JP2010143832A - リパーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

【課題】
本発明の目的は、茶由来の成分を含む、安全で香味を損なうことのないリパーゼ阻害剤、および該リパーゼ阻害剤を含む飲食料および医薬組成物を提供することである。
【解決手段】
高いリパーゼ阻害活性を有する（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含むリパーゼ阻害剤を飲食料や医薬組成物に添加することにより、安全で嗜好性の高い飲食料や医薬組成物を提供することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含むリパーゼ阻害剤に関する。

肥満は現代社会における最も重大な疾患の１つであるが、その主たる要因は脂肪の過剰摂取である。また、脂肪の過剰摂取は、肥満のみならず、肥満に起因する糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化等を発症させることが知られている。内蔵脂肪型肥満に加えて、高血糖・高血圧・脂質異常のうちいずれか２つ以上をあわせもった状態は、メタボリックシンドローム（内臓脂肪症候群）と呼ばれ、心臓病や脳卒中を発症する危険性が高いため、近年問題視されている。肥満に対する治療薬として、国内では、食欲抑制剤のマジンドール（登録商標）が唯一承認されているが、口渇、便秘、胃部不快感、悪心・嘔吐等の副作用が報告されている（臨床評価 1985;13(2):419-459、臨床評価 1985;13(2):461-515）。また、海外においては、リパーゼ阻害活性により腸管からの脂肪吸収の抑制作用を持つゼニカル（登録商標）が肥満改善薬として市販されているが、やはり脂肪便、排便数の増加、軟便、下痢、腹痛等の副作用が報告され、必ずしも安全とは言いがたい（Lancet 1998;352:67-172）。

肥満を予防するためには、食事制限により摂取カロリーを減らすことが有効な手段ではあるものの、しっかりとした栄養指導を受けなければならず、日常生活においての実行は困難である場合が多い。そこで、食事由来の脂肪が体内に吸収されることを安全かつ健康的に抑制することは、肥満及びそれに関連する疾患の治療あるいは健康増進の目的で、現実的で有用な方策であると考えられる。

このような背景のもと、安全でかつヒトに対する有効性が証明されている特定保健用食品の開発が注目されている。今までに食後の血清中性脂肪値の上昇を抑える食品素材としては、膵リパーゼ阻害により脂肪吸収を抑制するグロビン蛋白分解物（J. Nutr. 1988;128:56-60、日本臨床・食糧学会誌 1999;52(2):71-77、健康・栄養食品研究 2002;5(3):131-144）、トリアシルグリセロールとは異なる消化吸収特性を持つジアシルグリセロール（J. Am. Coll. Nutr. 2000;19(6):789-796、Clin. Chim. Acta. 2001;11(2):109-117）、魚油より精製されたエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などが特定保健用食品として発売されている。

また、植物由来のリパーゼ阻害活性物質も最近注目されつつあり、特に、リパーゼ阻害活性を有するポリフェノール類に関しては、植物樹皮由来のタンニン（特公昭６０−１１９１２）、マメ科植物カワラケツメイに含まれるタンニン類やフラボノイド類およびその配糖体（特開平８−２５９５５７）、緑茶中の主要な成分エピガロカテキンガレートおよびエピカテキンガレートを配合した脂質吸収抑制食品（特開平３−２２８６６４）、ピーマン、シメジ、かぼちゃ、まいたけ、ひじき、緑茶、ウーロン茶、などの水抽出物からなるリパーゼ阻害剤（特開平３−２１９８７２）、フラボンおよびフラボノール類（特開平７−６１９２７）、ヒドロキシ安息香酸類（没食子酸）（特開平１−１０２０２２）、トリテルペン類化合物およびその誘導体（特開平９−４０６８９）、タマリンドのプロシアニジンを有効成分とする抗肥満剤（特開平９−２９１０３９）などが報告されており、またブドウ種子抽出物のリパーゼ阻害作用（Nutrition 2003;19(10):876-879）、サラシア由来ポリフェノールによるリパーゼ阻害作用とラットの抗肥満作用（J. Nutr. 2002;132:1819-1824）、ウーロン茶抽出物によるマウスの抗肥満作用（Int. J. Obes. 1999;23:98-105）などが知られている。また、茶にはカテキン類が多く含まれ、その成分が多く分離・同定されており（日本食品科学工業会誌第４６巻、第３号、１３８〜１４７頁、１９９９年３月）、茶由来の成分を含むリパーゼ阻害剤（ＷＯ２００５／０７７３８４、ＷＯ２００６／００４１１０）に関する報告がある。

