KR102443831B1 - 장시간 작용형 아드레노메둘린 유도체 - Google Patents

장시간 작용형 아드레노메둘린 유도체 Download PDF

Info

Publication number
KR102443831B1
KR102443831B1 KR1020207025165A KR20207025165A KR102443831B1 KR 102443831 B1 KR102443831 B1 KR 102443831B1 KR 1020207025165 A KR1020207025165 A KR 1020207025165A KR 20207025165 A KR20207025165 A KR 20207025165A KR 102443831 B1 KR102443831 B1 KR 102443831B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
compound
group
amino acid
peg
Prior art date
Application number
KR1020207025165A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200105551A (ko
Inventor
카즈오 기타무라
모투 야마사키
Original Assignee
고쿠리츠 다이가쿠 호징 미야자키 다이가쿠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고쿠리츠 다이가쿠 호징 미야자키 다이가쿠 filed Critical 고쿠리츠 다이가쿠 호징 미야자키 다이가쿠
Publication of KR20200105551A publication Critical patent/KR20200105551A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102443831B1 publication Critical patent/KR102443831B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 아드레노메둘린의 약리 작용을 유지하면서 원치 않는 부작용을 실질적으로 억제할 수 있는, 장기간 지속적인 신규 아드레노메둘린 유도체를 제공한다. 하나의 예시적인 실시예로서, 본 발명은 식 (I)로 표시되는 화합물 또는 이의 염 또는 이의 수화물에 관한 것이다:
A-CH2-B (I)
[식에서,
A는 1 개 이상의 폴리에틸렌 글리콜기를 포함하는 기이며,
B는 아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 활성을 갖는 이의 변형된 형태에서 유래된 펩타이드 부분이며,
여기서, 펩타이드 부분 B는 N 말단의 α 아미노기의 질소 원자가 메틸렌기의 탄소 원자와 공유 결합해서 남은 부분과 연결된다.]

