CN101171266A - 来源于西印度樱桃果实的果胶和其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来源于西印度樱桃果实的果胶或其水解物，包括Aceronidin的络合物形式，其是新的多酚化合物。本发明的果胶可以用作抗氧化剂或皮肤增白剂的活性组分。

Description

来源于西印度樱桃果实的果胶和其应用
技术领域
本发明涉及来源于西印度樱桃(acerola)果实的果胶，其用作口服的抗氧化剂或皮肤增白剂。
背景技术
由于在空气中的氧造成的脂肪和油成份等等的氧化或氧化过度，在脂肪和油、含有它们的物品、食品、化妆品、药物制剂等等的存储、保存和加工步骤中是最麻烦的因素。尤其是，包含在脂肪和油中的不饱和脂肪酸例如亚油酸或亚麻酸容易被氧过度氧化，除了产生致癌物质之外，还产生过度氧化的脂质或自由基(Shokuhin-no-hoso(FoodPackaging)，vol.17，p.106(1986))。当氧化或氧化过度发生时，不但发生失去光泽、褪色、变性、异臭和营养价值的效果降低，而且产生毒物等，导致产品质量变坏。
通常使用各种抗氧化剂，通过抑制不饱和脂肪酸的氧化来预防产品质量的变坏。这些抗氧化剂具有对氧化时产生的过氧化物自由基起作用的效果，使得链式氧化反应终止，或作用于自由基，使得氧化反应终止。作为抗氧化剂、通常使用合成抗氧化剂例如丁基羟基茴香醚(BHA)和丁基羟基甲苯(BHT)。然而，由于使用这些合成抗氧化剂的机会增加，其安全性已经成为了问题。消费者的负面反应越强、这种抗氧化剂的消耗越少。此外，由于这些油溶性的抗氧化剂在水溶液中溶解性不够，它们也是有问题的。
因此，对于具有高安全性的、来源于天然产物的抗氧化剂的期望逐渐变得显著起来。
通常已知的天然抗氧化剂是例如维生素E(α-生育酚)和维生素C(抗坏血酸)。然而，维生素E具有高脂质溶解性，维生素C具有高水溶性，使得它们在食品工业中不适于抑制脂质氧化。这是因为：由于应该抑制脂质氧化的加工的产品(例如鱼、家畜肉和谷物)、盐腌的食品、含有脂肪和油类的作料等等，各自通常形成含有脂肪和油以及水基组分的混合系统，这些具有过度脂质溶解性或水溶性的抗氧化剂的应用受到了限制。此外，维生素E是有问题的，这是由于它在食品中具有其固有的不利味道，使得其加入数量和其应用受到了限制。维生素E和维生素C也是有问题的，这是由于它们的抗氧化活性不能以稳定的方式持续很久。
通过各种方法从植物中分离的果胶，已知其在特定条件下可以对于脂质产生抗氧化活性。然而，认为这种抗氧化活性非常弱，使得这种果胶不能用作常规的抗氧化剂。例如，已知从豆腐废物(大豆)分离的胶质和其酶处理的产品具有预防脂质氧化的效果(FOOD SCIENCE，VOL.36，NO.11，pp.93-102(1994))，但它们的抗氧化活性不足。此外，果胶是存在于各种植物中的多糖，由半乳糖醛酸、其甲基酯、其它中性糖等等组成。中性糖的例子包括鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖，但根据所涉及的植物，已知其类型和组合比例相互显著地不同(Takaaki Manabe，第一版，“Science and Food Texture of Pectin，”Saiwai Shobo，pp.8-22(2001))。
同时，通常主要将皮肤增白剂开发用于化妆品和准药物。由此，已经发现了许多活性组分例如熊果苷和抗坏血酸衍生物。然而，大部分这些活性组分用作外用皮肤制剂。目前，用于抑制斑点、晒斑等等产生的色素淀积的口服药物制剂例子，是含有抗坏血酸(维生素C)作为主要活性组分与半胱氨酸(其是氨基酸)和复合维生素B的产品，预计其可以相互混配产生协同效应。具体地说，认为抗坏血酸是通过口服摄取的、可以预计安全地产生色素淀积抑制效果的最合适的成份。
作为富含抗坏血酸的果实，西印度樱桃(学名：Malpighia emarginataDC)为大家所熟知。这种西印度樱桃作为皮肤增白剂活性组分的用途，描述在JP专利No.3513871中。西印度樱桃的应用限于外用皮肤制剂，例如化妆品。而且，作为皮肤增白剂组合物的用途，描述在JP专利No.3076787中，其中组合物基本上不包含抗坏血酸，并且通过西印度樱桃的发酵来获得。没有一种使用西印度樱桃制造的皮肤增白剂是由抗坏血酸及其它成份组成的，并且没有发现其口服效果。
也报道了关于来源于果浆中所包含的果胶的组份与皮肤增白效果之间的关系。据JP专利No.3596953报道，在动物细胞试验中，低聚半乳糖醛酸可以引起抑制黑色素产生的效果。本文中，“低聚半乳糖醛酸”是通过大约2至10个半乳糖醛酸结合形成的。此外，在Shokuhin-no-hoso(Food Packaging)，vol.17，p.106(1986)中，说明来源于番茄汁的果胶降解产物具有抑制黑色素产生的效果。在该文献中，也描述了还没有证实半乳糖醛酸和多聚半乳糖醛酸具有抑制黑色素的效果。人们认为，JP专利No.3596953中的结果与Shokuhin-no-hoso(Food Packaging)，vol.17，p.106(1986)中的结果不一致。这可能因为：相关的植物源在果胶结构和性质方面彼此非常不同。在JP专利No.3596953和Eiji Naru等人，Fragrance Journal，Vol.32，No.32，No.8，pp.24-30(2004)中，仅仅检验了针对动物细胞的效果。通过来源于果胶的组份及其它组分的组合来产生皮肤增白效果，还从来没有进行过报道。
发明内容
本发明要实现的目的
本发明一个目的是提供从自然界分离出来的水溶性抗氧化剂，和制备这种抗氧化剂的方法。
本发明的另一个目的是提供从自然界分离的口服的皮肤增白剂，和制备这种皮肤增白剂的方法。
实现目的的方法
本申请包括下列发明。
(1)来源于西印度樱桃果实的果胶或其水解物，包括果胶骨架和由下列化学式代表的多酚化合物形成的复合物：
Figure S2006800147688D00031
(2)制备按照(1)的果胶的方法，包括从西印度樱桃果实或其加工的产品分离或浓缩果胶的步骤。
(3)制备按照(1)的果胶水解物的方法，包括从西印度樱桃果实或其加工的产品分离或浓缩果胶的步骤、和将果胶水解的步骤。
(4)按照(3)的方法，包括下列步骤：通过用果胶酶处理果泥而将由西印度樱桃果实制备的果泥中的果胶水解的步骤，和由前面步骤中的加工产品的上清液来分离或浓缩水解的果胶的步骤。
(5)按照(2)至(4)的任一项的方法，其中分离或浓缩果胶的步骤是使用乙醇沉淀果胶的步骤。
(6)按照(2)至(4)的任一项的方法，其中分离或浓缩果胶的步骤是使用分离膜进行分离或浓缩果胶的步骤。
(7)按照(6)的方法，其中分离膜是超滤膜。
(8)按照(7)的方法，其中超滤膜具有从10,000至100,000的分子量分离点。
(9)含有来源于西印度樱桃果实的果胶的材料，其是通过一种方法制备的，该方法包括从西印度樱桃果实或其加工的产品中分离或浓缩果胶的步骤。
(10)含有来源于西印度樱桃果实的果胶水解物的材料，其是通过一种方法制备的，该方法包括从西印度樱桃果实或其加工的产品中分离或浓缩果胶的步骤、和将果胶水解的步骤。
(11)按照(10)的材料，其是通过一种方法制备的，该方法包括：通过用果胶酶处理浓果汁、将由西印度樱桃果实制备的浓果汁中的果胶水解的步骤，和从前面步骤中产生的加工产品的上清液中来分离或浓缩水解的果胶的步骤。
(12)按照(9)至(11)的任一项的材料，其中分离或浓缩果胶的步骤是使用乙醇沉淀果胶的步骤。
(13)按照(9)至(11)的任一项的材料，其中分离或浓缩果胶的步骤是使用分离膜来分离或浓缩果胶的步骤。
(14)按照(13)的材料，其中分离膜是超滤膜。
(15)按照(14)的材料，其中超滤膜具有从10,000至100,000的分子量分离点。
(16)一种抗氧化剂，含有按照(1)的果胶或其水解物作为活性组分。
(17)一种抗氧化剂，含有按照(9)至(15)的任一项的材料作为活性组分。
(18)一种脂质的抗氧化剂，含有西印度樱桃果实的加工产品(不包括西印度樱桃籽的加工产品)作为活性组分。
(19)按照(18)的抗氧化剂，其中西印度樱桃果实的加工产品含有多酚和/或抗坏血酸。
(20)具有抗氧化效果的食品，向其中加入按照(16)至(19)的任一项的抗氧化剂。
(21)制备食品的方法，包括使用按照(16)至(19)的任一项的抗氧化剂来增加食品氧化稳定性的步骤。
(22)一种口服皮肤-增白剂，含有按照(1)的果胶或其水解物作为活性组分。
(23)一种口服皮肤-增白剂，含有按照(9)至(15)的任一项的材料作为活性组分。
(24)按照(22)或(23)的口服皮肤-增白剂，进一步含有抗坏血酸。
(25)具有皮肤-增白效果的食品，向其中加入按照(22)至(24)的任一项的口服皮肤-增白剂。
(26)制备口服皮肤-增白剂的方法，包括下列步骤：将包含在西印度樱桃果实的果肉渣中的、或含有抗坏血酸和这种果肉渣的西印度樱桃果实的加工产品中的果胶水解的步骤，以使半乳糖醛酸的量相对于抗坏血酸的量是5％重量或更多。
(27)按照(26)的方法，进一步包括基本上除去葡萄糖和果糖的步骤。
在本发明中的术语“含有预定组份作为活性组分的抗氧化剂(对于脂质)”，表示两种组合物：其中在自然条件下含有预定组份的、具有抗氧化活性(对于脂质)的组合物，和向其中人工加入预定组份的、具有抗氧化活性(对于脂质)的组合物。
在本发明中的术语“含有预定组份作为活性组分的口服皮肤-增白剂”，表示两种组合物：其中在自然条件下含有预定组份的、具有皮肤-增白效果的组合物，和向其中人工加入预定组份的、具有皮肤-增白效果的组合物。
在上面(20)中的术语“向其中加入抗氧化剂、具有抗氧化效果的食品”，是指向其中人工加入预定抗氧化剂、具有抗氧化效果的食品。
在上面(25)中的术语“向其中加入口服皮肤-增白剂、具有皮肤-增白效果的食品”，是指向其中人工加入预定的口服皮肤-增白剂、具有皮肤-增白效果的食品。
本发明的效果
按照本发明的来源于西印度樱桃果实的果胶，包括多酚的复合物形式，用作抗氧化剂以及用作口服皮肤-增白剂。
此说明书包括日本专利申请No.2005-53479和2005-88860的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，其是本申请的优先权文件。
附图的简要说明
图1表示从来源于西印度樱桃果实的果胶中所提取样品的色谱，通过分析HPLC进行分析。
图2表示从来源于西印度樱桃果实的果胶中所提取样品的色谱，通过制备HPLC进行分析。
图3表示将通过制备HPLC级分得到的组分进行分析HPLC所获得的色谱。
图4A表示图3色谱中所示的22.4分钟处的峰的波谱数据。
图4B表示Aceronidin的波谱数据。
图5表示Aceronidin1H NMR波谱(上面的图形)与从来源于西印度樱桃果实的果胶中分离的多酚的1H NMR波谱(下面的图形)的比较。
图6A表示Aceronidin的总离子色谱。
图6B表示Aceronidin的高分辨率ESI质谱。
图7表示Aceronidin的1H NMR波谱。
图8表示Aceronidin的13C NMR波谱。
图9表示Aceronidin的DEPT波谱。
图1 0表示Aceronidin的DQF-COSY波谱。
图11表示Aceronidin的HSQC波谱。
图12表示Aceronidin的HMBC波谱。
图13表示Aceronidin的NOESY波谱。
图14表示测定抑制BHA、浓缩西印度樱桃果汁和西印度樱桃粉末的亚油酸的自动氧化能力的结果。
图15表示测定维生素C抑制亚油酸自动氧化能力的结果。
图16表示：测定来源于西印度樱桃的C18柱-吸附的组分、已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末、和西印度樱桃粉末抑制亚油酸自动氧化能力的结果。
图17表示：测定已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末、和已经除去C18柱吸附组分与维生素C的西印度樱桃粉末抑制亚油酸自动氧化能力的结果。
图18表示：测定用酸处理的来源于西印度樱桃的果胶(分子量2,000,000)和用酶处理的果胶(分子量20,000或更小)抑制亚油酸自动氧化能力的结果。
图19表示：显示在荧光照明条件下存储之后、加入西印度樱桃的盐腌鲑鱼样品的试验组的照片，和盐腌鲑鱼样品的对照试验组的照片。
图20显示了盐腌鲑鱼样品在荧光照明条件下存储期间的“a”值的跃迁，其中样品已经用含有西印度樱桃粉末的浸液处理。
图21说明了使用褐色豚鼠进行色素淀积抑制试验的结果。
本发明的优选实施方案
1.来源于西印度樱桃果实的果胶
用于本发明中的西印度樱桃(学名：Malpighia emarginata DC)果实的产品地域或种类没有特别限制。产品地域的例子包括冲绳、日本、巴西和越南。
本发明中的西印度樱桃果实可以指的是所有果实部分，包括籽，或进行常规处理例如除去籽、剥皮等等的西印度樱桃果实。
对于西印度樱桃果实，可以使用成熟果实或未成熟的果实。优选使用未成熟的果实。“未成熟的果实”是已经充分成长的果实，以便可以从这种果实中榨取果汁，但具有绿色至黄色，因为果实(不成熟的果实)是在其变成足够红色的成熟之前的阶段。
除了西印度樱桃果实本身之外，在本发明中可以使用西印度樱桃果实的各种形式的加工产物，只要它们含有果胶。例如，可以使用由西印度樱桃果实、粉碎或研磨的西印度樱桃果实的产品、或西印度樱桃果实提取物制备的果泥、果汁或果肉渣。作为按照本发明果胶产品的起始原料，优选由西印度樱桃果实制备的果泥、果汁或果肉渣。特别优选果泥。
可以按照传统方法、通过压榨西印度樱桃果实获得果汁。压榨果实收集果汁之后获得的残余物被称为“果肉渣”。
可以使用混合器等等，通过将西印度樱桃果实的可食部分和籽、或已经除去籽的西印度樱桃果实的可食部分粉碎来获得西印度樱桃果实的粉碎产品。此外，还可以使用进行处理例如提取或冷冻干燥的这种粉碎产品。
使用水、有机溶剂等等来提取西印度樱桃果实，可以获得西印度樱桃果实提取物。对于提取条件没有特别限制，只要在这种条件下不失去果胶。
不仅是来源于西印度樱桃果实的果胶、而且是常规“果胶”都具有下列结构，其中：由多聚半乳糖醛酸(由α-(1→4)-连接的半乳糖醛酸形成)组成的聚半乳糖醛酸苷(homogalacturonan)和由半乳糖醛酸与鼠李糖组成的鼠李聚糖半乳糖醛酸苷(rhamnogalacturonan)彼此重复连接，形成主链；从鼠李糖分支出半乳聚糖和阿拉伯聚糖等的侧链例。半乳糖醛酸的羧基以不同比例被甲基-酯化或乙酰基-酯化。此外，通过与多价阳离子例如钙或镁结合，果胶被认为具有交联结构。
在本发明中，由包括聚半乳糖醛酸苷和鼠李聚糖半乳糖醛酸苷的主链与从主链分出的侧链组成的果胶的糖链结构，被称为“果胶骨架”。
本发明人意外地发现，包含在西印度樱桃果实中的果胶是果胶骨架和由下列化学式代表的多酚化合物的络合物：