また、ウーロン茶に関して、脂質低下効果を示した報告がある。例えば、市販ウーロン茶を１日１３３０ｍｌずつ６週間飲用させ、血中中性脂肪値の有意な低下が認められたとの報告（日本栄養・食糧学会誌 1991;44(4):251-259）や、単純性肥満症の男女１０２名を対照に、ウーロン茶（２ｇ×４／日）を６週間連続経口摂取させた結果、６７％の被験者に１ｋｇ以上の体重減少が認められ、さらに血中中性脂肪値が高値を示した被験者においてウーロン茶摂取後に有意な改善効果が認められたとの報告（日本臨床栄養学会雑誌 1998;20(1):83-90）がある。
特公昭６０−１１９１２ 特開平８−２５９５５７ 特開平３−２２８６６４ 特開平３−２１９８７２ 特開平７−６１９２７ 特開平１−１０２０２２ 特開平９−４０６８９ 特開平９−２９１０３９ ＷＯ２００５／０７７３８４ ＷＯ２００６／００４１１０ 臨床評価 1985;13(2):419-459、臨床評価 1985;13(2):461-515 Ｌａｎｃｅｔ １９９８；３５２：６７−１７２ Ｊ． Ｎｕｔｒ． １９８８；１２８：５６−６０ 日本臨床・食糧学会誌 １９９９；５２（２）：７１−７７ 健康・栄養食品研究 ２００２；５（３）：１３１−１４４ J. Am. Coll. Nutr. 2000;19(6):789-796 Clin. Chim. Acta. 2001;11(2):109-117 Nutrition 2003;19(10):876-879 J. Nutr. 2002;132:1819-1824 Int. J. Obes. 1999;23:98-105 日本食品科学工業会誌第４６巻、第３号、１３８〜１４７頁、１９９９年３月 日本栄養・食糧学会誌 1991;44(4):251-259 日本臨床栄養学会雑誌 1998;20(1):83-90

ある植物の抽出物で効果があったとしても、その中に含まれる活性成分量を明確にしない限り、天然物が起源であるので、安定的にリパーゼ阻害活性を維持させることは困難である。また、上記に示した既報のリパーゼ阻害剤は、効果が十分でないものもある。

また、嗜好性の低い植物由来のリパーゼ阻害剤は、飲食物として利用すると香味に悪影響を及ぼすことが予想される。一方、嗜好性の高い茶に起源を発するリパーゼ阻害剤は有効な素材候補となり得るが、たとえば嗜好性の高いウーロン茶を飲用して脂質低下を図るとしても、大量に飲用しなければ効果が得られず、日常生活の中で行うことは現実的でない。

したがって、本発明の目的は、茶由来の嗜好性の高い、膵リパーゼに対して高い阻害活性を示し、食事由来の脂肪吸収を抑制し、および／または肥満の抑制や予防に寄与するリパーゼ活性阻害剤を提供することである。

また本発明の目的は、嗜好性が高くて、かつ血中の中性脂肪低減、健康増進を目的とした飲食料を提供することである。

さらに本発明の目的は、食事由来の脂肪の吸収を抑制し、血中中性脂肪の上昇を抑える医薬組成物を提供することである。

上記課題を解決する手段として、茶より脂肪吸収に必須な膵リパーゼを強力に阻害する成分を見出した。茶葉中に存在する種々のポリフェノールのリパーゼ阻害活性を評価し、（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートに強いリパーゼ阻害活性があることを突き止め、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、次式：

で表される（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含むリパーゼ阻害剤に関する。

また本発明は、（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含む、食事由来の脂肪の吸収を抑制するためのリパーゼ阻害剤に関する。