Description

장시간 작용형 아드레노메둘린 유도체{LONG-ACTING ADRENOMEDULLIN DERIVATIVE}
본 발명은 장시간 작용형 아드레노메둘린 유도체에 관한 것이다.
아드레노메둘린(adrenomedullin 다음 "AM"모두 기재한다)은 1993년에 갈색 세포종으로부터 분리 및 동정된 생리활성 펩타이드다(비특허문헌 1). 발견 당초, AM은 강력한 혈관 확장성 혈압 강하 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 특허문헌 1은 인간 AM의 아미노산 서열을 포함하는, 혈압 강하 작용을 갖는, 펩타이드를 개시한다.
후속 연구를 통해 AM은 심혈관 보호 작용, 항염증 작용, 혈관 신생 작용 및 조직 복구 촉진 작용 등의 다양한 약리 작용을 발휘하는 것으로 밝혀졌다. 또한 AM의 약리 작용을 질병 치료에 적용하는 것을 목표로, 다양한 질환 환자에 대한 AM의 투여 연구가 진행되어왔다. 특히, 염증성 장질환, 폐고혈압, 말초혈관 질환 또는 급성 심근경색 치료제로의 AM 유용성이 기대되고 있다.
예를 들어, 특허문헌 2는 비 세균성 염증 억제 활성을 갖는 아드레노메둘린 또는 그 유도체, 또는 비 세균성 염증 억제 활성을 갖는 이의 염을 유효성분으로 함유하는, 비 세균성 염증성 장질환의 예방 또는 치료제를 기재한다.
특허문헌 3은 스테로이드 제제, 면역 억제제 또는 생물학적 제제의 사용이 곤란하거나, 효과 불충분한 염증성 장질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에있어서, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료 방법이 기재되어 있고, 상기 방법은 유효량의 아드레노메둘린, 이의 변형 형태로서 염증 억제 활성을 갖는 것, 또는 상기 아드레노메둘린 또는 상기 변형 형태의 염이며 염증 억제 활성을 갖는 것을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료 방법을 기재한다.
또한, AM의 구조-활성 상관 관계 연구(SAR)에서, AM의 생리활성에 기여할 수 있는 필수 서열의 식별이 진행되었다(비특허문헌 2-9).
일반적으로 펩타이드는 생체 내(예를 들어 혈액)의 대사 반응에 기인하여 생체 내에서의 반감기가 짧은 것으로 알려져있다. 따라서, 펩타이드를 의약의 유효성분으로 사용하는 경우, 상기 펩타이드에 다른기를 연결한 펩타이드 유도체의 형태로함으로써 생체 내에서의 반감기를 연장하고, 약독항을 개선시킬 수 있다.
예를 들어, 특허문헌 4는 1.5 시간 이상의 혈청 반감기를 갖는 것을 특징으로하는 생리학적 활성 인터메딘 펩타이드 또는 아드레노메둘린 펩타이드를 기재한다. 해당 문헌은 알킬기 및 펩타이드 부분을 아미드 결합을 통해 연결하는 것을 기재한다.
특허문헌 5에는 AM의 TyR1의 페놀성 히드록시기를 통해 폴리에틸렌 글리콜(이하, "PEG"로 기재한다)기가 결합된 AM 유도체를 기재한다.
특허문헌 6은 PEG-알데히드와 펩타이드의 유리 아미노기를 반응시켜 펩타이드의 유리 아미노기에 PEG 기가 결합된 펩타이드 유도체 제조방법을 기재한다. 해당 문헌은 펩타이드로 AM을 기재한다.
비특허문헌 10은 AM의 N 말단의 α 아미노기에 PEG기를 아미드 결합을 통해 연결한 AM 유도체를 기재한다. 해당 문헌은 PEG기를 연결한 AM 유도체는 혈중 반감기가 연장된 것을 기재한다.
일본특허 제 2774769 호 공보 일본특허 제 4830093 호 공보 WO 2012/096411 WO 2012/138867 WO 2013/064508 US 2009/0252703
Kitamura K, Kangawa K, Kawamoto M, Ichiki Y, Nakamura S, Matsuo H, Eto T. Adrenomedullin: a novel hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma. Biochem Biophys Res Commun, April 30, 1993, 192 (2), pp. 553-560. Belloni, A. S. et al., Structure-activity relationships of adrenomedullin in the adrenal gland. Endocr Res, 1998, 24 (3-4), p. 729-30. Champion, H. C. et al., Catecholamine release mediates pressor effects of adrenomedullin- (15-22) in the rat. Hypertension, 1996, 28 (6), p. 1041-6. Champion, H. C., G. G. Nussdorfer, and P. J. Kadowitz, Structure-activity relationships of adrenomedullin in the circulation and adrenal gland. Regul Pept, 1999, 85 (1), p. 1-8. Eguchi, S. et al., Structure-activity relationship of adrenomedullin, a novel vasodilatory peptide, in cultured rat vascular smooth muscle cells. Endocrinology, 1994, 135 (6), p. 2454-8. J Med Chem, 2005, 48 (12), p. 4068-75. Graduate School of Science and Technology, Vol. Mitsuda, Y. et al., Large-scale production of functional human adrenomedullin: expression, cleavage, amidation, and purification. Protein Expr Purif, 2002, 25 (3), p. 448-55. Roldos, V. et al., Small-molecule negative modulators of adrenomedullin: design, synthesis, and 3D-QSAR study. ChemMedChem, 2008, 3 (9), p. 1345-55. Watanabe, T. X. et al., Vasopressor activities of N-terminal fragments of adrenomedullin in anesthetized rat. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 219 (1), p. 59-63. Kubo, K et al., Biological properties of adrenomedullin conjugated with polyethylene glycol. Peptides, 2014, 57, 118-21 Kato, J., Kitamura, K .. Bench-to-bedside pharmacology of adrenomedullin. European Journal of Pharmacology, 2015, 764, 140-148.
상기와 같이, 생체 내 지속 가능성의 향상 관점에서, AM의 약동학을 개선하기 위해, AM에 PEG 기와 같은 다른기를 연결한 AM 유도체가 알려져있다. 그러나 알려진 AM 유도체는 개선의 여지가 존재했다. 예를 들어, AM과 같은 비교적 작은 펩타이드에 PEG 기 같은 비교적 큰기를 연결하는 경우, PEG 기반의 분자량에 따라 결과 AM 유도체의 다양한 성질이 크게 변동할 가능성이 있다. 또한, 특허문헌 4 및 5, 및 비특허문헌 10에 기재된 바와 같이, 펩타이드 부분과 다른기가 아미드 결합 또는 에스테르 결합과 같은 생체 반응에 의해 절단될 수 있는 결합에 의해 연결되어 있는 경우, 투여 후 비교적 짧은 시간에 결합은 끊어질 수 있다. 또한, 특허문헌 5에 기재된 AM 유도체처럼 AM 아미노산 잔기의 측쇄에 다른 그룹을 연결하려는 경우, AM 부분의 입체 구조가 변화하여 AM을 인식하는 AM 수용체와의 친화력이 저하될 가능성이 있다. 이런 경우, 결과 AM 유도체는 AM으로서의 약리 작용이 저하될 가능성이 있다.
AM은 심혈관 보호 작용, 항염증 작용, 혈관 신생 작용 및 조직 복구 촉진 작용 등의 약리 작용뿐만 아니라, 강력한 혈관 확장 작용이 있다. 따라서, AM 또는 AM 유도체를 대상(피험자)에게 투여할 경우, 강력한 혈관 확장 작용에 기인하여 과도한 혈압 저하와 같은 바람직하지 않은 부작용을 일으킬 수 있다. 이러한 부작용의 발생은 특히 혈관 확장 작용 이외의 약리 작용을 발현하는 것을 기대하여 AM 또는 AM 유도체를 사용하는 경우, 문제가 될 수 있다.
따라서, 본 발명은 아드레노메둘린의 약리 작용을 유지하면서 원치않는 부작용을 실질적으로 억제할 수 있는, 장기간 지속적인 신규 아드레노메둘린 유도체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위한 수단을 다양하게 검토했다. 본 발명자들은 아드레노메둘린의 N 말단의 α 아미노기와 특정 분자량을 갖는 PEG 기를 메틸렌기 또는 우레탄기를 통해 연결함으로써 아드레노메둘린과 동일한 정도의 생리활성을 유지하면서 아드레노메둘린과 비교하여 혈중 반감기가 연장되는 것을 발견하였다. 또한, 상기 특징을 갖는 신규 아드레노메둘린 유도체는 과도한 혈압 저하와 같은 바람직하지 않은 부작용을 실질적으로 억제하고 있는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 상기 연구 결과에 따라 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 요지는 다음과 같다:
(1) 하기 식 (I)로 표시되는 화합물, 또는 이의 염, 또는 이의 수화물:
A-CH2-B (I)
(식에서,
A는 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜기를 포함하는 변형기(modifying group)이며,
B는 아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 활성을 갖는 이의 변형된 형태(modified form)로부터 유도된 펩타이드 부분이며,
여기서, 상기 펩타이드 부분 B는, 펩타이드 부분 B의 N 말단의 α 아미노기의 질소 원자와 메틸렌기의 탄소 원자가 공유 결합하여, 다른 부분과 연결된다).
(2) 상기 (1)에 따른 화합물이되, A가 하기 식 (II)로 표시되는 변형기이다:
Figure 112020091917216-pat00001
(식에서,
a는 1 이상의 정수이고,
m은 1 이상의 정수이고,
L1은 m + 1 가의 직쇄 또는 분지쇄 연결기이되, 여기서, 복수의 L1이 존재하는 경우, 상기 복수의 L1은 서로 동일하거나 상이할 수 있고,
L2 및 L2'는 서로 독립적으로, 결합 또는 2 가의 연결기이며, 여기서, 복수의 L2'가 존재하는 경우, 상기 복수의 L2'는 서로 동일하거나 상이할 수 있고,
M1은 하기 식 (III)으로 표시되는 폴리에틸렌 글로콜 기이고:
#-(CH2CH2O)n-**　(III)
(식 (III)에서,
n은 1 이상의 정수이고,
**는 L1과의 결합 위치이고,
#는 O 또는 L2'와의 결합 위치이다).
여기서, 복수의 M1가 존재하는 경우, 상기 복수의 M1은 서로 동일하거나 상이할 수 있고,
M2는 결합 또는 식 (III)로 표시되는 폴리에틸렌 글리콜 기이고, 여기서, 복수의 M2가 존재하는 경우, 상기 복수의 M2는 서로 동일하거나 상이할 수 있고,
R1은 수소, 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로 알킬, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알케닐, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알키닐, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로 알킬, 치환 또는 비치환된 C7-C20사이클로 알킬알킬, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로 알킬-C1-C20 알킬, 치환 또는 비치환된 C4-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴-C1-C20 알킬, 또는 치환 또는 비치환된 아실이고, 및
*는 다른 부분(moieties)과의 결합 위치이다).
(3) 상기 (1) 또는 (2)에 따른 화합물이되, A가 하기 식 (V), (VI), (VII), 또는 (VIII)로 표시되는 변형기이다:
Figure 112020091917216-pat00002
(식에서,
a는 1 이상의 정수이고,
M3, M3', M3'', M3''' 및 M3''''는 서로 독립적으로, 결합 또는 하기 식 (III )로 표시되는 폴리에틸렌 글리콜 기이고:
#-(CH2CH2O)n-** (III)
(식 (III)에서,
n은 1 이상의 정수이고,
**는 R3, R3' 또는 CH와의 결합 위치이고,
#은 O와의 결합 위치이다),
복수의 M3, M3', M3'', M3''' 또는 M3''''가 존재하는 경우, 상기 복수의 M3, M3', M3'', M3''' 또는 M3''''는 서로 동일하거나 상이할 수 있고, M3, M3', M3'', M3''' 및 M3'''' 중 적어도 하나는 상기 식 (III)로 표시되는 폴리에틸렌 글리콜 기이고,
R1, R1', R1'' 및 R1'''는 서로 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로 알킬, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알케닐, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알키닐, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로 알킬, 치환 또는 비치환된 C7-C20 사이클로 알킬알킬, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로 알킬-C1-C20 알킬, 치환 또는 비치환된 C4-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴-C1-C20 알킬, 또는 치환 또는 비치환된 아실이고,
R2는 결합, 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C7-C20 사이클로 알킬알킬렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로 사이클로알킬-C1-C20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 아릴렌, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴알킬렌, 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴렌, 또는 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴-C1-C20 알킬렌(상기 기는 선택적으로 하나 이상의 헤테로 원자, 아미드기(-CO-NH-), 에스테르기(-CO-O-), 또는 우레탄기(-O-CO-NH-)를 포함할 수 있다), 아미드기(-CO-NH-), 에스테르기(-CO-O-), 또는 우레탄기(-O-CO-NH-)이고,
R3, R3', 및 R3''은 서로 독립적으로, 결합, 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C7-C20 사이클로 알킬알킬렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로 사이클로알킬-C1-C20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 아릴렌, 치환 또는 비치환된 C5-C20아릴알킬렌, 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴렌, 또는 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴-C1-C20 알킬렌(상기 기는 선택적으로 하나 이상의 헤테로 원자, 아미드기(-CO-NH-), 에스테르기(-CO-O-) 또는 우레탄기(-O-CO-NH-)를 포함할 수 있다), 아미드기(-CO-NH-), 에스테르기(-CO-O-) 또는 우레탄기 (-O-CO-NH-)이고, 여기서, 복수의 R3, R3', 또는 R3''이 존재하는 경우, 상기 복수의 R3, R3', 또는 R3''는 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 및
*는 다른 부분(the other moieties)과의 결합 위치이다).
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 따른 화합물이되, 여기서 상기 식 (III)로 표시되는 폴리에틸렌 글리콜 기는 총 1-100 kDa 범위의 중량 평균 분자량을 갖는다.
(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 따른 화합물이되, 여기서 상기 아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 활성을 갖는 이의 변형된 형태(modified form)는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(i) 아드레노메둘린의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드,
(ii) 아드레노메둘린의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아미노산 서열 중 2개의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드,
(iii) (ii) 펩타이드에있어서, 상기 이황화 결합이 에틸렌기에 의해 치환되고, 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드,
(iv) (i)-(iii) 중 하나의 펩타이드에서, 1-15 개의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드,
(v) (i)-(iv) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 C 말단이 아미드화 된 펩타이드, 및
(vi) (i)-(iv) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 C 말단에 부가된 글리신 잔기를 가지는 펩타이드.
(6) 상기 (5)에 따른 화합물이되, 상기 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(i) 아드레노메둘린의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드,
(ii) 아드레노메둘린의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 상기 아미노산 서열 중 2개의 시스테인 잔기에 의해 형성된 디설파이드 결합을 가지는 펩타이드,
(v) (i) 또는 (ii)의 펩타이드에서, 이의 C 말단이 아미드화 된 펩타이드, 및
(vi) (i) 또는 (ii) 펩타이드에서, 이의 C 말단에 부가되는 글리신 잔기를 가지는 펩타이드.
(7) 상기 (5)에 따른 화합물이되, 상기 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(iv') (i)-(iii) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 N 말단에서 1-15 위치, 1-10 위치 또는 1-5 위치 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드,
(v) (iv')의 펩타이드에서, 이의 C 말단이 아미드화 된 펩타이드, 및
(vi) (iv')의 펩타이드에서, 이의 C 말단에 부가되는 글리신 잔기를 가지는 펩타이드.
(8) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 따른 화합물이되, 상기 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(a) 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위치의 시스테인 잔기와 21 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
(b) 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위치의 시스테인 잔기와 21 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
(c) 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위치의 시스테인 잔기와 21 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
(d) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위치의 시스테이 잔기와 21 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
(e) 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위치의 시스테인 잔기와 19 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
(f) 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위치의 시스테인 잔기와 19 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
(g) (a)-(f) 중 하나의 펩타이드에 있어서, 상기 이황화 결합이 에틸렌기에 의해 치환되고, 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드;
(h) (a)-(g) 중 하나 펩타이드에 있어서, 1-15 개의 아미노산 잔기의 결실, 치환 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드;
(i) (a)-(h) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 C 말단이 아미드화 된 펩타이드; 및
(j) (a)-(h) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 C 말단에 부가되는 글리신 잔기를 가지는 펩타이드.
(9) 상기 (8)에 따른 화합물이되, 상기 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(a) 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위치의 시스테인 잔기와 21 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
(b) 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위치의 시스테인 잔기와 21 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
(c) 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위치의 시스테인 잔기와 21 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
(d) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위치의 시스테이 잔기와 21 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
(e) 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위치의 시스테인 잔기와 19 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
(f) 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위치의 시스테인 잔기와 19 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
(i) (a)-(f) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 C 말단이 아미드화 된 펩타이드; 및
(j) (a)-(f) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 C 말단에 부가되는 글리신 잔기를 가지는 펩타이드.
(10) 상기 (8)에 따른 화합물이되, 상기 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(h') (a)-(d) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 N 말단에서 1-15 위치, 1-10 위치 또는 1-5 위치 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드, 또는 (e) 또는 (f)의 펩타이드에서, 이의 N 말단에서 1-13 위치, 1-8 위치 또는 1-5 위치 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드;
(i) (h')의 펩타이드에서, 이의 C 말단이 아미드화 된 펩타이드; 및
(j) (h')의 펩타이드에서, 이의 C 말단에 부가되는 글리신 잔기를 가지는 펩타이드.
(11) 환원제의 존재하에 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태로부터 유도되는 펩타이드 부분 B의 전구체를 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 변형기(modifying group) A의 전구체 알데히드(여기서, 상기 전구체 알데히드는 하기 식 (I-1)로 표시됨)와 반응시켜 식 (I)로 표시되는 화합물을 형성하는 연결 단계를 포함하는, 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 따른 화합물, 또는 이의 염, 또는 이의 수화물의 제조방법:
A-CHO (I-1).
(12) 하기 식 (X)로 표시되는 화합물, 또는 이의 염, 또는 이의 수화물:
A'-CO-B (X)
(식에서,
A'는 1 개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 변형기(modifying group)이고, 및
B는 아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 활성을 갖는 이의 변형된 형태로부터 유도된 펩타이드 부분이고,
여기서, 상기 펩타이드 부분 B는 이의 N 말단의 α-아미노기의 질소 원자가 카르보닐기의 탄소 원자와 공유 결합을 통해서 다른 부분(the other moieties)과 연결되어 있고,
A'는 하기의 식 (XI), (XI') 또는 (XII)에 의해 표시되는 변형기(modifying group)이고:
R1-O-M1-* (XI)
Figure 112020091917216-pat00003
(식에서,
a는 1 이상의 정수이고,
M1은 하기 식 (III)로 표시되는 폴리에틸렌 글리콜 기이고:
#-(CH2CH2O)n-**　(III)
(식에서,
n은 1 이상의 정수 이고,
**는 상기 *와의 결합 위치이고, 및
#은 O와의 결합 위치이고),
M3, M3', 및 M3''는 서로 독립적으로, 결합 또는 식 (III)로 표시되는 폴리에틸렌 글리콜 기이고:
#-(CH2CH2O)n-**　(III)
(식에서,
n은 1 이상의 정수이고,
**는 R3, R3', 또는 CH와의 결합 위치이고, 및
#은 O와의 결합 위치이고),
복수의 M3, M3', 또는 M3''이 존재하는 경우, 상기 복수의 M3, M3', 또는 M3''는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 또한 M3, M3', 및 M3'' 중 적어도 하나는 식 (III)로 표시되는 폴리에틸렌 글리콜 기이고,
R1 및 R1' 은 서로 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로 알킬, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알케닐, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알키닐, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로 알킬, 치환 또는 비치환된 C7-C20 사이클로 알킬알킬, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로 알킬-C1-C20 알킬, 치환 또는 비치환된 C4-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴-C1-C20 알킬, 또는 치환 또는 비치환된 아실이고,
R2는 결합, 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C7-C20 사이클로 알킬알킬렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로알킬-C1-C20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 아릴렌, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴알킬렌, 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴렌, 또는 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴-C1-C20 알킬렌(상기 기는 선택적으로 하나 이상의 헤테로 원자, 아미드기(-CO-NH-), 에스테르기(-CO-O-), 또는 우레탄기(-O-CO-NH-)를 포함할 수 있다), 아미드기(-CO-NH-), 에스테르기(-CO-O-), 또는 우레탄기(-O-CO-NH-)이고,
R3, R3', 및 R3''은 서로 독립적으로, 결합, 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C7-C20 사이클로 알킬알킬렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로 사이클로알킬-C1-C20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 아릴렌, 치환 또는 비치환된 C5-C20아릴알킬렌, 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴렌, 또는 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴-C1-C20 알킬렌(상기 기는 선택적으로 하나 이상의 헤테로 원자, 아미드기(-CO-NH-), 에스테르기(-CO-O-) 또는 우레탄기(-O-CO-NH-)를 포함할 수 있다), 아미드기(-CO-NH-), 에스테르기(-CO-O-) 또는 우레탄기 (-O-CO-NH-)이고, 여기서, 복수의 R3, R3', 또는 R3''이 존재하는 경우, 상기 복수의 R3, R3', 또는 R3''는 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 및
*는 다른 부분(the other moieties)과의 결합 위치이다).
(13) 상기 실시예 (1)-(10) 및 (12)의 어느 하나에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 수화물을 유효성분으로 함유하는 의약.
(14) 심혈관 질환(cardiovascular disease), 염증성 질환(inflammatory disease), 또는 말초 혈관 질환(peripheral vascular disease)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 실시예 (13)에 따른 의약.
(15) 상기 실시예 (1)-(10) 및 (12)의 어느 하나에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 수화물을 유효성분으로 함유하는 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 말초 혈관 질환의 예방 또는 치료용 약제.
(16) 상기 실시예 (1)-(10) 및 (12)의 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 수화물, 및 1 종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학적 조성물.
(17) 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 말초 혈관 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 실시예 (16)에 따른 약학적 조성물.
(18) 증상, 질환 및/또는 장애의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상으로 유효량의 상기 실시예 (1)-(10) 및 (12)의 어느 하나에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 수화물을 투여하는 단계를 포함하는, 증상, 질환 및/또는 장애의 예방 또는 치료 방법.
(19) 상기 증상, 질환 및/또는 장애가 순환기 질환, 염증성 질환 또는 말초 혈관 질환인, 상기 실시예 (18)에 따른 방법.
(20) 증상, 질환 및/또는 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 실시예 (1)-(10) 및 (12)의 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 수화물.
(21) 상기 증상, 질환 및/또는 장애는 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 말초 혈관 질환인, 상기 실시예 (20)에 따른 화합물.
(22) 증상, 질환 및/또는 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 상기 실시예 (1)-(10) 및 (12)의 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 수화물의 용도.
(23) 상기 증상, 질환 및/또는 장애는 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 말초 혈관 질환인, 상기 실시예 (22)에 기재된 용도.
본 발명은, 아드레노메둘린의 약리 작용을 유지하면서 원치 않는 부작용을 실질적으로 억제할 수 있는 장기간 지속가능한 신규 아드레노메둘린 유도체를 제공할 수 있다.
[도 1] 도 1은 절단 펩타이드의 역상 HPLC(RP-HPLC) 크로마토그램을 나타낸 도면이다. A: h.AM (1-52) 펩타이드 유래의 절단 펩타이드의 RP-HPLC 크로마토그램; B: 화합물 (2) 유래의 절단 펩타이드의 RP-HPLC 크로마토그램.
[도 2] 도 2는 10%-20%의 농도 구배를 갖는 폴리아크릴아마이드 겔을 이용한 SDS-PAGE에 의한 분리 화합물 (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11) 및 (12)의 결과를 나타내는 도면이다. 도면에서 레인 0은 분자량 표준 물질을, 레인 1은 화합물 (3)을, 레인 2는 화합물 (4)를, 레인 3은 화합물 (5)를, 레인 4는 화합물 (6)을, 레인 5는 화합물 (7)을, 레인 6은 화합물 (8)을, 레인 7은 화합물 (9)를, 레인 8은 화합물 (10)을, 레인 9는 화합물 (11)을, 레인 10은 화합물 (12)를 나타낸다.
[도 3] 도 3은 10%-20%의 농도 구배를 갖는 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 SDS-PAGE에 의한 분리 화합물 (1), (2), (13), (14), (15), (16) 및 (17)의 결과를 나타내는 도면이다. 도면에서 레인 0은 분자량 표준 물질을 레인 1은 화합물 (1)을, 레인 2는 화합물 (2)을, 레인 3은 화합물 (13)을, 레인 4는 화합물 (14)을, 레인 5는 화합물 (15)을, 레인 6은 화합물 (16)을, 레인 7은 화합물 (17)을 나타낸다.
[도 4]도 4는 10%-20%의 농도 구배를 갖는 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 SDS-PAGE에 의한 분리 화합물 (25), (26), (27), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35), (36) 및 (37)의 결과를 나타내는 도면이다. 도면에서 레인 0은 분자량 표준 물질을 레인 1은 화합물 (25)을, 레인 2는 화합물 (26)을, 레인 3은 화합물 (27)을, 레인 4는 화합물 (28)을, 레인 5는 화합물 (29)을, 레인 6은 화합물 (30)을, 레인 7은 화합물 (31)을, 레인 8은 화합물 (32)을, 레인 9는 화합물 (33)을, 레인 10은 화합물 (34)을 레인 11은 화합물 (35)을, 레인 12은 화합물 (36)을, 레인 13은 화합물 (37)을 나타낸다.
[도 5] 도 5는 10%-20%의 농도 구배를 갖는 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 SDS-PAGE에 의한 분리 화합물 (18), (19), (20), (21), (22), (23) 및 (24)의 결과를 나타내는 도면이다. 도면에서 레인 0과 1은 분자량 표준 물질을 레인 2는 화합물 (18)을, 레인 3은 화합물 (19)을, 레인 4는 화합물 (20)을, 레인 5는 화합물 (21)을, 레인 6은 화합물 (22)을, 레인 7은 화합물 (23)을, 레인 8은 화합물 (24)을 나타낸다.
[도 6] 도 6은 화합물 (2), 화합물 (4), 화합물 (8) 또는 h.AM (1-52)의 투여 시작 후 경과 시간과 평균 혈압과의 관계를 나타내는 도이다. A: 화합물 (2), 화합물 (4) 및 h.AM (1-52)의 결과; B: 화합물 (8) 및 h.AM (1-52)의 결과.
[도 7] 도 7은 화합물 (8)의 투여 시작 후 경과 시간과 혈장 AM 농도와의 관계를 나타내는 도면이다.
[도 8] 도 8은 화합물 (6) 또는 h.AM (1-52)의 투여 시작 후 경과 시간과 혈장 AM 농도와의 관계를 나타내는 도면이다.
[도 9] 도 9는 화합물 (8) 또는 생리 식염수 투여 2 일 전 및 투여 9 일 후 고혈압 자연 발병 쥐의 혈압을 나타내는 도면이다.
[도 10] 도 10은 투여 전날의 평균 수축 혈압에 대한 화합물 (37) 또는 생리 식염수 투여 4 일 후 및 투여 9 일 후의 혈압 변화 값을 나타내는 도면이다.
[도 11] 도 11은 화합물 (8) 투여군과 대조군의 덱스트란 황산 나트륨(DSS) 유발 대장염 모델 제작시부터의 경과 시간과 점수의 합계와의 관계를 나타내는 도면이다.
[도 12] 도 12는 화합물 (8) 투여군과 대조군의 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산(TNBS)-유발 대장염 모델 제작시부터의 경과 시간과 체중과의 관계를 나타낸다. a: 화합물 (8) 또는 생리 식염수를 피하 주사하고 단식을 개시한 날; b: TNBS를 투여한 날.
[도 13] 도 13은 화합물 (8) 투여군과 대조군의 대장의 무게를 나타내는 도면이다.
[도 14] 도 14는 화합물 (8) 투여군과 대조군의 대장의 창자 길이를 나타내는 도면이다.
[도 15] 도 15는 화합물 (8) 투여군과 대조군의 우심실 중량 / 좌심실 중량 비율을 나타내는 도면이다.
[도 16] 도 16은 화합물 (8) 투여군과 대조군의 상처 모델 제작시부터의 경과 시간과 상처 면적과의 관계를 나타내는 도면이다.
[도 17] 도 17은 화합물 (8) 투여군과 대조군의 히든 플랫폼 테스트에서 혈관 폐색 모델 제작시부터의 경과 시간과 탈출 대기 시간의 관계를 나타내는 도면이다.
[도 18] 도 18은 혈관 폐색 모델 쥐에 대한 화합물 (8) 투여군과 대조군의 프로브 테스트에서 체류율을 나타내는 도면이다.
[도 19] 도 19는 화합물 (8) 투여군 및 대조군에서 보조제 투여 후에 나타나는 발의 체적과 화합물 (8) 또는 비히클의 투여시부터의 경과 시간 사이의 관계를 나타내는 도면이다.
[도 20] 도 20은 화합물 (8) 투여군 및 대조군에서 보조제 투여 후에 나타나는 부종율과 화합물 (8) 또는 비히클의 투여시부터의 경과 시간 사이의 관계를 나타내는 도면이다.
[도 21] 도 21은 화합물 (8) 투여군 및 대조군에서 보조제 투여 후에 나타나는 염증 점수와 화합물 (8) 또는 비히클의 투여시부터의 경과 시간 사이의 관계를 나타내는 도면이다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제 2015-184685호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함하고 있다.
<1. 아드레노메둘린 유도체>
본 발명의 일 측면은 식 (I)로 표시되는 화합물, 이의 염, 이의 수화물에 관한 것이다:
A-CH2-B (I)
본 명세서에서, 상기 식 (I)로 표시되는 화합물을 "아드레노메둘린 유도체"로 설명될 수 있다.
본 발명에서 아드레노메둘린(AM)은 인간 갈색 세포종으로부터 분리 및 동정된 인간 유래의 펩타이드 (서열 번호 1, 비특허문헌 1)뿐만 아니라, 예를 들면 돼지 (서열 번호 3), 개 (서열 번호 5), 소 (서열 번호 7), 쥐 (서열 번호 9) 또는 마우스 (서열 번호 11)를 포함하는, 오쏘로그(ortholog)인, 다른 비 인간 포유동물(예를들어 온혈 동물) 유래의 펩타이드일 수 있다. 생체 내에서 이러한 각 펩타이드는 아미노산 서열 중 2 개의 시스테인 잔기에 의해 형성된 디설파이드 결합을 가지며, 또한 상기 펩타이드의 C 말단이 아미드화 되어있다. 본 명세서에서, 이황화 결합과 C 말단 아미드기를 갖는 상기 펩타이드는 "천연 아드레노메둘린" 또는 단순히 "아드레노메둘린"으로 설명될 수 있다. 본 발명은 상기 설명되는 임의의 펩타이드에 적용될 수 있다.
본 명세서에서 "C 말단 아미드화"는 생체 내에서 펩타이드의 번역 후 수식의 한 형태를 의미하며, 구체적으로는 펩타이드의 C 말단 아미노산 잔기의 주쇄 카르복실기가 아미드기의 형태로 변환되는 반응을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 "시스테인 잔기의 이황화 결합의 형성" 또는 "시스테인 잔기의 이황화 화"는 생체 내에서 펩타이드의 번역 후 수식의 한 형태를 의미하며, 구체적으로는 펩타이드 아미노산 서열 중 2 개의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합(-SS-)을 형성하는 반응을 의미한다. 생체 내에서 생산되는 많은 생리 활성 펩타이드는 개시적으로 더 큰 분자량의 전구체 단백질로서 생합성된다. 상기 전구체 단백질은 세포 내 이행 과정에서 C 말단 아미드화 및/또는 시스테인 잔기의 이황화 화 같은 번역 후 수식 반응을 받고, 성숙한 생리 활성 펩타이드가 된다. 상기 C 말단 아미드화는 일반적으로 전구체 단백질에 대해 C 말단 아미드화 효소가 작용하여 진행한다. C 말단 아미드기를 갖는 생리 활성 펩타이드의 경우, 그 전구체 단백질에서는 아미드화 된 C 말단 카르복실기에 Gly 잔기가 결합하고, 상기 Gly 잔기가 C 말단 아미드 화 효소에 의해 C 말단 아미드기로 변환된다. 또한 전구체 단백질의 C 말단 프로펩타이드, 예를 들어 Lys-Arg 또는 Arg-Arg 등의 염기성 아미노산 잔기의 조합을 포함하는 반복 서열을 가진다(Mizuno, Journal of Japanese Biochemical Society, 61(12): 1435-1461 (1989)). 시스테인 잔기에 의한 이황화 결합의 형성은 산화 조건에서 진행할 수 있다. 생체 내에서 시스테인 잔기의 이황화 화는 일반적으로 전구체 단백질에 단백질 이황화 이성질화효소(isomerase)에 의해 진행한다.
공지된 생리 활성 물질인, 아드레노메둘린은 펩타이드이다. 따라서 아드레노메둘린을 유효 성분으로 함유하는 의약은 대상(예를 들어 인간 환자)의 생체 내에서 유효하게 작용할 수 있는 시간이 극히 짧은 시간이 될 가능성이 있다. 이에, 아드레노메둘린에 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 다른기를 연결한 아드레노메둘린 유도체를 형태로함으로써 생체 내에서의 반감기를 연장하여 약물 동태를 개선하는 시도가 이루어져 왔다(특허문헌 4-6 및 비특허문헌 10). 그러나 아드레노메둘린같은 비교적 작은 펩타이드에 PEG 기 같은 비교적 큰기를 연결하는 경우, PEG 기반의 분자량에 따라, 결과 아드레노메둘린 유도체의 다양한 성질이 크게 변동할 가능성이 있다. 또한 아드레노메둘린과 다른 기와가 아미드 결합 또는 에스테르 결합과 같은 생체 반응에 의해 절단 될 수 있는 결합에 의해 연결되어있는 경우, 투여 후 비교적 짧은 시간에 결합이 끊어 질 수 있다. 또한 아드레노메둘린 아미노산 잔기의 측쇄에 다른기를 연결하는 경우, 아드레노메둘린 부분의 입체 구조가 변화하여 아드레노메둘린을 인식하는 아드레노메둘린 수용체와의 친화성이 저하될 가능성이 있다. 이런 경우, 결과 아드레노메둘린 유도체는 아드레노메둘린로의 약리 작용이 저하될 가능성이 있다.
아드레노메둘린은 강력한 혈관 확장 작용이 있다. 따라서 치료에 유효한 양의 아드레노메둘린 또는 그 유도체를 단회 투여 할 경우 강력한 혈관 확장 작용에 기인하여 바람직하지 않은 부작용 (예를 들면, 과도한 혈압 저하, 반사성 교감 신경 활성 상승에 동반 빈맥 및/또는 레닌 활성의 상승 등)을 일으킬 수 있다. 이러한 부작용의 발생은 특히 혈관 확장 작용 이외의 약리 작용을 발현하는 것을 기대하고 아드레노메둘린 또는 그 유도체를 사용하는 경우 문제가 될 수 있다. 상기와 같은 문제가 생기는 것을 방지하기 위해, 아드레노메둘린 또는 그 유도체를 유효 성분으로 함유하는 의약은 지속적으로 정맥 주사하여 대상에 투여될 필요가 있다. 이러한 투여 방법은 대상에 부담을 가할 수 있다.
본 발명자들은 아드레노메둘린의 N 말단의 α 아미노기와 특정 분자량을 갖는 PEG 기와를 메틸렌 기 또는 우레탄기를 통해 연결함으로써, 아드레노메둘린의 생리 활성을 유지하면서, 아드레노메둘린에 비해 혈중 반감기가 연장되는 것을 발견했다. 또한, 상기 특징을 갖는 신규 아드레노메둘린 유도체는 과도한 혈압 저하와 같은 바람직하지 않은 부작용을 실질적으로 억제하고 있음을 발견했다. 따라서, 본 발명의 식 (I)로 표시되는 화합물을, 아드레노메둘린으로 예방 또는 치료될 수 있는, 증상, 질환 및/또는 장애에 적용함으로써 바람직하지 않은 부작용을 실질적으로 억제하면서, 상기 증상, 질환 및/또는 장애를 지속적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
식 (I)에서, B는 아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 활성을 갖는 이의 변형된 형태에서 유래된 펩타이드 부분일 필요가 있다. 본 발명에서 "아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 활성을 갖는 이의 변형된 형태에서 유도된 펩타이드 부분"은 아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 활성을 갖는 이의 변형된 형태에서 1 개의 수소 원자(일반적으로 아미노기의 1 개의 수소 원자 일반적으로 N 말단의 α 아미노기의 1 개의 수소 원자)를 제거한 구조를 갖는 1 가의 유리기를 의미한다. 본 발명에서 "아드레노메둘린의 변형된 형태(a modified form of adrenomedullin)"는 상기에서 설명한 천연 아드레노메둘린이 화학적으로 수식된 펩타이드를 의미한다. 또한, 본 발명에서 "아드레노메둘린 활성"은 아드레노메둘린이 가지는 생물학적(생리학적) 활성(bioactivity)을 의미한다. 아드레노메둘린 활성으로는 다음을 들 수 있다:
(1) 심혈관계: 혈관 확장 작용, 혈압 강하 작용, 혈압 상승 억제 작용, 심박출량 증가 · 심부전 개선 작용, 폐 고혈압 개선 작용, 혈관 신생 작용, 림프관 신생 작용, 혈관 내피 기능 개선 작용, 항 동맥 경화 작용, 심근 보호 작용 (예를 들어, 허혈성 재관류 장애 또는 염증에서의 심근 보호 작용), 심근 경색 후 재발 억제 작용, 심장 비대 억제 작용 및 안지오텐신 전환 효소 억제 작용.
(2) 신장 · 물, 전해질 계: 이뇨 작용, 나트륨 이뇨 작용, 항이뇨 호르몬 억제 작용, 알도스테론 저하 작용, 신장 보호 작용(예를 들어, 고혈압 또는 허혈성 재관류 장애 등에서의 신장 보호 작용), 음주 행동 억제 작용, 및 염분 요구 억제 작용.
(3) 뇌 · 신경계: 신경 보호, 뇌 손상 억제 작용, 항염증 작용, 세포 사멸 억제 작용(예를 들어, 허혈성 재관류 장애 또는 염증에서의 세포 사멸 억제 작용), 자동 조절 기능 유지 작용, 산화 스트레스 억제 작용, 치매 개선 작용 및 교감 신경 억제 작용.
(4) 비뇨 생식기: 발기 개선 작용, 혈류 개선 작용 및 착상 촉진 작용.
(5) 소화기계: 항궤양 작용, 조직 복구 작용, 점막 신생 작용, 혈류 개선 작용, 항염증 작용 및 간 기능 개선 작용.
(6) 정형외과 계 : 조골 세포 자극 및 관절염 개선 작용.
(7) 내분비 대사 계 : 지방 세포 분화 작용, 지방 분해 제어 작용, 인슐린 감수성 개선 작용, 인슐린 분비 조절 작용, 항이뇨 호르몬 분비 억제 작용 및 알도스테론 분비 억제 작용.
(8) 기타 : 순환 개선 작용, 소염 작용, 사이토 카인 제어 작용, 장기 보호 작용, 산화 스트레스 억제 작용, 조직 복구 작용 (예를 들어, 항부비동 작용), 패혈증성 쇼크의 개선 작용, 다발성 장기 부전의 억제 작용, 자가 면역 질환의 억제 작용, 항균 작용, 육모 작용 및 양모 작용.
상기 혈압 강하 작용은 바람직하게 혈관 확장성 강압 작용이다. 상기 소화의 항염증 작용은 바람직하게, 스테로이드 저항성 또는 스테로이드 의존성의 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병 또는 장관 베체트 병)을 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료 작용이다. 상기의 아드레노메둘린 활성은 세포 내 cAMP의 농도 상승을 통해 나타난다. 따라서 세포 내 cAMP의 농도 상승을 아드레노메둘린 활성의 지표라고할 수 있다. 상기와 같은 생리 활성을 갖는 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태에서 유래된 펩타이드 부분 B는, 이를 포함하는 본 발명의 식 (I)로 표시되는 화합물이 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 동등한 생리 활성(즉, 아드레노메둘린 활성)을 발휘할 수 있게 한다.
상기 아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 활성을 갖는 이의 변형된 형태는 바람직하게 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(i) 아드레노메둘린의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드,
(ii) 아드레노메둘린의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아미노산 서열 중 2개의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드,
(iii) (ii) 펩타이드에있어서, 상기 이황화 결합이 에틸렌기에 의해 치환되고, 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드,
(iv) (i)-(iii) 중 하나의 펩타이드에서, 1-15 개의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드,
(v) (i)-(iv) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 C 말단이 아미드화 된 펩타이드, 및
(vi) (i)-(iv) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 C 말단에 부가된 글리신 잔기를 가지는 펩타이드.
일 실시예에서, 상기 아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 활성을 갖는 이의 변형된 형태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(i) 아드레노메둘린의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드,
(ii) 아드레노메둘린의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 상기 아미노산 서열 중 2개의 시스테인 잔기에 의해 형성된 디설파이드 결합을 가지는 펩타이드,
(v) (i) 또는 (ii)의 펩타이드에서, 이의 C 말단이 아미드화 된 펩타이드, 및
(vi) (i) 또는 (ii) 펩타이드에서, 이의 C 말단에 부가되는 글리신 잔기를 가지는 펩타이드.
다른 실시예에서, 상기 아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 활성을 갖는 이의 변형된 형태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(iv') (i)-(iii) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 N 말단에서 1-15 위치, 1-10 위치 또는 1-5 위치 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드,
(v) (iv')의 펩타이드에서, 이의 C 말단이 아미드화 된 펩타이드, 및
(vi) (iv')의 펩타이드에서, 이의 C 말단에 부가되는 글리신 잔기를 가지는 펩타이드.
상기 (i)-(vi) 및 (iv ')의 펩타이드에서 (v)에 포함되는 아드레노메둘린의 아미노산 서열로 이루어지며, C 말단이 아미드화되고, 또한 상기 아미노산 서열 중 2 개 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 형성하고 있는 펩타이드는 성숙한 천연 아드레노메둘린에 해당한다. (i)의 아드레노메둘린의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 C 말단 아미드화 및 시스테인 잔기의 이황화화 번역 후 수식을 받기 전(즉 미성숙한) 형태의 천연 아드레노메둘린에 해당한다. 상기 (i)-(vi) 및 (iv ')의 펩타이드에 있어서, 상기에 설명된 펩타이드를 제외한 다른 펩타이드는 아드레노메둘린의 변형된 형태에 해당한다.
상기 (ii)의 펩타이드는 상기 (i)의 펩타이드의 2 개의 시스테인 잔기의 티올기를 공기 산화하거나 또는 적절한 산화제를 이용하여 산화하여, 이황화 결합으로 변환함으로써 형성시킬 수 있다. 상기 (ii) 펩타이드를 이용하여 펩타이드 부분 B의 입체 구조를 천연 아드레노메둘린의 입체 구조와 유사하게 확립할 수 있다. 따라서, 이러한 유사한 입체 구조는 식 (I)로 표시되는 화합물의 아드레노메둘린 활성을 천연(형) 아드레노메둘린과 실질적으로 대략 동등한 활성으로 야기할 수 있다.
상기 (iii) 펩타이드는 상기 (ii)의 펩타이드의 이황화 결합을 에틸렌 기로 변환함으로써 형성시킬 수 있다. 이황화 결합에서 에틸렌 기로의 대체는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법으로할 수 있다(O. Keller et al., Helv. Chim. Acta, 1974, Volume 57, p. 1253). 상기 (iii)의 펩타이드를 이용하여 펩타이드 부분 B의 입체 구조를 안정화시킬 수 있다. 따라서 안정화된 입체 구조는, 식 (I)로 표시되는 화합물은 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있게 한다.
