JP2012036106A - バイオフィルム形成抑制剤 - Google Patents

Abstract

【課題】安全かつ効果的に細菌のバイオフィルム形成を抑制する。
【解決手段】アッサム茶抽出物を含む細菌のバイオフィルム形成抑制剤。
【選択図】図１

Description

本発明は、アッサム茶抽出物を含むバイオフィルム形成抑制剤に関する。

バイオフィルムとは、多糖類に保護された多様な細菌群の集落である。物質の表面に付着した細菌が非水溶性グルカン等の多糖類を産生してマイクロコロニーを形成し、マイクロコロニー中で多様な細菌群が繁殖して、バイオフィルムを形成する。

バイオフィルムの代表的なものは、湿度の高い浴室、台所、洗面所等の水周りで発生するヌメリや、歯周病関連細菌が口腔内に形成するプラーク等である。いずれも衛生上の問題や健康上の問題を引き起こす。

一旦バイオフィルムが形成されると、通常の状態にある細菌よりも洗剤や熱処理への耐性が強固になることが知られており、通常の洗浄や殺菌方法ではその効果が十分発揮できないことが多い。発生したバイオフィルムを除去するための方法として、例えば特許文献１では次亜塩素酸アルカリ金属塩、アルカリ金属水酸化物、界面活性剤を混合したバイオフィルム処理剤が提案されている。しかし、このようなバイオフィルム処理剤は作用の強い薬品を用いており、その取扱いは注意を要する。さらに、これらの薬品は口腔内に使用することは出来ない。

一旦形成されたバイオフィルムを除去することは困難であることから、バイオフィルムの形成を抑制することがより重要となる。このため、種々のバイオフィルム抑制剤が提案されている。例えば特許文献２では、カリオフィレン、リナロール、リモネン等の精油成分を用いたバイオフィルム抑制剤が開示されている。しかしながら、これらの精油成分は香りが強く、使用態様が限定される。

人体への影響を考慮し、様々な植物性原料が検討されてきたが、特に茶抽出物についてはその抗菌活性が見出されて以降様々な方面で利用されている。例えば、特許文献３では、カテキン類を使用したバイオフィルム形成抑制剤が開示されている。また、特許文献４では、カテキン類の中でもエピガロカテキンガレートを使用したバイオフィルム抑制剤が開示されている。

茶カテキン類を利用したバイオフィルム形成抑制剤は開示されているが、より効果が高く、簡便に利用できるバイオフィルム形成剤がいまだに求められている。

特開２００５−７５８７３号公報 特開２００７−９１７０６号公報 特開２００６−１４１７９４号公報 特開２００８−１３４５８号公報

本発明は、安全かつ効果的に、しかも簡便にバイオフィルム形成を抑制することを目的とする。

本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ね、アッサム茶の抽出物を用いた場合に上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は：
（１）アッサム茶抽出物を有効成分として含む、細菌のバイオフィルム形成抑制剤、
（２）アッサム茶抽出物が分子量１０，０００未満の画分である（１）のバイオフィルム形成抑制剤、
（３）アッサム茶抽出物が分子量１０，０００未満の画分を疎水性クロマトグラフィーに供した際の非吸着画分である、（２）のバイオフィルム形成抑制剤、
（４）アッサム茶抽出物が分子量１０，０００未満の画分を疎水性クロマトグラフィーに供した際に、３０％（ｖ／ｖ）以下の濃度のメタノールにて疎水性クロマトグラフィー担体から溶出されたものである、（２）のバイオフィルム形成抑制剤、
（５）歯磨き、洗口剤またはガムである（１）〜（４）のいずれか１のバイオフィルム形成抑制剤、
（６）洗剤である（１）〜（４）のいずれか１のバイオフィルム形成抑制剤、
（７）アッサム茶抽出物を用いることを特徴とする、細菌のバイオフィルム形成の抑制方法、
を提供する。

本発明によれば、安全かつ効果的なバイオフィルム形成抑制剤が得られる。また、本発明はアッサム茶を利用することにより、高度な精製を加えずとも十分なバイオフィルム形成抑制効果を得ることができるため、バイオフィルム形成抑制剤を安価で提供することが出来るという効果も有する。さらに、本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、高いバイオフィルム形成抑制作用を有し、少量でも効果が得られる。このため、茶由来のカテキン類の抗菌性による口腔常在菌のバランスへの悪影響を考慮しなくてもよいという効果も有する。

図１は、アッサム茶抽出物および緑茶抽出物が各濃度においてＳ．ｍｕｔａｎｓによるバイオフィルム形成に及ぼす影響を表すグラフである。 図２は、アッサム茶抽出物の全体、分子量１０，０００以上の画分、分子量１０，０００未満の画分が各濃度においてＳ．ｍｕｔａｎｓによるバイオフィルム形成に及ぼす影響を表すグラフである。 図３は、アッサム茶抽出物の分子量分画、疎水性クロマトグラフィー後の各画分がＳ．ｍｕｔａｎｓによるバイオフィルム形成に及ぼす影響を表すグラフである。

本発明におけるアッサム茶は、アッサム種系の茶樹から得られた茶葉や茎を意味し、その形状は問わない。アッサム種系とは、アッサム種（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ． ａｓｓａｍｉｃａ）はもちろん、アッサム種に他の種を交配したアッサム雑種も含む。アッサム種系は、アジア、アフリカ等の熱帯・亜熱帯地域の低地で主に栽培され、または自生している品種とされているが、本発明におけるアッサム茶の産地はこれに限定されるものではない。産地の例としては、インド、スリランカ、インドネシア、ケニア、日本等が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、本発明のアッサム茶は、非発酵または酸化発酵が行われたもの、あるいは加熱処理が行われたもの、またはこれらと実質的に同等の効果が得られる処理を経て製造されたものを含む。

本発明における茶抽出物は、上記の茶から当業者によって通常用いられる方法によって得ることができる。特に限定されるものではないが、例えば、上記茶をそのまま、または液体窒素下で粉砕し、溶媒抽出した後、ろ過し、濃縮、乾燥する等の方法が挙げられる。

抽出に使用する溶媒としては、特に限定されるものではないが、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、ヘキサンなどの有機溶媒、あるいはそれらの混合物が挙げられる。抽出溶媒の温度は特に限定されず、熱水を用いてもよい。有機溶媒の例としては、酢酸エチルが挙げられる。抽出比率は、特に限定されるものではないが、通常、茶９ｇに対して水３５０ｇである。抽出温度、時間は、特に限定されるものではないが、通常８５〜１００℃、１０〜３０分間である。

抽出物はそのままバイオフィルム抑制剤として用いてもよいが、好ましくは分子量１０，０００未満の画分を用いる。分子量分画方法としては、特に限定されるものではないが、膜分離またはゲルろ過等の方法が挙げられる。

好ましくは、分子量１０，０００未満の画分を疎水性クロマトグラフィーに供した非吸着画分をバイオフィルム抑制剤として用いる。疎水性クロマトグラフィー担体としては、スチレン−ジビニルベンゼン系、メタクリル酸エステル系、スチレン系、アクリル系、ビニルポリマー系などの合成吸着剤が挙げられる。

より好ましくは、分子量１０，０００未満の画分を疎水性クロマトグラフィーに供した吸着画分をバイオフィルム抑制剤として用いる。さらに好ましくは、疎水性クロマトグラフィー担体からの溶出を３０％（ｖ／ｖ）以下の濃度のメタノール、より好ましくは１０〜３０％（ｖ／ｖ）メタノールで行った吸着画分をバイオフィルム形成抑制剤として用いる。

得られた抽出液は、抽出溶媒が安全なものであれば、そのままで本発明のバイオフィルム形成抑制剤に用いることができる。また、必要に応じて常法により精製することもできる。該精製方法としては、例えば、各種クロマトグラフィー、イオン交換、膜分離等の分離精製等が挙げられる。抽出液中に残渣や微粒子が存在する場合には、ろ過、遠心分離等により、これらを除去することができる。

さらに、必要に応じて抽出物を濃縮して用いてもよい。抽出液の濃縮は、常法により行えばよく、例えば、エバポレーター等を用いて行うことができる。抽出液の乾燥は、常法により行えばよく、例えば凍結乾燥等により行うことができる。

