BRPI0920965B1

BRPI0920965B1 - Método para produzir derivados funcionalizados de ácido hialurônico e a formação de hidrogéis a partir dos mesmos

Info

Publication number: BRPI0920965B1
Application number: BRPI0920965-4A
Authority: BR
Inventors: Gaetano Giammona; Fabio Palumbo; Giovanna Pittarresi
Original assignee: Università Degli Studi Di Palermo
Priority date: 2008-11-28
Filing date: 2009-11-30
Publication date: 2019-07-09
Also published as: US20150183891A1; CA2744892A1; EP2370474B1; CN102227448B; JP5607061B2; RU2523182C2; CA2744892C; ITRM20080636A1; RU2011126353A; MX2011005528A; DK2370474T3; PL2370474T3; ES2397987T3; EP2370474A1; US9410000B2; BRPI0920965A2; JP2012510535A; WO2010061005A1; US20110236486A1; CN102227448A

Abstract

método para produzir derivados funcionalizados de ácido hialurônico e a formação de hidrogéis a partir dos mesmos a presente invenção descreve um procedimento de duas etapas, de utilidade na inserção de grupos funcionais ao ácido hialurônico (ha), através da formação em solvente orgânico de um grupo particular ativo em grupos hidroxila do ácido hialurônico e subseqüente substituição do grupo ativo inserido por uma porção pendurada, contendo pelo menos na sua porção terminal um grupo funcional nucleofílico, nh2-r. o grupo inserido pela substituição nucleofílica pode conter em outra de sua porção terminal um adicional grupo funcional nucleofílico, em um modo que possa ser facilmente explorável para outras funcionalizações químicas, como por exemplo, na obtenção da etapa de metacrilação de grupos funcionais de ha, para se obter derivados que podem ser foto-reticulados. os derivados diretos do processo proposto e aqueles obtidos pela adicional funcionalização podem ser empregados para a produção de hidrogéis.

Description

MÉTODO PARA PRODUZIR DERIVADOS FUNCIONALIZADOS DE ÁCIDO HIALURÔNICO Ε A FORMAÇÃO DE HIDROGÉIS A PARTIR DOS MESMOS

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a um procedimento para produção de derivados funcionalizados de ácido hialurônico e correspondentes hidrogéis. Mais particularmente, a presente invenção concerne uma metodologia de duas etapas, de utilidade para inserir grupos funcionais no ácido hialurônico, através da formação de um especifico grupo ativo em grupos hidroxila do ácido hialurônico, e a subseqüente substituição do grupo ativo inserido por uma porção pendurada, contendo como porção terminal pelo menos um grupo funcional nucleofilico. O grupo inserido por substituição nucleofilica pode conter como outra porção terminal, outro grupo funcional nucleofilico, que pode ser explorado para outras t” Ί Ί Vv z—·· “I Z™\ Vt —·% Ί -i r-7 —k z-w z\ Z—ι st ι -ι η ΥΥ\ “I z—< “Λ Z-' z-\ ΤΥΊ v*. —s ν' 4— ι , Ί —. iz- —« v* “» 4— —λ t -r z—k “iz. z—\ V· £ LlilQiQild, ± _L ZcdÇOG S CjUlmlCao _r GlLl pdlLlCUlal^ ραία IdvOIcCcI d reticulação de cadeias de ácido hialurônico produtoras de hidrogéis.

Estado da Técnica ácido hialurônico (HA) é o mais abundante glicosaminoglicano não sulfatado presente na matriz extracelular de todos os tecidos; o ácido hialurônico é um polissacarídeo constituído de unidades repetitivas de ácido D-glicorônico (GlcUA) e N-acetil-D-glicosamina (GlcNAc), cujas estruturas química podem ser representadas pelas fórmulas seguintes, mostrando duas consecutivas unidades repetitivas (o número n das unidades repetitivas pode ser tal, que pode ser capaz de determinar um peso molecular compreendido entre 50.000 e diversos milhões de Daltons).

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O ácido hialurônico participa ativamente de um número de importantes processos biológicos, tais como, mobilidade celular, diferenciação celular, cicatrização de feridas. Em particular, o ácido hialurônico desempenha um fundamental papel estrutural na organização da matriz extracelular da cartilagem, tendo lugar na formação de proteoglicanos mais abundantes, isto é, agrecanos.

ácido hialurônico com alto peso molecular é usado em cirurgias viscosas e na suplementação viscosa, sendo também usado no campo oftálmico e na redução da dor de osteoartrite como lubrificante, que pode ser aplicado através de injeções intra-articulares.

Recentemente, diversos derivados funcionalizados ou reticulados de ácido hialurônico foram produzidos como filmes ou esponjas, a serem aplicados em feridas, onde esse produto apresenta propriedades de cicatrização do tecido.

No campo de engenharia do tecido - matéria emergente que concerne o desenvolvimento de tecnologias de utilidade para se obter a regeneração ou completa substituição de tecidos humanos prejudicados ~ o ácido hialurônico tem sido amplamente utilizado para a produção de estruturas porosas tridimensionais conhecidas como estruturas tipo andaime. Essas matrizes melhoram o crescimento e diferenciação das células dos tecidos, favorecendo a regeneração e reconstrução do tecido.

Para essas aplicações, o ácido hialurônico é de utilidade quando adequadamente substituído para a obtenção

3/40 de hidrogéis. Como se sabe, os hidrogéis são constituídos por polímeros naturais ou sintéticos ou seus derivados ou mediante combinação de polímeros naturais e sintéticos, cujas moléculas interagem como resultado das interações de Van der Waals, ligação de hidrogênio, ligações eletrostáticas ou químicas, assim, os hidrogéis são redes de polímeros hidrofílicos capazes de absorver água até centenas de vezes em relação ao seu peso seco. Considerando suas propriedades hidofílicas e sua potencial biocompatibilidade, os hidrogéis têm recebido um crescente interesse para aplicações farmacêuticas e farmacêuticobiomédicas.

A funcionalização química da estrutura polissacaridica do ácido hialurônico, mediante inserção de grupos funcionais pendurados tem o objetivo de obter dispositivos farmacêuticos para prolongar a liberação de fármacos (sistema de liberação de fármacos); nesses sistemas o fármaco é física ou quimicamente ligado ao veículo de polissacarídeo, sendo liberado de modo e tempo seguintes, capazes de melhorar a biodisponibilidade do fármaco.

Considerando o grande interesse para as aplicações de ácido hialurônico nas áreas farmacêutica, biomédica e cosmética, é evidente a alta exigência de novas estratégias clínicas para permitir novas e mais simples modificações do ácido hialurônico. Esses novos derivados podem depois ser empregados para o encaixe em diversas e possíveis aplicações.

No passado, diversas modificações químicas do ácido hialurônico concernentes às funcionalidades de hidroxila e carboxila, e diversos derivados do ácido hialurônico para aplicação no campo biomédico ou farmacêutico foram descritas.

Como exemplo, a Patente U.S. No. 4.582.865 (Balasz e outros, da Biomatrix Inc.) descreve a reticulação

4/40 do ácido hialurônico, mediante a reação com divinilssulfona em condições altamente básicas. 0 Pedido de Patente Europeu, EP 0216453 (Fidia S.p.A.), descreve esterificações de sais de hialuronato com halogenetos de alquila em solventes apróticos polares. Esses derivados têm encontrado grandes aplicações no campo farmacêutico, tais como, estruturas tipo andaime para construção de tecido e como dispositivos para o controle de liberação de fármacos. Esses derivados de éster de ácido hialurônico tiveram as características físico-químicas modificadas, tais como, aumento da solubilidade em solventes orgânicos, como, por exemplo, dimetilsulfóxido, que melhora os desempenhos industriais na obtenção de fibras, estruturas porosas tipo andaime e filmes.

Recentemente, outras diferentes estratégias químicas forma propostas para a obtenção da funcionalização de ácido hialurônico com cadeias funcionais penduradas, utilizando reações em grupos carboxila da porção glicorônica e em grupos hidroxila das unidades repetitivas. Em particular, diversos artigos descrevem a química da carbodiimida (empregando compostos tendo a fórmula R¹N=C=N-R²) , para se obter a funcionalização química da porção D-glicorônica do ácido hialurônico.