상기 (iv)의 펩타이드에서 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 잔기의 수는 1-15의 범위인 것이 바람직하고, 1-10의 범위인 것이 보다 바람직하고, 1-8 개의 범위인 것이 더욱 바람직하고, 1-5 개의 범위인 것이 특히 바람직하고, 1-3 개의 범위인 것이 가장 바람직하다. 바람직한 (iv) 펩타이드는 (i)-(iii) 중 하나의 펩타이드에서 N 말단 측에서 1-15 위, 1-12 위, 1-10 위, 1-8 위, 1-5 정도 또는 1-3 위의 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드이며, 보다 바람직한 (iv) 펩타이드는 (i)-(iii) 중 하나의 펩타이드에서 N 말단 측에서 1-15 위, 1-10 위 또는 1-5 위 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드((iv ')의 펩타이드)이다. 상기 바람직한 펩타이드에서 1 또는 복수(예를 들면, 1-5 개, 1-3 개 또는 1 또는 2 개)의 아미노산 잔기가 더욱 결실, 치환 또는 부가되어 있어도 좋다. 상기 (iv) 또는 (iv ')의 펩타이드를 이용하여 식 (I)로 표시되는 화합물의 아드레노메둘린 활성을 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 대략 동등한 것으로할 수 있다. 또한, 상기 (iv) 또는 (iv ')의 펩타이드를 이용하여 식 (I)로 표시되는 화합물은 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
상기 (vi) 또는 (iv ')의 펩타이드는 C 말단 아미드화 효소의 작용에 의해 C 말단 글리신 잔기가 C 말단 아미드기로 변환되고, 상기 (v)의 펩타이드로 변환될 수 있다 . 그러므로, 상기 (vi) 또는 (iv ')의 펩타이드를 대상(subject)으로 투여함으로써, 상기 대상의 생체 내에서 일정 시간 경과 후에, C 말단 아미드화 된 펩타이드를 형성시킬 수 있다. 따라서 식 (I)로 표시되는 화합물은 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
상기 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태는 바람직하게 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(a) 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(b) 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(c) 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(d) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(e) 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위의 시스테인 잔기와 19 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(f) 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위의 시스테인 잔기와 19 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(g) (a)-(f) 중 하나의 펩타이드에있어서, 상기 이황화 결합이 에틸렌 기에 의해 대체되고, 한편 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드;
(h) (a)-(g) 중 하나의 펩타이드에서 1-15 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드;
(i) (a)-(h) 중 하나의 펩타이드에서 C 말단이 아미드화 된 펩타이드; 및
(j) (a)-(h) 중 하나의 펩타이드에서 C 말단에 글리신 잔기가 부가되는 펩타이드.
일 실시예에서, 상기 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태는 더 바람직하게 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(a) 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(b) 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(c) 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(d) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(e) 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위의 시스테인 잔기와 19 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(f) 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위의 시스테인 잔기와 19 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(i) (a)-(f) 중 하나의 펩타이드에서 C 말단이 아미드화 된 펩타이드; 및
(j ) (a)-(f) 중 하나의 펩타이드에서 C 말단에 글리신 잔기가 부가되는 펩타이드.
다른 실시예에서, 상기 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태는 더 바람직하게 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(h ') (a)-(d) 중 하나의 펩타이드에서 N 말단 측에서 1-15 위, 1-10 위 또는 1-5 위의 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는, 또는 (e) 또는 (f)의 펩타이드에서 N 말단 측에서 1-13 위, 1-8 위 또는 1-5 위 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드;
(i) (h ')의 펩타이드에서 C 말단이 아미드화 된 펩타이드; 및
(j) (h')의 펩타이드에서, C 말단에 글리신 잔기가 부가되는 펩타이드.
상기 (h)의 펩타이드에서, 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 잔기의 수는 1-12의 범위인 것이 바람직하고, 1-10의 범위인 것이 보다 바람직하고, 1-8 개의 범위인 것이 더욱 바람직하고, 1-5 개의 범위인 것이 특히 바람직하고, 1-3 개의 범위인 것이 가장 바람직하다. 바람직한 (h)의 펩타이드는 (a)-(g) 중 하나의 펩타이드에서 N 말단 측에서 1-15 위, 1-12 위, 1-10 위, 1-8 위, 1-5 정도 또는 1-3 위의 아미노산이 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드이며, 보다 바람직한 (h)의 펩타이드는 (a)-(d) 중 하나의 펩타이드에서 N 말단 측면에서 1-15 위, 1-10 위 또는 1-5 위 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드, 또는 (e) 또는 (f)의 펩타이드에서 N 말단 측에서 1-13 위, 1-8 위 또는 1-5 위 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드((h ')의 펩타이드)이다. 상기 바람직한 펩타이드에서 1 또는 복수(예를 들면, 1-5 개, 1-3 개 또는 1 또는 2 개)의 아미노산이 더욱 결실, 치환 또는 부가되어 있어도 좋다. 상기 (h) 또는 (h ')의 펩타이드를 이용하여 식 (I)로 표시되는 화합물의 아드레노메둘린 활성을 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 대략 동등한 것으로할 수 있다. 또한, 상기 (h) 또는 (h ')의 펩타이드를 이용하여 식 (I)로 표시되는 화합물은 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
식 (I)에서, A는 1개 이상의 PEG기를 포함하는 변형기(modifying group)가 필요하다. 변형기 A에서 1 개 이상의 PEG기를 포함하는 형태는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 1 개 이상의 PEG 기가 변형기 A의 말단부에 배치되어 있어도 좋고, 변형기 A의 내부에 배치되어 있어도 좋다. 또한 변형기 A는 PEG기를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄상의 기로서 당해 기술 분야에서 공지 된 각종 라디칼일 수 있다. 변형기 A로 사용할 수 있는 공지의 기로는 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, WO1995/11924, WO2006/084089, WO98/41562, WO2005/079838, WO2002/060978, WO2001/048052, WO1998/055500, WO1996/021469, WO2003/040211 및 일본 특허 공보(Kokai) 제 04-108827 A에 개시되는 기를 포함한다. 1 개 이상의 PEG기를 포함하는 기를 변형기 A로 사용하는 식 (I)로 표시되는 화합물은 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
A는 바람직하게 다음 식 (II)로 표시되는 변형기(modifying group)이다:
Figure 112020091917216-pat00004
식 (II)에서
a는 1 이상의 정수이고,
m은 1 이상의 정수이고,
L1은 m + 1 가의 직쇄 또는 분지쇄 연결기이되, 여기서, 복수의 L1이 존재하는 경우, 상기 복수의 L1은 서로 동일하거나 상이할 수 있고,
L2 및 L2'는 서로 독립적으로, 결합 또는 2 가의 연결기이며, 여기서, 복수의 L2'가 존재하는 경우, 상기 복수의 L2'는 서로 동일하거나 상이할 수 있고,
M1은 PEG 기이고, 여기서, 복수의 M1이 존재하는 경우, 상기 복수의 M1은 동일하거나 서로 다를 수 있으며,
M2는 결합 또는 PEG 기이고, 여기서, 복수의 M2가 존재하는 경우, 상기 복수의 M2는 동일하거나 서로 다를 수 있으며,
R1은 수소 또는 1가의 기이고, 및
*는 여타 부분과의 결합 위치이다.
m은 연결기 L1의 분지 수이다. 예를 들어, m이 1이면, L1은 2가 연결기이고, 말단 방향에 대해 비분지된 기, 즉 선형기이다. m이 2 이상인 경우, L1은 3가 이상의 연결기이며, 말단 방향에 대해 2 분지 이상의 기이다. m은 일반적으로 1 이상의 정수이며, 5 이하의 정수이며, 1-5의 범위인 것이 바람직하고, 1-4의 범위인 것이 보다 바람직하고, 1-3의 범위인 것이 보다 바람직하다. 연결기 L1 분지 수 m이 상기 범위의 경우, PEG기를 포함하는 변형기 A는 직쇄 또는 분지쇄상 구조를 가질 수 있다.
a는, PEG 기 M1 과 M2, 및 연결기 L1 및 L2' 를 포함하는 단위의 반복 수이다. 예를 들어, a가 1인 경우, 상기 단위는 반복 구조를 갖지 않는다. a가 2 이상이고, 또한 m이 1이면, 상기 단위는 선형의 반복 구조를 갖는다. a가 2 이상이고, 또한 m이 2 이상인 경우, 상기 단위는 수지상 분지쇄상의 반복 구조를 갖는다. a는 일반적으로 1 이상의 정수이며, 5 이하의 정수이며, 1-5의 범위인 것이 바람직하고, 1-2의 범위인 것이 보다 바람직하다. PEG 기 M1 과 M2, 및 연결기 L1 및 L2' 를 포함하는 단위의 반복 수 a가 상기 범위인 경우, PEG기를 포함하는 변형기 A는 직쇄 또는 분지쇄상 구조를 가질 수 있다.
M1 과 M2에서 PEG 기는 일반적으로 식 (III)에 의해 표시된다:
#-(CH2CH2O)n-**　(III)
식 (III)에서 **는 L1 과의 결합 위치이며, #는 O 또는 L2'과의 결합 위치이다. 식 (III)로 표시되는 PEG 기의 중량 평균 분자량은 변형기 A의 합계로서 일반적으로 1 kDa 이상, 바람직하게는 5 kDa 이상, 보다 바람직하게는 10 kDa 이상, 더욱 바람직하게는 20 kDa 이상이고, 일반적으로 2000 kDa 이하, 바람직하게는 1000 kDa 이하, 보다 바람직하게는 100 kDa 이하, 더욱 바람직하게는 80 kDa 이하이며, 특히 바람직하게는 60 kDa 이하이다. 식 (III)로 표시되는 PEG 기는 변형기 A의 합계로, 일반적으로 1-2000 kDa의 범위, 예를 들어 1-1000 kDa 범위의 중량 평균 분자량을 가지며, 1-100 kDa의 범위 중량 평균 분자량을 갖는 것이 바람직하고, 5-80 kDa 범위의 중량 평균 분자량을 갖는 것이 보다 바람직하고, 10-60 kDa 범위의 중량 평균 분자량을 갖는 것이 더욱 바람직하고, 20-60 kDa의 범위 중량 평균 분자량을 갖는 것이 특히 바람직하다. 변형기 A의 식 (III)로 표시되는 PEG 기의 총 중량 평균 분자량이 상기 범위인 경우, 식 (I)로 표시되는 화합물의 아드레노메둘린 활성은 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 동등한 것이라고 할 수 있다. 또한 식 (I)로 표시되는 화합물은 바람직하지 않은 부작용을 실질적으로 억제하면서 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
식 (III)에서 n은 상기 중량 평균 분자량에 따라 정의되는 에틸렌 옥사이드 단위의 반복 수이다. n은 상기 중량 평균 분자량의 바람직한 범위에 따라 정의하면 일반적으로 약 20 이상, 바람직하게는 약 110 이상,보다 바람직하게는 약 230 이상, 더욱 바람직하게는 약 460 이상의 정수이며, 일반적으로 약 45000 이하, 바람직하게는 약 22,000 이하, 보다 바람직하게는 약 2200 이하, 더욱 바람직하게는 약 1820 이하, 특히 바람직하게는 약 1360 이하의 정수이다. n은 상기 중량 평균 분자량의 바람직한 범위에 따라 정의하면 일반적으로 약 20-45000의 범위, 예를 들어 약 20-22000의 범위이며, 약 1-2200의 범위인 것이 바람직하고, 약 110-1820의 범위인 것이 보다 바람직하고, 약 230-1360의 범위인 것이 더욱 바람직하고, 약 460-1360의 범위인 것이 특히 바람직하다. 반복 수 n이 상기 범위인 경우, 식 (II)로 표시되는 기에 포함된 PEG 기의 총 중량 평균 분자량이 상기 범위가 된다. 그러므로 반복 수 n이 상기 범위인 경우, 식 (I)로 표시되는 화합물의 아드레노메둘린 활성을 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 대략 동등한 것이라 할 수 있다. 또한 식 (I)로 표시되는 화합물은 바람직하지 않은 부작용을 실질적으로 억제하면서 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
R1은 수소, 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로 알킬, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알케닐, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알키닐, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로 알킬, 치환 또는 비치환된 C7-C20사이클로 알킬알킬, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로 알킬-C1-C20 알킬, 치환 또는 비치환된 C4-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴-C1-C20 알킬, 또는 치환 또는 비치환된 아실이고, 보다 바람직하게 수소, 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알키닐, 보다 바람직하게 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실, 및 특히 바람직하게 메틸이다. 상기 기가 치환되는 경우, 상기 치환기는 각각 독립적으로 바람직하게, 할로겐(불소, 염소, 브롬 또는 요오드), 시아노, 니트로, 치환 또는 비치환된 C1-C5 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C5 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C5 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C6 사이클로 알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C6 사이클로 알케닐, 치환 또는 비치환된 C3-C6 사이클로 알키닐, 치환 또는 비치환된 아미노, 및 치환 또는 비치환된 C1-C5 알콕시로 이루어진 군에서 선택되는 1가 기이고, 보다 바람직하게 할로겐(불소, 염소, 브롬 또는 요오드), 시아노, 니트로, 치환되지 않은 C1-C5 알킬, 치환되지 않은 C2-C5 알케닐, 치환되지 않은 C2-C5 알키닐, 치환되지 않은 C3-C6 사이클로 알킬, 치환되지 않은 C3-C6 사이클로 알케닐, 치환되지 않은 C3-C6 사이클로 알키닐, 치환되지 않은 아미노 및 치환되지 않은 C1-C5 알콕시로 이루어진 군에서 선택 되는 1가 기이다. R1이 상기 기인 경우, 식 (I)로 표시되는 화합물의 아드레노메둘린 활성은 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 대략 동등한 것이다. 또한 식 (I)로 표시되는 화합물은 바람직하지 않은 부작용을 실질적으로 억제하면서 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
L1은 m + 1 가의 직쇄 또는 분지쇄상의 연결기이다. L1은 치환 또는 비치환된 m + 1가의 직쇄 또는 분지쇄상 탄화수소 기가 바람직하다. 상기 기는 하나 이상의 헤테로 원자, 지환(alicyclic) 기, 방향족 기, 아미드기(-CO-NH-), 에스테르 기(-CO-O-) 또는 우레탄 기(-O-CO-NH-)를 포함할 수 있다. 상기 기가 치환되는 경우, 상기 치환기는 각각 독립적으로 할로겐(불소, 염소, 브롬 또는 요오드), 시아노, 니트로, 및 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 분지쇄상 탄화수소 기로 이루어진 군에서 선택되는 1가 기인 것이 바람직하다.
L2 및 L2'는 서로 독립적으로, 결합 또는 2가의 연결기이다. L2 및 L2'가 2 가의 연결기인 경우, L2 및 L2'는 서로 독립적으로, 치환 또는 비치환된 2가의 탄화수소기, 아미드기(-CO-NH-) 에스테르 기(-CO-O-) 또는 우레탄 기(-O-CO-NH-)인 것이 바람직하며, 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C7-C20 사이클로 알킬알킬렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원자의 헤테로 사이클로알킬-C1-C20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 아릴렌, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴알킬렌, 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴렌, 또는 치환 또는 비치환된 5-15 원자의 헤테로아릴-C1-C20 알킬렌, 아미드기(-CO-NH-), 에스테르기(-CO-O-), 또는 우레탄기(-O-CO-NH-)이다. 상기 기는 선택적으로 하나 이상의 헤테로 원자, 아미드기(-CO-NH-), 에스테르기(-CO-O-), 또는 우레탄기(-O-CO-NH-)를 포함할 수 있다. 상기 기가 치환되는 경우, 상기 치환기는 각각 독립적으로 할로겐(불소, 염소, 브롬 또는 요오드), 시아노, 니트로, 및 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 분지쇄상 탄화수소 기로 이루어진 군에서 선택되는 1가 기인 것이 바람직하고, 할로겐(불소, 염소, 브롬 또는 요오드), 시아노, 니트로, 치환되지 않은 C1-C5 알킬, 치환되지 않은 C2-C5 알케닐, 치환되지 않은 C2-C5 알키닐, 치환되지 않은 C3-C6 사이클로 알킬, 치환되지 않은 C3-C6 사이클로 알케닐, 치환되지 않은 C3-C6 사이클로 알키닐, 치환되지 않은 아미노 및 치환되지 않은 C1-C5 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1가 기인 것이 보다 바람직하다.
L1, L2 및 L2' 가 상기 기인 경우, 식 (I)로 표시되는 화합물의 아드레노메둘린 활성을 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 대략 동등한 것으로 할 수 있다. 또한 식 (I)로 표시되는 화합물은 바람직하지 않은 부작용을 실질적으로 억제하면서 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
적합한 변형기 A는 다음 식 (V), (VI), (VII) 또는 (VIII)에 의해 표시되는 변형기이다:
Figure 112020091917216-pat00005
상기 식 (V), (VI), (VII) 또는 (VIII)에 있어서,
a는 1 이상의 정수이고,
M3, M3', M3'', M3''' 및 M3''''는 서로 독립적으로, 결합 또는 PEG기이고, 여기서, 복수의 M3, M3', M3'', M3''' 또는 M3''''가 존재하는 경우, 상기 복수의 M3, M3', M3'', M3''' 또는 M3''''는 서로 동일하거나 상이할 수 있고, M3, M3', M3'', M3''' 및 M3'''' 중 적어도 하나는 PEG 기이고,
R1, R1' 및 R1'' 및 R1'''는 서로 독립적으로 수소 또는 1 가의 기이고,
R2는 결합 또는 2가의 기이고,
R3, R3' 및 R3''은 서로 독립적으로, 결합 또는 2 가의 기이고, 여기서, 복수의 R3, R3' 및 R3''가 존재하는 경우, 상기 복수의 R3, R3' 및 R3''는 서로 동일하거나, 또는 달라도 좋고,
*는 다른 부분과의 결합 위치이다.
a는 PEG 기 M3, M3', M3'', M3''' 및 M 3''''를 포함한 단위의 반복 수이다. 예를 들어, a가 1 인 경우, 상기 단위는 반복 구조를 갖지 않는다. 식 (V)에서 a가 2 이상인 경우, 상기 단위는 선형의 반복 구조를 갖는다. 식 (VI), (VII) 및 (VIII)에서 a가 2 이상인 경우, 상기 단위는 수지상 분지쇄상의 반복 구조를 갖는다. a는 일반적으로 1 이상의 정수이며, 5 이하의 정수이며, 1-5의 범위인 것이 바람직하고, 1-2의 범위인 것이 보다 바람직하다. PEG 기 M3, M3', M3'', M3''' 및 M 3''''를 포함한 단위의 반복 수 a가 상기 범위의 경우, PEG기를 포함하는 변형기 A는 선형 또는 분지쇄상 구조를 가질 수 있다.
M3, M3', M3'', M3''' 및 M 3''''가 PEG 기의 경우, 상기 PEG 기는 일반적으로 식 (III)로 나타내지는 기이다. 식 (III)로 표시되는 PEG 기는 상기와 같은 의미를 가진다. 이 경우 식 (I)로 표시되는 화합물의 아드레노메둘린 활성을 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 대략 동등한 것으로할 수 있다. 또한 식 (I)로 표시되는 화합물은 바람직하지 않은 부작용을 실질적으로 억제하면서 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
R1 은 상기와 같은 의미를 가진다. 또한 R1' 및 R1'' 및 R1'''는 상기 R1과 같은 의미를 가진다. 이 경우 식 (I)로 표시되는 화합물의 아드레노메둘린 활성을 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 대략 동등한 것으로 할 수 있다. 또한 식 (I)로 표시되는 화합물은 바람직하지 않은 부작용을 실질적으로 억제하면서 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
R2는 결합, 치환 또는 비치환된 2가의 탄화수소 기, 아미드기(-CO-NH-), 에스테르 기(-CO-O-) 또는 우레탄 기(-O-CO-NH-) 인 것이 바람직하고, 결합, 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알케닐렌, 치환 또는 비치환 C2-C20 알키닐렌, 치환 또는 비치환 C3-C20 사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원의 헤테로 사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C7-C20 사이클로 알킬알킬렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원의 헤테로 사이클로 알킬-C1-C20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20아릴렌, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴알킬렌, 치환 또는 비치환된 5-15 원 헤테로아릴렌, 치환 또는 비치환된 5-15 원의 헤테로아릴-C1-C20 알킬렌, 아미드기(-CO-NH-), 에스테르 기(-CO-O-) 또는 우레탄 기(-O-CO-NH-)인 것이 보다 바람직하다. 상기 2 가의 탄화수소 기는 선택적으로 1 개 이상의 헤테로 원자, 아미드기(-CO-NH-), 에스테르 기(-CO-O-) 또는 우레탄 기(-O-CO-NH-)를 포함한다. 상기 기가 치환되는 경우, 상기 치환기는 각각 독립적으로 할로겐(불소, 염소, 브롬 또는 요오드), 시아노, 니트로, 치환 또는 비치환된 C1-C5 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C5 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C5 알키닐, 치환 또는 비치환 C3-C6 사이클로 알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C6 사이클로 알케닐, 치환 또는 비치환된 C3-C6 사이클로 알키닐, 치환 또는 비치환된 아미노 및 치환 또는 비치환된 C1-C5 알콕시로 이루어진 군에서 선택되는 1가 기인 것이 바람직하고, 할로겐(불소, 염소, 브롬 또는 요오드), 시아노, 니트로, 치환되지 않은 C1-C5 알킬, 치환되지 않은 C2-C5 알케닐, 치환되지 않은 C2-C5 알키닐, 치환되지 않은 C3-C6 사이클로 알킬, 치환되지 않은 C3-C6 사이클로 알케닐, 치환되지 않은 C3-C6 사이클로 알키닐, 치환되지 않은 아미노 및 치환되지 않은 C1-C5 알콕시로 이루어진 군에서 선택되는 1가 기인 것이 보다 바람직하다. R2는 바람직하게는 결합 또는 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬렌 기이며,보다 바람직하게는 결합, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 부틸렌이며, 더욱 바람직하게는 결합 또는 에틸렌이다.
R3, R3' 및 R3''는 서로 독립적으로, 결합, 치환 또는 비치환된 2 가의 탄화수소 기, 아미드기(-CO-NH-), 에스테르 기(-CO-O- ) 또는 우레탄 기(-O-CO-NH-) 인 것이 바람직하고, 결합, 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 알키닐렌, 치환 또는 비치환 C3-C20 사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 사이클로 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원의 헤테로 사이클로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C7-C20 사이클로 알킬알킬렌, 치환 또는 비치환된 3-6 원의 헤테로 사이클로 알킬-C1-C20알킬렌, 치환 또는 비치환된 C4-C20 아릴렌, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴 알킬렌, 치환 또는 비치환된 5-15 원 헤테로 아릴렌 또는 치환 또는 비치환된 5-15 원 헤테로 아릴-C1-C20 알킬 아미드기(-CO-NH-), 에스테르 기(-CO-O-) 또는 우레탄 기(-O-CO-NH-) 인 것이 보다 바람직하다. 상기 2 가의 탄화수소 기는 선택적으로 1 개 이상의 헤테로 원자, 아미드기(-CO-NH-), 에스테르 기(-CO-O-) 또는 우레탄 기(-O-CO-NH-)를 포함할 수 있다. 상기 기가 치환되는 경우, 상기 치환기는 각각 독립적으로 할로겐(불소, 염소, 브롬 또는 요오드), 시아노, 니트로, 치환 또는 비치환된 C1-C5 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C5 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C5 알키닐, 치환 또는 비치환 C3-C6 사이클로 알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C6 사이클로 알케닐, 치환 또는 비치환된 C3-C6 사이클로 알키닐, 치환 또는 비치환된 아미노 및 치환 또는 비치환된 C1-C5 알콕시로 이루어진 군에서 선택되는 1가 기인 것이 바람직하고, 할로겐(불소, 염소, 브롬 또는 요오드), 시아노, 니트로, 치환되지 않은 C1-C5 알킬, 치환되지 않은 C2-C5 알케닐, 치환되지 않은 C2-C5 알키닐, 치환되지 않은 C3-C6 사이클로 알킬, 치환되지 않은 C3-C6 사이클로 알케닐, 치환되지 않은 C3-C6 사이클로 알키닐, 치환되지 않은 아미노 및 치환되지 않은 C1-C5 알콕시로 이루어진 군에서 선택되는 1가 기인 것이 더 바람직하다. R3, R3' 및 R3''는 바람직하게는 서로 독립적으로, 결합, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬렌기, 아미드기를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬렌기, 또는 아미드기(-CO-NH-)이며, 보다 바람직하게는 서로 독립적으로, 결합, 메틸렌, 에틸렌, -CO-NH-(CH2)4-, -CH2-O-CO-NH-(CH2)3- 또는 -CO-NH-이다.
R2, R3, R3' 및 R3''가 상기 기인 경우, 식 (I)로 표시되는 화합물의 아드레노메둘린 활성은 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 대략 동등한 것으로 할 수 있다. 또한 식 (I)로 표시되는 화합물은 바람직하지 않은 부작용을 실질적으로 억제하면서 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
특히 적합한 변형기 A는 다음 식 (V-1-1), (VI-1-1), (VII-1-1), (VII-1-2), (VII-2-1) 또는 (VIII-1-1)로 표시되는 변형기이다:
Figure 112020091917216-pat00006
식에서,
n은 상기 정의와 같고,
n'은 n에 대한 상기 정의와 동일하고,
*는 다른 부분과의 결합 위치이다.
식 (V-1-1)에서 PEG 기는 바람직하게는 총 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 60 kDa 또는 80 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다.
식 (VI-1-1)에서 PEG 기는 바람직하게는 총 40 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다.
식 (VII-1-1)에서 PEG 기는 바람직하게는 총 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 60 kDa 또는 80 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다.
식 (VII-1-2)에서 PEG 기는 바람직하게는 총 50 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다. 이 경우 일반적으로 (CH2CH2O)n의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 40 kDa의 중량 평균 분자량을 가지며, (CH2CH2O)n'의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 10 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다.
식 (VII-2-1)에서 PEG 기는 바람직하게는 총 40 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다. 이 경우 일반적으로 (CH2CH2O)n의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 30 kDa의 중량 평균 분자량을 가지며, (CH2CH2O)n'의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 10 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다. 혹은 PEG 기는 바람직하게는 총 60 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다. 이 경우 일반적으로 (CH2CH2O)n의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 50 kDa의 중량 평균 분자량을 가지며, (CH2CH2O)n'의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 10 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다. 혹은 PEG 기는 바람직하게는 총 80 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다. 이 경우 일반적으로 (CH2CH2O)n의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 70 kDa의 중량 평균 분자량을 가지며, (CH2CH2O)n'의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 10 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다.
식 (VIII-1-1)에서 PEG 기는 바람직하게는 총 40 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다.
변형기 A로 상기의 기준을 사용하여 식 (I)로 표시되는 화합물은 천연 아드레노메둘린의 약리 작용을 유지하면서 원치 않는 부작용을 실질적으로 억제하고 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
식 (I)에서 펩타이드 부분 B는 N 말단의 α 아미노기의 질소 원자가 메틸렌 기의 탄소 원자와 공유 결합해서 남은 부분과 연결되는 것이 필요하다. 본 발명에서 1 개 이상의 PEG기를 포함하는 변형기 A와 펩타이드 부분 B와가 상기 연결기로 연결되어있는 경우, "알킬아민 연결형 아드레노메둘린 유도체"라고 기재하는 경우가있다. 알킬아민 연결형 아드레노메둘린 유도체는 비특허문헌 10에 기재된 아드레노메둘린 유도체처럼 아드레노메둘린의 N 말단의 α 아미노기의 질소 원자가 아미드 결합을 형성함으로써 다른 부분과 연결되는 아드레노메둘린 유도체(다음 "아미드 연결형 아드레노메둘린 유도체"라고도 기재한다)와 비교하여 더 높은 아드레노메둘린 활성을 가진다. 또한, 본 발명의 식 (I)로 표시되는 알킬아민 연결형 아드레노메둘린 유도체는 아미드 연결형 아드레노메둘린 유도체와 비교하여 바람직하지 않은 부작용(예를 들면, 과도한 혈압 저하, 반사성 교감 신경 활성 상승에 따른 빈맥 및/또는 레닌 활성의 상승 등)이 더 억제된다. 그러므로, 본 발명의 식 (I)로 표시되는 화합물은 공지의 아드레노메둘린 유도체와 비교하여 원하지 않는 부반응을 더 억제하면서 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
특히 바람직한 식 (I)로 표시되는 화합물은
A가 식 (V-1-1), (VI-1-1), (VII-1-1), (VII-1-2) (VII-2-1) 또는 (VIII-1-1)로 표현되는, PEG기를 포함하는 변형기이며, 및
B는 아드레노메둘린 활성을 가지는, 아드레노메둘린, 또는 이의 변형된 형태 유래의 펩타이드 부분이고, 상기 아드레노메둘린, 또는 이의 변형된 형태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(a) 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고있는 펩타이드;
(b) 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 3 의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고있는 펩타이드;
(c) 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 5의 아미노산 배열로 구성되며, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고있는 펩타이드;
(d) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고있는 펩타이드;
(e) 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위의 시스테인 잔기와 19 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고있는 펩타이드;
(f) 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위의 시스테인 잔기와 19 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고있는 펩타이드;
(i) (a )-(f) 중 하나의 펩타이드에서 C 말단이 아미드화 된 펩타이드; 및
(j) (a)-(f) 중 하나의 펩타이드에서 C 말단에 글리신 잔기가 부가되는 펩타이드; 또는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드:
(h') (a)-(d) 중 하나의 펩타이드에서 N 말단 측에서 1-15 위, 1-10 위 또는 1-5 위 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드, 혹은 (e) 또는 (f)의 펩타이드에서 N 말단 측에서 1-13 위, 1-8 위 또는 1-5 위 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드;
(i) (h ')의 펩타이드에서 C 말단이 아미드화 된 펩타이드; 및
(j) (h')의 펩타이드에서 C 말단에 글리신 잔기가 부가되는 펩타이드.
상기 특징을 갖는 식 (I)로 표시되는 화합물은 천연 아드레노메둘린의 약리 작용을 유지하면서 한편 바람직하지 않은 부작용을 실질적으로 억제하여 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현하는 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 하기 (X)로 표시되는 화합물, 이의 염, 또는 이의 수화물에 관한 것이다:
A'-CO-B (X)
본 명세서에서, 식 (X)로 표시되는 화합물을 "우레탄 연결형 아드레노메둘린 유도체" 라고 기재하는 경우가 있다.
식 (X)에서 B는 아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 활성을 갖는 이의 변형된 형태에서 유도된 펩타이드 부분인 것이 필요하다. 펩타이드 부분 B는 식 (I)로 표시되는 화합물에서 상기 정의와 같은 의미를 가진다.
A'는 1 개 이상의 PEG기를 포함하는 변형기인 것이 필요하다. 단, A'는 PEG기를 포함하는 변형기의 산소 원자가 카르보닐기의 탄소 원자와 공유 결합해서 다른 부분과 연결되는 것이 필요하다. 변형기 A'가 이러한 구조를 가짐으로써 식 (X)로 표시되는 화합물은 우레탄 결합을 통해 변형기 A' 및 펩타이드 부분 B가 연결되는 구조를 가질 수 있다.
A'는 다음 식 (XI), (XI') 또는 (XII)로 표시되는 변형기가 바람직하다:
R1-O-M1-* (XI)
Figure 112020091917216-pat00007
식 (XI), (XI ') 및 (XII)에서 *는 다른 부분과의 결합 위치이다.
식 (XI), (XI ') 및 (XII)에서 a, R1, R1', R2, R3, R3', R3'', M1, M3, M3' 및 M3''는 식 (I)로 표시되는 화합물에서 상기 정의와 같은 의미를 가진다.
특히 적합한 변형기 A'는 다음 식 (XI-1-1), (XII-1-1) 또는 (XII-2-1)로 표시되는 변형기이다:
CH3O-(CH2CH2O)n-* (XI-1-1)
Figure 112020091917216-pat00008
식에서,
n은 상기 정의와 동일한 의미를 가지며,
n'은 n에 대한 상기 정의와 동일한 의미를 가지며,
*는 다른 부분과의 결합 위치이다.
식 (XI-1-1)에서 PEG 기는 바람직하게는 총 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 60 kDa 또는 80 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다.
식 (XII-1-1)에서 PEG 기는 바람직하게는 총 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 60 kDa 또는 80 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다.
식 (XII-2-1)에서 PEG 기는 바람직하게는 총 40 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다. 이 경우 일반적으로 (CH2CH2O)n 의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 30 kDa의 중량 평균 분자량을 가지며, (CH2CH2O)n' 의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 10 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다. 혹은 PEG 기는 바람직하게는 총 60 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다. 이 경우 일반적으로 (CH2CH2O)n 의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 50 kDa의 중량 평균 분자량을 가지며, (CH2CH2O)n' 의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 10 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다. 혹은 PEG 기는 바람직하게는 총 80 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다. 이 경우 일반적으로 (CH2CH2O)n 의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 70 kDa의 중량 평균 분자량을 가지며, (CH2CH2O)n'의 에틸렌 옥사이드 단위는 총 10 kDa의 중량 평균 분자량을 가진다.
변형기 A'로 상기의 기를 사용하여, 식 (X)로 표시되는 화합물은 천연 아드레노메둘린의 약리 작용을 유지하면서 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
식 (X)에서 펩타이드 부분 B는 N 말단의 α 아미노기의 질소 원자가 카르보닐기의 탄소 원자와 공유 결합해서 다른 부분과 연결되는 것이 필요하다. 우레탄 연결형 아드레노메둘린 유도체는 비특허문헌 10에 기재된 아미드 연결형 아드레노메둘린 유도체와 비교하여 더 높은 아드레노메둘린 활성을 가진다. 그러므로, 본 발명의 식 (X)로 표시되는 화합물은 공지의 아드레노메둘린 유도체와 비교하여 더 높은 아드레노메둘린 활성을 생체 내에서 지속적으로 발현할 수 있다.
특히 바람직한 식 (X)로 표시되는 화합물은,
A'가 식 (XI-1-1), (XII-1-1) 또는 (XII-2-1)로 표현되는, PEG기를 포함하는 변형기이고, 및
B는 아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 활성을 갖는 이의 변형된 형태로부터 유래된 펩타이드 부분이며, 상기 아드레노메둘린 또는 변형된 형태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드이다:
(a) 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(b) 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(c) 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(d) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위의 시스테인 잔기와 21 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(e) 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위의 시스테인 잔기와 19 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(f) 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위의 시스테인 잔기와 19 위의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 있는 펩타이드;
(i) (a)-(f) 중 하나의 펩타이드 에서 C 말단이 아미드화 된 펩타이드; 및
(j) (a)-(f) 중 하나의 펩타이드에서 C 말단에 글리신 잔기가 부가되는 펩타이드; 또는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드:
(h') (a)-(d) 중 하나의 펩타이드이되, N 말단 측에서 1-15 위, 1-10 위 또는 1-5 위 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드, 혹은 (e) 또는 (f)의 펩타이드이되, N 말단 측에서 1-13 위, 1-8 위 또는 1-5 위 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드;
(i) (h')의 펩타이드에서 C 말단이 아미드화 된 펩타이드; 및
(j) (h')의 펩타이드에서 C 말단에 글리신 잔기가 부가되는 펩타이드.
상기 특징을 갖는 식 (X)로 표시되는 화합물은 공지의 아드레노메둘린 유도체와 비교하여 더 높은 아드레노메둘린 활성을 생체 내에서 지속적으로 발현할 수 있다.
본 발명에서, 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 상기 화합물 자체뿐만 아니라 그 염도 포함하고 있다. 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물이 염의 형태인 경우, 약학적으로 허용가능한 염인 것이 바람직하다. 본 발명의 화합물의 염에 반대 이온은, 이로 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 또는 치환 또는 비치환된 암모늄 이온과 같은 양이온, 또는 염화물 이온, 브롬 이온, 요오드화물 이온, 인산 이온, 질산 이온, 황산 이온, 탄산 이온, 탄산 수소 이온, 과염소산 이온, 포름산 이온, 초산 이온, 트리플루오로아세트산 이온, 프로피온산 이온, 젖산 이온, 말레인산 이온, 히드록시 말레산 이온, 메틸 말레산 이온, 푸마르산 이온, 아디프산 이온, 벤조산 이온, 2-아세톡시벤조산 이온, p-아미노벤조산 이온, 니코틴산 이온, 계피산 이온(cinnamate), 아스코르빈산 이온, 파모산 이온(pamoate), 숙신산 이온, 살리실산 이온, 비스메틸렌 살리실산 이온, 옥살산 이온, 주석산 이온, 말레산 이온, 구연산 이온, 글루콘산 이온, 아스파르트산 이온, 스테아르산 이온, 팔미트산 이온, 이타콘산 이온, 글리콜산 이온, 글루타민산 이온, 벤젠술폰산 이온, 사이클로헥실술파민산 이온, 메탄술폰산 이온, 에탄술폰산 이온, 이세티온산 이온, 벤젠술폰산 이온, p-톨루엔설폰산 이온, 또는 나프탈렌술폰산 이온과 같은 음이온을 포함한다. 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물이 상기의 반대 이온과의 염 형태인 경우, 상기 화합물의 아드레노메둘린 활성을 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 대략 동등한 것으로 할 수 있다.
식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 상기 화합물 자체뿐만 아니라, 상기 화합물 또는 이의 염의, 용매화물을 포함한다. 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물 또는 이의 염이 용매화물의 형태인 경우, 약학적으로 허용가능한 용매화물인 것이 바람직하다. 상기 화합물 또는 이의 염으로 용매화물을 형성할 수 있는 용매로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 물, 또는 메탄올, 에탄올, 2-프로판올(이소프로필알코올), 디메틸설폭사이드(DMSO), 초산, 에탄올아민, 아세토니트릴, 또는 에틸아세테이트와 같은 유기 용매를 포함한다. 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물 또는 이의 염이 상기 용매와의 용매화물의 형태인 경우, 상기 화합물의 아드레노메둘린 활성을 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 대략 동등한 것으로 할 수 있다.
식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 상기 또는 하기 화합물 자체뿐만 아니라 이의 보호 형태도 포함한다. 본 명세서에서 "보호 형태"는 1 개 또는 복수의 관능기(예를 들어 리신 잔기의 측쇄 아미노기)에 보호 기가 도입된 형태를 의미한다. 또한, 본 명세서에서 "보호기"는 바람직하지 않은 반응의 진행을 방지하기 위해 특정 작용기에 도입되는 기로서 특정 반응 조건에서 정량적으로 제거되고, 또한 그 이외의 반응 조건에서 실질적으로 안정, 즉 반응 불활성인 기를 의미한다. 상기 화합물의 보호 형태를 형성할 수 있는 보호기로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, t-부톡시카보닐(Boc), 2-브로모벤질옥시카보닐(BrZ), 9-플루오르닐메톡시카보닐(Fmoc), p-톨루엔설포닐(Tos), 벤질(Bzl), 4-메틸벤질(4-MeBzl), 2-클로로벤질옥시카보닐(ClZ), 사이클로헥실(cHex), 및 페나실(Pac)을 포함하고; 아미노기의 다른 보호기로는, 벤질옥시카보닐, p-클로로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, 벤즈히드릴옥시카르보닐, 2-(p-바이페닐)이소프로필옥시카보닐, 2-(3,5-디메톡시페닐)이소프로필옥시카보닐, p-페닐아조벤질옥시카르보닐, 트리페닐포스포노에틸옥시카르보닐, 9-플루오르닐메틸옥시카보닐, t-아밀로옥시옥시카보닐, 디이소프로필메틸옥시카보닐, 이소프로필옥시카보닐, 에틸옥시카보닐, 알릴옥시카보닐, 2-메틸술포닐에틸 옥시카르보닐, 2,2,2-트리클로로에틸옥시카르보닐, 사이클로펜틸옥시카르보닐, 사이클로헥실옥시카르보닐, 아다만틸옥시카보닐, 이소보닐옥시카르보닐, 벤젠술포닐, 메시틸렌술포닐, 메톡시트리메틸페닐술포닐, 2-니트로벤젠술포닐, 2-니트로벤젠술페닐, 4-니트로벤젠설포닐, 및 4-니트로벤젠 술페닐을 포함하고; 카르복실기의 다른 보호기로는, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, t-부틸 에스테르, p-메톡시벤질에스테르, 및 p-니트로벤질에스테르를 포함하고; Arg의 다른 측쇄 보호기로는, 2,2,4,6,7-펜타메틸-2,3-디히드로벤조퓨란-5-술포닐, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐, 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐, 및 2-메톡시벤젠술포닐을 포함하고; Tyr의 다른 보호기로는, 2,6-디클로로벤질, t-부틸 및 사이클로헥실을 포함하고; Cys의 다른 보호기로는 4-메톡시벤질, t-부틸, 트리틸, 아세트아미도메틸, 및 3-니트로-2-피리딘술페닐을 포함하고; His의 다른 보호기로는, 벤질옥시메틸, p-메톡시벤질옥시메틸, t-부톡시메틸, 트리틸 및 2,4-디니트로페닐을 포함하고; 및, Ser과 Thr의 다른 보호기로는, t-부틸 등을 포함한다. 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물이 상기 보호기로 보호된 형태인 경우, 상기 화합물의 아드레노메둘린 활성을 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 대략 동등한 것으로 할 수 있다.
또한 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 상기 화합물의 개별 거울상 이성질체(enantiomer)와 부분 입체 이성질체(diastereomer), 및 라세메이트와 같은 상기 화합물의 입체 이성질체의 혼합물도 포함한다.
상기 특징을 가짐으로써, 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 천연 아드레노메둘린의 약리 작용을 유지하면서 한편 바람직하지 않은 부작용을 실질적으로 억제하여 생체 내에서 지속적으로 아드레노메둘린 활성을 발현할 수 있다.
<2. 아드레노메둘린 유도체의 의약 용도>
본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 생체 내에서 부모 분자이고, 아드레노메둘린과 실질적으로 동등한 생리 활성(즉 아드레노메둘린 활성)을 지속적으로 발현할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 수화물을 유효 성분으로 함유하는 의약에 관한 것이다.
본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물을 의약 용도에 적용할 경우, 상기 화합물을 단독으로 사용하여도 좋고, 1 종 이상의 약학적으로 허용가능한 성분과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 의약은 원하는 투여 방법에 따라 당해 기술 분야에서 통상 사용되는 다양한 제형으로 제제화될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 의약은 또한, 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물과 1 종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물의 형태로 제공될 수도 있다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분 이외에 약학적으로 허용가능한 1 종 이상의 담체, 부형제, 결합제, 비히클, 용해 보조제, 방부제, 안정제, 팽창 방지제, 윤활제, 계면 활성제, 유성 액체, 완충제, 무통화제(soothing agent), 항산화제, 감미료 및 향미제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물을 유효 성분으로 함유하는 의약의 제형은 특별히 한정되지 않고, 비경구 투여에 사용하기 위한 제제, 경구 투여에 사용하기 위한 제제일 수 있다. 또한, 본 발명의 의약의 제형은 단위 용량 형태의 제제도 좋고, 여러 투여 형태의 제제들 수 있다. 비경구 투여에 사용하기 위한 제제로서, 예를 들어 물 또는 다른 약학적으로 허용가능한 액체 중의 멸균 용액 또는 현탁액 등의 주사제를 들 수 있다. 주사제에 혼합할 수 있는 첨가제로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 포도당이나 기타 보조제(예를 들면, D-소르비톨, D-만니톨 또는 염화나트륨)을 포함하는 등장액과 생리 식염수와 같은 비히클; 알코올(예: 에탄올 또는 벤질알코올), 에스테르(예를 들면 벤질 벤조에이트), 및 폴리알코올(예를 들면 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 용해 보조제; 폴리소르베이트 80 또는 폴리옥시에틸렌 하이드로제네이트 캐스터 오일과 같은 비이온성 계면 활성제; 참기름 또는 대두유와 같은 유성액; 인산염 완충액 또는 초산 나트륨 완충액 같은 완충제; 염화 벤잘코늄 또는 염산 프로카인과 같은 슈딩제(soothing agent); 인간 혈청 알부민 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 안정제; 보존제; 및 산화 방지제 등을 포함할 수 있다. 조제된 주사제는 일반적으로 적당한 유리병(예를 들어 앰플)에 충전된 후 사용시까지 적절한 환경에서 저장된다.