かくして得られた本発明のバイオフィルム抑制剤は、安全かつ効果的にバイオフィルム形成を抑制することができる。

本発明のバイオフィルム形成抑制剤の形態は特に限定されず、目的に応じて様々な形状をとり得る。例えば、液体、ゼリー状、粉末、顆粒、フォーム剤のような形状とすることができる。作用させる箇所に長くとどめるために、粘度を持たせた液体とすることもできる。また、液体の場合、噴霧しやすいようにスプレー容器に充填して提供することもできる。

また、特に限定されるものではないが、本発明のバイオフィルム抑制剤を、例えば歯磨き、洗口剤、ガム等の口腔用組成物および排水管洗浄用などの洗剤等に添加して使用することもできる。また、既存のバイオフィルム処理剤に混合して、処理剤にバイオフィルム形成抑制効果を持たせることもできる。

他の態様において、本発明はアッサム茶抽出物を用いるバイオフィルム形成抑制方法を提供する。

本態様で用いるアッサム茶抽出物は分子量１０，０００未満の画分であることが好ましい。さらに好ましくは、この分子量１０，０００未満の画分をさらに疎水性クロマトグラフィーに供した際の、非吸着画分、または３０％（ｖ／ｖ）以下のメタノールで溶出された画分であることが好ましい。さらにより好ましくは、１０〜３０％（ｖ／ｖ）のメタノールで溶出された画分であることが好ましい。

本発明のバイオフィルム形成の抑制方法は、上記のアッサム茶抽出物を、目的とする箇所に作用させることを特徴とする。作用形態は特に限定されるものではないが、アッサム茶抽出物を目的の箇所に塗布、噴霧、散布することが例示される。アッサム茶抽出物は、目的に応じて液体、ゼリー状、粉末、顆粒、フォーム剤のような形状とすることができるがその形状は特に限定されるものではない。

以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、各実施例は本発明を限定するものではない。

試料として、アッサム茶葉、比較として一般的な緑茶葉を用意した。本実施例のアッサム茶葉は、人為的な酸化発酵を行っていないものを使用した。各茶葉の成分分析値を表１に示す。

茶抽出物の調製
熱湯３５０ｍｌ中にアッサム茶、緑茶各９ｇを投入し、撹拌下で１０分間加熱、加熱を止め２０分間静置して抽出し、ろ紙ろ過によって得られた抽出液をそれぞれ試料Ａ、Ｂとした。

バイオフィルム形成に対する影響の測定
試料ＡおよびＢについて、う蝕原性細菌によるバイオフィルム形成に及ぼす影響を測定した。
う蝕原性細菌としてストレプトコッカスミュータンスＭＴ８１４８（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＭＴ８１４８）を供試菌株とした。各試料について濃度０．６３〜１０％（ｖ／ｖ）で添加し、試験を行った。バイオフィルム形成量は、ポリスチレン製９６穴プレートのウェル内壁への付着性によって評価した。
以下の方法で測定を行った。
（ａ）ＢＨＩ液体培地に供試菌株を接種し、嫌気下で３７℃、１晩培養した。
（ｂ）ＰＢＳ緩衝液にて培地を洗浄後、培地のＡ_５５０を０．５に調製した。
（ｃ）ポリスチレン製９６穴プレートの各ウェルに各濃度の茶葉抽出物を添加し、（ｂ）で調製した培地をウェルあたり２０μｌ、ＴＳＢ ｗ／ｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ＋０．２５％ｓｕｃｒｏｓｅをウェルあたり１６０μｌ加えた。
（ｅ）植菌したプレートを嫌気下で３７℃１６時間培養した。
（ｆ）培養後のウェルから培養液を除去し、ＰＢＳ緩衝液にてウェルを洗浄した。
（ｇ）サフラニン溶液にて１５分間ウェル内を染色した。
（ｈ）付着した色素を７０％エタノールにより３０分間抽出した。
（ｉ）抽出溶液のＡ_４９２をもってバイオフィルム形成量とした。

測定の結果、試料Ｂはバイオフィルム抑制効果をほとんど示さず、試料Ａは濃度依存的にバイオフィルム形成抑制を示した（図１）。

分子量分画後のアッサム茶抽出物がバイオフィルム形成に与える影響の測定
試料Ａを分子量１０，０００未満の画分および１０，０００以上の画分に分画し、それぞれがバイオフィルム形成に及ぼす影響を測定した。分子量分画はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １０，０００ＮＭＷＬおよび５０，０００ＮＭＷＬを用いた。遠心分離を５，０００×ｇ、３７℃の条件で、濃縮画分が３００μｌ以下になるまで行った。この操作により、各試料を１０ｋＤａ未満画分、１０〜５０ｋＤａ画分および５０ｋＤａ以上画分に分離した。１０〜５０ｋＤａおよび＞５０ｋＤａ画分は混合し、１０ｋＤａ以上画分として使用した。
各画分について、濃度０．１６〜５．００％（ｖ／ｖ）で添加し、実施例１と同様の方法でバイオフィルム形成量を測定した。

測定の結果、試料Ａの分子量１０，０００未満の画分にバイオフィルム形成抑制活性が認められた（図２）。試料Ａの、分子量１０，０００未満の画分を０．６３％（ｖ／ｖ）以上添加した場合にバイオフィルム形成をほぼ抑制することが示された。アッサム茶抽出物の分子量１０，０００未満の画分に強力なバイオフィルム抑制活性が認められた。

アッサム茶の分子量分画後の疎水性クロマトグラフィーによって得られた画分がバイオフィルム形成に与える影響の測定
試料Ａの分子量分画は実施例３と同様の方法で行った。分子量１０，０００未満の画分を疎水性クロマトグラフィーに供した。担体としてＯＤＳカラム（ナカライテスク社製、コスモシール７５Ｃ_１８−ＯＰＮ）を使用し、単体１ｇ当り試料Ａの分子量１０，０００未満の画分５ｍｌを吸着処理した。そのまま流出したものをＦｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈサンプルとし、続いて、１０、３０、５０、７０、１００％（ｖ／ｖ）メタノールで各々５ｍｌずつ溶出した。各溶出サンプルを溶媒留去し、原液濃度に調製した後、０．２μｍフィルターでろ過除菌した。各サンプルについて、実施例２と同様の方法でバイオフィルム形成量を測定した。

測定の結果、Ｆｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ、１０％（ｖ／ｖ）および３０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶出画分にバイオフィルム形成抑制効果が認められた（図３）。

本発明によるバイオフィルム形成抑制剤を配合した歯磨きの処方を表２に示す。

本発明によるバイオフィルム形成抑制剤を配合した洗口剤の処方を表３に示す。

本発明によるバイオフィルム形成抑制剤を配合したガムの処方を表４に示す。

本発明によるバイオフィルム形成抑制剤を洗剤に配合した処方を表５に示す。

本発明は、口腔ケアの分野、洗剤の分野、衛生産業の分野等に利用することができる。

Claims (7)

1. アッサム茶抽出物を有効成分として含む、細菌のバイオフィルム形成抑制剤。
2. アッサム茶抽出物が分子量１０，０００未満の画分である請求項１記載のバイオフィルム形成抑制剤。
3. アッサム茶抽出物が分子量１０，０００未満の画分を疎水性クロマトグラフィーに供した際の非吸着画分である、請求項２記載のバイオフィルム形成抑制剤。
4. アッサム茶抽出物が分子量１０，０００未満の画分を疎水性クロマトグラフィーに供した際に、３０％（ｖ／ｖ）以下の濃度のメタノールにて疎水性クロマトグラフィー担体から溶出されたものである、請求項２記載のバイオフィルム形成抑制剤。
5. 歯磨き、洗口剤またはガムである請求項１〜４のいずれか１項記載のバイオフィルム形成抑制剤。
6. 洗剤である請求項１〜４のいずれか１項記載のバイオフィルム形成抑制剤。
7. アッサム茶抽出物を用いることを特徴とする、細菌のバイオフィルム形成の抑制方法。

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