31)、(33)及び(34)におけるPEG基は、いずれもN末端のαアミノ基に結合していることが確認された。
実験書(実験医学別冊「タンパク質実験ハンドブック」羊土社、竹縄忠臣,伊藤俊樹/編)に基づき、実験II-1で得られた化合物(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)及び(34)(各200 ng)を、10%~20%の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEによって分離した。結果を図3、4及び5に示す。図3中、レーン0は分子量標準物質を、レーン1は前述した化合物(1)を、レーン2は前述した化合物(2)を、レーン3は前述した化合物(13)を、レーン4は前述した化合物(14)を、レーン5は化合物(15)を、レーン6は化合物(16)を、レーン7は化合物(17)を、それぞれ示す。図4中、レーン0は分子量標準物質を、レーン1は前述した化合物(25)を、レーン2は前述した化合物(26)を、レーン3は前述した化合物(27)を、レーン4は前述した化合物(28)を、レーン5は化合物(29)を、レーン6は化合物(30)を、レーン7は化合物(31)を、レーン8は化合物(32)を、レーン9は化合物(33)を、レーン10は化合物(34)を、レーン11は前述した化合物(35)を、レーン12は後述する化合物(36)を、レーン13は後述する化合物(37)を、それぞれ示す。図5中、レーン0及び1は分子量標準物質を、レーン2は化合物(18)を、レーン3は化合物(19)を、レーン4は化合物(20)を、レーン5は化合物(21)を、レーン6は化合物(22)を、レーン7は化合物(23)を、レーン8は化合物(24)を、それぞれ示す。分子量標準物質は、いずれもPrecision Plus Protein(TM) Dual Xtra Standards(バイオラッド社)を用いた。図3、4及び5に示すように、各化合物は、所望の分子量を有することが確認された。
ゲル濾過カラム(Superdex 200 Increace 10/300 GL、GEヘルスケア社)を用いたゲル濾過HPLCにより、アドレノメデュリン誘導体分子の会合を確認した。実験II-1で得られた化合物(18)、(21)、(22)、(23)、(24)、(29)及び(34)(各50 μg)を、カラムに添加した。溶出液(100 mM 酢酸ナトリウム及び100 mM 硫酸ナトリウム, pH 6.0)を、0.75 mL/分の流速でカラムに通液した。得られたゲル濾過クロマトグラムから、各化合物は、分子量に応じた保持時間を有する単一ピークを示した。前記結果から、各アドレノメデュリン誘導体分子は、会合しておらず、単量体として存在することが確認された。前記ゲル濾過クロマトグラムにおける各化合物の保持時間を、表2に示す。
〔実験III-1:C末端グリシン付加アドレノメデュリン誘導体の合成〕
[実験III-1-1:GL-2分岐型CH3O-PEG(40k)-CH2-αNH-(h.AM(1-52))-Gly(化合物(36))の合成]
実験I-1-5において、h.AM(1-52)ペプチドをh.AM(1-52)-Glyペプチドに変更し、CH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、80 mgの式(VII-1-1’):
実験I-1-5において、h.AM(1-52)ペプチドをh.AM(1-52)-Glyペプチドに変更し、CH3O-PEG化試薬(PEG-2)に代えて、80 mgの式(VII-1-1’):
[実験III-2-1:アミノ酸配列分析によるPEG基の結合位置の同定]
化合物(36)及び(37)を、プロテインシーケンサー(Procise 494 HT Protein Sequencing System、アプライドバイオシステムズ社)を用いて、アミノ酸配列分析に供した。その結果、いずれの化合物ともヒトアドレノメデュリンのN末端アミノ酸残基に相当するアミノ酸は検出されなかった。前記結果から、化合物(36)及び(37)におけるPEG基は、いずれもN末端のαアミノ基に結合していることが確認された。
[実験IV-1:アドレノメデュリン誘導体による細胞内cAMP濃度上昇作用]
アドレノメデュリン(AM)の生理作用は、細胞内cAMPの濃度の上昇を介して発現することが知られている(非特許文献1参照)。そこで、AM受容体を発現させた培養細胞株(HEK293細胞株)に、実験I-1、実験II-1及び実験III-1で調製した各化合物又は全長AM、N末端欠失AM若しくはC末端グリシン付加AMを添加して、細胞内cAMPの産生量を測定した。コンフルエントのHEK293細胞に、0.5 mMのIBMXの存在下、10-8 mol/Lの各化合物、又はh.AM(1-52)、h.AM(6-52)、h.AM(11-52)、h.AM(16-52)若しくはh.AM(1-52)-Glyを添加して、15分間インキュベートした。その後、cAMP測定用ELISAキット(GEヘルスケアー、#RPN2251)を用いて、各試験区のHEK293細胞における細胞内cAMP濃度を測定した。AM受容体発現培養細胞におけるアドレノメデュリン誘導体による細胞内cAMP濃度上昇作用を表3に示す。