경구 투여에 사용하기 위한 제제로서, 예를 들어, 필요에 따라 당이나 용해성 피막 처리된 정제, 캡슐제, 엘릭서제, 마이크로 캡슐, 정제, 시럽, 현탁액 등을들 수 있다. 정제 또는 캡슐제 등으로 혼합할 수 있는 첨가제로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 젤라틴, 옥수수 전분, 검 트라가칸스(gum tragacanth), 및 아라비아 검과 같은 결합제; 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제; 옥수수 전분, 젤라틴 및 알기네이트와 같은 증량제; 스테아린산 마그네슘과 같은 윤활제; 수크로즈, 락토즈, 또는 사카린과 같은 감미제; 박하, 아카모노 오일(Gaultheria adenothrix oil) 또는 체리와 같은 향미제; 등을 포함할 수 있다. 제제가 캡슐인 경우 또한 오일/지방과 같은 액상 담체를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 생체 내에서 부모 분자이고, 아드레노메둘린과 실질적으로 동등한 아드레노메둘린 활성을 지속적으로 발현할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물을 유효 성분으로 함유하는 의약은 데포 제제(depot formulation)로 제제화 할 수 있다. 이 경우 데포 제제의 제형(투약 형태)에서 본 발명의 의약은, 예를 들어 피하 또는 근육 내로 이식되거나 또는 근육 주사로 투여할 수 있다. 본 발명의 의약을 데포 제제에 적용함으로써, 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물의 아드레노메둘린 활성을 장기간에 걸쳐 지속적으로 발현할 수 있다.
본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물을 유효 성분으로 함유하는 의약은 의약으로서 유용한 1 종 이상의 다른 약물과 병용할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 의약은 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 수화물과 1 종 이상의 다른 약제를 포함하는 단일 의약의 형태로 볼 수 있으며, 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 약학적으로 허용되는 수화물은 1 종 이상의 다른 약물과 별도로 제제화된 복수의 제제를 포함한 의약 조합 또는 키트의 형태로 제공될 수 있다. 의약 조합 또는 키트의 형태인 경우, 각각의 제제를 동시 또는 별도로(예를 들어 연속적으로) 투여할 수 있다.
본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물을 의약 용도에 적용할 경우, 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 상기 화합물 자체뿐만 아니라, 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염 및 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물도 포함한다. 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용되는 염 및 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 상기에서 예시한 염 또는 용매화물이 바람직하다. 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물이 상기 염 또는 용매화물의 형태인 경우, 상기 화합물을 원하는 의약 용도에 적용할 수 있다.
본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물을 유효 성분으로 함유하는 의약(medicament)은 아드레노메둘린 의해 예방 또는 치료되는 여러 가지 증상, 질환 및/또는 장애를 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 증상, 질환 및/또는 장애로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 하기를 들 수 있다:
(1) 심혈관 질환: 심부전, 폐고혈압, 폐색성 동맥경화증, 버거 병(Buerger's disease), 심근 경색, 림프 부종, 카와사키 병, 심근염, 고혈압, 고혈압으로 인한 장기 기능 장애 및 동맥 경화증.
(2) 신장 · 물 전해질계 질환: 신부전 및 신염.
(3) 뇌·신경계 질환: 뇌경색, 치매 및 뇌염.
(4) 비뇨 생식기계 질환: 발기 부전 (ED).
(5) 소화기계 질환: 염증성 장 질환, 궤양성 질환, 장관 베체트 병 및 간부전.
(6) 정형 외과계 질환: 관절염.
(7) 내분비 대사 질환: 당뇨병 및 당뇨병에 의한 기관 기능 장애, 및 원발성 알도스테론증.
(8) 기타: 패혈증성 쇼크, 자가 면역 질환, 다발성 장기 부전, 욕창, 상처 치유 및 탈모증.
상기 심혈관 질환은 바람직하게 심근 경색, 폐동맥 고혈압 또는 심부전 중 어느 하나이다. 상기 소화기계 질환은 바람직하게 스테로이드 내성 또는 스테로이드 의존성의 염증성 장 질환(예를 들어, 궤양성 대장염, 크론 병 또는 장관 베체트 병)을 포함하는 임의의 염증성 질환 중 임의의 것이다.
본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 천연 생리 활성 펩타이드이고, 아드레노메둘린과 변형기를 연결한 구조를 갖는다. 따라서 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 안전하고 저독성이다. 그러므로, 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 의약은 상기 증상, 질환 및/또는 장애의 예방 또는 치료를 필요로 하는 다양한 대상에 적용될 수 있다. 상기 대상은 인간 또는 비인간포유동물(예를 들면, 돼지, 개, 소, 랫트, 마우스, 기니피그, 토끼, 닭, 양, 고양이, 원숭이, 개코 원숭이 나 침팬지 등의 온혈 동물)의 피험체(대상) 또는 환자인 것이 바람직하다. 상기 대상으로 본 발명의 의약을 투여함으로써 아드레노메둘린에 의해 예방 또는 치료되는 여러 가지 증상, 질환 및/또는 장애를 예방 또는 치료할 수 있다.
본 명세서에서, "예방"은, 증상, 질환 및/또는 장애 발생(발달 또는 발병)을 실질적으로 방지하는 것을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 "치료"는 발생(발달된 또는 발병된)된 증상, 질환 및/또는 장애를 억제(예: 진행의 억제), 경감(완화), 회복 및/또는 치유하는 것을 의미한다.
본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 상기에서 설명한 증상, 질환 및/또는 장애(예를 들어, 심혈관 질환, 말초 혈관 질환 또는 염증성 질환)를 갖는 대상에서 해당 증상, 질병 및/또는 장애의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 의약은 상기에서 설명한 증상, 질환 및/또는 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 의약인 것이 바람직하고, 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 말초 혈관 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 의약인 것이 보다 바람직하다. 또한, 본 발명은 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 수화물을 유효성분으로 함유하는 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 말초 혈관 질환의 예방 또는 치료 제(agent)에 관한 것이다. 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물을 상기에서 설명한 증상, 질환 및/또는 장애의 예방 또는 치료에 사용함으로써, 상기 증상, 질환 및/또는 장애를 지속적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 상기에서 설명한 증상, 질환 및/또는 장애(예를 들어, 심혈관 질환, 말초 혈관 질환 또는 염증성 질환)을 갖는 대상에서 해당 증상, 질병 및/또는 장애의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 일 실시예는 상기에서 설명한 증상, 질환 및/또는 장애의 예방 또는 치료를 필요로하는 대상으로 유효량의 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 수화물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환 또는 증상의 예방 또는 치료 방법이다. 상기 증상, 질환 및/또는 장애는 심혈관 질환, 말초 혈관 질환 또는 염증성 질환 인 것이 바람직하다. 상기 증상, 질환 및/또는 장애의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상으로 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물을 투여함으로써, 상기 증상, 질환 및/또는 장애를 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예는 상기에서 설명한 증상, 질환 및/또는 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 수화물이다. 본 발명의 다른 실시예는 상기에서 설명한 증상, 질환 및/또는 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 수화물의 용도이다. 상기 증상, 질환 및/또는 장애는 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 말초 혈관 질환인 것이 바람직하다. 본 발명의 의약을 상기에서 설명한 증상, 질환 및/또는 장애의 예방 또는 치료에 사용함으로써, 상기 증상, 질환 및/또는 장애를 지속적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 의약을 대상 특히 인간 환자에 투여할 경우, 정확한 투여량 및 투여 횟수는 대상의 연령, 성별, 예방 또는 치료될 증상, 질환 및/또는 장애의 정확한 상태(예: 심각도) 및 투여 경로 등의 많은 요인을 감안하여 담당 의사가 치료에 효과적인 투여량 및 투여 횟수를 최종 결정해야 한다. 그러므로, 본 발명의 의약에서 유효성분인 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 치료에 유효한 양 및 횟수에서 대상에 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 의약을 인간 환자에 투여하는 경우, 유효성분인 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물의 투여량은 일반적으로 1 일 체중 60 kg 당 0.01-100 mg 의 범위이며, 일반적으로 하루에 체중 60 kg 당 0.01-10 mg의 범위이다.
본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 의약의 투여 경로 및 투여 횟수는 특별히 한정되지 않고, 경구로 단회 또는 복수회 투여 되어도 좋고, 비경구로 단회 또는 복수회 투여될 수 있다. 본 발명의 의약은 정맥 투여, 장내 투여, 피하 투여, 근육 내 투여 또는 복강 내 투여와 같은 비경구 경로로 투여되는 것이 바람직하며, 정맥 투여 또는 피하 투여하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 본 발명의 의약은 단회 투여되는 것이 바람직하다. 본 발명의 의약은 정맥 또는 피하에 단회 투여하기 위해 사용되는 것이 특히 바람직하다. 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물의 부모 분자인, 아드레노메둘린은 강력한 혈관 확장 작용을 갖는다. 따라서 치료에 유효한 양의 아드레노메둘린을 단회 투여할 경우 강력한 혈관 확장 작용에 의해 과도한 혈압 저하, 반사성 교감 신경 활성 상승에 따른 빈맥 및/또는 레닌 활성의 상승과 같은 바람직하지 않은 부작용을 일으킬 수 있다. 이에 대해 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물은 천연 아드레노메둘린과 실질적으로 동등한 아드레노메둘린 활성을 유지하면서 천연 아드레노메둘린에 비해 혈중 반감기를 유의하게 연장할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물을 유효 성분으로 함유하는 의약을 대상 정맥에 단회 투여함으로써 아드레노메둘린의 혈관 확장 작용으로 인해 원치 않는 부반응을 억제하면서 대상의 증상, 질환 및/또는 장애를 지속적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
<3. 아드레노메둘린 유도체의 제조 방법>
본 발명은 또한, 본 발명의 식 (I) 및 (X)로 표시되는 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
[3-1. 전구체 준비 단계]
본 발명의 방법은 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태에서 유도된 펩타이드 부분 B의 전구체, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜기를 포함하는 변형기 A 또는 A'의 전구체 중 적어도 어느 하나를 준비하는 단계(제조 단계)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태에서 유래된 펩타이드 부분 B의 전구체"는 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태 자체를 의미하거나 혹은 다음에서 설명하는 연결 단계에서 펩타이드 부분 B 및 변형기 A 또는 A'가 축합 반응에 의해 서로 연결되도록, 적절히 수정되거나 또는 활성화된 상기 펩타이드 부분 B의 유도체를 의미한다. 펩타이드 부분 B의 전구체는 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태 자체, 또는 이의 보호된 형태인 것이 바람직하다.
변형기 A의 전구체는 일반적으로 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 변형기 A의 전구체 알데히드이고, 상기 전구체 알데히드는 식 (I-1)에 의해 표시된다:
A-CHO (I-1)
이 단계에서 상술한 특징을 갖는 전구체의 준비(제조)는 하기 설명하는 연결 단계에서 각 전구체의 연결 반응을 통하여 식 (I)로 표시되는 화합물을 고수율로 얻을 수 있게 한다.
변형기 A'의 전구체는 일반적으로 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 변형기 A'의 전구체 p-니트로페닐 카보네이트 에스테르이고, 상기 전구체 p-니트로페닐 카보네이트 에스테르는 식 (X-1)로 표시된다:
A'-CO-OC6H4-p-NO2 (X-1)
대안적으로, 상기 변형기 A'의 전구체는 하나 이상의 폴리에틸렌 글로콜 기를 포함하는 변형기 A'의 전구체 N-히드록시숙신이미딜 카보네이트 에스테르일 수 있고, 상기 전구체 N-히드록시숙신이미딜 카보네이트 에스테르는 식 (X-2)로 표시된다:
A'-CO-OC4H4NO2 (X-2)
이 단계에서 상술한 특징을 갖는 전구체의 준비(제조)는 하기 설명하는 연결 단계에서 각 전구체의 연결 반응을 통하여 식 (X)로 표시되는 화합물을 고수율로 얻을 수 있게 한다.
이 단계에서 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태에서 유도된 펩타이드 부분 B의 전구체는 당해 기술 분야에서 통상 사용되는 수단에 의해 형성될 수 있다. 펩타이드 부분 B의 전구체가 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태 자체인 경우, 예를 들어 고상계 또는 액상계의 펩타이드 합성법을 이용하여도 좋고, 아드레노메둘린을 생산할 수 있는 인간 또는 비인간 포유동물의 조직 또는 세포로부터 천연 펩타이드를 정제하는 방법을 사용할 수 있다. 혹은 아드레노메둘린을 생산할 수 있는 인간 또는 비인간 포유동물의 아드레노메둘린을 코딩하는 DNA(예를 들면, 서열 번호 2,4,6,8,10 또는 12)를 사용하여 대장균 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 등의 형질전환 시스템에서 재조합 단백질을 대량 발현시키는 방법을 사용할 수 있다. 혹은, 미리 제조된 펩타이드를 구매하는 등의 방법을 이용해도 좋다. 어떠한 경우에도 이 공정의 실시예에 포함된다.
상기 방법에 의해 형성된 펩타이드 부분 B의 전구체에서, 상기 아미노산 서열 중 2 개의 시스테인 잔기의 티올기를 이황화 화 함으로써, 상기 아미노산 서열 중 2 개의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 형성하고 있는, 전구체를 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 형성된 펩타이드 부분 B의 전구체에서, 상기 아미노산 서열 중 2 개의 시스테인 잔기 사이에 형성된 이황화(디설파이드) 결합을 에틸렌 기로 대체함으로써, 상기 이황화 결합이 에틸렌 기에 의해 치환된 전구체를 얻을 수 있다. 상기 이황화 화 반응(디서파이드 결합의 형성 반응) 및 에틸렌 기에 의한 치환 반응은 당해 기술 분야에서 통상 사용되는 조건에 따라 실시할 수 있다. 상기 이황화화 반응 및 에틸렌 기에 의한 치환 반응은 이 단계에서 실시할 수 있고, 또는 다음에서 설명하는 연결 단계에서 실시할 수 있다. 어떠한 경우에도 본 발명의 방법의 실시예에 포함된다.
펩타이드 부분 B의 전구체 및 변형기 A 또는 A'의 전구체의 적어도 하나가 이의 보호 형태인 경우, 이 단계에서 선택적으로, 펩타이드 부분 B의 전구체 및 변형기 A 또는 A'중 적어도 어느 하나에 1 종 이상의 보호기를 도입하는 보호 단계, 및/또는 펩타이드 부분 B의 전구체 및 변형기 A 또는 A'의 전구체의 보호 형태 중 적어도 어느 하나에서, 1 종 이상 보호기를 탈보호 시키는 탈보호 단계를 실시할 수 있다. 상기 보호 단계 및 탈보호 단계는 당해 기술 분야에서 통상 사용되는 보호 반응 및 탈보호 반응에 의해 실시할 수 있다. 상기 보호 단계 및 탈보호 단계는 이 단계에서 실시할 수 있으며, 또는 다음에서 설명하는 연결 단계에서 실시할 수 있다. 어떠한 경우에도 본 발명의 방법의 실시예에 포함된다.
[3-2. 연결 단계]
본 발명의 방법은 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태에서 유도된 펩타이드 부분 B의 전구체와 변형기 A 또는 A'의 전구체를 연결시켜 식 (I) 또는 (X)로 표시되는 화합물을 얻도록 하는 연결 단계가 포함되는 것이 필요하다.
식 (I)에서, 이 단계는 일반적으로 펩타이드 부분 B의 전구체와 식 (I-1)로 표시되는 1 개 이상의 PEG기를 포함하는 변형기 A의 전구체 알데히드 및 환원제 존재 하에서 반응시킴으로써 실시된다. 이 단계에서 사용되는 환원제로서는, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면, 소듐 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3), 소듐 보로하이드라이드(NaBH4), 붕산 디메틸아민, 붕산 트리메틸아민, 보레이트 피리딘, 피리딘 보란, 2-피콜린 보란 및 3-피콜린 보란을 들 수 있다. 이 단계의 반응 온도는 -20 - 50℃의 범위인 것이 바람직하고, 0-15℃의 범위인 것이 보다 바람직하다. 또한, 이 단계에서의 반응 시간은 5 분-100 시간의 범위인 것이 바람직하다.
식 (X)로 표시되는 화합물을 제조하기 위해, 이 단계는 일반적으로 펩타이드 부분 B의 전구체와 식 (X-1) 또는 식 (X-2)로 표시되는 1 개 이상의 PEG기를 포함하는 변형기 A' 전구체 p-니트로페닐 카보네이트 또는 N-히드록시숙신이미딜 카보네이트와 염기 존재 하에서 반응시킴으로써 실시된다. 이 단계에서 사용되는 염기로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 트리에틸아민, 피리딘 및 디메틸아미노피리딘을들 수 있다. 이 단계의 반응 온도는 0-50℃의 범위인 것이 바람직하다. 또한, 이 단계에서의 반응 시간은 5 분-200 시간의 범위인 것이 바람직하다.
실시예
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험 I: 전체 길이의 아드레노메둘린 유도체의 제조>
[실험 I-1: 전체 길이의 아드레노메둘린 유도체의 합성]
[실험 I-1-1: CH3O-PEG(5k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM(1-52))(화합물 (1))의 합성]
공지 문헌(Kubo, K et al., "Biological properties of adrenomedullin conjugated with polyethylene glycol.", Peptides, 2014, vol. 57, p. 118-21)에 설명되는 방법에 따라, 5 kDa의 N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르형 CH3O-PEG화 시약(PEG-1) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)5-CO-O-NHS)을 사용하여, 인간 아드레노메둘린의 1-52 아미노산 잔기(서열 번호 1)에 대응하는 펩타이드 인, H-Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2(이하 "h.AM (1-52)"라고도 기재한다)의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 Cys16-Cys21 디설파이드 브릿지(이황화 가교)의 N 말단 아미노기에 아미드 결합을 통해, 5 kDa의 중량 평균 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 기(이하,"PEG (5k)"라고도 기재한다)를 연결하여, 아미드 결합형 PEG (5k) 아드레노메둘린 유도체(CH3O-PEG (5k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM (1-52 ))) (1)를 합성 하였다.
[실험 I-1-2: CH3O-PEG(20k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (2))의 합성]
실험 I- 1-1과 동일한 방법에 따라, N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르형 20 kDa의 CH3O-PEG화 시약(PEG-1)(CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)5-CO-O-NHS)를 이용하여 h.AM (1-52) 펩타이드의 N 말단 아미노기에 아미드 결합을 통해 20 kDa의 중량 평균 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 기(이하 "PEG (20k)"라고도 기재한다)를 연결하여 아미드 결합형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체(CH3O-PEG (20k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM (1-52))) (2)를 합성 하였다.
[실험 I-1-3: CH3O-PEG (10k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (3))의 합성]
2 mg 의 h.AM (1-52) 펩타이드를 100 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.5에 용해하여 2 mL의 펩타이드 용액을 얻었다. 이 펩타이드 용액에 빙냉하에 16 mg의 알데히드형 10 kDa의 중량 평균 분자량의 CH3O-PEG 화 시약(PEG-2)(CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)를 첨가 하였다. 또한,이 펩타이드 용액에 NaCNBH 320 mM의 최종 농도가되도록 첨가하였다. 반응액을 4℃ 하에서 24 시간 방치하였다. 얻어진 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액 pH4.0를 사용하여 5 배 희석했다. 희석된 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0에서 평형화 된 SP-Sepharose HP (GE 헬스케어사) 컬럼(2 mL)에 2 mL/hr의 유속으로 통액했다. 2 mL의 50 mM 아세트산 나트륨 완충액 pH4.0를 사용하여 컬럼을 세척했다. 이어 5 mL의, 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.0)을 컬럼에 통과하여 용출 분획을 얻었다. 용출 분획에 알킬아민 연결형 PEG (10k) 아드레노메둘린 유도체(CH3O-PEG (10k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (1-52))) (3 ) 및 미반응 h.AM (1-52) 펩타이드가 회수되었다. 이 용출 분획을 한외 여과막 (Amicon Ultra 4, Merck Millipore)을 이용하여 0.2 mL에 농축 하였다. 얻어진 농축액을 Superdex 200 HR 10/30(GE Healthcare Japan Corp.) 컬럼와 연결된 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 시스템 (L-2000; manufactured by Hitachi High-Tech Science Corp.)을 이용하여 정제 및 분취하였다(용출액: 80 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 6 + 80 mM Na2SO4 함유 20% CH3CN, 유속: 0.5 mL/min). 분취용 HPLC로 목적 화합물 (3) 1.0mg (h.AM (1-52) 환산)을 수득하였다.
[실험 I-1-4: CH3O-PEG (20k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (4))의 합성]
1 mg 의 h.AM (1-52) 펩타이드를 100 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.5)에 용해하여 1 mL의 펩타이드 용액을 얻었다. 이 펩타이드 용액에 빙냉하에 32 mg의 알데히드형 20 kDa의 중량 평균 분자량의 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)를 첨가 하였다. 또한,이 펩타이드 용액에 NaCNBH 320 mM의 최종 농도가되도록 첨가 하였다. 반응액을 4 ℃ 하에서 24 시간 방치 하였다. 얻어진 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)을 사용하여 5 배 희석했다. 희석된 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0) 2mL으로 평형화된 SP-Sepharose HP(GE Healthcare Japan Corp.) 컬럼에 2 mL/hr의 유속으로 통액했다. 2 mL의 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)을 사용하여 컬럼을 세척했다. 이어 5 mL의 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.0)을 컬럼에 통과하여 용출 분획을 얻었다. 용출 분획에 알킬아민 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (20k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (4 ) 및 미반응 h.AM (1-52) 펩타이드가 회수되었다. 이 용출 분획을 한외 여과 막 (Amicon Ultra 4, Merck Millipore)을 이용하여 0.2 mL로 농축하였다. 얻어진 농축액을 Superdex 200 HR10/30 (GE Healthcare Japan Corp.) 컬럼을 연결한 HPLC 시스템 (L-2000; manufactured by Hitachi High-Tech Science Corp.)을 이용하여 정제 및 분취하였다(용출액: 80 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH6 + 80 mM Na2SO4 함유 20 % CH3CN, 유속: 0.5 mL/min). 분취용(preperative) HPLC로 목적 화합물 (4) 0.3mg (h.AM (1-52) 기준)을 수득 하였다.
[실험 I-1-5: CH3O-PEG (30k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (5))의 합성]
2 mg 의 h.AM (1-52) 펩타이드를 100 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.5)에 용해하여 2 mL의 펩타이드 용액을 얻었다. 이 펩타이드 용액에 빙냉하에 30 mg의 알데히드형 30 kDa의 중량 평균 분자량의 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)을 첨가 하였다. 또한, 이 펩타이드 용액에 NaCNBH 320 mM의 최종 농도가 되도록 첨가 하였다. 반응액을 4 ℃ 하에서 24 시간 방치 하였다. 얻어진 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)을 사용하여 5 배 희석했다. 희석된 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)에서 평형화된 SP-Sepharose HP(GE Healthcare Japan Corp.) 컬럼(2mL)에 2 mL/hr의 유속으로 통액했다. 2 mL의 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)를 사용하여 컬럼을 세척했다. 이어 5 mL의 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.0)을 컬럼에 통과하여 용출 분획을 얻었다. 용출 분획에 알킬아민 연결형 PEG (30k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (30k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (1-52))) (5 ) 및 미반응 h.AM (1-52) 펩타이드가 회수되었다. 이 용출 분획을 한외 여과막(Amicon Ultra 4, Merck Millipore)을 이용하여 0.2 mL로 농축 하였다. 얻어진 농축액을 Superdex 200 HR10/30 (GE Healthcare Japan Corp.) 컬럼을 연결한 HPLC 시스템 (L-2000; manufactured by Hitachi High-Tech Science Corp.)를 이용하여 정제 및 분취하였다(용출액: 100 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH6 + 200 mM Na2SO4, 유속: 0.5 mL/min). 분취용 HPLC로 0.8 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (5)를 얻었다.
[실험 I-1-6: GL-2 분지형 CH3O-PEG (20k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (6))의 합성]
상기 실험 I-1-5에서 사용한 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2)을 대신하여, 45 mg의 식 (VII-1-1')로 표시되는 20 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-3):
Figure 112020091917216-pat00009
를 이용한 것 외에는, 상기 실험 I-1-5에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격-함유 2-분지된 알킬아민 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2-분지된 CH3O-PEG (20k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52))) (6)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00010
분취 HPLC로 1.0 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (6)을 얻었다.
[실험 I-1-7 : GL-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (7))의 합성]
상기 실험 I-1-5에서 사용한 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2)을 대신하여, 80 mg의 식 (VII-1-1')로 표시되는 40 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-3):
Figure 112020091917216-pat00011
를 이용한 것 외에는, 상기 실험 I-1-5에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 2 분지형 알킬아민 연결형 PEG (40k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52))) (7)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00012
분취 HPLC로 1.2 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (7)을 얻었다.
[실험 I-1-8: GL-2 분지형 CH3O-PEG (60k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (8))의 제조]
상기 실험 I- 1-4에서 사용한 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2)을 대신하여, 40 mg의 식 (VII-1-1')로 표시되는 60 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-3):
Figure 112020091917216-pat00013
를 이용한 것 외에는, 상기 실험 I- 1-4에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 2 분지형 알킬아민 연결형 PEG (60k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2 분지형 CH3O-PEG (60k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52))) (8)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00014
분취 HPLC로 0.4 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (8)을 얻었다.
[실험 I-1-9: GL-2 분지형 CH3O-PEG (80k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (9))의 합성]
상기 실험 I-1-5에서 사용한 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2)을 대신하여, 121 mg의 식 (VII-1-1')로 표시되는 80 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-3):
Figure 112020091917216-pat00015
를 이용한 것 외에는, 상기 실험 I-1-5에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 2 분지형 알킬아민 연결형 PEG (80k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2 분지형 CH3O-PEG (60k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52))) (9)를 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00016
분취 HPLC로 1.1 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (9)를 얻었다.
[실험 I-1-10: Lys-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (10))의 합성]
상기 실험 I-1-4에서 사용한 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2)을 대신하여, 42.9 mg의 식 (VI-1-1')초 표시되는 40 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-4):
Figure 112020091917216-pat00017
를 이용한 것 외에는, 상기 실험 I-1-4에서와 같은 절차를 통해 라이신 골격을 갖는 2 분지형 알킬아민 연결형 PEG (40k) 아드레노메둘린 유도체 (Lys-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52))) (10)를 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00018
분취 HPLC로 0.4 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (10)을 얻었다.
[실험 I-1-11: GL-4 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (11))의 합성]
상기　실험 I-1-3에서 사용한 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2)을 대신하여, 93 mg의 식 (VII-2-1')로 표시되는 40 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-5):
Figure 112020091917216-pat00019
을 이용한 것 외에는, 상기 실험 I-1-3에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 4 분지형 알킬아민 연결형 PEG (40k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-4 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52))) (11)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00020
분취 HPLC로 1.1 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (11)을 얻었다.
[실험 I-1-12: Xyl-4 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (12))의 합성]
상기 실험 I- 1-3에서 사용한 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2)을 대신하여, 94 mg의 식 (VIII-1-1')로 표시되는 40 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-6):
Figure 112020091917216-pat00021
을 이용한 것 외에는, 상기 실험 I- 1-3에서와 같은 절차는 자일로스 골격을 갖는 4 분지형 알킬아민 연결형 PEG (40k) 아드레노메둘린 유도체 (Xyl-4 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52))) (12)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00022
분취 HPLC로 1.0 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (12)을 얻었다.
[실험 I-1-13: GL-3 분지형 CH3O-PEG (50k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (13))의 합성]
상기　실험 I-1-3에서 사용한 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2)을 대신하여, 94 mg의 식 (VII-1-2')로 표시되는 50 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-7):
Figure 112020091917216-pat00023
을 이용한 것 외에는, 상기와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 3 분지형 알킬아민 연결형 PEG (50k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-3 분지형 CH3O-PEG (50k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52))) (13)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00024
분취 HPLC로 0.9 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (13)을 얻었다.
[실험 I-1-14: CH3O-PEG (20k)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (14))의 합성]
Fmoc 펩타이드 합성법을 이용하여, Fmoc-Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 Cys16-Cys21 이황화 가교체(디설파이드 브릿지 형태)(이하 "Fmoc-αNH-(h.AM (1-52))" 라고도 기재한다)를 커미션(commission) 합성하였다. 18 mg의 Fmoc-αNH-(h.AM (1-52)) 펩타이드를 1.8 mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켰다. 이 용액에 9 mg의 t-부틸 숙신이미딜 카보네이트 및 6 μL의 디이소프로필에틸아민을 첨가 하였다. 반응 용액을 5 시간 동안 교반 하였다. 얻어진 반응액에 수용성 초산을 더했다. 이 후, 이 용액을 동결 건조했다. 잔류물을 2 mL의 DMSO에 용해시켰다. 얻어진 용액에 0.2 mL의 디에틸아민을 첨가 하였다. 얻어진 용액을 70 분간 교반 하였다. 반응액에 수용성 초산 용액을 첨가하여 희석하였다. 얻어진 용액을 역상 HPLC를 이용하여 분취하여 h.AM (1-52) 펩타이드를 포함하는 분획을 얻었다. 이 분획을 동결 건조하여 Boc기로 보호된 4 개의 리신 잔기를 가지는 10 mg의 h.AM (1-52)의 펩타이드를 백색 분말로 얻었다.
상기 얻어진 펩타이드 2 mg을 2 mL의 DMSO에 용해시켰다. 이 펩타이드 용액에 빙냉하에, 20 kDa의 중량 평균 분자량의 p-니트로페닐에스테르형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-8) (CH3O-(CH2CH2O)n-CO-OC6H4-p-NO2) 15 mg을 첨가 하였다. 또한, 이 펩타이드 용액에 6.5 μL의 0.1 M 트리에틸아민/DMSO 용액을 첨가 하였다. 반응액을 빙냉 하에서 1 시간 방치 하였다. 그 후, 반응액을 실온 24 시간 방치 하였다. 또한, 반응액의 온도를 30 ℃로 올리고 이틀 동안 반응을 계속했다. 반응액을 동결 건조했다. 얻어진 잔사에 1 mL의 트리플루오로아세트산을 빙냉하에 첨가 하였다. 혼합물의 온도를 실온으로 하고, 2 시간 방치했다. 이어서, 증발기를 이용하여 혼합물에서 트리플루오로아세트산을 감압 증류했다. 얻어진 잔사에 4 mL의 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.0)을 첨가하여 용해시켰다. 이 용액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)에서 평형화된 SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) 컬럼(1 mL)에 1 mL/hr의 유속으로 통액했다. 2 mL의 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)을 사용하여 컬럼을 세척했다. 이어 5 mL의, 1 M NaCl 함유 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.0)을 컬럼에 통과하여 용출 분획을 얻었다. 용출 분획에서 우레탄 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (20k)-CO-αNH-(h.AM (1-52))) (14) 및 미반응 h.AM (1-52) 펩타이드가 회수되었다. 이 용출 분획을 한외 여과막 (Amicon Ultra 4, Merck Millipore)을 이용하여 0.2 mL로 농축 하였다. 얻어진 농축액을 Tsk gel G2000SWxL (60 cm, Tosoh Corp.) 컬럼을 연결한 HPLC 시스템 (L-2000; manufactured by Hitachi High-Tech Science Corp.)을 이용하여 정제 및 분취하였다(용출액 : 80 mM 아세트산 나트륨 완충액 pH6 + 80 mM Na2SO4 함유 20 % CH3CN, 유속: 0.5 mL/min). 상기 분취용 HPLC로 250 μg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (14)을 얻었다.
[실험 I-1-15: CH3O-PEG (5k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (35))의 합성]
상기　실험 I-1-3에서 사용한 10 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2)을 대신하여, 5 mg의 5 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)를 이용한 것 외에는, 상기 실험 I-1-3에서와 같은 절차를 수행하여, 알킬아민 연결형 PEG (5k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (5k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (1-52))) (35)를 얻었다. 분취 HPLC로 0.8 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (35)을 얻었다.
[실험 I-1-16: CH3O-PEG (40k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (25))의 합성]
상기　실험 I-1-3에서 사용한 10 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2)을 대신하여, 40 mg의 40 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)를 이용한 것 외에는, 상기 실험 I-1-3에서와 같은 절차를 수행하여, 알킬아민 연결형 PEG (40k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (40k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (1-52))) (25)를 얻었다. 분취 HPLC로 0.6 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (25)을 얻었다.
[실험 I-1-17: GL-2 분지형 CH3O-PEG (20k)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (26))의 합성]
상기　실험 I-1 -14에서 사용한, 20 kDa의 중량 평균 분자량의 p-니트로페닐에스테르형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-8) (CH3O-(CH2CH2O)n-CO-OC6H4-p-NO2)을 대신하여, 25 mg의 식 (XII-1-1')로 표시되는, 20 kDa의 중량 평균 분자량의 p-니트로페닐에스테르형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-9):
Figure 112020091917216-pat00025
을 이용한 것 외에는, 상기 실험 I-1 -14에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 2 분지형 우레탄 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2 분지형 CH3O-PEG (20k)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (26)를 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00026
분취 HPLC로 0.2 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (26)을 얻었다.
[실험 I-1-18: GL-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (27))의 합성]
상기　실험 I-1-14에서 사용한, 20 kDa의 중량 평균 분자량의 p-니트로페닐에스테르형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-8) (CH3O-(CH2CH2O)n-CO-OC6H4-p-NO2)을 대신하여, 35 mg의 식 (XII-1-1')로 표시되는 40 kDa의 중량 평균 분자량의 p-니트로페닐에스테르형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-9):
Figure 112020091917216-pat00027
을 이용한 것 외에는, 상기 실험 I-1-14에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 2 분지형 우레탄 연결형 PEG (40k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (27)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00028
분취 HPLC로 0.2 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (27)을 얻었다.
[실험 I-1-19: GL-4 분지형 CH3O-PEG (40k)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (화합물 (28))의 합성]
상기　실험 I-1-14에서 사용한, 20 kDa의 중량 평균 분자량의 p-니트로페닐에스테르형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-8) (CH3O-(CH2CH2O)n-CO-OC6H4-p-NO2)을 대신하여, 40 mg의 식 (XII-2-1')로 표시되는 40 kDa의 중량 평균 분자량의 p-니트로페닐에스테르형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-10):
Figure 112020091917216-pat00029
를 이용한 것 외에는, 상기 실험 I-1-14에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 4 분지형 우레탄 연결형 PEG (40k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-4 분지형 CH3O-PEG (40k)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (28)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00030
분취 HPLC로 0.2 mg (h.AM (1-52) 환산)의 목적 화합물 (28)을 얻었다.
[실험 I-2: 전체 길이 아드레노메둘린 유도체의 구조 분석]
[실험 I-2-1: 절단 펩타이드의 질량 분석(mass spectrometry)에 의한 PEG 기의 결합 위치의 식별 (1)]
10 μg의 화합물 (3)을 70% 포름산 및 600 μg의 브롬화 시안(BrCN)와 혼합하여 총 양을 500 μL로 하였다. 이 혼합물을 실온에서 밤새 반응시켰다. Sep Pak (Waters Corp.) 컬럼에 클로로포름, 메탄올 및 0.1 % 트리플루오로아세트산 함유 60 % 아세토니트릴 수용액을 각각 1 mL 씩 순차적으로 통액하였고, 컬럼을 세척했다. 이후, 1 mL의 초순수를 적용하여 Sep Pak 컬럼을 평형화했다. 밤새 반응된 브롬화 시안-처리된 반응액(500 μL)에 4,500 μL의 초순수를 첨가하여 5 mL의 희석 반응액을 얻었다. 이 희석 반응액을 상기 컬럼에 통과시켜 절단 펩타이드를 흡착시켰다. 다음, 상기 컬럼에 초순수 및 0.1 % 트리플루오로아세트산 함유 10 % 아세토니트릴 수용액을 각각 1 mL 씩 순차적으로 통액하였고, 컬럼을 세척하여 미흡착 물질을 제거하였다. 마지막으로, 상기 컬럼에 1 mL의 0.1 % 트리플루오로아세트산 함유 60 % 아세토니트릴 수용액을 통액하여 절단 펩타이드를 컬럼에서 용출시켰다.
상기 처리에서 얻은 Sep Pak 컬럼으로부터의 절단 펩타이드의 용출 분획에서 아세토니트릴을 감압 증류하였다. 얻어진 잔류물을 역상 컬럼(ODS-120A TSKgel, Tosoh Corp.)을 이용한 역상 HPLC(RP-HPLC)으로 정제 및 분취시켰다. RP-HPLC의 용출은, 100 % A 액(0.1 % 트리플루오로아세트산 함유 10 % 아세토니트릴 수용액)에서 100 %의 B 액(0.1 % 트리플루오로아세트산 함유 60 % 아세토니트릴 수용액)로 변화시키는 선형 구배 프로그램하에서 60 분 이상 수행되었다. 질량 분석 장치 (AXIMA-confidence, Shimadzu Corp.)를 이용하여, 분취된 절단 펩타이드의 MS 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과, 절단 펩타이드의 분자량은 인간 아드레노메둘린의 6-52 아미노산 잔기에 해당하는 펩타이드의 분자량과 일치하는 것으로 확인되었다((M + Na)+, 계산 값: m/z 5385.935; 측정 값: m/z 5385.9986). 인간 아드레노메둘린에 존재하는 모든 라이신 잔기(N 말단에서 25,36,38 및 46 잔기)는 6-52 아미노산 잔기의 범위 내에 존재한다. 그러므로, 상기 결과로부터, 알킬아민 연결형 PEG (10k) 아드레노메둘린 유도체 (3)의 PEG 기는 N 말단의 α 아미노기에 결합되어 있는 것이 확인되었다.
[실험 I-2-2 : 절단 펩타이드의 질량 분석에 의한 PEG 기의 결합 위치 식별 (2)]
10-40 μg의 화합물 (2)를 2.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 30 % N,N-디메틸포름아미드 및 250 mM Tris-HCl(pH 8.5)을 포함하는 500 μL의 용액에 녹여주고, 상기 용액을 볼텍스 믹서 및 초음파 처리에 의해 교반 및 혼합 하였다. 혼합물에 2.5 mg의 1,4-디티오트레이톨을 첨가하여, 혼합물이 pH 8.0 이상인 것을 확인했다. 혼합물에 질소 가스를 주입하여 초음파 처리를 5 분간 실시했다. 이 혼합물을 37 ℃에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후 반응 혼합물에 차광하에서 6.25 mg의 모노아이도 초산을 가하여 25 ℃에서 30 분간 더 반응시켰다. 그 후, 반응 혼합물에 최종 농도가 1 N이되도록 아세트산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. Sep Pak (Waters Corp.) 컬럼에 클로로포름, 메탄올 및 0.1 % 트리플루오로아세트산 함유 60 % 아세토니트릴 수용액을 각각 1 mL 씩 순차적으로 통액하였고, 컬럼을 세척하였다. 다음, 1 mL의 1 N 아세트산을 통액하여 Sep Pak 컬럼을 평형화했다. 환원 알킬화된 반응액을 컬럼에 통과시켜 반응된 펩타이드를 흡착시켰다. 다음, 컬럼에 1N 초산 및 0.1 % 트리플루오로아세트산 함유 10 % 아세토니트릴 수용액을 각각 1 mL 씩 순차적으로 통액하여 컬럼을 세척하고, 미흡착 물질을 제거하였다. 마지막으로, 컬럼에 1 mL의 0.1 % 트리플루오로아세트산 함유 60 % 아세토니트릴 수용액을 통액하여 환원 알킬화된 펩타이드를 컬럼에서 용출하였다.
