CN101094851B - 具有脂肪酶抑制活性的新型化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供来自茶的具有脂肪酶抑制活性的新型多酚化合物、其制造方法及含有该化合物的饮食品、医药品。更加具体地说，本发明是使用茶叶酶(多酚氧化酶)将乌龙茶的主要儿茶素成分表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(epigallocatechin-3-O-gallate)氧化聚合得到的下式表示的新型二聚体化合物乌龙茶氨酸-3’-O-没食子酸酯(oolongtheanin-3’-O-gallate)、及含有所述新型化合物且抑制餐后脂肪吸收、抑制血中中性脂肪升高的饮食品及医药组合物。[化学式1]

Description

具有脂肪酶抑制活性的新型化合物
技术领域
本发明提供具有脂肪酶抑制活性的来自乌龙茶的新型多酚、其制造方法及含有该化合物的饮食品、医药品。
背景技术
近年来，伴随日本人生活模式的欧美化，高脂肪饮食的摄取在不断增加。根据平成11年日本国国民营养调查，有报告指出尽管能量摄取量在逐年减少，但脂质能量比超过正常比例25％，中性脂肪值、胆固醇值高的人的比例在60岁以上的人中占5～6成(日本国厚生劳动省 平成11年国民营养调查结果概要 临床营养2001；98(5)：577-588)(日本国厚生労働省 平成11年国民栄養調查结果の概要 臨床栄養2001；98(5)：577-588)。
肥胖是现代社会中最重大的疾病之一，其主要原因是过剩摄取脂肪。并且已知过剩摄取脂肪不仅引起肥胖，而且还诱发起因于肥胖的糖尿病、高血脂症、高血压、动脉硬化等。作为治疗这种肥胖的药物，在日本国内唯一批准了食欲抑制剂马吲哚(Mazindol)(注册商标)，但报告其有口渴、便秘、胃部不适感、恶心、呕吐等副作用(临床评价1985；13(2)：419-459、临床评价1985；13(2)：461-515)。此外，在日本国外，作为肥胖改善药Xenical(注册商标)已在市场销售，该药通过脂肪酶抑制活性具有抑制从肠管吸收脂肪的作用，但仍报告有脂肪便、排便次数增加、软便、下痢、腹痛等副作用，很难说一定安全(The Lancet1998；352：67-172)。
为了预防肥胖，限制饮食从而减少摄取的热量是有效的手段，但必须接受严格的营养指导，在日常生活中很多情况下难于实行。因此，安全且健康地抑制餐后脂肪在体内吸收，从治疗肥胖及其相关疾病或增进健康的目的来看，认为是实际的有用的对策。
在这种背景下，安全且证明对人体有效的特定保健用食品的开发受到关注。到目前为止，作为抑制饭后血清中性脂肪值升高的食品材料，通过抑制胰脂肪酶从而抑制脂肪吸收的珠蛋白分解物(J.Nutr.1988；128：56-60，1988、日本临床 食粮学会志 1999；52(2)：71-77、健康·营养食品研究2002；5(3)：131-144)(J.Nutr.1988；128：56-60，1988、日本酶床 食糧学会誌 1999；52(2)：71-77、健康 栄養食品研究 2002；5(3)：131-144)、具有与三酰基甘油不同的消化吸收特性的二酰基甘油(J.Am.Coll.Nutr.2000；19(6)：789-796、Clin.Chim.Acta.2001；11(2)：109-117)、从鱼油中精制的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等已成为日本国特定保健用食品在销售。
另一方面，最近来自植物的脂肪酶抑制活性物质也正在受到关注，特别是关于具有脂肪酶抑制活性的多酚类，报道了来自植物树皮的单宁(日本国特公昭60-11912)，在豆科植物水皂角中含有的单宁类、类黄酮类及其糖苷(日本国特开平8-259557)，配合有绿茶中的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯及表儿茶素没食子酸酯的抑制脂质吸收的食品(日本国特开平3-228664)，含有青椒、丛生口蘑、南瓜、灰树花(Grifola frondosa)、羊栖菜、绿茶、乌龙茶等水提取物的脂肪酶抑制剂(日本国特开平3-219872)，黄酮及黄酮醇类(日本国特开平7-61927)，羟基安息香酸类(没食子酸)(日本国特开平1-102022)，三萜类化合物及其衍生物(日本国特开平9-40689)，以罗望子的原花青素(Procyanidin)为有效成分的抗肥胖剂(日本国特开平9-291039)等。并且知道葡萄种子提取物的脂肪酶抑制作用(Nutrition vol.19，(10)，876-879，2003)，来自五层龙属(salacia)植物的多酚的脂肪酶抑制作用和对大白鼠的抗肥胖作用(J.Nutr.，132，1819-1824，2002)，乌龙茶提取物对小白鼠的抗肥胖作用(Int.J.Obes.，23 98-105，1999)等。
但是，上述所报道的来自植物的脂肪酶抑制剂，其效果并不充分，例如，即使某植物的提取物有效果，但只要其中含有的活性成分的量不确定，又因为来自于天然物质，所以难于维持稳定的脂肪酶抑制活性。此外，如果是来自不受欢迎的植物的抑制剂，作为饮食品利用时会产生影响香味的问题。例如，在说明乌龙茶的脂质改善效果的报告中，有下述报告，即、每日饮用1330ml的市售乌龙茶，服用6周后发现血中中性脂肪值显著降低(日本营养·食粮学会志1991；44(4)：251-259)；以102名单纯性肥胖症男女为对象，使其连续6周经口摄取乌龙茶(2g×4/日)，结果发现67％被验者体重减少1kg以上，并且发现血中中性脂肪值为高值的被验者摄取乌龙茶后有显著的改善效果(日本临床营养学会杂志1998；20(1)：83-90)。虽然证明如此大量饮用乌龙茶有效果，但在日常生活中难于持续，并且即使提供单纯浓缩的乌龙茶，因为有强的苦味、涩味，且咖啡因的量也会增加，所以作为实际的对策不合适。
[专利文献1]
日本国特公昭60-11912
[专利文献2]
日本国特开平8-259557
[专利文献3]
日本国特开平3-228664
[专利文献4]
日本国特开平3-219872
[专利文献5]
日本国特开平7-61927
[专利文献6]
日本国特开平1-102022
[专利文献7]
日本国特开平9-40689
[专利文献8]
日本国特开平9-291039
[非专利文献1]
日本国厚生劳动省 平成11年国民营养调查结果概要
[非专利文献2]
临床营养2001；98(5)：577-588
[非专利文献3]
临床评价 1985；13(2)：419-459、临床评价 1985；13(2)：461-515
[非专利文献4]
The Lancet 1998；352：67-172
[非专利文献5]
J.Nutr.1988；128：56-60，1988
[非专利文献6]
日本临床 食粮学会志 1999；52(2)：71-77
[非专利文献7]
健康 营养食品研究 2002；5(3)：131-144
[非专利文献8]
J.Am.Coll.Nutr.2000；19(6)：789-796
[非专利文献9]
Clin.Chim.Acta.2001；11(2)：109-117
[非专利文献10]
Nutrition vol.19，(10)，876-879，2003
[非专利文献11]
J.Nutr.132，1819-1824，2002
[非专利文献12]
Int.J.Obes.23 98-105，1999
[非专利文献13]
日本营养 食粮学会志 1991；44(4)：251-259
[非专利文献14]
日本临床营养学会杂志 1998；20(1)：83-90
发明内容
本发明关注受欢迎的茶中含有的成分，提供来自茶的具有脂肪酶抑制活性的新型多酚化合物及其制造方法。
本发明还提供含有具有脂肪酶抑制活性的本发明的新型多酚化合物、且抑制餐后脂肪吸收、抑制血中中性脂肪升高的饮食品。
本发明进一步提供含有具有脂肪酶抑制活性的本发明的新型多酚化合物、且抑制餐后脂肪吸收、抑制血中中性脂肪升高的医药组合物。
本发明者发现，使用茶叶酶(多酚氧化酶)将乌龙茶的主要儿茶素成分表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(epigallocatechin-3-O-gallate)氧化聚合后得到下式表示的二聚体的新型化合物乌龙茶氨酸-3’-O-没食子酸酯(oolongtheanin-3’-O-gallate)，该化合物具有强的抑制脂肪吸收时所必须的胰脂肪酶的功能的作用。
[化学式1]
Figure G05827908020070225D000051
制造方法
本发明的化合物可以通过使用多酚氧化酶氧化聚合表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(epigallocatechin-3-O-gallate)而得到。初始物质表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(epigallocatechin-3-O-gallate)已公知且有市售，也可以从绿茶、红茶、乌龙茶等天然材料中提取得到。氧化聚合使用的多酚氧化酶，如可以采用实施例1所述的方法从茶叶中提取制备，但只要能够催化表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(epigallocatechin-3-O-gallate)氧化聚合为乌龙茶氨酸-3’-O-没食子酸酯(oolongtheanin-3’-O-gallate)(OTNG)，并不限于来自茶叶中的酶，如可以使用来自辣根的酶。
使初始物质(表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯：epigal locatechin-3-O-gallate)、氧化剂(如H2O2等)以及多酚氧化酶存在于pH4～7、优选pH5～6的水性缓冲液中，在20～40℃、优选25～35℃的条件下，使氧化聚合反应进行1～4小时、优选3小时。氧化剂及多酚氧化酶的使用量，如相对于100mg初始物质，分别为2mg氧化剂及从100g生茶叶中得到的酶。
氧化聚合反应得到的生成物可采用色谱法等通常方法进行精制。精制的乌龙茶氨酸-3’-O-没食子酸酯(oolongtheanin-3’-O-gallate)的性状为“白色粉末，可溶于水、乙醇、DMSO，中性”，由于其安全性高，从抑制餐后脂肪吸收、抑制血中中性脂肪升高或降低已升高的血中中性脂肪的目的出发，优选作为饮食品、医药品等的脂肪酶抑制活性成分使用。
乌龙茶氨酸-3’-O-没食子酸酯(oolongtheanin-3’-O-gallate)是通过上述氧化聚合反应提供的新型化合物，但也可能存在于茶叶等天然材料中，也能够从这些天然材料中提取精制得到。
脂肪酶抑制活性的测定方法
本发明的化合物对脂肪酶特别是胰脂肪酶具有强的抑制作用，其抑制活性可根据实施例2具体记载的方法进行测定。
脂肪酶抑制剂
本发明的化合物可以单独、或与溶剂、固体担体同时作为脂肪酶抑制剂使用。对于溶剂或担体，考虑到要作为下述饮食品及/或医药品使用，优选食品或医药品能够安全使用的物质。本发明的脂肪酶抑制剂有多种用途，例如可以为试验研究用、作为预防中性脂肪蓄积的食品、医药品有效成分使用。含有乌龙茶氨酸-3’-O-没食子酸酯(oolongtheanin-3’-O-gallate)的饮食品
将本发明的化合物或含有该化合物的脂肪酶抑制剂作为脂肪酶抑制活性成分添加到饮食品中，能够防止餐后摄取脂肪成分所产生的不期望的血中中性脂肪的升高及/或降低已升高的血中中性脂肪。优选的饮食品为日常摄取的饮食品，如绿茶、麦茶、乌龙茶、红茶、咖啡、运动饮料、饮料水、调味料、调味汁(dressing)。并且饮食品可以为通常食用的饮食品，也可以为清凉饮料、鸡尾酒、啤酒、威士忌、蒸馏酒、葡萄酒、清酒、调味料、调味汁(dressing)、调味米、加工食品、快速食品、蒸煮袋食品、巧克力、鲜奶油、洋式点心、乳制品、健康食品、营养辅助食品等。
饮食品中本发明化合物的添加量，以每餐摄取量为0.1mg～1000mg进行添加。但因本发明的化合物来自食品，安全性非常高，在饮食品中的添加量实际上没有上限。
含有乌龙茶氨酸-3’-O-没食子酸酯(oolongtheanin-3’-O-gallate)的医药品
本发明的化合物或脂肪酶抑制剂，还能够作为抑制餐后脂肪吸收、防止不期望的血中中性脂肪升高及/或使升高的不期望的血中中性脂肪降低的药剂的有效成分使用。优选药剂为口服药剂，如可以为保健饮料、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、滴丸剂等。药剂中含有的本发明化合物的量，每次服用量为0.1mg～1000mg。
本发明的医药品，因为脂肪酶抑制活性成分乌龙茶氨酸-3’-O-没食子酸酯(oolongtheanin-3’-O-gallate)的安全性高，即使长期服用也很安全，因此，为了防止或消除成为生活习惯病的肥胖，可以日常服用。
本发明能够提供添加有来自乌龙茶的多酚、不损坏香味、受欢迎且以降低中性脂肪、促进健康为目的的饮食品。为了抑制餐后脂肪吸收，期望进餐的同时进行摄取且从茶中得到的有效成分得到强化的饮料意义重大。
本发明的化合物，以乌龙茶内大量含有的表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(epigallocatechin-3-O-gallate)为初始原料，采用简单方法制造，并容易精制。
附图说明
图1表示乌龙茶氨酸-3’-O-没食子酸酯(oolongtheanin-3’-O-gallate)(OTNG)的质谱。
图2表示OTNG的1H NMR。
图3表示OTNG的13C NMR。
图4表示OTNG的化学结构式。
实施例
实施例1 乌龙茶氨酸-3’-O-没食子酸酯(oolongtheanin-3’-O-gallate)(OTNG)的酶合成
酶的制备
将600g茶叶品种·京研129号(日本国京都府立茶业研究所(KyotoPrefectural Tea Industry Research Institute)提供)在液态氮中粉碎，加入1800ml提取用缓冲液(用0.01M KH2PO4和0.02M K2HPO4调整pH为7.0)和300ml聚酰胺，搅拌后用纱布过滤。将滤液在8000rpm离心分离20分钟，在1500ml上清液中加入预先冷却至-20℃的丙酮1500ml，搅拌后4℃静置1小时。将该溶液在8000rpm、4℃离心分离20分钟，得到白色沉淀。将该沉淀溶解于600ml反应用缓冲液(用0.01M柠檬酸和0.02M H3PO4调整pH为5.6)，制成酶溶液。
酶反应
在600ml酶溶液中加入600mg表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(epigallocatechin-3-O-gallate)(和光纯药工业株式会社)和8.8mM H2O2，搅拌后在32℃进行反应。3小时后加入600ml含1％三氟乙酸(TFA)的90％乙腈终止反应。将该溶液用水稀释5倍，使其负载于吸附树脂HP-20(1000ml、三菱化学株式会社)，水洗后用2000ml含0.1％TFA的90％乙腈洗脱反应生成物，减压浓缩后进行冷冻干燥。反应物经过下述制备型HPLC进行精制。
精制
柱子：Develosil ODS-UG-5(50mmφ×500mm，野村化学)
移动相：A：0.05％TFA/H2O，B：90％CH3CN、0.05％TFA
检测：A280nm
流速：32ml/min
梯度：从B20％到B50％线性梯度洗脱100分钟
通过该色谱法，洗脱52分钟得到乌龙茶氨酸没食子酸酯(oolongtheanin-gallate)，为了进一步提高纯度，再进行一次制备型HPLC分离。
柱子：Develosil C30-UG-5(20mmφ×250mm，野村化学)
移动相：A：0.1％TFA/H2O，B：90％CH3CN、0.1％TFA
检测：A280nm
流速：6ml/min
梯度：从B10％到B40％线性梯度洗脱40分钟。通过该色谱法，洗脱时间34分钟得到25mg  乌龙茶氨酸-3’-O-没食子酸酯(oolongtheanin-3’-O-gallate)。
在Chem.Pharm.Bull 36(5)，1676-1684，1988中曾报告从茶叶中分离出乌龙茶氨酸(Oolongtheanin)(无Gallate)，但本次得到的乌龙茶氨酸-3’-O-没食子酸酯(oolongtheanin-3’-O-gallate)是新型化合物。
MS测定是在Q-TOF(Micromass，Manchester，UK)上使用ESI探针，在正离子模式(Positive mode)下测定。确认在M/z 885处有[M+H]+离子吸收峰，在m/z 907处有[M+Na]+离子吸收峰。图1表示光谱。
1H NMR、13C NMR、1H[13C]-HSQC、1H[13C]-HMBC、TOCSY及DQF-COSY是溶解于CD3OD并在DMX-750(BRUKER BIOSPIN)上测定。图2表示1H NMR，图3表示13C NMR，图4表示结构式。
实施例2 脂肪酶抑制活性的测定
脂肪酶活性的测定，通过下述步骤实施，即、使用荧光性4-甲基伞形酮油酸酯(4-UMO)作基质，测定反应生成的4-甲基伞形酮的荧光。
测定时，缓冲液使用含有150mM NaCl、1.36mM CaCl2的13mM Tris-HCl(pH8.0)，基质4-UMO(Sigma公司制)为将制备成的0.1M DMSO溶液用上述缓冲液稀释1000倍，脂肪酶为将猪胰脂肪酶(Sigma公司制)同样用上述缓冲液制备成400U/ml溶液，以供酶测定使用。
酶反应是在25℃条件下，在96孔微型板上添加并混合50μl的4-UMO缓冲溶液、25μl蒸馏水(或试料水溶液)，然后添加25μl脂肪酶缓冲液溶液使反应开始，反应进行30分钟后，添加100μl的0.1M柠檬酸缓冲液(pH 4.2)终止反应。反应生成的4-甲基伞形酮的荧光(激发波长355nm、荧光波长460nm)用荧光分析仪(Labsystems公司制Fluoroskan Asent CF)测定。
被检试料的抑制活性，以相对于对照(蒸馏水)的活性产生50％抑制的试料量IC50求出。测定OTNG的脂肪酶抑制活性的结果，IC50为0.06μg/ml(0.068μM)，而单体EGCG的IC50为0.16μg/ml(0.349μM)，表明与单体相比活性非常强。

Claims (4)

1.下式表示的乌龙茶氨酸-3′-O-没食子酸酯用于制备抑制餐后脂肪吸收和/或抑制哺乳动物血中中性脂肪升高、和/或预防或消除肥胖症的饮食品或医药品的用途，
Figure FSB00000253818700011
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述饮食品或医药品以每餐摄取量为0.1mg～1000mg、或每次服用量为0.1mg～1000mg的量含有所述乌龙茶氨酸-3′-O-没食子酸酯。
3.如权利要求2所述的用途，其中，所述用途是用于制备从包括茶饮料、清凉饮料及健康食品的组中选择的饮食品。
4.下式表示的乌龙茶氨酸-3′-O-没食子酸酯用于制备抑制脂肪酶活性的饮食品或医药品的用途，
Figure FSB00000253818700012
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