Como exemplo, Prestwich, Poyani e outros, empregaram carbodiimidas solúveis em água para a inserção de cadeias penduradas de hidrazida no arcabouço hialurônico, (Patente U.S. No. 5.502.081 de Prestwich e outros, concedida à The Research Foundation of State University of New York; Patente U.S. No. 5.616.568 de T. Pouyany e outros; Publicação de T. Pouyany, e G.D. Prestwich, Functionalized Derivatives of Hyaluronic Acid Oligosaccharides: Drug Carriers and Novel Biomaterials, Bioconjugate Chem., 1994, 5, 339-347). Nesses exemplos, os grupos carboxílicos de ácido hialurônico reagem com

5/40 moléculas bi-funcionais tendo a fórmula geral: H₂N-NH-CO-A

CO-NHNH₂, onde A é produz derivados de um grupo de espaçamento genérico que ácido hialurônico funcionalizados, compreendendo grupos pendurados de hidrazida tendo a fórmula HA-CONH-NH-CO-A-CO-NH-NH₂.

Seguindo a mesma linha de pesquisa,

Vercruysse e outros,

Synthesis and in Vitro

Degradation of New Polyvalent

Hydrazide

Hydrogels of

Hyalyronic Acid, Bioconjugate Chem., 1997, 8, descreveram como funcionalizar o ácido hialurônico usando moléculas portadoras de mais de dois grupos terminais hidrazida, permitindo uma reticulação do polissacarideo de partida para, então, produzir hidrogéis.

Aeschlimann e outros (Patente U.S. No. 6.630.457 de Aeschlimann e outros, concedida à Othogene LLC, correspondente à Patente Européia EP 1757314) modificou o método de ativação do grupo carboxila do ácido hialurônico proposto por Pouyani, mediante combinação ao emprego de carbodiimidas solúveis em água do uso de ativadores nucleofilicos, tais como, hidroxisuccinimidas e hidroxitriazóis. Em particular, o método divulgado trata da introdução de novos grupos funcionais na estrutura do ácido hialurônico, primeiro, para ativar seus grupos carboxílicos, produzindo grupos éster intermediários, depois, substituindo esses grupos éster de saida usando moléculas contendo um satisfatório grupo nucleofilico em um lado, e um grupo funcional quimicamente protegido no outro lado.

Desse modo, os intermediários ativados de ácido hialurônico são mais estáveis e, assim, a seguinte funcionalização por moléculas bifuncionais nucleofilicas é mais seletiva. Desse modo, derivados de amina e aldeido de ácido hialurônico foram produzidos como adequados para subseqüente reticulação, dessa forma, obtendo-se hidrogéis biocompativeis à base de ácido hialurônico.

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Além disso, o Pedido de Patente Internacional, WO 02/098923 proposto pela Empresa Eurand Pharmaceuticals Ltd, cujos inventores são Mariotti e outros, mostra métodos para produzir derivados funcionalizados de ácido hialurônico, em que seus grupos hidroxila são esterifiçados ou carbomoilados (HA-O-CONH-) e os grupos carboxila são total ou parcialmente esterifiçados com álcool. Esses grupos hidroxila carbamoilados são obtidos reagindo o polissacarideo com isocianatos de alquila, arila ou arilalquila (R-N=C=O). Desse modo, os derivados de ácido hialurônico carbomoilados e esterifiçados foram obtidos, para serem aplicados como fases estacionárias em análise cromatográfica.

Similarmente ao descrito por Mariotti e outros, Chen Jui-hsiang e outros, na Patente EP 1538166 (proposta pelo Industrial Technology Research Institute), descreve a produção de derivados de ácido hialurônico contendo cadeias penduradas hidrofóbicas, hidrofílicas e anfifílicas, obtidas através da reação entre o polissacarideo e derivados de isocianato dos mesmos polímeros.

As duas últimas patentes citadas descrevem a formação de derivado carbâmico de ácido hialurônico, nos grupos hidroxila primários das unidades repetitivas do dissacarídeo, executando uma reação com o uso de sais de ácido hialurônico solúveis em solvente aprótico polar e isocianatos reativos. Nesse caso, os grupos hidroxila do ácido hialurônico foram funcionalizados em uma reação de etapa única, produzindo então uma ligação carbâmica (-O-CONH-, também conhecida como ligação uretânica) entre o ácido hialurônico e a nova funcionalidade pendurada; essa funcionalização pode ser então descrita usando a seguinte fórmula geral (HA-O-CO-NH-R), hidrofílica, lipofílica ou citadas metodologias sofrem onde R pode ser uma cadeia anfifilica. Entretanto, as do inconveniente de que a

7/40 funcionalização é restringida somente aos derivados de isocianatos que foram utilizados como reagentes de partida.

Considerando as metodologias descritas acima, a presente invenção tem o objetivo de divulgar um novo método para a produção de derivados funcionalizados de ácido hialurônico, os quais podem ser explorados na produção de hidrogéis reticulados ou como intermediários úteis para a obtenção de posterior funcionalização, tanto em solventes aquosos como em solventes orgânicos. Um adicional objetivo da presente invenção é a divulgação de metodologias em que esses derivados funcionais de ácido hialurônico podem ser facilmente explorados para a produção de novos hidrogéis.

Resumo da Invenção

Conforme esse objetivo e de acordo com a presente invenção, foi descoberto um versátil método químico para a obtenção de derivados funcionais de ácido hialurônico, de modo a não envolver na reação química os grupos carboxila das porções glicorônicas do ácido hialurônico. Esse método envolve um procedimento em duas etapas, onde a primeira etapa consiste da introdução de uma porção química ativa em pelo menos um grupo hidroxila do ácido hialurônico, de modo a proporcionar um intermediário ativo, e onde na segunda etapa o dito intermediário ativo reage com um nucleófilo reativo; dito nucleófilo reativo contendo, pelo menos, um grupo de amina primária. A aplicação consecutiva de duas etapas do procedimento gera a formação de pelo menos um grupo carbâmico (-O-C0-NH-), ligado à estrutura do ácido hialurônico, através de pelo menos um de seus grupos hidroxila.

Em particular, na primeira etapa do método, específicas moléculas de ativação, como, por exemplo, a bem conhecida e comercialmente disponível molécula de bis (4nitrofenil-carbonato) ou a molécula de cloro-nitrofenil

8/40 carbonato, são empregadas para inserir grupos nitrofenoxicarbonila (NO₂-Ph-O-CO-) em grupos hidroxila de ácido hialurônico, (primário e/ou secundário); na segunda etapa, o satisfatório grupo de saida inserido (nitrofenoxila) é substituído por uma molécula nucleofílica tendo a fórmula geral NH₂-R. Essa molécula nucleofílica deverá conter, pelo menos, um grupo de amina primária, e R representa NH₂, um grupo alquilamino, uma cadeia alquílica, uma cadeia arilalquílica, uma cadeia poliacrílica, uma ou mais cadeias de polioxietileno, geralmente, qualquer molécula com baixo (por exemplo, um fármaco) ou alto peso molecular (por exemplo, um polímero, uma proteína, etc.); preferivelmente, dita molécula com baixo ou alto peso molecular é biocompatível e solúvel em solventes orgânicos ou em meio aquoso.

De acordo com a presente invenção, é possível se obter uma nova ligação carbâmica através de uma reação de duas fases, nos grupos hidroxila primário e/ou secundário do ácido hialurônico, utilizando o oportuno intermediário de ativação. Em particular, o composto reativo de bis (4nitrofenil-carbonato) foi empregado para gerar um derivado de nitrofenil-carbonato no ácido hialurônico, facilmente reativo com as moléculas nucleofílicas, preferivelmente, contendo funcionalidades amino ou hidrazida.

Ά cadeia pendurada inserida na segunda etapa do procedimento, em caso de necessidade, pode conter pelo menos outro grupo funcional, ainda disponível para posteriores funcionalizações químicas executadas em meio orgânico ou aquoso, reagindo com moléculas contendo outros grupos funcionais, em particular, grupos químicos capazes de permitir uma reação de reticulação.

O método divulgado pode ser empregado para produzir derivados de ácido hialurônico contendo novas funcionalidades químicas de amina ou hidrazida, ou para

9/40 produzir derivados de ácido hialurônico contendo cadeias penduradas hidrofilicas ou lipofilicas.