상기 처리에서 얻은 Sep Pak 컬럼으로부터의 환원 알킬화된 펩타이드 용출 분획에서 아세토니트릴을 감압 증류시켰다. 얻어진 환원 알킬화 펩타이드를 리실 엔도펩티다제와, 펩타이드:리실 엔도펩티다제 질량 비 20:1이 되도록 혼합했다. 혼합물에 1 M Tris-HCl (pH 8.5)을 가하여 200 μL의 부피 및 50mM Tris-HCl의 최종 농도가 되도록 조제 하였다. 이 혼합물을 37 ℃에서 하룻밤 (16 시간 이상) 방치했다. 얻어진 절단 펩타이드를 역상 컬럼 (ODS-120A TSKgel, Tosoh Corp.)을 이용한 RP-HPLC로 정제 및 분취시켰다. RP-HPLC의 용출은 100 % A 액 (0.1 % 트리플루오로아세트산)을 5 분간 통액 한 다음, 60 분 동안 100 %의 A 액에서 50 %의 B 액(0.1 % 트리플루오로아세트산 함유 60 % 아세토니트릴 수용액)까지 변화시키는 선형 구배 조건에서 통액하고, 100 %의 B 액을 15 분간 통액 시키는 프로그램하에서 실시하였다. 대조적으로, 화합물 (2) 대신에 합성한 표 제품 h.AM (1-52) 펩타이드를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 반응 및 분취 RP-HPLC를 실시하였다. 절단 펩타이드의 RP-HPLC 크로마토그램을 도 1에 나타낸다. 도 1A는 h.AM (1-52) 펩타이드 유래의 절단 펩타이드의 RP-HPLC 크로마토그램을, 도 1B는 화합물 (2) 유래의 절단 펩타이드의 RP-HPLC 크로마토그램을 각각 나타낸다. 도 1A와 같이, h.AM (1-52) 펩타이드 유래의 절단 펩타이드의 RP-HPLC 크로마토그램에서 유지 시간 28.08 분 (이하 '피크 (1)'라고도 기재한다), 36.97 분 (이하 "피크 (2)"라고도 기재한다), 54.53 분 (이하 '피크 (3)"라고도 기재한다) 및 67.52 분 (이하'피크 (4)'라고도 기재)에 4 개의 주요 피크가 검출되었다. 한편, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 화합물 (2) 유래의 절단 펩타이드의 RP-HPLC 크로마토그램에서 유지 시간 28. 69 분 (이하 '피크 (5)"로 기재한다), 36.98 분 (이하'피크 (6)"로 기재한다), 54.57 분 (이하 '피크 (7)"로 기재한다) 및 72.30 분 (이하 '피크 (8)"로 기재)에 4 개의 주요 피크가 검출되었다. 유지 시간의 비교에서 피크 (1) 및 (5) 피크 (2) 및 (6) 및 피크 (3) 및 (7)은 각각 동일한 펩타이드 단편에 대응한다. 피크 (4) 및 (8)은 유지 시간이 다르다. 피크 (8)의 화합물은 피크 (4) 펩타이드 단편에 PEG 기가 결합한 화합물 추측된다.
화합물 (7), (8) 및 (26)을 이용하여 상기와 동일한 방법으로 반응 및 분취 RP-HPLC를 실시했다. 그 결과, 화합물 (2)를 이용한 경우와 마찬가지로 피크 (1), (2) 및 (3)에 해당하는 유지 시간을 갖는 피크가 검출되었다. 또한 피크 (8)과 같이 피크 (4) 펩타이드 단편에 PEG 기가 결합한 화합물에 해당하는 것으로 추측되는 피크도 검출되었다.
질량 분석 장치 (QSTAR Elite, AB Sciex Pte. Ltd)를 이용하여 분취한 절단 펩타이드의 MS 스펙트럼을 측정했다. 인간 아드레노메둘린은 4 개의 리신 잔기 (N 말단 측에서 25,36,38 및 46 잔기)를 가지고있다. 따라서 리실 엔도펩티다제에 의해 수득된 절단 펩타이드는 5개의 펩타이드 단편, 구체적으로는 N 말단 측에서 YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQK (h.AM (1-25)), LAHQIYQFTAK (h.AM (26-36)), DK (h.AM (37-38)), DNVAPRSK (h.AM (39-46)), 및 ISPQGY (h.AM (47-52))의 펩타이드 단편으로 구성된다. 얻어진 MS 스펙트럼에서, 피크 (1) 및 (5)는 h.AM (39-46) 펩타이드 단편에, 피크 (2)와 (6)은 h.AM (47-52) 펩타이드 단편에, 피크 (3) 및 (7)은 h.AM (26-36) 펩타이드 단편에, 피크 (4)는 h.AM (1-25) 펩타이드 단편에 각각 대응하는 것으로 확인되었다. 또한 질량 분석 장치 (autoflex II, Bruker Daltonics K.K.)을 이용하여 피크 (8)의 펩타이드 단편의 MS 스펙트럼을 측정한 결과, 피크 (8)의 화합물은 h.AM (1-52) 펩타이드의 N 말단 펩타이드 단편에 PEG 기가 결합한 화합물 인 것으로 확인되었다. 그러므로, 상기 결과로부터, 화합물 (7), (8) 및 (26)의 PEG 그룹은 모두 N 말단의 α 아미노기에 결합되어있는 것이 확인되었다.
[실험 I-2-3: 아미노산 서열 분석에 의한 PEG 기의 결합 위치 식별]
화합물 (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12) 및 (13)을 단백질 시퀀서(Procise 494 HT Protein Sequencing System, Applied Biosystems, Inc.)를 이용하여 아미노산 서열 분석에 사용하였다. 그 결과, 화합물 모두 인간 아드레노메둘린의 N 말단 아미노산 잔기에 상당하는 아미노산은 검출되지 않았다. 상기 결과로부터, 화합물 (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12) 및 (13)의 PEG 그룹은 모두 N 말단의 α 아미노기에 결합되어있는 것이 확인되었다.
[실험 I-2-4: 이온 교환 HPLC에 의한 PEG 기의 결합 위치 식별]
이온 교환 컬럼 (CM-2SW, Tosoh Corp.)을 이용한 이온 교환 HPLC로, h.AM (1-52) 펩타이드와 인간 아드레노메둘린 6-52 아미노산 잔기에 해당하는 펩타이드를 분리했다. 이온 교환 HPLC의 용출은 0-40 분에 80 %의 A 액 (100 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0) 및 20 %의 B 액 (1 M 황산 나트륨을 함유하는 100 mM 아세트산 나트륨, pH 7.0)에서 20 %의 A 액과 80 %의 B 액까지 변화하는 선형 구배 프로그램하에 실시되었다.
실험 I-2-1에서 Sep Pak 컬럼으로부터 얻어진 화합물 (3) 절단 펩타이드의 용출 분획에서 아세토니트릴을 감압 증류하였고, 잔류물을 상기 조건의 이온 교환 HPLC로 분석하였다. 그 결과, 화합물 (3)에 대한 인간 아드레노메둘린 6-52 아미노산 잔기에 해당하는 펩타이드와 동일한 용출 시간을 갖는 피크를 확인 하였다. 실험 I-2-1과 동일한 방법으로 얻어진 화합물 (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12) (13), (25), (27), (28) 및 (35)의 절단 펩타이드 Sep Pak 컬럼 용출 분획에서 아세토니트릴을 감압 증류하여, 잔류물을 상기 조건의 이온 교환 HPLC로 분석한 결과, 화합물 (3)의 피크와 일치하는 것을 확인했다. 그러므로, 상기 결과로부터, 화합물 (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13 ), (25), (27), (28) 및 (35)의 PEG 그룹은 모두 N 말단의 α 아미노기에 결합되어있는 것이 확인되었다.
[실험 I-2-5: SDS-PAGE에 의한 분자량 분석]
실험서(Experimental Medicine, Suppl., "Handbook for Protein Experiments", Yodosha Co., Ltd., edited by Tadaomi Takenawa and Toshiki Ito)에 따라, 실험 I-1에서 얻은 화합물 (1), (2), (3), (4 ), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (25), (26) (27), (28) 및 (35) (각 200 ng)을 10 %-20 %의 농도 구배를 갖는 폴리아크릴아마이드겔을 이용한 SDS-PAGE에 의해 분리 하였다. 결과는 도 2, 3 및 4에 나타냈다. 도 2 중, 레인 0은 분자량 표준 물질을, 레인 1은 화합물 (3)을, 레인 2는 화합물 (4)을, 레인 3은 화합물 (5)을, 레인 4는 화합물 (6)을, 레인 5 화합물 (7)을, 레인 6은 화합물 (8)을, 레인 7은 화합물 (9)을, 레인 8은 화합물 (10)을, 레인 9는 화합물 (11)을, 레인 10은 화합물 (12)를 각각 나타낸다. 도 3 중, 레인 0은 분자량 표준 물질을, 레인 1은 화합물 (1)을, 레인 2는 화합물 (2)을, 레인 3은 화합물 (13)을, 레인 4는 화합물 (14)을, 레인 5 후술하는 화합물 (15)을, 레인 6은 후술하는 화합물 (16)을, 레인 7은 후술하는 화합물 (17)을 각각 나타낸다. 도 4 중, 레인 0은 분자량 표준 물질을, 레인 1은 화합물 (25)을, 레인 2는 화합물 (26)을, 레인 3은 화합물 (27)을, 레인 4는 화합물 (28)을, 레인 5 후술하는 화합물 (29)을, 레인 6은 후술하는 화합물 (30)을, 레인 7은 후술하는 화합물 (31)을, 레인 8은 후술하는 화합물 (32)을, 레인 9는 후술하는 화합물 (33)을, 레인 10은 후술하는 화합물 (34)을, 레인 11은 화합물 (35)을, 레인 12은 후술하는 화합물 (36)을, 레인 (13)은 후술하는 화합물 (37)을 각각 나타낸다. 분자량 표준 물질은 모두 Precision Plus Protein (TM) Dual Xtra Standards (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용 하였다. 도 2, 3 및 4와 같이, 각 화합물은 목적하는 분자량을 갖는 것으로 확인되었다.
[실험 I-2-6: 겔 여과 HPLC에 의한 회합(association) 확인]
겔 여과 컬럼 (Superdex 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare Japan Corp.)을 이용한 겔 여과 HPLC로, 아드레노메둘린 유도체 분자의 회합을 확인했다. 실험 I-1에서 얻은 화합물 (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (25), (27), (28) 및 (35) (각 50 μg)을 컬럼에 첨가 하였다. 용출액 (100 mM 아세트산나트륨 및 100 mM 황산나트륨, pH 6.0)을 0.75 mL/분의 유속으로 컬럼에 통과시켰다. 얻어진 겔 여과 크로마토그램에서 각 화합물은 분자량에 따른 유지 시간을 갖는 단일 피크를 보여 주었다. 상기 결과에서 각 아드레노메둘린 유도체 분자는 회합하지 않고 단량체로 존재하는 것이 확인되었다. 상기 겔 여과 크로마토그램에서 각 화합물의 머무름 시간(Retention time)을 표 1에 나타낸다.
아드레노메둘린 유도체 머무름 시간(Retention time)
화합물 (3) 18.6
화합물 (4) 16.2
화합물 (5) 14.6
화합물 (6) 16.4
화합물 (7) 13.7
화합물 (8) 12.9
화합물 (9) 11.9
화합물 (10) 13.8
화합물 (11) 14.1
화합물 (12) 14.4
화합물 (13) 13.3
화합물 (25) 13.9
화합물 (27) 13.9
화합물 (28) 14.5
화합물 (35) 21.2
<실험 II: N 말단 결실 아드레노메둘린 유도체의 제조>
[실험 II-1: N 말단 결실 아드레노메둘린 유도체의 합성]
[실험 II-1-1: CH3O-PEG (5k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM (6-52)) (화합물 (15))의 합성]
공지 문헌(Kubo, K et al., "Biological properties of adrenomedullin conjugated with polyethylene glycol.", Peptides, 2014, vol. 57, p. 118-21)에 기재된 방법에 따라 N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르형의 5 kDa의 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-1) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)5-CO-O-NHS)를 이용하여 인간 아드레노메둘린 6-52 아미노산 잔기에 해당하는 펩타이드인 H-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 Cys16-Cys21 이황화 가교체 (이하 "h.AM (6- 52)"라고도 기재한다)의 N 말단 아미노기에 아미드 결합을 통해 5 kDa의 중량 평균 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 기 (PEG (5k))를 연결하여, 아미드 결합형 PEG (5k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (5k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM (6-52))) (15)를 합성 하였다.
[실험 II-1-2: CH3O-PEG (5k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM (11-52)) (화합물 (16))의 합성]
실험 II- 1-1과 동일한 방법에 따라 N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르형의 5 kDa의 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-1) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)5-CO-O-NHS)를 이용하여 인간 아드레노메둘린의 11-52 아미노산 잔기에 해당하는 펩타이드인 H-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 Cys16-Cys21이황화 가교체 (이하 "h.AM (11-52)"모두 기재한다)의 N 말단 아미노기에 아미드 결합을 통해 5 kDa의 중량 평균 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 기 (PEG (5k))를 연결하여 아미드 결합형 PEG (5k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (5k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM (11-52))) (16)를 합성하였다.
[실험 II-1-3: CH3O-PEG (5k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM (16-52)) (화합물 (17))의 합성]
실험 II- 1-1과 동일한 방법에 따라 N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르형의 5 kDa의 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-1) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)5-CO-O-NHS)를 이용하여 인간 아드레노메둘린 16-52 아미노산 잔기에 해당하는 펩타이드인 H-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2 의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 Cys16-Cys21이황화 가교체 (이하 "h.AM (16-52)"모두 기재한다)의 N 말단 아미노기에 아미드 결합을 통해 5 kDa의 중량 평균 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 기 (PEG (5k))를 연결하여 아미드 결합형 PEG (5k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (5k)-(CH2)5-CO-αNH-(h.AM (16-52))) (17)를 합성하였다.
[실험 II-1-4: CH3O-PEG (5k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (6-52)) (화합물 (18))의 합성]
0.4 mg 의 h.AM (6-52) 펩타이드를 100 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.5)에 용해하여 0.5 mL의 펩타이드 용액을 얻었다. 이 펩타이드 용액에 빙냉하에, 2 mg의 알데히드형의 5 kDa의 중량 평균 분자량의 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)를 첨가 하였다. 또한,이 펩타이드 용액에 NaCNBH 320 mM의 최종 농도가되도록 첨가 하였다. 반응액을 4 ℃ 하에서 24 시간 방치 하였다. 얻어진 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)를 사용하여 5 배 희석했다. 희석 된 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)에서 평형화된 SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) 컬럼 (2 mL)에 2 mL/hr의 유속으로 통액했다. 2 mL의 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)을 사용하여 컬럼을 세척했다. 이어 5 mL의 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.0)을 컬럼에 통과하여 용출 분획을 얻었다. 용출 분획에 알킬아민 연결형 PEG (5k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (5k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (6-52))) (18 ) 및 미반응 h.AM (6-52) 펩타이드가 회수되었다. 이 용출 분획을 한외 여과막 (Amicon Ultra 4, Merck Millipore)를 이용하여 0.2 mL로 농축 하였다. 얻어진 농축액을 Tsk gel G2000SWxL (60 cm, Tosoh Corp.) 컬럼을 연결한 HPLC 시스템 (L-2000; manufactured by Hitachi High-Tech Science Corp.)를 이용하여 정제 및 분취하였다(용출액 : 80 mM 아세트산 나트륨 완충액 pH6 + 80 mM Na2SO4를 함유하는 20 % CH3CN 유속: 0.5 mL/min). 상기 분취용 HPLC로 0.12 mg (h.AM (6-52) 환산)의 목적 화합물 (18)을 얻었다.
[실험 II-1-5 : CH3O-PEG (5k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (11-52)) (화합물 (19))의 합성]
0.44 mg 의 h.AM (11-52) 펩타이드를 100 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.5에 용해하여 0.5 mL의 펩타이드 용액을 얻었다. 이 펩타이드 용액에 빙냉 하에서 2.5 mg의 알데히드형의 5 kDa의 중량 평균 분자량의 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)를 첨가 하였다. 또한,이 펩타이드 용액에 NaCNBH 320 mM의 최종 농도가되도록 첨가 하였다. 반응액을 4 ℃ 하에서 24 시간 방치 하였다. 얻어진 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액 pH4.0를 사용하여 5 배 희석했다. 희석 된 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)에서 평형화된 SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) 컬럼 (2 mL)에 2 mL/hr의 유속으로 통액했다. 2 mL의 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)을 사용하여 컬럼을 세척했다. 이어 5 mL의 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.0)을 컬럼에 통과하여 용출 분획을 얻었다. 용출 분획에 알킬아민 연결형 PEG (5k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (5k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (11-52))) (19 ) 및 미반응 h.AM (11-52) 펩타이드가 회수되었다. 이 용출 분획을 한외 여과막 (Amicon Ultra 4, Merck Millipore)을 이용하여 0.2 mL에 농축 하였다. 얻어진 농축액을 Tsk gel G2000SWxL (60 cm, Tosoh Corp.) 컬럼을 연결한 HPLC 시스템 (L-2000; manufactured by Hitachi High-Tech Science Corp.)를 이용하여 정제 및 분취하였다(용출액: 80 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH6 + 80 mM Na2SO4를 함유하는 20 % CH3CN 유속: 0.5 mL/min). 상기 분취용 HPLC로 0.1 mg (h.AM (11-52) 환산)의 목적 화합물 (19)을 얻었다.
[실험 II-1-6: CH3O-PEG (5k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (16-52)) (화합물 (20))의 합성]
0.46 mg 의 h.AM (16-52) 펩타이드를 100 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.5)에 용해하여 0.5 mL의 펩타이드 용액을 얻었다. 이 펩타이드 용액에 빙냉하에 3 mg의 알데히드형의 5 kDa의 중량 평균 분자량의 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)를 첨가 하였다. 또한,이 펩타이드 용액에 NaCNBH 320 mM의 최종 농도가되도록 첨가 하였다. 반응액을 4 ℃ 하에서 24 시간 방치 하였다. 얻어진 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)을 사용하여 5 배 희석했다. 희석 된 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0에서 평형화 된 SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) 컬럼 (2 mL)에 2 mL/hr의 유속으로 통액했다. 2 mL의 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)을 사용하여 컬럼을 세척했다. 이어 5 mL의 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.0)를 컬럼에 통과하여 용출 분획을 얻었다. 용출 분획에 알킬아민 연결형 PEG (5k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (5k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (16-52))) (20 ) 및 미반응 h.AM (16-52) 펩타이드가 회수되었다. 이 용출 분획을 한외 여과막 (Amicon Ultra 4, Merck Millipore)을 이용하여 0.2 mL로 농축 하였다. 얻어진 농축액을 Tsk gel G2000SWxL (60 cm, Tosoh Corp.) 컬럼을 연결한 HPLC 시스템 (L-2000; manufactured by Hitachi High-Tech Science Corp.)를 이용하여 정제 및 분취하였다(용출액 : 80 mM 아세트산 나트륨 완충액 pH6 + 80 mM Na2SO4를 함유하는 20 % CH3CN 유속 : 0.5 mL/min). 분취용 HPLC로 0.15 mg (h.AM (16-52) 환산)의 목적 화합물 (20)을 얻었다.
[실험 II-1-7: CH3O-PEG (20k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (6-52)) (화합물 (21))의 합성]
0.22 mg 의 h.AM (6-52) 펩타이드를 100 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.5)에 용해하여 0.2 mL의 펩타이드 용액을 얻었다. 이 펩타이드 용액에 빙냉 하에서 4.1 mg의 알데히드형 20 kDa의 중량 평균 분자량의 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)를 첨가 하였다. 또한, 이 펩타이드 용액에 NaCNBH 320 mM의 최종 농도가되도록 첨가 하였다. 반응액을 4 ℃ 하에서 24 시간 방치 하였다. 얻어진 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액 pH4.0를 사용하여 5 배 희석했다. 희석 된 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0에서 평형화 된 SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) 컬럼(2 mL)에 2 mL/hr의 유속으로 통액했다. 2 mL의 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)를 사용하여 컬럼을 세척했다. 이어 5 mL의 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.0)를 컬럼에 통과하여 용출 분획을 얻었다. 용출 분획에 알킬아민 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (20k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (6-52))) (21) 및 미반응 h.AM (6-52) 펩타이드가 회수되었다. 이 용출 분획을 한외 여과막 (Amicon Ultra 4, Merck Millipore)를 이용하여 0.2 mL에 농축 하였다. 얻어진 농축액을 Tsk gel G2000SWxL (60 cm, Tosoh Corp.) 컬럼을 연결한 HPLC 시스템 (L-2000; manufactured by Hitachi High-Tech Science Corp.)를 이용하여 정제 및 분취하였다(용출액 : 80 mM 아세트산 나트륨 완충액, pH6 + 80 mM Na2SO4를 함유하는 20 % CH3CN 유속 : 0.5 mL/min). 분취용 HPLC로 0.1 mg (h.AM (6-52) 환산)의 목적 화합물 (21)을 얻었다.
[실험 II-1-8: CH3O-PEG (20k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (11-52)) (화합물 (22))의 합성]
0.22 mg 의 h.AM (11-52) 펩타이드를 100 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.5)에 용해하여 0.2 mL의 펩타이드 용액을 얻었다. 이 펩타이드 용액에 빙냉 하에서 4.6 mg의 알데히드형 20 kDa의 중량 평균 분자량의 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)를 첨가 하였다. 또한,이 펩타이드 용액에 NaCNBH 320 mM의 최종 농도가되도록 첨가 하였다. 반응액을 4 ℃ 하에서 24 시간 방치 하였다. 얻어진 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)를 사용하여 5 배 희석했다. 희석 된 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)에서 평형화 된 SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) 컬럼 (2 mL)에 2 mL/hr의 유속으로 통액했다. 2 mL의 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)를 사용하여 컬럼을 세척했다. 이어 5 mL의 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.0)를 컬럼에 통과하여 용출 분획을 얻었다. 용출 분획에 알킬아민 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (20k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (11-52))) (22) 및 미반응 h.AM (11-52) 펩타이드가 회수되었다. 이 용출 분획을 한외 여과막 (Amicon Ultra 4, Merck Millipore)를 이용하여 0.2 mL에 농축 하였다. 얻어진 농축액을 Tsk gel G2000SWxL (60 cm, Tosoh Corp.) 컬럼을 연결한 HPLC 시스템 (L-2000; manufactured by Hitachi High-Tech Science Corp.)를 이용하여 정제 및 분취하였다(용출액 : 80 mM 아세트산 나트륨 완충액 pH6 + 80 mM Na2SO4를 함유하는 20 % CH3CN 유속 : 0.5 mL/min). 분취용 HPLC로 0.1 mg (h.AM (11-52) 환산)의 목적 화합물 (22)을 얻었다.
[실험 II-1-9: CH3O-PEG (20k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (16-52)) (화합물 (23))의 합성]
0.22 mg 의 h.AM (16-52) 펩타이드를 100 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.5)에 용해하여 0.2 mL의 펩타이드 용액을 얻었다. 이 펩타이드 용액에 빙냉 하에서 5.2 mg의 알데히드형 20 kDa의 중량 평균 분자량의 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) (CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2)2-CHO)를 첨가 하였다. 또한,이 펩타이드 용액에 NaCNBH 320 mM의 최종 농도가되도록 첨가 하였다. 반응액을 4 ℃ 하에서 24 시간 방치 하였다. 얻어진 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)를 사용하여 5 배 희석했다. 희석 된 반응액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)에서 평형화 된 SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) 컬럼 (2 mL)에 2 mL/hr의 유속으로 통액했다. 2 mL의 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH4.0)를 사용하여 컬럼을 세척했다. 이어 5 mL의 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH5.0)를 컬럼에 통과하여 용출 분획을 얻었다. 용출 분획에 알킬아민 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 (CH3O-PEG (20k)-(CH2)2-CH2-αNH-(h.AM (16-52))) (23) 및 미반응 h.AM (16-52) 펩타이드가 회수되었다. 이 용출 분획을 한외 여과막 (Amicon Ultra 4, Merck Millipore)를 이용하여 0.2 mL에 농축 하였다. 얻어진 농축액을 Tsk gel G2000SWxL (60 cm, Tosoh Corp.) 컬럼을 연결한 HPLC 시스템 (L-2000; manufactured by Hitachi High-Tech Science Corp.)를 이용하여 정제 및 분취하였다(용출액 : 80 mM 아세트산 나트륨 완충액, pH6 + 80 mM Na2SO4를 함유하는 20 % CH3CN 유속 : 0.5 mL/min). 분취용 HPLC로 0.1 mg (h.AM (16-52) 환산)의 목적 화합물 (23)을 얻었다.
[실험 II-1-10: GL-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (16-52)) (화합물 (24))의 합성]
상기 실험 II-1-6에서 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) 대신에, 20 mg의 식 (VII-1-1')로 표시되는 40 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-3):
Figure 112020091917216-pat00031
를 이용한 것 외에는, 상기 실험 II-1-6에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 2 분지형 알킬아민 연결형 PEG (40k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (16-52))) (24)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00032
분취 HPLC로 0.2 mg (h.AM (16-52) 환산)의 목적 화합물 (24)을 얻었다.
[실험 II-1-11: GL-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (6-52)) (화합물 (29))의 합성]
상기　실험 II-1-7에서 사용한 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) 대신에, 20 mg의 식 (VII-1-1')로 표시되는 40 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-3):
Figure 112020091917216-pat00033
를 이용한 것 외에는, 상기 실험 II-1-7에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 2 분지형 알킬아민 연결형 PEG (40k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (6-52))) (29)를 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00034
분취 HPLC로 0.15 mg (h.AM (6-52) 환산)의 목적 화합물 (29)을 얻었다.
[실험 II-1-12: GL-2 분지형 CH3O-PEG (20k)-CO-αNH-(h.AM (6-52)) (화합물 (30))의 합성]
Fmoc 펩타이드 합성법을 이용하여 Fmoc-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 Cys16-Cys21 이황화 가교체 (이하 "Fmoc-αNH-(h.AM (6-52))"라고도 기재한다)를 합성 하였다. 17 mg의 Fmoc-αNH-(h.AM (6-52))펩타이드를 1.8 mL의 DMSO에 용해시켰다. 이 용액에 9 mg의 t-부틸숙신이미딜 카보네이트 및 6 μL의 디이소프로필에틸아민을 첨가 하였다. 반응액을 5 시간 동안 교반 하였다. 얻어진 반응 용액에 초산 수용액을 더했다. 그 후,이 용액을 동결 건조했다. 잔류물을 2 mL의 DMSO에 용해시켰다. 얻어진 용액에 0.2 mL의 디에틸아민을 첨가 하였다. 얻어진 용액을 70 분간 교반 하였다. 반응 용액에 초산 수용액을 첨가하여 희석 하였다. 얻어진 용액을 역상 HPLC를 이용하여 분취하여 h.AM (6-52) 펩타이드를 포함하는 분획을 얻었다. 이 분획을 동결 건조하여 Boc기로 보호된 4 개의 리신 잔기를 가지는 9 mg의 h.AM (6-52)이 펩타이드를 백색 분말로 얻었다.
상기 얻어진 펩타이드 2 mg을 2 mL의 DMSO에 용해시켰다. 이 펩타이드 용액에 빙냉하에 15 mg 식 (XII-1-1')로 표시되는 20 kDa의 중량 평균 분자량의 p-니트로페닐에스테르형 GL2 분지형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-9):
Figure 112020091917216-pat00035
를 첨가 하였다. 또한, 이 펩타이드 용액에 6.5 μL의 0.1 M 트리에틸아민/DMSO 용액을 첨가 하였다. 반응액을 빙냉 하에서 1 시간 방치 하였다. 그 후, 반응액을 실온 24 시간 방치 하였다. 또한, 반응액의 온도를 30 ℃로 올리고 이틀 반응을 계속했다. 반응액을 동결 건조했다. 얼음 냉하에 얻어진 잔사에 1 mL의 트리플루오로아세트산을 첨가 하였다. 혼합물의 온도를 실온 2 시간 방치했다. 이어서, 증발기를 이용하여 혼합물에서 트리플루오로아세트산을 감압 증류했다. 얻어진 잔사에 4 mL의 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.0)을 첨가하여 용해시켰다. 이 용액을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.0)에서 평형화 된 SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) 컬럼 (1 mL)에 1 mL/hr의 유속으로 통액했다. 2 mL의 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.0)을 사용하여 컬럼을 세척했다. 이어 5 mL의 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.0)을 컬럼에 통과하여 용출 분획을 얻었다. 용출 분획에 글리세롤 골격을 갖는 2 분지형 우레탄 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2 분지형 CH3O-PEG (20k)-CO-αNH-(h.AM (6-52) )) (30):
Figure 112020091917216-pat00036
및 미반응 h.AM (6-52) 펩타이드가 회수되었다. 이 용출 분획을 한외 여과막 (Amicon Ultra 4, Merck Millipore)를 이용하여 0.2 mL에 농축 하였다. 얻어진 농축액을 Tsk gel G2000SWxL (60 cm, Tosoh Corp.) 컬럼을 연결한 HPLC 시스템 (L-2000; manufactured by Hitachi High-Tech Science Corp.)를 이용하여 정제 및 분취하였다(용출액 : 80 mM 아세트산 나트륨 완충액 pH6 + 80 mM Na2SO4를 함유하는 20 % CH3CN 유속 : 0.5 mL/min). 분취용 HPLC로 0.2 mg (h.AM (6-52) 환산)의 목적 화합물 (30)을 얻었다.
[실험 II-1-13 : GL-2 분지형 CH3O-PEG (20k)-CO-αNH-(h.AM (11-52)) (화합물 (31))의 합성]
Fmoc 펩타이드 합성법을 이용하여 Fmoc-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 Cys16-Cys21 이황화 가교체 (이하 "Fmoc-αNH-(h.AM (11-52))"라고도 기재한다)를 합성 하였다. Fmoc-αNH-(h.AM (11-52))를 이용하여 실험 II-1-12과 같은 순서에 의해, Boc기 로 보호된 4 개의 리신을 가지는 6 mg의 h.AM (11-52)의 펩타이드를 백색 분말로 얻었다.
실험 II-1-12에서, h.AM (6-52) 펩타이드를 상기에서 얻어진 h.AM (11-52) 펩타이드로 변경하고, 또한 20 mg 식 (XII-1-1')로 표시되는 20 kDa의 중량 평균 분자량의 p-니트로페닐에스테르 형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-9):
Figure 112020091917216-pat00037
을 이용한 것 외에는, 상기 실험 II-1-12에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 2 분지형 우레탄 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2 분지형 CH3O-PEG (20k)-CO-αNH-(h.AM (11-52))) (31)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00038
분취 HPLC로 0.2 mg (h.AM (11-52) 환산)의 목적 화합물 (31)을 얻었다.
[실험 II-1-14: GL-2 분지형 CH3O-PEG (20k)-CO-αNH-(h.AM (16-52)) (화합물 (32))의 합성]
　Fmoc 펩타이드 합성법을 이용하여 Fmoc-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 Cys16-Cys21 이황화 가교체 (이하, "Fmoc-αNH-(h.AM (16-52))"라고도 기재한다)를 합성 하였다. Fmoc-αNH-(h.AM (16-52))를 이용하여 실험 II-1-12과 같은 순서에 의해, Boc 기로 보호된 4 개의 리신 잔기를 가지는 6 mg의 h.AM (16-52)의 펩타이드를 백색 분말로 얻었다.
실험 II-1-12에서, h.AM (6-52) 펩타이드를 상기에서 얻어진 h.AM (16-52) 펩타이드로 변경하고, 또한 15 mg 식 (XII-1-1')로 표시되는 20 kDa의 중량 평균 분자량의 p-니트로페닐에스테르 형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-9):
Figure 112020091917216-pat00039
을 이용한 것 외에는, 상기와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 2 분지형 우레탄 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2 분지형 CH3O-PEG (20k)-CO-αNH-(h.AM (16-52))) (32)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00040
을 얻었다. 분취 HPLC로 0.2 mg (h.AM (16-52) 환산)의 목적 화합물 (32)을 얻었다.
[실험 II-1-15: GL-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CO-αNH-(h.AM (16-52)) (화합물 (33))의 합성]
상기 실험 II-1-14에서 p-니트로페닐에스테르 형 20 kDa의 중량 평균 분자량의 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-9) 대신에, 32 mg의 식 (XII-1-1')로 표시되는 20 kDa의 중량 평균 분자량의 p-니트로페닐에스테르 형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-9):
Figure 112020091917216-pat00041
을 이용한 것 외에는, 상기 실험 II-1-14에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 2 분지형 우레탄 연결형 PEG (40k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CO-αNH-(h.AM (16-52)) (33)를 얻었다. 분취용 HPLC로 0.15 mg (h.AM (16-52) 환산)의 목적 화합물 (33)을 얻었다.
[실험 II-1-16: GL-4 분지형 CH3O-PEG (40k)-CO-αNH-(h.AM (6-52)) (화합물 (34))의 합성]
상기　실험 II-1 -12에서 p-니트로페닐에스테르 형 20 kDa의 중량 평균 분자량의 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-9)을 대신하여, 20 mg의 식 (XII-2-1')로 표시되는 40 kDa의 중량 평균 분자량의 p-니트로페닐에스테르 형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-10):
Figure 112020091917216-pat00042
를 이용한 것 외에는, 상기 실험 II-1 -12에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 4 분지형 우레탄 연결형 PEG (40k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-4 분지형 CH3O-PEG (40k)-CO-αNH-(h.AM (6-52)) (34)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00043
분취 HPLC로 0.15 mg (h.AM (6-52) 환산)의 목적 화합물 (34)을 얻었다.
[실험 II-2: N 말단 결실 아드레노메둘린 유도체의 구조 분석]
[실험 II-2-1: 절단 펩타이드의 질량 분석에 의한 PEG 기의 결합 위치 식별]
실험 I-2-2과 동일한 방법으로, 화합물 (18), (19), (20), (21), (22), (23), (24), (29), (30), (31), (32), (33) 및 (34)의 리실 엔도펩티다제에 의한 절단 펩타이드를 얻었다. 얻어진 절단 펩타이드를 실험 I-2-2과 동일한 방법으로, RP-HPLC로 정제 및 분취했다. 그 결과, 모든 화합물 유래의 절단 펩타이드의 RP-HPLC 크로마토그램에서 도 1 피크 (5), (6), (7) 및 (8)에 대응하는 피크가 검출되었다. 실험 I-2-2의 결과에서 피크 (1) 및 (5) h.AM (39-46) 펩타이드 단편에, 피크 (2)와 (6)은 h.AM (47-52)의 펩타이드 단편에, 피크 (3) 및 (7)은 h.AM (26-36) 펩타이드 단편에, 피크 (4)는 h.AM (1-25) 펩타이드 단편에, 피크 (8)은 h .AM (1-52) 펩타이드의 N 말단 펩타이드 단편에, PEG 기가 결합한 화합물에 각각 대응하는 것으로 확인되었다. 그러므로, 상기 결과로부터, 화합물 (18), (19), (20), (21), (22), (23), (24), (29), (30), (31), (32), (33) 및 (34)의 PEG 그룹은 모두 N 말단의 α 아미노기에 결합되어있는 것이 확인되었다.
[실험 II-2-2: 아미노산 서열 분석에 의한 PEG 기의 결합 위치 식별]
화합물 (18), (21), (22), (23), (24), (31), (33) 및 (34)을 단백질 시퀀서 (Procise 494 HT Protein Sequencing System, Applied Biosystems, Inc.)를 이용하여 아미노산 서열 분석에 사용하였다. 그 결과, 두 화합물 모두 인간 아드레노메둘린의 N 말단 아미노산 잔기에 해당하는 아미노산은 검출되지 않았다. 상기 결과로부터, 화합물 (18), (21), (22), (23), (24), (31), (33) 및 (34)의 PEG 그룹은 모두 N 말단의 α 아미노기에 결합되어있는 것이 확인되었다.
[실험 II-2-3: SDS-PAGE에 의한 분자량 분석]
실험서(Experimental Medicine, Suppl., "Handbook for Protein Experiments", Yodosha Co., Ltd., edited by Tadaomi Takenawa and Toshiki Ito)에 따라 실험 II-1에서 얻은 화합물 (15), (16), (17), (18 ), (19), (20), (21), (22), (23), (24), (29), (30), (31), (32), (33) 및 (34) (각 200 ng)을 10 %-20 %의 농도 구배를 갖는 폴리아크릴아마이드 겔을 이용한 SDS-PAGE에 의해 분리 하였다. 결과를 도 3, 4 및 5에 나타냈다. 도 3 중, 레인 0은 분자량 표준 물질을, 레인 1은 전술한 화합물 (1)을, 레인 2는 전술한 화합물 (2)을, 레인 3은 전술한 화합물 (13)을, 레인 4는 전술한 화합물 (14)을, 레인 5는 화합물 (15)을, 레인 6은 화합물 (16)을, 레인 7은 화합물 (17)을 각각 나타낸다. 도 4 중, 레인 0은 분자량 표준 물질을, 레인 1은 전술한 화합물 (25)을, 레인 2는 전술한 화합물 (26)을, 레인 3은 전술한 화합물 (27)을, 레인 4는 전술한 화합물 (28)을, 레인 5는 화합물 (29)을, 레인 6은 화합물 (30)을, 레인 7은 화합물 (31)을, 레인 8은 화합물 (32)을, 레인 9는 화합물 (33)을, 레인 10은 화합물 (34)을, 레인 11은 전술한 화합물 (35)을, 레인 12은 후술하는 화합물 (36)을, 레인 (13)은 후술하는 화합물 (37)을 각각 나타낸다. 도 5 중, 레인 0과 1은 분자량 표준 물질을, 레인 2는 화합물 (18)을, 레인 3은 화합물 (19)을, 레인 4는 화합물 (20)을, 레인 5는 화합물 (21)을, 레인 6은 화합물 (22)을, 레인 7은 화합물 (23)을, 레인 8은 화합물 (24)을 각각 나타낸다. 분자량 표준 물질은 모두 Precision Plus Protein (TM) Dual Xtra Standards (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용 하였다. 도 3, 4 및 5와 같이 각 화합물은 목적하는 분자량을 갖는 것이 확인되었다.
[실험 II-2-4 : 겔 여과 HPLC에 의한 회합(association) 확인]
겔 여과 컬럼 (Superdex 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare Japan Corp.)을 이용한 겔 여과 HPLC로, 아드레노메둘린 유도체 분자의 회합을 확인했다. 실험 II-1에서 얻은 화합물 (18), (21), (22), (23), (24), (29) 및 (34) (각 50 μg)을 컬럼에 첨가 하였다. 용출액 (100 mM 아세트산 나트륨 및 100 mM 황산 나트륨, pH 6.0)을 0.75 mL/분의 유속으로 컬럼에 통과했다. 얻어진 겔 여과 크로마토그램에서 각 화합물은 분자량에 따른 유지 시간을 갖는 단일 피크를 보여 주었다. 상기 결과에서 각 아드레노메둘린 유도체 분자는 회합하지 않고 단량체로 존재하는 것이 확인되었다. 상기 겔 여과 크로마토그램에서 각 화합물의 유지 시간을 표 2에 나타냈다.
아드레노메둘린 유도체 머무름 시간(Retention time)
화합물 (18) 21.4
화합물 (21) 16.2
화합물 (22) 16.2
화합물 (23) 16.2
화합물 (24) 13.9
화합물 (29) 13.9
화합물 (34) 14.5
<실험 III: C 말단 글리신 부가 아드레노메둘린 유도체의 제조>
[실험 III-1: C 말단 글리신 부가 아드레노메둘린 유도체의 합성]
[실험 III-1-1: GL-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52))-Gly (화합물 (36))의 합성]
상기 실험 I-1-5에서 h.AM (1-52) 펩타이드를 h.AM (1 -52) -Gly 펩타이드로 변경하고, CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) 대신에, 80 mg의 식 (VII-1-1')로 표시되는 40 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-3):
Figure 112020091917216-pat00044
를 이용한 것 외에는, 상기 실험 I-1-5에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 2 분지형 알킬아민 연결형 PEG (40k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2 분지형 CH3O-PEG (40k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52) -Gly)) (36)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00045
분취 HPLC로 0.8 mg (h.AM (1-52) -Gly 환산)의 목적 화합물 (36)을 얻었다.
[실험 III-1-2: GL-2 분지형 CH3O-PEG (60k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52))-Gly (화합물 (37))의 합성]
상기 실험 I-1-5에서 h.AM (1-52) 펩타이드를 h.AM (1-52) -Gly 펩타이드로 변경하고, CH3O-PEG 화 시약 (PEG-2) 대신에, 80 mg 식 (VII-1-1')로 표시되는 60 kDa의 중량 평균 분자량의 알데히드형 CH3O-PEG 화 시약 (PEG-3):
Figure 112020091917216-pat00046
를 이용한 것 외에는, 상기 실험 I-1-5에서와 같은 절차를 통해 글리세롤 골격을 갖는 2 분지형 알킬아민 연결형 PEG (60k) 아드레노메둘린 유도체 (GL-2 분지형 CH3O-PEG (60k)-CH2-αNH-(h.AM (1-52) -Gly)) (37)을 얻었다:
Figure 112020091917216-pat00047
분취 HPLC로 0.7 mg (h.AM (1-52) -Gly 환산)의 목적 화합물 (37)을 얻었다.
[실험 III-2: C 말단 글리신 부가 아드레노메둘린 유도체의 구조 분석]
[실험 III-2-1: 아미노산 서열 분석에 의한 PEG 기의 결합 위치 식별]
화합물 (36) 및 (37)을 단백질 시퀀서 (Procise 494 HT Protein Sequencing System, Applied Biosystems, Inc.)를 이용하여 아미노산 서열 분석에 사용 하였다. 그 결과, 두 화합물 모두 인간 아드레노메둘린의 N 말단 아미노산 잔기에 상당하는 아미노산은 검출되지 않았다. 상기 결과로부터, 화합물 (36) 및 (37)의 PEG 기는 모두 N 말단의 α 아미노기에 결합되어있는 것이 확인되었다.
<실험 IV : 아드레노메둘린 유도체의 사용 예>
[실험 IV-1 : 아드레노메둘린 유도체에 의한 세포 내 cAMP 농도 상승 작용]
아드레노메둘린 (AM)의 생리 작용은 세포 내 cAMP의 농도의 상승을 통해 발현되는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1 참조). 이에, AM 수용체를 발현시키는 배양 세포주 (HEK293 세포주)에 실험 I-1 실험 II-1 및 실험 III-1에서 제조한 각 화합물 또는 전체 길이 AM, N 말단 결실 AM 또는 C 말단 글리신 부가 AM를 첨가하여 세포 내 cAMP의 생산량을 측정했다. 0.5 mM의 IBMX의 존재하에 합류 HEK293 세포(세포수: 5 X 104)에 10-8 mol/L의 각 화합물 또는 h.AM (1-52), h.AM (6-52), h.AM (11-52 ), h.AM (16-52) 또는 h.AM (1-52)-Gly을 첨가하여 15 분 동안 배양했다. 그 후, cAMP 측정용 ELISA 키트(GE Healthcare Japan Corp., #RPN2251)를 이용하여 각 시험군의 HEK293 세포에서 세포 내 cAMP 농도를 측정했다. AM 수용체 발현 배양 세포에서 아드레노메둘린 유도체에 의한 세포 내 cAMP 농도 상승 작용을 표 3에 나타냈다.
화합물 세포 내 cAMP 농도 상승 작용(%)1)
(1) 81
(2) 67
(3) 101
(4) 100
(5) 100
(6) 91
(7) 96
(8) 99
(9) 94
(10) 102
(11) 95
(12) 81
(13) 80
(14) 100
(15) 101*)
(16) 16**)
(17) 9***)
(18) 90
(19) 80
(20) 39
(21) 98*)
(22) 97
(23) 97
(24) 93***)
(25) 101
(26) 99
(27) 87
(28) 85
(29) 77
(30) 99
(31) 104
(32) 96
(33) 61
(34) 83
(35) 91
(36) 96****)
(37) 91****)
1) h.AM (1-52)의 첨가에 의해 얻어진 세포 내 cAMP 농도에 대한, 각 화합물의 첨가에 의해 얻어진 세포 내 cAMP 농도의 백분율 (%)*) hAM (6-52)의 첨가에 의해 얻어진 세포 내 cAMP 농도에 대한, 각 화합물의 첨가에 의해 얻어진 세포 내 cAMP 농도의 백분율 (%)