さらに本発明は、（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含むリパーゼ阻害剤を添加した飲食料に関する。

また本発明は、（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含むリパーゼ阻害剤を添加した、茶飲料、清涼飲料および健康食品からなる群から選択される飲食料に関する。

さらに、本発明は、（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含むリパーゼ阻害剤を含有する医薬組成物に関する。

さらに、本発明は、（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含む、食事由来の脂肪の吸収を抑制するための医薬組成物に関する。

本発明は、茶葉に由来する（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含むリパーゼ阻害剤を添加し、香味を損なうことなく、嗜好性が高くて、かつ中性脂肪低減、健康増進を目的とした飲食料を提供できる。食事性脂肪の吸収を抑えるためには、食事と共に摂取することが望ましく、茶から得られた有効成分を強化した飲料は意義が大きい。特に、これらの成分を増強することにより、抗肥満作用、健康増進を目的とした飲料の提供が可能になった。

また、本発明は、食経験の豊富な茶由来の成分である（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含む、安全性が高く、副作用の低減された医薬組成物をも提供することができる。

リパーゼ阻害剤
本発明は、（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含むリパーゼ阻害剤である。

本発明のリパーゼ阻害剤の有効成分である（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートは、化学合成によっても、緑茶、紅茶、ウーロン茶等の天然材料から溶媒抽出して得ることができる。抽出原料の天然材料は、茶葉をそのまま用いてもよいし、粉砕して用いてもよい。抽出に用いる溶媒は、水、有機溶媒、またはこれらの混合物などを用いることができるが、熱水が好ましい。得られた抽出液は、適切な分離用担体を用いて、分離・精製することができる。分離用担体としては、（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを吸着し、適切な分離用溶媒によって分離することができるものであれば、いずれをも用いることができる。例えば、スチレン系の合成吸着剤を用いて分離・精製することができる。このような分離用担体に上記の抽出液を負荷したのち、適切な溶媒を用いて、（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを分離する。より具体的には、本明細書の実施例１の記載に従って、（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを得ることができる。このようにして得られた（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートは、濃縮して用いてもよく、また、凍結乾燥等の方法によって粉末として用いてもよい。

本発明のリパーゼ阻害剤は、リパーゼ、特に膵リパーゼに対する強い阻害作用を有する。リパーゼ阻害活性の測定は、背景技術に示した先行出願に記載されているいずれのリパーゼ活性評価法によっても行われることができる。例えば、蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステルを基質として使用し、リパーゼによる反応で生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより評価することができる。例示的には、実施例３に記載の方法にて本発明のリパーゼ阻害活性を測定できる。リパーゼ阻害活性は、例えば５０％の阻害を与える試料量ＩＣ_５０として表すことができる。

（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートの精製品または粗精製品は、単独でリパーゼ阻害剤として使用することもでき、または溶媒や担体とともにリパーゼ阻害剤として使用することが可能である。溶媒または担体は、下記飲食料および／または医薬品としての使用を考えて、食品としてまたは医薬品として安全に使用できるものであることが好ましい。本発明のリパーゼ阻害剤は種々の用途を有し、例えば試験研究用、中性脂肪の蓄積を予防するための食品、医薬品の有効成分としての使用が例示される。
リパーゼ阻害剤含有飲食料
本発明の（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含むリパーゼ阻害剤または濃縮物を、リパーゼ阻害活性成分として飲食料に添加して、食事からの脂肪分の摂取に伴う血中中性脂肪の望ましくない上昇を防止し、および／または上昇した血中中性脂肪を低減させる飲食料を調製することができる。飲食料の好ましい例は、日常的に摂取する飲食料、例えば、緑茶、麦茶、ウーロン茶、紅茶、コーヒー、スポーツドリンク、飲料水、調味料、ドレッシングである。しかし飲食料は通常食するものであればよく、清涼飲料、カクテル、ビール、ウイスキー、焼酎、ワイン、清酒、調味料、ドレッシング、味付け米、加工食品、インスタント食品、レトルト食品、チョコレート、生クリーム、洋菓子、乳製品、健康食品、サプリメント等であってもよい。