Desse modo, uma ampla variedade de grupos químicos funcionais comercialmente disponíveis pode ser ligada ao ácido hialurônico através de seus grupos hidroxila (primária e/ou secundária). Além disso, de acordo com esse procedimento é possível ainda funcionalizar esses derivados de amina e hidrazida, também, em um ambiente orgânico; em particular, os sais de tetrabultilamônio (TBA) desses derivados de amina ou hidrazida de ácido hialurônico podem ser empregados para posterior funcionalização. Em geral, essa posterior funcionalização pode ser realizada em ambos os meios aquoso e orgânico, em particular, em solventes apróticos polares, tais como, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, dimetilacetamida e suas misturas.

Breve Descrição das Figuras

Alguns resultados experimentais são ilustrados nos seguintes desenhos, nos quais:

- a figura 1 mostra o espectro de ^XH-NMR (D₂O) de derivado de HA-EDA, tendo um percentual de 50% mol/mol de funcionalização em grupos etilenodiamina, obtido de acordo com o procedimento da invenção;

- a figura 2 mostra o espectro de ^XH-NMR (D₂O) de derivado de HA-BTA, tendo um percentual de 52% mol/mol de funcionalização em grupos butila, obtido de acordo com o procedimento da invenção;

- a figura 3 mostra o espectro de ¹H-NMR (D₂O) de derivado de HA-NH-PEG, tendo um percentual de 33% mol/mol de funcionalização em cadeias de polioxietileno-monometilmonoamino, obtido de acordo com o procedimento da invenção;

- a figura 4 mostra o espectro de ¹H-NMR (D₂O) de derivado de HA-EDA-MA, tendo um percentual de 50% mol/mol de funcionalização em grupos de etilenodiamina, e 50% mol/mol

10/40 de funcionalização em grupos metacrílicos, obtido de acordo com o procedimento da invenção;

- a figura 5 mostra imagens de SEM, de hidrogel de HA-EDABC seco por congelamento, a uma concentração de 0,5% em peso/volume;

- a figura 6 mostra a proliferação de condrócitos humanos encapsulados em hidrogéis de HA-EDA-BC. Os valores são expressos como desvio padrão (σ) da absorbância (n = 9); e

- a figura 7 mostra o manchamento vivo/morto de condrócitos encapsulados em 3D, em hidrogéis de HA-EDA-BC, após 3 dias de cultura. As células mortas são indicadas pelos quadros.

Descrição Detalhada da Invenção

Assim, constitui um objeto especifico da presente invenção, um procedimento para a produção de derivados funcionais de ácido hialurônico, composto das seguintes etapas subseqüentes:

(a) ativação de pelo menos um grupo hidroxila do ácido hialurônico (HA) (esse (HA) como sal solúvel em solventes orgânicos); reagindo esse sal de ácido hialurônico em um solvente aprótico polar com um agente de carbonatação, escolhido entre fenilésteres carbônicos ou fenilésteres halofórmicos;

(b) reação do sal de ácido hialurônico ativado obtido na etapa (a) , por meio de substituição nucleofilica, com um composto tendo a fórmula geral NH₂-R, onde R pode ser: NH₂, um grupo aminoalquila, uma cadeia alquilica, uma cadeia arilalquilica, uma cadeia poliacrilica, uma cadeia de polioxietileno, ou uma molécula de baixo peso molecular (por exemplo, um fármaco) ou uma molécula de alto peso molecular (por exemplo, um polímero, uma proteína, etc.); preferivelmente, a dita molécula de baixo ou alto peso

11/40 molecular é biocompatível e solúvel em solventes orgânicos ou em um meio aquoso.

Em particular, o agente de carbonatação reativo empregado na primeira etapa pode ser o composto de bis (4nitrofenil-carbonato) (um éster fenil-carbonílico) e/ou um carbonato de cloro-nitrofenila.

O sal de ácido hialurônico solúvel em solventes orgânicos pode, preferivelmente, ser escolhido entre o sal tetrabutilamônico (indicado por TBA) ou o sal de cetiltrimetilamônio (indicado por CTA).

De acordo com alguns aspectos de realização preferidos da invenção, o solvente orgânico para as reações de funcionalização é escolhido dentre dimetilsulfóxido, dimetilformamida, dimetilacetamida e suas misturas, e ambas as etapas de ativação (a) e substituição nucleofílica (b) são realizadas sob temperaturas entre 10 e 60°C.

grau de funcionalização obtido dos derivados de ácido hialurônico pode variar de apenas um grupo hidroxila para o total de grupos hidroxila de ácido hialurônico e depende (de uma maneira diretamente proporcional) da quantidade de agente de carbonilação reativo usado no processo descrito acima. Preferivelmente, o grau de funcionalização varia entre 5 e 95%, mais preferivelmente, entre 20 e 80% (para um melhor entendimento sobre isso, ver o Exemplo 1).

De acordo com outras modalidades específicas, o composto tendo fórmula geral NH₂-R pode ser escolhido entre hidrazina (NH₂-NH₂) e um grupo bis-aminoalquila, tendo a fórmula NH₂- (CH₂) _n-NH₂, onde n é um número entre 1 e 30, preferivelmente, entre 1 e 10. Em outra modalidade específica mostrada na seguinte seção experimental, moléculas bifuncionais, tais como, etilenodiamina (NH₂-CH₂CH₂-NH₂, chamada de EDA) e hidrazina (NH₂-NH₂, chamada de Hy) , foram ligadas à estrutura do ácido hialurônico (HA)

12/40 para a obtenção dos derivados HA-EDA e HA-Hy, respectivamente.

De acordo com a presente invenção, um derivado de ácido hialurônico, tal como, HA-EDA ou HA-Hy pode ser empregado para produzir um hidrogel, através de um procedimento de auto-reticulação, utilizando carbodiimidas como agentes de ativação ou um procedimento de reticulação química, mediante uso de moléculas bifuncionais de reticulação, como, por exemplo, glutaraldeido ou outras moléculas polifuncionais. Detalhes específicos das modalidades mencionadas são apresentados na seguinte seção experimental.

A presente invenção divulga métodos para empregar sais solúveis em solventes orgânicos, em particular, sais tetrabultilamônicos, de derivados de amino ou hidrazina de ácido hialurônico, ou sais de ácido hialurônico solúveis em água, obtidos através dos procedimentos mostrados na presente invenção, para executar posteriores derivações. Essas derivações podem ser realizadas em solventes orgânicos ou em meio aquoso.

De acordo com outros aspectos preferidos da invenção, um derivado de sal de ácido hialurônico obtido como na etapa (b) do procedimento, segue um outro procedimento de funcionalização, mediante substituição nucleofílica por uma molécula tendo a fórmula geral Y-R' , onde Y é um satisfatório grupo de saída, tal como, halogênio, N-oxisuccinimida, um grupo alcoxila com 1-6 átomos de carbono, ou Y é uma porção eletrofílica de um anidrido ou um epóxido, e R' é uma porção, tal como, um grupo acriloíla ou metacriloíla, ambos opcionalmente substituídos, ou uma porção de uma molécula solúvel em solvente orgânico ou solvente aquoso.

Preferivelmente, a posterior funcionalização é realizada na presença de um solvente aprótico polar,

13/40 escolhido dentre dimetilsulfóxido, dimetilformamida, dimetilacetamida ou suas misturas, sob temperaturas compreendidas entre 5 e 60°C; conforme ainda outros aspectos preferidos da invenção, a reação é realizada na presença de um catalisador, escolhido dentre dietilamina, trietilamina, dimetilaminopiridina e suas misturas.

Para a produção de derivados acrílicos ou metacrílicos de ácido hialurônico, o composto tendo a fórmula Y-R' é, preferivelmente, anidrido metacrílico, cloreto de metacriloíla, cloreto de acriloila, acrilato de glicidila ou metacrilato de glicidila; para a produção de outro derivado particular, mostrado na seguinte seção experimental, o derivado de benzoilcisteína de ácido hialurônico, o composto de fórmula geral Y-R' é o monoéster de N-oxisuccinimida ou diéster de N,Ν'-dibenzoil-L-cistina, ou seus derivados similares.

Nesse último exemplo, o derivado obtido dessa adicional funcionalização é subsequentemente tratado com um procedimento de redução, para obter uma porção de benzoilcisteína ligada ao ácido hialurônico.

De acordo ainda com outro aspecto, a presente invenção se refere a novos produtos, consistindo de derivados funcionalizados de ácido hialurônico, tendo peso molecular na faixa de 50.000-1.500.000 Daltons, que podem ser obtidos a partir do processo conforme descrito acima.

A seguir serão apresentadas fórmulas estruturais, que deverão ser pretendidas como adequadas representações do tipo de funcionalização (ligação covalente) que ocorre com um grupo hidroxila de ácido hialurônico, quando submetido ao processo descrito acima. As estruturas adiante relatadas não deverão ser pretendidas como representações do grau de funcionalização, que, conforme indicado anteriormente, é diretamente proporcional à quantidade de agente de carbonilação reativo usado no processo acima.

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De acordo com uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a derivados acrílicos ou metacrílicos de ácido hialurônico, tendo pesos moleculares compreendidos entre 50.000 e 1.500.000 Daltons, que podem ser obtidos, a partir do processo descrito acima.

O tipo de funcionalização desses derivados metacrílicos pode ser representado pela estrutura seguinte, descrevendo duas consecutivas unidades de dissacarídeo do ácido hialurônico de partida, em que pelo menos um grupo hidróxi foi funcionalizado:

Os derivados acrílicos podem ser representados pela fórmula acima, em que no lugar do grupo metacriloíla, está presente um grupo acriloíla.

Esses derivados acrílicos ou metacrílicos podem ser produzidos de acordo com o procedimento de duas etapas descrito na invenção, seguido de uma adicional funcionalização, conforme acima relatado.

Além disso, é possível controlar a quantidade da terceira etapa de funcionalização nos grupos acrílicos ou

15/40 metacrílicos, para se obter derivados tendo grupos amino livres, variando de 5 a 95%.

Um hidrogel reticulado pode ser obtido a partir dos produtos descritos acima, utilizando um procedimento de foto-reticulação, onde a concentração do mencionado derivado funcionalizado em solução aquosa ou orgânica é compreendida entre 1% peso/volume e 20% peso/volume. Preferivelmente, o hidrogel é obtido por irradiação com comprimentos de ondas compreendidos entre 180 e 800 nm, com ou sem fotoiniciador de radical, com um tempo de irradiação compreendido entre 5 minutos e 10 horas. Esses hidrogéis podem também ser obtidos por irradiação de microonda γ, ou por outras radiações ionizantes.

Esse procedimento de foto-reticulação pode também ocorrer na presença de apropriados aditivos, tais como, monômeros acrílicos e metacrilicos, metacrilatos e acrilatos de polietilenoglicol, ambos, mono e polifuncionais, ou na presença de outros aditivos empregados para modificar ou melhorar as características de plasticidade e z^J 1 T -tz* z-v r-7 —\ z~\ -S r*** ζ—ί “» -v. —s z—l 4- ν' 4 n 4 -ι t—l h i z~J ν' -Γ “ι I -I z—« “·> r—’ z—s I 1 V~*\ z-s T *Ί I ΐ ΖΊ —ΐ

O. U, X. θ 1 d f d o O d -L d O L- G11 o L· 10 d & 111 d 1 011110 d o d 11 01 _1—LI O d o

De acordo com um adicional aspecto da invenção, constitui um objetivo específico um novo derivado, obtido de acordo com o proposto procedimento de duas etapas, isto é, o derivado de benzoilcisteína de ácido hialurônico ou seus derivados similares, tendo peso molecular compreendido entre 50.000 e 1.500.000 Daltons, que podem ser obtidos a partir do processo acima descrito. Esses derivados de benzoilcisteína de ácido hialurônico podem ser representados pela estrutura seguinte, que se refere a duas consecutivas unidades de dissacarídeos do ácido hialurônico de partida, em que pelo menos um grupo hidróxi foi funcionalizado:

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HA-EDA-BC
Esse	derivado aminoacidico	pode ser	obtido de
acordo com o	procedimento de duas	etapas	conforme a

invenção, com seguinte adicional funcionalização, conforme anteriormente descrito e por uma subseqüente redução da ligação de dissulfeto do derivado de ácido hialurônico.

TiT c ·3 c· /~s Á rx /x o o *í t t Ί z—, 1—\ 4— z-x v- ι τ τγχ Vx -ι z-xl ν' ζ~χ /~χ z-x 1

IN ο ο θ O â o O f tu jp O o o 1 e X o G O X) TL X Lllll 11 _L U X U y c X reticulado, mesmo por meio de oxidação ao ar.

Em geral, a presente invenção inclui no seu escopo os hidrogéis obtidos por meio dos métodos descritos, esses hidrogéis podendo ser produzidos mediante aplicação de apropriados procedimentos técnicos, na forma de nanopartículas ou microparticulas, filmes, membranas, fibras e estruturas tipo andaime.

Finalmente, a presente invenção concerne o uso dos hidrogéis descritos para a produção de dispositivos de liberação de fármacos ou genes, para usos cosméticos e agroalimentícios, para a produção de sistemas de cobertura de feridas, órgãos ou tecidos, de materiais e estruturas tipo andaime, implantáveis, para regeneração de tecidos.

As características especificas da presente invenção, como suas vantagens e suas metodologias e específicos exemplos de aplicações, referidos a adicionais

17/40 funcionalizações dos derivados e à preparação dos hidrogéis, se tornarão mais claras dentro da descrição exemplificativa detalhada apresentada a seguir.

Parte Experimental

Exemplo 1 - Síntese do Derivado de Etilenodiamína do Ácido Hialurônico (HA-EDA).

Uma quantidade de 3 g de sal de tetabutilamônio de ácido hialurônico (HA-TBA), preparado mediante neutralização de uma solução de ácido hialurônico, usando uma solução de hidróxido de tetrabutilamônio, foi dissolvida em 270 mL de dimetilsulfóxido anidro (peso molecular ponderai médio do ácido hialurônico de 270 kDa).

A quantidade adequada de bis(4-nitrofenil)carbonato, (4-NPBC) escolhida de modo a obter proporções molares de 4-NPBC/moles de HA-TBA, respectivamente iguais a 0,75, 0,5 e 0,25, foi dissolvida em 30 mL de dimetilsulfóxido anidro; essa solução foi adicionada, gota a gota, à solução de HA-TBA, à temperatura de 40°C, sob agitação. Após 4 horas, foram adicionados 3 mL de etilenodiamina (EDA), gota a gota, e a solução foi deixada à temperatura de 40°C por mais 3 horas. Depois, o processamento da reação foi obtido, primeiro mediante precipitação do derivado de ácido hialurônico em acetona, depois, lavagem no mesmo solvente, até que um produto sem reação intermediária seja obtido.

O sólido obtido, formado pelo copolímero de HATBA-EDA foi finamente triturado.

O sal de sódio do derivado de etilenodiamina de ácido hialurônico, o derivado de HA-EDA, foi obtido descarregando a solução de HA-TBA-EDA em dimetilsulfóxido, através de uma coluna carregada com resina DOWEX 50 Wx8, ativada na sua forma sódica. O produto foi recuperado trocando a solução de DMSO por água, usando um procedimento

18/40 de diálise e, depois, secando por congelamento a solução aquosa. O Esquema 1 mostra o procedimento de funcionalização.

Esquema 1 - Reação de Funcionalização de Sal de

Tetrabutilamônio de Ácido Hialurônico (HA-TBA) com

Etilenodiamina, para Obtenção do Derivado de HA-EDA.

19/40

O derivado de HA-EDA foi caracterizado por análise de ¹H-NMR, conforme mostrado no espectro apresentado na figura 1 (ver os desenhos).

Em particular, a

3,1 (m, CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂) .

20/40

O grau de funcionalização foi calculado mediante comparação da área de pico em δ 1,9, atribuível ao CH3 da porção de N-acetilglicosamina do ácido hialurônico, com a área do pico em δ 3,1, atribuível à porção de etilenodiamina ligada ao ácido hialurônico. O grau de funcionalização foi expresso em moles% da porção de etilenodiamina inserida, por moles da unidade repetitiva de ácido hialurônico.

A Tabela 1 seguinte mostra, por exemplo, a funcionalização molar em grupos de etilenodiamina ligados ao ácido hialurônico obtido, empregando três diferentes proporções de moles de 4-NPBC/moles de unidades repetitivas de HA-TBA.

Tabela 1

Moles 4-NPBC/moles unidades repetitivas de HA-TBA	Grau de Funcionalização Molar em Grupos de Etilenodiamina Ligados ao Ácido Hialurônico
0,25	22% mol/mol
0,50	52% mol/mol
0,75	70% mol/mol

Exemplo 2 - Síntese de Derivado de Hidrazina de Ácido

Hialurônico (HA-Hy)

Uma quantidade de 3 g de sal de tetabutilamônio de ácido hialurônico (HA-TBA) foi dissolvida em 270 mL de dimetilsulfóxido anidro (peso molecular ponderai médio do ácido hialurônico de 27 0 kDa) . Em seguida, 30 mL de uma solução de dimetilsulfóxido anidro, contendo 0,73 g de bis(4-nitrofenil)carbonato (4-NPBC), foram adicionados, gota a gota, à solução de HA-TBA, ocorrendo a reação por 4 horas à temperatura de 40°C, sob agitação. Após esse período de tempo, foram adicionados 2,7 mL de monoidrato de

21/40 a gota, e a solução foi 40°C por mais 1 hora.

reação foi obtido, primeiro derivado de ácido hialurônico mediante lavagem com acetona.

hidrazina, gota temperatura de processamento da precipitação do dietílico, depois, o sal de sódio de HA-Hy, descarregada através de uma DOWEX 50 Wx8, ativada na precipitada em acetona e Então, o sólido obtido dialisado com água, de funcionalização, usando ácido 50% mol/mol.

Esquema 2 - Reação de

Tetrabutilamônio de Ácido Monoidrato de Hidrazina, para coluna, sua forma lavada com o foi dissolvido depois, seco por congelamento.

detectado por ensaio trinitrobenzenossulfônico (TNSB) O Esquema 2 mostra o procedimento deixada à Depois, o mediante em éter

Para obter a solução de reação foi carregada com resina sódica, depois, mesmo solvente, em água, sendo

O grau colorimétrico foi igual a da reação.

Funcionalização de Sal de Hialurônico (HA-TBA) com Obtenção do Derivado de HA-Hy

22/40

Exemplo 3 - Síntese do Derivado de Ácido Hialurônico

Funcionalizado com Butilamina (HA-BTA).

Uma quantidade de 3 g de sal de tetabutilamônio de ácido hialurônico (HA-TBA) foi dissolvida em 270 mL de dimetilsulfóxido anidro (peso molecular ponderai médio do ácido hialurônico de 270 kDa) . Em seguida, 30 mL de uma

23/40 solução de dimetilsulfóxido anidro, contendo 0,73 g de bis(4-nitrofenil)carbonato (4-NPBC), foram adicionados, gota a gota, à solução de HA-TBA, ocorrendo a reação por 4 horas à temperatura de 40°C, sob agitação. Após esse período de tempo, foram adicionados 4,7 mL de butilamina, gota a gota, e a mistura reacional foi deixada à temperatura de 40°C por 24 horas. Depois, a solução reacional foi descarregada através de uma coluna, carregada com resina DOWEX 50 Wx8, ativada na sua forma sódica, depois, precipitada em acetona e lavada com o mesmo solvente. Finalmente, a solução foi dialisada com água e seca por congelamento. No derivado obtido, chamado de HABTA, a ausência de butilamina não-reagida foi confirmada pelo ensaio do ácido trinitrobenzenossulfônico (TNSB). O Esquema 3 mostra o procedimento de funcionalização.

Esquema 3 - Reação de Funcionalização de Sal de Tetrabutilamônio de Ácido Hialurônico (HA-TBA) com Butilamina (BTA), para Obtenção de Derivado de HA-BTA.

24/40

O derivado de HA-BTA foi caracterizado pela análise de ¹H-NMR, conforme apresentado na figura 2, 5 mostrando os seguintes sinais:

(D₂0) : δ 0,8 (-NH-CH2-CH2-CH2-CH3) ; δ 1,3 (-NHCH₂-CH₂-CH₂CH₃); δ 1,4 (-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₃) ; δ 2,0 (s, -NH-COCH₃) ; δ

3,1 (-nh-ch₂-ch₂-ch₂-ch₃) .

25/40

O grau de funcionalização foi calculado mediante comparação das áreas de picos em δ 0,8, 1,3, 1,4 e 3,1, atribuíveis ao metileno da cadeia de butilamina, com a área de pico em δ 2,0, atribuível ao grupo metila da porção de N-acetilglicosamina de ácido hialurônico. 0 grau de funcionalização foi igual a 52% mol/mol.

Exemplo 4 - Síntese do Derivado de Aminopolietilenoglicol de Ácido Hialurônico (HA-NH-PEG).

g de sal de tetrabutilamônio de ácido hialurônico (HA-TBA) (peso molecular ponderal médio do ácido hialurônico de partida igual a 230 kDa) foi dissolvida em 90 mL de dimetilsulfóxido anidro. Em seguida, 0,4 g de bis(4-nitrofenil)-carbonato (4-NPBC) foram dissolvidas em 10 mL de dimetilsulfóxido anidro. A solução de 4-NPBC foi adicionada, gota a gota, à solução de HA-TBA, à temperatura de 40°C, sob agitação, depois, a reação foi deixada na mesma temperatura por 4 horas.

Após esse período de tempo, 6 g de O-(2aminoetil)-O-metil-polietilenoglicol (PEG-NH₂) (peso molecular de 750 Da), dissolvidas em 5 mL de dimetilsulfóxido foram adicionadas, gota a gota, e a solução foi deixada à temperatura de 40°C por 24 horas. Depois, a solução reacional foi descarregada através de uma coluna, carregada com resina DOWEX 50 Wx8, ativada na sua forma sódica, depois, precipitada em acetona e lavada com o mesmo solvente. O produto obtido, chamado de HA-NH-PEG, após secagem por congelamento, foi dissolvido em água e dializado com água durante 5 dias, usando uma membrana de diálise Spectrapor, tendo um corte molecular igual a 1200014000. O Esquema 4 seguinte mostra o procedimento de funcionalização.

26/40

Esquema 4

Reação de Funcionalização de Sal de

Tetrabutilamônio de Ácido Hialurônico aminoetil)-O-metil-polietilenoglicol (HA-TBA) com O- (2(PEG-NH₂) , para

Obtenção de Derivado de HA-NH-PEG.

-PEG-TBA

HA-NH-PEG

27/40

A ausência de PEG-NH₂ não-reagido foi confirmada, por meio de ensaio colorimétrico de NTSB para os grupos amino livres.

derivado de HA-NH-PEG foi caracterizado Poe análise de ¹H-NMR, conforme mostrado na figura 3, onde os seguintes picos estão presentes:

(D₂0) : δ 1,4 (s, -CO-NH-(O-CH₂-CH₂) n-O-CH₃) ; δ 2,0 (s, -NHCO-CH3) ; δ 3,7 (s, -CO-NH-(O-CH₂-CH₂) n-O-CH₃) .

grau de funcionalização foi de valor igual a 33% mol/mol.

Preparação de Derivados Metacrilicos de Etilenodiamina de Ácido Hialurônico (HA-EDA-MA)

Considerando o interesse de produzir derivados de ácido hialurônico foto-reticuláveis disponíveis na construção de tecidos, no campo de liberação de fármacos, aumento de tecido, etc., uma das aplicações mais vantajosas do método aqui proposto é a funcionalização de copolímeros de amina e ácido hialurônico com porções metacrílicas.

Na literatura científica, diversos exemplos de derivados metacrilicos de ácido hialurônico foram relatados. No procedimento primeiramente descrito por Smeds e outros (J. Biomed. Mat. Res. 2001; 54(1):115-121), o derivado metacrilico de ácido hialurônico (HA-MA) foi produzido em ambiente aquoso mediante uso de 20 vezes excesso molar de anidrido metacrilico, em relação aos grupos hidroxila primários de ácido hialurônico. Entretanto, o uso desse procedimento proporciona um sistema de duas fases, o que reduz a eficiência da funcionalização.

Recentemente, Oudshoorn e outros {Polymer 48 (2007) 1915-1920), descreveram a formação de copolímero de HA-MA, utilizando uma reação em solvente orgânico aprótico polar (dimetilsulfóxido), entre o sal de tetrabutilamônio do ácido hialurônico e metacrilato de glicidila (GMA).

28/4

Nesse caso, foi obtido apenas 30% mol/mol de funcionalização, usando uma proporção de moles de GMA para moles de grupos hidroxila de ácido hialurônico igual 200.

No método aqui divulgado, a presença de mais grupos nucleofilicos na cadeia lateral do ácido hialurônico (por exemplo, o grupo amino do derivado de etilenodiamina de ácido hialurônico) pode ser convenientemente explorada para obtenção de uma funcionalização mais eficiente, empregando, por exemplo, anidrido metacrilico (AMA) como reagente.

A fim de estudar a potencialidade do método e demonstrar a funcionalização seletiva dos grupos amino livres no ácido hialurônico, três diferentes lotes de sal de tetrabutilamônio de derivados de amina de ácido hialurônico (HA-TBA-EDA), tendo um grau de funcionalização molar igual a 75, 50 e 25% mol/mol (conforme obtido no Exemplo 1), respectivamente, foram preparados mediante emprego do procedimento descrito no seguinte Exemplo 5. Em particular, nesse exemplo, apenas um excesso molar de duas vezes AMA, comparado aos grupos amino livres de HA-TBA-EDA, foi suficiente para obter a completa funcionalização de todos os grupos amino presentes no derivado de etilenodiamina de ácido hialurônico, obtendo, assim, os copolímeros denominados de HA-EDA-MA. A ausência de grupos amino não-reagidos em copolímeros de ΗΆ-EDA-MA foi avaliada por meio de ensaio colorimétrico utilizando ácido trinitrobenzenossulfônico (TNBS). Além disso, é possível controlar a quantidade de funcionalização nos grupos metacrílicos, para se obter derivados de HA-EDA-MA tendo grupos amino livres, variando de 5 a 95%.

Exemplo 5 - Síntese de Derivados Metacrílicos de Etilenodiamina de Ácido Hialurônico (HA-EDA-MA) g de HA-TBA-EDA obtido conforme relatado no Exemplo 1, tendo um grau de funcionalização em grupos de «

29/40 etilenodiamina igual a 50% mol/mol, foi dissolvida em 100 mL de dimetilsulfóxido anidro (DMSO). Depois, um adequado volume de anidrido metacrilico (AMA) foi adicionado, para se obter um excesso molar de duas vezes, comparado aos moles dos grupos amino no composto de HA-TBA-EDA. O catalisador de dietilamina foi adicionado em proporção equimolar aos moles dos grupos amino de HA-EDA-TBA, e a solução final foi deixada por 24 horas à temperatura de 40°C. Após esse período de tempo, a solução orgânica foi descarregada em uma coluna contendo uma resina DOWEX 50 Wx8, ativada com sódio. A solução eluída foi depois precipitada em acetona e o sólido obtido, denominado de HAEDA-MA, foi lavado diversas vezes com o mesmo solvente, depois, seco, dissolvido em água e dialisado com água destilada. A solução foi filtrada e seca por congelamento. O seguinte Esquema 5 mostra o procedimento da reação.

Esquema 5 - Reação de Funcionalização de Sal de

Tetrabutilamônio de Etilenodiamina de Ácido Hialurônico (HA-EDA-TBA) com Anidrido Metacrilico (AMA), para Obtenção de Derivado de HA-EDA-MA.

30/40

ΝΗ

1) DMSO ΑΜΑ

2) Dowex Na ⁺

NH

HA-EDA-MA

O derivado de HA-EDA-MA foi caracterizado por análise de ^XH-NMR (ver a figura 4), mostrando os seguintes 5 picos:

(D₂O) : δ 1,9 (s, -CO-CH=CH-CH₃) ; δ 2,0 (s, -NH-CO-CH₃) ; δ

5,5 e 5,8 (m, -CO-CH=CH-CH₃) .

O grau de funcionalização foi avaliado mediante comparação das áreas dos picos em δ 5,5 e 5,8, atribuíveis 10 aos prótons de vinila do grupo metacrílico, com a área em δ

1,9 atribuível ao grupo metila da porção de Nacetilglicosamina das unidades repetitivas de ácido hialurônico. O grau de funcionalização nos grupos metacrílicos ligados às unidades repetitivas de HA-EDA teve 15 o resultado de 50% mol/mol, isto é, todos os grupos amino foram derivados com o anidrido metacrílico.

31/40

Preparação de Derivado de Benzoilcisteina de Etilenodiamina de Ácido Hialurônico (HA-EDA-BC)

Uma das mais importantes propriedades estruturais da matriz extracelular é sua estrutura fibrilar, devido à presença de colágeno e outras proteínas. Essa estrutura fibrilar fundamental para a conexão das células com o ambiente para a difusão ótima de fatores humorais e nutrientes.

Recentemente, muitos esforços são alocados para a possibilidade de produzir estruturas artificiais tipo andaime com uma estrutura fibrilar (Biomaterials, (2008), 1989 2006).

Nesse contexto, uma possibilidade concerne produção de copolímeros híbridos, capazes de espontaneamente formar uma precisa estrutura hierárquica.

Assim, por exemplo, Zhang e outros, produziram oligopeptídeos auto-complementares, capazes de espontaneamente formar estruturas fibrilares tipo andaime, quando dissolvidos em tampões aquosos; essas matrizes encontraram diversas aplicações no campo de construção de tecidos {Chemical Biology 2002, 6:865-871).

O interesse de produzir estruturas tipo andaime, capazes de auto-reticulação após injeção dentro do corpo, é justificado pelo fato de que sua direta deposição no órgão ou tecido prejudicado (isto é, para reconstrução da cartilagem articular), pode evitar a necessidade de uma implantação cirúrgica, desse modo, facilitando a integração da nova matriz extracelular formada com o tecido hospedeiro.

Considerando esse ponto de vista, é fundamental que a reticulação não deva envolver reações potencialmente tóxicas para os tecidos, além disso, a reação deverá permitir o encapsulamento da matriz, regenerando células, sem interferir com a sua viabilidade (Advanced Drug

Delivery Reviews 59 (2007) 263-273) . Assim, por exemplo,

32/4

Shu e outros, recentemente desenvolveram um derivado de tiol de ácido hialurônico, capaz de lentamente se reticular pela oxidação ao ar, ou rapidamente se reticular se derivados de diacrilato de polietilenoglicol forem empregados como agentes de reticulação (Biomaterials 25 (2004) 1339-1348; Biomaterials, 24 (2003) 3825-3834, WO 2005/056608) .

Alguns compostos não-poliméricos são capazes de espontaneamente em conjunto, em meio orgânico ou aquoso, formar hidrogéis. Por exemplo, o aminoácido N-N'-dibenzoilL-cistina (DBC) e seus derivados (J. Med. Chem. 1967, 10, 1172), formam hidrogéis por espontânea auto-montagem, mesmo em concentração bastante baixa. A força de transmissão dessa agregação espontânea é a formação de interações n-n, promovidas pelos grupos arila (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 584; J. Am. Chem. Soc 2000, 122, 11679-11691).

Considerando as propriedades do DBC e seus derivados de produzir hidrogéis fibrilares por espontânea auto-montagem, e desde que a presença de uma ligação de dissulfeto possa ser, em caso de necessidade, reversivelmente quebrada por uma simples reação de óxiredução para formar grupos livres de tiol, depois, novamente oxidada para formar uma ligação de S-S, o método relatado na presente invenção pode ser empregado para sintetizar o derivado de benzoil-cisteina de etilenodiamina de ácido hialurônico (HA-EDA-BC), capaz de apresentar propriedades de oxidação e de auto-montagem para produzir uma estrutura fibrilar.

Exemplo 6 - Síntese de Derivado de Benzoilcisteína de

Etilenodiamina de Ácido Hialurônico (HA-EDA-BC)

1,3 g de N,N'-dibenzoil-L-cistina (DBC) são dissolvidas em 28 mL de diclorometano e 20 mL de ♦

33/40 dimetilsulfóxido anidro. 0,6 g de dicicloexilcarbodiimida (DCC) e 0,34 g de N-hidroxisuccinimida (NHS) foram adicionadas a essa solução. A reação de ativação foi realizada à temperatura ambiente durante 24 horas. Após esse período de tempo a solução foi filtrada e o excesso de diclorometano foi removido a vácuo.

Essa solução contendo o derivado de Noxisuccinimida de N,N'-dibenzoil-L-cistina (DBC-NOS) foi adicionada, gota a gota, a 80 mL de dimetilsulfóxido contendo 1 g de HA-TBA-EDA, com um grau de funcionalização de 30% mol/mol nos grupos amino. A reação foi realizada com dietilamina como catalisador (960 μΐ).

Após 28 horas à temperatura de 40°C, a solução foi eluída em uma coluna carregada com resina DOWEX 500 Wx8, ativada na sua forma sódica, depois, o copolímero foi precipitado em éter dietílico e lavado com etanol e acetona. 0 composto de HA-EDA-DBC assim obtido foi finamente triturado e depois disperso em água, até um hidrogel homogêneo ser obtido. Em seguida, o pH do hidrogel obtido foi ajustado para 8, com adição de NaOH 1N, depois, foram adicionadas 1,2 g de ditiotreitol para reduzir a ligação ou ponte de dissulfeto, obtendo o derivado de benzoilcisteína de etilenodiamina de ácido hialurônico (HAEDA-BC).

A solução foi deixada por 24 horas à temperatura ambiente e após regular o pH para 3,5, foi dialisada com água acídica por 5 dias. Em seguida, a solução foi filtrada e seca por congelamento. O Esquema 6 seguinte mostra o procedimento de funcionalização descrito acima.

Esquema 6 - Reação de Funcionalização de Sal de Tetrabutilamônio de Etilenodiamina de Ácido Hialurônico (HA-TBA-EDA) com Derivado de N-oxisuccinimida de N,N'

34/40 dibenzoil-L-cistina (DBC-NOS), e Subsequente Redução da Ligação de Dissulfeto, para Obtenção do Derivado de Benzoilcisteina de Etilenodiamina de Ácido Hialurônico (HAEDA-BC).

HA-EDA-BC

CH·

35/4

A análise de ¹H-NMR e análises colorimétricas mostraram um grau de funcionalização de ácido hialurônico com benzoilcisteína igual a 30% mol/mol. A análise colorimétrica com TNSB demonstrou a ausência de grupos amino não-reagidos no derivado HA-EDA-BC.

Hidrogéis Derivados de Ácido Hialurônico Reticulado

A reticulação de derivados metacrilicos de ácido hialurônico da série HA-EDA-MA foi realizada em meio aquoso ou orgânico, com ou sem fotoiniciadores, após irradiação com raios γ, raios UV, irradiação visível, microondas. Foi experimentalmente confirmado que soluções aquosas (na faixa de concentração de 1-20% peso/volume) de copolímeros de HAEDA-MA tendo diversos graus de funcionalização molar em etilenodiamina ou grupos metacrilicos ligados ao ácido hialurônico, obtidas de acordo com os procedimentos da invenção, produzem hidrogéis, após exposição à radiações tendo comprimentos de ondas compreendidos entre 180 e 800 nm, ou empregando uma fonte de microondas, como, por exemplo, uma fonte de raios γ, ou outras fontes de ionização.

A reticulação de derivado de hidrazina de ácido hialurônico (HA-Hy) foi realizada em ambiente aquoso, preferivelmente, em um pH de 4,75, na presença de carbodiimidas solúveis em água, por exemplo, (l-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida) (EDCI).

A reticulação do derivado de etilenodiamina de ácido hialurônico (HA-EDA) foi realizada em tampão de fosfato, com pH de 7-8, mediante uso de agentes de

36/40 reticulação bifuncionais ou polifuncionais, preferivelmente, glutaraldeído.

A reticulação do derivado de HA-EDA-BC foi realizada em tampão de fosfato, preferivelmente, com pH de

7,4, mediante processo de oxidação ao ar.

Exemplo 7 - Produção de Hidrogéis à base de HA-EDA-MA.

Soluções	aquosas de	copolímero	de	HA-EDA-	-MA
obtidas conforme	o	Exemplo	5, com	um	grau	de
funcionalização molar	igual a	50% mol/mol	em	grupos	de

etilenodiamina e 50% mol/mol em grupos metacrilicos ligados ao ácido hialurônico, e com uma concentração variando de 1 a 20% peso/volume, foram estratifiçadas em um prato de Petri, desse modo, obtendo uma espessura de poucos milímetros.

Os pratos de Petri foram alocados em uma caixa refrigerada à temperatura de 12°C, e irradiadas empregando uma lâmpada de polímero (Italquartz, Milan) de 125 Watt, tendo uma faixa de emissão compreendida entre 250 e 370 nm, e um pico de intensidade máxima em 310 nm. A distância entre a lâmpada e o prato de Petri foi de cerca de 30 cm. O tempo desses ciclos de irradiação foi na faixa de 15-90 minutos. Para cada concentração polimérica, foi determinado o intervalo de tempo para a obtenção de filmes de hidrogéis facilmente destacáveis do prato.

A Tabela 2 seguinte mostra, por exemplo, os tempos de irradiação necessários para a obtenção de filmes de hidrogéis, considerando três diferentes concentrações.

37/40

Tabela 2

Concentração de HA-EDA-MA (peso/volume)	Tempo para formar filmes de hidrogel à base de HAEDA-MA
2%	60 minutos
4%	45 minutos
8%	20 minutos

Exemplo 8 - Auto-reticulação de Hidrazina de Ácido Hialurônico (HA-Hy)

O derivado de HA-Hy obtido conforme o Exemplo 2, tendo um grau de funcionalização molar em grupos hidrazina igual a 50% mol/mol, foi dissolvido em água destilada para se obter uma concentração igual a 1% peso/volume. 0 pH da solução foi ajustado para 4,75 empregando poucas gotas de HCl 0,1 N.

Uma quantidade molar do composto de (l-etil-3(dimetilaminopropil-carbodiimida) (EDCI) igual à quantidade de grupos hidrazina ligados ao ácido hialurônico foi adicionada e o pH foi mantido constante através da adição de HCl 0,lN, até a formação de um hidrogel. O hidrogel foi recuperado e lavado com água destilada, depois, seco por congelamento.

O rendimento do hidrogel produzido foi de 80%, comparado ao polímero de partida, e o material sólido foi então caracterizado por meio de análise de FT-IR. .

Exemplo 9 - Produção de Hidrogéis de Copolímeros HA-EDA-BC.

Uma solução formadora de gel foi obtida mediante dispersão de uma adequada solução tampão de fosfato posterior agitação por 5 completa solubilização.

quantidade	de	polímero em	uma
da Dulbecco,	em pH 7,4,	com
minutos,	até	ser obtida	uma
Amostras	de	hidrogéis	em

38/40 concentração de 0,5 peso/volume, à base de HA-EDA-BC, foram preparadas mediante oxidação ao ar. Após a formação de gel, as amostras foram lavadas com água destilada e congeladas em nitrogênio líquido, secas por congelamento e observadas mediante uso de um microscópio de varredura de elétrons (SEM) . Conforme mostrado nas figuras 5a e 5b, o hidrogel à base de HA-EDA-BC mostra uma estrutura fibrilar com fibrilas interligadas, variando de diâmetro entre 500 nm e 1 pm.

Exemplo 10 - Encapsulamento de Condrócitos e Ensaio de

Viabilidade

Condrócitos humanos articulares, recentemente isolados da cartilagem articular humana, foram cultivados por duas passagens durante duas semanas em um meio DMEM completo. 0 composto de HA-EDA-BC seco por congelamento foi esterilizado por meio de irradiação UV (usando uma lâmpada de UV de 125 W) por 2 horas. Depois, 150 mg de HA-EDA-BC foram dissolvidas em 9,4 mL de um meio DMEM, suavemente agitado durante cerca de 10 minutos e, depois, a espuma formada foi removida por sonificação durante 3 minutos. P encapsulamento dos condrócitos foi conseguido pela adição de 0,6 mL de um meio DMEM, contendo 5 x 10⁶ células e suave agitação por poucos minutos, de modo a assegurar uma homogênea distribuição de células. Em seguida, 150 pL de uma suspensão formadora de gel foram derramados dentro de 24 poços de múltiplos pratos com inserções de NUNC CC (membranas de policarbonato). Os hidrogéis formadores de gel foram depois deixados por 2 horas, antes da adição de 1,1 mL de DMEM e incubação à temperatura de 37°C, com 5% de CO₂. A viabilidade dos condrócitos encapsulados foi avaliada pelo ensaio de MTS após 2 horas, 3, 7, 14 e 21 dias. Para cada dia, três inserções contendo hidrogel

39/40 encapsulado em HA-EDA-BC foram tratadas com 1000 mL de solução de MTS e deixadas reagir durante 4 horas. Em seguida, a absorbância foi lida em uma placa de 96 poços, em 550 nm (n=9), usando como branco um hidrogel isento de HA-EDA-BC, tratado como o hidrogel com condrócitos. O ensaio de cito-compatibilidade no estado vivo ou morto foi realizado no hidrogel carregado de condrócitos com HA-EDABC, mediante uso de um duplo procedimento de manchamento, usando calceina AM e homodimero de etidio III (Eth-III). A calceina AM é uma molécula permeável de célula, nãofluorescente, que é clivada no interior da célula, por meio de esterases intracelulares, para produzir sua contrapartida fluorescente (fluorescência verde). O Eth-III é uma mancha de ácido nucléico não permeável através de células viáveis, mas que pode se difundir através da membrana das células mortas, onde se liga ao DNA e proporciona uma fluorescência vermelha. Após três dias de cultura, as inserções contendo géis foram lavadas três vezes com PBS, pH 7,4, depois, incubadas por 1 hora com as soluções de manchamento e depois lavadas novamente, para remover o excesso de soluções de manchamento.

Os géis são montados em lábios de cobertura e analisados usando um microscópio de fluorescência Axioscop 2 (Zeiss), e capturados com uma câmera digital Axiocam (Zeiss), tendo a interface de um computador.

Conforme visto na figura 6, a absorbância obtida por análise de MTS aumenta durante todos os 21 dias de incubação, demonstrando uma satisfatória viabilidade e proliferação das células no interior da estrutura tipo andaime tridimensional de hidrogel à base de HA-EDA-BC.

A ilustração de fluorescência observada no estado vivo/morto (ver a figura 7), após três dias de cultura, mostra diversas células vivas e apenas poucas células mortas (ver os quadros na ilustração), desse modo,

40/40 indicando uma satisfatória biocompatibilidade do procedimento de encapsulamento. Na ilustração de cor original, as células vivas são de cor verde e as células mortas de cor vermelha.

A presente invenção foi aqui descrita com referência a algumas modalidades especificas, porém, deve ser pretendido que variações ou modificações óbvias poderão ser implementadas por especialistas versados na técnica, sem que seja afastado o escopo de proteção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para produção de derivados funcionalizados de ácido hialurônico, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas subsequentes:

a) ativação de pelo menos um grupo hidroxila do ácido hialurônico, na forma de um sal do mesmo, solúvel em solventes orgânicos, pela reação do dito sal de ácido hialurônico em um solvente polar aprótico com um agente de carbonilação selecionado de ésteres fenil-carbônicos e ésteres fenil-halofórmicos;

b) reação do sal de ácido hialurônico ativado resultante da etapa (a), por uma reação de substituição nucleofílica, com um composto de fórmula geral NH2-R, em que R é selecionado do grupo que consiste em NH2, um grupo aminoalquila, um grupo alquila ou uma cadeia arilalquila, uma cadeia poliacrílica, uma cadeia de polioxietileno ou um fármaco, um polímero ou uma proteína.

2/5 em dimetilsulfóxido, dimetilformamida, dimetilacetamida e suas misturas.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que ambas as etapas de ativação (a) e substituição nucleofílica (b) são realizadas a uma temperatura compreendida entre 10 °C e 60 °C.

7 . Processo para produção de hidrogel caracterizado pelo fato de submeter um derivado funcionalizado de ácido hialurônico obtido pelo processo

conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 a um procedimento de auto-reticulação, na presença de uma carbodiimida como agente de ativação, ou a uma reticulação química através do uso de agentes de reticulação bifuncionais ou polifuncionais.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que um derivado funcionalizado de ácido hialurônico na forma de sal, obtido a partir da dita etapa (b), é submetido a uma funcionalização adicional através de substituição nucleofílica, por reação com um composto que apresenta a fórmula Y-R', em que Y é um bom grupo de saída, selecionado dentre halogênio, N-oxisuccinimida, um grupo alcoxila com 1 a 6 átomos de carbono, ou Y representa a porção eletrofílica de um anidrido ou um epóxido, e R' é selecionado do grupo que consiste em acriloíla ou metacriloíla, ambos os grupos sendo opcionalmente substituídos, ou um grupo pertencendo a uma molécula solúvel em solventes orgânicos ou em solventes aquosos.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita funcionalização adicional é realizada em um meio aquoso ou em um solvente orgânico.

Petição 870190018528, de 22/02/2019, pág. 7/10

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito agente de carbonilação é selecionado dentre bis(4nitrofenilcarbonato) e clorofenilcarbonato.

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10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 e 9, caracterizado pelo fato de que a dita funcionalização adicional é realizada a uma temperatura compreendida entre 5 °C e 60 °C.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a dita funcionalização adicional é realizada na presença de um catalisador selecionado do grupo que consiste em dietilamina, trietilamina, dimetilaminopiridina e suas misturas.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o dito composto de fórmula Y-R^z corresponde a anidrido metacrílico, cloreto de metacriloíla, cloreto de acriloíla, acrilato de glicidila ou metacrilato de glicidila.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o dito composto de fórmula Y-R^z corresponde ao éster de Noxisuccinimida ou o diéster de N,N'-dibenzoil-L-cistina ou derivados similares.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o derivado obtido a partir da dita funcionalização adicional é submetido a um processo de redução, de modo a se obter uma porção de benzoilcisteína ou seus derivados similares.

15. Derivado funcionalizado de ácido hialurônico,

caracterizado pelo fato de apresentar um peso molecular na faixa de 50.000 a 1.500.000 Daltons, obtido a partir do processo conforme definido em qualquer uma das

reivindicações 1 a 14.

16. Derivado funcionalizado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o grau de funcionalização é compreendido entre pelo menos um grupo

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3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que o dito composto de fórmula geral NH2-R é selecionado de hidrazina e de um grupo diaminoalquila de fórmula NH2-(CH2)n-NH2, em que n é um número entre 1 e 30.

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hidroxila e o total de grupos hidroxila do ácido hialurônico. 17. Derivado funcionalizado, de acordo com

qualquer uma das reivindicações 15 e 16, caracterizado pelo fato de ser obtido a partir do processo conforme definido na reivindicação 12.

18. Hidrogel, compreendendo o derivado funcionalizado de ácido hialurônico conforme definido na reivindicação 17, obtido a partir de um processo de fotoreticulação, caracterizado pelo fato de que a concentração do dito derivado funcionalizado na solução aquosa ou orgânica é compreendida entre 1 % em peso/volume e 20 % em peso/volume.

19. Hidrogel, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de ser obtido por irradiação, com comprimentos de onda máximos na faixa de 180 a 800 nm, na presença ou ausência de um iniciador de radical, com tempos de irradiação variáveis de 5 minutos a 10 horas.

20. Hidrogel, compreendendo o derivado funcionalizado de ácido hialurônico conforme definido na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de ser obtido a partir de um processo de irradiação com raios γ, microondas ou outras radiações ionizantes.

21. Derivado funcionalizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 e 16, caracterizado pelo fato de ser obtido a partir do processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 13 e 14.

22. Hidrogel, compreendendo o derivado funcionalizado de ácido hialurônico conforme definido na reivindicação 21, caracterizado pelo fato de ser obtido a partir de um processo de auto-oxidação no ar.

23. Hidrogéis, obtidos a partir do processo conforme definido na reivindicação 7 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20 e 22,

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5/5 caracterizados pelo fato de serem produzidos na forma de nanopartículas ou micropartículas, filmes, membranas, fibras e estruturas tipo andaime.

24. Uso de hidrogéis conforme definidos na

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito sal de ácido hialurônico é selecionado dentre sal de tetrabutilamônio e sal de cetiltrimetilamônio.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito solvente polar aprótico é selecionado do grupo que consiste

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5 reivindicação 23, caracterizado pelo fato de ser para a produção de sistemas de liberação contínua de fármacos ou material genético, ou de sistemas para cobertura de feridas, órgãos ou tecidos, ou para materiais ou estruturas tipo andaime, implantáveis, para regeneração de tecidos.