麻酔下ラットの静脈内に、実験I-1及び実験II-1で調製した各化合物又は全長AMを1 nmol/kgの用量で単回投与して、該ラットの血圧の経過を観察した。11~14週齢の雄性ウイスターラットを、イソフルランの吸入により麻酔導入した。気管切開の後、1.5~2.5%のイソフルラン濃度及び0.6~0.8 L/分の流量にて、吸入麻酔管理を行った。前記ラットから、右頸静脈を単離し、26G相当のカテーテルチューブを挿入した。次に、前記処置後のラットから、左頸動脈を単離し、23G相当のカテーテルチューブを挿入した。右頸静脈のカテーテルチューブより、生理食塩水ヘパリン溶液(生理食塩水:100 mL;ヘパリン:1000単位)を2.4 mL/時間で補液した。同じカテーテルチューブより、1 nmol/kgの化合物(2)、化合物(4)、化合物(8)又はh.AM(1-52)を、生理食塩水に溶解した形態で投与した。頸動脈に挿入したカテーテルを、圧トランスデューサーに接続した。化合物(2)、化合物(4)又はh.AM(1-52)の投与前の血圧と投与後の血圧とを、経時的に測定した。化合物(2)、化合物(4)、化合物(8)又はh.AM(1-52)の投与開始時からの経過時間と平均血圧との関係を図6に示す。Aは、化合物(2)、化合物(4)及びh.AM(1-52)の結果を、Bは、化合物(8)及びh.AM(1-52)の結果を、それぞれ示す。なお、図中、縦軸は、各薬剤投与時の平均血圧から、各薬剤投与前の平均血圧を差し引いた差を示す。
ラットの皮下に、実験I-1で調製した化合物(8)又は全長AMを10 nmol/kgの用量で単回投与して、アドレノメデュリン誘導体の血中濃度の経時変化を観察した。7~8週齢の雄性ウイスターラット(約250 g)に、生理食塩水に溶解した化合物(8)又はh.AM(1-52)を皮下投与した。投与開始時から1日後、7日後及び10日後に、50 mgのペントバルビタールを腹腔内投与して、麻酔下にて尾静脈より毎回300 μL採血した。得られた血液検体に、直ちに300 μgのEDTA-2Na、及び21 μgのアプロチニンを添加して、10分、3000回転の条件で遠心分離して血漿を得た。各検体の血漿中AM濃度を、ラジオイムノアッセイ(RIA)法(Kitamura K, Ichiki Y, Tanaka Mら, Immunoreactive adrenomedullin in human plasma. FEBS Lett. 第341巻, p. 288-90, 1994年)にて測定した。化合物(8)の投与開始時からの経過時間と血漿中AM濃度との関係を図7に示す。
麻酔下ラットの静脈内に、実験I-1で調製した化合物(6)又は全長AMを3 nmol/kgの用量で単回投与して、アドレノメデュリン誘導体の血中濃度の経時変化を観察した。8~9週齢の雄性ウイスターラット(約300 g)を、イソフルランの吸入により麻酔導入した。気管切開の後、1.5~2.5%のイソフルラン濃度及び0.6~0.8 L/分の流量にて、吸入麻酔管理を行った。前記ラットから、右頸静脈を単離し、26G相当のカテーテルチューブを挿入した。次に、前記処置後のラットから、左頸動脈を単離し、23G相当のカテーテルチューブを挿入した。右頸静脈のカテーテルチューブより、生理食塩水ヘパリン溶液(生理食塩水:100 mL;ヘパリン:1000単位)を2.4 mL/時間で補液した。同じカテーテルチューブより、3 nmol/kgの化合物(6)又はh.AM(1-52)を、生理食塩水に溶解した形態で投与した。頸動脈に挿入したカテーテルより、投与開始時から1時間後、2時間後及び4時間後に、300 μlの採血を経時的に行った。得られた血液検体に、直ちに300 μgのEDTA-2Na、及び21 μgのアプロチニンを添加して、10分、3000回転の条件で遠心分離して血漿を得た。各検体の血漿中AM濃度を、ラジオイムノアッセイ(RIA)法(Kitamura K, Ichiki Y, Tanaka Mら, Immunoreactive adrenomedullin in human plasma. FEBS Lett. 第341巻, p. 288-90, 1994年)にて測定した。化合物(6)又はh.AM(1-52)の投与開始時からの経過時間と血漿中AM濃度との関係を図8に示す。
高血圧自然発症ラット(SHR)の皮下に、実験I-1で調製した化合物(8)を336 μg/100 μLの用量で単回投与して、アドレノメデュリン誘導体の血圧上昇抑制効果を観察した。8週齢の雄性SHR(約200 g)に対し、高塩食(8% NaCl)を与えた。高塩食投与時に、化合物(8)を生理食塩水に溶解した形態で投与した。対照群として、同じ条件の雄性SHR (約200 g)に、100 μLの生理食塩水を皮下単回投与した。化合物(8)又は生理食塩水の投与2日前及び投与9日後の血圧及び脈拍を経時的に測定した。化合物(8)又は生理食塩水の投与2日前及び投与9日後の血圧値を図9に示す。
実験IV-3と同様の手順により、ラットの皮下に、実験I-1で調製した化合物(27)を10 nmol/kgの用量で単回投与して、アドレノメデュリン誘導体の血中濃度の経時変化を観察した。