Figure S2006800147688D00081
该多酚化合物是本发明人第一次分离的化合物，并且命名为Aceronidin。关于这种化合物的专利是于2004年12月22日、在JP专利申请No.2004-372266中申请的。
本发明中的“包括果胶骨架和多酚化合物的络合物”是指Aceronidin和果胶骨架以某种方式共存，以使它们通过果胶的常规分离或浓缩法例如乙醇沉淀法或膜滤法(例如超滤)相互不可分离。没有说明Aceronidin-果胶骨架复合物的具体结构。其合适的结构可能是例如其中一部分Aceronidin和一部分果胶骨架通过共有结合(例如酯键或苷连接基)连接的结构，其中它们通过氢键连接的结构，或其中它们通过疏水键连接的结构。此外，在Aceronidin-果胶骨架络合物中的Aceronidin与果胶骨架的定量比例没有特别限制。本发明中的“来源于西印度樱桃果实的果胶”是指由果胶骨架和Aceronidin形成的络合物，除非特别限制。此外，“分离或浓缩果胶”是指分离或浓缩果胶骨架和Aceronidin的络合物形式的果胶。此外，按照本发明的果胶可以表示为“抗氧化果胶”，是指“具有抗氧化效能的果胶”。
本发明中的“来源于西印度樱桃果实的果胶的水解物”是指通过果胶骨架(包括来源于西印度樱桃果实的果胶的主链和侧链)中的组分糖之间连接基、特别是主链中的组分糖之间连接基的化学或酶水解获得的产品。按照本发明人进行的研究，即使用果胶酶(其将主链水解)将果胶骨架水解之后，通过对于分离或浓缩的果胶进行处理，例如乙醇沉淀法或超滤法，Aceronidin和果胶骨架的水解物(认为主要由侧链组成)仍是不可分离的。具体地说，“来源于西印度樱桃果实的果胶的水解物”也包括果胶骨架的水解物与Aceronidin的络合物。本发明人进行的进一步研究显示，具有分子量大约2,000,000的来源于西印度樱桃果实的果胶，与具有分子量20,000或更小分子量的来源于西印度樱桃果实的果胶的水解物两者都具有抗氧化活性。由此，用于本发明中的来源于西印度樱桃果实的果胶的分子量或其水解物的分子量没有特别限制。
按照本发明的来源于西印度樱桃果实的果胶是通过将西印度樱桃果实或其加工产品分离或浓缩来制备的。分离或浓缩这种果胶方法的例子包括：将乙醇加入到含有果胶的样品中来沉淀果胶的方法，和借助于分离膜将果胶分离或浓缩的方法。这些方法之中，许多相同类型或不同类型的方法可以组合。使用乙醇沉淀果胶的步骤的重复，可以除去水溶性的抗坏血酸、或易溶于醇中的有机酸或多酚。对于分离膜，优选超滤膜。超滤膜是可以阻断微粒或聚合物通路的膜，所述微粒或聚合物大小通常从0.1μm至2nm(分子量几百到数百万)。优选这种超滤膜具有公称分子量1,000或更高的分离点，且更优选公称分子量从10,000至100,000的分离点。
当由西印度樱桃果实或含有果肉渣例如西印度樱桃果肉渣和西印度樱桃果泥的西印度樱桃果实的加工产品分离或浓缩果胶时，将强酸例如盐酸或硝酸加入到含有果肉渣的样品中，而后进行上述最后段落中描述的方法，以使酸溶性的组分也可以溶解。
通过膜滤法获得的果胶浓缩液可以直接用作抗氧化剂或皮肤增白剂的活性组分。还可以将这种果胶浓缩液制成粉末，而后使用。可以通过冷冻干燥法或喷雾干燥法制备果胶浓缩液的粉末。当利用膜滤法时，可以选择浓缩的任一浓缩程度，优选，浓缩液中的果胶的固体含量是10％(W/W)或更高、优选20％(W/W)或更高时的浓缩程度。对于这种浓缩液的粉末，可能需要通过使用酵母等等进行脱糖来除去浓缩液中的葡萄糖和果糖。当浓缩程度在上述范围之内时，可以很容易地进行脱糖。此外，适当地选择超滤膜的分子量分离和浓缩条件，而后通过膜滤法来从浓缩液中除去葡萄糖和果糖，使得当将浓缩液粉末化时不需要进行脱糖。
按照本发明的来源于西印度樱桃果实的果胶的水解物，是通过包括上述分离或浓缩果胶的步骤和将果胶水解的步骤的方法制备的。水解步骤既可以在前者步骤之前、也可以在前者步骤之后进行。果胶水解是指将来源于西印度樱桃果实的果胶骨架中的组成糖之间的连接、尤其是主链中的组成糖之间的连接进行化学或酶催水解。优选使用果胶酶进行水解。当使用果胶酶时，对于果胶酶的类型没有特别限制。例如，可以使用具有体内-多聚半乳糖醛酸酶活性的果胶酶。对于果胶酶的来源没有特别限制。果胶酶的例子是来源于曲霉属的微生物(例如A.Pulverulentus或A.niger)。使用来源于西印度樱桃果实的果胶的果胶酶制备的水解物含有游离半乳糖醛酸，其是主链的水解液。为了从由此获得的水解物中分离出与Aceronidin形成络合物的唯一一种组份，可将这种组份吸附到疏水性柱(例如C18柱)上，而后可以通过洗脱收集吸附的组份。由此收集的组份也是按照本发明果胶的水解物的一个实施方案。
在最优选实施方案中，按照本发明的来源于西印度樱桃果实的果胶水解物的制备方法包括：通过使用果胶酶处理、将由西印度樱桃果实制备的果泥中的果胶水解的步骤，和将前面步骤中所处理产品的上清液中的水解果胶分离或浓缩的步骤。在该实施方案中，优选，将上清液通过优选的0.2-μm过滤器过滤，而后将水解的果胶分离或浓缩。同样，在该实施方案中，优选使用超滤膜将水解的果胶浓缩。优选，将通过超滤法获得的浓缩液进一步粉末化。由此获得的粉末可以容易地进行最后的碾压，并且具有高流动性和低吸湿性。
2.来源于西印度樱桃果实的果胶的应用
按照本发明的来源于西印度樱桃果实的果胶或其水解物，具有抑制脂质的自动氧化的效果、和清除自由基的效果，使得它可以用作抗氧化剂的活性组分。
按照本发明的来源于西印度樱桃果实的果胶或其水解物，也具有通过口服产生的皮肤增白效果，使得它可以用作这种皮肤增白剂的活性组分。
3.含有西印度樱桃果实的加工产品作为活性组分的脂质抗氧化剂
本发明人意外地发现，吸附到疏水性柱的组分(含有多酚化合物)和包含在西印度樱桃果实中的抗坏血酸也可以用作脂质的抗氧化剂。具体地说，本发明进一步涉及脂质的抗氧化剂，其含有西印度樱桃果实的加工产品作为活性组分。
优选，这种西印度樱桃果实的加工产品是水溶性的，因为它通常可以特别在食品工业中使用。
在本发明的实施方案中，这种西印度樱桃果实的加工产品可以用作脂质的抗氧化剂的活性组分，只要它含有来源于西印度樱桃果实的多酚化合物和抗坏血酸中的至少一种即可，优选两种。然而，在本发明的这个实施方案中，这种西印度樱桃加工产品来源于非西印度樱桃籽部分，例如西印度樱桃果肉和果皮。
这种来源于西印度樱桃果实的化合物的具体例子包括：Aceronidin，花色素苷色素例如花青素-3-鼠李糖苷和花葵素-3-鼠李糖苷，栎精苷例如栎素(栎精-3-鼠李糖苷)，异栎素(栎精-3-糖苷)和金丝桃甙(hyperoside)(栎精-3-半乳糖苷)，和落新妇苷(astilbin)。这些多酚可以以混合物的形式使用，混合物包括大量多酚化合物，或可以以单独化合物的形式使用。可以分离或制备这些多酚化合物，使其具有更高的浓度，而后使用。对于分离多酚化合物的方法和制备更高浓度多酚化合物的方法没有特别限制。这种方法的例子包括HPLC、合成吸附色谱、离子交换色谱法和凝胶过滤。尤其是，优选合成吸附色谱。
作为含有来源于西印度樱桃果实的多酚化合物的西印度樱桃果实的加工产品、由西印度樱桃果汁等等通过上述各种形式色谱中的一种分馏的含有这种多酚化合物的馏份，可以适当地用于本发明。具体地说，从西印度樱桃果汁等等处获得的C18柱(疏水性柱)-吸附的馏份，优选用于本发明中。含有来源于西印度樱桃果实的多酚的馏份例如C18柱吸附的馏份的例子包括洗脱液、其浓缩物和其干制品。
通常，认为多酚化合物高度不溶于水。用于本发明中的西印度樱桃加工产品含有处于容易溶于水状态的多酚。
通常，抗坏血酸不能单独充当脂质的抗氧化剂(参见实施例2中的实验2.7)，这是由于其具有高水溶性。然而，人们认为，在西印度樱桃加工的产品中，抗坏血酸起脂质的抗氧化剂的作用(参见实施例2中的实验2.9)。
4.按照本发明的抗氧化剂的使用方法
如上所述，来源于西印度樱桃果实的(a)果胶或其水解物，(b)C18柱吸附的组份和(c)抗坏血酸，用作抗氧化剂活性组分。
优选，本发明的抗氧化剂含有至少一种、更优选含有2种、最优选含有组分(a)(b)和(c)的全部。
在实施例2的实验2.1中，通过从西印度樱桃果汁中除去葡萄糖和果糖、而后将生成物粉末化制备的这种物质，含有组分(a)、(b)和(c)，并且具有出色的抗氧化活性。该物质是本发明的抗氧化剂(具体地说，脂质的抗氧化剂)的优选实施方案。
本发明的抗氧化剂是水溶性的。由此，当生产加工的产品例如鱼、家畜肉、和谷物(这些常常形成脂肪和油以及水基组分的混合系统)、盐腌食品和含有脂肪和油的作料时，该抗氧化剂可以适当地用作脂质的抗氧化剂。此外，当在相同条件下比较时，在实施例2的实验2.1中制备的西印度樱桃粉末具有优于α-生育酚(维生素E)的抗氧化活性(对于脂质)，被称为脂质-可溶性抗氧化剂(参见实施例2中的实验2.6)。
本发明进一步涉及含有上述说明的抗氧化剂、具有增加的氧化稳定性的食品，和制备这种食品的方法。本发明的抗氧化剂可以在含有脂质(具体地说，容易氧化的脂质)的食品生产中用作添加剂。这种食品的例子包括含有不饱和脂肪酸例如亚油酸和亚麻酸的加工的产品，例如鱼、家畜肉和谷物、盐腌的食品和作料(例如调味品)。对于加入这种添加剂的方法没有具体的限制。例如，当生产加工的食品时，可以将这种添加剂加入到腌汁溶液、作料或食品原料中。
本发明的抗氧化剂不但可以以食品添加剂的形式使用，而且可以以充当体内抗氧化剂的食品或药物制剂的形式使用。此外，可以按照传统方法、以合适的食品或制剂形式制备抗氧化剂，如果需要的话，可以使用合适的载体、赋形剂等等。
这种形式的食品可以是饮料、固体食品或半固体食品。饮料的具体例子包括天然果汁饮料、软饮料和酒精饮料。另外，在摄取之前，饮料也可以是用水稀释的形式，等等。固体或半固体食品的例子包括片剂，糖衣片，颗粒，粉末状食品例如粉末饮料和粉末汤，块状糖食例如饼干，胶囊，和凝胶剂。根据需要，通常用于食品加工中的各种添加剂还可以是复合的。这种添加剂的例子包括稳定剂，pH值调节剂，糖，甜味剂，香料，各种维生素，矿物质，抗氧化剂，赋形剂，增溶剂，结合剂，润滑剂，悬浮液，湿润剂，成膜物质，味道矫正剂，香味矫正剂，色料，和防腐剂。
可以按照传统方法，以制剂的形式制备本发明的抗氧化剂。在这种情况下，可以从常规物质之中充分选择载体、赋形剂、结合剂、防腐剂、氧化稳定剂、崩解剂、润滑剂、味道矫正剂或稀释剂。对于这种制剂的形式没有具体限制，可以根据需要充分地选择。通常可以将本发明的抗氧化剂配制为口服制剂，包括片剂，胶囊，颗粒，微粒剂，粉末，丸剂，液体，糖浆剂，悬浮液，乳状液，酏剂，等等，或肠胃外的制剂，包括注射剂，滴剂，栓剂，吸入剂，透皮吸附药，转化粘液质吸附药，经鼻制剂，肠内制剂，粘附剂，油膏，等等。
5.按照本发明的口服皮肤增白剂的使用方法
如上面2中所述，来源于西印度樱桃果实的果胶或其水解物用作口服皮肤增白剂的活性组分。
同时，众所周知，在西印度樱桃果实中富含的抗坏血酸也可以用作口服皮肤增白剂的活性组分。
更优选，除了来源于西印度樱桃果实的果胶或其水解物之外，本发明的口服皮肤增白剂还含有抗坏血酸。
含有来源于西印度樱桃果实的果胶的水解物和抗坏血酸的口服皮肤增白剂，可以使用各自独立制备的来源于西印度樱桃果实的果胶的水解物和抗坏血酸来制备。另外，还可以通过下列方法制备皮肤增白剂。具体地说，这种方法包括：将西印度樱桃果实或含有抗坏血酸和果肉渣的西印度樱桃果实的加工产品水解的步骤。具体地说，在此步骤中，将果肉渣中的果胶水解，使得相对于抗坏血酸的半乳糖醛酸的量是5％重量或更多。本文中，“果肉渣”是指包含在果实中的纤维性组份。这种果肉渣通常含有纤维骨架例如果胶或纤维素作为主要成分，并且具有一定结构，以使其它组分与骨架以各种模式结合。当果胶被水解时，可以提高游离半乳糖醛酸的量。由此，产生的半乳糖醛酸的量可以是果胶水解进展的一个指标。在本发明的实施方案中，优选进行果胶水解，以使相对于抗坏血酸的半乳糖醛酸的量是5％重量或更多，且更优选10％重量。对于水解程度没有具体的上限。这种水解的典型程度，是相对于抗坏血酸的半乳糖醛酸的量是20％重量或更小。此外，可以通过滴定试验来定量抗坏血酸，在滴定试验中，蓝色的0.02％2，6-二氯靛酚水溶液转变为无色，这是由于抗坏血酸的还原效果。半乳糖醛酸可以通过3，5-二甲苯酚方法进行定量，如实施例3所述。
优选，按照本发明的口服皮肤增白剂是基本上除去葡萄糖和果糖的药剂。当基本上除去这些糖时，加工(粉末化)的产品具有更低的吸湿性。由此，这种药剂具有以下优点：它能够允许加入较低数量的赋形剂等等，并由此能够增加活性组分的比例。此外，按照本发明的皮肤增白剂是口服摄取的。由此，由于除去糖的结果，该药剂具有更低的卡路里，这也是适宜的。表述“基本上除去葡萄糖和果糖”，是指当将加工的产品粉末化时，将葡萄糖和果糖除去到一定程度，以使吸湿性充分降低。
可以通过例如使用酵母发酵的方法除去葡萄糖和果糖。在发酵中，葡萄糖和果糖转变为二氧化碳气和乙醇，而后除去。因为皮肤增白剂的有用组分例如抗坏血酸没有失去，通过发酵除去糖的这种步骤是有利的。降解果肉渣的步骤和除去糖的步骤可以以这种顺序进行，反之亦然，或可以同时进行这两个步骤。
本发明的口服皮肤增白剂可以独自使用，或与其它组分以食品或饮料组合物或药物组合物的形式组合使用。举例来说，希望皮肤增白剂不但有助于皮肤增白，而且可以产生预防皮肤老化或预防或治疗皮肤癌的效果。
食品或饮料组合物形式的例子包括饮料、固体食品和半固体食品。这种组合物也可以是用于特定健康用途的营养增补剂或食品的形式。饮料的具体例子包括果汁饮料、软饮料和酒精饮料。另外，在摄取之前，食品饮料组合物可以是用水稀释的形式，等等。固体食品可以是各种形式。这种形式的例子包括片剂例如糖果和锭剂，糖衣片，颗粒，粉末例如粉末饮料和粉末汤，块状糖食例如饼干，胶囊，和凝胶剂。半固体食品形式的例子包括膏剂例如果酱和胶质例如口香糖。除了本发明的皮肤增白剂之外，这些食品或饮料组合物还可以与通常用作食品起始原料的各种成份在使得本发明的最佳效果没有退化的范围之内混合。这种成份的例子包括水、醇、甜味剂、酸化剂、色料、防腐剂、芳香剂和赋形剂。这些成份可以单独使用或两种或多种组合使用。
对于药物组合物的形式没有具体限制，只要该形式是口服制剂。可能形式的例子包括粉末、片剂、颗粒、微粒剂、液体、胶囊、丸剂、锭剂、内服使用的液剂、悬浮液、乳状液、糖浆液和酏剂。根据症状，制剂的这些形式可以单独使用或两种或多种组合使用。可按照传统方法制备出这些制剂形式中的每种制剂。在这种情况下，可以从惯用的物质之中充分选择使用的载体、赋形剂、结合剂、防腐剂、氧化稳定剂、崩解剂、润滑剂、味道矫正剂或稀释剂等等。例如，当进行粉末化时，可以使用贝壳钙增加流动性。
可以按照症状和目的适当地选择按照本发明的口服皮肤增白剂的剂量。当药剂用作抑制色素淀积(由于斑点或晒斑)的药物制剂时，优选，摄取按照本发明的口服皮肤增白剂的剂量，可以使抗坏血酸的摄取剂量在每天300毫克至600毫克的范围。
实施例1
实验1.1.从果汁中收集抗氧化果胶
