CN114934079B - 一种制备高纯度半乳糖二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备高纯度半乳糖二酸的方法，包括：1)以果胶为底物，采用果胶酶进行酶水解生产制备获得含半乳糖醛酸的溶液；2)对含半乳糖醛酸的溶液进行电渗析分离纯化，获得酸室中的溶液；3)取酸室中的溶液接入氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化生产获得高纯度半乳糖二酸溶液。本方法不需要采用金属催化剂或苛刻的酸、碱反应条件，利用温和的酶及细胞反应，绿色友好的降解果胶并制备生产获得相应的高纯度半乳糖二酸。
Description
技术领域
本发明涉及半乳糖二酸制备技术领域，特别涉及一种制备高纯度半乳糖二酸的方法，即“酶水解-电渗析-静息细胞催化”多步骤联合工艺制备半乳糖二酸的方法。
背景技术
糖二酸最为一个二元羧酸，由于其双羧基模块，已经成为了十分重要的平台化合物。2004年，葡萄糖二酸就被美国能源部定义为12个最具竞争力的生物质基平台化合物之一。目前，越来越多的研究报道葡萄糖二酸及其衍生物能有效预防和抑制结肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、皮肤癌以及膀胱癌等癌症。此外，葡萄糖二酸还可以作为聚酰胺类聚合物的合成单体、尼龙或2，5-呋喃二甲酸的前提以及螯合物。这些潜在的应用将葡萄糖二酸定义为“最有价值的生物炼制产品”。
半乳糖二酸作为葡萄糖二酸的典型替代品，引起原料便宜、来源广泛而引起越来越多的关注和研究。目前半乳糖二酸的制备方法与葡萄糖二酸类似，主要采用化学法，包括硝酸氧化法、金属催化法、TEMPO氧化法等。然而这些化学过程并不符合绿色可持续发展，因为在半乳糖二酸制备过程中消耗了大量的试剂和昂贵的金属，并形成氮氧化物和各种副产物污染。相反，生物法具有工艺温和、选择性高、安全性好等优点，而目前采用生物法制备高纯度的半乳糖二酸还没有相关研究报道。因此，为满足工业中绿色环保地制备半乳糖二酸的技术要求，本申请选择以果胶为原材料，对其酶解、纯化以及催化技术工艺进行深化研究及针对性优化。
发明内容
针对目前工业中制备半乳糖二酸存在副产物多，污染性强以及成本昂贵等工艺技术瓶颈，本发明所要解决的技术问题是提供一种制备高纯度半乳糖二酸的方法，采用酶水解-电渗析-静息细胞催化联合工艺制备半乳糖二酸，通过三个阶段模块组合，以果胶为原料制备高纯度半乳糖二酸，可以大幅度降低原料成本，并且避免其他糖及糖酸等副产物的生成，有效地保证产品得率及纯度。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种制备高纯度半乳糖二酸的方法，包括以下步骤：
1)以果胶为底物，采用果胶酶进行酶水解生产制备半乳糖醛酸；
2)实时监测反应体系中半乳糖醛酸生成量，至反应体系中半乳糖醛酸的浓度不再增加停止反应，离心酶解液后将上清液转移至双极膜电渗析系统的料室中进行分离纯化；
3)当电渗析系统盐室中电导率将至100～200μs/cm时，分离过程完成；将酸室中的溶液转移至生物反应器中，并接入氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化生产获得高纯度半乳糖二酸溶液。
所述的制备高纯度半乳糖二酸的方法，果胶的浓度为4～5g/L。
所述的制备高纯度半乳糖二酸的方法，果胶酶的用量为底物质量的4％～5％。
所述的制备高纯度半乳糖二酸的方法，酶水解反应条件为：控制反应温度为50～55℃，pH为3.8～4.2。
所述的制备高纯度半乳糖二酸的方法，控制电渗析设备电压20～30V，电流5A以下。
所述的制备高纯度半乳糖二酸的方法，氧化葡萄糖酸杆菌的接入量为8～10g/L。
所述的制备高纯度半乳糖二酸的方法，静息细胞阶段反应条件为：控制反应温度为28～30℃，搅拌转速为500～550rpm，pH为4.0～4.5。
所述的制备高纯度半乳糖二酸的方法，包括以下步骤：
1)在震荡反应体系中，加入4g/L的底物基质果胶，接入4％果胶酶进行酶水解生产半乳糖醛酸混合液；实时监测反应体系中半乳糖醛酸生成量，并通过氢氧化钠控制反应pH3.8～4.2；
(2)至震荡反应体系中半乳糖醛酸的浓度不再增加停止反应，离心酶解液后将上清液转移至双极膜电渗析系统的料室中进行分离纯化，至电渗析系统盐室中电导率将至100～200μs/cm时，分离过程完成，于酸室获得高纯度半乳糖醛酸溶液；
(3)将酸室中的半乳糖醛酸溶液转移至1L生物反应器中，并接入10g/L氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化生产半乳糖二酸；实时监测反应体系中半乳糖二酸生成量，并控制反应体系pH 4.0～4.5。
一种制备高纯度半乳糖二酸的方法：以半乳糖醛酸为底物，接入氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化，生产获得高纯度半乳糖二酸溶液；其中，反应条件为：反应温度28～30℃，搅拌转速为500～550rpm，pH为4.0～4.5。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1)本申请以果胶作为原料，采用果胶酶降解、电渗析处理以及静息细胞催化三个工艺阶段联合制备高纯度半乳糖二酸，是一条较为温和有效的绿色制备方法，为工业中半乳糖二酸的生产方法提供了新途径。
2)本申请利用酶水解-电渗析-静息细胞催化联合工艺制备半乳糖二酸，可以实现有效催化制备高纯度半乳糖二酸的工艺目的，使得最终半乳糖二酸产品中完全不含其他糖及糖酸产品，并且半乳糖二酸的产品质量远高于现有制备方法。
3)本申请利用酶水解-电渗析-静息细胞催化联合工艺制备半乳糖二酸，以果胶为原料，有助于解决工厂中食品及农业废料堆积的问题，有效降低工艺成本，实现可持续发展工艺目的。
附图说明
图1是实施例1产品的高效离子色谱图；
图2是实施例10产品的高效离子色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例所使用的双极膜电渗析系统由中国科佳高分子材料科技有限公司设计，装置中，聚苯醚膜堆总膜面积为21cm×9cm×15cm，并设置一个钛图层电极板。
以下实施例所使用的高效离子色谱检测主要条件为：色谱柱：PA200，流动相：200mmol氢氧化钠及500mmol醋酸钠。
实施例1
将4g/L果胶(半乳糖醛酸干基为74％)装入含有500mL无菌水的三角锥形瓶中，加入4％果胶酶(基于底物质量计算)进行果胶降解，反应温度控制为50℃，pH为4.0，水浴搅拌转速为150rpm。在反应达到12小时后，反应体系中半乳糖醛酸的产量累积到2.75g/L时，停止反应，获得酶解液，半乳糖醛酸得率为92.9％。
通过冷冻离心机，在6000rpm条件下将酶解液进行固形物分离，上清液移至双极膜电渗析系统。启动双极膜电渗析系统，控制电渗析系统运行电压为20V，分离过程通过电导率仪实时检测，当料室中电导率单位级数下降至100μs/cm时分离停止。
将电渗析处理后的酸室溶液转移至1L生物反应器中，接入10g/L氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化72h，反应温度控制为30℃，pH为4，搅拌转速为500rpm。
经高效离子色谱检测，通过酶解-电渗析-静息细胞催化联合工艺最终可以获得2.52g/L半乳糖二酸，且产品中不含有其他糖及糖酸产品，色谱图如图1所示。
实施例2
将5g/L果胶(半乳糖醛酸干基为74％)装入含有500mL无菌水的三角锥形瓶中，加入4％果胶酶(基于底物质量计算)进行果胶降解，反应温度控制为55℃，pH为4.2，水浴搅拌转速为150rpm。在反应达到12小时后，反应体系中半乳糖醛酸的产量累积到3.39g/L时，半乳糖醛酸得率为91.5％。
通过冷冻离心机，在6000rpm条件下将酶解液进行固形物分离操作，上清液移至双极膜电渗析系统。启动双极膜电渗析系统，控制电渗析系统运行电压为25V，分离过程通过电导率仪实时检测，当料室中电导率单位级数下降至150μs/cm时分离停止。
将电渗析处理后的酸室溶液转移至1L生物反应器中，接入8g/L氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化72h，反应温度控制为30℃，pH为4.2，搅拌转速为500rpm。
经高效离子色谱检测，通过酶解-电渗析-静息细胞催化联合工艺最终可以获得2.37g/L半乳糖二酸，且产品中不含有其他糖及糖酸产品。
实施例3
将4g/L果胶(半乳糖醛酸干基为74％)装入含有500mL无菌水的三角锥形瓶中，加入5％果胶酶(基于底物质量计算)进行果胶降解，反应温度控制为50℃，pH为4.0，水浴搅拌转速为150rpm。在反应达到12小时后，反应体系中半乳糖醛酸的产量累积到2.83g/L时，半乳糖醛酸得率为95.6％。
通过冷冻离心机，在6000rpm条件下将酶解液进行固形物分离操作，上清液移至双极膜电渗析系统。启动双极膜电渗析系统，控制电渗析系统运行电压为20V，分离过程通过电导率仪实时检测，当料室中电导率单位级数下降至100μs/cm时分离停止。
将电渗析处理后的酸室溶液转移至1L生物反应器中，接入10g/L氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化72h，反应温度控制为30℃，pH为4，搅拌转速为500rpm。
经高效离子色谱检测，通过酶解-电渗析-静息细胞催化联合工艺最终可以获得2.35g/L半乳糖二酸，且产品中不含有其他糖及糖酸产品。
实施例4
将5g/L果胶(半乳糖醛酸干基为74％)装入含有500mL无菌水的三角锥形瓶中，加入5％果胶酶(基于底物质量计算)进行果胶降解，反应温度控制为55℃，pH为4.5，水浴搅拌转速为150rpm。在反应达到12小时后，反应体系中半乳糖醛酸的产量累积到3.41g/L时，半乳糖醛酸得率为92.1％。
通过冷冻离心机，在6000rpm条件下将酶解液进行固形物分离操作，上清液移至双极膜电渗析系统。启动双极膜电渗析系统，控制电渗析系统运行电压为25V，分离过程通过电导率仪实时检测，当料室中电导率单位级数下降至150μs/cm时分离停止。
将电渗析处理后的酸室溶液转移至1L生物反应器中，接入8g/L氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化72h，反应温度控制为30℃，pH为4.5，搅拌转速为500rpm。
经高效离子色谱检测，通过酶解-电渗析-静息细胞催化联合工艺最终可以获得2.49g/L半乳糖二酸，且产品中不含有其他糖及糖酸产品。
实施例5
将4g/L果胶(半乳糖醛酸干基为74％)装入含有500mL无菌水的三角锥形瓶中，加入4％果胶酶(基于底物质量计算)进行果胶降解，反应温度控制为55℃，pH为4.0，水浴搅拌转速为150rpm。在反应达到12小时后，反应体系中半乳糖醛酸的产量累积到2.66g/L时，半乳糖醛酸得率为89.7％。
通过冷冻离心机，在6000rpm条件下将酶解液进行固形物分离操作，上清液移至双极膜电渗析系统。启动双极膜电渗析系统，控制电渗析系统运行电压为20V，分离过程通过电导率仪实时检测，当料室中电导率单位级数下降至100μs/cm时分离停止。
将电渗析处理后的酸室溶液转移至1L生物反应器中，接入10g/L氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化72h，反应温度控制为32℃，pH为4.0，搅拌转速为500rpm。
经高效离子色谱检测，通过酶解-电渗析-静息细胞催化联合工艺最终可以获得2.27g/L半乳糖二酸，且产品中不含有其他糖及糖酸产品。
实施例6
将4g/L果胶(半乳糖醛酸干基为74％)装入含有500mL无菌水的三角锥形瓶中，加入4％果胶酶(基于底物质量计算)进行果胶降解，反应温度控制为50℃，pH为4.2，水浴搅拌转速为150rpm。在反应达到12小时后，反应体系中半乳糖醛酸的产量累积到2.53g/L时，半乳糖醛酸得率为85.5％。
通过冷冻离心机，在6000rpm条件下将酶解液进行固形物分离操作，上清液移至双极膜电渗析系统。启动双极膜电渗析系统，控制电渗析系统运行电压为20V，分离过程通过电导率仪实时检测，当料室中电导率单位级数下降至100μs/cm时分离停止。
将电渗析处理后的酸室溶液转移至1L生物反应器中，接入10g/L氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化72h，反应温度控制为30℃，pH为6.0，搅拌转速为500rpm。
经高效离子色谱检测，通过酶解-电渗析-静息细胞催化联合工艺最终仅可以获得0.35g/L半乳糖二酸，且产品中不含有其他糖及糖酸产品。
实施例7
将5g/L果胶(半乳糖醛酸干基为74％)装入含有500mL无菌水的三角锥形瓶中，加入4％果胶酶(基于底物质量计算)进行果胶降解，反应温度控制为50℃，pH为4.0，水浴搅拌转速为150rpm。在反应达到12小时后，反应体系中半乳糖醛酸的产量累积到2.71g/L时，半乳糖醛酸得率为73.2％。
通过冷冻离心机，在6000rpm条件下将酶解液进行固形物分离操作，上清液移至双极膜电渗析系统。启动双极膜电渗析系统，控制电渗析系统运行电压为15V，分离过程通过电导率仪实时检测，当料室中电导率单位级数下降至150μs/cm时分离停止。
将电渗析处理后的酸室溶液转移至1L生物反应器中，接入10g/L氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化72h，反应温度控制为30℃，pH为3.0，搅拌转速为500rpm。
经高效离子色谱检测，通过酶解-电渗析-静息细胞催化联合工艺最终可以获得1.19g/L半乳糖二酸，且产品中不含有其他糖及糖酸产品。
实施例8
将4g/L果胶(半乳糖醛酸干基为74％)装入含有500mL无菌水的三角锥形瓶中，加入4％果胶酶(基于底物质量计算)进行果胶降解，反应温度控制为55℃，pH为4.0，水浴搅拌转速为150rpm。在反应达到12小时后，反应体系中半乳糖醛酸的产量累积到2.66g/L时，半乳糖醛酸得率为89.8％。
通过冷冻离心机，在6000rpm条件下将酶解液进行固形物分离操作，上清液移至双极膜电渗析系统。启动双极膜电渗析系统，控制电渗析系统运行电压为10V，分离过程通过电导率仪实时检测，当料室中电导率单位级数下降至100μs/cm时分离停止。
将电渗析处理后的酸室溶液转移至1L生物反应器中，接入10g/L氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化72h，反应温度控制为30℃，pH为2.0，搅拌转速为500rpm。
经高效离子色谱检测，通过酶解-电渗析-静息细胞催化联合工艺最终仅可以获得0.11g/L半乳糖二酸，且产品中不含有其他糖及糖酸产品。
实施例9
将4g/L纯品半乳糖醛酸装入含有500mL无菌水的三角锥形瓶中。将溶液移至双极膜电渗析系统。启动双极膜电渗析系统，控制电渗析系统运行电压为20V，分离过程通过电导率仪实时检测，当料室中电导率单位级数下降至100μs/cm时分离停止。
将电渗析处理后的酸室溶液转移至1L生物反应器中，接入10g/L氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化72h，反应温度控制为30℃，pH为4.5，搅拌转速为500rpm。
经高效离子色谱检测，纯品半乳糖醛酸-电渗析-静息细胞催化联合工艺最终可以获得2.76g/L半乳糖二酸，且产品中不含有其他糖及糖酸产品。。
实施例10
将4g/L果胶(半乳糖醛酸干基为74％)装入含有500mL无菌水的三角锥形瓶中，加入4％果胶酶(基于底物质量计算)进行果胶降解，反应温度控制为50℃，pH为3.8，水浴搅拌转速为150rpm。在反应达到12小时后，反应体系中半乳糖醛酸的产量累积到2.46g/L时，半乳糖醛酸得率为82.4％。
将酶解后的酶解液直接转移至1L生物反应器中，接入10g/L氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化72h，反应温度控制为30℃，pH为4.5，搅拌转速为500rpm。
经高效离子色谱检测，通过酶解-静息细胞催化联合工艺最终可以获得2.08g/L半乳糖二酸，但产品中含有其余糖及糖酸产品，色谱图如图2所示。
Claims (2)
1.一种制备高纯度半乳糖二酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以果胶为底物，采用果胶酶进行酶水解生产制备半乳糖醛酸；其中，果胶的浓度为4~5g/L；果胶酶的用量为底物质量的4%~5%；酶水解反应条件为：控制反应温度为50~55℃，pH为3.8~4.2；
2)实时监测反应体系中半乳糖醛酸生成量，至反应体系中半乳糖醛酸的浓度不再增加停止反应，离心酶解液后将上清液转移至双极膜电渗析系统的料室中进行分离纯化；其中，控制电渗析设备电压20~30V，电流5A以下；
3)当电渗析系统盐室中电导率将至100~200μs/cm时，分离过程完成；将酸室中的溶液转移至生物反应器中，并接入氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化生产获得高纯度半乳糖二酸溶液；其中，氧化葡萄糖酸杆菌的接入量为8~10g/L；静息细胞阶段反应条件为：控制反应温度为28~30℃，搅拌转速为500~550rpm，pH为4.0~4.5。
2.根据权利要求1所述的制备高纯度半乳糖二酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在震荡反应体系中，加入4g/L的底物基质果胶，接入4%果胶酶进行酶水解生产半乳糖醛酸混合液；实时监测反应体系中半乳糖醛酸生成量，并通过氢氧化钠控制反应pH 3.8~4.2；
（2）至震荡反应体系中半乳糖醛酸的浓度不再增加停止反应，离心酶解液后将上清液转移至双极膜电渗析系统的料室中进行分离纯化，至电渗析系统盐室中电导率将至100~200μs/cm时，分离过程完成，于酸室获得高纯度半乳糖醛酸溶液；
（3）将酸室中的半乳糖醛酸溶液转移至1L生物反应器中，并接入10g/L氧化葡萄糖酸杆菌进行静息细胞催化生产半乳糖二酸；实时监测反应体系中半乳糖二酸生成量，并控制反应体系pH 4.0~4.5。
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