**) h.AM (11-52)의 첨가에 의해 얻어진 세포 내 cAMP 농도에 대한, 각 화합물의 첨가에 의해 얻어진 세포 내 cAMP 농도의 백분율 (%)
***) h.AM (16-52)의 첨가에 의해 얻어진 세포 내 cAMP 농도에 대한, 각 화합물의 첨가에 의해 얻어진 세포 내 cAMP 농도의 백분율 (%)
****) h.AM (1-52)-Gly의 첨가에 의해 얻어진 세포 내 cAMP 농도에 대한, 각 화합물의 첨가에 의해 얻어진 세포 내 cAMP 농도의 백분율 (%)
표 3에 나타낸 바와 같이 시험한 아드레노메둘린 유도체는 모두 PEG기를 연결하지 않은, 전체 길이 AM, N 말단 결실 AM, 또는 C 말단 글리신 부가 AM과 같은 정도의 세포 내 cAMP 농도 상승 작용을 나타냈다. 그러므로, PEG기를 연결한 아드레노메둘린 유도체는, 부모 화합물인 전체 길이 AM, N 말단 결실 AM 또는 C 말단 글리신 부가 AM과 동일한 정도의 생물학적 활성을 유지하고있는 것으로 추측된다.
동일 (20 kDa)의 중량 평균 분자량의 PEG 기, 및 동일한 아미노산 서열의 펩타이드 부분 (h.AM (1-52))이 있고, PEG 기와 펩타이드 부분과 연결 양식만 다른 아드레노메둘린 유도체 화합물 (2) 화합물 (4), 화합물 (6) 및 화합물 (14)을 대비하면, 알킬아민 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체인 화합물 (4) 및 화합물 (6)은 아미드 결합 형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 인 화합물 (2)와 비교하여 더 높은 세포 내 cAMP 농도 상승 작용을 나타내었다. 마찬가지로 우레탄 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 인 화합물 (14)은 아미드 결합 형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 인 화합물 (2)와 비교하여 더 높은 세포 내 cAMP 농도 상승 작용을 나타내었다.
동일 (5 kDa)의 중량 평균 분자량의 PEG 기, 및 동일한 아미노산 서열의 펩타이드 부분 (h.AM (6-52) h.AM (11-52) 또는 h.AM (16-52))를 가지고 있고 PEG 기와 펩타이드 부분과 연결 양식만 다른 아드레노메둘린 유도체 인 화합물 (15) 화합물 (16) 및 화합물 (17) 및 화합물 (18) 화합물 (19) 및 화합물 (20)을 각각 대비하면, 아미드 연결형 PEG (5k) 아드레노메둘린 유도체인 화합물 (15) 화합물 (16) 및 화합물 (17)은 펩타이드 부분의 N 말단 결실의 확대에 따라 세포 내 cAMP 농도 상승 작용이 현저하게 감소했다. 한편, 알킬아민 연결형 PEG (5k) 아드레노메둘린 유도체인 화합물 (18) 화합물 (19) 및 화합물 (20)는 펩타이드 부분의 N 말단 결실에 의한 세포 내 cAMP 농도 상승 작용에 미치는 영향을 억제하였다.
동일 (20 kDa)의 중량 평균 분자량의 PEG 기, 및 동일한 PEG 기와 펩타이드 부분과 연결 방법을 가지고 있고, 아미노산 서열의 펩타이드 부분만 다른 아드레노메둘린 유도체 인 화합물 (4) 및 화합물 (21 ) 화합물 (22) 및 화합물 (23)을 대비하면, 알킬아민 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체인 화합물 (21) 화합물 (22) 및 화합물 (23)은 펩타이드 부분의 N 말단 결실에 의한 세포 내 cAMP 농도 상승 작용에 미치는 영향없이 높은 세포 내 cAMP 농도 상승 작용을 나타내었다.
[실험 IV-2 : 아드레노메둘린 유도체에 의한 혈압 강하 작용]
마취 쥐의 정맥에 실험 I-1 및 실험 II-1에서 제조한 각 화합물 또는 전체 길이 AM를 1 nmol/kg 용량으로 단회 투여하여, 상기 쥐(rat)의 혈압의 변화를 관찰했다. 11-14 주령의 수컷 위스타 랫트(쥐) 각각을 이소플루레인 흡입시켜 마취시켰다. 기관 절개 후, 1.5-2.5 %의 이소플루레인 농도 및 0.6-0.8 L/min의 유량으로 흡입 마취 관리를 실시했다. 상기 쥐에서 오른쪽 경정맥을 랫트(쥐)에서 분리하고, 26G 상당의 카테터 튜브를 삽입했다. 다음으로, 상기 처리된 쥐에서 왼쪽 경동맥을 분리하고, 23G 상당의 카테터 튜브를 삽입했다. 오른쪽 경정맥 카테터 튜브로부터 식염수 헤파린 용액(생리 식염수 : 100 mL; 헤파린 : 1000 단위)을 2.4 mL/시간으로 주입하였다. 같은 카테터 튜브로부터 1 nmol/kg 화합물 (2) 화합물 (4), 화합물 (8) 또는 h.AM (1-52)을 생리 식염수에 용해된 형태로 투여했다. 경동맥에 삽입한 카테터를 압력 변환기에 연결했다. 화합물 (2) 화합물 (4) 또는 h.AM (1-52) 투여 전 혈압과 투여 후 혈압을 경시적으로 측정했다. 화합물 (2) 화합물 (4), 화합물 (8) 또는 h.AM (1-52)의 투여 시작 후 경과 시간과 평균 혈압과의 관계를 도 6에 나타낸다. 도 6A는 화합물 (2) 화합물 (4) 및 h.AM (1-52)의 결과를 도 6B는 화합물 (8) 및 h.AM (1-52)의 결과를 각각 나타낸다. 또한, 도 중, 세로축은 각 약제 투여시의 평균 혈압에서 각 약제 투여 전 평균 혈압을 뺀 차이를 나타낸다.
도 6에 나타낸 바와 같이, PEG기를 연결하지 않은 전체 길이 AM (h.AM (1-52))에서는 투여 직후 급격한 혈압 저하가 관찰되었다. 이에 대해 PEG기를 연결한 아드레노메둘린 유도체 (화합물 (2) 화합물 (4) 및 화합물 (8))에서는 h.AM (1-52)에서 관찰 된 투여 직후의 급격한 혈압 저하는 없었다. 그러므로, PEG기를 연결한 아드레노메둘린 유도체는 부모 화합물 인 길이 AM에 발생할 수 있는 급격한 혈압 강하와 같은 바람직하지 않은 부반응을 억제할 수 있는 것으로 생각된다.
동일 (20 kDa)의 중량 평균 분자량의 PEG 기, 및 동일한 아미노산 서열의 펩타이드 부분 (h.AM (1-52))이 있고, PEG 기와 펩타이드 부분과 연결 양식만 다른 아드레노메둘린 유도체 화합물 (2) 및 화합물 (4) 및 화합물 (8)을 대비하면, 알킬아민 연결형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체인 화합물 (4) 및 화합물 (8)은 아미드 결합형 PEG (20k) 아드레노메둘린 유도체 인 화합물 (2)와 비교하여 투여 직후의 혈압 저하가 더욱 억제되었다.
[실험 IV-3 : 피하 투여 아드레노메둘린 유도체의 경시적(시간 경과에 따른) 혈중 농도 측정 (1)]
쥐의 피하에 상기 실험 I-1에서 제조 한 화합물 (8) 또는 전체 길이 AM을 10 nmol/kg 용량으로 단회 투여하여 아드레노메둘린 유도체의 혈중 농도의 경시 변화를 관찰했다. 7-8 주령의 수컷 위스타 랫트(쥐)(약 250 g)에 생리 식염수에 용해된 화합물 (8) 또는 h.AM (1-52)를 피하 투여했다. 투여 시작부터 1 일 후, 7 일 후와 10 일 후 50 mg의 펜토바비탈(Pentobarbital-)을 복강 내 투여하여 마취 하에서 꼬리 정맥으로부터 매회 300 μL씩 채혈했다. 얻어진 혈액 검체에 즉시 300 μg의 EDTA-2Na 및 21 μg의 아프로티닌을 첨가하여 10 분 3000 회전의 조건으로 원심 분리하여 혈장을 얻었다. 각 검체의 혈장 AM 농도를 방사 면역 측정법 (radioimmunoassay; RIA) (Kitamura K, Ichiki Y, Tanaka M et al., Immunoreactive adrenomedullin in human plasma. FEBS Lett., vol. 341, p. 288-90, 1994)으로 측정했다. 화합물 (8)의 투여 시작 후 경과 시간과 혈장 AM 농도와의 관계를 도 7에 나타낸다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 화합물 (8)을 투여한 경우에는 1 일 이후 2600 pM 이상, 7 일 후 740 pM 이상, 10 일 후에도 280 pM 이상의 혈장 AM 농도가 확인됐다. 한편, h.AM (1-52)을 투여 한 경우, 혈장 중의 AM 농도는 1 일 후 (화합물 (8)의 투여에 의해) 6.7 pM이었고, 7 일 후와 10 일 후는 어느 측정에서도 혈장 AM 0 pM (검출 감도 이하 )였다. 보통 쥐의 혈장 AM 농도는 1 pM 정도 인 것으로 알려져있다(Mori, Y. et al., Long-Term Adrenomedullin Infusion Improves Survival in Malignant Hypertensive Rats. Hypertension, 2002, vol. 40, p. 107-113.). 상기 결과로부터, 본 발명의 알킬아민 연결형 아드레노메둘린 유도체는 부모 분자인 아드레노메둘린과 비교하여 현저하게 긴 기간에 걸쳐 혈중에 고농도로 존재하는 것을 발견했다.
[실험 IV-4 : 경정맥 단회 투여시의 아드레노메둘린 유도체의 경시적 혈중 농도 측정]
마취 쥐의 정맥에 실험 I-1에서 제조 한 화합물 (6) 또는 전체 길이 AM를 3 nmol/kg 의 용량으로 단회 투여하여 아드레노메둘린 유도체의 혈중 농도의 경시적 변화를 관찰했다. 8-9 주령의 수컷 위스타 쥐(약 300 g), 이소플루레인을 흡입시켜 마취하였다. 기관 절개 후 1.5-2.5 %의 이소플루레인 농도 및 0.6-0.8 L/min의 유량으로 흡입 마취 관리를 실시했다. 상기 쥐에서 오른쪽 경정맥을 분리하고, 26G 상당의 카테터 튜브를 삽입했다. 다음으로, 상기 처리 된 쥐에서 왼쪽 경동맥을 분리하고, 23G 상당의 카테터 튜브를 삽입했다. 오른쪽 경정맥 카테터 튜브로부터 식염수 헤파린 용액 (생리 식염수 : 100 mL; 헤파린 : 1000 단위)을 2.4 mL/시간으로 주입하였다. 같은 카테터 튜브로부터 3 nmol/kg 화합물 (6) 또는 h.AM (1-52)을 생리 식염수에 용해된 형태로 투여했다. 경동맥에 삽입한 카테터로부터, 투여 시작 후 1 시간, 2 시간 후 및 4 시간 후의 시점에 300 μl로 채혈하였다. 얻어진 혈액 검체에 즉시 300 μg의 EDTA-2Na 및 21 μg의 아프로티닌을 첨가하여 10 분 3000 회전의 조건으로 원심 분리하여 혈장을 얻었다. 각 검체의 혈장 AM 농도를 방사 면역 측정법 (RIA)(Kitamura K, Ichiki Y, Tanaka M 등, Immunoreactive adrenomedullin in human plasma. FEBS Lett. 제 341 권, p. 288-90 1994 년)으로 측정하였다. 화합물 (6) 또는 h.AM (1-52)의 투여 시작 후 경과 시간과 혈장 AM 농도와의 관계를 도 8에 나타낸다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 화합물 (6)은 h.AM (1-52)과 비교하여 혈중 반감기가 현저하게 연장되었다. 상기의 결과로부터 본 발명의 알킬아민 연결형 아드레노메둘린 유도체는, 부모 분자인 아드레노메둘린과 비교하여 혈중 반감기가 현저하게 연장되는 것을 발견했다.
[실험 IV-5 : 고혈압 자연 발병 쥐(SHR rat)에서의 혈압 상승 억제 작용 (1)]
고혈압 자연 발병 쥐(SHR)의 피하에 실험 I-1에서 제조한 화합물 (8)을 336 μg/100 μL의 용량으로 단회 투여하여 아드레노메둘린 유도체의 혈압 상승 억제 효과를 관찰했다. 8 주령의 수컷 SHR(약 200 g)에 대해 고염식이(8 % NaCl)가 공급되었다. 고염식이 투여시 화합물 (8)을 생리 식염수에 용해된 형태로 투여했다. 대조군으로 동일한 조건의 수컷 SHR(약 200 g)에 100 μL의 생리 식염수를 피하 단회 투여했다. 화합물 (8) 또는 생리 식염수 투여 2 일 전 및 투여 9 일 후 혈압과 맥박을 경시적으로 측정했다. 화합물 (8) 또는 생리 식염수 투여 2 일 전 및 투여 9 일 후 혈압을 도 9에 나타낸다.
도 9와 같이, 화합물 (8) 투여군은 대조군(생리 식염수 투여군)에 비해 혈압 상승이 억제되었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 알킬아민 연결형 아드레노메둘린 유도체는 혈압 상승 억제의 약리 효과를 갖는 것을 발견했다.
[실험 IV-6: 피하 투여시 아드레노메둘린 유도체의 경시적 혈중 농도 측정 (2)]
상기 실험 IV-3과 같은 순서에 의해 쥐의 피하에 실험 I-1에서 제조한 화합물 (27)을 10 nmol/kg 용량으로 단회 투여하여 아드레노메둘린 유도체의 혈중 농도의 경시적 변화를 관찰했다.
화합물 (27)을 투여 한 경우에는 1 일 이후 3600 pM 이상, 7 일 후 120 pM 이상의 혈장 AM 농도가 확인됐다. 상기 결과로부터, 본 발명의 우레탄 연결형 아드레노메둘린 유도체는, 부모 분자인 아드레노메둘린과 비교하여 현저하게 긴 기간에 걸쳐 혈중에 고농도로 존재하는 것을 발견했다.
[실험 IV-7 : 피하 투여시 아드레노메둘린 유도체의 경시적 혈중 농도 측정 (3)]
쥐의 피하에 상기 실험 III-1에서 제조한 화합물 (37)를 30 nmol/kg 용량으로 단회 투여하여 아드레노메둘린 유도체의 혈중 농도의 경시적 변화를 관찰했다. 7-8 주령의 수컷 위스타 쥐(약 250 g)에 생리 식염수에 용해된 화합물 (37)을 피하 투여했다. 투여 시작부터 1 일 후 2 일 후 4 일 후, 7 일 후와 9 일 후 50 mg의 펜토바비탈(Pentobarbital)-을 복강 내 투여하여 마취 하에서 꼬리 정맥으로부터 매회 300 μL 채혈했다. 얻어진 혈액 검체에 즉시 300 μg의 EDTA-2Na 및 21 μg의 아프로티닌을 첨가하여 10 분 3000 회전의 조건으로 원심 분리하여 혈장을 얻었다. 각 검체의 혈장 AM 농도를 RIA 법으로 측정하였다.
화합물 (37)을 투여 한 경우에는 1 일 이후에 34000 pM 이상, 7 일 후에 1600 pM 이상, 9 일 후에도 110 pM 이상의 혈장 AM 농도가 확인됐다. 상기 결과로부터, 본 발명의 알킬아민 연결형 글리신 부가 아드레노메둘린 유도체는, 부모 분자인 아드레노메둘린과 비교하여 현저하게 긴 기간에 걸쳐 혈중에 고농도로 존재하는 것을 발견했다.
[실험 IV-8: 고혈압 자연 발병 쥐(SHR)의 혈압 상승 억제 작용 (2)]
SHR의 피하에 상기 실험 III-1에서 제조 한 화합물 (37)를 30 nmol/kg 용량으로 단회 투여하고, 아드레노메둘린 유도체의 혈압 상승 억제 효과를 관찰했다. 8 주령의 수컷 SHR (약 200 g)에 화합물 (37)을 생리 식염수에 용해된 형태로 투여했다. 대조군으로 동일한 조건의 수컷 SHR (약 200 g)에 100 μL의 생리 식염수를 피하 단회 투여했다. 화합물 (37) 또는 생리 식염수 투여 1 일 전 및 투여 4 일 후 및 투여 9 일 후 혈압을 경시적으로 측정했다. 화합물 (37) 또는 생리 식염수 투여 4 일 후 및 투여 9 일 후 투여 전날의 평균 수축 혈압에 대한 혈압 변화 값을 도 10에 나타낸다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 화합물 (37) 투여군은 대조군과 비교하여 혈압 상승이 억제되었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 알킬아민 연결형 글리신 부가 아드레노메둘린 유도체는 혈압 상승 억제의 약리 효과를 갖는 것을 발견했다.
[실험 IV-9 : 덱스트란 황산 나트륨(DSS) 유발 대장염 모델에서의 약리 작용]
DSS 유발 대장염 모델에 대한 화합물 (8)의 피하 투여에 의한 개선 작용을 검토했다. 화합물 (8)을 마우스 등에 피하 투여했다. 투여 다음날 (0 일)에, 대장염 모델 준비는 7 일 동안 식수로서 3 % DSS를 투여함으로써 시작되었다. 화합물 (8)의 투여량은 1, 5 및 25 nmol/kg 3 가지 용량으로 했다. 대조군에 비히클로 생리 식염수를 투여했다. DSS 음수 개시일(0 일)부터 3, 5 및 7 일째에, 체중 및 대변의 형상을 표 4에 나타내는 점수를 기준으로 평가했다. 화합물 (8) 투여군과 대조군의 DSS 유발 대장염 모델 제작시부터의 경과 시간과 점수의 합계와의 관계를 도 11에 나타낸다.
체중 손실 대변 일관성 출혈/점액 및 피 묻은 대변
점수 기준 점수 기준 점수 기준
0 손실 없음 0 정상 0 정상
1 1-5% 손실 2 묽은 대변(Loose stool) 2 출혈
2 5-10% 손실 4 설사 4 점액과 피 묻은 변
3 10-20% 손실
도 11에 나타낸 바와 같이, 화합물 (8) 투여군은 5 및 25 nmol/kg 투여군에서 유의한 점수의 감소가 확인되었다. 점수의 감소는 대장염의 완화 작용을 시사한다. 또한 비히클 대조군과 비교하여 5 nmol/kg 투여군에서 장관의 습 중량이 가벼워지는 경향이 확인되고, 25 nmol/kg 투여군에서 창자의 길이가 길어지는 경향이 확인되었다. 상기 결과로부터, 화합물 (8)의 피하 투여에 의한 이 시험 조건 하에서 DSS 대장염 모델의 병태에 대한 완화 작용이 시사되었다.
[실험 IV-10: 2,4,6- 벤젠설폰산(TNBS) 유발 대장염 모델에서의 약리 작용]
TNBS 유도 대장염 모델에 대한 화합물 (8)의 피하 투여에 의한 개선 작용을 검토했다. 7 주령의 수컷 위스타 쥐를 일주일 순화 사육했다. 그 후, 쥐에 화합물 (8) (1 nmol/kg) 또는 생리 식염수를 피하 투여 하였다(0 일째). 체내에서 대변을 제거하기 위해 피하 투여와 함께 24 시간 동안 금식을 수행했다. 하기 단계에서, 대장염 모델을 제작 하였다. TNBS(Nacalai Tesque, Inc.)는 30 mg/500μL (50 % 에탄올 수용액)의 농도가 되도록 조제 하였다. 50 mg의 펜토바비탈(Pentobarbital)-을 복강 내 투여하여 마취 하에서, 폴리에틸렌 카체처를 이용하여 항문에서 천천히 회전시키면서 8 cm 삽입하고 500 μL의 약액을 주입하였다(1 일). 그 후, 2 분간 거꾸로 상태를 유지했다. 체중과 설사의 성상을 매일 평가했다. 14 일 후, 50 mg의 펜토바비탈을 복강 내 투여하여 마취 하에서 심장 채혈을 실시하고, 대장을 적출했다. 적출시 장관의 길이와 무게를 측정하여 각 군의 비교를 실시했다. 화합물 (8) 투여군과 대조군의 TNBS 유도 대장염 모델 제작시부터의 경과 시간과 체중과의 관계를 도 12에 나타낸다. 도면에서 a는 화합물 (8) 또는 생리 식염수를 피하 주사하고 단식을 개시 한 날을, b는 TNBS를 투여 한 날을 각각 나타낸다. 화합물 (8) 투여군과 대조군의 대장의 무게를 도 13에 나타낸다. 화합물 (8) 투여군과 대조군의 대장의 창자 길이를 도 14에 나타낸다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 비히클 대조군에서는 대장염 발병으로 인한 체중 감소가 확인되었지만, 화합물 (8) 투여군에서는 대장염 발병으로 인한 체중 감소가 개선되었다. 대장염이 발달함에 따라, 일반적으로 염증 부위의 부종으로 인해 대장의 무게가 증가한다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 화합물 (8) 투여군에서는 비히클 대조군과 비교하여 대장의 무게 증가가 분명하게 억제되었다. 또한 대장염으로 인해 염증이 진행되면 일반적으로 대장의 창자 길이가 짧아진다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 화합물 (8) 투여군에서는 비히클 대조군과 비교하여 대장의 창자 길이의 감소가 분명하게 억제되었다. 대장의 해부 소견에서도 화합물 (8) 투여군에서는 비히클 대조군과 비교하여 분명히 병적 변화가 적은 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, 화합물 (8)의 피하 투여에 의한 본 시험 조건 하에서 TNBS 유도 대장염 모델의 병태에 대한 완화 작용이 시사되었다. 그러므로, 본 발명의 아드레노메둘린 유도체는 대장염에 대한 치료 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.
[실험 IV-11 : 폐 고혈압 모델에서의 약리 작용]
폐 고혈압 모델에 대한 화합물 (8)의 피하 투여에 의한 개선 작용을 검토했다. 3 주령의 수컷 위스타 쥐(Charles River Laboratories Japan, Inc.)를 구입하고 1 주일 순화 사육했다. 그 후, 쥐에 모노크로탈린 용액을 60 mg/kg의 농도로 피하 투여했다. 동시에, 등의 다른 위치로 화합물 (8) (1 nmol / kg) 또는 생리 식염수를 단회 피하 투여했다. 폐동맥 고혈압 모델의 효과 판정 지표로서 일반적인 심장 우심실과 좌심실과의 중량비를 측정했다. 이 모델에서는 병태가 진행 될수록 우심실의 비대에 따라 중량비가 커지는 것으로 알려져있다 (Miyauchi T., Yorikane R., Sakai S., Sakurai T., Okada m., Nishikibe M., Yano M., Yamaguchi I., Sugishita Y. and Goto k.: Contribution of endogenous endothelin-1 to the progression of cardiopulmonary alterations in rats with monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Circ. Res., vol. 73, pp. 887-897, 1993). 투여 14 일 후 50 mg의 펜토바비탈을 복강 내 투여하여 마취 하에서, 하대 정맥으로부터 채혈했다. 그 후 심장을 적출하여 무게를 측정 하였다. 적출한 심장은 우심실과 좌심실로 나누어 각각의 무게를 측정하고 우심실 중량 / 좌심실 무게 비율을 산출했다. 화합물 (8) 투여군과 대조군의 우심실 중량 / 좌심실 무게 비율을 도 15에 나타낸다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 화합물 (8) 투여군은 비히클 대조군과 비교하여 우심실 / 좌심실 중량 비율이 현저하게 낮았다. 상기 결과로부터, 화합물 (8)의 피하 투여에 의한 본 시험 조건 하에서 폐동맥 고혈압 모델의 병태에 대한 완화 작용이 시사되었다.
[실험 IV-12 : 상처 모델에서의 약리 작용]
상처 모델에 대한 화합물 (8)의 피하 투여에 의한 약리 작용을 검토했다. 5 주령의 수컷 BALB/c-nu/nu 마우스 (Charles River Laboratories Japan, Inc.)를 구입하고 1 주일 순화 사육했다. 그 후, 마우스에 5 mg의 펜토바비탈을 복강 내 투여하여 마취 하였다. 소독용 에탄올을 이용하여 피부를 소독했다. 마우스와 등의 피부를 손가락으로 옆으로 잡아 당기고, 제도용 소독 매트에서 한쪽에서 다른 쪽을 향해, 피부 생검(플런저시스템이 있는 일회용 생검 펀치)을 위해 둥근 칼로 눌러 잘라, 지름 6mm의 2개의 결손 창상을 제족하였다. 동시에, 뒤의 다른 위치로 화합물 (8) (1 nmol / kg)을 단회 피하 투여했다. 비히클 대조군으로 생리 식염수를 투여했다. 상처 부위를 포함하는 뒤를 덮도록 드레싱제를 도포했다. 상처 면적의 변화를 경시적으로 관찰했다. 화합물 (8) 투여군과 대조군의 상처 모델 제작시부터의 경과 시간과 상처 면적과의 관계를 도 16에 나타낸다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 화합물 (8) 투여군은 비히클 대조군과 비교하여 상처 면적의 축소가 빠르게 진행했다. 상기 결과로부터, 화합물 (8)의 피하 투여에 의한 본 시험 조건 하에서 상처 치유 촉진 작용이 확인되었다.
[실험 IV-13: 혈관 폐색 모델에서의 약리 작용]
모리스 물 미로 실험(Morris water maze test)을 이용하여 혈관 폐색 모델 쥐의 학습 및 기억 장애에 대한 화합물 (8)의 피하 투여에 의한 약리 작용을 검토했다. 척추 동맥 폐색 수술 전에 화합물 (8)을 피하 투여했다. 화합물 (8)의 투여량은 1과 10 nmol/kg 2 가지 용량으로 했다. 비히클 대조군으로 생리 식염수를 투여했다. 그 후 마취하에 양측 척추 동맥을 영구 폐쇄했다. 다음날 봉합을 이용하여 마취하에 양측 총 경동맥을 30 분간 폐쇄했다. 그 후 봉합사를 제거하고 혈류를 다시 개통해 주었다. 양측 총 경동맥 폐색 날짜를 혈관 폐색 모델의 제작 날짜, 즉 0 일로 했다. 모델 제작 후 9 일째에, 모리스 물 미로에 쥐를 1차 시도로서 유영시켰다(물 적응). 모델 제작 후 10 일째부터 4 시도/일 간격으로 5 일간 숨겨진 플랫폼 테스트 (hidden platform test)를 실시 하였다. 숨겨진 플랫폼 테스트 5 일째(모델 제작 후 14 일)의 마지막 시도 1 시간 후에 프로브 테스트(probe test)를 실시하였다.
모리스 물 미로 실험은 아래의 실험 장치를 이용하여 수행 하였다. 직경 150 cm, 높이 45 cm, 수심 30 cm의 원형 풀을 준비했다. 직경 12 cm의 무색 투명한 플랫폼을 원형 수영장의 수면 아래 약 1 cm의 위치에 놓았다. 원형 수영장의 수온을 23 ± 1 ℃로 설정했다. 실험 장치를 설치한 실내에는 간접 조명을 설치하여 동물의 시각적 단서가 된다(달력, 공, 큐브 및 줄무늬 종이)를 배치했다. 시험 기간 동안 이러한 배치는 항상 일정하게했다. 측정은 비디오 이미지 행동 분석 장치 (Smart, Panlab, S.L.U.)를 사용 하였다.
숨겨진 플랫폼 테스트는 다음 단계에서 실시했다. 수술 후 9 일째에 플랫폼을 설치하지 않고 90 초 수영하고 물에 순화시켰다(물 적응). 측정은 수술 후 10 일째부터 시작했다. 측정은 4 시도/일 간격으로 실시했다. 처음부터 플랫폼 도달까지 수영 시간(도피 잠수시)을 측정했다. 시작 위치는 시도마다 변경했다. 플랫폼의 위치는 모든 시도에서 같은 위치에 고정했다. 또한 1 시도 최장 유영 시간을 90 초로 했다. 최장 유영 시간 내에 플랫폼에 도달할 수 없는 쥐에 대하여, 유영 후 플랫폼에 30 초간의 체류 시간을 마련했다.
프로브 테스트는 다음 단계에서 실시했다. 실험 장치 플랫폼을 설치하지 않고 풀을 4 분할했다. 숨겨진 플랫폼 테스트시에 플랫폼이 설치된 분수에서 수영 시간을 측정했다. 측정된 수영 시간을 이용하여 아래의 계산식에 따라 체류율(%)을 산출했다. 프로브 테스트 유영 시간은 60초로 했다. 모델 제작 후 14 일째의 마지막 숨겨진 플랫폼 테스트가 종료 한 후, 1 시간 후에 1 시도만 실시했다.
Figure 112020091917216-pat00048
화합물 (8) 투여군과 대조군의 혈관 폐색 모델 제작시부터의 경과 시간과 숨겨진 플랫폼 테스트에서 탈출 대기 시간과의 관계를 도 17에 나타낸다. 또한 혈관 폐색 모델 쥐에 대한 화합물 (8) 투여군과 대조군의 프로브 테스트에서 체류율을 도 18에 나타낸다. 도 17에서 확인되는 바와 같이 숨겨진 플랫폼 테스트에서 화합물 (8) 투여군은 1과 10 nmol/kg 투여군에서 비히클 대조군과 비교하여 플랫폼에 도달 시간, 즉 탈출 대기 시간이 단축했다. 또한,도 18에 나타낸 바와 같이, 프로브 테스트에서도 화합물 (8) 투여군은 1과 10 nmol/kg 투여군에서 비히클 대조군과 비교하여 체류율이 유의하게 상승했다. 본 연구에서는 양측 총 경동맥 폐색 수술시의 사망률에는 유의한 차이는 확인되지 않았다. 상기 결과로부터, 화합물 (8)의 피하 투여에 의한 본 시험 조건의 4-혈관 폐색 모델 쥐의 학습 및 기억 장애의 경감 작용이 확인되었다.
[실험 IV-14 : 보조제 유발 관절염 모델에서의 약리 작용]
보조제(adjuvant) 유도 관절염 모델에 대한 화합물 (8)의 피하 투여에 의한 약리 작용을 검토했다. 화합물 (8)을 쥐에 피하 투여했다. 화합물 (8)의 투여 다음날 (1 일)에, 동물의 오른쪽 뒷다리에 0.1 mL/마리 투여량으로 보조제(prophlogistic agent)를 피하 투여하여 관절염을 유발시켰다. 화합물 (8)의 투여량은 1과 10 nmol/kg 2 가지 용량으로 했다. 비히클 대조군으로 생리 식염수를 투여했다. 발 부피 측정 장치 (MK-550, Muromachi Kikai Co., Ltd.)를 이용하여 0 일째 (보조제 투여 전날) 4 일째, 7 일째, 10 일째 및 14 일째에 좌, 우측 다리의 발 용적 및 팽창률(부종)을 측정했다. 또한 표 5 점수에 따라 0 일째(보조제 투여 전날) 4 일째, 7 일째, 10 일째 및 14 일째 염증 점수를 평가했다. 화합물 (8) 투여군과 대조군의 투여시부터의 경과 시간과 보조제 투여 후에 나타나는 발 용적 사이의 관계를 도 19에 나타낸다. 화합물 (8) 투여군과 대조군의 투여시부터의 경과 시간과 보조제 투여 후 발현된 부종율과의 관계를 도 20에 나타낸다. 또한 화합물 (8) 투여군과 대조군의 투여시부터의 경과 시간과 보조제 투여 후 발현된 염증 점수와의 관계를 도 21에 나타낸다.
점수 위치 기준
0
우측 앞다리
좌측 앞다리
좌측 뒷다리		 정상
1 손가락의 작은 관잘 하나에서만 발적(붉어짐)/부종
2 두개 이상의 작은 관절 또는 상대적으로 큰 발목 관절의 발적/부종
3 하나의 전체 사지에서 발적(붉어짐)/부종
4 하나 이상의 사지에서 최대치의 부종이 판단되는 경우
도 19 및 20에 나타낸 바와 같이, 화합물 (8) 투여군은 1과 10 nmol/kg 투여군에서 비히클 대조군과 비교하여 발 용적 및 부종율이 유의하게 감소했다. 또한,도 21에 나타낸 바와 같이, 화합물 (8) 투여군은 1과 10 nmol/kg 투여군에서 비히클 대조군과 비교하여 관절염 점수가 유의하게 감소했다. 상기 결과로부터, 화합물 (8)의 피하 투여에 의한 본 시험 조건의 보조제 유도 관절염 모델 쥐의 관절염의 완화 작용이 확인되었다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 본원에 그대로 참고로 포함된다.
<110> University of Miyazaki <120> Long term functional adrenomedullin derivative <130> PH-6705-PCT <150> JP 2015-184685 <151> 2015-09-18 <160> 13 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys 1 5 10 15 Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln 20 25 30 Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser 35 40 45 Pro Gln Gly Tyr 50 <210> 2 <211> 1449 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (157)..(711) <400> 2 ctggatagaa cagctcaagc cttgccactt cgggcttctc actgcagctg ggcttggact 60 tcggagtttt gccattgcca gtgggacgtc tgagactttc tccttcaagt acttggcaga 120 tcactctctt agcagggtct gcgcttcgca gccggg atg aag ctg gtt tcc 171 Met Lys Leu Val Ser 1 5 gtc gcc ctg atg tac ctg ggt tcg ctc gcc ttc cta ggc gct gac acc 219 Val Ala Leu Met Tyr Leu Gly Ser Leu Ala Phe Leu Gly Ala Asp Thr 10 15 20 gct cgg ttg gat gtc gcg tcg gag ttt cga aag aag tgg aat aag tgg 267 Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp 25 30 35 gct ctg agt cgt ggg aag agg gaa ctg cgg atg tcc agc agc tac ccc 315 Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro 40 45 50 acc ggg ctc gct gac gtg aag gcc ggg cct gcc cag acc ctt att cgg 363 Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg 55 60 65 ccc cag gac atg aag ggt gcc tct cga agc ccc gaa gac agc agt ccg 411 Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro 70 75 80 85 gat gcc gcc cgc atc cga gtc aag cgc tac cgc cag agc atg aac aac 459 Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn 90 95 100 ttc cag ggc ctc cgg agc ttt ggc tgc cgc ttc ggg acg tgc acg gtg 507 Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val 105 110 115 cag aag ctg gca cac cag atc tac cag ttc aca gat aag gac aag gac 555 Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp 120 125 130 aac gtc gcc ccc agg agc aag atc agc ccc cag ggc tac ggc cgc cgg 603 Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr Gly Arg Arg 135 140 145 cgc cgg cgc tcc ctg ccc gag gcc ggc ccg ggt cgg act ctg gtg tct 651 Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu Val Ser 150 155 160 165 tct aag cca caa gca cac ggg gct cca gcc ccc ccg agt gga agt gct 699 Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly Ser Ala 170 175 180 ccc cac ttt ctt taggattta ggcgcccatg gtacaaggaa tagtcgcgca 750 Pro His Phe Leu 185 agcatcccgc tggtgcctcc cgggacgaag gacttcccga gcggtgtggg gaccgggctc 810 tgacagccct gcggagaccc tgagtccggg aggcaccgtc cggcggcgag ctctggcttt 870 gcaagggccc ctccttctgg gggcttcgct tccttagcct tgctcaggtg caagtgcccc 930 agggggcggg gtgcagaaga atccgagtgt ttgccaggct taaggagagg agaaactgag 990 aaatgaatgc tgagaccccc ggagcagggg tctgagccac agccgtgctc gcccacaaac 1050 tgatttctca cggcgtgtca ccccaccagg gcgcaagcct cactattact tgaactttcc 1110 aaaacctaaa gaggaaaagt gcaatgcgtg ttgtacatac agaggtaact atcaatattt 1170 aagtttgttg ctgtcaagat tttttttgta acttcaaata tagagatatt tttgtacgtt 1230 atatattgta ttaagggcat tttaaaagca attatattgt cctcccctat tttaagacgt 1290 gaatgtctca gcgaggtgta aagttgttcg ccgcgtggaa tgtgagtgtg tttgtgtgca 1350 tgaaagagaa agactgatta cctcctgtgt ggaagaagga aacaccgagt ctctgtataa 1410 tctatttaca taaaatgggt gatatgcgaa cagcaaacc 1449 <210> 4 <211> 52 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 4 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys 1 5 10 15 Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln 20 25 30 Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Gly Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser 35 40 45 Pro Gln Gly Tyr 50 <210> 5 <211> 1493 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 5 gcggaacagc tcgagccttg ccacctctag tttcttacca cagcttggac gtcggggttt 60 tgccactgcc agagggacgt ctcagacttc atcttcccaa atcttggcag atcaccccct 120 tagcagggtc tgcacatctc agccgggatg aagctggttc ccgtagccct catgtacctg 180 ggctcgctcg ccttcctggg cgctgacaca gctcggctcg acgtggcggc agagttccga 240 aagaaatgga ataagtgggc tctaagtcgt ggaaaaagag aacttcggct gtccagcagc 300 taccccaccg ggatcgccga cttgaaggcc gggcctgccc agactgtcat tcggccccag 360 gatgtgaagg gctcctctcg cagcccccag gccagcattc cggatgcagc ccgcatccga 420 gtcaagcgct accgccagag tatgaacaac ttccagggcc tgcggagctt cggctgtcgc 480 tttgggacgt gcaccgtgca gaagctggcg caccagatct accagttcac ggacaaagac 540 aaggacggcg tcgccccccg gagcaagatc agcccccagg gctacggccg ccggcgccga 600 cgctctctgc ccgaagccag cctgggccgg actctgaggt cccaggagcc acaggcgcac 660 ggggccccgg cctccccggc gcatcaagtg ctcgccactc tctttaggat ttaggcgcct 720 actgtggcag cagcgaacag tcgcgcatgc atcatgccgg cgcttcctgg ggcggggggc 780 ttcccggagc cgagcccctc agcggctggg gcccgggcag agacagcatt gagagaccga 840 gagtccggga ggcacagacc agcggcgagc cctgcatttt caggaacccg tcctgcttgg 900 aggcagtgtt ctcttcggct taatccagcc cgggtccccg ggtgggggtg gagggtgcag 960 aggaatccaa aggagtgtca tctgccaggc tcacggagag gagaaactgc gaagtaaatg 1020 cttagacccc caggggcaag ggtctgagcc actgccgtgc cgcccacaaa ctgatttctg 1080 aaggggaata accccaacag ggcgcaagcc tcactattac ttgaactttc caaaacctag 1140 agaggaaaag tgcaatgtat gttgtatata aagaggtaac tatcaatatt taagtttgtt 1200 gctgtcaaga tttttttttg taacttcaaa tatagagata tttttgtacg ttatatattg 1260 tattaagggc attttaaaac aattgtattg ttcccctccc ctctatttta atatgtgaat 1320 gtctcagcga ggtgtaacat tgtttgctgc gcgaaatgtg agagtgtgtg tgtgtgtgtg 1380 cgtgaaagag agtctggatg cctcttgggg aagaagaaaa caccatatct gtataatcta 1440 tttacataaa atgggtgata tgcgaagtag caaaccaata aactgtctca atg 1493 <210> 6 <211> 52 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 6 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Pro Arg Ser Phe Gly Cys 1 5 10 15 Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln 20 25 30 Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Gly Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser 35 40 45 Pro Gln Gly Tyr 50 <210> 7 <211> 1432 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 7 ggttttgcca gcaccagagc gacgtctcag accttctcct cccggatctt ggcagatcac 60 cccctcagca gggtctgcgc atcgccgcca gcatgaagct ggttcccgtc gccctcttat 120 acctgggctc cctcgccttc ttgggcgcgg acaccgcacg gctagacgtg gcgtcagagt 180 tccgaaagaa gtggaataaa tgggctgtaa gtcgtggaaa gagggaactt cgagtgtcca 240 gcagctatcc caccgggctc gctgaagtga aggccgggcc ggcccagact cttattcgga 300 cccaggacgt gaagggcgcc tctcgcaacc cccagaccag cggtccggac gccgcccgca 360 tccgagtcaa acgctaccgc cagagtatga acaatttcca gggcccgcgg agcttcggct 420 gccgcttcgg aacgtgcacg gtgcagaaac tggcgcacca gatctaccag ttcacagaca 480 aggacaagga cggcgtcgcc cccaggagca agattagccc tcagggctac ggccgccggc 540 gccggcgctc cctgcccgag cccggccttc gccggactct gttgttcccg gagccacggc 600 caggcggggc tccggccccc cgggcgcatc aggtgctcgc caacctcctt aagatgtagg 660 cgcctgtggc agcagcgaac tggcgcgcgt gtgcatcccg ctggcttccc cctgggcgga 720 gggcttcccc gagccgagcc cctctgccga tggaagtcgg gcagagaccg ggattccggg 780 aggcaccgtc ccgcggccag ccctggcttt gcgcgagccc cttctcctcg gaggcacgga 840 tccctctgtc ccaagccggc ccaggtgtcc cgtggggggc agaggaatgc aagggaggcc 900 tgccaggctc acggagagga ttaactgaga attaaatgag aattaaatgc ttgagaccct 960 cccccctccc cccccaggga caggggtctg agtcactgcc gtgcctgccc acaaactgat 1020 ttctcacggg gtgtcacccc accggggcgc aagcctcact attacttgaa ctttccaaaa 1080 cctagagagg aaaagtgcaa tgcgtgttgt atatacagag gtaactatca atatttaagt 1140 tcgttgctgt cagaagattt tttttgtaac ttcaaatata gagatatttt tgtacgttat 1200 atattgtatt aagggcattt aaaaaccatt gcattgtccc cctccccact tattttaata 1260 cgtgaatgtc tcagcgaggt gtaacgttgt ttttgctgca gagtgtgtga gtgtgcgtga 1320 gagacttatt acctcttgtg gaagaaggaa caccgtgtct ctgcattatc tatttacata 1380 aaatgggtga tatgcgaaaa tagcaaatca ataataaacg gtctcgatgc tg 1432 <210> 8 <211> 52 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 8 Tyr Arg Gln Ser Leu Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys 1 5 10 15 Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr His 20 25 30 Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Gly Ser Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser 35 40 45 Pro Gln Gly Tyr 50 <210> 9 <211> 1439 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 9 cgggaaacag ctcgaacctt ctcacttttg gcttctcact gcagcttcga cgtcggggtt 60 ttgccactgc cagaacgccg tctcagactt aatactccaa agaattttgg cagatcaccc 120 cctcagcagg gtctgcgcat cgccgccggg atgaagctgg ttcccgtcgc cctcctgtac 180 ctggggtcgc tcgccttcct aggcgtggac acggcacggc tcgacgtggc ggcagagttc 240 cgaaagaaat ggaataagtg ggctctaagt cgtggaaaaa gagaacttcg cgagtccagt 300 agctacccca ccgggctcgc cgacgtgaag gccgggcctg tccagactct tattcggccc 360 caggatgtaa agggcgcctc tcgaagccct caggccagca gtcctgacgc agcccgcatc 420 cgagtcaagc gctaccgcca gagtttgaac aacttccagg gcctgcggag cttcggttgt 480 cgcttcggga catgcacggt gcagaagttg gcgcatcaga tctaccattt cacggacaag 540 gacaaggacg gatccgcccc caggagcaag atcagccccc agggctacgg ccgtcggcgc 600 cgacgttcac tgcctgaggc cggcttgggt cggactctat tacagcctcc agagccaaag 660 ctgcgagggg ccccggactc ccgggtgcat caagtacttg ccaccctcag gatttaggcg 720 cctgggcagc agcgaacagt cgcgcacgca tctcgccggc acctcttcgg gcgggagggc 780 ttccgcgagc cgagcccctc actcagccta tgggcccggg ctgagaacag ccctgagaga 840 ccgagagtcc aggaggcacc gtccggcagc cagcgagcac tggctttgca ggaacccgtc 900 ctcctcggag gggaggcagt gttctcttca ctctaattgg ggccaggtgc agtttctcct 960 ctccgtgagc ctggcagacg ctcacggaga ggagaaactg cgaaataaat gatgagaccc 1020 tcaggggcaa gggtctgagc cactgccgtg cccgcccaca aactgattcc tgatgggggt 1080 gtcaccccac cggggtgcaa gcctcactat tacttgaact ttccgaaacc tagagaggaa 1140 aagtgcaatg agtgttgtat atacagagat aattatcaat atttaaattt gttgttgtca 1200 agattttttt tgtaacttca aatatagaga tatttttgta cgttatatat tgtattaagg 1260 gcattttaaa gcaattgtat tgttcccctc ccctctattt taataagtga atgtctcagc 1320 gagatgcaac gttgtttgct gcgtggaatg tgagagtgtg tgcgtgaaag agatgagttg 1380 cctcttgtgg aagaagaaaa caccgtgtct gtataatcta tttacataaa gtgggccgg 1439 <210> 10 <211> 50 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 10 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Thr Gly Cys Arg Phe 1 5 10 15 Gly Thr Cys Thr Met Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln 35 40 45 Gly Tyr 50 <210> 11 <211> 1376 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 11 tccagccttt accgctcctg gtttctcggc ttctcatcgc agtcagtctt ggactttgcg 60 ggttttgccg ctgtcagaag gacgtctcgg actttctgct tcaagtgctt gacaactcac 120 cctttcagca gggtatcgga gcatcgctac agaatgaagc tggtttccat cgccctgatg 180 ttattgggtt cgctcgccgt tctcggcgcg gacaccgcac ggctcgacac ttcctcgcag 240 ttccgaaaga agtggaataa gtgggcgcta agtcgtggga agagggaact acaagcgtcc 300 agcagctacc ctacggggct cgttgatgag aagacagtcc cgacccagac tcttgggctc 360 caggacaagc agagcacgtc tagcacccca caagccagca ctcagagcac agcccacatt 420 cgagtcaaac gctaccgcca gagcatgaac caggggtccc gcagcactgg atgccgcttt 480 gggacctgca caatgcagaa actggctcac cagatctacc agtttacaga caaagacaag 540 gacggcatgg cccccagaaa caagatcagc cctcaaggct atggccgccg gcgccggcgt 600 tccctgccag aggtcctccg agcccggact gtggagtcct cccaggagca gacacactca 660 gctccagcct ccccggcgca ccaagacatc tccagagtct ctaggttata ggtgcgggtg 720 gcagcattga acagtcgggc gagtatccca ttggcgcctg cggaatcaga gagcttcgca 780 ccctgagcgg actgagacaa tcttgcagag atctgcctgg ctgcccctag gggaggcaga 840 ggaacccaag atcaagccag gctcacgtca gaaaccgaga attacaggct gatactctct 900 ccgggcaggg gtctgagcca ctgccttgcc cgctcataaa ctggttttct cacggggcat 960 acggctcatt acttacttga actttccaaa acctagcgag gaaaagtgca atgcttgtta 1020 tacagccaaa ggtaactatc atatttaagt ttgttgatgt caagaggttt ttttttttgt 1080 aacttcaaat atatagaaat atttttgtac gttatatatt gtattaaggg cattttaaag 1140 cgattatatt gtcaccttcc cctattttaa gaagtgaatg tctcagcaag gtgtaaggtt 1200 gtttggttcc gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtaagg 1260 tggagagcgc ctgattaccg cctgtggatg aagaaaaaac attgtgtctt ctataatcta 1320 tttacataaa atatgtgatc tgggaaaaag caaaccaata aactgtctca atgctg 1376 <210> 12 <211> 50 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe 1 5 10 15 Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu Thr 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln 35 40 45 Gly Tyr 50 <210> 13 <211> 1381 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 cttggtgaca ctagacagag caactccagc gttaccgctc ccgctcctgg tttctcggct 60 tctcatcgca gtcaatcttg gactttgggg ttttgctact gtcagaagga cttctttctg 120 cttcaagtgc ttgacaacgc acccctttat cagggtatca gagcatcgcc acagaatgaa 180 gctggtttcc atcaccctga tgttattggg ttcactcgct ttcctaggcg cggacactgc 240 agggccagat actccttcgc agttccgaaa gaagtggaat aagtgggcgc taagtcgtgg 300 gaagagggaa ctacaagcat ccagcagcta ccctacggga ctcgctgatg agacgacagt 360 tcctacccag actcttgatc cattcctgga cgagcagaac acaactggcc ccctacaagc 420 cagcaatcag agcgaagccc acattcgtgt caaacgctac cgccagagca tgaaccaggg 480 ttcccgcagc aatggatgcc gcttcgggac ctgcacattt cagaaattgg cccaccagat 540 ctaccagcta acagacaaag acaaggacgg catggctccc agaaacaaga tcagccctca 600 aggctatggc cgccggcgcc ggcgttccct gctggaggtc ctccggtccc ggactgtgga 660 gtcctcccag gagcagacac acacagcccc aggcccctgg gcgcacatct ccagactctt 720 taggatatag gtgcgggtga cagcattgaa cagtcgggcg agtatcccgt tggcgcctgc 780 ggaatcagag aacttcgcac cggggcggac tgagacaatc ctgcagagat ctgcctggct 840 gcccctaggg gaggcagagg aacccaagac caagccaggc tcatgccaga aaccgagact 900 tacaggctga tactctccgg gcaggggtct gagccactgc cttgcccgct cataaactgg 960 tttctcacgg ggcataagcc tcattactac ttgaactttc caaaacctag cgaggaacgt 1020 gcaatgcttg ttgtccagcc aaaggtaact atagtattta agtttgttgc tgtcaaggtt 1080 tttttttttg taacttcaaa tatatagaga tatttttgta cgttatatat tgtattaagg 1140 gcattttaaa gtgattatat tgtcaccttc ccctatttta agacgtgaat gtctcagcaa 1200 ggtgtaaggt tgtttggttc cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1260 taaggtggag agcgcctgat tatcgcctgt ggatgaagaa aaaacattgt gtttcctata 1320 atctatttac ataaaatatg tgatctggga aaaagcaaac caataaactg tctcaatgct 1380 g 1381