实验1.1.1.从桃汁、葡萄柚汁、柠檬汁和葡萄汁中收集果胶
使用切刀从用作样品的果实中除去果皮和籽，以便只获得食用部分。紧接着，使用榨汁器粉碎可食部分。在4950rpm和20℃条件下，将粉碎产品离心60分钟。使用0.2μm过滤器，将各个上清液过滤，由此收集纯的果汁溶液。将乙醇加入到果汁溶液中，加入量为溶液重量的3倍。然后搅拌混合物，在室温下静置过夜，而后在20℃、在4950 rpm下离心20分钟，由此收集沉淀。该沉淀是来源于果汁样品的果胶。此外，为了增加果胶的纯化度，将沉淀溶于净化水中，净化水的数量大于沉淀10或更多倍。将乙醇加入到溶液中，加入数量是总重量的两倍。搅拌该溶液，在室温下静置30分钟，而后在20℃、在4950 rpm下离心20分钟，由此收集沉淀。将沉淀通过冷冻干燥进行干燥，以便收集来源于果汁样品的果胶。在各个实验中所使用的样品数量和收集的果胶数量列于表1中。
表1
样品     桃汁     葡萄柚汁     柠檬汁     葡萄汁
使用的果实重量     5264g     6383g     2992g     5294g
过滤后的果汁重量     2942g     3468g     1232g     2886g
干燥果胶重量     9.93g     3.35g     1.2g     12.12g
实验1.1.2.从绿色西印度樱桃果汁中收集果胶
使用果肉渣精轧机，从不成熟的绿色西印度樱桃果实(当它们形成红色时，在成熟之前是绿色至黄色)除去籽，由此制备果泥。将18337克果泥在4200rpm、在20℃下离心45分钟，而后收集上清液。使用0.2μm过滤器过滤上清液，以便收集13632克纯的果汁溶液。由于溶液的量是过量的，使用真空蒸馏设备将溶液浓缩。由此，收集4258克溶液。将乙醇加入到果汁溶液中，加入量为溶液重量的3倍。然后搅拌该混合物，而后在室温下放置过夜。使用不锈钢网收集固体。为了增加果胶的纯化度，将沉淀溶于净化水中，将乙醇加入到溶液中，加入数量是总重量的两倍，而后搅拌该混合物。将生成物在室温下静置30分钟，而后在20℃、在4200rpm下离心30分钟，由此收集沉淀。为了进一步提高果胶的纯化度，将沉淀溶于净化水中，将乙醇加入到溶液中，加入量为溶液重量的3倍，而后搅拌该混合物。将生成物在室温下静置30分钟，而后在20℃、在4200rpm下离心30分钟，由此收集沉淀。总计进行3次乙醇沉淀法。将沉淀通过冷冻干燥进行干燥，由此收集19.7克来源于绿色西印度樱桃果汁的果胶。
实验1.1.3.抗氧化效能的评价
通过试验方法1中描述的有关抑制β-胡萝卜素褪色的试验、和试验方法2中描述的DPPH自由基清除活性试验来评价5种来源于果汁的果胶。表2显示了结果。一种结果是所有种类的果胶产生抑制β-胡萝卜素褪色的效果，其是抗氧化的效果。然而，只有在来源于西印度樱桃果汁的果胶中观察到强烈的DPPH自由基清除活性。这种来源于西印度樱桃果汁的果胶具有DPPH自由基清除效果，因此预计其可以具有针对许多目标的抗氧化效能。如上所述，显示了抗氧化果胶可以通过进行乙醇沉淀法、由没有失去抗氧化活性的西印度樱桃果汁产生。
表2
来源于果汁的果胶的抗氧化活性
果胶种类     在具有0.025％浓度的样品中的β-胡萝卜素褪色的抑制比(％)     在具有0.1％浓度的样品中的DPPH自由基清除比(％)
桃汁     14％     0.8％
葡萄柚汁     57％     0％
柠檬汁     77％     0％
葡萄汁     82％     6.6％
绿色西印度樱桃果汁     88％     83.2％
实验1.2.从果肉渣中收集抗氧化果胶
实验1.2.1.从桃子果肉渣、葡萄柚果肉渣、柠檬果肉渣和葡萄果肉渣中 收集果胶
使用切刀从用作样品的果实中除去果皮和籽，以便只获得食用部分。紧接着，使用榨汁器粉碎可食部分。在4950rpm和20℃条件下，将粉碎产品离心60分钟，由此收集沉淀。沉淀是来源于果实的果肉渣。将果肉渣量3.5至8倍的净化水加入到果肉渣中，以便能够搅拌。搅拌生成物，而后加入浓盐酸，调节生成物pH值至2.0。将生成物在80℃加热2小时，同时搅拌生成物，而后在室温下过夜搅拌。在4950rpm和20℃条件下，将该溶液离心60分钟，由此收集上清液。使用0.2μm过滤器过滤上清液，以便收集纯的果胶提取物。将乙醇加入到提取物中，加入数量是提取物重量的两倍。然后搅拌混合物，在室温下静置过夜，而后在20℃、在4950rpm下离心20分钟，由此收集沉淀。该沉淀是来源于果肉渣样品的果胶。此外，为了增加果胶的纯化度，将沉淀溶于净化水中，净化水的数量大于沉淀10或更多倍。加入乙醇，加入数量是总重量的两倍，而后搅拌生成物。将生成物在室温下静置30分钟，而后在20℃、在4950rpm下离心20分钟，由此收集沉淀。将沉淀通过冷冻干燥进行干燥，以便收集来源于果肉渣样品的果胶。在各个实验中所使用的样品数量和收集的果胶数量列于表3中。
表3
样品     桃子果肉渣   葡萄柚果肉渣   柠檬果肉渣 葡萄果肉渣
此处使用的果实重量     5264g   6383g   2992g 5294g
果肉渣重量     1302g   1644g   826g 581g
干燥果胶重量     10.92g   40.62g   17g 2.87g
实验1.2.2从绿色西印度樱桃果肉渣中收集果胶
使用果肉渣精轧机，从不成熟的绿色西印度樱桃果实(当它们形成红色时，在成熟之前是绿色至黄色)除去籽，由此制备果泥。将18337克果泥在4200rpm、在20℃下离心45分钟，而后收集3386克沉淀。沉淀是西印度樱桃果肉渣。将果肉渣量5倍的净化水加入到果肉渣中，以便能够搅拌。然后搅拌该混合物。加入浓盐酸，调节生成物pH值至2.0。将生成物在80℃加热2小时，同时搅拌生成物，而后在室温下过夜搅拌。在4200rpm和20℃条件下，将该溶液离心30分钟，由此收集上清液。使用0.2μm过滤器过滤上清液，以便收集纯的果胶提取物。将乙醇加入到溶液中，加入数量是溶液重量的两倍，而后搅拌该混合物。将混合物在室温下放置过夜，而后使用不锈钢网收集固体。为了增加果胶的纯化度，将沉淀溶于净化水中，将乙醇加入到溶液中，加入数量是总重量的两倍，而后搅拌该混合物。将混合物在室温下静置30分钟，而后在20℃、在4200rpm下离心30分钟，由此收集沉淀。为了进一步提高果胶的纯化度，将沉淀溶于净化水中，将乙醇加入到溶液中，加入数量是总重量的两倍，而后搅拌该混合物。将混合物在室温下静置30分钟，而后在20℃、在4200 rpm下离心30分钟，由此收集沉淀。总计进行3次乙醇沉淀法。将沉淀通过冷冻干燥进行干燥，由此收集38.63克来源于绿色西印度樱桃果肉渣的果胶。
实验1.2.3.抗氧化效能的评价
通过试验方法1中描述的有关抑制β-胡萝卜素褪色试验和试验方法2中描述的DPPH自由基清除活性试验，评价5种来源于果肉渣的果胶的抗氧化效能。表4显示了结果。结果是，所有种类的果胶都产生抑制β-胡萝卜素褪色的效果，其是一种抗氧化效果。然而，只有在来源于西印度樱桃果肉渣的果胶中观察到强烈的DPPH自由基清除活性。这种来源于西印度樱桃果肉渣的果胶具有DPPH自由基清除效果，因此预计其可以具有针对许多目标氧化的抗氧化效能。如上所述，显示了这种抗氧化果胶可以通过使用酸进行热处理和乙醇沉淀法、由没有失去抗氧化活性的西印度樱桃果肉渣产生。
表4
来源于果肉渣的果胶的抗氧化活性
果胶种类     在具有0.025％浓度的样品中的β-胡萝卜素褪色的抑制比(％)     在具有0.1％浓度的样品中的DPPH自由基清除比(％)
桃子果肉渣     31％     0.4％
葡萄柚果肉渣     35％     0％
柠檬果肉渣     32％     0％
葡萄果肉渣     55％     0.4％
绿色西印度樱桃果实果肉渣     80％     34.6％
实验1.3.来源于不同成熟度的西印度樱桃果实的抗氧化果胶的评价
通过DPPH自由基50％清除活性试验(参见试验方法2)，评价来源于绿色-果实-果汁的果胶和来源于绿色-果实-果肉渣的果胶(由绿色西印度樱桃果实获得，按照上面的1.1和1.2制备)的抗氧化活性。此外，利用相同试验，评价由已经充分成熟、形成红色的成熟西印度樱桃果实、通过下列方法制备的果胶的抗氧化活性。
实验1.3.1.从成熟西印度樱桃的果汁中采集果胶
使用果肉渣精轧机，从已经充分成熟、形成红色的成熟西印度樱桃果实中除去籽，由此制备果泥。将21861克果泥在4200rpm、在20℃下离心45分钟，而后收集上清液。使用0.2μm过滤器过滤上清液，以便收集15324克纯的果汁溶液。由于溶液的量是过量的，使用真空蒸馏设备将溶液浓缩。由此，收集5618克浓缩液。将乙醇加入到果汁溶液中，加入数量大于溶液重量3倍。然后搅拌该混合物，而后在室温下放置过夜。使用不锈钢网收集固体。为了增加果胶的纯化度，将沉淀溶于净化水中，将乙醇加入到溶液中，加入数量是总重量的两倍，而后搅拌该混合物。将混合物在室温下静置30分钟，而后在20℃、在4200rpm下离心30分钟，由此收集沉淀。为了进一步提高果胶的纯化度，将沉淀溶于净化水中，将乙醇加入到溶液中，加入数量大于总重量的3倍，而后搅拌该混合物。将混合物在室温下静置30分钟，而后在20℃、在4200rpm下离心30分钟，由此收集沉淀。总计进行3次乙醇沉淀法。将沉淀通过冷冻干燥进行干燥，由此收集39克来源于成熟西印度樱桃果汁的果胶。
实验1.3.2.从成熟西印度樱桃果实的果肉渣中采集果胶
使用果肉渣精轧机，从已经充分成熟、形成红色的成熟西印度樱桃果实中除去籽，由此制备果泥。将21861克果泥在4200rpm、在20℃下离心45分钟，而后收集5022克沉淀。这些沉淀物是西印度樱桃果肉渣。将净化水加入到果肉渣中，数量大于果肉渣5倍，以便能够搅拌。然后搅拌该混合物。加入浓盐酸，调节生成物pH值至2.0。将生成物在80℃加热2小时，同时搅拌，而后在室温下过夜搅拌。在4200rpm和20℃条件下，将该溶液离心30分钟，由此收集上清液。使用0.2μm过滤器过滤上清液，以便收集纯的果胶提取物。由于溶液的量是过量的，通过真空蒸馏将溶液浓缩。由此，收集9159克溶液。将乙醇加入到溶液中，加入数量是溶液重量的两倍。然后搅拌该混合物，而后在室温下放置过夜。使用不锈钢网收集固体。为了增加果胶的纯化度，将沉淀溶于净化水中，将乙醇加入到溶液中，加入数量是总重量的两倍，而后搅拌该混合物。将混合物在室温下静置30分钟，而后在20℃、在4200rpm下离心30分钟，由此收集沉淀。为了进一步提高果胶的纯化度，将沉淀溶于净化水中，将乙醇加入到溶液中，加入数量是总重量的两倍，而后搅拌该混合物。将混合物在室温下静置30分钟，而后在20℃、在4200rpm下离心30分钟，由此收集沉淀。总计进行3次乙醇沉淀法。将沉淀通过冷冻干燥进行干燥，由此收集26克来源于成熟西印度樱桃果实的果肉渣的果胶。
实验1.3.3.抗氧化效能的评价
通过DPPH自由基50％清除活性试验，评价4种来源于西印度樱桃的果胶的抗氧化活性。表5显示了结果。各个试验结果说明了需要清除50％DPPH自由基的样品的浓度。它表示，样品的浓度越低、相关果胶的抗氧化效能越强。结果是，在所有种类的果胶中，观察到了足够的抗氧化效能。然而，来源于绿色果实的果胶的抗氧化效能，比来源于成熟果实的果胶的抗氧化效能更强。因此，可以断定，绿色西印度樱桃果实更适宜作为抗氧化果胶提取物的原料。
表5
具有不同成熟度的西印度樱桃果实果胶的抗氧化效能
果胶种类     清除50％DPPH自由基所需要的果胶浓度
源于绿色果实果汁的果胶     0.05％
源于绿色果实果肉渣的果胶     0.14％
源于成熟果实果汁的果胶     0.23％
源于成熟果实果肉渣的果胶     0.25％
实验1.4.通过果胶酶处理来制备抗氧化果胶的方法
使用果肉渣精轧机(将果汁和果肉渣与籽分离的装置)，用绿色西印度樱桃果实制备西印度樱桃果泥，而后冷冻保存。将西印度樱桃果泥解冻。将19899克解冻的西印度樱桃果泥升温至室温。将0.1％(W/W)果胶酶(果胶酶A“Amano”，Amano Enzyme Inc.)加入到生成物中，而后在50℃搅拌2小时。在室温下继续搅拌，直到第二天为止。将酶处理的果泥离心(4950rpm和30分钟)，由此收集上清液。为了除去不能溶解的组分，将上清液过滤几次，而后最终用0.2μm过滤器过滤。由此，通过过滤收集17420克果汁。然后使用真空蒸馏和浓缩装置将溶液浓缩，以便收集2981克浓缩液。将乙醇加入到浓缩液中，加入量为浓缩液重量的4倍。在室温下将溶液静置1或更多天，而后离心(4950rpm和5分钟)，由此收集600克(含水)乙醇沉淀物(第一次)。将净化水加入到乙醇沉淀物中，加入量为沉淀物重量的20倍，以便将沉淀溶解。将乙醇进一步加入到沉淀中，加入数量是沉淀重量的两倍，而后将生成物冷藏1或更多天。使用玻璃纤维过滤器过滤溶液。收集544克残留在滤纸上的第二次乙醇沉淀物(含水)。将净化水加入到沉淀中，然后将沉淀溶解。将乙醇加入到溶液中，相对于溶液，加入数量相等，而后将生成物冷藏1或更多天。使用玻璃纤维过滤器过滤溶液。收集434克残留在滤纸上的第三次乙醇沉淀物(含水)。将沉淀在-80℃冷冻。沉淀完全冷冻后，进行冷冻干燥。由此，收集78克来源于西印度樱桃的果胶粉。
由此获得的来源于西印度樱桃的果胶的抗氧化效能，可与来源于绿色-果实-果汁的果胶和来源于绿色-果实-果肉渣的果胶(从绿色西印度樱桃果实处获得，按照实验1.1和1.2制备)相比较。
通过DPPH自由基50％清除效能试验(试验方法2)，评价各个果胶的抗氧化效能。表6显示了结果。
表6
抗氧化果胶的收集比例(％)和抗氧化活性
果胶种类     基于果泥重量的收集比例(％)   清除50％DPPH自由基所需要的果胶浓度
源于绿色果实果汁的果胶     0.11％*   0.05％
源于绿色果实果肉渣的果胶     0.21％*   0.14％
用果胶酶处理的绿色果实的果胶     0.39％   0.067％
*得自于绿色果汁的果胶和得自于绿色果实果肉渣的果胶，是用相同果泥制备的。
当果泥分离为果汁和果肉渣、且从其各自中收集果胶时，全部果胶收集比例(％)是0.32％(＝0.11％+0.21％)。同时，说明可以获得更高的收集比例(％)，以使该实验中的果胶酶处理的果胶的收集比例(％)是0.39％。此外，果胶酶处理的果胶(在该实验中获得)也具有足够的抗氧化活性。
实验1.5.通过超滤法制备抗氧化果胶溶液的方法
使用果肉渣精轧机(将果汁和果肉渣与籽分离的装置)，用绿色西印度樱桃果实制备西印度樱桃果泥，而后冷冻保存。将西印度樱桃果泥解冻。将55000克解冻的西印度樱桃果泥升温至室温。将0.1％(W/W)果胶酶(果胶酶A“Amano”，Amano Enzyme Inc.)加入到生成物中，而后在50℃搅拌2小时。在室温下继续搅拌，直到第二天为止。将酶处理的果泥离心(4950rpm和30分钟)，由此收集上清液。为了除去不能溶解的组分，将上清液过滤几次，而后最终用0.2μm过滤器过滤。由此，收集47130克果汁。使用具有分子量分离点为10,000的超滤膜(Hydrosart 10K，SARTORIUS K.K.)，对收集的产品进行超滤法。由此，收集8730克浓缩液。
浓缩液中的固体浓度是11.77％(蒸发后残余物的浓度)。对浓缩液进行乙醇沉淀法，以便收集抗氧化果胶。从500克浓缩液中收集16.87克抗氧化果胶。证明浓缩液中的抗氧化果胶含量是3.374％。基于这种浓度，计算浓缩液中的果胶重量是294.2克。基于果泥的重量，计算所收集果胶的百分比是0.53％。显示这种收集比例(％)比在实验1.4中所使用制备方法的条件下的收集比例(％)好。此外，在该实验中，按照抗氧化果胶溶液中的总固形物含量的百分比，抗氧化果胶含量是28.7％。在超滤法的情况下，可以通过改变储备溶液量与最终浓缩液量的比例来调节这种含量。
实验1.6.用实验1.5制备的溶液来制备西印度樱桃粉末的方法
将实验1.5中制备的来源于西印度樱桃的抗氧化果胶的600克浓缩液冷冻，而后将生成物通过冰冻干燥法进行冷冻干燥。结果，收集63克粉末。浓缩液中的固体的浓度是11.77％。由此，理论上的固体含量是70.62克，收集比例(％)是89.2％。粉末中的抗坏血酸的浓度是21.06％，通过靛酚法测定。基于浓缩液中的抗氧化果胶含量，计算粉末中的抗氧化果胶浓度是28.7％。冷冻干燥后，可以在良好的条件下将由此获得的粉末精细地研磨，表现出不显著的吸湿性，并且流动性极好。人们认为，抗氧化果胶充当了赋形剂。
实验1.7.来源于西印度樱桃的抗氢化果胶中的多酚的检验(1)
将实验1.4中制备的10克来源于西印度樱桃的抗氧化果胶粉溶于500毫升2N氢氧化钠水溶液中，而后使用恒温振动器、在40℃水解16小时。为了进一步提高酸性多酚的溶解度，加入浓盐酸，调节溶液的pH值至2.0。为了除去源于果胶的游离糖含量，将乙醇加入到溶液中，数量大于溶液重量的4倍。在冷藏室中，将溶液静置1或更多天，以便进行乙醇沉淀法。在与果胶收集所应用的相同条件下进行该方法，以便只有通过强碱水解的产物保持未沉淀，并且以游离状态存在于上清液之中。将已经加入乙醇的溶液离心(4200rpm和30分钟)，以便引起固体内含物沉淀，收集上清液。使用0.45μm过滤器过滤上清液，由此完全除去固体内含物。通过真空蒸馏来浓缩滤液，收集250毫升浓缩液。将可以吸收多酚的两个C18柱(Sep-Pak Vac 35 cc(10g)C18柱体，WatersCorporation)的每一个装载一半数量的浓缩液。将未被吸收的组分用净化水洗涤后，使用25％甲醇水溶液洗脱被吸收的组分。干燥洗脱液，而后使用真空蒸馏设备固化。将生成物溶于5毫升100％甲醇中，由此制备果胶提取物样品。使用分析HPLC柱(4.6mm×250mm，ODS-3，GLSciences Inc.)和0.01N盐酸水溶液与甲醇的线性梯度来分析样品中的组分。图1说明了结果。
通过该分析，证明在22.4分钟处存在主要组分。紧接着，使用制备柱，对4.5毫升果胶提取物样品进行制备分离。ODS-3(20mm×250mm，GL Sciences Inc.)用作这种制备柱。使用0.01N盐酸水溶液和甲醇的梯度、流速12毫升/分钟，进行制备分离。图2说明了制备分离的结果。
收集图2中的33.46分钟峰值处的物质，干燥并使用真空蒸馏设备固化，溶于净化水中，而后在冷藏室放置过夜。将由此产生的沉淀离心，由此收集28毫克沉淀。此外，将沉淀溶于甲醇中。然后使用配有光二极管矩阵检测器、分析HPLC柱(4.6mm×250mm，ODS-3，GL SciencesInc.)的HPLC系统，和已经加入0.05％TFA的0.05％TFA水溶液和甲醇的线性梯度，分析样品的组分。图3说明了结果。结果证明，上述沉淀是果胶提取物样品的主要组分。
此外，证明了图3所示22.4分钟处的峰值的波谱数据(图4A)。由此，显示了数据几乎与Aceronidin(参考实施例1)的波谱数据(图4B)一致。此外，使用包括HPLC装置(本文中使用的装置是LC-2010CHT(ShimadzuCorporation))(带有包括在其中的光二极管矩阵检测器(PDA；本文中使用的检测器是SPD-M20A(Shimadzu Corporation)))收集示于图4A和B中的波谱数据。
结果显示，基于以上所述HPLC洗脱时间和波谱数据，包含在来源于西印度樱桃的抗氧化果胶中的多酚很可能是Aceronidin。
实验1.8.来源于西印度樱桃的抗氧化果胶中的多酚的检验(2)
通过ESI-MS测定和NMR测定，进一步分析从来源于西印度樱桃的抗氧化果胶中提取的多酚的结构。当使用LCT质谱仪(Micromass)分析分子量时，以类似于Aceronidin情况下的方式观察m/z 473(钠加合离子(M+Na)+)。由此证明，该多酚与具有450分子量的Aceronidin相同。此外，作为1H NMR测定的结果，在3.3ppm和4.8ppm附近观察源于溶剂的峰值(图5中的下面的图)。其显示这些峰值与Aceronidin峰值(图5中的上面的图)符合很好。
如上所述，证明从来源于西印度樱桃的抗氧化果胶中提取的多酚是Aceronidin。
实验1.9.来源于西印度樱桃的、C18柱结合的果胶的制备
将在实验1.4中制备的50克来源于西印度樱桃的果胶溶于5000毫升1％六偏磷酸钠水溶液中。使用0.2μm过滤器过滤生成物。将滤液装载到二十个C18柱(Sep-Pak Vac 35cc(10g)C18柱体，WatersCorporation)上。将未被吸收的组分用净化水洗涤，而后使用50％甲醇水溶液洗脱被吸收的组分。干燥洗脱液，而后使用真空蒸馏设备固化。将生成物溶于净化水中，而后使用0.2μm过滤器除去不溶物质。然后将生成物冷冻并冷冻干燥，由此获得6.24克冷冻干燥的粉末。
对实验1.4中制备的来源于西印度樱桃的果胶(样品1)和在该实验中制备的来源于西印度樱桃的C18柱结合果胶(样品2)的多酚浓度、DPPH自由基清除活性、酪氨酸酶抑制活性和糖组成，进行各自分析。通过Folin-Denis方法，使用儿茶素作为标准物质，测定多酚浓度。通过试验方法2分析DPPH自由基清除活性，通过试验方法3进行酪氨酸酶-抑制活性试验，通过试验方法4分析糖组成。
表7
多酚的含量和活性、来源于西印度樱桃的抗氧化果胶的因素
样品号码 馏份 基于果胶酶处理的果胶的含量 多酚含量(根据儿茶素测定) 50％自由基清除活性浓度    酪氨酸酶-抑制活性
1 用果胶酶处理的果胶 100％ 5.4％ 670ppm    10.8％
2 C18-结合的果胶 12.5％ 25.3％ 125ppm    33.8％
参比 Aceronidin - 59.2％ 80ppm    3.1％
参比 α-生育酚 - - 127ppm    -
表8
糖组成(糖组成百分比(％))
糖种类     样品1(用果胶酶处理的果胶)     样品2(C18-结合的果胶)
中性糖
鼠李糖     8.85％     5.21％
甘露糖     1.63％     3.15％
阿拉伯糖     17.28％     25.60％
半乳糖     14.79％     8.60％
木糖     3.56％     2.45％
葡萄糖     8.71％     47.47％
酸性糖
半乳糖醛酸     44.93％     7.01％
葡萄糖醛酸     0.25％     0.51％
基于表7和8中的结果，人们认为来源于西印度樱桃的抗氧化果胶由主链和侧链组成，其中主链主要由多聚半乳糖醛酸组成，侧链主要由中性糖组成。基于分析C18树脂结合组分的结果，人们认为多酚可能主要存在于侧链中。具有高多酚含量的样品2也具有强烈的抗氧化活性和强烈的皮肤增白效果。由此，认为这种抗氧化活性和皮肤增白效果是由于Aceronidin的效果。然而，在Aceronidin中，几乎观察不到皮肤增白效果(抑制酪氨酸酶的效果)。因此，显示皮肤增白效果表现了来源于西印度樱桃的抗氧化果胶的独特活性。
试验方法1.1.与抑制β-胡萝卜素褪色有关的试验
该方法是测定试验物质如何抑制亚油酸的过氧化物引起β-胡萝卜素褪色的效果的方法。在该实验中，将0.48毫升10％(W/V)亚油酸/氯仿溶液、1.2毫升0.01％(W/V)β-胡萝卜素/氯仿溶液和2.4毫升20％(W/V)tween 40/氯仿溶液放进200毫升依氏烧瓶中，而后混合。将混合物用氮气吹扫，以除去氯仿。然后混合108毫升净化水和12毫升0.2M磷酸钠缓冲液(pH值6.8)。将由此制备的溶液用作亚油酸溶液。将稀释至适宜浓度的0.1毫升样品加入到4.9毫升亚油酸溶液中，然后将生成物混合。在470纳米处测定吸光度，测定值表示0分钟时的值。测定后，在50℃恒温槽中立即加热生成物。120分钟以后，在470纳米处测定吸光度。测定值表示120分钟时的值。使用净化水(用其稀释样品)代替样品来测定空白试验值。通过下列方程式计算β-胡萝卜素褪色抑制比(％)。
β-胡萝卜素褪色抑制比(％)
＝100-(1-(0分钟时的样品值-120分钟时的样品值)/((0分钟时的空白试验值-120分钟时的空白试验值))×100
试验方法1.2.DPPH自由基清除活性试验
使用稳定的diphenyl-p-picrylhydradil(DPPH)的乙醇溶液评价抗氧化活性。将1200μl乙醇和400μl样品(调节至任一浓度)与1600μl的250mM乙酸盐缓冲液(pH值＝5.5)混合，而后在30℃预培育5分钟。将800μl的500μM DPPH/乙醇溶液加入到该溶液中，并与其混合，然后在30℃将生成物静置30分钟。在517纳米处测量吸光度。对于α-生育酚也进行类似的方法，而后将该结果用作阳性对照。本文中使用的对照物是使用溶剂代替样品溶液、通过进行类似的方法来制备的。通过下列方程式、使用由此测定的吸光度来计算自由基清除比例。
清除比例(％)＝(1-[样品的吸光度]/[对照物的吸光度])×100
得到清除比例的上述测定是通过逐步改变溶液中的样品浓度来测定的。发现引起50％DPPH自由基清除比例的样品溶液的浓度，并指示需要清除50％DPPH自由基所需要的浓度。由此，可以说数字值越低、自由基清除能力越高。
试验方法1.3.抑制酪氨酸酶的效果(皮肤增白活性)
通过下列方法进行与抑制酪氨酸酶的活性有关的试验，酪氨酸酶是产生黑色素的酶。
(1)将*4毫升L-DOPA水溶液、**4毫升以不同浓度稀释的各个样品、和2毫升0.2 M磷酸盐缓冲液(pH值6.8)混合。将混合物在37℃恒温槽中加热。将此加热的混合物作为样品混合物。
*L-DOPA水溶液：将L-β-(3，4-二羟苯基)丙氨酸(Wako PureChemical Industries，Ltd)溶于0.2 M磷酸盐缓冲液(pH值6.8)中，浓度为3mM
使用0.2 M磷酸盐缓冲液将**样品全部稀释，并溶解。
(2)将在37℃加热的2.5毫升样品混合物和*0.5毫升酪氨酸酶溶液放进吸收分光计的小池中，而后在475纳米处测定。使用kinetics软件进行测定。从开始至结尾每隔0.1秒钟自动测定吸光度的变化，进行20秒钟。开始测定后，计算4秒钟和10秒钟之间的吸光度的升高速度。*酪氨酸酶溶液：将来源于蘑菇的酪氨酸酶(SIGMA)溶解在0.2M磷酸盐缓冲液(pH值6.8)中，浓度为300单位/毫升，而后使用0.2μm过滤器进行过滤，获得溶液
(3)为了获得空白试验值，使用0.2M磷酸盐缓冲液代替样品进行测定，而后通过下面的方程式计算酪氨酸酶-抑制活性。此外，将不能溶于磷酸盐缓冲液的物质溶于二甲亚砜(DMSO)中，用磷酸盐缓冲液稀释，而后测定。使用含有相同浓度DMSO的空白试验的测量结果进行计算。
酪氨酸酶活性抑制比率(％)
＝100-((样品的吸光度升高速度)/(空白试验的吸光度升高速度))×100
试验方法1.4.糖组成分析
如下进行分析。将2N三氟乙酸加入到各个样品中，而后在100℃进行水解6小时。使用净化水收集由此水解的中性糖和糖醛酸，而后进行HPLC方法。分析条件如下。
中性糖分析条件
检测器：荧光分光光度计
柱：TSK-gel Suger AXG 4.6mm×150mm(TOSOH Corporation)
流动相：0.5M硼酸钾缓冲液，pH值8.7
流动相流速：0.4mL/min
柱后标记：反应试剂1％精氨酸/3％硼酸
反应试剂流速：0.5mL/min
反应温度：150℃
检测波长：EX.320nm，EM.430nm
糖醛酸分析条件
检测器：荧光分光光度计
柱：Shimpack ISA07 4.6mm×250mm(Shimadzu Corporation)
流动相：1.0M硼酸钾缓冲液，pH值8.7
流动相流速：0.8mL/min
柱后标记：反应试剂1％精氨酸/3％硼酸
反应试剂流速：0.8mL/min
反应温度：150℃
检测波长：EX.320nm，EM.430nm
作出中性糖和糖醛酸的校准曲线，而后基于该曲线测定样品的糖含量。在该分析中，不是所有的糖链都能够水解，部分糖可能被水解，但未被检测出。
参考实施例：Aceronidin的分离和鉴定
(1)Aceronidin的分离
用于制备Aceronidin的原料是西印度樱桃粉末(NichireiCorporation，Nichirei西印度樱桃粉末VC30)，该西印度樱桃粉末是使用酵母将浓缩西印度樱桃果汁发酵、除去葡萄糖和果糖、将赋形剂食用纤维和氧化钙溶解于其中、而后粉末化来制备的。
将400克西印度樱桃粉末溶于净化水中，由此制备20％(W/W)水溶液(2000克)。将乙酸乙酯加入到水溶液中，加入体积是溶液的一半(基于体积)，而后搅拌该溶液。使用分液漏斗进行液-液分离，以便收集水层级份。将丁醇加入到水层级份中，加入体积是级份的一半(基于体积)，而后搅拌该生成物。使用分液漏斗进行液-液分离，以便收集丁醇层级份。以适宜的数量将净化水加入到丁醇层级份中。然后进行真空蒸馏，干燥和固化，由此收集24克固体。
将上述固体溶于50毫升净化水中。使用C18柱(Sep-Pak Vac 35cc(10g)C18柱体，Waters Corporation)对生成物进行部分纯化。具体地说，将样品装载到柱上，而后用净化水和10％甲醇水溶液洗涤，而后用20％甲醇水溶液洗脱。收集由此洗脱的馏份。使用真空蒸馏设备将馏份蒸干，由此收集0.8克固体。
将固体溶于10毫升20％甲醇水溶液中。通过高效液相色谱法对样品进行高纯度纯化。对于制备柱，使用Inertsil ODS-35μm 4.6×250mm(GL-science)。通过用0.5毫升每个制备分离的样品来装载柱，进行制备分离，用10％甲醇水溶液洗涤柱，用10％至50％甲醇浓度梯度洗脱，而后收集含有多酚苷的峰值处的物质。这种制备分离重复20次。
使用真空蒸馏设备，将通过上述方法纯化的含有多酚-苷的甲醇水溶液干燥并固化。将生成物悬浮在净化水中。通过离心法从上清液中分离不溶物质，而后收集。将不溶物质再次溶于甲醇中。使用真空蒸馏设备将溶液蒸干，而后再次悬浮在净化水中，由此收集不溶物质。收集不溶物质，而后使用冷冻干燥器从其中除去水，由此获得10毫克多酚苷。
(2)Aceronidin的鉴定
使用各种型式的波谱测量，测定通过上述方法分离的多酚苷的结构。
表9说明了各个测定条件。
表9
测定条件
高分辨率ESI-MS
装置：                           LCT质谱仪(Micromass)
流动相：                         甲醇(0.1毫升/分钟)
注射样品溶液的体积：             5μl
测定的离子：                     阳离子
进样：                           脉冲注射
雾化电压：                       3,000V
锥电压：                         30V
Ext.锥电压：                     2V
脱溶剂(desolvation)单元温度：    150℃
离子源温度：                     120℃
Rf透镜：                         200单位
脱溶剂(desolvation)气体：        氮气(大约700L/hr)
扫描范围：                       m/z 150至1,000(1秒)
扫描间隔：                       0.1秒
内标物质：                       亮氨酸脑啡肽
NMR
装置：                           UNITY INOVA 500(Varian)
观测频率：                       1H：499.8 MHz，13C：125.7 MHz
溶剂：                           CD3OD
浓度：                           6.3mg/0.65mL
标准：                           TMS
温度：                           25℃
1H NMR测定：
观察宽度：    5KHz
数据点：      64K
脉冲角度：    30°
脉冲重复周期：10sec
累计次数：    16次
13C NMR测定：
观察宽度：    30KHz
数据点：      64K
脉冲角度：    45°
脉冲重复周期：3sec
累计次数：    2,400次
DEPT测定：(具有正信号的CH和CH3的测定和具有负信号的CH2的测定)
观察宽度：    30KHz
数据点：      64K
脉冲重复周期：3sec
累计次数：    800次
DQF-COSY测定：
观察宽度：    t2轴：5KHz
              t1轴：5KHz
数据点：      t2轴：2048
              t1轴：256×2(zerofilling to 2048)
脉冲等待时间：3sec
累计次数：    16次
HSQC测定
观察宽度：    t2轴：20KHz
              t1轴：5KHz
数据点：      t2轴：2048
              t1轴：256×2(zerofilling to 2048)
脉冲等待时间：2.5sec
累计次数：    16次
HMBC测定：
观察宽度：    t2轴：25KHz
              t1轴：5KHz
数据点：      t2轴：2048
              t1轴：512(zerofilling to 2048)
脉冲等待时间：2.5sec
累计次数：    32次
NOESY测定：
观察宽度：    t2轴：5KHz
              t1轴：5KHz
数据点：      t2轴：2048
              t1轴：256×2(zerofilling to 2048)
混合时间：    1sec
脉冲等待时间：3.446sec
累计次数：    16次
缩写
DEPT：Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
(测定碳种类(在CH3、CH2、CH和C之间辨别)的方法)
DQF-COSY：Double Quantum Filtered Correlation Spectroscopy
(1H-1H COSY的方法)
NOESY：Nuclear Overhauser Effect SpectroscopyY
HSQC：Heteronuclear Single Quantum Coherence
(1H-13C COSY的方法)
HMBC：Heteronuclear Multiple Bond Correlation
(远程1H-13C COSY的方法)
高分辨率ESI-MS
图6A说明了全部离子色谱，图6B说明了高分辨率ESI质谱。在这种测定中，强烈地观察到具有m/z 473的钠加合离子(M+Na)+，而后使用其精确的质量(实际测定值)计算化学组成，m/z 473.1064。C、H、O、和Na元素各自用于化学组成计算。结果，测定的组成式是C21H22O11Na。理论的精确质量是m/z 473.1060，具有0.4 mDa的误差。在该测定中，由于已经加入钠的这种离子的存在，Aceronidin的组成式是C21H22O11，分子量是450。
NMR测定
从高磁场侧(右侧)，指定符号“a”至“o”为1H NMR信号，指定“A”至“U”为13C NMR信号，而后进行分析。
1H NMR
图7说明了1H NMR波谱，表10显示了信号的列表。
表10
  频率(PPM)   HZ     SUB   高度
  6.9206.9166.8546.8506.8386.8346.7956.7795.9875.9835.8025.7975.3255.3034.8724.8654.8504.6404.6244.5774.2674.2614.2454.2393.8193.7973.7943.6383.6283.6143.6033.5853.5833.5663.3873.3613.3483.3283.3093.3053.3023.2993.2853.2693.2663.2501.2860.000   3458.7103456.8793425.9033423.9203417.8163415.8333396.4543388.3672992.7062990.4172899.9332897.6442661.8962650.9092435.1502431.7932424.1642319.3362311.4012287.7502133.0262129.6692122.0402118.6831909.0271897.8881896.5151818.3901813.3541806.3351800.6901791.84O1790.9241782.5321692.9631679.8401673.4311663.6661653.7481652.2221650.6961649.1701642.1511634.0641632.5381624.603642.5480.000     -3458.7101.83130.9751.9846.1041.98419.3798.087395.6602.28990.4852.289235.74810.986215.7593.3577.629104.8287.93523.651154.7243.3577.6293.357209.65611.1391.37378.1255.0357.0195.6468.8500.9168.39289.56913.1236.4099.7669.9181.5261.5261.5267.0198.0871.5267.935982.056642.548     404.1434.4161.4147.3274.7259.7495.8295.5467.1491.9459.7442.6301.3317.5393.5494.38167.5301.6312.723.6180.7178.2177.6173.1175.8213.7206.9125.0144.5121.1190.3162.1161.4137.334.939B.1273.761.3385.3520.1398.0228.9189.1218.5206.6158.918.9484.1
1H NMR波谱说明存在1，2，4-三取代的苯(“o”，“n”，“m”信号)和1，2，4，5-四取代的苯(“l”或“k”信号)的部分结构。此外，基于化学位移值，“a”至“j”信号归位是CHn-O(n＝1或2)。
13CNMR
图8显示了13C NMR波谱，表11显示了信号的列表。
表11
频率(PPM)     Hz     SUB   高度
 161.130159.397157.918147.073146.527130.016121.217116.294116.090101.11597.31395.73394.62681.35579.89976.25774.86674.80872.05568.63962.60849.56349.39649.22849.05448.88648.71148.5440.000   20251.68020033.81219847.98318484.93318416.27716341.03615235.21714616.39814590.76612708.67812230.83212032.18711893.04510225.16210042.0809584.3739409.5299402.2069056.1808626.8517868.8896229.3856208.3306187.2766165.3066144.2516122.2826101.2270.000    -20251.680217.868185.8291363.05068.6562075.2411105.819618.81925.6321882.089477.846198.645139.1431667.882183.083457.706174.8447.323346.026429.329757.9621639.50521.05421.05421.97021.05421.97021.0546101.227     58.165.170.460.665.749.2106.084.477.543.754.070.193.7100.6112.674.988.391.875.991.263.1761.52610.44509.35972.05092.52329.7898.49.8
在13C NMR波谱的情况下，观察到21个信号，结果与MS测量结果一致。没有观察到酮羰基的信号。
DEPT
图9表示DEPT波谱。基于该波谱，确定了各个信号的碳归属(参见表12)。
DQF-COSY
图10表示DQF-COSY波谱。下列部分结构从该波谱得出。
(1)j(5.31ppm)-g(4.25ppm)-I(4.87ppm)
-CH(j)-CH(g)-CH(i)-
(2)h(4.63ppm)-a(3.27ppm)-d(3.58ppm)-b(3.35ppm)或c
f(3.81ppm)-e(3.62ppm)-c(3.36ppm)或b
HSQC
图11表示HSQC波谱。由HSQC波谱测定在1J(1H，13C)处偶合的1H和13C。表12显示了该结果的概述。
表12
13C的类型、13C的化学位移、
与13C键合的1H的化学位移和自旋偶合常数
  13C信号 13C的类型 13C的化学位移(ppm)   与13C键合的1H的化学位移(ppm) 自旋偶合常数J(Hz)
    A   CH2     62.6     e(3.62)，f(3.81)     Je，f＝12.1，Je，c＝5.3，Jf，c＝1.4
    B   CH     68.6     i(4.87)     Ji，g＝3.4
    C   CH     72.1     b(3.35)
    D   CH     74.8     j(5.31)     Jj，g＝11.0
    E   CH     74.9     d(3.58)     Jd，b＝8.4
    F   CH     76.3     g(4.25)
    G   CH     79.9     c(3.36)
    H   CH     81.4     a(3.27)     Ja，d＝9.5
    I   CH     94.6     h(4.63)     Ja，h＝7.9
    J   CH     95.7     k(5.80)     Jk，l＝2.3
    K   CH     97.3     l(5.99)
    L   C     101.1     -     -
    M   CH     116.1     o(6.92)     Jo，n＝2.0
    N   CH     116.3     m(6.79)     Jm，n＝8.1
    O   CH     121.2     n(6.84)
    P   C     130.0     -     -
    Q   C     146.5     -     -
    R   C     147.1     -     -
    S   C     157.9     -     -
    T   C     159.4     -     -
    U   C     161.1     -     -
Figure S2006800147688D00371
HMBC
图12表示HMBC波谱。表13显示了在HMBC波谱中所观察到的远程相关信号。
表13
a-B，C，E，I
b-A，E，G
c-C，E
d-C，H，I
e，f-C，G
g-B，D，I，P
h-E，G，H
i-D，F，H，L，S，T
j-B，F，M，O，P，S
k-K，L，S，U
l-J，L，T，U
m-P，Q，R
n-D，M，R
o-D，O，R
本发明化合物的平面结构源自于该结果。
NOESY测定
图13表示NOESY波谱。如NOESY波谱所示，观察到质子之间的下列相关信号。
Figure S2006800147688D00381
Jh，a＝7.9Hz、Ja，d＝9.5Hz和Jd，b＝8.4Hz的自旋偶合常数是糖的特征，表示其为Axial-Axial型。
在“h”和“c”质子之间观察到NOE，表示在Axial位置存在“c”质子。因此，确定糖组份是β-葡萄糖。
其中葡萄糖的1位OH和2位OH为如上所述进行偶合的结构，是从“g”质子和“I”碳、“i”质子和“H”碳、“a”质子和“B”碳之间的HMBC相关信号推断的。
从“A”和“i”、“h”和“j”、“g”和“i”质子之间的NOE，如上所述推断“j”、“g”和“i”质子的相对构型。
Ji，g＝11.0Hz和Jg，i＝3.4Hz表示上述相对构型。
表14是归属列表的概述，其中将原子加以编号。
表14
NMR归属表
碳编号   13C的化学位移(ppm)   1H的化学位移(ppm)   自旋偶合常数J(Hz)
    2     74.8     5.31     J2，3＝11.0
    3     76.3     4.25     J3，4＝3.4
    4     68.6     4.87
    4a     101.1     -     -
    5     159.4     -     -
    6     97.3     5.99     J6，8＝2.3
    7     161.1     -     -
    8     95.7     5.80     J6，8＝2.3
    8a     157.9     -     -
    1′     130.0     -     -
    2′     116.1     6.92     J2′，6′＝2.0
    3′     146.5     -     -
    4′     147.1     -     -
    5′     116.3     6.79     J5′，6′＝8.1
    6′     121.2     6.84
    1″     94.6     4.63     J1″，2″＝7.9
    2″     81.4     3.27     J2″，3″＝9.5
    3″     74.9     3.58     J3″，4″＝8.4
    4″     72.1     3.35
    5″     79.9     3.36     J5″，6″＝5.3，1.4
    6″     62.6     3.62，3.81     J6″，6″＝12.1
Figure S2006800147688D00401
基于上述结果，确定新的多酚苷具有下面结构式表示的结构：
本发明人将新的多酚苷命名为Aceronidin。
实施例2
实验2.1.西印度樱桃粉末的制备
将1400千克浓缩西印度樱桃果汁(在Brazil制备)用净化水稀释，以便制备具有31％Brix值的溶液。将1％重量酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))加入到该溶液中。在30℃进行发酵20小时，以便除去葡萄糖和果糖。发酵后，进行离心和过滤。由此，获得2297千克已经除去葡萄糖和果糖的加工和浓缩的西印度樱桃果汁。将4.0％(W/W)食用纤维(食用纤维相对于果汁的固体含量(重量)比例)和1.5％(W/W)贝壳钙(钙相对于果汁的固体含量(重量)比例)作为赋形剂和加工试剂，分别溶解在加工和浓缩的西印度樱桃果汁中。通过喷雾-干燥法将溶液粉末化，由此获得806千克西印度樱桃粉末。该西印度樱桃粉末含有35.3％(W/W)维生素C和1.5％(W/W)多酚。
通过下列方法测定西印度樱桃粉末中的多酚含量。将西印度樱桃粉末以20％的浓度(W/W)溶于净化水中。将C18柱(Sep-Pak Vac 35 cc(10g)C18柱体，Waters Corporation)装载上50克溶液，用净化水洗涤柱，而后收集用甲醇洗脱的馏份。使用儿茶素((+)-儿茶素水合物，Sigma-Aldrich Corporation)作为标准物质，通过Folin-Denis方法测定甲醇-洗脱馏份中的多酚的数量。使用西印度樱桃粉末的重量(用于装载柱的重量)、收集的甲醇洗脱液的量和测定的多酚的量，计算西印度樱桃粉末中的多酚含量。此外，借助于该测定方法，与果胶骨架形成复合物的Aceronidin可以不必测量为“多酚”。
人们认为，C18柱吸附的组分含有多酚。由此，在该实施例中，使用C18柱吸附组分的量作为指标来测定多酚的量。
实验2.2.已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末水溶液的制备
将实验2.1中制备的西印度樱桃粉末溶于净化水中，浓度20％(W/W)，由此制备50毫升水溶液。将C18柱(Sep-Pak Vac 35cc C18柱体，Waters Corporation)装载上溶液，而后将含有游离多酚等等的C18柱吸附组分吸附到该柱中。将已经通过该柱的馏份进行收集，以便制备已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末的水溶液。发现溶液中的固体的浓度是15.3％(W/W)。通过高效液相色谱法(C18柱：ODS-34.6mm×250mm GL Sciences Inc.)测定水溶液中的多酚的量。由此获得样品中的多酚的峰面积，可与除去C18柱吸附的组分前的通过分析西印度樱桃粉末水溶液获得的多酚的峰面积(多酚浓度：0.3％(W/W))相比较。当比较后计算比例时，证明样品中的多酚浓度是与其比较的产物的1％或更小(具体地说，多酚浓度：0.003％(W/W)或更小)。具体地说，基于固体含量，已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末中的多酚含量是0.02％(W/W)或更小。
在下面实验中使用由此获得的水溶液。在说明书中，该水溶液被称为“已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末的水溶液”。此外，包含在水溶液中的固体可以称为“已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末”。
实验2.3.已经除去C18柱吸附组分和维生素C的西印度樱桃粉末水溶 液的制备
将已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末的水溶液(在实验2.2中制备)用净化水稀释，固体浓度0.1％(W/W)。将100μl抗坏血酸氧化酶(TOYOBO Co.，Ltd.)溶液加入到5毫升该水溶液中，产生30U的酶活性。此外，将400μl的10mM磷酸氢二钠水溶液加入到该溶液中，而后在30℃、在恒温槽中反应过夜。反应完毕后，在120℃进行热处理10分钟，由此使酶失活。通过高效液相色谱法测定维生素C的残留量，确定该数量相当于酶处理前的1％或更少。此外，在酶处理之前，基于固体含量，发现维生素C含量是35.3％(W/W)。因此，基于固体含量，除去维生素C后的西印度樱桃粉末中的维生素C含量是0.35％(W/W)或更小。
在下面实验中使用由此获得的水溶液。在说明书中，该水溶液被称为“已经除去C18柱吸附组分和维生素C的西印度樱桃粉末的水溶液”。此外，包含在水溶液中的固体可以称为“已经除去C18柱吸附组分和维生素C的西印度樱桃粉末”。
实验2.4.来源于西印度樱桃的、C18柱吸附组分的制备
将实验2.1中制备的西印度樱桃粉末溶于净化水中，浓度20％(W/W)，由此制备40毫升水溶液。将C18柱(Sep-Pak Vac 35cc C18柱体，WatersCorporation)装载上溶液，而后将含有游离多酚等等的C18柱吸附组分吸附到该柱中。用净化水洗涤该柱，用甲醇进行洗脱，而后使用真空蒸馏设备干燥并固化洗脱液。由此，收集0.17克C18柱吸附的组分。
抗氧化活性的试验方法
实验背景：
亚油酸也是在人体内富含的不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸特征为：当静置时，其自身氧化，形成脂类过氧化物。在该实验中，将亚油酸与样品混合，将混合物在40℃静置，而后基于从亚油酸纯化的脂类氧化物数量的增加，评价抗氧化活性。
试验方法2.1
使用亚油酸测定抗氧化活性(硫氰苯胺-铁方法)
将2毫升的99.5％乙醇和2毫升蒸馏水(样品已经预先溶于99.5％乙醇或蒸馏水的任何一个中)的混合物加入到2毫升2.5％(w/v)亚油酸(99.5％乙醇溶液)和4毫升0.05 M磷酸盐缓冲液(pH值7.0)的混合物中。将得到的混合物放进褐色螺帽瓶中，以便制备10毫升反应溶液。当样品是不溶于水的组份时，将样品溶于上述99.5％乙醇中，以便制备反应溶液。当样品是水溶性的组份时，将样品溶于上述蒸馏水中，以便制备反应溶液。此外，在该试验方法中，术语“样品浓度”表示在2毫升99.5％乙醇或2毫升蒸馏水中的样品浓度。因此，在各个反应溶液中的各个样品的最后浓度是预定浓度的五分之一。
此外，对于抗氧化活性呈阳性的样品BHA，进行使其在反应溶液中含有适宜量的类似操作。以此作为阳性对照样品。本文中使用的对照物是通过将2毫升99.5％乙醇和2毫升蒸馏水单独加入到反应溶液中制备的。将在40℃保存在黑暗中的这种反应溶液用于主要的试验，并且将存储在4℃的这种反应溶液用于空白试验。将试验物质定时加以取样，而后按照如下所述进行测定。试验进行2周或更多周
将0.1毫升2×10-2M氯化亚铁(3.5％盐酸溶液)加入到0.1毫升试验物质、9.7毫升75％乙醇和0.1毫升30％硫氰酸铵水溶液的混合物中。加入后正好3分钟，在500纳米处测量吸光度。在空白试验中类似地测量吸光度：Δ吸光度＝[主要试验的吸光度]-[空白试验的吸光度]。吸光度越高、氧化脂质的量越高。该结果表示相关样品的弱抗氧化活性。此外，当样品的氧化起始时，吸光度提高。吸光度达到峰值后，吸光度随着样品氧化量的降低而降低。因此可以说，吸光度达到峰值越快、抗氧化活性越弱。
此外，根据氧化率(％)，比较样品的抗氧化活性。使用对照物的氧化(吸光度)作为100％，通过下式获得氧化率(％)。
[式1]
氧化率(％)＝([Δ样品的吸光度]/[Δ对照物的吸光度])×100
因此可以说，氧化率(％)越高、抗氧化活性越低。
实验2.5.浓缩西印度樱桃果汁和西印度樱桃粉末的水溶液对于脂质的 抗氧化活性
基于固体含量、用0.02％(W/W)的样品浓度、通过试验方法2.1测定实验2.1中制备的浓缩西印度樱桃果汁(Brix52.2，维生素C浓度：18.4％(W/W)，基于固体含量(重量))和西印度樱桃粉末样品的抗氧化活性。图14说明了结果。图14中的Y轴是指吸光度。它表示，数字值越高、亚油酸的氧化越多。即使28天后，浓缩西印度樱桃果汁和西印度樱桃粉末也产生足够的抗氧化活性。尤其是，西印度樱桃粉末产生的抗氧化活性，达到了相当于BHA产生的抗氧化活性水平，BHA是具有相同浓度的合成抗氧化剂。
实验2.6西印度樱桃粉末和α-生育酚的抗氧化活性的比较
使用试验方法2.1比较α-生育酚(维生素E)和西印度樱桃粉末的抑制亚油酸自动氧化的效果。α-生育酚是源于自然界的已知的脂质可溶性抗氧化剂。
在该实验中，使用α-生育酚((±)-α-生育酚：Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.，一级试剂)、合成抗氧化剂BHA(3(2)-叔丁基-4-羟基苯甲醚：Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，特级试剂)和实验2.1中制备的西印度樱桃粉末。对于所有的样品浓度，在各个样品的固体含量(浓度)是0.02％(W/W)的条件下进行实验。表15显示了试验结果。
在实验1中，α-生育酚与BHA(阳性对照)的比较，显示BHA产生的抗氧化活性优于α-生育酚的抗氧化活性。在实验2中，当BHA与西印度樱桃粉末相比较时，西印度樱桃粉末产生的抗氧化活性水平相当于BHA的抗氧化活性或甚至比其更高。基于该两个试验结果，显示西印度樱桃粉末比α-生育酚(维生素E)更强烈地抑制亚油酸的自动氧化。
表15
通过α-生育酚和西印度樱桃粉末抑制亚油酸自动氧化的有关试验
    实验1     实验2
存储天数   对照物   α-生育酚     BHA     对照物     BHA     西印度樱桃粉末
    1   0.0142   0.0195     0.0000     0.0617     0.0001     0.0038
    4   0.5058   0.0827     0.0105     0.7387     0.0088     0.0433
    5   0.8090   0.1014     0.0111     1.0746     0.0121     0.0438
    8   1.4743   0.1326     0.0313     1.5887     0.0269     0.0537
    11   1.8764   0.1551     0.0559     -     -     -
    14   -   -     -     1.8165     0.0609     0.0537
    15   1.7866   0.1796     0.0752     -     -     -
    18   -   -     -     1.7379     0.0866     0.0520
实验2.7.维生素C(抗坏血酸)对于脂质的抗氧化活性
基于固体含量(重量)，通过试验方法1测定0.02％(W/W)和0.04％(W/W)浓度的维生素C(抗坏血酸，特级试剂，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)样品的抗氧化活性。图15显示了结果。图15中的Y轴是指吸光度，表示数字值越高、亚油酸的氧化越高级。0.02％(W/W)和0.04％(W/W)的维生素C样品根本没有产生抗氧化活性。反而，开始实验后，从实验开始到7天期间，0.02％(W/W)浓度的维生素C样品引起亚油酸氧化，比对照物引起的亚油酸氧化更早。
实验2.8.按照抗氧化效能，西印度樱桃粉末、已经除去C18柱吸附组 分的西印度樱桃粉末、和来源于西印度樱桃的C18柱吸附组分的比较
具有不同样品浓度(W/W)的实验2.1中制备的西印度樱桃粉末和实验2.4中制备的C18柱吸附组分(来源于西印度樱桃)，在该实验中用作样品。此外，将实验2.2中制备的已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末水溶液的固体成分(固体浓度：15.3％(W/W))稀释为不同的浓度(W/W)。将由此稀释的样品在该实验中使用。将这些样品在40℃存储28天，而后按照试验方法2.1测定对于亚油酸的抗氧化效果。图16显示了结果。测定值通过亚油酸的氧化率(％)(参见上面式1)表示，表明氧化率(％)越高、样品的抗氧化效能越弱。
100％的氧化率(％)是指亚油酸氧化物的量与对照物的相同。横轴是指在该试验中使用的样品浓度。由进行评价抗氧化剂试验的经验可以断定，在相同条件下，当氧化率(％)是20％或小于对照物的氧化率(％)时，抗氧化剂显著地抑制氧化。由此，基于图16中的结果，可以断定，各个样品的有效浓度是：在来源于西印度樱桃的C18柱吸附组份的固体含量(浓度)情况下，0.005％(W/W)或更大；在西印度樱桃粉末样品情况下，0.015％(W/W)或更大；和在已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末样品的情况下，0.0175％(W/W)或更大。