飲食料に対する本発明のリパーゼ阻害剤の添加量は、１食あたりの（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートの摂取量が０．０１ｍｇ〜１０ｇとなるように添加するが、０．１ｍｇ〜５ｇとなるよう添加するのが好ましい。ただし、本発明の（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含むリパーゼ阻害剤は食品に由来するため、安全性が非常に高く、飲食料に対する添加量に実質的上限はない。
リパーゼ活性阻害剤含有医薬品
本発明の（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含むリパーゼ阻害剤は、食事由来の脂肪の吸収を抑制し、血中中性脂肪の望ましくない上昇を防止および／または低下させるための薬剤の有効成分としても使用できる。好ましい薬剤は、経口投与される薬剤であり、その例として、ドリンク剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、キャンデー、ドロップ剤等があげられる。薬剤に含まれる本発明の化合物の量は、１回服用量当たり、０．０１ｍｇ〜１０ｇであり、好ましくは０．１ｍｇ〜５ｇである。

本発明の医薬品は、リパーゼ活性阻害成分の安全性が高いため、長期間にわたって服用しても安全である。したがって、生活習慣病としての肥満の防止または解消のために、日常的に服用することも可能である。

以下に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらによって何ら制限されるものではない。
＜実施例１ （−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートの抽出＞
アッサムファニングス種紅茶（Camellia sinensic）の葉（乾燥物）１００ｇを２５００ｍｌの熱水（９０℃）で２０分間抽出し凍結乾燥した。凍結乾燥粉末３０ｇを２５０ｍｌの２０％アセトニトリルに溶解し水で３倍希釈し、吸着樹脂ＣＨＰ−２０Ｐカラム（１０００ｍｌ、７５−１５０μｍ、三菱化学株式会社）に負荷した。２０００ｍｌの水で洗浄後、１０００ｍｌの２５％アセトニトリル、１０００ｍｌの３０％アセトニトリル、１０００ｍｌの３５％アセトニトリルで順次溶出し、３０％アセトニトリル溶出画分は２５０ｍｌずつ４フラクション（ｆｒ．１からｆｒ．４）に分画し、３５％アセトニトリル溶出画分は２５０ｍｌずつ４フラクション（ｆｒ．５からｆｒ．８）に分画した。このうちｆｒ．４、８００ｍｇをＤｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−５（５０ｍｍ×５００ｍｍ、野村化学株式会社製）に負荷し、０．１％ギ酸存在下、５−４５％アセトニトリルの直線勾配（３２ｍｌ／ｍｉｎ、６０ｍｉｎ）において溶出させ、Ａ２８０ｎｍの吸収をモニターしながら分画した。９３分から９５分に溶出した画分を凍結乾燥し、２０ｍｇの粉末を得た。次いでＹＭＣ−Ｐａｋ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃ−１８（２０×３００ｍｍ、ワイエムシー株式会社製）に負荷し、０．１％ギ酸存在下、３０−５０％アセトニトリルの直線勾配（６ｍｌ／ｍｉｎ、６０分）において溶出させ、４８分から５０分に溶出した成分を凍結乾燥し、９ｍｇの白色粉末を得た。
＜実施例２ 得られた化合物の構造解析＞
実施例１で得られた化合物について、ＭＳおよびＮＭＲ測定を行った。マススペクトルはＱ−ＴＯＦ Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製、ＵＫ）により、イオン源にＺスプレーイオンソースをつけたＥＳＩを用い、ネガティブ、Ｖモードで測定した。Ｃｏｎｅ ｖｏｌｔ．：４５Ｖ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅ：３ＫＶ、Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｔｅｍｐ：１８０℃、ロックスプレーによる質量補正を行い、リファレンスにはロイシンエンケファリン（ｍ／ｚ５５４．２６１５［Ｍ−Ｈ］⁻）を用いた。またＭＳ／ＭＳは同様の条件下で、Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙを１０から３０ｅＶに設定し測定した。その結果、ｍ／ｚ５９３．０９１８の［Ｍ−Ｈ］⁻の分子イオンを与え、分子式Ｃ_２９Ｈ_２２Ｏ_１４（ｅｒｒ．：−２．２ｐｐｍ）と算出された。またＭＳ／ＭＳの結果、ｍ／ｚ４４１．０７、ｍ／ｚ２７１．０６のフラグメントイオンが認められ、没食子酸２分子の存在が示唆され、エピカテキンガレートにさらに１分子の没食子酸が付加した物質であると推定された。

ＮＭＲは、以下の条件で測定を行った。３ｍｇの実施例１で得られた化合物をＣＤ_３ＯＨに溶解し、ＣＤ_３ＯＨのプロトンと^１３Ｃの残存ピークであるδ３．３０およびδ４８．９７を内部標準とした。項目は^１Ｈ ＮＭＲ、^１３Ｃ ＮＭＲ、^１Ｈ｛^１３Ｃ｝−ＨＳＱＣ、^１Ｈ｛^１３Ｃ｝−ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹおよびＲＯＥＳＹをＤＭＸ−７５０ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（BRUKER BIOSPIN,Germany)で測定した。その結果、実施例１で得られた化合物の構造は（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートであることが明らかになった。また、実施例１で得られた化合物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータはTetrahedron, vol.28, p2819-2826 (1972)）に示された（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートのデータと一致した。ＮＭＲのアサインメントを図１に示す。
＜実施例３ リパーゼ阻害活性の測定＞
測定サンプル
・（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート（１）、（−）−エピガロカテキン３−Ｏ−ガレート（２）は和光純薬工業株式会社より購入した。
・（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレート（３）は実施例１の方法で得た。
測定方法
リパーゼ活性の測定は、基質に蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステル（４−ＭＵＯ）を使用し、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより実施した。測定にあたり、緩衝液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．３６ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む１３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。基質である４−ＭＵＯ（シグマ社製）は０．１ＭのＤＭＳＯ溶液とした後に上記緩衝液で４０００倍希釈したものを、また、リパーゼはブタ膵リパーゼ（シグマ社製）を同様に上記緩衝液を用い４００Ｕ／ｍｌ溶液として調整したものを酵素測定に供した。

酵素反応は、２５℃条件下において、９６穴マイクロプレートに５０μｌの４−ＭＵＯ緩衝液溶液、２５μｌの蒸留水（あるいは試料水溶液）を添加し混合した後に、２５μｌのリパーゼ緩衝液溶液を添加することにより開始させた。３０分間反応を行った後に、１００μｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を添加して反応を停止させ、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光（励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（Labsystem社製Fluoroskan Asent CF）を用い測定した。

被験試料の阻害活性は、対照（蒸留水）の活性に対して５０％阻害を与える試料量ＩＣ_５０（μＭ）として求めた。
結果
カテキン類（１）〜（３）のリパーゼ阻害活性を表１に示した。なお、図２には評価に供した化合物の化学構造式を記載した。

茶に存在している主要な没食子酸がエステル結合しているカテキン類（１）および（２）は強いリパーゼ阻害活性を示した。（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート（１）にもう１分子の没食子酸が結合した（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレート（３）は、（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート（１）の約１５倍、（−）−エピガロカテキン３−Ｏ−ガレート（２）の約２倍の強い活性を示した。

図１は、実施例１で得られた化合物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータのアサインメントを示す。 図２は、実施例３でリパーゼ阻害活性の評価に供した化合物の化学構造式を示す。

Claims (6)

1. 次式：
   

   

   で表される（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含むリパーゼ阻害剤。
2. 食事由来の脂肪の吸収を抑制するための、請求項１のリパーゼ阻害剤。
3. 請求項１または２のリパーゼ阻害剤を添加した飲食料。
4. 茶飲料、清涼飲料および健康食品からなる群から選択される、請求項３の飲食料。
5. 次式：
   

   

   で表される（−）−エピカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートを含む医薬組成物。
6. 食事由来の脂肪の吸収を抑制するための、請求項５の医薬組成物。

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