Claims (7)

  1. 하기 식 (X)로 표시되는 화합물, 또는 이의 염, 또는 이의 수화물:
    A'-CO-B (X)
    (식 (X)에서,
    A'는 1 개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 변형기(modifying group)이고, 및
    B는 아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 활성을 갖는 이의 변형된 형태(modified form)로부터 유도된 펩타이드 부분(peptide moiety)이고,
    여기서, 상기 펩타이드 부분 B는 이의 N 말단의 α-아미노기의 질소 원자가 카르보닐기의 탄소 원자와 공유 결합을 통해서 다른 부분(the other moieties)과 연결되어 있고,
    A'는 상기 변형기의 산소 원자가 카르보닐기의 탄소 원자와 공유결합함으로써 우레탄 결합을 통해 다른 부분(B)과 연결되고,
    A'가 식 (XI-1-1), (XII-1-1) 또는 (XII-2-1)로 표시되는 변형기인 것을 특징으로 하는 화합물:
    CH3O-(CH2CH2O)n-* (XI-1-1)
    Figure 112022049800762-pat00072

    (식에서,
    n은 1이상의 정수이며,
    n'은 n에 대한 상기 정의와 동일한 의미를 가지며,
    *는 다른 부분과의 결합 위치이다)
    상기 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 화합물:
    (a) 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위치의 시스테인 잔기와 21 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
    (b) 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위치의 시스테인 잔기와 21 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
    (c) 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위치의 시스테인 잔기와 21 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
    (d) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 16 위치의 시스테이 잔기와 21 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
    (e) 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위치의 시스테인 잔기와 19 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
    (f) 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 14 위치의 시스테인 잔기와 19 위치의 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 가지는 펩타이드;
    (i) (a)-(f) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 C 말단이 아미드화 된 펩타이드; 및
    (j) (a)-(f) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 C 말단에 부가되는 글리신 잔기를 가지는 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아드레노메둘린 또는 이의 변형된 형태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 화합물:
    (h') (a)-(d) 중 하나의 펩타이드에서, 이의 N 말단에서 1-15 위치, 1-10 위치 또는 1-5 위치 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드, 또는 (e) 또는 (f)의 펩타이드에서, 이의 N 말단에서 1-13 위치, 1-8 위치 또는 1-5 위치 아미노산 잔기가 결실되어 있고, 또한 아드레노메둘린 활성을 갖는 펩타이드;
    (i) (h')의 펩타이드에서, 이의 C 말단이 아미드화 된 펩타이드; 및
    (j) (h')의 펩타이드에서, 이의 C 말단에 부가되는 글리신 잔기를 가지는 펩타이드.
  3. 아드레노메둘린 또는 아드레노메둘린 변형된 형태(modified form)로부터 유도 된 펩타이드 부분의 전구체와 식 (X-1):
    A'-CO-O-C6H4-p-NO2 (X-1)
    로 표시되는 1개 이상의 폴리에틸렌 글로콜 기를 포함하는 변형기 A'의 전구체 p-니트로페닐 카보네이트 에스테르, 또는 식 (X-2):
    A'-CO-O-C4H4NO2 (X-2)
    로 표시되는 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜기를 포함하는 변형기 A'의 전구체 N-히드록시숙신이미딜 카보네이트 에스테르를 염기존재 하에서 반응시켜 식 (X)로 표시되는 화합물을 얻는, 연결 단계를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 화합물, 또는 이의 염, 또는 이의 수화물의 제조방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 따른 화합물, 또는 이의 염, 또는 이의 수화물과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 심혈관 질환(cardiovascular disease), 염증성 질환(inflammatory disease), 또는 말초 혈관 질환(peripheral vascular disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
KR1020207025165A 2015-09-18 2016-09-16 장시간 작용형 아드레노메둘린 유도체 KR102443831B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015184685 2015-09-18
JPJP-P-2015-184685 2015-09-18
KR1020187007746A KR102152437B1 (ko) 2015-09-18 2016-09-16 장시간 작용형 아드레노메둘린 유도체
PCT/JP2016/077543 WO2017047788A1 (ja) 2015-09-18 2016-09-16 長時間作用型アドレノメデュリン誘導体