很清楚，分离的来源于西印度樱桃的C18柱吸附组分的抗氧化活性最高。此外，已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末也具有足够的抗氧化活性。由此可以推断，非C18柱吸附组分的组分也有助于抗氧化活性。基于溶液，在具有有效西印度樱桃粉末浓度(固体含量浓度：0.015％(W/W))的溶液中的多酚成分极低，是0.000225％(W/W)。由于西印度樱桃粉末比已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末具有稍高水平的抗氧化活性，可以推断，这种少量的C18柱吸附组分有助于抗氧化活性。由此可以断定，西印度樱桃粉末抑制亚油酸自动氧化的效果，是通过C18柱吸附组分及其它组分组合产生的。
实验2.9.使用已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末水溶液、和 已经除去C18柱吸附组分和维生素C的西印度樱桃粉末水溶液进行脂质 的抗氧化试验
通过试验方法1，基于固体含量(重量)，使用0.02％(W/W)的样品浓度，测定在实验2.2中制备的、已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末水溶液样品的抗氧化活性，和在实验2.3中制备的、已经除去C18柱吸附组分和维生素C的西印度樱桃粉末水溶液样品的抗氧化活性。图17显示了结果。证明已经除去C18柱吸附组分和维生素C的西印度樱桃粉末的水溶液对于脂质具有足够的抗氧化活性。此溶液比具有相同浓度的、已经除去C18柱吸附组分的西印度樱桃粉末所具有的抗氧化活性低的原因，可能由于除去了维生素C。另一方面，如实验2.7所示，维生素C不能单独充当脂质的抗氧化剂(图15)。由此，该实验的结果说明，在与非C18柱吸附组分的西印度樱桃组分的联合中，西印度樱桃之中的维生素C对于脂质发挥抗氧化活性。
实验2.10.酸溶性的西印度樱桃果胶的制备
使用韦林氏搅拌器将西印度樱桃果实粉碎，同时将3千克净化水加入到3千克西印度樱桃果实中，以便制备粉碎的西印度樱桃产品。将乙醇加入到该产品中，直到占30％重量为止。将生成物在室温下搅拌过夜，以便提取水和乙醇可溶的组分。在4200rpm条件下，将提取物离心30分钟，由此分离固体成分。收集1500克的固体成分。
将5200克净化水加入到1500克固体成分中，制备悬浮液。将浓盐酸加入到悬浮液中，调节生成物pH值至2.2。使用片式加热器，在80℃至90℃进行热处理2小时，同时搅拌该悬浮液。将悬浮液静置，降温至室温，而后在4200rpm下离心30分钟。由此，将生成物分离为固体成分和上清液，而后收集上清液。使用0.2μm过滤器过滤上清液，除去不能溶解的组分，由此获得纯的提取物。
将乙醇加入到提取物中，加入数量大于提取物重量3倍，以便将乙醇不能溶解的果胶组份沉淀。使用不锈钢网收集沉淀的果胶组份。此外，为了除去乙醇和水溶性的组分，将生成物用90％乙醇水溶液洗涤两次，收集，而后使用冷冻干燥器干燥。由此，收集6.24克酸溶性的西印度樱桃果胶。
实验2.11.用果胶酶处理的西印度樱桃果胶的制备
使用韦林氏搅拌器将西印度樱桃果实粉碎，同时将2千克净化水加入到2千克西印度樱桃果实中，以便制备粉碎的西印度樱桃产品。将乙醇加入到该产品中，直到占40％重量为止。将生成物在室温下搅拌过夜，以便提取水和乙醇可溶的组分。在4200rpm条件下，将提取物离心30分钟，由此分离固体成分。收集1000克的固体成分。
将1000克固体成分与3000克净化水混合，而后与4克果胶酶粉末(果胶酶“AMANO A”，AMANO ENZYME INC.混合。将混合物在45℃下静置过夜。在4200 rpm条件下，将混合物离心30分钟，以便混合物分离为固体成分和上清液。收集上清液。使用0.2μm过滤器过滤上清液，除去不能溶解的组分，由此获得纯的提取物。
将乙醇加入到提取物中，加入数量大于提取物重量3倍，以便将乙醇不能溶解的果胶组份沉淀。在4200rpm条件下，将沉淀的果胶组份离心30分钟，以便收集固体成分形式的组份。将固体成分进一步用90％乙醇水溶液洗涤，而后使用冷冻干燥器干燥。由此收集12.6克干固体成分。将干固体成分指定为果胶酶处理的果胶。由于该果胶组份几乎没有果胶水溶液的粘性特征，人们认为该果胶组份是果胶水解物。
实验2.12.来源于西印度樱桃的果胶的分子量测定
通过凝胶过滤色谱法，测定用酸处理的果胶(在实验2.10中制备)、和已经用酸处理而后用果胶酶处理的果胶产品的分子量。
将用酸处理的果胶溶于净化水中，浓度0.5％(W/W)。由此制备20毫升水溶液，使用0.2μm过滤器过滤，而后使用。已经用酸处理、而后用果胶酶处理的果胶产品制备如下。将用酸处理的果胶(在实验2.10中制备)溶于净化水中，浓度0.3％(W/W)，以便制备20毫升水溶液。将6毫克果胶酶粉末(果胶酶“AMANO A”，AMANO ENZYME INC.)加入到该溶液中，而后在50℃反应过夜。反应完毕后，在120℃进行热处理15分钟，使酶失活。使用0.2μm过滤器过滤生成物。使用真空蒸馏设备，将过滤生成物浓缩至2毫升，而后使用0.2μm过滤器将浓缩产品过滤。用Sephacryl S-300 High Solution(Amersham Biosciences)作为凝胶过滤的载体。将柱用载体装载，而后进行凝胶过滤测定。PBS(Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水)用作缓冲液。在分子量的测定中，本文中使用认为适合该测定的分子量标记。这些分子量标记是：蓝色右旋糖酐2000，催化酶，Alubmin和胰凝乳蛋白酶原A，在HMW凝胶过滤标准试剂盒(AmershamBiosciences)和LMW凝胶过滤标准试剂盒(Amersham Biosciences)中。
作为该测定的结果，发现用酸处理的果胶(在实验2.10中制备)的分子量几乎与使用蓝色右旋糖酐2000测定的分子量相同。由此显示，用酸处理的果胶(在实验2.10中制备)是具有大约2,000,000分子量的分子。此外，在用酸处理、而后用果胶酶处理的果胶产品的情况下观察到大量峰值。证明所有的分子量比具有分子量20.4 kDa的胰凝乳蛋白酶原A的分子量低。因此推断，用酶处理的果胶是各自具有20,000分子量或更小分子量的分子的混合物。
实验2.13.根据抗氧化效能，来源于西印度樱桃的果胶样品的比较
通过试验方法2.1，基于固体含量(重量)，使用0.1％(W/W)的样品浓度，测定用酸处理的来源于西印度樱桃的果胶(在实验2.10中制备)的抗氧化活性，和用果胶酶处理的来源于西印度樱桃的果胶(在实验2.11中制备)的抗氧化活性。图18显示了结果。两种样品对于脂质都显示了足够的抗氧化活性。由此显示，两种类型的果胶可有效作为脂质的抗氧化剂。如实验2.12所述，尽管用酸处理的西印度樱桃果胶和用酶处理的果胶在分子量方面相互完全不同，但前者果胶表现的脂质抗氧化活性与后者果胶产生的脂质抗氧化活性水平相等。可以推断，通过其它酶等等水解的来源于西印度樱桃的果胶，对于脂质也具有抗氧化活性，水平相当于其它果胶的抗氧化活性。
实验2.14
通过DPPH自由基清除活性试验，评价来源于西印度樱桃的果胶的抗氧化活性。
使用稳定的diphenyl-p-picrylhydradil(DPPH)的乙醇溶液评价抗氧化活性。将1600μl的250 mM乙酸盐缓冲液(pH值＝5.5)与1200μl的乙醇和400μl的样品(在预定浓度下调节)混合，而后在30℃预培育5分钟。将800μl的500μM DPPH/乙醇溶液加入到该溶液中，而后将溶液混合。在30℃，将溶液静置30分钟，而后在517纳米处测定吸光度。本文中使用的对照物是使用净化水代替样品溶液、通过类似的方法来制备的。本文中使用的样品是用酸处理的来源于西印度樱桃的果胶(在实验2.10中制备)和用酶处理的来源于西印度樱桃的果胶(在实验2.11中制备)。用于比较的样品是通过将来源于苹果的果胶(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.，reagent)和来源于柑桔的果胶(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.，reagent)分别以0.3％(W/W)和0.1％(W/W)的浓度用净化水溶解来制备的溶液。通过下式、使用由此测定的吸光度来计算自由基清除比例。
[式2]
清除比例(％)＝(1-[样品的吸光度]/[对照物的吸光度])×100
表16显示了结果。这些结果显示，与其它果胶不同，用酸处理的来源于西印度樱桃的果胶或用酶处理的果胶是具有自由基清除活性的抗氧化物质。此外也显示，通过果胶酶(酶)处理，抗氧化活性增加了大约2倍。
表16
    浓度     OD517   自由基清除比例(％)
对照物(净化水)     1.26
用酸处理的来源于西印度樱桃的果胶     0.3％0.1％     0.731.00   41.921.1
用酶处理的来源于西印度樱桃的果胶     0.3％0.1％     0.130.77   89.938.9
来源于苹果的果胶     0.3％0.1％     1.261.27   0.50.0
来源于柑桔的果胶     0.3％0.1％     1.251.26   0.60.2
实验2.15
将鲑鱼的一半身体浸在含有西印度樱桃粉末的盐溶液中，以便制备盐腌的鲑鱼样品。在荧光照明条件下，在存储前后，测定外观、感觉性、颜色(Hunter Lab)、酸值和过氧化值方面的变化。基于这些变化，确定西印度樱桃粉末对于脂质的抗氧化效果。
如下制备西印度樱桃粉末。将1400千克浓缩西印度樱桃果汁(在Brazil制备)用净化水稀释，而后将Brix值调节至31％。将1％重量酵母(Saccharomyces cerevisiae)加入到该溶液中，而后在30℃进行发酵20小时，以便除去葡萄糖和果糖。发酵后，进行离心和过滤。由此，获得2297千克已经除去葡萄糖和果糖的加工和浓缩的西印度樱桃果汁。紧接着，将400克作为赋形剂的糊精、150克食用纤维、50克加工的淀粉溶于含有来源于西印度樱桃的固体成分的400克加工和浓缩的西印度樱桃果汁中。通过喷雾-干燥法将溶液粉末化，以便获得780克用于食品加工的西印度樱桃粉末。这种西印度樱桃粉末含有0.5％至1.0％多酚。这种西印度樱桃粉末不同于实验2.1中获得的西印度樱桃粉末，因为它不包含苦味组份贝壳钙，以便西印度樱桃粉末可以用于广泛的食品加工中。
作为用于西印度樱桃加入试验中的浸液，制备含有上述西印度樱桃粉末(5％重量)、食盐(20％重量)和碳酸氢钠(5％重量)的水溶液。此外，作为用于对照试验的浸液，制备含有食盐(20％重量)的水溶液。
将冷冻原料鱼(银鲑(适当处理))解冻，用盐水洗涤，以洗掉粘性的表面，而后切成肉片。从肉片中除去腹部的骨头，以便制备该实验的样品。将一条鲑鱼的一半身体浸在含有西印度樱桃粉末的浸液中。另一半身体浸在对照试验的浸液中。过夜浸泡后，将肉片排水，真空包装，而后冷冻保存，直到对肉片进行下列荧光照明实验为止。
通过下列方法进行荧光照明实验。首先，将上述盐腌鲑鱼样品解冻，切成合适的规格，而后放进泡沫聚苯乙烯托盘中。将该托盘完全用包装材料(Shin-etsu Polymer Co.，Ltd.，“Polymawrap”)包裹，放入陈列柜中，而后在10℃对其进行48小时的1500lux.荧光照明。
观察荧光照明前后外观方面的变化。在光照之前，与对照试验组的样品相比较，已经加入西印度樱桃的样品组呈略微暗的颜色，但它们相互之间没有太多不同。荧光光照实验后，与光照之前样品相比较，已经加入西印度樱桃的样品组呈略微暗和深色，但保持红色。相反，对照试验组的样品显示了红色的明显褪色。由此，证实西印度樱桃粉末可以在存储期间防止鲑鱼褪色。此外，在荧光光照前后，观察感觉方面的变化。在光照之前，在已经加入西印度樱桃的组和对照试验组两者中，没有感觉到脂质氧化产生的气味。光照后，在对照试验组中，感觉由脂质氧化和脂质恶化产生的味道，比已经加入西印度樱桃组中的味道更强烈。下面的表显示了上述评价的结果。对于各个试验组，制备20个样品。表中的数字是相应于各项的样品的数目。此外，图19显示了在荧光照明条件下存储后的样品的图片。
表17
  加入西印度樱桃的试验组   对照试验组
味道和外观很好     5     1
味道和外观良好     8     1
既好又不好     5     3
味道和外观恶化     1     10
味道和外观非常恶化     1     5
用于测色的Hunter Lab测定，是在3个时间点进行的：在浸泡之前；浸泡后但在光照之前(简单地说，表18中的“光照之前”)；和光照后。Lab测定是使用CHROMA METER CR-200(Minolta Co.，Ltd.)进行的。浸泡之前的测定和光照后的测定进行了5个样品。浸泡后但在光照以前的测定，进行了2个样品。均值各自概括在表18中。
表18
    加入西印度樱桃的试验组     对照试验组
    L     a     b     L     a     b
浸泡之前     39.24     21.24     20.45     40.52     25.42     23.75
光照之前     42.53     19.96     17.46     42.68     19.58     15.12
光照后     39.36     19.54     17.18     45.93     16.56     17.04
从表18中仅提取出在光照前后观察到的  “a”值(显示红色)的变化，并示于图20中。从图20明显的看出，观察到已经加入西印度樱桃的试验组的“a”值几乎没有降低，而在对照试验组中观察到了“a”值的降低。
此外，测定各个样品在荧光照明后的酸值(AV)和过氧化值(POV)。按照Food Analysis Handbook(2nd ed.，KENPAKUSHA)中描述的方法进行测定。表19显示了结果。
表19
荧光照明实验后的酸值和过氧化值
  加入西印度樱桃的试验组   对照试验组
酸值(mgKOH/g)     2.20     2.30
过氧化值(meq/kg)     0.00     4.33
荧光照明和存储后，加入西印度樱桃的试验组的酸值和过氧化值小于对照试验组的酸值和过氧化值。具体地说，表明西印度樱桃粉末的加入，抑制了脂质氧化。
实验2.16
将鲑鱼卵(sujiko)浸在含有西印度樱桃粉末的调味品溶液中，以便制备调味的鲑鱼卵。在荧光照明条件下，在存储前后，测定外观、味道、酸值和过氧化值方面的变化。基于这些变化，确定西印度樱桃粉末的抗脂质氧化效果。