ラットの皮下に、実験III-1で調製した化合物(37)を30 nmol/kgの用量で単回投与して、アドレノメデュリン誘導体の血中濃度の経時変化を観察した。7~8週齢の雄性ウイスターラット(約250 g)に、生理食塩水に溶解した化合物(37)を皮下投与した。投与開始時から1日後、2日後、4日後、7日後及び9日後に、50 mgのペントバルビタールを腹腔内投与して、麻酔下にて尾静脈より毎回300 μL採血した。得られた血液検体に、直ちに300 μgのEDTA-2Na、及び21 μgのアプロチニンを添加して、10分、3000回転の条件で遠心分離して血漿を得た。各検体の血漿中AM濃度を、RIA法にて測定した。
SHRの皮下に、実験III-1で調製した化合物(37)を30 nmol/kgの用量で単回投与して、アドレノメデュリン誘導体の血圧上昇抑制効果を観察した。8週齢の雄性SHR(約200 g)に、化合物(37)を生理食塩水に溶解した形態で投与した。対照群として、同じ条件の雄性SHR (約200 g)に、100 μLの生理食塩水を皮下単回投与した。化合物(37)又は生理食塩水の投与1日前並びに投与4日後及び投与9日後の血圧を経時的に測定した。化合物(37)又は生理食塩水の投与4日後及び投与9日後の、投与前日の平均収縮血圧に対する血圧変化値を図10に示す。
DSS誘発大腸炎モデルに対する化合物(8)の皮下投与による改善作用を検討した。化合物(8)を、マウスの背部に皮下投与した。投与翌日(0日目)に、3%DSSの7日間飲水投与により、大腸炎モデルの作製を開始した。化合物(8)の投与量は、1、5及び25 nmol/kgの3種類の用量とした。媒体の対照群として、生理食塩水を投与した。DSS飲水開始日(0日目)から3、5及び7日目に、体重及び便の性状を、表4に示すスコアに基づき評価した。化合物(8)投与群及び対照群におけるDSS誘発大腸炎モデル作製時からの経過時間とスコアの合計値との関係を図11に示す。
TNBS誘発大腸炎モデルに対する化合物(8)の皮下投与による改善作用を検討した。7週齢の雄性ウィスターラットを1週間馴化飼育した。その後、ラットに、化合物(8)(1 nmol/kg)又は生理食塩水を皮下投与した(0日目)。また、皮下投与と一緒に24時間絶食を行い、体内の糞便の除去を行った。下記の手順で、大腸炎モデルを作製した。TNBS(ナカライテスク社)は、30 mg/500μL(50%エタノール水溶液中)の濃度となるように調製した。50 mgのペントバルビタールを腹腔内投与して、麻酔下にてゾンデを用いて肛門からゆっくりと回転させながら8 cm挿入し、500 μLの薬液を注入した(1日目)。その後、2分間逆さまの状態を維持した。体重及び下痢の性状を毎日評価した。14日後、50 mgのペントバルビタールを腹腔内投与して、麻酔下にて心臓採血を行い、大腸を摘出した。摘出時に、腸管の長さ及び重量を測定して、各群の比較を行った。化合物(8)投与群及び対照群におけるTNBS誘発大腸炎モデル作製時からの経過時間と体重との関係を図12に示す。図中、aは、化合物(8)又は生理食塩水を皮下投与して絶食を開始した日を、bは、TNBSを投与した日を、それぞれ示す。化合物(8)投与群及び対照群における大腸の重量を図13に示す。化合物(8)投与群及び対照群における大腸の腸管長を図14に示す。
肺高血圧モデルに対する化合物(8)の皮下投与による改善作用を検討した。3週齢の雄性ウイスターラット(日本チャールス・リバー社)を購入し、1週間馴化飼育した。その後、ラットに、60 mg/kgの濃度でモノクロタリン溶液を皮下投与した。同時に、背部の別の位置に、化合物(8)(1 nmol/kg)又は生理食塩水を単回皮下投与した。肺高血圧モデルにおける効果の判定指標として、一般的な心臓の右室と左室との重量比を測定した。同モデルでは、病態が進むほど、右室の肥大に伴い、重量比が大きくなることが知られている(Miyauchi T.,Yorikane R.,Sakai S.,Sakurai T.,Okada m.,Nishikibe M.,Yano M.,Yamaguchi I.,Sugishita Y.and Goto k.: Contribution of endogenous endothelinl to the progression of cardiopulmonary alterations in rats with monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Circ. Res., 第73巻, pp. 887-897, 1993年)。投与14日後に、50 mgのペントバルビタールを腹腔内投与して、麻酔下にて下大静脈より採血した。その後、心臓を摘出して重量を測定した。摘出した心臓は、右室と左室とに分け、それぞれの重量を測定して右室重量/左室重量比を算出した。化合物(8)投与群及び対照群における右室重量/左室重量比を図15に示す。
創傷モデルに対する化合物(8)の皮下投与による薬理作用を検討した。5週齢の雄性BALB/c-nu/nuマウス(日本チャールス・リバー社)を購入し、1週間馴化飼育した。その後、マウスに、5 mgのペントバルビタールを腹腔内投与して麻酔した。消毒用エタノールを用い、皮膚を消毒した。マウスを側臥させた状態で、背部皮膚を指で引っ張り、消毒した製図用マットの上で、片側から反対側に向けて、皮膚バイオプシー用円形ナイフ(生検トレパン)で押し切るようにして、各直径6 mmの2個の欠損創を作製した。同時に、背部の別の位置に、化合物(8)(1 nmol/kg)を単回皮下投与した。媒体の対照群として、生理食塩水を投与した。創傷部位を含む背部を覆うようにドレッシング剤を塗布した。創傷面積の変化を、経時的に観察した。化合物(8)投与群及び対照群における創傷モデル作製時からの経過時間と創傷面積との関係を図16に示す。
モリスの水迷路試験を用いて、血管閉塞モデルラットにおける学習及び記憶障害に対する化合物(8)の皮下投与による薬理作用を検討した。椎骨動脈閉塞手術前に、化合物(8)を皮下投与した。化合物(8)の投与量は、1及び10 nmol/kgの2種類の用量とした。媒体の対照群として、生理食塩水を投与した。その後、麻酔下で両側椎骨動脈を永久閉塞した。翌日、縫合糸を用いて、麻酔下で両側総頸動脈を30分間閉塞した。その後、縫合糸を取り除き、血流を再開通した。両側総頸動脈閉塞日を、血管閉塞モデルの作製日、すなわち0日とした。モデル作製後9日目に、モリスの水迷路を1試行遊泳させた(水慣らし)。モデル作製後10日目より、4試行/日の間隔で5日間、隠されたプラットフォームテスト(hidden platform test)を行った。隠されたプラットフォームテストの5日目(モデル作製後14日目)の最終試行の1時間後に、プローブテスト(probe test)を行った。
アジュバント誘発関節炎モデルに対する化合物(8)の皮下投与による薬理作用を検討した。化合物(8)を、ラットに皮下投与した。化合物(8)の投与翌日(1日目)に、動物の右側後肢の皮下に、アジュバント(起炎剤)を0.1 mL/匹の投与量で投与して、関節炎を誘発させた。化合物(8)の投与量は、1及び10 nmol/kgの2種類の用量とした。媒体の対照群として、生理食塩水を投与した。足容積測定装置(MK-550、室町機械株式会社)を用いて、左右足の足容積及び浮腫率を、0日目(アジュバント投与前日)、4日目、7日目、10日目及び14日目に測定した。また、表5に示すスコアに基づき、0日目(アジュバント投与前日)、4日目、7日目、10日目及び14日目の炎症スコアを評価した。化合物(8)投与群及び対照群における投与時からの経過時間とアジュバント投与後に発現した足容積との関係を図19に示す。化合物(8)投与群及び対照群における投与時からの経過時間とアジュバント投与後に発現した浮腫率との関係を図20に示す。また、化合物(8)投与群及び対照群における投与時からの経過時間とアジュバント投与後に発現した炎症スコアとの関係を図21に示す。
Claims (8)
- 式(I):
A-CH2-B (I)
[式中、
Aは、以下の式(V-1-1)、(VI-1-1)、(VII-1-1)、(VII-1-2)、(VII-2-1)、又は(VIII-1-1):
[式中、
nは、1以上の整数であり、
n ' は、nに関する前記定義と同様の意味を有し、
*は、残部分との結合位置である。]
で表される、1個以上のポリエチレングリコール基を含む修飾基であり、
Bは、アドレノメデュリン又はアドレノメデュリン活性を有するその修飾体から誘導されるペプチド部分であり、
但し、ペプチド部分Bは、そのN末端のαアミノ基の窒素原子がメチレン基の炭素原子と共有結合することによって残部分と連結されており、
前記アドレノメデュリン又はアドレノメデュリン活性を有するその修飾体は、下記:
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号1のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(b)配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号3のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(c)配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号5のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(d)配列番号7のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号7のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(e)配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号9のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(f)配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号11のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(g)(a)~(f)のいずれかのペプチドにおいて、前記ジスルフィド結合が、エチレン基によって置換されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド;
(h)(a)~(g)のいずれかのペプチドにおいて、1~5個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド;
(i)(a)~(h)のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド;並びに
(j)(a)~(h)のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド;
からなる群より選択されるペプチドである。]
で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの水和物。 - -(CH2CH2O)n-基若しくは-(CH2CH2O)n '-基が、合計で1~100 kDaの範囲の重量平均分子量を有する、請求項1に記載の化合物若しくはその塩、又はそれらの水和物。
- 前記アドレノメデュリン又はアドレノメデュリン活性を有するその修飾体が、下記:
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号1のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(b)配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号3のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(c)配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号5のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(d)配列番号7のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号7のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(e)配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号9のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(f)配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号11のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド;
(i)(a)~(f)のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド;並びに
(j)(a)~(f)のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド;
からなる群より選択されるペプチドである、請求項1又は2に記載の化合物若しくはその塩、又はそれらの水和物。 - 前記アドレノメデュリン又はアドレノメデュリン活性を有するその修飾体が、下記:
(h')(a)~(d)のいずれかのペプチドにおいて、N末端側から1~5位のアミノ酸残基が欠失されており、且つアドレノメデュリン活性を有する、或いは、(e)又は(f)のペプチドにおいて、N末端側から1~5位のアミノ酸残基が欠失されており、且つアドレノメデュリン活性を有するペプチド;
(i)(h')のペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド;並びに
(j)(h')のペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド;
からなる群より選択されるペプチドである、請求項1又は2に記載の化合物若しくはその塩、又はそれらの水和物。 - アドレノメデュリン又はアドレノメデュリン活性を有するその修飾体から誘導されるペプチド部分Bの前駆体と、式(I-1):
A-CHO (I-1)
で表される1個以上のポリエチレングリコール基を含む修飾基Aの前駆体アルデヒドとを還元剤存在下で反応させて、式(I)で表される化合物を得る、連結工程を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の化合物若しくはその塩、又はそれらの水和物の製造方法。 - 請求項1~4のいずれか1項に記載の化合物若しくはその製薬上許容される塩、又はそれらの製薬上許容される水和物を有効成分として含有する医薬。
- 循環器疾患、炎症性疾患又は末梢血管疾患の予防又は治療に使用するための、請求項6に記載の医薬。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載の化合物若しくはその製薬上許容される塩、又はそれらの製薬上許容される水和物を有効成分として含有する、循環器疾患、炎症性疾患又は末梢血管疾患の予防又は治療剤。
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