BRPI0609051A2

BRPI0609051A2 - pectina derivada da fruta acerola e sua aplicação

Info

Publication number: BRPI0609051A2
Application number: BRPI0609051-6A
Authority: BR
Inventors: Masakazu Kawaguchi; Akiko Sasaki; Kenichi Nagamine; Jun Kamihigashi
Original assignee: Nichirei Foods Inc; Nichirei Biosciences Inc
Priority date: 2005-02-28
Filing date: 2006-02-28
Publication date: 2010-02-17
Also published as: WO2006090935A1; EP1878753A4; EP1878753A1; CN101171266A; CN101171266B; JP4782104B2; JPWO2006090935A1

Abstract

PECTINA DERIVADA DA FRUTA ACEROLA E SUA APLICAçãO. A presente invenção refere-se a uma pectina derivada de uma fruta de acerola ou um hidrolisado da mesma, compreendendo um complexo formado de Aceronidina, a qual é um novo composto polifenólico. A pectina da presente invenção pode ser usada como um ingrediente ativo de um antioxidante ou um agente branqueador de pele.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PECTINA DERIVADA DA FRUTA ACEROLA E SUA APLICAÇÃO".

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a uma pectina derivada da fruta acerola útil como um antioxidante ou um agente branqueador da pele para administração oral. Antecedentes da Técnica

Oxidação ou hiperoxidação de ingredientes gordurosos e oleosos ou similares por oxigênio no ar é o fator mais problemático nas etapas de estocagem, conservação e etapas de processamento para gorduras e óleos, mercadorias que os contém, produtos alimentícios, cosméticos, preparações farmacêuticas e similares. Particularmente, ácido graxo insaturado, tal como ácido linoléico ou ácido linolênico contido em gorduras e óleos é facilmente hiperoxidado pelo oxigênio para gerar lipídeos hiperoxidados ou radicais livres, além das substâncias carcinogênicas (Shokuhin-no-hoso (Food Packaging), vol. 17, pág. .106 (1986)). Quando ocorre a oxidação ou a hiperoxidação, não somente acontece o manchamento, a descoloração, a degeneração, o odor anormal e a eficácia diminuída do valor nutritivo, mas também a geração de veneno ou similares, resultando na deterioração na qualidade do produto.

Vários antioxidantes foram usados convencionalmente para prevenir a deterioração na qualidade do produto através da supressão da oxidação de ácidos graxos insaturados. Esses antioxidantes têm efeitos de a-ção em radicais peróxidos que são gerados na oxidação, de forma a interromper as reações de oxidação de cadeia ou da ação em radicais livres, para interromper as reações de oxidação. Como antioxidantes, antioxidantes sintéticos, tais como butilidroxianisol (BHA) e butilidroxitolueno (BHT), por exemplo, foram geralmente usados convencionalmente. Entretanto, uma vez que as chances de usar esses antioxidantes sintéticos tenham sido aumentadas, sua segurança se tornou um problema. Quanto mais fortes as respostas negativas dos consumidores, menor o consumo de tais antioxidantes. Além disso, esses antioxidantes solúveis em óleo também são problemáticospelo fato de que eles não têm solubilidade em soluções aquosas.

Conseqüentemente, expectativas por antioxidantes derivados de produtos naturais com alta segurança estão crescendo consideravelmente.

Antioxidantes naturais convencionalmente conhecidos são a vi- tamina E (a-tocoferol) e a vitamina C (ácido ascórbico), por exemplo. Entretanto, a vitamina E tem uma alta solubilidade lipídica e a vitamina C tem uma alta solubilidade aquosa, de forma que elas são inapropriadas para a supressão da oxidação lipídica na indústria de alimentos. Isso ocorre porque: uma vez que produtos processados (por exemplo, peixe, carne de criação e grãos), produtos alimentícios curados com sal, temperos contendo gordura e óleo, e similares, para os quais a oxidação lipídica deva ser processada, cada um geralmente forma um sistema misturado contendo gorduras e óleos e componentes baseados em água, tendo a aplicação desses antioxidantes extrema solubilidade lipídica ou solubilidade em água limitada. Além disso, a vitamina E é problemática pelo fato de que ela tem seu próprio sabor desfavorável em um produto alimentício, de forma que a sua quantidade a ser a-dicionada e sua aplicação são limitadas. Vitamina E e vitamina C também são problemáticas pelo fato de que a sua atividade antioxidação não dura muito de uma forma estável.

Sabe-se que pectinas isoladas de plantas por vários métodos exibem atividades antioxidativas para lipídeos sob condições específicas. Entretanto, cogita-se que as atividades antioxidativas sejam muito fracas, de forma que tais pectinas não são usadas como antioxidantes gerais. Por e-xemplo, sabe-se que uma pectina isolada do refugo do coágulo do feijão (so- ja) e seu produto tratado com enzimas tem um efeito de prevenção de oxidação lipídica (FOOD SCIENCE, VOL. 36D N°. 11, pág. 93-102 (1994)), mas sua atividade antioxidação é insuficiente. Além disso, pectinas são polissa-carídeos que existem em várias plantas, as quais são compostas de ácido galacturônico, seu éster metílico, outros açúcares neutros ou similares. E- xemplos de um açúcar neutro incluem ramnose, arabinose e galactose, mas seus tipos e proporções de composições suas são conhecidas por diferir significativamente uns dos outros dependendo das plantas envolvidas (escri-to por Takaaki Manabe, Primeira edição, "Science and Food Texture of Pec-tin," Saiwai Shobo, pág. 8-22 (2001)).

Entretanto, agentes branqueadores de pele foram convencionalmente desenvolvidos principalmente para cosméticos e quase-fármacos. Conseqüentemente, muitos ingredientes ativos, tais como arbutina e derivados do ácido ascórbico, foram descobertos. Entretanto, a maioria desses ingredientes ativos é usada como preparações de pele externas. Atualmente, um exemplo de uma preparação farmacêutica para suprimir a pigmenta-ção devido a manchas, queimaduras solares ou similares através de inges- tão oral é um produto contendo ácido ascórbico (vitamina C) como um ingrediente ativo principal com cisteína (a qual é um aminoácido) e complexo de vitamina B, os quais se espera que exerçam um efeito sinergístico, composto com isso. Especificamente, cogita-se que o ácido ascórbico seja o ingrediente mais apropriado que pode ser esperado que exerça seguramente um efeito de supressão de pigmentação através da ingestão oral.

Como uma fruta que é rica em ácido ascórbico, acerola (nome científico: Malpighia emarginata DC) é bem conhecida. O uso de tal acerola como um ingrediente ativo para um agente branqueador de pele está descrito na Patente Japonesa N°. 3513871. A aplicação da acerola é limitada a preparações para a pele externas, tais como cosméticos. Além disso, o uso de uma composição como um agente branqueador de pele está descrito na Patente Japonesa No. 3076787, em que a composição que não contém substancialmente ácido ascóbrico é obtida pela fermentação da acerola. Nenhum agente branqueador de pele, que seja produzido usando acerola, que seja composto de ácido ascórbico e outros ingredientes e seja eficaz para administração oral foi descoberto.

Também há relatórios envolvendo a relação entre um componente derivado de uma pectina contida na polpa de fruta e um agente branqueador de pele. É reportado na Patente Japonesa No. 3596953 que o ácido oligogalacturônico exerceu um efeito de supressão da produção de melanina em um teste em células animais. Aqui, "ácido oligogalacturônico" é formado através da ligação de aproximadamente 2 a 10 ácidos galacturônicos. Alémdisso, em Shokuhin-no-hoso (Food Packaging), vol. 17, pág. 106 (1986), foi demonstrado que um produto de degradação da pectina derivado de suco de tomate tem um efeito de supressão da geração de pigmentos de melanina. Também está descrito nesse documento que o efeito de supressão do pig- mento de melanina não foi confirmado para o ácido galacturônico e o ácido poligalacturônico. Foi ensinado que os resultados na Patente Japonesa No. 3596953 entram em conflito com aqueles em Shokuhin-no-hoso (Food Packaging), vol. 17, pág. 106 (1986). Isso pode ser devido ao fato de as fontes relevantes de plantas diferirem muito umas das outras em termos de estrutu- ra e da natureza da pectina. Tanto na Patente Japonesa No. 3596953 quanto em Eiji Naru et al., Fragrance Journal, Vol. 32 No. 8, pág. 24-30 (2004), somente foi examinado o efeito contra células animais. Um efeito branquea-dor de pele exercido por uma combinação de um componente derivado de uma pectina e outros componentes nunca foi reportado.

Descrição da Invenção

Objetos a serem alcançados pela invenção

É um objeto da presente invenção fornecer um antioxidante solúvel em água isolado da natureza e um método de produção de tal antioxidante.

Outro objeto da presente invenção é fornecer um agente bran- queador de pele para administração oral isolado da natureza e um método para produzir tal agente branqueador de pele. Formas de alcançar os objetos

A presente invenção inclui as seguintes invenções.

(1) Uma pectina derivada de uma fruta de acerola ou um hidroli-

sado seu, compreendendo um complexo formado de uma estrutura principal de pectina e de um composto de polifenol representado pela fórmula química:<formula>formula see original document page 5</formula>(2) O método para produzir a pectina, de acordo com (1), compreendendo a etapa de isolar ou concentrar a pectina de uma fruta de acerola ou um produto processado do mesmo.

(3) O método para produzir o hidrolisado de pectina, de acordo 5 com (1), compreendendo uma etapa de isolar ou concentrar uma pectina de

uma fruta de acerola ou um produto processado o mesmo e uma etapa de hidrolisar a pectina.

(4) O método, de acordo com (3), compreendendo uma etapa de hidrolisar uma pectina em purê preparada a partir de uma fruta acerola atra-

10 vés do tratamento do purê com pectinase e uma etapa de isolar ou concentrar a pectina hidrolisada de um sobrenadante do produto processado na etapa anterior.

(5) O método, de acordo com qualquer um de (2) a (4), em que a etapa de isolar ou concentrar a pectina é uma etapa de precipitar a pectina

15 usando etanol.

(6) O método, de acordo com qualquer um de (2) a (4), em que a etapa de isolar ou concentrar a pectina é uma etapa de isolar ou concentrar a pectina usando uma membrana de separação.

(7) O método, de acordo com (6), em que a membrana de sepa-20 ração é uma membrana de ultrafiltração.

(8) O método, de acordo com (7), em que a membrana de ultrafiltração tem um corte de peso molecular variando de 10.000 a 100.000.

(9) Um material contendo pectina derivada de uma fruta acerola, a qual é produzida por um método compreendendo a etapa de isolar ou con-

centrar uma pectina a partir da fruta acerola ou de um produto processado do mesmo.

(10) Um material contendo um hidrolisado de uma pectina derivado de uma fruta acerola, o qual é produzido por um método compreendendo uma etapa de isolamento ou concentração da pectina a partir da fruta

acerola ou um produto processado do mesmo e uma etapa de hidrolisar a pectina.

(11) 0 material, de acordo com (10), o qual é produzido por ummétodo compreendendo a etapa de hidrolisar uma pectina em purê preparada a partir da fruta acerola através do tratamento do purê com pectinase e a etapa de isolar ou concentrar a pectina hidrolisada do sobrenadante do produto processado resultante da etapa anterior. 5 (12) Material, de acordo com qualquer uma de (9) a (11), em que

a etapa de isolar ou concentrar pectina é uma etapa de precipitar uma pectina usando etanol.

(13) Material, de acordo com qualquer uma de (9) a (11), em que a etapa de isolar ou concentrar pectina é uma etapa de isolar ou concentrar

uma pectina usando uma membrana de separação.

(14) O material, de acordo com (13), em que a membrana de separação é uma membrana de ultrafiltração.

(15) O material, de acordo com (14), em que a membrana de ultrafiltração tem um corte de peso molecular variando de 10.000 a 100.000.

(16) Um antioxidante, contendo a pectina ou o hidrolisado do

mesmo, de acordo com (1) como um ingrediente ativo.

(17) Um antioxidante, contendo o material de acordo com qualquer uma de (9) a (15), como um ingrediente ativo.

(18) Um antioxidante para lipídeos, contendo um produto pro-20 cessado de uma fruta de acerola (excluindo um produto processado de uma

semente de acerola) como um ingrediente ativo.

(19) O antioxidante, de acordo com (18), em que o produto processado de uma fruta de acerola contém polifenol e/ou ácido ascórbico.

(20) Um produto alimentício, como um efeito antioxidativo, ao qual o antioxidante, de acordo com qualquer uma de (16) a (19) é adicionado.

(21) Um método para produzir um produto alimentício, compreendendo uma etapa de aumentar a estabilidade à oxidação de um produto alimentício usando um antioxidante, de acordo com qualquer uma de (16) a

(19).

(22) Um agente de branqueamento da pele para administração oral, contendo a pectina ou o seu hidrolisado do mesmo de acordo com (1)como um ingrediente ativo.

(23) Um agente de branqueamento da pele para administração oral, contendo o material de acordo com qualquer uma de (9) a (15) como um ingrediente ativo. (24) O agente de branqueamento da pele para administração

oral, de acordo com (22) ou (23), contendo ainda ácido ascórbico.

(25) Um produto alimentício com um efeito de branqueamento de pele, ao qual o agente de branqueamento de pele para administração oral de acordo com qualquer uma de (22) a (24) é adicionado.(26) Um método para produzir um agente de branqueamento de

pele para administração oral, compreendendo uma etapa de hidrolisar uma pectina contida na polpa de uma fruta de acerola ou de um produto processado de uma fruta de acerola contendo ácido ascórbico e tal polpa, de forma que a quantidade de ácido galacturônico é de 5% em peso ou mais em rela- ção ao ácido ascórbico.

(27) O método, de acordo com (26), compreendendo ainda uma etapa de remover substancialmente glicose e frutose.

O termo "antioxidante (para lipídeos), contendo um componente predeterminado como um ingrediente ativo" na presente invenção indica tan-to uma composição com atividades antioxidativas (para lipídeos) na qual um componente predeterminado está contido em uma condição natural e uma composição com atividades antioxidativas (para lipídeos) aos quais um componente predeterminado é artificialmente adicionado.

O termo "agente branqueador da pele para administração oral, contendo um componente predeterminado como um ingrediente ativo" na presente invenção indica tanto uma composição com um efeito branqueador de pele no qual um componente predeterminado está contido em uma condição natural e uma composição com um efeito branqueador de pele ao qual um componente predeterminado é artificialmente adicionado. O termo "um produto alimentício com um efeito antioxidativo, ao

qual o antioxidante é adicionado" em (20) acima significa um produto alimentício com um efeito antioxidativo ao qual um antioxidante predeterminado éartificialmente adicionado.

O termo "um produto alimentício com um efeito branqueador de pele, ao qual o agente branqueador de pele para administração oral é adicionado" em (25) acima significa um produto alimentício com um efeito branqueador de pele ao qual um agente branqueador de pele predeterminado para administração oral é artificialmente adicionado. Efeito da invenção

A pectina derivada de fruta de acerola de acordo com a presente invenção, compreendendo um complexo formado de polifenol, é útil como um antioxidante e também útil como um agente branqueador de pele para administração oral.

Essa descrição inclui parte de todos os conteúdos conforme descritos na descrição e/ou desenhos dos Pedido de Patente Japonesas Nos. 2005-53479 e 2005-88860, os quais são documentos de prioridade do presente pedido. Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 mostra o cromatograma de uma amostra extraída de uma pectina derivada de fruta de acerola, conforme analisada por HPLC a-nalítico.

Figura 2 mostra o cromatograma de uma amostra extraída de uma pectina derivada de fruta de acerola, conforme analisada por HPLC preparativo.

Figura 3 mostra o cromatograma obtido pela submissão do componente fracionado por HPLC preparativo ao HPLC analítico.

Figura 4A mostra os dados de espectro para o pico em 22,4 minutos apresentado no cromatograma da figura 3.

Figura 4B mostra os dados de espectro para a Aceronidina.

Figura 5 mostra a comparação do espectro de 1H RMN para A-ceronidina (gráfico superior) com aquele do polifenol (gráfico inferior) separada de uma pectina derivada de fruta de acerola.

Figura 6A mostra o cromatograma iônico total da Aceronidina.

Figura 6B mostra o espectro de massa ESI de alta resoluçãopara a Aceronidina.

Figura 7 mostra o espectro de 1H RMN para a Aceronidina.

Figura 8 mostra o espectro de RMN 13C para a Aceronidina.

Figura 9 mostra o espectro DEPT para a Aceronidina. 5 Figura 10 mostra o espectro de DQF-COSY para a Aceronidina.

Figura 11 mostra o espectro de HSQC para a Aceronidina.

Figura 12 mostra o espectro de HMBC para a Aceronidina.

Figura 13 mostra o espectro de NOESY para a Aceronidina.

Figura 14 mostra os resultados de determinação da capacidade 10 de suprimir a auto-oxidação do ácido linoléico do BHA, suco de acerola concentrado e pó de acerola.

Figura 15 mostra os resultados da determinação da capacidade da vitamina C de suprimir a auto-oxidação do ácido linoléico.

Figura 16 mostra os resultados da determinação da capacidade ,15 dos componentes adsorvidos na coluna C18 derivados de acerola, um pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 tenham sido removidos, e um pó de acerola para suprimir a auto-oxidação do ácido linoléico.

Figura 17 mostra os resultados da determinação da capacidade 20 de um suco de acerola a partir do qual componentes adsorvidos na coluna C18 tenham sido removidos e um pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 e vitamina C tenham sido removidos para suprimir a auto-oxidação do ácido linoléico.

Figura 18 mostra os resultados da determinação da capacidade 25 de uma pectina derivada de acerola (peso molecular de 2.000.000) tratada com ácido e uma pectina (peso molecular de 20.000 ou menos) tratada com uma enzima para suprimir a auto-oxidação do ácido linoléico.

Figura 19 mostra fotografias mostrando um grupo de teste de amostras de salmão curado com sal aos quais acerola tenha sido adicionada 30 depois de estocagem sob condições de iluminação fluorescentes e um grupo de teste de controle de amostras de salmão curadas com sal.

Figura 20 mostra a transição do valor "a" durante a estocagemsob condições de iluminação fluorescentes de amostras de salmão curado com sal que tenham sido tratadas com um fluido de imersão contendo um pó de acerola.

Figura 21 mostra os resultados da condução de um teste de supressão de pigmentação usando porquinhos-da-índia marrons. Modalidades Preferidas da Invenção 1. Pectina derivada da fruta acerola

A área de produção das variedades das frutas de acerola (nome científico: Malpighia emarginata DC) a serem usadas na presente invenção não são particularmente limitadas. Exemplos de áreas de produção incluem Okinawa, Japão, Brasil e Vietnã.

Frutas de acerola na presente invenção podem se referir a todas as porções das frutas, incluindo sementes, ou frutas de acerola submetidas a um tratamento geral, tal como a remoção de sementes, descasamento ou similar.

Como frutas de acerola, frutas maduras ou frutas verdes podem ser usadas. O uso de frutas verdes é preferível. "Fruta verde" é uma fruta que cresceu suficientemente de forma que suco possa ser espremido de tal fruta, mas tem coloração de verde para amarelo porque a fruta (fruta imatura) está em um estágio antes do grau de maturidade do mesmo fica alta o suficiente para ter coloração vermelha.

Além da própria fruta de acerola, produtos processados de vários tipos de fruta de acerola podem ser usados na presente invenção, contanto que eles contenham pectina. Por exemplo, purê, suco de fruta ou polpa preparada de um suco de acerola, produtos de frutas de acerola esmagadas ou moídas ou extratos de fruta de acerola podem ser usados. Como material de partida para a produção de pectina de acordo com a presente invenção, são preferidos purê, suco de fruta ou polpa preparados da fruta acerola. Purê é particularmente preferido.

Suco de fruta pode ser obtido pela compressão da fruta acerola de acordo com técnicas convencionais. Um resíduo obtido depois de espremer uma fruta para coletar suco de fruta é referido como "polpa".Um produto esmagado de uma fruta de acerola pode ser obtido pelo esmagamento, usando um misturador ou similar, das partes comestíveis e sementes da fruta de acerola ou de partes comestíveis da mesma a partir da qual as sementes tenham sido removidas. Além disso, tal produto esmagado submetido ao tratamento, tal como extração ou liofilização, pode também ser usado.

Um extrato de fruta de acerola pode ser obtido submetendo-se uma fruta de acerola à extração usando água, um solvente orgânico ou similar. As condições de extração não são particularmente limitadas, contanto que nenhuma pectina seja perdida sob tais condições.

Não somente uma pectina derivada de uma fruta de acerola, mas também uma pectina "geral" tem uma estrutura em que: homogalacturonano composto de ácido poligalacturônico formado por ácido galacturônico ligado de forma a-(1->4) e ramnogalacturonano composto de ácido galactu-15 rônieo composto de ácido galacturônico e ramnose repetidamente ligados uns aos outros formam a cadeia principal; e cadeias laterais, tais como ga-lactano e arabinano se ramificam da ramnose. Grupos carboxílicos de ácido galacturônico são metil-esterificados ou acetil-esterificados em diferentes proporções. Além disso, acredita-se que a pectina tenha uma estrutura liga-20 da de forma cruzada através da ligação com um cátion polivalente, tal como cálcio ou magnésio.

Na presente invenção, a estrutura da cadeia de açúcar da pectina composta da cadeia principal compreendendo homogalacturonano e ramnogalacturonano e as cadeias laterais que se ramificam da cadeia prin-25 cipal é referida como "estrutura principal da pectina".

Surpreendentemente, os presentes inventores descobriram que a pectina contida em uma fruta de acerola é um complexo formado da estrutura principal de pectina e de um composto de polifenol representado pela fórmula química:<formula>formula see original document page 13</formula>

O composto polifenólico é um composto que foi isolado pela pri-meira vez pelos presentes inventores e que foi chamado de Aceronidina.Uma patente para esse composto foi aplicada em 22 de dezembro de 2004, sob o Pedido de Patente JP No. 2004-372266.

"Compreendendo um complexo formado de uma estrutura prin-cipal de pectina e um composto polifenólico" na presente invenção significaque a Aceronidina e a estrutura principal de pectina coexistem de uma formatal que elas são inseparáveis uma da outra por um método de isolamento ou de concentração geral para a pectina, tal como por precipitação com etanolou filtração com membrana (por exemplo, ultrafiltração). A estrutura específi-ca da estrutura principal do complexo de Aceronidina-pectina não foi eluci-dada. Uma estrutura possível do mesmo pode ser uma estrutura em queuma porção de Aceronidina e uma porção da estrutura principal de pectina estão ligadas através de uma ligação covalente (tal como uma ligação ésterou uma ligação glicosídica), uma estrutura na qual elas estão ligadas atravésde ligação de hidrogênio, ou uma estrutura em que elas estão ligadas atra-vés de uma ligação hidrofóbica, por exemplo. Além disso, a proporção quan-titativa de Aceronidina em relação à estrutura principal de pectina no com- plexo de estrutura principal de Aceronidina-pectina não é particularmentelimitada. "Pectina derivada de uma fruta de acerola" na presente invençãosignifica um complexo que é formado pela estrutura principal de pectina eAceronidina, a não ser que seja particularmente limitado. Além disso, "isola-mento ou concentração de pectina" significa isolar ou concentrar uma pecti- na que é um complexo da estrutura principal de pectina e Aceronidina. Alémdisso, a pectina de acordo com a presente invenção pode ser expressa co-mo "pectina antioxidativa", significando "pectina com potência antioxidativa".

"Hidrolisado de uma pectina derivada de uma fruta de acerola"na presente invenção refere-se a um produto obtido por hidrólise química ouenzimática da ligação entre os açúcares constituintes na estrutura principalde pectina compreendendo a cadeia principal e as cadeias laterais da pecti-na derivada da fruta de acerola, e particularmente, da ligação entre os açú- cares constituintes na cadeia principal. De acordo com os estudos conduzi-dos pelos presentes inventores, mesmo após a hidrólise da estrutura princi-pal da pectina com pectinase (a qual hidrolisa a cadeia principal), Aceronidi-na e um hidrolisado (suposto ser principalmente composto de cadeias late-rais) da estrutura principal de pectina são inseparáveis pelo tratamento para

isolar e concentrar pectina, tal como precipitação com etanol ou ultrafiltra-ção. Especificamente, "hidrolisado de uma pectina derivada de uma fruta deacerola" também compreende um complexo formado de um hidrolisado deestrutura principal de pectina e de Aceronidina. Estudos adicionais conduzi-dos pelos presentes inventores revelaram que tanto uma pectina derivada da

fruta acerola com um peso molecular de aproximadamente 2.000.000 e umhidrolisado de uma pectina derivada da fruta acerola com um peso molecularde 20.000 ou menos têm atividades antioxidativas. Conseqüentemente, opeso molecular da pectina derivada da frua acerola ou o mesmo do seu hi-drolisado do mesmo a ser usado na presente invenção não são particular-

mente limitados.

A pectina derivada da fruta acerola de acordo com a presenteinvenção é produzida pelo isolamento ou concentração de uma fruta acerolaou de um produto processado do mesmo. Exemplos de um método para iso-lar ou concentrar tal pectina incluem um método que envolve a precipitação

da pectina através da adição de etanol a uma amostra contendo pectina eum método que envolve o isolamento ou concentração da pectina com o usode uma membrana de separação. Desses métodos, uma pluralidade dosmesmos tipos de ou diferentes tipos de métodos podem ser combinados. Arepetição de uma etapa de precipitação de pectina usando etanol torna pos-

sível remover ácido ascórbico solúvel em água, ou ácido orgânico ou polife-nóis que sejam facilmente solúveis em álcool. Como uma membrana de se-paração, é preferível uma membrana de ultrafiltração. Uma membrana deultrafiltração é uma membrana que pode bloquear a passagem de partículasou polímeros em tamanhos geralmente variando de 0,1 |u.m até 2 nm (pesomolecular de várias centenas de multimilhões). Tal membrana de ultrafiltra-ção preferivelmente tem um peso molecular nominal de corte de 1.000 ou superior e, mais preferivelmente, um peso molecular nominal de corte vari-ando de 10.000 até 100.000.

Quando pectina é isolada ou concentrada a partir de uma frutaacerola ou um produto processado de uma fruta acerola contendo polpa, talcomo polpa de acerola e purê de acerola, um ácido forte, tal como ácido clo- rídrico ou ácido nítrico é adicionado a uma amostra contendo polpa antes doprocedimento descrito no último parágrafo acima, de forma que os compo-nentes solúveis em ácido possam também ser dissolvidos.

Uma solução concentrada de pectina obtida pela filtração emmembrana pode ser diretamente usada como um ingrediente ativo de um antioxidante ou como um agente branqueador de pele. Tal solução concen-trada de pectina também pode ser pulverizada e, a seguir, usada. A pulveri-zação de uma solução concentrada de pectina pode ser efetuada por ummétodo de liofilização ou por um método de secagem por atomização. Nafiltração por membranas, qualquer grau de concentração para um concen-trado pode ser selecionado, e ele é preferivelmente um grau de concentra-ção no qual o conteúdo sólido da pectina na solução concentrada é de 10%(p/p) ou superior e, preferivelmente, de 20% (p/p) ou superior. Para a pulve-rização de tal solução concentrada, pode haver a necessidade de remoçãode glicose e frutose na solução concentrada através da retirada de açúcarusando leveduras ou similares. Quando um grau de concentração está dafaixa acima, a retirada de açúcar pode ser facilmente efetuada. Além disso,um peso molecular de corte de uma membrana de ultrafiltração e as condi-ções de concentração são apropriadamente selecionadas e, dessa forma, aglicose e a frutose são removidas do concentrado por filtração em membra-na, tornando a retirada de açúcar desnecessária na pulverização da soluçãoconcentrada.

Um hidrolisado da pectina derivada da fruta acerola de acordocom a presente invenção é produzido por um método que compreende aetapa acima de isolamento ou concentração de pectina e a etapa de hidróli-se da pectina. A etapa de hidrólise pode ser efetuada ou antes ou depois daetapa precedente. A hidrólise da pectina significa hidrolisar quimicamente ou enzimaticamente a ligação entre os açúcares constitutivos na estrutura dapectina derivada da fruta acerola e, particularmente, da ligação entre os açú-cares constitutivos na cadeia principal. A hidrólise é preferivelmente efetuadausando a pectinase. Quando a pectinase é usada, os tipos de pectinase nãosão particularmente limitados. Por exemplo, pectinase com atividade de en- dopoligalacturanase pode ser usada. As origens da pectinase não são parti-cularmente limitadas. Um exemplo de pectinase é a derivada de um micróbiodo gênero Aspergillus (por exemplo, A. Pulverulentus ou A. niger). Um hidro-lisado produzido usando a pectinase da pectina derivada da fruta acerolacontém ácido galacturônico livre que é a digestão da cadeia principal. Para a separação de somente um componente que forma um complexo com a Ace-ronidina dos hidrolisados obtidos dessa forma, tal componente é adsorvidoem uma coluna hidrofóbica (por exemplo, coluna C18) e, a seguir, o compo-nente adsorvido pode ser coletado através de eluição. O componente cole-tado dessa forma também é uma modalidade de um hidrolisado de uma pec- tina, de acordo com a presente invenção.

Na modalidade mais preferida, um método de produção de umhidrolisado de pectina derivada de fruta acerola de acordo com a presenteinvenção compreende a etapa de hidrolisar uma pectina na forma de purêpreparada de uma fruta de acerola através de tratamento usando pectinasee de uma etapa de isolamento ou concentração da pectina hidrolisada dosobrenadante do produto tratado na etapa anterior. Nessa modalidade, épreferível filtrar o sobrenadante através de, preferivelmente, um filtro de 0,2u.m antes do isolamento ou concentração da pectina hidrolisada. Tambémnessa modalidade, é preferível concentrar a pectina hidrolisada usando umamembrana de ultrafiltração. Uma solução concentrada obtida pela ultrafiltra-ção é preferivelmente adicionalmente pulverizada. O pó obtido dessa formapode, facilmente, ser moído finamente e tem uma alta fluidez e uma baixahigroscopicidade.

2. Aplicação da pectina derivada da fruta acerola

A pectina derivada da fruta acerola ou hidrolisado do mesmo deacordo com a presente invenção tem um efeito de suprimir a auto-oxidaçãode lipídeos e um efeito de retirar radicais livres, de forma que ela pode serusada como um ingrediente ativo de um antioxidante.

A pectina derivada da fruta acerola ou o seu hidrolisado domesmo de acordo com a presente invenção também tem um efeito branque-ador de pele que é exercido através de administração oral, de forma que elapossa ser usada como um ingrediente ativo de tal agente branqueador depele.

3. Antioxidantes para lipídeos, contendo o produto processado de uma frutaacerola como um ingrediente ativo

Surpreendentemente, os presentes inventores descobriram quecomponentes (contendo um composto polifenólico) que estão adsorvidos auma coluna hidrofóbica e ácido ascórbico contido em uma fruta acerola tam-bém são úteis como antioxidantes para lipídeos. Especificamente, a presen-te invenção refere-se ainda a um antioxidante para lipídeos, o qual contémum produto processado de fruta acerola como um ingrediente ativo.

Tal produto processado de uma fruta acerola é preferivelmentesolúvel em água porque ele pode ser particularmente geralmente usado naindústria de alimentos.

Na modalidade da presente invenção, tal produto processado deuma fruta acerola pode ser usado como um ingrediente ativo de um antioxi-dante para lipídeos, contanto que ele contenha pelo menos um de e preferi-velmente ambos de um polifenol derivado de fruta acerola e de ácido ascór-bico. Entretanto, nessa modalidade da presente invenção, tal produto pro-cessado de acerola é derivado de porções diferentes de sementes de acero-la, tal como da polpa e do pericarpo da fruta acerola.

Exemplos específicos de tal composto de polifenol derivado defruta acerola incluem Aceronidina, pigmentos de antocianina tais como ciani-dina-3-ramnosídeo e pelargonidina-3-ramnosídeo, glicosídeos de quercetinatais como quercitrina (quercetina-3-ramnosídeo), isoquercitrina (quercetina-3-glicosídeo) e hiperosídeo (quercetina-3-galactosídeo) e astilbina. Essespolifenóis podem ser usados na forma de uma mistura compreendendo umapluralidade de compostos polifenólicos ou podem ser usados sozinhos na forma de um composto individual. Esses compostos polifenólicos podem serisolados ou preparados para ter concentrações mais elevadas e, a seguir,usados. Métodos para o isolamento de compostos polifenólicos e métodospara o preparo do mesmo com concentrações mais elevadas não são parti-cularmente limitados. Exemplos de tais métodos incluem HPLC, cromatogra-

fia absorvente sintética, cromatografia de troca iônica e filtração em gel. Par-ticularmente, é preferível a cromatografia absorvente sintética.

Como um produto processado de uma fruta acerola contendoum composto polifenólico derivado de fruta acerola, uma fração contendo talcomposto polifenólico fracionada por um dos vários tipos acima de cromato-

grafia do suco de fruta acerola ou similar pode ser apropriadamente usadapara a presente invenção. Particularmente, uma fração adsorvida em colunaC18 (coluna hidrofóbica) obtida do suco da fruta acerola ou similar é preferi-velmente usada na presente invenção. Exemplos de frações contendo poli-fenol derivado de acerola, tais como uma fração adsorvida em coluna C18,

inclui eluatos, concentrados do mesmo e produtos secos dos mesmos.

Em geral, compostos polifenólicos são ditos como sendo alta-mente insoluveis em água. Um produto processado de acerola a ser usadona presente invenção contém polifenol em um estado tal que ele é facilmen-te solúvel em água.

Em geral, ácido ascórbico sozinho não age como um antioxidan-

te para lipídéos (vide Experimento 2.7 no exemplo 2) devido à sua alta solu-bilidade em água. Entretanto, acredita-se que em um produto processado deacerola, o ácido ascórbico funciona como um antioxidante para lipídéos (videexperimento 2.9 no exemplo 2).

4. Modos de uso do antioxidante de acordo com a presente invenção

Conforme descrito acima, (a) uma pectina ou um hidrolisadoseu, (b) um componente adsorvido em uma coluna C18 e (c) ácido ascórbi-co, os quais são derivados de frutas acerola, são úteis como ingredientesativos de um antioxidante.

O antioxidante da presente invenção preferivelmente contémpelo menos 1 tipo, mais preferivelmente 2 tipos, e mais preferivelmente to-dos os componentes (a), (b) e (c).

Tal material preparado no experimento 2.1 do exemplo 2 pelaremoção de glicose e frutose do suco de fruta de acerola e, a seguir, pelapulverização do resultante contém os componentes (a), (b) e (c) e tem exce-lentes atividades antioxidativas. O material é uma modalidade preferida doantioxidante (particularmente, um antioxidante para lipídeos) da presenteinvenção.

O antioxidante da presente invenção é solúvel em água. Dessaforma, o antioxidante pode ser apropriadamente usado como um antioxidan-te para lipídeos na produção de produtos processados tais como peixe, car-ne de criação e grão, o qual geralmente forma sistemas misturados de gor-duras e óleos e componentes baseados em água, produtos alimentícios cu-rados com sal e temperos contendo gordura e óleo. Além disso, um pó deacerola preparado no experimento 2.1 no exemplo 2 tem atividades antioxi-dativas (para lipídeos) superiores àquelas do oc-tocoferol (vitamina E), co-nhecidas como antioxidante solúvel em lipídeo, quando eles são compara-dos sob as mesmas condições (ver experimento 2.6 no exemplo 2).

A presente invenção refere-se ainda a um produto alimentíciocom estabilidade de oxidação aumentada contendo o antioxidante acimaexplicado e a um método para produzir tal produto alimentício. O antioxidan-te da presente invenção pode ser usado como um aditivo na produção deprodutos alimentícios contendo lipídeos e, particularmente, lipídeos que sãofacilmente oxidados. Exemplos de tais produtos alimentícios incluem produ-tos processados tais como peixe, carne de animais de criação e grãos, pro-dutos alimentícios curados com sal e temperos (por exemplo, molhos) con-tendo ácidos graxos insaturados tais como ácido linoléico e ácido linolênico.Métodos para a adição de tal aditivo não são particularmente limitados. Porexemplo, tal aditivo pode ser adicionado, na produção de produtos alimentí-cios processados, a uma solução em conserva, a um tempero ou a um mate-rial alimentício.

O antioxidante da presente invenção pode ser usado na formanão somente de um aditivo alimentício, mas também de um produto alimen- tício ou de uma preparação farmacêutica que age in vivo como um antioxi-dante. Além disso, o antioxidante pode ser preparado na forma de um produ-to alimentício apropriado ou de uma preparação de acordo com técnicasconvencionais usando um veículo, excipiente apropriado ou similar, casonecessário.

Tais formas de produto alimentícios podem ser bebidas, produ-

tos de alimentos sólidos ou produtos de alimentos semi-sólidos. Exemplosespecíficos de bebidas incluem bebidas de suco de fruta, bebidas de refres-cos e bebidas alcoólicas. Alternativamente, uma bebida também pode estarem uma forma que seja diluída com água ou similar antes da ingestão. E-

xemplos de produtos alimentícios sólidos ou semi-sólidos incluem comprimi-dos, comprimidos revestidos com açúcar, grânulos, produtos alimentíciospulverizados, tais como bebidas em pó e sopa em pó, confeitos em forma deblocos, tais como biscoitos, cápsulas e géis. De acordo com a necessidade,vários aditivos que são geralmente usados para o preparo de produtos ali-

mentícios podem ser compostos. Exemplos de tais aditivos incluem estabili-zadores, ajustadores de pH, açúcares, adoçantes, materiais de fragrância,várias vitaminas, minerais, antioxidantes, excipientes, solubilizantes, ligan-tes, lubrificantes, suspensões, agentes umidificantes, substâncias formado-ras de filme, corretores de sabor, corretores de sabor, corantes e conservan-

tes.

O antioxidante da presente invenção pode ser preparado naforma de uma preparação de acordo com técnicas convencionais. Em talcaso, veículos, excipientes, ligantes, conservantes, estabilizantes oxidativos,desintegrantes, lubrificantes, corretores de sabor ou diluentes podem ser adequadamente selecionados dentre as substâncias convencionais. A formade tal preparação não é particularmente limitada, e ela pode ser adequada-mente selecionada de acordo com a necessidade. O antioxidante da presen-te invenção pode ser geralmente formulado em preparações orais incluindocomprimidos, cápsulas, grânulos, grânulos finos, pós, pílulas, líquidos, xaro-pes, suspensões, emulsões, elixires e similares ou em preparações parente-rais incluindo injeções, gotas, supositórios, inalantes, absorventes transdér-micos, absorventes transmucosais, preparações transnasais, preparaçõesenterais, preparações adesivas, ungüentos e similares.5. Modos de uso do agente branqueador de pele para administração oral deacordo com a presente invenção

Conforme descrito em 2 acima, a pectina derivada de fruta ace-rola ou o seu hidrolisado é útil como um ingrediente ativo de um agentebranqueador de pele para administração oral.

Entretanto, sabe-se que ácido ascórbico contido ricamente nafruta acerola pode ser usado como um ingrediente ativo de um agente bran-queador de pele para administração oral.

O agente branqueador de pele para administração oral da pre-sente invenção contém, mais preferivelmente, ácido ascórbico além da pec-tina derivada de fruta acerola ou de um derivado do mesmo.

O agente branqueador de pele para administração oral contendoum hidrolisado da pectina derivada de fruta acerola e ácido ascórbico podeser produzido usando um hidrolisado da pectina derivada da fruta acerola eácido ascórbico, que são cada um independentemente preparados. Alterna-tivamente, o agente branqueador de pele também pode ser produzido peloseguinte método. Especificamente, tal método compreende a etapa de hidro-lisar uma fruta acerola ou um produto processado da fruta acerola contendoácido ascórbico e polpa. Especificamente, nessa etapa, a pectina na polpa éhidrolisada, de forma que a quantidade de ácido galacturônico será de 5%em peso ou mais em relação ao ácido ascórbico. Aqui, "polpa" refere-se aum componente fibroso contido em uma fruta. Tal polpa geralmente contémuma estrutura principal fibrosa, tal como pectina ou celulose como o principalconstituinte e tem uma estrutura tal que os outros componentes se ligam àestrutura principal de várias formas. Uma vez que a pectina é hidrolisada, aquantidade de ácido galacturônico livre aumenta. Dessa forma, a quantidadede ácido galacturônico gerada pode ser um indicador do avanço da hidrólisede pectina. Na modalidade da presente invenção, a hidrólise de pectina épreferivelmente efetuada de forma que a quantidade de ácido galacturônicoseja 5% em peso ou maior, e mais preferivelmente 10% em peso em relaçãoao ácido ascórbico. Não há limite superior particular do grau de hidrólise. Umgrau típico de tal hidrólise é aquele no qual a quantidade de ácido galacturô-nico é de 20% em peso ou menos em relação ao ácido ascórbico. Além dis-so, ácido ascórbico pode ser quantificado por um teste de titulação no qual acoloração azul de uma solução aquosa de 0,02% de 2,6-dicloroindofenol é

alterada para ficar pálida devido ao efeito de redução do ácido ascórbico.Ácido galacturônico pode ser quantificado por um método com 3,5-dimetilfenol conforme descrito no exemplo 3.

O agente branqueador de pele para administração oral de acor-do com a presente invenção é preferivelmente um agente a partir do qual

glicose e frutose tenham sido substancialmente removidos. Quando essesaçúcares são substancialmente removidos, o produto processado (pulveri-zado) tem uma higroscopicidade reduzida. Dessa forma, tal agente é vanta-joso no fato de que ele capacita que quantidades menores de um excipienteou similar sejam adicionadas e, dessa forma, capacita uma proporção au-

mentada de ingredientes ativos. Além disso, o agente branqueador de pelede acordo com a presente invenção é ingerido oralmente. Dessa forma, ele étambém apropriado no fato de que o agente tem menos calorias como resul-tado da remoção dos açúcares. A expressão "glicose e frutose são substan-cialmente removidos" significa que quando um produto processado é pulve-

rizado, glicose e frutose são removidas até um grau tal que a higroscopici-dade seja suficientemente reduzida.

Glicose e frutose podem ser removidas por fermentação usandoleveduras, por exemplo. Na fermentação, glicose e frutose são convertidasem gás dióxido de carbono e álcool etilico e, a seguir, removido. Tal etapa

de remoção de açúcares por fermentação é vantajoso porque componentesúteis do agente branqueador de pele, tal como ácido ascórbico, não sãoperdidos. Uma etapa de degradação de polpa e uma etapa de remoção deaçúcares podem ser efetuados nessa ordem ou vice-versa, ou as etapaspodem ser efetuadas simultaneamente.

O agente branqueador de pele para administração oral da pre-sente invenção pode ser usado sozinho ou em combinação com outroscomponentes na forma de uma composição alimentícia ou de bebida ou naforma de uma composição farmacêutica. Espera-se que o agente branquea-dor de pele não somente contribua para o branqueamento da pele, mastambém exerça um efeito de prevenção de envelhecimento da pele ou deprevenção ou tratamento de câncer de pele, por exemplo.

Exemplos de formas de composições de comida e de bebidaincluem bebidas, produtos alimentícios sólidos e produtos alimentícios semi-sólidos. Tais composições também podem estar na forma de suplementosdietéticos ou produtos alimentícios para usos relativos à saúde especifica-dos. Exemplos específicos de bebidas incluem bebidas de suco de fruta,bebidas de refresco e bebidas alcoólicas. Alternativamente, composições decomida e de bebida podem estar nas formas que são diluídas com água ousimilares antes da ingestão. Produtos alimentícios sólidos podem estar emvárias formas. Exemplos de tais formas incluem comprimidos tais como ba-las confeitadas e pastilhas, comprimidos revestidos com açúcar, grânulos,pós tais como bebidas em pó e sopa em pó, confeitos em forma de blocotais como biscoitos, cápsulas e géis. Exemplos das formas de produtos ali-mentícios semi-sólidos incluem pastas tais como geléias de fruta e gomas,tais como goma de mascar. Essas composições de alimentos ou bebidaspodem ser compostas com, além do agente branqueador de pele da presen-te invenção, vários ingredientes que são geralmente usados como materiaisde partida para produtos alimentícios, em uma faixa tal que os efeitos dese-jados da presente invenção não sejam deteriorados. Exemplos de tais ingre-dientes incluem água, álcoois, adoçantes, acidulantes, corantes, conservan-tes, perfumes e excipientes. Esses ingredientes podem ser usados sozinhosou em combinações de dois ou mais.

A forma de uma composição farmacêutica não está particular-mente limitada, contanto que a forma seja uma preparação para administra-ção oral. Exemplos de formas possíveis incluem pós, comprimidos, grânulos,grânulos finos, líquidos, cápsulas, pílulas, pastilhas, formulações líquidaspara uso interno, suspensões, emulsões, xaropes e elixires. Essas formaspara preparação podem ser usadas sozinhas ou em combinações de dois ou mais, dependendo dos sintomas. A preparação em cada uma dessas formasde preparação suas é efetuada de acordo com técnicas convencionais. Veí-culos, excipientes, ligantes, conservantes, estabilizantes oxidativos, desinte-grantes, lubrificantes, corretores de sabor, diluentes ou similares que sãousados em tal caso podem ser adequadamente selecionados dentre assubstâncias convencionais. Por exemplo, quando é efetuada a pulverização,a capacidade de fluxo pode ser aumentada usando cálcio de molusco.

A dose do agente branqueador de pele para administração oralde acordo com á presente invenção pode ser apropriadamente selecionadade acordo com os sintomas e propósitos. Quando o agente é usado comouma preparação farmacêutica para suprimir a pigmentação devido a man-chas ou queimaduras de sol, é preferível ingerir o agente branqueador depele para administração oral de acordo com a presente invenção de formaque a dose de ingestão de ácido ascórbico varie de 300 mg a 600 mg pordia.

Exemplo 1

Experimento 1.1 Coleta de pectina antioxidacão de suco de frutaExperimento 1.1.1 Coleta de pectina de suco de pêssego, suco de torania.suco de limão e suco de uva

Os pericarpos e as sementes foram removidos usando uma facadas frutas a serem usadas como espécimes, de forma a obter somente asporções comestíveis. Depois, as porções comestíveis foram esmagadas u-sando uma centrífuga. Os produtos esmagados foram centrifugados sobcondições de 4950 rpm a 20-C por 60 minutos. Cada sobrenadante foi filtra-do usando um filtro de 0,2 |im, coletando dessa forma uma solução de suco de fruta límpida. Etanol foi adicionado à solução de suco de fruta em umaquantidade 3 vezes maior do que o peso da solução. A mistura foi, a seguir,agitada, deixada em repouso em temperatura ambiente de um dia para ooutro, e a seguir centrifugada a 4950 rpm por 20 minutos a 205C, coletandopor meio disso um precipitado. O precipitado foi derivado da pectina a partirde uma espécime de suco de fruta. Além disso, para aumentar o grau depurificação da pectina, o precipitado foi dissolvido em água purificada em uma quantidade 10 ou mais vezes maior do que aquela do precipitado. Eta-nol foi adicionado à solução em uma quantidade duas vezes daquela do pe-so total. A solução foi agitada, deixada em repouso em temperatura ambien-te por 30 minutos, e a seguir centrifugada a 4950 rpm por 20 minutos a20eC, coletando dessa forma um precipitado. O precipitado foi seco através de liofilização, de forma que a pectina derivada do espécime de suco de fru-ta tenha sido coletada. Quantidades de espécimes usadas e quantidades depectina coletada em cada experimento estão listadas na tabela 1.

Tabela 1

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Experimento 1.1.2. Coleta da pectina do suco de acerola verde

As sementes foram removidas de frutas de acerola verde imatu-ra (frutas de verde a amarelo antes da maturação, quando elas desenvolvemcoloração vermelha) usando um retocador de polpa, preparando dessa for-ma purê. 18337 g do purê foram centrifugados a 4200 rpm por 45 min a

209C e, a seguir, o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante foi filtradousando um filtro de 0,2 |i.m, de forma que foi coletado 13632 g de uma solu-ção de suco de fruta. Uma vez que a quantidade de solução foi excessiva, asolução foi concentrada usando um aparelho de destilação a vácuo. Dessaforma, 4258 g de solução foram coletadas. Etanol foi adicionado à solução

de suco de fruta em uma quantidade 3 vezes maior do que o peso da solu-ção. A mistura foi, a seguir, agitada e, a seguir, deixada em repouso de umdia para o outro em temperatura ambiente. O conteúdo sólido foi coletadousando uma malha inoxidável. Para aumentar o grau de purificação da pec-tina, o precipitado foi dissolvido em água purificada, etanol foi adicionado àsolução em uma quantidade duas vezes maior do que o peso total, e a se- guir a mistura foi agitada. O resultante foi deixado em repouso em tempera-tura ambiente por 30 minutos e, a seguir, centrifugado a 4200 rpm por 30min a 209C, coletando dessa forma um precipitado. Para aumentar adicio-nalmente o grau de purificação da pectina, o precipitado foi dissolvido emágua purificada, etanol foi adicionado à solução em uma quantidade 3 vezes

maior do que o peso total, e a seguir a mistura foi agitada. O resultante foideixado em repouso por 30 minutos em temperatura ambiente e foi, a seguir,centrifugado a 4200 rpm por 30 minutos a 20eC, coletando dessa forma umprecipitado. A precipitação com etanol foi efetuada 3 vezes no total. O preci-pitado foi seco por liofilização, coletando dessa forma 19,7 g de uma pectina

derivada de suco de acerola verde.

Experimento 1.1.3. Avaliação da potência antioxidativa

5 tipos de pectina derivadas de suco de fruta foram avaliadaspor um teste envolvendo a supressão da descoloração do p-caroteno descri-ta no método de Teste 1 e um teste de atividade de retirada do radical DPPH

descrito no Método de Teste 2. A tabela 2 mostra os resultados. Um resulta-do foi que todos os tipos de pectina exerceram um efeito de supressão dadescoloração de p-caroteno, o qual é um efeito antioxidativo. Entretanto, aatividade de retirada do radical DPPH foi fortemente observada somente napectina derivada do suco de acerola. Tal pectina derivada do suco de acero-

Ia tem um efeito de retirada do radical DPPH, de forma que ele pode ser es-perado para ter uma potência antioxidativa contra muitos objetos. Conformedescrito acima, foi revelado que pectinas antioxidativas podem ser produzi-das a partir de suco de acerola sem perder sua atividade antioxidativa pelaefetuação de um método de precipitação com etanol.Tabela 2

Atividades antioxidativas das pectinas derivadas de suco de fruta

<table>table see original document page 27</column></row><table>

Experimento 1.2 Coleta de pectina antioxidativa da polpa Experimento 1.2.1 Coleta de pectina da polpa de pêssego, da polpa de to-rania. da polpa de limão e da polpa de uva

Os pericarpos e as sementes foram removidos usando uma facadas frutas a serem usadas como espécimes, de forma a obter somente por-ções comestíveis. Depois, as porções comestíveis foram esmagadas usandouma centrífuga. Os produtos esmagados foram centrifugados sob s condi-ções de 4950 rpm e 209C por 60 minutos, coletando dessa forma um precipi-tado. O precipitado foi derivado da polpa das frutas. Água purificada foi adi-cionada à polpa em uma quantidade de 3,5 a 8 vezes maior do que aquelada polpa, de forma a capacitar a agitação. O resultante foi agitado e, a se- guir, ácido clorídrico concentrado foi adicionado para ajustar o resultante empH 2,0. O resultante foi aquecido a 809C por 2 horas, durante a agitação doresultante, seguido pela agitação de um dia para o outro em temperaturaambiente. A solução foi centrifugada sob condições de 4950 rpm e 209C por60 minutos, coletando por meio disso o sobrenadante. O sobrenadante foi filtrado usando um filtro de 0,2 u.m de forma que foi coletado um extrato depectina límpido. Etanol foi adicionado ao extrato em uma quantidade duasvezes o peso do extrato. A mistura foi, a seguir, agitada, deixada em repou-so em temperatura ambiente de um dia para o outro, e a seguir centrifugadaa 4950 rpm por 20 minutos a 209C, coletando dessa forma um precipitado. O precipitado foi derivado de pectina do espécime da polpa. Além disso, paraaumentar o grau de purificação da pectina, o precipitado foi dissolvido emágua purificada em uma quantidade de 10 vezes ou mais vezes maior doque aquela do precipitado. Etanol foi adicionado em uma quantidade duasvezes do peso total e, a seguir, o resultante foi agitado. O resultante foi dei- xado em repouso em temperatura ambiente por 30 minutos, e a seguir cen-trifugado a 4950 rpm por 20 minutos a 20-C, coletando dessa forma um pre-cipitado. O precipitado foi seco através de liofilização, de forma que pectinaderivada do espécime da polpa foi coletada. Quantidades dos espécimesusados e quantidades de pectina coletada em cada experimento estão lista- das na tabela 3.

Tabela 3

<table>table see original document page 28</column></row><table>

Experimento 1.2.2 Coleta de pectina de polpa de acerola verde

As sementes foram removidas a partir de frutas de acerola ver- des imaturas (frutas de cor verde a amarelo antes do amadurecimento,quando elas desenvolvem coloração vermelha) usando um retocador de pol-pa, preparando dessa forma purê. 18337 g do purê foram centrifugadas a4200 rpm por 45 min a 209C e, a seguir, 3386 g do precipitado foram coleta-das. O precipitado foi de polpa de acerola. Água purificada foi adicionada à polpa em uma quantidade 5 vezes maior do que aquela da polpa, de forma apermitir a agitação. A mistura foi, a seguir, agitada. Ácido clorídrico concen-trado foi adicionado para ajustar o resultante em pH 2,0. O resultante foi a-quecido a 80SC por 2 horas, durante a agitação do resultante, seguido pelaagitação de um dia para o outro em temperatura ambiente. A solução foi centrifugada sob condições de 4200 rpm e 209C por 30 minutos, coletandopor meio disso o sobrenadante. O sobrenadante foi filtrado usando um filtrode 0,2 um de forma que foi coletado um extrato de pectina límpido. Etanol foiadicionado à solução em uma quantidade duas vezes o peso da solução e, aseguir, a mistura foi agitada. A mistura foi deixada em repouso em tempera-tura ambiente de um dia para o outro, e a seguir o conteúdo sólido foi cole-tado usando malha inoxidável. Para aumentar o grau de purificação da pec-tina, o precipitado foi dissolvido em água purificada, etanol foi adicionado àsolução em uma quantidade duas vezes do peso total, e a seguir a misturafoi agitada. A mistura foi deixada em repouso em temperatura ambiente por30 minutos e, a seguir, foi centrifugada a 4200 rpm por 30 minutos a 20eC,coletando dessa forma um precipitado. Para aumentar adicionalmente o graude purificação da pectina, o precipitado foi dissolvido em água purificada,etanol foi adicionado à solução em uma quantidade de duas vezes o pesototal, e a seguir a mistura foi agitada. A mistura foi deixada em repouso por30 min em temperatura ambiente e, a seguir, foi centrifugada a 4200 rpm por30 minutos a 209C, coletando por meio disso o precipitado. A precipitaçãocom etanol foi efetuada 3 vezes no total. O precipitado foi seco por liofiliza-ção, por meio disso coletando 38,63 g de uma pectina derivada da polpa deacerola verde.

Experimento 1.2.3. Avaliação da potência antioxidativa

A potência antioxidativa de 5 tipos de pectinas derivadas a polpafoi avaliada por um teste envolvendo a supressão a descoloração de p-caroteno descrita no método de teste 1 e de um teste de atividade de retira-da do radical DPPH descrito no método de teste 2. A tabela 4 mostra os re-sultados. Como um resultado, todos os tipos de pectina exerceram o efeitode supressão da descoloração de p-caroteno, o qual é um dos efeitos antio-xidativos. Entretanto, a atividade de retirada do radical DPPH foi fortementeobservada somente na pectina derivada da polpa de acerola. Tal pectinaderivada da polpa de acerola tem um efeito de retirada do radical DPPH, deforma que pode ser esperado que a pectina tenha uma potência antioxidati-va contra a oxidação de muitos objetos. Conforme descrito acima, foi revela-do que tais pectinas antioxidativas podem ser produzidas da polpa de acero-la sem perder sua atividade de antioxidação pela efetuação do tratamento decalor usando ácido e um método de precipitação de etanol.<table>table see original document page 30</column></row><table>Experimento 1.3 Avaliação da pectina antioxidativa derivada de frutas acero- Ia diferindo no grau de maturidade

A atividade antioxidativa de uma pectina derivada de suco defruta verde e pectina derivada de polpa de fruta verde (obtida das frutas deacerola verdes, conforme preparado em 1.1 e em 1.2 acima) foi avaliada porum teste de atividade de retirada de 50% de radical DPPH (ver o método doteste 2). Além disso, a atividade antioxidativa de pectinas preparadas peloseguinte método a partir de frutas de acerola maduras que se maturaramsuficientemente para desenvolver coloração vermelha foi avaliada pelomesmo teste.

Experimento 1.3.1 Coleta de pectina de suco de acerola madura Sementes foram removidas de frutas de acerola maduras que se

maturaram suficientemente para desenvolver coloração vermelha usandoum retocador de polpa, preparando por meio disso purê. 21861 g de purêforam centrifugadas a 4200 rpm por 45 minutos a 209C e, a seguir, o sobre-nadante foi coletado. O sobrenadante foi filtrado usando um filtro de 0,2 u.m, de forma que 15324 g de uma solução de suco de fruta límpida foram cole-tados. Uma vez que a quantidade de solução foi excessiva, a solução foiconcentrada usando um aparelho de destilação a vácuo. Dessa forma, 5618g da solução concentrada foram coletados. Etanol foi adicionado à soluçãode suco de frutas em uma quantidade 3 vezes maior do que o peso da solu-ção. A mistura foi, a seguir, agitada e, a seguir, deixada em repouso de umdia para o outro em temperatura ambiente. O conteúdo sólido foi coletadousando malha inoxidável. Para aumentar o grau de purificação da pectina, oprecipitado foi dissolvido em água purificada, etanol foi adicionado à solução em uma quantidade de duas vezes o peso total, e a seguir a mistura foi agi-tada. A mistura foi deixada em repouso em temperatura ambiente por 30minutos e, a seguir, centrifugada a 4200 rpm por 30 min a 20QC, coletandodessa forma um precipitado. Para aumentar adicionalmente o grau de purifi-cação da pectina, o precipitado foi dissolvido em água purificada, etanol foi

adicionado à solução em uma quantidade 3 vezes maior do que a do pesototal, e a seguir a mistura foi agitada. A mistura foi deixada em repouso por30 minutos em temperatura ambiente e, a seguir, foi centrifugada a 4200rpm por 30 minutos a 20eC, coletando dessa forma um precipitado. A precipi-tação com etanol foi efetuada 3 vezes no total. O precipitado foi seco por

liofilização, coletando dessa forma 39 g de uma pectina derivada de suco deacerola madura.

Experimento 1.3.2 Coleta de pectina da polpa de fruta de acerola madura

As sementes foram removidas e frutas de acerola maduras quetinham se maturado suficientemente para desenvolver coloração vermelha

usando um retocador de polpa, preparando por meio disso purê. 21861 g depurê foram centrifugadas a 4200 rpm por 45 min a 209C e, a seguir, 5022 gde precipitado foram coletados. O precipitado foi polpa de acerola. Água pu-rificada foi adicionada para a polpa em uma quantidade 5 vezes maior doque aquela da polpa, de forma a capacitar a agitação. A mistura foi, a seguir,

agitada. Ácido clorídrico concentrado foi adicionado para ajustar o resultantepara pH 2,0. O resultante foi aquecido a 809C por 2 horas enquanto foi agi-tado, seguido por uma agitação de um dia para o outro em temperatura am-biente. A solução foi centrifugada sob condições de 4200 rpm e 209C por 30minutos, coletando por meio disso um sobrenadante. O sobrenadante foi

filtrado usando um filtro de 0,2 fim, de forma que um extrato de pectina lím-pido foi coletado. Uma vez que a quantidade de solução foi excessiva, a so-lução foi concentrada por destilação a vácuo. Dessa forma, 9159 g de solu-ção foram coletadas. Etanol foi adicionado à solução em uma quantidade deduas vezes o peso da solução. A mistura foi, a seguir, agitada e, a seguir,deixada em repouso de um dia para o outro em temperatura ambiente. Oconteúdo de sólidos foi coletado usando malha inoxidável. Para aumentar o grau de purificação da pectina, o precipitado foi dissolvido em água purifica-da, etanol foi adicionado à solução em uma quantidade de duas vezes o pe-so total, e a seguir a mistura foi agitada. A mistura foi deixada em repousoem temperatura ambiente por 30 minutos e, a seguir, centrifugada a 4200rpm por 30 minutos a 20eC, coletando por meio disso um precipitado. Para

aumentar adicionalmente o grau de purificação da pectina, o precipitado foidissolvido em água purificada, etanol foi adicionado à solução em uma quan-tidade de duas vezes o peso total, e a seguir a mistura foi agitada. A misturafoi deixada em repouso por 30 minutos em temperatura ambiente e, a seguir,foi centrifugada a 4200 rpm por 30 minutos a 209C .coletando dessa forma

um precipitado. A precipitação com etanol foi efetuada 3 vezes no total. Oprecipitado foi seco por liofilização, coletando dessa forma 26 g de pectinaderivadas da polpa de fruta de acerola madura.Experimento 1.3.3 Avaliação da potência antioxidativa

As atividades antioxidativas de 4 tipos de pectinas derivadas de

acerola foram avaliadas por um teste de atividade de retirada de 50% deradicais DPPH. A tabela 5 mostra os resultados. Cada resultado de testeestá mostrado com a concentração de uma amostra que é necessária pararetirar 50% dos radicais DPPH. É indicado que quanto mais baixa a concen-tração de uma amostra, mais forte é a potência antioxidativa da pectina rele-

vante. Como resultado, foi observada potência antioxidativa suficiente emtodos os tipos de pectina. Entretanto, a potência antioxidativa foi mais forteem pectinas derivadas de frutas verdes do que em pectinas derivadas defrutas maduras. Conseqüentemente, foi concluído que uma fruta de acerolaverde é mais apropriada como matéria-prima para extração de uma pectina

antioxidativa.

Tabela 5

Potência antioxidativa de pectinas de fruta acerola com diferentes graus dematuridade

<table>table see original document page 33</column></row><table>Experimento 1.4 método para a produção de pectina antioxidativa através detratamento com pectinase Purê de acerola foi preparado a partir de frutas de acerola ver-

des usando um retocador de polpa (um aparelho para separar suco de frutae polpa das sementes) e a seguir foi crio conservado. O purê de acerola foidescongelado. 19899 g do purê de acerola descongelado foi deixado retor-nar até a temperatura ambiente. 0,1% (p/p) de pectinase (pectinase A "ama-

no", Amano Enzyme Inc.) foi adicionada ao resultante, seguido por 2 horasde agitação a 50eC. A agitação foi continuada até o dia seguinte em tempe-ratura ambiente. Purê tratado com enzima foi centrifugado (4950 rpm e 30minutos), coletando por meio disso o sobrenadante. Para remover compo-nentes insolúveis, o sobrenadante foi filtrado por várias vezes, seguido pela

filtração final com um filtro de 0,2 |im. Dessa forma, 17420 g de suco de fru-tas foi coletado através de filtração. A solução foi, a seguir, concentrada u-sando um destilador a vácuo e um aparelho de concentração, de forma que2981 g de uma solução concentrada foram coletadas. Etanol foi adicionado àsolução concentrada em uma quantidade 4 vezes maior do que a do peso da

solução. A solução foi deixada em repouso em temperatura ambiente por 1ou mais dias e, a seguir, centrifugada (4950 rpm e 5 minutos), coletandodessa forma 600 g (contendo água) de um precipitado de etanol (1ê vez).Água purificada foi adicionada ao precipitado de etanol em uma quantidade vezes maior do que o peso do precipitado, de forma que o precipitado foi

dissolvido. Etanol foi ainda adicionado ao precipitado em uma quantidadeduas vezes do peso do precipitado e, a seguir, o resultante foi refrigeradopor 1 ou mais dias. A solução foi filtrada usando um filtro de fibra de vidro.544 g de um 2- precipitado de etanol (contendo água) que havia permaneci-do no papel de filtro foi coletado. Água purificada foi adicionada ao precipita-do e, a seguir, o precipitado foi dissolvido. Etanol foi adicionado à soluçãoem uma quantidade equivalente em relação à solução e, a seguir, o resultan- te foi refrigerado por 1 ou mais dias. A solução foi filtrada usando um filtro defibra de vidro. 434 g de um 3Q precipitado de etanol (contendo água) que ha-via permanecido no papel de filtro foram coletados. O precipitado foi conge-lado a -80eC. Depois de o precipitado ser completamente congelado, a liofili-zação foi efetuada. Dessa forma, 78 g de um pó de pectina derivada de ace- rola foram coletados.

A potência antioxidativa da pectina derivada de acerola obtidadessa forma foi comparada com aquela da pectina derivada de suco de frutaverde e com a pectina derivada de polpa de fruta verde (obtida de frutas deacerola verde conforme preparado nos experimentos 1.1 e 1.2).

A potência antioxidativa de cada pectina foi avaliada por um tes-te de atividade de retirada de 50% de radicais DPPH (método de teste 2).Tabela 6 mostra os resultados.

<table>table see original document page 34</column></row><table>

* A pectina do suco de fruta verde e a pectina da polpa de frutaverde foram preparadas a partir do mesmo purê.

Quando o purê foi separado em suco de fruta e polpa e a pectina foi coletada de cada um dos mesmos, a proporção de coleta e pectina total(%) foi de 0,32% (= 0,11% + 0,21%). Entretanto, foi demonstrado que umaproporção de coleta mais elevada (%) foi obtida de forma que a proporçãode coleta (%) da pectina tratada com pectinase foi de 0,39% nesse experi-mento. Além disso, a pectina tratada com pectinase (obtida nesse experi-mento) também teve atividades antioxidativas suficientes.Experimento 1.5 Método para a produção de solução de pectina antioxidati-va pelo método de ultrafiltracão

Purê de acerola foi preparado a partir de frutas de acerola ver-des usando um retocador de polpa (um aparelho para separar suco de frutae polpa das sementes) e a seguir foi crio conservado. O purê de acerola foidescongelado. 55000 g do purê de acerola descongelado foi deixado retor-nar até a temperatura ambiente. 0,1% (p/p) de pectinase (pectinase A "ama-no", Ama.no Enzyme Inc.) foi adicionada ao resultante, seguido por 2 horasde agitação a 509C. A agitação foi continuada até o dia seguinte em tempe-ratura ambiente. Purê tratado com enzima foi centrifugado (4950 rpm e 30minutos), coletando por meio disso o sobrenadante. Para remover compo-nentes insolúveis, o sobrenadante foi filtrado por várias vezes, seguido pelafiltração final com um filtro de 0,2 u/n. Dessa forma, 47130 g de suco de fru-tas foram coletados. O produto coletado foi submetido à ultrafiltracão usandouma membrana de ultrafiltracão (Hydrosart 10 K, SARTORIUS K.K.) comumpeso molecular de corte de 10.000. Conseqüentemente, 8730 g de uma so-lução concentrada foram coletados.

A concentração do conteúdo sólido da solução concentrada foide 11,77% (concentração de um resíduo após a evaporação). A soluçãoconcentrada foi submetida à precipitação com etanol, de forma que foi cole-tada uma pectina antioxidação. 16,87 g da pectina antioxidação foram cole-tados a partir de 500 g de solução concentrada. Foi confirmado que o conte-údo de pectina antioxidação na solução concentrada foi de 3,374%. Basean-do-se em tal concentração, o peso da pectina na solução concentrada foicalculado como sendo de 294,2 g. A porcentagem de pectina coletada foicalculada como sendo 0,53% baseando-se no peso do purê. Foi reveladoque tal proporção de coleta (%) foi melhor do que aquela no caso do métodode produção usado no experimento 1.4. Além disso, o conteúdo de pectinaantioxidação como uma porcentagem do conteúdo de sólidos totais na solu-ção de pectina antioxidação foi de 28,7% nesse experimento. No caso dométodo de ultrafiltração, tal conteúdo pode ser regulado pela variação daproporção da quantidade da solução estoque da solução concentrada final.Experimento 1.6 Método para a produção de pó de acerola a partir da solu-ção preparada no Experimento 1.5

600 g da solução concentrada de pectina antioxidativa derivadade acerola preparada no experimento 1.5 foram congelados e, a seguir, oresultante foi liofilizado pelo método de liofilização. Como resultado, 63 g deum pó foram coletados. A concentração do conteúdo sólido na solução con-centrada foi de 11,77%. Disso, teoricamente o conteúdo de sólidos foi de70,62 g e a proporção de coleta (%) foi de 89,2%. A concentração de ácidoascórbico no pó foi de 21,06%, conforme medido por um método de indofe-nol. Baseando-se no conteúdo de pectina antioxidativa na solução concen-trada, a concentração de pectina antioxidativa, no pó foi calculada comosendo 28,7%. O pó obtido dessa forma pode ser finamente pulverizado sobboas condições depois da liofilização, não exerce higroscopicidade significa-tiva e é excelente quanto a sua capacidade de fluxo. É considerado que a pectina antioxidativa age como um excipiente.

Experimento 1.7 Exame (1) de polifenol em pectina antioxidativa derivada deacerola

10 g do pó de pectina antioxidativo derivado de acerola prepara-do no experimento 1,4 foi dissolvido em 500 ml_ de uma solução aquosa de hidróxido de sódio 2 N, seguido por 16 horas de hidrólise a 40eC usando umvibrador termostático. Para aumentar adicionalmente a solubilidade do poli-fenol ácido, ácido clorídrico concentrado foi adicionado para ajustar a solu-ção para pH 2,0. Para remover o conteúdo de açúcar livre derivado da pecti-na, etanol foi adicionado à solução em uma quantidade 4 vezes maior do que o peso da solução. A solução foi deixada em repouso por 1 ou mais diasem uma área de refrigeração de forma que ocorreu a precipitação com eta-nol. O procedimento foi efetuado sob as mesmas condições que as aplica-das na coleta de pectina, de forma que somente o produto hidrolisado porálcali poderia permanecer não-precipitado e estar presente em um estadolivre no sobrenadante. A solução para a qual etanol foi adicionado foi centri-fugada (4200 rpm e 30 minutos), de forma a causar a precipitação do conte-údo sólido e a coletar o sobrenadante. O sobrenadante foi filtrado usandoum filtro de 0,45 |im, removendo dessa forma completamente o conteúdosólido. A solução filtrada foi concentrada por destilação a vácuo, de formaque 250 mL de uma solução concentrada foi coletada. Cada uma de duascolunas C18 (Sep-Pak Vac 35 cc (10 g) Cartuchos C18, Waters Corporati-on), à qual polifenol pode adsorver, foi carregada com metade da quantidadede solução concentrada. Depois de os componentes não-adsorvidos seremlavados com água purificada, os componentes adsorvidos foram eluídos u-sando uma solução aquosa de metanol a 25%. O eluato foi seco e, a seguir,solidificado usando um aparelho de destilação a vácuo. O resultante foi dis-solvido em 5 mL de 100% de metanol, preparando dessa forma uma amos-tra de extrato de pectina. Os componentes na amostra foram analisados u-sando uma coluna de HPLC analítica (4,6 mm x 250 mm, ODS-3, GL Scien-ces Inc.) e um gradiente linear de uma solução aquosa de ácido clorídrico0,01 N e metanol, figura 1 mostra os resultados.

A presença do principal componente em 22,4 minutos foi confir-mada por essa análise. Depois, 4,5 mL de amostra de extrato de pectina foisubmetida ao isolamento preparativo usando uma coluna preparativa. ODS-3 (20 mm x 250 mm, GL Sciences Inc.) foi usada como tal coluna preparati-va. O isolamento preparativo foi efetuado em uma taxa de fluxo de 12mL/minuto usando um gradiente de solução aquosa de ácido clorídrico 0,01N e metanol, figura 2 mostra os resultados do isolamento preparativo.

O pico a 33,46 minutos na figura 2 foi coletado, seco e solidifica-do usando um aparelho de destilação a vácuo, dissolvido em água purificadae, a seguir, deixado em repouso de um dia para o outro em uma área sobrefrigeração. O depósito gerado dessa forma foi centrifugado, coletandodessa forma 28mg do depósito. Além disso, o depósito foi dissolvido em me-tanol. A seguir, os componentes da amostra foram analisados usando umsistema de HPLC munido com um detector de feixe de fotodiodo, uma coluna de HPLC analítica (4,6 mm x 250 mm, ODS-3, GL Sciences Inc.), e um gradiente linear de 0,05% de solução aquosa de TFA e metanol, ao qual TFA 0,05% foi adicionado. Figura 3 mostra os resultados. Como resultado, 5 foi confirmado que o depósito acima foi o principal componente da amostra de extrato de pectina.

Além disso, os dados de espectro (figura 4A) do pico a 22,4 minutos mostrado na figura 3 foram confirmados. Dessa forma, foi revelado que os dados foram quase que em acordo com os dados de espectro (figura

4B) para a Aceronidina (exemplo de referência 1). Além disso, os dados de espectro mostrados na figura 4A e B foram coletados usando um sistema compreendendo um aparelho de HPLC (o aparelho aqui utilizado foi o LC-2010CHT (Shimadzu Corporation)) com um detector de feixe de fotodiodo (PDA; o detector aqui utilizado foi um SPD-M20A (Shimadzu Corporation))

incluído com isso.

Foi revelado que se baseando no tempo de eluição do HPLC acima e nos dados espectrais, polifenol contido na pectina antioxidativa derivada de acerola foi provavelmente sendo da Aceronidina. Experimento 1.8 Exame (2) do polifenol em pectina antioxidativa derivada de

acerola

A estrutura do polifenol extraído da pectina antioxidativa derivada de acerola foi ainda analisada por medição de ESI-EM e medição de RMN. Quando o peso molecular foi analisado usando um espectrômetro de massa LCT (Micromass), m/z 473 (íon aducto de sódio (M + Na)+) foi obser-

vado de uma maneira similar ao caso da Aceronidina. Conseqüentemente, foi confirmado que o polifenol foi idêntico à Aceronidina com um peso molecular de 450. Além disso, como resultado,da medição de 1H RMN, os picos (no gráfico de baixo, na figura 5) derivados do solvente foram observados na vizinhança de 3,3 ppm e de 4,8 ppm. Foi revelado que esses picos concor-

daram bem com os picos para Aceronidina (no gráfico de cima, na figura 5).

Conforme descrito acima, foi confirmado que o polifenol extraído da pectina antioxidativa derivada de acerola foi Aceronidina.Experimento 1.9 Preparação de pectina ligada à coluna C18 derivada de acerola

50 g da pectina derivada de acerola preparados no experimento 1.4 foram dissolvidos em 5000 ml_ de uma solução aquosa de 1% de hexa- metafosfato de sódio. O resultante foi filtrado usando um filtro de 0,2 fim. Vinte colunas C18 (Sep-Pak Vac 35 cc (10 g) Cartuchos C18, Waters Corporation) foram carregados com o filtrado. Componentes não-adsorvidos foram lavados com água purificada e, a seguir, os componentes adsorvidos foram eluídos usando uma solução aquosa de metanol a 50%. O eluato foi seco e solidificado usando um aparelho de destilação a vácuo. O resultante foi dissolvido em água purificada e, a seguir o material insolúvel foi removido u-sando um filtro de 0,2 ^im. O resultante foi, a seguir, congelado e liofilizado, obtendo dessa forma 6,24 g de um pó liofilizado.

A pectina derivada de acerola (amostra 1) preparada no experi- mento 1.4 e a pectina ligada à coluna C18 derivada de acerola (amostra 2) preparada nesse experimento foram cada uma analisadas em termos da concentração de polifenol, da atividade retiradora de radical DPPH, da atividade inibidora da tirosinase e da composição de açúcar. A concentração de polifenol foi medida pelo método de Folin-Denis usando catequina como uma substância padrão. A atividade retiradora do radical DPPH foi analisada pelo método de teste 2, um teste de atividade inibidora da tirosinase foi conduzido pelo método de teste 3, e a composição de açúcar foi analisada pelo método de teste 4.Tabela 7

Conteúdo e atividade do polifenol, um elemento da pectina antioxidativa derivada da acerola

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Tabela 8

Composição de açúcar (porcentagem de composição de açúcar (%))

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Baseando-se nos resultados nas tabelas 7 e 8, é considerado que a pectina antioxidativa derivada de acerola é composta de uma cadeia principal consistindo principalmente em ácido poligalacturônico e cadeiaslaterais consistindo principalmente em açúcar neutro. Baseando-se nos resultados da análise dos componentes ligados à resina C-18, é considerado que o polifenol pode estar principalmente presente nas cadeias laterais. A amostra 2 com um alto conteúdo de polifenol também tem fortes atividades antioxidativas e um forte efeito branqueador de pele. Conseqüentemente, tais atividades antioxidativas e o efeito branqueador de pele foram julgados ser devido aos efeitos da Aceronidina. Entretanto, quase nenhum efeito branqueador de pele (efeito de inibição da tirosinase) foi observado na Aceronidina. Conseqüentemente, foi revelado que o efeito branqueador de pele representa a atividade única da pectina antioxidativa derivada de acerola. Método de teste 1.1 Teste envolvendo a supressão da descoloracão de fi-caroteno

Esse método é um método para determinar como uma substância de teste suprime o efeito do peróxido do ácido linoléico para causar a descoloracão de p-caroteno. Nesse experimento, 0,48 ml_ de uma solução de ácido linolênico 10% (p/v)/clorofórmio, 1,2 ml_ de uma solução de p-caroteno 0,01% (p/v)/clorofórmio e 2,4 ml_ de uma solução de tween 40 20% (p/v)/clorofórmio foram colocados em um frasco de erlenmeyer de 200 ml_ e, a seguir, misturados. A mistura foi pulverizada com gás nitrogênio para remover o clorofórmio. 108 ml_ de água purificada e 12 mL de tampão de fosfato de sódio 0,2 M (pH 6,8) foram, a seguir, misturados. A solução preparada dessa forma foi usada como uma solução de ácido linolênico. 0,1 mL de um espécime diluído para uma concentração apropriada foi adicionado a 4,9 mL de uma solução de ácido linolênico, e o resultante foi, a seguir, misturado. A absorvância foi medida a 470 nm e o valor medido foi designado o valor em 0 minuto. Imediatamente após a medição, o resultante foi aquecido em um banho termostático a 50eC. 120 minutos mais tarde, a absorvância foi medida a 470 nm. O valor medido foi designado o valor em 120 minutos. Um valor em branco foi medido usando água purificada (com a qual um espécime foi diluído) ao invés de um espécime. A proporção da supressão da descoloracão de p-caroteno (%) foi calculada pela seguinte equação.

proporção da supressão da descoloracão de p-caroteno (%) =100 - (1 - (valor do espécime em 0 minuto - valor do espécime em 120 mi-nutos)/(valor do branco em 0 minutos - valor do branco em 120 minutos)) x 100

Método de teste 1.2. Teste de atividade de retirada do radical DPPH 5 Atividades antioxidativas foram avaliadas usando uma solução

etanólica de difenil-p-picrilidradil (DPPH), o qual é um radical estável. 1200 de etanol e 400 uL de um espécime (ajustado para qualquer concentração) foram misturados com 1600 |iL de um tampão de acetato de 250 mM (pH = 5,5), seguido pela pré-incubação a 30eC por 5 minutos. 800 |iL de uma

solução de DPPH 500 |j.M/etanol foram adicionados a uma solução e misturados com ela, e o resultante foi, a seguir, deixado em repouso a 309C por 30 minutos. A absorvância foi medida a 517 nm. Um procedimento similar foi efetuado também para o oc-tocoferol e, a seguir, o resultado foi um controle positivo. O controle aqui utilizado foi preparado pela efetuação de um proce-

dimento similar usando um solvente ao invés de uma solução de amostra. A proporção de retirada de radical foi calculada pela seguinte equação usando as absorvâncias medidas desta maneira.

Proporção de retirada (%) = (1 - [absorvância da amostra]/[ab-sorvância do controle]) x 100

A medição acima para descobrir as proporções de retirada foi

efetuada pela variaçãa etapa a etapa da concentração de uma amostra em solução. A concentração de uma solução de amostra levando a uma retirada de radical DPPH de 50% foi descoberta e designada como a concentração necessária para retirar 50% dos radicais DPPH. Dessa forma, pode ser dito

que quanto mais baixo o valor numérico, maior é a capacidade de retirada de radical.

Método de teste 1.3 Efeito da inibição da tirosinase (atividade branqueadora da pele)

Um teste envolvendo a atividade de inibição da tirosinase, a qual 30 é uma enzima que gera um pigmento de melanina, foi conduzido pelo seguinte procedimento.

(1) *4 ml_ de uma solução aquosa de L-DOPA, **4 ml_ de cadauma das amostras diluídas em diferentes concentrações, e 2 ml_ de um tampão fosfato 0,2 M (pH 6,8) foram misturados. A mistura foi aquecida em um banho termostático a 37QC. A mistura aquecida dessa forma foi designada uma mistura de amostra.

*Solução aquosa de L-DOPA: L-p-(3,4-diidroxifenil)alanina (Wa-

ko Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolvida em tampão fosfato 0,2 M (pH 6,8) em uma concentração de 3 mM.

**As amostras foram todas diluídas e dissolvidas usando um tampão fosfato 0,2 M.

(2) 2,5 mL da mistura de amostra e *0,5 ml_ da solução de tirosi-

nase aquecida a 379C foram colocados em uma célula de um espectrômetro de absorção, seguido pela medição a 475 nm. A medição foi efetuada usando um programa de computador de cinética. As alterações na absorvância foram automaticamente medidas por mais de 20 segundos do início ao fim

em intervalos de 0,1 segundo. A velocidade de elevação da absorvância entre 4 segundos e 10 segundos depois do início da medição foi calculada.

*Solução de tirosinase: solução obtida pela dissolução de tirosk nase (SIGMA) derivada de um cogumelo em tampão fosfato 0,2 M (pH 6,8) em uma concentração de 300 unidades/mL e, a seguir, pela efetuação dafiltragem usando um filtro de 0,2 ^im.

(3) Para obter um valor em branco, a medição foi efetuada u-sando um tampão fosfato 0,2 M ao invés de uma amostra e, a seguir, a atividade inibidora da tirosinase foi calculada pela equação abaixo. Além disso, uma substância a qual não pôde se dissolver em tampão fosfato foi dissolvi-

da em dimetilsulfóxido (DMSO), diluída com tampão fosfato e, a seguir, medida. O cálculo foi efetuado usando os resultados da medição de um branco contendo DMSO na mesma concentração.

Proporção de inibição da atividade da tirosinase (%) = 100 -((velocidade de elevação da absorvância na amostra)/(velocidade de eleva-

ção da absorvância do branco)) x 100

Método de teste 1.4 Análise da composição de açúcar

A análise foi efetuada como se segue. Ácido trifluoracético 2 Nfoi adicionado a cada amostra e, a seguir, a hidrólise foi efetuada a 100eC por 6 horas. O açúcar neutro hidrolisado dessa forma e ácido urônico foram coletados usando água purificada e, a seguir, o método de HPLC foi efetuado. As condições analíticas foram as seguintes. Condições analíticas de açúcar neutro

Detector: Espectrofotofluorômetro

Coluna: Gel TSK sugar AXG 4.6 mm x 150 mm (TOSOH Corporation)

Fase móvel: Tampão de borato de potássio 0,5 M pH 8,7 10 Taxa de fluxo de fase móvel: 0,4 mL/min

Rotulagem pós-coluna: reagente reacional 1% de arginina/3% de

ácido bórico

Taxa de fluxo de reagente reacional: 0,5 mL/min Temperatura reacional: 150eC - Comprimento de onda de detecção: EX.320 nm, EM.430 nm

Condições analíticas de ácido urônico

Detector: Espectrofotofluorômetro

Coluna: Shimpack ISA07 4,6 mm x 250 mm (Shimadzu Corporation)

Fase móvel: Tampão de borato de potássio 1,0 M pH 8,7

Taxa de fluxo de fase móvel: 0,8 mL/min Rotulagem pós-coluna: reagente reacional 1% de arginina/3% de

ácido bórico

Taxa de fluxo de reagente reacional: 0,8 mL/min 25 Temperatura reacional: 1509C

Comprimento de onda de detecção: EX.320 nm, EM.430 nm Uma curva de calibração de açúcar neutro e de ácido urônico foi preparada e, a seguir, o conteúdo de açúcar de uma amostra foi medido baseando-se na curva. Nessa análise, nem todas as cadeias de açúcar são capazes de serem hidrolisadas e açúcares parciais podem ser hidrolisados e permanecer não-detectados.

Exemplo de referência: isolamento e identificação da Aceronidina(1) Isolamento da Aceronidina

Uma matéria-prima usada para o preparo de Aceronidina foi um pó de acerola (Nichirei Corporation, Nichireipó de acerola VC30) preparado a partir da fermentação de suco de acerola concentrado usando levedura, removendo a glicose e a frutose, dissolvendo como excipientes de fibra de dieta e oxido de cálcio e, a seguir, pela pulverização do produto.

400 g de pó de acerola foram dissolvidos em água purificada, preparando dessa forma uma solução aquosa 20% (p/p) (2000 g). Acetato de etila foi adicionado à solução aquosa em um volume de metade daquele

da solução (em uma base de volume) e, a seguir, a solução foi agitada. O fracionamento líquido-líquido foi efetuado usando um funil de separação de forma que uma fração de camada aquosa foi coletada. Butanol foi adicionado à fração de camada aquosa em um volume igual à metade daquele da fração (em uma base de volume), e a seguir o resultante foi agitado. O fra-

cionamento líquido-líquido foi efetuado usando um funil de separação, de forma que uma fração de camada de butanol foi coletada. Água purificada foi adicionada em uma quantidade apropriada à fração de camada de butanol. A destilação a vácuo foi, a seguir, efetuada para secar e solidificar o resultante, coletando dessa forma 24 g de conteúdo de sólido.

O conteúdo de sólido acima foi dissolvido em 50 ml_ de água

purificada. O resultante foi submetido à purificação parcial usando colunas C18 (Sep-Pak Vac 35 cc (10 g) cartuchos C18, Waters Corporation). Especificamente, a coluna foi carregada com a amostra e, a seguir, lavada com água purificada e uma solução aquosa de metanol a 10%, seguido pela elui-

ção com uma solução aquosa de metanol a 20%. Dessa forma, a fração elu-ída foi coletada. A fração foi evaporada até a secura usando um aparelho de destilação a vácuo, coletando dessa forma 0,8 g de conteúdo de sólido.

O conteúdo de sólido foi dissolvido em 10 mL de uma solução aquosa de metanol a 20%. O espécime foi submetido a uma purificação de

alta pureza por cromatografia líquida de alta eficiência. Como uma coluna preparativa, Inertsil ODS-3 5 |am 4,6 x 250 mm (GL-science) foi usada. O isolamento preparativo foi efetuado pela carga da coluna com 0,5 mL de umespécime por isolamento preparativo, lavando a coluna com uma solução aquosa de metanol a 10%, eluindo com um gradiente de concentração de metanol de 10% a 50%, e a seguir pela coleta do pico contendo polifenol glicosídeo. Esse isolamento preparativo foi repetido por 20 minutos. 5 A solução aquosa de metanol contendo polifenol-glicosídeo puri-

ficada pelo método acima foi seca e solidificada usando um aparelho de des-tilação a vácuo. O resultante foi suspenso em água purificada. Matéria insoluvel foi separada por centrifugação do sobrenadante e, a seguir, coletada. A matéria insoluvel foi dissolvida novamente em metanol. A solução foi evapo-

rada até a secura usando um aparelho de destilação a vácuo e, a seguir, novamente suspensa em água purificada, coletando dessa forma matéria insoluvel. A matéria insoluvel foi coletada e, a seguir, água foi removida dali usando um liofilizador, obtendo dessa forma 10 mg de polifenol glicosídeo. (2) Identificação da Aceronidina

A estrutura do polifenol glicosídeo isolado dos procedimentos

acima foi determinada usando vários tipos de medições de espectro. Tabela 9 mostra cada condição de medição.

Tabela 9

Condições de medição 20 ESI-EM de alta resolução

Aparelho: Espectrômetro de massa LCT (Micromass)

Fase móvel: Metanol (0,1 mL/min)

Volume de solução de amostra

injetado: 5 uL

íons a serem medidos: íons positivos

Introdução de amostra: Injeção por pulso

Voltagem da pulverização: 3,000 V

Voltagem do cone: 30 V

Ext. da voltagem do cone: 2 V 30 Temperatura de unidade de

dessolvatação: 150eC

Temperatura da fonte iônica: 1209CLentes de RF: 200 unidades

Gás de dessolvatação: Nitrogênio (aproximadamente 7i

Faixa de varredura: m/z 150 a 1.000 (1 seg)

Intervalo de varredura: 0,1 seg

Substância de padrão interno: Leucina encefalina

RMN

Aparelho: UNITY INOVA 500 (Varian)

Freqüência de observação: 1H: 499,8 MHz, 13C: 125,7 MHz

Solvente: CD3OD

Concentração: 6,3 mg/0,65 mL

Padrão: TMS

Temperatura: 259C

Medição de 1H RMN:

Amplitude da observação: 5 KHz

Ponto de dado: 64 K

Ângulo de pulso: 30s

Tempo de repetição de pulso: 10 seg

Repetições: 16 vezes

Medição de RMN 13C:

Amplitude da observação: 30 KHz

Ponto de dado: 64 K

Ângulo de pulso: 45e

Tempo de repetição de pulso: 3 seg

Repetições: 2.400 vezes

Medição de DEPT: (medição de CH e de CH3 com sinais positi'

vos e de CH2 com sinais negativos).

Amplitude da observação: 30 KHz

Ponto de dado: 64 K

Tempo de repetição de pulso: 3 seg

Repetições: 800 vezes

Medição DQF-COSY:

Amplitude da observação: eixo t2: 5 KHz<formula>formula see original document page 48</formula>

Ponto de dado:

Tempo de espera de pulso: Repetições: Medição HSQC Amplitude da observação:

Ponto de dado:

Tempo de espera de pulso: Repetições: Medição HMBC: Amplitude da observação:

Ponto de dado:

Tempo de espera de pulso: Repetições: Medição NOESY: Amplitude da observação:

Ponto de dado:

eixo t1: 5 KHz eixo t2: 2048

eixo t1: 256 x 2 (zero enchendo até 2048) 3 seg 16 vezes

eixo t2: 20 KHz eixo t1: 5 KHz eixo t2: 2048

eixo t1: 256 x 2 (zero enchendo até 2048) 2,5 seg 16 vezes

eixo t2: 25 KHz eixo t1: 5 KHz eixo t2: 2048

eixo t1: 512 (zero enchendo até 2048) 2,5 seg 32 vezes

eixo t2: 5 KHz eixo t1: 5 KHz eixo t2: 2048

eixo t1: 256 x 2 (zero enchendo até 2048) 1 seg 3.446 seg 16 vezes

Tempo de mistura: Tempo de espera de pulso: Repetições: Abreviações

DEPT: Aumento da ausência de distorção pela Transferência de

Polarização

(Um método para determinar um tipo de carbono (distinguindo entre CH3, CH2, CH e Q)DQF-COSY: Espectroscopia de correlação filtrada de duplo

quantum

(Um método de 1H-1H COSY)

NOESY: Espectroscopia de efeito Overhauser nuclear HSQC: Coerência de quantidade única heteronuclear(Um método de 1H-13C COSY)

HMBC: Correlação de ligação múltipla heteronuclear

(Um método de 1H-13C COSY de longo alcance) ESI-EM de alta resolução Figura 6A mostra um cromatograma de íons total e a figura 6B

mostra um espectro de massas ESI de alta resolução. Nessa medição, um aducto de sódio (M+Na)+ com m/z 473 foi fortemente observado e, a seguir, o cálculo da composição foi efetuado usando massa precisa da mesma (valor de massa real), m/z 473,1064. Os elementos C, H, O e Na foram cada - um usados para o cálculo da composição. Como resultado, a fórmula com-posicional foi determinada como sendo C2iH220nNa. A massa precisa teórica foi m/z 473,1060 com um erro de 0,4 mDa. Devido à presença de tal íon ao qual sódio tenha sido adicionado nessa medição, a fórmula composicio-nal da Aceronidina é C21H22O11 e o peso molecular é 450. Medição de RMN

Do lado do elevado campo magnético (lado direito), os símbolos de "a" a "o" foram atribuídos a sinais de 1H RMN, de "A" a "U" foram atribuídos a sinais de RMN 13C, e a seguir foi efetuada a análise. 1H RMN

figura 7 mostra um espectro de 1H RMN e a tabela 10 mostra a

lista de sinais.

Tabela 10

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table>

O espectro de 1H RMN demonstra a presença das estruturas

parciais do benzeno 1,2,4-trissubstituído (sinais "o", "n" e "m") e do benzeno 1,2,4,5-tetrassubstituído (sinal "I" ou "k"). Além disso, os sinais de "a" a "j" foram atribuídos a CHn-0 (n = 1 ou 2) baseando-se em valores de alterações 5 químicas. RMN 13C

Figura 8 mostra o espectro de RMN 13C e a tabela 11 mostra a lista de sinais.

Tabela 11

<table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table>

No caso do espectro de RMN 13C, os sinais 21 foram observa-

dos e os resultados concordaram com os resultados das medições de ES.

Os sinais da carbonil cetona não foram observados.

DEPT

Figura 9 mostra o espectro DEPT. Baseando-se nesse espectro,

foi determinado o carbono ao qual cada sinal foi atribuído (ver tabela 12). DQF-COSY

Figura mostra o espectro DQF-COSY. As seguintes estruturas parciais foram derivadas do espectro.(1) j (5,31 ppm) - g (4,25 ppm) -1 (4,87 ppm) - CH(j) - CH(g) - CH(i)-

(2) h (4,63 ppm)-a (3,27 ppm) - d (3,58 ppm) - b (3,35 ppm) ou c f (3,81 ppm) - e (3,62 ppm) - c (3,36 ppm) ou b

HSQC

Figura 11 mostra o espectro HSQC. O acoplamento de 1H e de 13C em 1J(1H, 13C) foi determinado a partir do espectro de HSQC. A tabela 12 mostra o resumo dos resultados.

Tabela 12

Tipos de 13C. alterações químicas de 13C, alterações químicas de 1H a ser ligado ao 13C e constantes de acoplamento de rotação<table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table>

HMBC

figura 12 mostra o espectro de HMBC. A tabela 13 mostra os principais sinais de correlação de longo alcance conforme observado no espectro de HMBC.

Tabela 13

&-B, C, E, I

b-A, E,G c-C,E d-C, H,I e, f- C, G g-B, D, I,P h-E, G, H

i- D, F, H, L, S, T j-B, F, M, O, P, S k-K, L, S, U

1-J, L, T, U m-P, Q, R

ii— D, M, R o-D, O, R

A estrutura plana do composto da presente invenção foi derivada

dos resultados.Medição NOESY

Figura 13 mostra o espectro de NOESY. Conforme mostrado no espectro de NOESY, os seguintes sinais de correlação entre os prótons foram observados.

<formula>formula see original document page 55</formula>

Constantes de acoplamento de rotação de Jh, a = 7.9 Hz, Jaad = 9.5 Hz, e Jdüb=8.4 Hz são característicos de açúcar, sugerindo sua forma axial-axial.

NOE foi observado entre os prótons "h" e "c", indicando a pre- sença do próton "c" em uma posição axial. Por essa razão, o componente do açúcar foi determinado como sendo p-glicose.

Uma estrutura na qual OH na posição 1 e OH na posição 2 da glicose estão acoplados conforme descrito acima foi deduzida dos sinais de correlação de HMBC entre o próton "g" e o carbono "I", o próton "i" e o car- bono "H", e o próton "a" e o carbono "B".

A configuração relativa dos prótons "j", "g" e "i" foi deduzida conforme descrito acima a partir do NOE entre os prótons "A" e "i", "h" e "j" e "g" e"i".

JJDg = 11,0 Hz e Jgoi = 3,4 Hz indicam a configuração relativa a-

cima.

Tabela 14 é o resumo da lista de atribuição, na qual os átomos estão numerados.

Tabela 14

Tabela de atribuição de RMN<table>table see original document page 56</column></row><table><formula>formula see original document page 57</formula>

Baseando-se nos resultados acima, foi determinado que o novo polifenol glicosídeo tem uma estrutura representada pela fórmula estrutural:

<formula>formula see original document page 57</formula>

Os presentes inventores designaram o novo polifenol glicosídeo como Aceronidina. Exemplo 2

Experimento 2.1 Preparação do pó de acerola

1400 Kg de suco de acerola concentrado (produzido no Brasil) foi diluído com água purificada, de forma a preparar uma solução com um valor de Brix de 31%. 1% em peso de levedura {Saccharomyces cerevisiae) foi adicionada à solução. A fermentação foi efetuada a 309C por 20 horas, de forma a remover glicose e frutose. Depois da fermentação, foram efetuadas a centrifugação e a filtração. Dessa forma, 2297 Kg de suco de acerola processado e concentrado, a partir do qual glicose e frutose foram removidos,foram obtidos. 4,0% (p/p) de fibra de dieta (proporção de conteúdo sólido (peso) de fibra de dieta em relação ao suco) e 1,5% (p/p) de cálcio de molusco (proporção de conteúdo sólido (peso) de cálcio em relação ao suco) foram dissolvidos como um excipiente e um agente para o processamento, 5 respectivamente, no suco de acerola processado e concentrado. A solução foi pulverizada por um método de secagem por atomização, obtendo dessa forma 806 Kg de um pó de acerola. O pó de acerola continha 35,3% (p/p) de vitamina C e 1,5% (p/p) de polifenol.

O conteúdo de polifenol no pó de acerola foi medido pelo seguin-

te procedimento. O pó de acerola foi dissolvido em água purificada em uma concentração de 20% (p/p). Uma coluna C18 (Sep-Pak Vac 35 cc (10 g) Cartuchos C18, Waters Corporation) foi carregada com 50 g de solução, a coluna foi lavada com água purificada, e a seguir uma fração eluída com metanol foi coletada. A quantidade de polifenol na fração eluída com metanol foi me-

dida pelo método de Folin-Denis usando catequina ((+)-hidrato de catequina, Sigma-AIdrich Corporation) como uma substância padrão. O conteúdo de polifenol no pó de acerola foi calculado usando o peso do pó de acerola u-sado para carregar a coluna, a quantidade de eluato de metanol coletada e a quantidade de polifenol medida. Além disso, com o uso desse método de

medição, Aceronidina que forma um complexo com a estrutura principal de pectina pode não ser medida como "polifenol".

Foi considerado que os componentes adsorvidos na coluna C18 contêm polifenol. Conseqüentemente, nesse exemplo, a quantidade de polifenol foi medida usando a quantidade dos componentes adsorvidos na colu-

na C18 como um indicador.

Experimento 2.2 Preparação de solução aquosa do pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 foram removidos

O pó de acerola preparado no experimento 2.1 foi dissolvido em água purificada a 20% (p/p), preparando dessa forma 50 ml_ de uma solução

aquosa. Uma coluna C18 (Sep-Pak Vac 35 cc Cartucho C18 Waters Corporation) foi carregada com a solução e, a seguir, os componentes adsorvidos na coluna C18 contendo polifenol livre e similares foram adsorvidos à colu-na. Uma fração que passou através da coluna foi coletada, de forma que uma solução aquosa do pó de acerola a partir do qual os componentes ad-sorvidos na coluna C18 foram removidos foi preparada. A concentração do conteúdo de sólido na solução foi descoberta como sendo de 15,3% (p/p). A quantidade de polifenol na solução aquosa foi medida por cromatografia líquida de alta eficiência (coluna C18: ODS-3 4.6 mm x 250 mm GL Sciences Inc.). A área do pico de polifenol no espécime obtido dessa forma foi comparada com a área do pico de polifenol obtida pela análise de uma solução a-quosa de pó de acerola (concentração de polifenol: 0,3% (p/p)) antes da re- moção dos componentes adsorvidos na coluna C18. Quando a proporção foi calculada depois da comparação, a concentração de polifenol no espécime foi confirmada como sendo de 1% ou menos (especificamente, concentração de polifenol: 0,003% (p/p) ou menos) do produto comparado com ele. Especificamente, o conteúdo de polifenol no pó de acerola a partir do qual os j componentes adsorvidos na coluna C18 foram removidos foi de 0,02% (p/p) ou menos em uma base de conteúdo sólido.

A solução aquosa obtida dessa forma foi usada no seguinte experimento. A solução aquosa é referida como "solução aquosa do pó de acerola a partir do qual componentes adsorvidos na coluna C18 foram removi- dos" na descrição. Além disso, o conteúdo sólido contido na solução aquosa pode ser referido como "pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 foram removidos".

Experimento 2.3 Preparação da solução aquosa do pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 e vitamina C foram removi- dos

A solução aquosa do pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 foram removidos (preparada no experimento 2.2) foi diluída com água purificada em uma concentração de conteúdo sólido de 0,1% (p/p). 100 jjL de uma solução de ácido ascórbico oxidase(TOYOBO Co., Ltd.) foi adicionada a 5 mL da solução aquosa, resultando em 30 U de atividade de enzima. Além disso, 400 jiL de uma solução aquosa de hidrogenofosfato dissódico 10 mM foram adicionados à solução, se-guido pela reação de um dia para o outro a 309C em um banho termostático. Depois do fim da reação, o tratamento com calor foi efetuado a 120QC por 10 minutos, desativando dessa forma a enzima. A quantidade residual de vitamina C foi medida por cromatografia líquida de alta eficiência, de forma que a quantidade foi confirmada como correspondente a 1% ou menos da quantidade antes do tratamento enzimático. Além disso, o conteúdo de vitamina C antes do tratamento enzimático foi descoberto como sendo de 35,3% (p/p) em uma base de conteúdo sólido. Conseqüentemente, o conteúdo de vitamina C no pó de acerola depois da remoção da vitamina C foi de 0,35% (p/p) ou menos em uma base de conteúdo sólido.

A solução aquosa obtida dessa forma foi usada no seguinte experimento. A solução aquosa é referida como "solução aquosa do pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 e vitamina C foram removidos" na descrição. Além disso, o conteúdo sólido contido na solução aquosa pode ser referido como "pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 e vitamina C foram removidos". Experimento 2.4 Preparação dos componentes adsorvidos na coluna C18 derivados de acerola

O pó de acerola preparado no Experimento 2.1 foi dissolvido em água purificada a 20% (p/p), preparando dessa forma 40 ml_ de uma solução aquosa. Uma coluna C18 (Sep-Pak Vac 35 cc Cartucho C18 Waters Corporation) foi carregado com a solução e, a seguir, os componentes adsorvidos na coluna C18 contendo polifenol livre e similares foram adsorvidos na coluna. A coluna foi lavada com água purificada, a eluição foi efetuada com me- tanol, e a seguir o eluato foi seco e solidificado usando um aparelho de desti-lação a vácuo. Dessa forma, 0,17 g dos componentes adsorvidos na coluna C18 foi coletado.

Método do teste da atividade antioxidativa Antecedentes do experimento:

Ácido linoléico é um ácido graxo insaturado que está contido ri-

camente também no corpo humano. O ácido graxo insaturado é caracterizado por ser auto-oxidado quando ele é deixado em repouso, de forma a serperóxido lipídico. Nesse experimento, ácido Ijnoléico é misturado com uma amostra, a mistura é deixada em repouso a 40QC e, a seguir, as atividades antioxidativas são avaliadas baseando-se nos aumentos nas quantidades de óxidos lipídicos purificados a partir do ácido linoléico. 5 Método de teste 2.1

Medição da atividade de antioxidacão (método de ferro-Rhodan) usando ácido linoléico)

A mistura de 2 ml_ de etanol 99,5% e 2 ml_ de água destilada (um espécime foi previamente dissolvido ou em etanol 99,5% ou em água 10 destilada) foi adicionada à mistura de 2 ml_ de 2,5% (p/v) de ácido linoléico (solução de etanol a 99,5%) e 4 mL de tampão fosfato 0,05 M (pH 7,0). A mistura resultante foi posta em uma garrafa de tampa de rosca âmbar, de forma que 10 mL da solução reacional foram preparados. Quando um espécime foi um componente insolúvel em água, o espécime foi dissolvido no j 15 etanol 99,5% acima, de forma que uma solução reacional foi preparada. Quando um espécime foi um componente solúvel em água, o espécime foi dissolvido na água destilada acima, de forma que a solução reacional foi preparada. Além disso, nesse método de teste, o termo "concentração do espécime" indica uma concentração do espécime em 2 mL de etanol 99,5% 20 ou 2 mL de água destilada. Conseqüentemente, a concentração final de cada espécime em cada solução reacional foi de um quinto da concentração predeterminada.

Além disso, considerando os espécimes positivos para atividades antioxidativas, procedimentos similares foram efetuados para o BHA de

25 forma que ele está contido em quantidades apropriadas nas soluções rea-cionais. Espécimes de controle positivo foram, assim, preparados. Um controle usado aqui foi preparado pela adição de 2 mL de etanol 99,5% e 2 mL de água destilada unicamente à solução reacional. Tal solução reacional estocada no escuro a 40gC foi usada para o teste principal e tal solução rea-

30 cional estocada a 4eC foi usada para um teste em branco. As substâncias do teste foram amostradas com o tempo e, a seguir, medidas conforme descrito abaixo. Os testes foram conduzidos por 2 ou mais semanas.0,1 ml_ de cloreto terroso 2 x 10"2 M (solução de ácido clorídrico 3,5%) foi adicionado à mistura de 0,1 mL de uma substância de teste, 9,7 ml_ de etanol 75% e 0,1 mL de solução aquosa de rodanato de amônio 30%. Precisamente aos 3 minutos após a adição, a absorvância foi medida a 500 5 nm. A absorvância foi semelhantemente medida em um teste em branco: A de absorvância = [absorvância no teste principal] - [absorvância no teste em branco]. Quanto mais alta a absorvância, mais alta a quantidade de lipídeos oxidados. Esse resultado indica a fraca atividade antioxidativa do espécime relevante. Além disso, onde a oxidação de uma amostra é iniciada, a absor-10 vância aumenta. Depois da absorvância alcançar um pico, a absorvância diminui conforme a quantidade de uma amostra a ser oxidada diminui. Pode ser dito que quanto mais cedo a absorvância alcançar um pico, mais fraca é a atividade antioxidativa.

Além disso, as atividades antioxidação das amostras foram - 15 comparadas em termos da proporção de oxidação (%). A proporção de oxidação (%) foi obtida pela seguinte fórmula usando a oxidação (absorvância) do controle como 100%. [Fórmula 11

Proporção de oxidação (%) - ([A de absorvância da amostra]/[ A 20 de absorvância do controle]) x 100

Pode ser dito que quanto mais alta for a proporção de oxidação (%), mais baixa será a atividade antioxidação.

Experimento 2.5 Atividades antioxidativas para lipídeos de suco de acerola concentrado e solução aquosa de pó de acerola

25 As atividades antioxidativas de um espécime de suco de acerola

concentrado (Brix 52,2, concentração de vitamina C: 18,4% (p/p) em uma base de conteúdo sólido (peso)) e de um espécime do pó de acerola preparado no Experimento 2.1 foram determinadas com uma concentração de espécime de 0,02% (p/p) em uma base de conteúdo sólido pelo método de

30 teste 2.1. figura 14 mostra os resultados. O eixo Y na figura 14 refere-se à absorvância. É indicado que quanto mais alto for o valor numérico, mais a-vançada é a oxidação do ácido linoléico. O suco de acerola concentrado e opó de acerola exerceram atividades antioxidativas suficientes mesmo depois de 28 dias. Particularmente, o pó de acerola exerceu atividades antioxidativas em um nível equivalente àquele exercido pelo BHA, o qual é um antioxi-dante sintético com a mesma concentração. Experimento 2.6 Comparação das atividades antioxidativas do pó de acerola e do g-tocoferol

Os efeitos da supressão da auto-oxidação do ácido linoléico do cc-tocoferol (vitamina E) e de pó de acerola foram comparados usando o método de Teste 2.1. a-tocoferol é um antioxidante solúvel em lipídeo conheci- do derivado da natureza.

Nesse experimento, a-tocoferol ((±)-a-tocoferol: Wako Pure Chemical Industries, Ltd., reagente de primeiro grau), BHA (3(2)-t-butil-4-hidroxianisol: Wako Pure Chemical Industries, Ltd., reagente de primeiro grau), o qual é um antioxidante sintético, e o pó de acerola preparado no - Experimento 2.1 foram usados. Considerando todas as concentrações dos espécimes, o experimento foi conduzido sob condições tais quais o conteúdo de sólidos (concentração) de cada espécime foi de 0,02% (p/p). A Tabela 15 mostra os resultados experimentais.

A comparação do a-tocoferol com o BHA (controle positivo) no Experimento 1 revelou que o BHA exerceu atividades antioxidativas superiores àquelas do a-tocoferol. Quando o BHA foi comparado com o pó de acerola no Experimento 2, o pó de acerola exerceu atividades antioxidativas em um nível equivalente ou mesmo superior daquele do BHA. Baseando-se nos dois resultados experimentais, foi revelado que o pó de acerola suprimiu de maneira mais forte a auto-oxidação do ácido linoneico do que o a-tocoferol (vitamina E).Tabela 15

Teste envolvendo a supressão da auto-oxidação do ácido linoléico pelo a-tocoferol e pó de acerola

Experimento 1 Experimento 2<table>table see original document page 64</column></row><table>

Experimento 2.7 Atividades antioxidativas da vitamina C (ácido ascórbico) para lipídeos

As atividades antioxidativas dos espécimes de vitamina C (ácido ascórbico, reagente de grau especial, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) com concentrações de 0,02% (p/p) e de 0,04% (p/p) em uma base de conte-

údo sólido (peso) foram determinadas pelo método de teste 1. figura 15 mostra os resultados. O eixo Y na figura 15 refere-se à absorvância, indicando que quanto mais alto for o valor numérico, mais avançado é o estado de oxi-dação. Os espécimes de vitamina C com 0,02% (p/p) e 0,04% (p/p) não e-xerceu atividades antioxidativas sob qualquer condição. Ao invés disso, o

espécime de vitamina C com uma concentração de 0,02% (p/p) causou a oxidação do ácido linoléico antes do caso do controle durante o período a partir do início do experimento até 7 dias depois do início do experimento. Experimento 2.8 Comparação do pó de acerola, pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 foram removidos e de com-

ponentes adsorvidos na coluna C18 derivados de acerola em termos de potência antioxidativa

o pó de acerola preparado no Experimento 2.1 e os componen-tes adsorvidos na coluna C18 (derivados de acerola) preparados no Experimento 2.4, com diferentes concentrações de espécimes (p/p) foram usados como espécimes nesse experimento. Além disso, o conteúdo sólido da solução aquosa do pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 foram removidos (concentração de conteúdo sólido: 15,3% (p/p)) preparado no experimento 2.2 foi diluído em diferentes concentrações (p/p). Os espécimes diluídos dessa forma foram usados nesse experimento. Esses espécimes foram estocados a 40QC por 28 dias e, a seguir, o efeito antioxi-dativo para o ácido linoléico foi determinado de acordo com o método de teste 2.1. figura 16 mostra os resultados. Os valores medidos foram representados pela proporção de oxidação (%) do ácido linoléico (ver Fórmula 1 acima), indicando que quanto mais alta a proporção de oxidação (%), mais fraca é a potência antioxidativa de um espécime.

Uma proporção de oxidação (%) de 100% significa que a quanti- dade de oxido de ácido linoléico foi a mesma que aquela do controle. O eixo horizontal refere-se às concentrações de amostra usadas no teste. A partir da experiência de condução do teste para avaliar antioxidantes, pode ser concluído que um antioxidante suprime significativamente a oxidação quando a proporção de oxidação (%) for de 20% ou menos do que aquela do con- trole sob as mesmas condições. Conseqüentemente, baseando-se nos resultados na figura 16, pode ser concluído que a concentração efetiva de cada espécime é: 0,005% (p/p) ou mais no caso do espécime do componente adsorvido na coluna C18 derivado da acerola; 0,015% (p/p) ou mais no caso do espécime do pó de acerola; e 0,0175% (p/p) ou mais no caso do espéci- me do pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 tenham sido removidos em uma base de conteúdo sólido (concentração).

As atividades antioxidativas dos componentes adsorvidos na coluna C18 isolados derivados de acerola foram claramente as maiores. A-30 lém disso, o pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 foram removidos também têm atividades antioxidativas suficientes. Conseqüentemente, foi inferido que os componentes diferentes doscomponentes adsorvidos na coluna C18 também contribuíram com as atividades antioxidativas. O conteúdo de polifenol em uma solução com uma concentração de pó de acerola efetiva (concentração de conteúdo sólido: 0,015% (p/p)) foi tão baixo quanto 0,000225% (p/p) em uma base de solu-5 ção. Uma vez que o pó de acerola tem um nível um pouco mais alto de atividades antioxidativas em relação ao pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 foram removidos, foi inferido que tal pequena quantidade de componentes adsorvidos na coluna C18 contribui com as atividades antioxidativas. Conseqüentemente, foi concluído que o efeito 10 do pó de acerola para suprimir a auto-oxidação do ácido linoléico é exercido por uma combinação dos componentes adsorvidos na coluna C18 e outros componentes.

Experimento 2.9 Teste de antioxidação para lipídeos usando a solução a-quosa do pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na colu-- 15 na C18 foram removidos e a solução aquosa do pó de acerola a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 e vitamina C foram removidos

As atividades antioxidativas de um espécime da solução aquosa de pó de acerola, a partir do qual os componentes adsorvidos na coluna C18

foram removidos, preparados no experimento 2.2 e aqueles de um espécime da solução aquosa do pó de acerola, do qual componentes adsorvidos na coluna C18 e vitamina C forma removidos, preparados no experimento 2.3 foram determinados usando uma concentração da espécime de 0,02% (p/p) em um conteúdo de base sólida (peso) pelo método de teste 1. figura 17

mostra os resultados. Foi confirmado que a solução aquosa do pó de acerola do qual os componentes adsorvidos na coluna C18 e vitamina C foram removidos tem atividades antioxidação suficientes para os lipídeos. A razão pela qual essa solução tem atividades antioxidativas mais baixas do que a-quelas do suco de acerola do qual os componentes adsorvidos na coluna

C18 foram removidos com a mesma concentração pode ser devido à remoção da vitamina C, Por outro lado, conforme mostrado no experimento 2.7, vitamina C sozinha não age como um antioxidante para lipídeos (figura 15).Conseqüentemente, os resultados desse experimento demonstram que a vitamina C na acerola exerce atividades antioxidativas para os lipídeos juntamente com os componentes da acerola diferentes dos componentes ad-sorvidos na coluna C18. 5 Experimento 2.10. Preparação da pectina de acerola solúvel em ácido

Frutas de acerola foram esmagadas usando um misturador Wa-ring durante a adição de 3 Kg de água purificada em 3 Kg das frutas de acerola, de forma que um produto de acerola esmagado foi preparado. Etanol foi adicionado ao produto até ele contabilizar por 30% em peso. O resultante foi

agitado em temperatura ambiente de um dia para o outro de forma que os componentes solúveis em água e etanol foram extraídos. O extrato foi centrifugado a 4200 rpm por 30 minutos, separando dessa forma o conteúdo sólido. 1500 g do conteúdo sólido foram coletados.

5200 g de água purificada foram adicionados a 1500 g de conte-- 15 údo sólido para preparar uma suspensão. Ácido clorídrico concentrado foi adicionado à suspensão para ajustar o resultante até o pH 2,2. O tratamento com calor foi efetuado por 2 horas a de 80QC a 90QC usando uma placa a-quecedora durante a agitação da suspensão. A suspensão foi deixada em repouso para reduzir a temperatura e, a seguir, foi submetida à centrifuga-

ção a 4200 rpm por 30 minutos. Conseqüentemente, o resultante foi separado no conteúdo sólido e no sobrenadante e, a seguir.o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante foi filtrado usando um filtro de 0,2 um para remover os componentes insolúveis, obtendo dessa forma um extrato límpido.

Etanol foi adicionado ao extrato em uma quantidade 3 vezes

maior do que o peso do extrato, de forma que um componente de pectina insolúvel em etanol foi depositado. O componente de pectina depositado foi coletado usando malha inoxidável. Além disso, para remover os componentes solúveis em etanol e em água, o resultante foi lavado duas vezes com uma solução aquosa de etanol 90%, coletado e, a seguir, seco usando um

liofilizador. Conseqüentemente, 6,24 g da pectina de acerola solúvel em ácido foram coletados.Experimento 2.11 Preparação da pectina de acerola digerida com pectinase

As frutas de acerola foram esmagadas usando um misturador Waring durante a adição de 2 Kg de água purificada às frutas de acerola, de forma que um produto de acerola esmagado foi preparado. Etanol foi adicio-nado ao produto até ele contabilizar por 40% em peso. O resultante foi agitado em temperatura ambiente de um dia para o outro de forma que os componentes solúveis em água e etanol foram extraídos. O extrato foi centrifugado a 4200 rpm por 30 minutos, separando dessa forma o conteúdo sólido. 1000 g do conteúdo sólido foram coletados.

1000 g do conteúdo sólido foram misturados com 3000 g de á-

gua purificada e, a seguir, misturados com 4 g de um pó de pectinase (pectinase "AMANO A," AMANO ENZYME INC.). A mistura foi deixada em repouso a 45eC de um dia para o outro. A mistura foi centrifugada a 4200 rpm por 30 minutos, de forma que a mistura foi separada em conteúdo sólido e em sobrenadante. O sobrenadante foi coletado. O sobrenadante foi filtrado u-sando um filtro de 0,2 fim para remover os componentes insolúveis, obtendo dessa forma um extrato límpido.

Etanol foi adicionado ao extrato em uma quantidade 3 vezes maior do que o peso do extrato, de forma que um componente de pectina insolúvel em etanol foi depositado. O componente de pectina depositado foi centrifugado a 4200 rpm por 30 minutos, de forma que o componente foi coletado como conteúdo sólido. O conteúdo sólido foi adicionalmente lavado com uma solução aquosa de etanol 90% e, a seguir, seca usando um liofili-zador. Dessa forma, 12,6 g de conteúdo sólido seco foram coletados. O con- teúdo sólido seco foi designado uma pectina tratada com pectinase. É considerado que o componente de pectina é um hidrolisado de pectina porque o componente de pectina tem uma baixa viscosidade, embora a viscosidade seja uma característica de uma solução de pectina aquosa. Experimento 2.12 Medição do peso molecular da pectina derivada de acero-]a

Os pesos moleculares da pectina tratada com ácido (preparada no Experimento 2.10) e os produtos de pectina que foram tratados com áci-do e, a seguir, digeridos com pectinase foram medidos por cromatografia de filtração de gel.

A pectina tratada com ácido foi dissolvida em água purificada a 0,5% (p/p). 20 ml_ de uma solução aquosa foi, dessa forma, preparada, fil-5 trada usando um filtro de 0,2 ja.m, e a seguir usada. Os produtos de pectina que foram tratados com ácido e, a seguir, digeridos com pectinase foram preparados como se segue. A pectina tratada com ácido (preparada no Experimento 2.10) foi dissolvida em água purificada a 0,3% (p/p), de forma que 20 mL de uma solução aquosa foi preparada. 6 mg de um pó de pectinase (pectinase "AMANO A," AMANO ENZYME INC.) foram adicionados à solução, seguido por uma reação a 50eC de um dia para o outro. Depois do término da reação, o tratamento com calor foi efetuado a 1209C por 15 minutos para desativar a enzima. O resultante foi filtrado usando um filtro de 0,2 ^im. O resultante filtrado foi concentrado usando um aparelho de destilação a , 15 vácuo para 2 mL e, a seguir, o produto concentrado foi filtrado usando um filtro de 0,2 |im. Sephacryl S-300 de Alta Resolução (Amersham Bioscien-ces) foi usado como um veículo de filtração em gel. Uma coluna foi carregada com o veículo e, a seguir, a medição da filtração em gel foi efetuada. PBS (salina tamponada com fosfato da Dulbecco) foi usada como tampão. Na medição dos pesos moleculares, os marcadores de peso molecular considerados como sendo apropriados para essa medição foram aqui utilizados. Esses marcadores de peso molecular são: Azul Dextran 2000, Catalase, Al-bumina e Quimiotripsinogênio A em um kit de calibração de filtração em gel HMW (Amersham Biosciences) e um kit de calibração de filtração em gel

LMW (Amersham Biosciences).

Como resultado da medição, o peso molecular da pectina tratada com ácido (preparada no experimento 2.10) foi descoberto como sendo quase o mesmo que aquele medido usando Azul Dextran 2000. Dessa forma, foi revelado que a pectina tratada com ácido (preparada no Experimento 2.10) é uma molécula com um peso molecular de aproximadamente 2.000.000. Além disso, uma pluralidade de picos foi observada no caso dos produtos de pectina que foram tratados com ácido e, a seguir, digeridos compectinase. Foi confirmado que todos os pesos moleculares foram menores do que aquele do quimiotripsinogênio A com um peso molecular de 20,4 KDa. Conseqüentemente, foi inferido que a pectina tratada com a enzima foi uma mistura de moléculas, cada uma com um peso molecular de 20.000 ou menos. Experimento 2.13. Comparação de espécimes de pectina derivada de acerola em termos de potência antioxidativa As atividades antioxidativas da pectina derivada de acerola tratada com ácido (preparada no Experimento 2.10) e a mesma da pectina de- rivada de acerola tratada com pectinase (preparada no Experimento 2.11) foram determinadas pelo método do teste 2.1 usando uma concentração de espécime de 0,1% (p/p) em uma base de conteúdo sólido (peso). Figura 18 mostra os resultados. Ambas as espécimes exibiram atividades antioxidativas suficientes para os lipídeos. Dessa forma, foi revelado que ambos os tipos de pectina são eficazes como antioxidantes para lipídeos. Conforme descrito no Experimento 2.12, embora a pectina da acerola tratada com ácido e a pectina tratada com enzima sejam distintas uma da outra quanto ao peso molecular, a primeira pectina exerceu atividades antioxidativas lipídicas em um nível equivalente àquele exercido pela última pectina. É inferido que a pectina derivada da acerola que foi hidrolisada por outra enzima ou similar também tenha atividades antioxidativas para lipídeos em um nível equivalente àqueles das outras pectinas. Experimento 2.14 As atividades antioxidativas das pectinas derivadas de acerola foram avaliadas por um teste de atividade de retirada do radical DPPH. A atividade antioxidação foi avaliada usando uma solução de etanol de difenil-p-picrilidradil (DPPH) o qual é um radical estável. 1600 uL de um tampão acetato de 250 mM (pH 5,5) foram misturados com 1200 ul. de etanol e 400 u,L de uma espécime (ajustada em uma concentração prede- terminada), seguido pela pré-incubação a 309C por 5 minutos. 800 uL de uma solução de DPPH 500 jiM/etanol foi adicionado à solução e, a seguir, a absorvância foi medida a 517 nm. Um controle aqui utilizado foi preparadopor procedimentos similares usando água purificada ao invés da solução da amostra. Espécimes usadas aqui foram a pectina derivada de acerola tratada com ácido (preparada no Experimento 2.10) e a pectina derivada de acerola tratada com enzima (preparada no experimento 2.11). As espécimes 5 usadas para comparação foram as soluções preparadas pela dissolução de uma pectina derivada de maçã (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., rea-gente) e de uma pectina derivada de fruta cítrica (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., reagente) a 0,3% (p/p) e 0,1% (p/p), respectivamente, com água purificada. As proporções de retirada de radicais foram calculadas pela 10 seguinte fórmula usando as absorvâncias medidas dessa forma. Fórmula 21

Proporção de retirada (%) = (1 - [absorvância da amos-tra]/[absorvância de controle] x 100

Tabela 16 mostra os resultados. Esses resultados revelaram que - diferentemente de outras pectinas, a pectina derivada de acerola tratada com ácido ou a pectina tratada com enzima é uma substância antioxidativa com atividade de retirada de radical. Além disso, também foi revelado que as atividades antioxidativas são aumentadas aproximadamente 2 vezes através do tratamento com pectinase (enzima).

Tabela 16

<table>table see original document page 71</column></row><table>

Experimento 2.15

Metades de corpos de salmão foram imersos em soluções sali-nas contendo um pó de acerola, de forma a preparar amostras de salmão curadas com sal. Sob condições de iluminação fluorescente, alterações na aparência, sensualidade, cor (Hunter Lab), valor de ácido e valor de peróxido foram medidos antes e depois da estocagem. Baseando-se nessas altera- ções, o efeito antioxidação do pó de acerola para lipídeos foi confirmado.

O pó de acerola foi preparado como se segue. 1400 Kg de suco de acerola concentrado produzido no Brasil foi diluído com água purificada e, a seguir, o valor do Brix foi ajustado para ser de 31%. 1% em peso de levedura {Saccharomyces cerevisiaé) foi adicionado à solução e, a seguir, a fer- mentação foi efetuada a 30eC por 20 horas, de forma que a glicose e a fruto-se foram removidas. Depois da fermentação, a centrifugação e a filtração foram efetuadas. Dessa forma, 2297 Kg de um suco de acerola processado e concentrado foram obtidos, a partir do que glicose e frutose foram removidas. Depois, 400 g de dextrina como excipiente, 150 g de fibra de dieta e 50 -15 g de amido processado foram dissolvidos em 400 g do suco de acerola processado e concentrado contendo conteúdo sólido derivado de acerola. A solução foi pulverizada por um método de atomização, de forma que 780 g de pó de acerola para processamento alimentício foram obtidos. Esse pó de acerola é diferente do pó de acerola obtido no Experimento 2.1, pelo fato de que ele não contém cálcio de molusco, que é um componente amargo, de forma que o pó de acerola pode ser usado para processar uma ampla faixa de produtos alimentícios.

Como um fluido de imersão a ser usado em um teste de adição de acerola, uma solução aquosa contendo o pó de acerola acima (5% em peso), sal comum (20% em peso) e hidrogenocarbonato de sódio (5% em peso) foi preparada. Além disso, como um fluido de imersão a ser usado em um teste de controle, uma solução aquosa contendo sal comum (20% em peso) foi preparada.

Peixe de matéria-prima congelado (salmão prata (preparado)) foidescongelado, lavado com água salina para retirar por lavagem a superfície limosa, e a seguir cortado em filés. Os ossos do abdômen foram removidos dos filés, de forma que as amostras para esse experimento foram prepara-das. Uma das metades do corpo do salmão foi imersa no fluido de imersão contendo o pó de acerola. A outra metade do mesmo foi imersa no fluido de imersão para o teste de controle. Depois da imersão de um dia para o outro, os filés foram dessangrados, embalados a vácuo e, a seguir, criopreserva- dos até os filés serem submetidos ao seguinte experimento de iluminação fluorescente.

O experimento de iluminação fluorescente foi conduzido pelos seguintes procedimentos. Primeiramente, a amostra de salmão curada com sal acima foi descongelada, cortada em um tamanho apropriado e, a seguir, posta em uma bandeja de poliestireno espumada. A bandeja foi embalada completamente com uma manta (Shin-etsu Polymer Co., Ltd., "Polyma-wrap"), colocada em uma vitrine e, a seguir, submetida a 48 horas de iluminação fluorescente com 1500 lux a 10SC.

As alterações na aparência foram observadas antes e depois da iluminação fluorescente. Antes da iluminação, as amostras do grupo ao qual acerola foi adicionada estavam com coloração levemente turva em comparação com as amostras do grupo de teste de controle, mas elas não foram muito diferentes uma da outra. Depois do experimento de iluminação fluorescente, as amostras do grupo ao qual acerola foi adicionada estavam com uma coloração levemente turva e escurecida em comparação com as amostras do mesmo antes da iluminação, entretanto, reteram a coloração vermelha. Ao contrário, as amostras do grupo de teste de controle apresentaram uma clara descoloração da coloração vermelha. Conseqüentemente, foi demonstrado que o pó de acerola pode prevenir a descoloração do salmão du- rante a estocagem. Além disso, alterações na sensualidade foram observadas antes e depois da iluminação fluorescente. Antes da iluminação, nenhum odor resultante da oxidação lipidica foi sentido em ambos os grupos nos quais acerola foi adicionada e no grupo de teste de controle. Depois da iluminação, o sabor resultante da oxidação e a deterioração lipidica foram sentidos mais fortemente no caso do grupo de teste de controle do que no caso do grupo ao qual acerola foi adicionada. A tabela abaixo mostra os resultados da avaliação acima. 20 amostras foram preparadas para cada gru-po de teste. Os números na tabela são os números das amostras correspondendo a cada item. Além disso, figura 19 mostra fotografias das amostras depois da estocagem sob condições de iluminação fluorescente.

Tabela 17

<table>table see original document page 74</column></row><table>

A medição de Hunter Lab para a medição de cor foi efetuada em

3 pontos de tempo: antes da imersão; depois da imersão, porém antes da iluminação (simplesmente "antes da iluminação" na Tabela 18; e após a iluminação. A medição no laboratório foi efetuada usando CHROMA METER 10 CR-200 (Minolta Co., Ltd.). A medição antes da imersão e a medição depois da iluminação foram efetuadas para 5 amostras. A medição após a imersão, mas antes da iluminação foi efetuada para 2 amostras. Os valores médios são cada um resumidos na Tabela 18.

Tabela 18

<table>table see original document page 74</column></row><table>

Somente alterações no valor "a" (indicando coloração vermelha)

observadas antes e depois da iluminação estão extraídas da Tabela 18 e mostradas na figura 20. Conforme fica claro a partir da figura 20, enquanto quase nenhum decréscimo foi observado no valor "a" no grupo de teste aoqual acerola foi adicionada, decréscimos no valor de "a" foram observados no grupo de teste de controle.

Além disso, o valor de ácido (AV) e o valor de peróxido (POV) de cada amostra depois da iluminação fluorescente foram medidos. A medição 5 foi efetuada de acordo com o método descrito em Food Analysis Handbook (25 ed., KENPAKUSHA). A Tabela 19 apresenta os resultados.

Tabela 19

Valor de ácido e valor de peróxido depois do experimento de iluminação fluorescente

<table>table see original document page 75</column></row><table>

Depois da iluminação fluorescente e da estocagem, o valor de ácido e o valor de peróxido no grupo de teste ao qual acerola foi adicionada foram menores do que aqueles no grupo de teste de controle. Especificamente, foi demonstrado que a adição do pó de acerola suprimiu a oxidação lipídica.

Experimento 2.16

Ova de salmão salgada foi imersa em uma solução de tempero contendo um pó de acerola, deforma que ova de salmão temperada foi preparada. Alterações na aparência, sabor, valor de ácido e valor de peróxido foram medidas antes e depois da estocagem sob condições de iluminação fluorescente. Baseando-se nessas alterações, o efeito de oxidação antilipídi-ca do pó de acerola foi confirmado.

Como um pó de acerola, o pó de acerola preparado no Experimento 2.15 foi usado. Como uma solução de tempero a ser usada para um teste de adição de acerola, uma solução aquosa contendo o pó de acerola acima (5% em peso), sake (35% em peso), shiro-shoyu (molho de soja branco) (35% em peso), mirin (vinho de arroz doce japonês para cozinhar) (20% em peso), hidrogenocarbonato de sódio (4,995% em peso), e nitrito de sódio (0,005%em peso) foi preparada. Além disso, como uma solução de tempero para um teste de controle, uma solução aquosa com a mesma composição, exceto que ela não continha pó de acerola e sem hidrogenocarbonato de sódio foi preparada.

Ova de salmão salgada congelada (ova de salmão salgada bruta

que foi congelada) foi descongelada, lavada com água salina, imergida na solução de tempero acima por 1 hora, refrigerada de um dia para o outro para maturação e, a seguir, separada em "san-toku (triplo especial)" e em "kuroko (ova de salmão negro)". Depois da separação, a ova de salmão foi 10 crioconservada até ser submetida ao seguinte experimento de iluminação fluorescente.

O experimento de iluminação fluorescente foi conduzido pelos seguintes procedimentos. Primeiramente, "san-toku" ou "kuroko" separados de salmão salgado foram descongelados e, a seguir, colocados em uma 15 bandeja de poliestireno espumada. A bandeja foi completamente envolta (Shin-etsu Polymer Co., Ltd., "Polymawrap"), colocada em estocagem a frio e, a seguir, submetida a 144 horas de iluminação fluorescente com 1500 lux. A10eC.

Alterações na aparência e sabor foram observadas antes e de-20 pois da iluminação fluorescente. Antes e depois da iluminação, alterações na aparência e na deterioração no sabor (geração de sabor por oxidação lipídi-ca) foram suprimidas no grupo de teste ao qual acerola foi adicionada em comparação com o grupo de teste de controle. Os resultados acima de avaliação estão mostrados na tabela abaixo. 20 amostras foram preparadas pa-25 ra cada grupo de teste. As quantidades na tabela são os números de amostras correspondendo a todos os itens.

Tabela 20

<table>table see original document page 76</column></row><table>O valor de ácido (AV) e o valor de peróxido (POV) de cada a-mostra foram medidos depois da iluminação fluorescente (entretanto, no caso das amostras kuroko, somente o valor de ácido foi medido). A medição foi efetuada de acordo com o método descrito no Food Analysis Handbook (2- ed., KENPAKUSHA). Tabela 21 mostra os resultados.<table>table see original document page 77</column></row><table>

Tanto no caso Santoku quanto no caso Kuroko, o valor de ácido

e o valor de peróxido depois da iluminação fluorescente e estocagem foram significativamente menores no grupo de teste ao qual acerola foi adicionada do que aqueles no grupo de teste de controle. Especificamente, foi demonstrado que a adição de pó de acerola suprimiu a oxidação lipídica.

Exemplo 3

Preparação da pectinase

No seguinte experimento, a digestão da polpa foi efetuada usando uma preparação de pectinase (pectinase A "Amano," AMANO ENZYME INC.). Essa preparação de enzima contém 45% de pectinase, 25% de p-amilase e 30% de terra diatomácea. Dessa forma, o componente de pectina e o componente de amido na polpa de acerola são digeridos pela preparação enzimática. A pectinase é uma enzima que é purificada do produto de cultura dos fungos Aspergillius pulverulentus e Aspergillius niger. A pectinase é assumida como sendo uma mistura de uma variedade de tipos de pec- tinase. Uma vez que a pectinase causa um rápido decréscimo na viscosida-de de uma pectina derivada de acerola extraída através do tratamento comácido e calor, é considerado que a pectinase contém extremidade de poliga-lacturonase que diva aleatoriamente o interioro da molécula de pectina para imediatamente abaixar o seu peso molecular.

Experimento 3.1 Método para preparar pó de acerola VC30 (produto para 5 comparação)

Porções de semente foram removidas das frutas de acerola produzidas no Brasil. Para aumentar a capacidade de fluxo, as porções de semente foram misturadas com água de troca iônica, O grande conteúdo de sólidos na mistura foi removido usando um filtro de malha de aço e, a seguir,o resultante foi posto em um tanque para tratamento com pectinase. Uma preparação de pectinase de 0,01% (p/p) (pectinase A "Amano," AMANO ENZYME INC.) por 7 Brix conforme medida usando um sacarímetro foi colocada em um tanque durante o aquecimento do tanque a 40eC a 50gC, de forma que foi efetuada de 1 a 2 horas de tratamento enzimático. O produto - de acerola tratado dessa forma foi aquecido após o tratamento enzimático, de forma que a enzima foi desativada. O produto foi esterilizado e, a seguir, submetido à filtração com terra diatomácea, de forma que foi obtido um suco de acerola límpido. O suco de acerola foi concentrado por um método de destilação a vácuo e concentração, preparando dessa forma suco de acerola concentrado.

1400 Kg do suco de acerola concentrado foram diluídos com água purificada, de forma a ajustar o valor do Brix para 31%. 1% em peso de levedura {Saccharomyces cerevisiae) foi adicionado à solução diluída, seguido por 20 horas de fermentação a 309C. Depois da fermentação, centrifu-gação e filtração foram efetuadas para remover glicose e frutose. Dessa forma, 2297 Kg de suco de acerola processado e concentrado foi obtido. 4,0% (p/p) de fibra de dieta (proporção de conteúdo sólido (peso) de fibra de dieta no suco) e 1,5% (p/p) de cálcio de molusco (proporção de conteúdo sólido (peso) de cálcio de molusco em relação ao suco) foram dissolvidos como um excipiente e um agente para processamento no suco de acerola processado e concentrado. A solução obtida dessa forma foi submetida a um método de liofilização, de forma que 806 Kg de um pó deacerola foram obtidos (de agora em diante, o pó de acerola também é referido como "pó de acerola VC30"). O pó de acerola contém 35,0% (p/p) de ácido ascórbico e 1,07% (p/p) de ácido galacturonico. Especificamente, o pó de acerola VC30 contém 3,1% em peso de ácido galacturonico em relação ao ácido ascórbico. Considerando um método de quantificação para o ácido galacturonico, ver a seguinte descrição.

3.2 Método para preparar pó de acerola A (produto da presente invenção)

As sementes foram removidas das frutas de acerola produzidas no Brasil, de forma que foi preparado purê de acerola. Nenhum procedimen-

to para remover o conteúdo sólido do purê de acerola foi efetuado. Dessa forma, a polpa está contida ricamente no purê de acerola. Uma preparação de pectinase a 1% (p/p) (pectinase A "Amano," AMANO ENZYME INC.) foi misturada com 10,8 Kg de purê de acerola (valor de Brix: 8%). A mistura foi aquecida a 50eC por 4 horas. Através do aquecimento do produto tratado, a - enzima foi desativada e foi efetuada a esterilização. O resultante foi separado por centrifugação em conteúdo sólido e em suco de fruta. O suco de fruta foi concentrado por destilação a vácuo, de forma que 3,6 Kg da solução concentrada (valor de Brix: 25,2%) foram coletados. 1% em peso de levedura {Saccharomyces cerevisiaé) foi adicionado à solução concentrada, seguido

por 20 horas de fermentação a 309C. Depois da fermentação, foram efetuadas a centrifugação e a filtração para remover glicose e frutose. Conseqüentemente, 3,3 Kg de suco de acerola processado e concentrado (valor de Brix: 21,5%) foram obtidos. 4,0% (p/p) de fibra de dieta (proporção de conteúdo sólido (peso) de fibra de dieta em relação ao suco) e 1,5% de cálcio de

molusco (proporção de conteúdo sólido (peso) de cálcio de molusco em relação ao suco) foram dissolvidos como um excipiente e um agente para processamento em 2,8 Kg do suco de acerola processado e concentrado. A solução foi submetida a um método de atomização, de forma que aproximadamente 0,5 Kg de um pó de acerola foi obtido (de agora em diante, ele

também pode ser referido como "pó de acerola A"). O pó de acerola contém 29,3% (p/p) de ácido ascórbico e 3,47% (p/p) de ácido galacturonico. Especificamente, o pó de acerola A contém 11,8% em peso de ácido galacturonicoem relação ao ácido ascórbico. Com referência a um método de quantificação para o ácido galacturônico, ver a seguinte descrição. 3.3 Método para quantificação de ácido galacturônico

Ácido galacturônico foi quantificado pelo seguinte método. 20 g de um espécime contendo ácido galacturônico foi dissolvido em 80 g de água purificada que foi adicionada a isso. Depois de o espécime ter se dissolvido suficientemente, 10 g da solução foram pesados e coloca- dos em um tubo de centrífuga de 50 ml_. 40 ml_ de álcool etílico (grau especial, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foram adicionados a e misturados suficientemente com o resultante no tubo (precipitação com etanol). Depois da mistura ser deixada em repouso por 30 minutos ou mais, a centrifugação foi efetuada a 3000 rpm por 20 minutos (209C). Subseqüentemente, o precipitado foi completamente coletado e, a seguir, seco e solidificado usando um liofilizador. O produto seco dessa forma foi dissolvido em água purificada a " 15 0,02%, 0,05%, 0,1%, e 0,2% (p/p), preparando dessa forma soluções para quantificação. A quantidade de ácido galacturônico foi quantificada por um método de 3,5-dimetilfenol. Primeiramente, 125 |iL de cada uma das soluções para quantificação foram colocados em um tubo de teste. Subseqüentemente, 125 jiL de uma solução aquosa de cloreto de sódio a 2% e 2 mL de ácido sulfúrico concentrado (grau especial, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foram, cada um, adicionados às soluçõ.es, seguido por 10 minutos de reação a 702C. Cada resultante foi esfriado em água por 20 ou 30 segundos. 0,1 mL de um reagente corante (preparado pela dissolução de 0,1 g de 3,5-dimetilfenol em 100 mL de ácido acético glacial) foi adicionado ao resultante. 10 minutos mais tarde, absorvância foi medida a 450 nm e 400 nm e, a seguir, a diferença entre os dois foi encontrada. Como uma substância padrão, ácido galacturônico monoidratado (regente de grau especial, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi usado. Baseando-se na curva de calibraçao (12,5 ng/g a 50 ug/g) de substância padrão, a quantidade de ácido galactu- rônico no produto seco foi calculada. Com o uso do valor calculado dessa forma e do peso do produto seco obtido de 2 g de um espécime através da precipitação com etanol e secagem, o conteúdo de ácido galacturônico noespécime foi calculado. Tabela 22 mostra os resultados de quantificação. Além disso, os precipitados de etanol obtidos nessa quantificação também continham fibra de dieta que foi usada como um excipiente.

Tabela 22

<table>table see original document page 81</column></row><table>

3.4 Teste de branqueamento de pele

O efeito da supressão da pigmentação depois da irradiação com UV foi examinado usando porquinho-da-índia marrons (SPF). Os porqui-nhos-da-índia marrons são de uma espécie animal que sofre pigmentação devido à irradiação UV de uma forma similar aos seres humanos e de uma linhagem que foi claramente mantida. Seis porquinhos-da-índia foram usados para cada grupo nesse teste. Para promover a pigmentação, irradiação UV (UVB) foi efetuada a partir de uma distância de 40 cm usando cinco lâmpadas SE (comprimento de onda entre 250 nm e 350 nm, FL20SE, TOSHI- BA Corporation) instaladas em um aparelho de radiação UV (Y-798-II, Orion Electric Co., Ltd.). O tempo mais curto necessário para aparecer o eritema na pele devido à radiação UV foi medido em um teste preliminar e descobriu-se ser de 12 minutos e 30 segundos. Esse tempo foi designado o tempo para a irradiação UV nesse teste. Cada sítio de irradiação foi de uma áreaquadrada de 2 cm x 2 cm localizada ou na esquerda ou na direita através da linha mediana do dorso de um porquinho-da-índia que foi tosquiado usando tosquiadores elétricos e, a seguir, raspado usando um barbeador elétrico. A irradiação UV foi efetuada 3 vezes no total, incluindo no dia da administração inicial (designado dia 0) e nos dias 2 e 4 depois da administração inicial.Uma substância de teste foi administrada através da administração oral (u-sando um cateter) de uma solução de cada substância de teste, a qual foi preparada de forma que a dose do ácido ascórbico foi de 300 mg/Kg do peso de animal/dia. Especificamente, o experimento foi conduzido usando quantidades iguais de ácido ascórbico. Como branco, água para injeção (OTSUKA Pharmaceutical Co., Ltd.) foi administrada. Como substâncias de teste, o pó de acerola VC30 (831 mg/5 mL) que foi o produto para comparação, o pó de acerola A (1024 mg/5 mL) que foi o produto da presente invenção, e ácido ascórbico (reagente de grau especial, Wako Pure Chemical In-

dustries, Ltd.) (300 mg/5 mL) foram usados. A administração oral foi efetuada por 42 dias. A pigmentação foi medida como se segue. Antes da administração inicial (antes da irradiação) no dia do início da administração e nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42 depois da administração inicial, o valor L (claridade) dos sítios irradiados foram medidos usando um colorímetro (CR-300, - Minolta Co., Ltd.) e, a seguir, o valor AL (valor de L no dia da observação -valor de L antes da irradiação) foi encontrado. Um total de 5 locais de medições usados aqui incluem o centro e 4 cantos localizados diametralmente opostos uns em relação aos outros em cada local de irradiação. Seu valor médio foi designado como valor L de cada porquinho-da-índia individual. É

indicado que quanto mais alto for o valor AL, mais forte é o nível de pigmentação. Figura 21 mostra os resultados do teste. O eixo vertical indica o valor de AL e o eixo horizontal indica os dias após o início do teste. Cada valor de medição é o valor médio dos valores AL de 6 porquinhos-da-índia de um grupo.

Como resultado, no caso do grupo ao qual o pó de acerola VC30

(o produto para comparação) foi administrado, um decréscimo no valor de AL foi descoberto como sendo significativamente suprimido em cada ponto de tempo de observação, em comparação com o grupo ao qual água para injeção foi administrada. Especificamente, o efeito da supressão da pigmen-

tação foi exercido. Nos casos do grupo ao qual pó de acerola VC30 (o produto para comparação) foi administrado e o grupo (controle positivo) ao qual ácido ascórbico foi administrado, os valores das medições foram quase osmesmos. Conseqüentemente, foi inferido que o feito do pó de acerola VC30 para suprimir a pigmentação é devido ao ácido ascorbico contido ali.

Por outro lado, os valores de AL no caso do grupo ao qual o pó de acerola A (o produto da presente invenção) foi administrado foram meno- res do que os valores de AL no caso do grupo ao qual ácido ascorbico foi administrado em todos os dias de observação. Concordantemente, foi sugerido que o pó de acerola A (o produto da presente invenção) tem um componente que promove o efeito do ácido ascorbico de suprimir a pigmentação que não está contida no produto para comparação (pó de acerola VC30).

Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes aqui cita-dos são incorporados aqui por referência na sua totalidade.

Claims

1. Pectina derivada de uma fruta de acerola ou um hidrolisado da mesma, compreendendo um complexo formado de uma estrutura de pectina e de um composto de polifenol representado pela fórmula química:

2. Método para produzir a pectina, como definida na reivindicação 1, compreendendo a etapa de isolar ou concentrar a pectina de uma fruta de acerola ou um produto processado da mesma.

3. Método para produzir o hidrolisado de pectina, como definido na reivindicação 1, compreendendo uma etapa de isolar ou concentrar uma pectina de uma fruta de acerola ou um produto processado da mesma e uma etapa de hidrolisar a pectina.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, compreendendo uma etapa de hidrolisar uma pectina em purê preparada a partir de uma fruta de acerola através do tratamento do purê com pectinase e uma etapa de isolar ou concentrar a pectina hidrolisada de um sobrenadante do produto processado na etapa anterior.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 4, em que a etapa de isolar ou concentrar a pectina é uma etapa de preci- pitar a pectina usando etanol.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 4, em que a etapa de isolar ou concentrar a pectina é uma etapa de isolar ou concentrar a pectina usando uma membrana de separação.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que a membra- na de separação é uma membrana de ultrafiltração.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que a membrana de ultrafiltração tem um peso molecular de corte variando de 10.000 a 100.000.

9. Material contendo pectina derivada de uma fruta de acerola, a qual é produzida por um método compreendendo a etapa de isolar ou concentrar uma pectina a partir da fruta de acerola ou de um produto processado da mesma.

10. Material contendo um hidrolisado de uma pectina derivadode uma fruta de acerola, o qual é produzido por um método compreendendo uma etapa de isolamento ou concentração da pectina a partir da fruta de acerola ou um produto processado da mesma e uma etapa de hidrolisar a pectina.

11. Material, de acordo com a reivindicação 10, o qual é produ-zido por um método compreendendo a etapa de hidrolisar uma pectina em purê preparada a partir da fruta de acerola através do tratamento do purê com pectinase e a etapa de isolar ou concentrar a pectina hidrolisada do so-brenadante do produto processado resultante da etapa anterior.

12. Material, de acordo com qualquer uma das reivindicações de9 a 11, em que a etapa de isolar ou concentrar pectina é uma etapa de precipitar uma pectina usando etanol.

13. Material, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 11, em que a etapa de isolar ou concentrar pectina é uma etapa de isolar ou concentrar uma pectina usando uma membrana de separação.

14. Material, de acordo com a reivindicação 13, em que a membrana de separação é uma membrana de ultrafiltração.

15. Material, de acordo com a reivindicação 14, em que a membrana de ultrafiltração tem um peso molecular de corte variando de 10.000 a25 100.000.

16. Antioxidante, contendo a pectina ou o hidrolisado da mesma, como definido na reivindicação 1, como um ingrediente ativo.

17. Antioxidante, contendo o material como definido em qualquer uma das reivindicações de 9 a 15, como um ingrediente ativo.

18. Antioxidante para lipídeos, contendo um produto processadode uma fruta de acerola (excluindo um produto processado de uma semente de acerola) como um ingrediente ativo.

19. Antioxidante, de acordo com a reivindicação 18, em que o produto processado de uma fruta de acerola contém polifenol e/ou ácido as-córbico.

20. Produto alimentício, como um efeito antioxidativo, ao qual o antioxidante, como definido em qualquer uma das reivindicações de 16 a 19 é adicionado.

21. Método para produzir um produto alimentício, compreendendo uma etapa de aumentar a estabilidade à oxidação de um produto alimentício usando um antioxidante, como definido em qualquer uma das reivindi- cações de 16 a 19.

22. Agente branqueador da pele para administração oral, contendo a pectina ou o seu hidrolisado como definida na reivindicação 1 como um ingrediente ativo.

23. Agente branqueador de pele para administração oral, con-- 15 tendo o material como definido em qualquer uma das reivindicações de 9 a como um ingrediente ativo.

24. Agente branqueador de pele para administração oral, de a-cordo com a reivindicação 22 ou com a reivindicação 23, contendo ainda ácido ascórbico.

25. Produto alimentício com um efeito de branqueamento de pe- le, ao qual o agente branqueador de pele para administração oral como definido em qualquer uma das reivindicações de 22 a 24 é adicionado.

26. Método para produzir um agente branqueador de pele para administração oral, compreendendo uma etapa de hidrolisar uma pectina contida na polpa de uma fruta de acerola ou de um produto processado de uma fruta de acerola contendo ácido ascóbrico e tal polpa, de forma que a quantidade de ácido galacturônico é de 5% em peso ou mais em relação ao ácido ascórbico.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, compreendendo 30 ainda uma etapa de remover substancialmente glicose e frutose.