对于西印度樱桃粉末，使用实验2.15中制备的西印度樱桃粉末。
对于用于西印度樱桃加入试验的调味品溶液，制备含有上述西印度樱桃粉末(5％重量)、清酒(35％重量)、白酱油(35％重量)、味  (Mirin，用于烹调的日本调味料)(20％重量)、碳酸氢钠(4.995％重量)和亚硝酸钠(0.005％重量)的水溶液。此外，对于对照试验的调味品溶液，制备具有相同组成的水溶液，只不过它不包含西印度樱桃粉末和碳酸氢钠。
将冷冻的鲑鱼卵(已经冷冻处理过的生鲑鱼卵)解冻，用盐水洗涤，浸于上述调味品溶液中1小时，低温过夜进行熟化，而后分为“3特”和“黑子”。分类后，将鲑鱼卵冷冻保存，直到对它进行下列荧光照明实验为止。
通过下列方法进行荧光照明实验。首先，将从鲑鱼卵中分选的“3特”或“黑子”解冻，而后放进泡沫聚苯乙烯托盘中。将该托盘完全用包装材料(Shin-etsu Polymer Co.，Ltd.，“Polymawrap”)包裹，放入冷藏库中，而后在10℃对其进行144小时的1500 lux.荧光照明。
观察荧光照明前后外观和味道方面的变化。在照明前后，与对照试验组相比较，加入西印度樱桃的试验组抑制了外观变化和味道恶化(产生脂质氧化味)。上述评价结果示于下面表中。对于各个试验组，制备20个样品。表中的数字是相应于所有项的样品的数目。
表20
  加入西印度樱桃的试验组   对照试验组
味道和外观很好     3     1
味道和外观良好     10     3
既好又不好     3     4
味道和外观恶化     3     7
味道和外观非常恶化     1     5
测定各个样品在荧光照明后的酸值(AV)和过氧化值(POV)(然而，在kuroko样品的情况下，仅仅测定酸值)。按照Food Analysis Handbook(2nded.，KENPAKUSHA)中描述的方法进行测定。表21显示了结果。
表21
荧光照明实验后的酸值和过氧化值
    3特     黑子
加入西印度樱桃的试验组 对照试验组 加入西印度樱桃的试验组 对照试验组
酸值(mgKOH/g)     0.90     3.00     0.90     3.50
过氧化值(meq/kg)     0.00     10.00     -     -
在3特和黑子的两种情况下，加入西印度樱桃的试验组中的荧光照明和存储后的酸值和过氧化值，都显著地比对照试验组的小。具体地说，表明西印度樱桃粉末的加入，抑制了脂质氧化。
实施例3
果胶酶制剂
在下面实验中，使用果胶酶制剂(果胶酶A“Amano”，AMANOENZYME INC.)进行果肉渣消化。这种酶制剂含有果胶酶45％，β-淀粉酶25％和硅藻土30％。由此，西印度樱桃果肉渣中的果胶组份和淀粉组份可以通过酶制剂水解。果胶酶是从霉菌Aspergillius pulverulentus和Aspergillius niger的培养产物中纯化出的酶。认为果胶酶是许多类型果胶酶的混合物。由于果胶酶导致用酸和加热处理提取的来源于西印度樱桃的果胶的粘度的快速降低，人们认为果胶酶含有可以使果胶分子内部随机裂解的、使得其分子量很快地降低的内切-多聚半乳糖醛酸酶。
实验3.1.制备西印度樱桃粉末VC30(对比产物)的方法
从在Brazil生产的西印度樱桃果实中除去籽部分。为了增加流动性，将籽部分与离子交换水混合。使用不锈钢网式过滤器除去混合物中的大量固体成分，而后将生成物放进用于果胶酶处理的罐中。将每7 Brix(使用糖量计测定)的0.01％(W/W)果胶酶制剂(果胶酶A“Amano”，AMANO ENZYME INC.)放进罐中，同时在40℃至50℃加热罐，以便进行1至2小时的酶处理。酶处理后，将由此处理的西印度樱桃产品加热，以使酶失活。将产品灭菌，而后进行硅藻土过滤，以便获得清澈的西印度樱桃果汁。将西印度樱桃果汁通过真空蒸馏和浓缩法进行浓缩，由此制备浓缩的西印度樱桃果汁。
将1400千克浓缩西印度樱桃果汁用净化水稀释，以调节Brix值至31％。将1％重量酵母(Saccharomyces cerevisiae)加入到稀溶液中，而后在30℃发酵20小时。发酵后，进行离心和过滤，以除去葡萄糖和果糖。由此，获得2297千克加工和浓缩的西印度樱桃果汁。将4.0％(W/W)食用纤维(食用纤维与果汁的固体含量(重量)比例)和1.5％(W/W)贝壳钙(贝壳钙与果汁的固体含量(重量)比例)作为赋形剂和加工试剂，溶解在加工和浓缩的西印度樱桃果汁中。对由此获得的溶液进行喷雾-干燥法，以便获得806千克西印度樱桃粉末(在下文，西印度樱桃粉末也称为“西印度樱桃粉末VC30”)。该西印度樱桃粉末含有35.0％(W/W)抗坏血酸和1.07％(W/W)半乳糖醛酸。具体地说，相对于抗坏血酸，西印度樱桃粉末VC30含有3.1％重量半乳糖醛酸。对于半乳糖醛酸的定量方法，参见下面的说明书。
3.2.制备西印度樱桃粉末A(本发明的产品)的方法
从在Brazil生产的西印度樱桃果实中除去籽，以便制备西印度樱桃果泥。不用进行从西印度樱桃果泥中除去固体成分的过程。由此，在西印度樱桃果泥中富含果肉渣。将1％(W/W)果胶酶制剂(果胶酶A“Amano”，AMANO ENZYME INC.)与10.8千克西印度樱桃果泥(Brix值：8％)混合。将混合物在50℃加热4小时。通过加热该处理的产品，使酶失活，进行灭菌。通过离心法，将生成物分离为固体成分和果汁。通过真空蒸馏将果汁浓缩，以便收集3.6千克的浓缩液(Brix值：25.2％)。将1％重量酵母(酿酒酵母)加入到浓缩液中，而后在30℃发酵20小时。发酵后，进行离心和过滤，以除去葡萄糖和果糖。由此，获得3.3千克加工和浓缩的西印度樱桃果汁(Brix值：21.5％)。将4.0％(W/W)食用纤维(食用纤维与果汁的固体含量(重量)比例)和1.5％(W/W)贝壳钙(贝壳钙与果汁的固体含量(重量)比例)作为赋形剂和加工试剂，溶解在2.8千克的加工和浓缩的西印度樱桃果汁中。对该溶液进行喷雾-干燥法，以便获得大约0.5千克的西印度樱桃粉末(在下文，它也可以被称为“西印度樱桃粉末A”)。该西印度樱桃粉末含有29.3％(W/W)抗坏血酸和3.47％(W/W)半乳糖醛酸。具体地说，相对于抗坏血酸，西印度樱桃粉末A含有11.8％重量半乳糖醛酸。对于半乳糖醛酸的定量方法，参见下面的说明书。
3.3.定量半乳糖醛酸的方法
通过下面的方法定量半乳糖醛酸。
将20克含有半乳糖醛酸的样品在已经加入到其中的80克净化水中溶解。样品已经充分溶解后，称量10克溶液，并放进50毫升离心管中。将40毫升乙醇(特级，Wako Pure Chemical Industries，Ltd)加入到其中，并与生成物在试管中充分地混合(乙醇沉淀法)。将混合物静置30分钟或更长时间后，在3000rpm下进行离心20分钟(20℃)。随后，完全收集沉淀，而后使用冷冻干燥器进行干燥和固化。将由此干燥的产品溶于净化水中，浓度为0.02％、0.05％、0.1％和0.2％(W/W)，由此制备定量用溶液。利用3，5-二甲酚方法，定量半乳糖醛酸的量。首先，将125μl每个定量用溶液放进试管中。随后，将125μl的2％氯化钠水溶液和2毫升浓硫酸(特级，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)各自加入到溶液中，而后在70℃反应10分钟。将各个生成物在水中冷却20至30秒钟。将0.1毫升显色试剂(通过将0.1克3.5-二甲苯酚溶解在100毫升冰醋酸中来制备)加入到生成物中。10分钟以后，在450纳米和400纳米处测定吸光度，而后得到两者之间的差异。对于标准物质，使用半乳糖醛酸一水合物(特级试剂，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)。基于标准物质的校准曲线(12.5μg/g至50μg/g)，计算干燥产品中的半乳糖醛酸的量。借助于由此计算的数值、和通过乙醇沉淀法和干燥从2克样品处获得的干燥产品的重量，计算样品中的半乳糖醛酸成分。表22显示了定量结果。此外，在该定量中获得的乙醇沉淀也含有用作赋形剂的食用纤维。
表22
  西印度樱桃粉末VC30(对比产品)   西印度樱桃粉末A(本发明的产品)
通过乙醇沉淀和干燥从2克样品中获得的干燥产品重量     1.205g     1.36g
干燥产品中的半乳糖醛酸含量(W/W％)     1.8％     5.1％
样品中的半乳糖醛酸含量(W/W％)     1.08％     3.47％
3.4.皮肤-增白试验
使用褐色豚鼠(SPF)检验UV照射后的色素淀积的抑制效果。由于以类似于人类的方式进行UV照射、和已经明显保养的品系，褐色豚鼠是进行色素淀积的动物。在该试验中，每个组使用六个豚鼠。为了促进色素淀积，使用安装在UV照射装置(Y-798-II，Orion Electric Co.，Ltd.)处的5个SE灯(波长在250纳米和350纳米之间，FL20S E，TOSHIBACorporation)，从40厘米的距离进行UV(UVB)照射。由于UV照射而在皮肤上出现红斑所需要的最短时间，是在预先测试中测定的，并且确定是12分钟和30秒钟。在该试验中，将这个时间指定为UV照射时间。每个照射位点是2厘米×2厘米平方区域，位于跨越豚鼠背部中线的左或右侧，使用电剪刀将豚鼠剪毛，而后使用电动刮胡刀剃削。UV照射总计进行3次，包括初始给药的当天(称为第0天)和初始给药后的第2和4天。通过口服(使用导管)已经制备的每个试验物质的溶液来给予试验物质，使得抗坏血酸的剂量是300毫克/千克动物重量/天。具体地说，使用相等数量的抗坏血酸进行实验。对于空白，给予注射用水(OTSUKAPharmaceutical Co.，Ltd.)。对于试验物质，使用对比产品西印度樱桃粉末VC30(831毫克/5毫升)、本发明的产品西印度樱桃粉末A(1024毫克/5毫升)、和抗坏血酸(特级试剂，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(300毫克/5毫升)。进行42天口服。色素淀积测定如下。在初始给药(照射之前)之前、起始给药当天、和初始给药后第7、14、21、28、35和42天，使用色度计(CR-300，Minolta Co.，Ltd.)测定照射位点的L值(光照)，而后确定ΔL值(观察当天的L值-照射之前的L值)。本文中使用的总共5个测定位点包括中心点和位于每个照射位点互相间直径上对置的4个角。其平均值称为每个个体豚鼠的L值。表明ΔL值越高、色素淀积水平越强烈。图2 1显示了试验结果。纵轴表示ΔL值，横轴表示试验起始后的天数。每个测定值是一组6个豚鼠的ΔL值的平均值。
结果，在给予西印度樱桃粉末VC30(对比产品)的组中，与给予注射用水的组相比较，发现在每个观察时间点，ΔL值的降低被显著地抑制。具体地说，产生了抑制色素淀积的效果。在给予西印度樱桃粉末VC30(对比产品)的组和给予抗坏血酸的组(阳性对照)的情况下，测定值几乎相同。因此可以推断，西印度樱桃粉末VC30抑制色素淀积的效果，是由于含在其中的抗坏血酸。
另一方面，在所有的观察天中，给予西印度樱桃粉末A(本发明的产品)的组中的ΔL值，小于给予抗坏血酸的组中的ΔL值。相应地，有人提出，西印度樱桃粉末A(本发明的产品)具有促进抗坏血酸抑制色素淀积效果的组份，该组份不包含在对比产品(西印度樱桃粉末VC30)中。
本文中所引用的全部出版物、专利和专利申请在此以其整体被引入作为参考。

Claims (27)

1.来源于西印度樱桃果实的果胶或其水解物，包括果胶骨架和由下列化学式代表的多酚化合物形成的络合物：
Figure S2006800147688C00011
2.制备按照权利要求1的果胶的方法，包括从西印度樱桃果实或其加工的产品分离或浓缩果胶的步骤。
3.制备按照权利要求1的果胶水解物的方法，包括从西印度樱桃果实或其加工的产品分离或浓缩果胶的步骤、和将果胶水解的步骤。
4.按照权利要求3的方法，包括下列步骤：通过用果胶酶处理果泥而将由西印度樱桃果实制备的果泥中的果胶水解的步骤，和由前面步骤中的加工产品的上清液来分离或浓缩水解的果胶的步骤。
5.按照权利要求2至4的任一项的方法，其中分离或浓缩果胶的步骤是使用乙醇沉淀果胶的步骤。
6.按照权利要求2至4的任一项的方法，其中分离或浓缩果胶的步骤是使用分离膜进行分离或浓缩果胶的步骤。
7.按照权利要求6的方法，其中分离膜是超滤膜。
8.按照权利要求7的方法，其中超滤膜具有从10,000至100,000的分子量分离点。
9.含有来源于西印度樱桃果实的果胶的材料，其是通过包括从西印度樱桃果实或其加工的产品中分离或浓缩果胶的步骤的方法制备的。
10.含有来源于西印度樱桃果实的果胶水解物的材料，其是通过包括从西印度樱桃果实或其加工的产品中分离或浓缩果胶的步骤和将果胶水解的步骤的方法制备的。
11.按照权利要求10的材料，其是通过包括通过用果胶酶处理果泥、将由西印度樱桃果实制备的果泥中的果胶水解的步骤，和从前面步骤中产生的加工产品的上清液中分离或浓缩水解的果胶的步骤的方法制备。
12.按照权利要求9至11的任一项的材料，其中分离或浓缩果胶的步骤是使用乙醇沉淀果胶的步骤。
13.按照权利要求9至11的任一项的材料，其中分离或浓缩果胶的步骤是使用分离膜分离或浓缩果胶的步骤。
14.按照权利要求13的材料，其中分离膜是超滤膜。
15.按照权利要求14的材料，其中超滤膜具有从10,000至100,000的分子量分离点。
16.一种抗氧化剂，含有按照权利要求1的果胶或其水解物作为活性组分。
17.一种抗氧化剂，含有按照权利要求9至15的任一项的材料作为活性组分。
18.一种脂质的抗氧化剂，含有西印度樱桃果实的加工产品(不包括西印度樱桃籽的加工产品)作为活性组分。
19.按照权利要求18的抗氧化剂，其中西印度樱桃果实的加工产品含有多酚和/或抗坏血酸。
20.具有抗氧化效果的食品，向其中加入按照权利要求16至19的任一项的抗氧化剂。
21.制备食品的方法，包括使用按照权利要求16至19的任一项的抗氧化剂来增加食品氧化稳定性的步骤。
22.一种口服皮肤-增白剂，含有按照权利要求1的果胶或其水解物作为活性组分。
23.一种口服皮肤-增白剂，含有按照权利要求9至15的任一项的材料作为活性组分。
24.按照权利要求22或23的口服皮肤-增白剂，进一步含有抗坏血酸。
25.具有皮肤-增白效果的食品，向其中加入按照权利要求22至24的任一项的口服皮肤-增白剂。
26.制备口服皮肤-增白剂的方法，包括下列步骤：将包含在西印度樱桃果实的果肉渣中的、或含有抗坏血酸和这种果肉渣的西印度樱桃果实的加工产品中的果胶水解的步骤，以使半乳糖醛酸的量相对于抗坏血酸的量是5％重量或更多。
27.按照权利要求26的方法，进一步包括基本上除去葡萄糖和果糖的步骤。
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