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187007746A Division KR102152437B1 (ko) 2015-09-18 2016-09-16 장시간 작용형 아드레노메둘린 유도체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200105551A KR20200105551A (ko) 2020-09-07
KR102443831B1 true KR102443831B1 (ko) 2022-09-15

Family

ID=58289487

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207025165A KR102443831B1 (ko) 2015-09-18 2016-09-16 장시간 작용형 아드레노메둘린 유도체
KR1020187007746A KR102152437B1 (ko) 2015-09-18 2016-09-16 장시간 작용형 아드레노메둘린 유도체

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187007746A KR102152437B1 (ko) 2015-09-18 2016-09-16 장시간 작용형 아드레노메둘린 유도체

Country Status (14)

Country Link
US (3) US10842879B2 (ko)
EP (1) EP3351561A4 (ko)
JP (2) JP6991569B2 (ko)
KR (2) KR102443831B1 (ko)
CN (2) CN108026182B (ko)
AU (3) AU2016324119B2 (ko)
BR (1) BR112018004208A2 (ko)
CA (1) CA2997131C (ko)
IL (1) IL257995B (ko)
NZ (1) NZ740534A (ko)
RU (2) RU2020111229A (ko)
SG (2) SG11201802180TA (ko)
WO (1) WO2017047788A1 (ko)
ZA (1) ZA201802079B (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106164088B (zh) * 2014-03-20 2021-11-23 国立大学法人宫崎大学 长效肾上腺髓质素衍生物
EP3604538A4 (en) * 2017-03-29 2020-12-30 University of Miyazaki LONG-ACTING ADRENOMEDULLINE DERIVATIVE
JP7498882B2 (ja) * 2019-12-05 2024-06-13 国立大学法人 宮崎大学 異常タンパク質蓄積性神経変性疾患の治療剤
JP7499533B2 (ja) 2020-04-02 2024-06-14 国立大学法人 宮崎大学 新規アドレノメデュリン類縁体、その製造方法及びその医薬用途
WO2022030580A1 (ja) * 2020-08-06 2022-02-10 国立大学法人宮崎大学 長時間作用型新規アドレノメデュリン誘導体、その製造方法及びその医薬用途
WO2022054825A1 (ja) * 2020-09-09 2022-03-17 国立大学法人宮崎大学 ウイルス性感染症を有する対象における症状又は障害を予防又は治療するための医薬
JPWO2022054826A1 (ko) * 2020-09-09 2022-03-17

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005044846A1 (ja) 2003-10-24 2005-05-19 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. アドレノメデュリン２およびその用途
US20120178676A1 (en) 2010-05-17 2012-07-12 Cebix, Inc. Pegylated c-peptide
WO2013064508A1 (en) 2011-11-03 2013-05-10 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Polyethylene glycol based prodrug of adrenomedullin and use thereof

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4830093B1 (ko) 1969-10-29 1973-09-17
JP2774769B2 (ja) * 1993-04-26 1998-07-09 賢治 寒川 アドレノメデュリン
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
MXPA03005406A (es) * 2000-12-20 2003-09-25 Hoffmann La Roche Conjugados de eritropoyetina.
DE60144439D1 (de) * 2000-12-20 2011-05-26 Hoffmann La Roche Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg)
AU2002356990A1 (en) 2001-11-20 2003-06-10 Pharmacia Corporation Chemically-modified human growth hormone conjugates
PL1729795T3 (pl) * 2004-02-09 2016-08-31 Human Genome Sciences Inc Białka fuzyjne albuminy
US8475764B2 (en) * 2004-05-24 2013-07-02 Institut De Cardiologie De Montreal Labelled adrenomedullin derivatives and their use for imaging and therapy
TWI376234B (en) * 2005-02-01 2012-11-11 Msd Oss Bv Conjugates of a polypeptide and an oligosaccharide
JP4830093B2 (ja) 2005-04-08 2011-12-07 国立大学法人 宮崎大学 非細菌性の炎症性疾患の予防又は治療剤
US20090252703A1 (en) 2006-10-19 2009-10-08 Gegg Jr Colin V Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields
WO2009044918A1 (ja) 2007-10-05 2009-04-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited ニューロメジンｕ誘導体
CN101945659A (zh) * 2008-02-19 2011-01-12 国立大学法人旭川医科大学 肾上腺髓质素产生增强剂
FR2948939B1 (fr) 2009-08-05 2013-03-22 Pf Medicament Derives de 2h pyridazin-3-ones, leur preparation et leur application en therapeutique humaine
US9629895B2 (en) 2011-01-12 2017-04-25 University Of Miyazaki Method for prevention or treatment of intractable inflammatory bowel disease
CN103458916B (zh) 2011-04-07 2016-08-10 小利兰·斯坦福大学托管委员会 长效肽类似物
CN106164088B (zh) 2014-03-20 2021-11-23 国立大学法人宫崎大学 长效肾上腺髓质素衍生物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005044846A1 (ja) 2003-10-24 2005-05-19 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. アドレノメデュリン２およびその用途
US20120178676A1 (en) 2010-05-17 2012-07-12 Cebix, Inc. Pegylated c-peptide
WO2013064508A1 (en) 2011-11-03 2013-05-10 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Polyethylene glycol based prodrug of adrenomedullin and use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUBO KEISHI et al.,"Biological properties of adrenomedullin conjugated with polyethylene glycol", Peptide, 2014, Vol.57, pp.118-121 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
EP3351561A4 (en) 2019-05-15
IL257995A (en) 2018-05-31
AU2021254623A1 (en) 2021-11-18
JP2022019883A (ja) 2022-01-27
AU2020200934A1 (en) 2020-02-27
EP3351561A1 (en) 2018-07-25
KR20180052642A (ko) 2018-05-18
AU2020200934B2 (en) 2021-09-09
AU2016324119B2 (en) 2019-11-14
AU2021254623B2 (en) 2024-05-02
CN108026182B (zh) 2022-04-26
SG10202008963QA (en) 2020-10-29
AU2016324119A1 (en) 2018-04-05
NZ740534A (en) 2019-07-26
RU2018114075A (ru) 2019-10-21
US20230142095A1 (en) 2023-05-11
ZA201802079B (en) 2022-07-27
SG11201802180TA (en) 2018-04-27
US20210008219A1 (en) 2021-01-14
JP6991569B2 (ja) 2022-02-15
WO2017047788A1 (ja) 2017-03-23
KR20200105551A (ko) 2020-09-07
JPWO2017047788A1 (ja) 2018-07-05
CN114805540A (zh) 2022-07-29
RU2018114075A3 (ko) 2019-10-21
US20180264123A1 (en) 2018-09-20
IL257995B (en) 2021-09-30
RU2738416C2 (ru) 2020-12-14
CN108026182A (zh) 2018-05-11
KR102152437B1 (ko) 2020-09-07
RU2020111229A (ru) 2020-06-08
US10842879B2 (en) 2020-11-24
CA2997131A1 (en) 2017-03-23
BR112018004208A2 (pt) 2018-09-25
CA2997131C (en) 2021-05-25
US11478551B2 (en) 2022-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102443831B1 (ko) 장시간 작용형 아드레노메둘린 유도체
RU2716985C2 (ru) Соединения-агонисты gip и способы
JP6873097B2 (ja) 選択的ペプチド二重ｇｌｐ−１／グルカゴン受容体アゴニストとしての新しいエキセンジン−４誘導体
KR101593406B1 (ko) 글루카곤 유사체
WO2015141819A1 (ja) 長時間作用型アドレノメデュリン誘導体
JP2021184753A (ja) 長時間作用型アドレノメデュリン誘導体
OA16287A (en) Glucagon analogues.

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant