BR122023020889A2 - Métodos para fornecimento de enzimas a uma planta - Google Patents

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BR122023020889A2
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Abstract

"MÉTODOS PARA FORNECIMENTO DE ENZI-MAS A UMA PLANTA". A presente invenção se refere a proteínas de fusão conten-do uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium de um membro da família Bacillus cereus. Tam-bém são fornecidos membros da família Bacillus cereus recombinante que expressam tais proteínas de fusão. Igualmente fornecidos são os membros da família Bacillus cereus inativados geneticamente e mem-bros da família Bacillus cereus recombinantes que sobrexpressam pro-teínas do exosporium. Igualmente fornecidos são as sementes revesti-das com membros da família Bacillus cereus recombinante e métodos para uso dos membros da família Bacillus cereus recombinante (por exemplo, para estimular o crescimento de plantas). Várias modifica-ções dos membros da família de Bacillus cereus recombinante que expressam as proteínas de fusão também são fornecidas. Proteínas de fusão que compreendem uma proteína de revestimento de esporos e uma proteína ou peptídeo de interesse, bactérias recombinantes que expressam tais proteínas de fusão, sementes revestidas com tais bac-térias recombinantes e métodos para uso de tais bactérias recombinantes (por exemplo, para estimular o crescimento de plantas) também são fornecidos.

Description

Dividido do BR112017005326-8, depositado em 17.09.2015. REFERÊNCIA CRUZADA EM RELAÇÃO AOS PEDIDOS
[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório N° de Série US 62/051,885, depositado em 17 de setembro de 2014, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS APRESENTADAS POR VIA ELE-TRÔNICA
[002] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida ele-tronicamente no EFS-Web como uma listagem de sequência formatada em ASCII com um arquivo chamado "3005.WO Gene Sequence Listing.txt", criado em 10 de setembro de 2015 e com um tamanho de 488 kilobytes, e está arquivada em simultâneo com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida neste documento em formato ASCII é parte do relatório descritivo e é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção se refere genericamente a proteínas de fusão contendo uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium, ou um fragmento de proteína do exosporium uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium de um membro da família Bacillus cereus. A invenção também se refere a membros da família Bacillus cereus recombinante que expressam tais proteínas de fusão, formulações contendo os membros da família Bacillus cereus recombinantes, sementes revestidas com os membros da família Bacillus cereus recombinantes, e métodos para usar os membros da família Bacillus cereus recombinantes (por exemplo, para estimular o cresci-mento das plantas, que protege uma planta a partir de um agente pa-togênico, aumentando a resistência ao estresse em uma planta, imobi-lizando esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante em uma planta, estimular a germinação de sementes de plantas, e distribuição de ácidos nucleicos para as plantas). A invenção se refere adicionalmente a membros da família Bacillus cereus recombinantes que superexpressam uma protease ou uma nuclease, em que a sobreexpressão da protease ou da nuclease parcialmente ou completamente inativa esporos do membro da família Bacillus cereus ou torna os esporos mais suscetíveis à inativação química ou física. A presente invenção se refere ainda a membros da família Bacillus cereus recombinantes que sobre-expressam proteínas do exosporium, sementes revestidas com tais membros da família Bacillus cereus recombinantes, e métodos de utilização de tais membros da família Bacillus cereus recombinantes (por exemplo, para estimular o crescimento das plantas, aumentando a resistência ao estresse nas plantas e proteger as plantas de agentes patogênicos).
[004] A invenção diz ainda respeito a várias modificações dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam as proteínas de fusão, incluindo: (i) a sobre-expressão de proteínas moduladoras que modulam a expressão da proteína de fusão recombinante nos membros de Bacillus cereus; (ii) a inativação genética dos membros da família Bacillus cereus recombinantes; e (iii) as mutações ou outras alterações genéticas dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que permitam a recolha de fragmentos de exosporium contendo a proteína de fusão. A invenção também se refere a vários métodos para a utilização dos fragmentos exosporium.
[005] A invenção diz ainda respeito a proteínas de fusão compreendendo uma proteína de revestimento de esporos e uma proteína ou peptídeo de interesse, bactérias recombinantes que expressam essas proteínas de fusão, sementes revestidas com tais bactérias recombinantes e métodos para usar tais bactérias recombinantes (por exemplo, para estimular o crescimento das plantas, proteger uma planta a partir de um agente patogênico, aumentando a resistência à tensão em uma planta, imobilizando um recombinante de esporos bacterianos sobre uma planta, estimular a germinação de sementes de plantas, e distribuir ácidos nucleicos para plantas).
[006] A presente invenção também diz respeito a culturas bacterianas biologicamente puras das novas cepas de bactérias.
[007] A presente invenção se refere, adicionalmente, para plantar sementes revestidas com uma enzima que catalisa a produção de óxi-donítrico ou um superóxido dismutase, ou com uma bactéria formadora de esporos recombinante que sobre-expressa uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou uma superóxido-dismutase.
[008] A invenção também se refere a métodos para a distribuição de bactérias benéficas e enzimas ou vacinas para animais, e outros métodos de utilização.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[009] Dentro da zona circundante das raízes de uma planta está uma região chamada de rizosfera. Na rizosfera, bactérias, fungos, e outros organismos competem por nutrientes e para a ligação com as estruturas da raiz da planta. Ambas as bactérias e os fungos prejudiciais e benéficos podem ocupar a rizosfera. As bactérias, fungos, e o sistema radicular da planta podem ser influenciados pelas ações de peptídeos, enzimas e outras proteínas na rizosfera. Aumento de solo ou tratamento de plantas com certos peptídeos, enzimas, ou outras proteínas que têm efeitos benéficos sobre as populações totais de bactérias do solo e fungos benéficos, cria um ambiente do solo em geral mais saudável para o crescimento das plantas, melhora o crescimento das plantas, e fornece a proteção das plantas contra determinados agentes patogênicos bacterianos e fúngicos. No entanto, tentativas anteriores para introduzir peptídeos, enzimas e outras proteínas no solo para induzir esses efeitos benéficos sobre as plantas têm sido dificultadas pela baixa sobrevivência de enzimas, proteínas e peptídeos no solo. Além disso, a prevalência de proteases naturalmente presentes no solo conduz à degradação das proteínas no solo. O ambiente em torno das raízes de uma planta (a rizosfera) é uma mistura única de bactérias, fungos, nutrientes, e as raízes que tem qualidades diferentes do que a do solo nativo. A relação simbiótica entre estes organismos é única, e pode ser alterada para melhor com a inclusão de proteínas exógenas. A alta concentração de fungos e bactérias na rizosfera provoca ainda maior degradação das proteínas devido a níveis anormalmente elevados de proteases e de outros elementos prejudiciaisàs proteínas no solo. Além disso, as enzimas e outras proteínas introduzidas no solo podem dissipar a partir de raízes de plantas rapidamente.
[0010] Assim, existe uma necessidade na técnica para um método eficaz para a distribuição de peptídeos, enzimas e outras proteínas de plantas (por exemplo, para sistemas de raízes das plantas) e para prolongar o período de tempo durante o qual essas moléculas permanecem ativas. Além disso, existe uma necessidade na técnica de um método de direcionamento seletivo de tais peptídeos, enzimas e proteínas para a rizosfera e folhas da planta e as raízes das plantas em particular.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] As características da invenção são definidas nas reivindicações anexas e a lista de modalidades fornecidas abaixo na seção intitulada "MODALIDADES". Outros objetivos e características serão em parte evidentes e em parte assinalados adiante.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0012] As FIGs. 1A e 1B mostram os alinhamentos da sequência de aminoácidos de uma porção amino-terminal de cepa Bacillus anthracis Sterne BclA e com a região correspondente de várias proteínas do exosporium de membros da família Bacillus cereus.
[0013] A FIG. 2 mostra exemplos de resultados de microscopia fluorescente para a expressão de proteínas de fusão contendo várias proteínas do exosporium ligadas a um repórter mCherry na exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante.
[0014] A FIG 3 apresenta dados que mostram a esporos Bacillus thuringiensis BT013A recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de ligação de DNA.
[0015] A FIG. 4 é uma micrografia de transmissão eletrônica mostrando fragmentos e um esporo exosporium membro da família Bacillus cereus a partir do qual o exosporium se perdeu, gerado utilizando um membro da família Bacillus cereus recombinante que tem uma mutação knock-out do seu gene CotE.
[0016] A FIG. 5 é uma fotografia de um gel de SDS-PAGE que mostra um padrão de marcador de proteína (pista 1) e proteínas a partir de fragmentos exosporium gerado usando um membro da família Bacillus cereus recombinante que tem uma mutação knock-out do seu gene Cote (pista 2).
[0017] A FIG. 6 fornece dados que ilustram a atividade da enzima de uma fosfatase ácida em fragmentos de exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus que tem uma mutação knockout do seu gene Cote.
[0018] A FIG. 7 fornece dados que ilustram que o membro da família Bacillus cereus EE349 reduz os efeitos inibitórios do herbicida no comprimento radicular em lentilhas.
[0019] FIG. 8 fornece dados que ilustram o aumento da atividade da fosfatase num membro da família Bacillus cereus modificado para superexpressão da fosfatase ácida (AcpC).
[0020] A FIG. 9 fornece dados que mostram a atividade endoglucanase de esporos de Bacillus thuringiensis recombinante expressando uma proteína de fusão CotC-endoglucanase.
[0021] A FIG. 10 fornece campo claro e fluorescência que mostram imagens de microscopia de detecção de RNA sobre a superfície dos esporos B. thuringiensis recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1 e SspC ligados a ambos os RNA de cadeia simples (ssRNA) ou de RNA de cadeia dupla (dsRNA).
[0022] A FIG. 11 fornece uma fotografia que mostra os efeitos do microRNA MIR319 sobre a altura da soja e desenvolvimento radicular, após a distribuição de plantas de soja utilizando esporos B. thuringiensis recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1 e ligado a SSPC MIR319.
[0023] A FIG. 12 fornece campo claro e fluorescência que mostram imagens de microscopia de detecção de GFP e mCherry no intestino de nemátodos alimentados com OP50 E. coli bacteriana alimentar normal (dois painéis direitos) ou nemátodos alimentados com esporos de B. thuringiensis que expressam uma proteína de fusão compreendendo os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1 e GFP ou mCherry (três painéis esquerdos).
[0024] A FIG. 13 fornece uma imagem de microscopia de fluorescência que mostra a detecção de bactérias endofíticas de dentro das plantas de milho tratadas com Bacillus thuringiensis EE-B00184 expressando uma proteína de fusão compreendendo os aminoácidos 2035 da SEQ ID NO: 1 e GFP. Setas indicam esporos individuais.
[0025] A FIG. 14 fornece uma fotografia que mostra a fluorescência de colônias de bactérias contendo membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1 e GFP, isolados a partir de dentro de plantas de milho desenvolvidas a partir de sementes revestidas com as bactérias recombinantes.
[0026] A FIG. 15 fornece uma micrografia eletrônica de transmissão mostrando: (A) esporos intactos de Bacillus thuringiensis BT013A cercados por exosporium em anexo; (B) esporos da cepa CotE knockout de Bacillus thuringiensis BT013A, com exosporium individual; e (C) uma preparação de fragmento exosporium purificada de fragmentos exosporium derivados de uma cepa CotE knockout Bacillus thuringiensis BT013A.
DEFINIÇÕES
[0027] Quando os artigos "uma,""um,""uma,""o", e "referido" são aqui utilizados, significam "pelo menos um" ou "um ou mais", a menos que indicado de outra forma.
[0028] Os termos "veículo aceitável em agricultura" e "veículo" são aqui utilizados indiferentemente.
[0029] O termo "animal" compreende qualquer animal não humano, bem como seres humanos. Por exemplo, onde o termo "animal" é aqui utilizado, o animal pode ser um mamífero (por exemplo, um humano, ovelha, cabra, vaca, porco, veado, alpaca, bisontes, camelos, burro, cavalo, mula, lama, coelho, cão, ou gato), um pássaro (por exemplo, um frango, peru, pato, ganso, codorna, ou faisão), um peixe (por exemplo, salmão, truta, tilápia, atum, peixe-gato, ou uma carpa), ou um crustáceo (por exemplo, um camarão, camarão grande, lagosta, caranguejo ou lagostim).
[0030] Uma "cultura bacteriana biologicamente pura" se refere a uma cultura de bactérias que não contêm outras espécies bacterianas em quantidades suficientes para interferir com a replicação de cultura ou ser detectada por técnicas bacteriológicas normais. Dito de outra maneira, é uma cultura em que praticamente todas as células bacterianas presentes são da cepa selecionada.
[0031] Os termos "compreendendo", "incluindo" e "tendo"destinam-se a ser inclusivos e significam que pode haver outros elementos adicionais do que os elementos listados.
[0032] O termo "peptídeo bioativo" se refere a qualquer peptídeo que exerce uma atividade biológica. "Peptídeos bioativos" podem ser gerados, por exemplo, através da clivagem de uma proteína, peptídeo, pró-proteína, ou preproproteína por uma protease ou peptidase.
[0033] O termo "quantidade eficaz" se refere a uma quantidade que é suficiente para resultar num aumento estatisticamente significativo do crescimento e/ou produção de proteína e/ou de produção de grãos de uma planta, em comparação com o rendimento de crescimento, rendimento de proteína e grão da planta de tratamento de controle.
[0034] Uma "enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de planta" inclui qualquer enzima que catalisa qualquer etapa de uma via de síntese biológica de um composto que estimula o crescimento de planta ou altera a estrutura da planta, ou qualquer enzima que catalisa a conversão de uma forma inativa ou derivado menos ativo de um composto que estimula o crescimento de planta ou altera estrutura de planta de uma forma ativa ou mais ativa do composto. Tais compostos incluem, por exemplo, mas não estão limitados a hormônios de pequenas moléculas de plantas, tais como auxinas e citocininas, peptídeos bioativos, e moléculas de estimulação de crescimento de pequenas plantas sintetizadas por bactérias ou fungos na rizosfera (por exemplo, 2,3-butanodiol).
[0035] O termo "proteína de fusão", tal como aqui utilizado se refere a uma proteína com uma sequência polipeptídica que compreende sequências derivadas a partir de duas ou mais proteínas diferentes. Uma proteína de fusão pode ser gerada através da junção de uma molécula de ácido nucleico que codifica toda ou parte de um primeiro polipeptídeo com uma molécula de ácido nucleico que codifica toda ou parte de um segundo polipeptídeo para criar uma sequência de ácido nucleico que, quando expressa, produz um único polipeptídeo possuindo propriedades funcionais derivadas de cada uma das proteínas originais.
[0036] O termo "taxa de germinação", tal como aqui utilizado se refere ao número de sementes que germinam durante um determinado período de tempo. Por exemplo, uma taxa de germinação de 85% indica que 85 de 100 sementes germinam durante um determinado período de tempo.
[0037] O termo "inativa" ou "inativação", tal como aqui utilizado em referência à inativação de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante ou uma bactéria formadora de esporos recombinante significa que os esporos são incapazes de germinar, ou que os esporos podem germinar, mas são danificados de tal forma que a germinação não resulta numa bactéria viva. Os termos "parcialmente inativar" ou "inativação parcial" significa que uma percentagem dos esporos é inativada, mas que alguns esporos mantêm a capacidade de germinar e retornam a um estado de replicação vivo. O termo "inativação genética"se refere à inativação de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante ou bactéria formadora de esporos recombinante por uma mutação do DNA do esporo que resulta na inativação parcial ou completa do esporo. Os termos "inativação física"e "inativação química se referem à inativação de esporos, utilizando quaisquer meios físicos ou químicos, por exemplo, por tratamento de calor, irradiação gama, irradiação de raios-x, irradiação UV-A, irradiação com UV-B, ou o tratamento com um solvente, tal como glutaraldeido, formaldeído, peróxido de hidrogênio, ácido acético, água sanitá-ria,clorofórmio, ou fenol, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0038] Os termos "imobilização de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante em uma planta" e "a imobilização de um esporo de uma bactéria formadora de esporos recombinante numa planta" se referem à ligação de esporos de um membro da famíliaBacillus cereus recombinante ou um esporo de uma bactéria formadora de esporos recombinante para plantar, por exemplo, a raiz de uma planta ou a uma parte aérea de uma planta tal como uma folha, caule, flor ou fruto, de tal modo que o esporo é mantido na estrutura de raiz da planta ou parte aérea, em vez de dissipar para o meio de crescimento da planta ou para o ambiente em torno das partes aéreas da planta.
[0039] O termo "inoculante" tal como descrito na presente invenção é definido em vários regulamentos Federais, ou regulamentos Estaduais como (1) "inoculantes de solo ou plantas incluem qualquer transportador ou cultura de um micro-organismo ou uma mistura específica de microrganismos representados para melhorar o solo ou o crescimento, qualidade ou produtividade das plantas, e deve também incluir qualquer semente ou fertilizante representado a ser inoculado com uma cultura"(New York State 10-Lei consolidada); (2) "com exceção de substâncias fertilizantes, fabricadas, vendidas ou representadas para uso na melhoria da condição física do solo ou para auxiliar o crescimento da planta ou rendimentos das colheitas" (Canada Fertilizers Act); (3) "uma formulação contendo misturas puras ou prédeterminadas de bactérias, fungos ou partículas de vírus vivo para o tratamento de sementes, plântulas ou de outro material de propagação de plantas com o objetivo de aumentar a capacidade de crescimento ou resistência a doenças ou de outro modo alterar as propriedades de eventuais plantas ou culturas" (Ad hoc Grupo Europeu de Trabalho, 1997) ou (4)" significando qualquer substância química ou biológica da mistura de substâncias ou dispositivo distribuído nesse estado a ser aplicado ao solo, plantas ou sementes para fins de correção do solo; ou que se destina a melhorar a germinação, o crescimento, a qualidade, rendimento, qualidade do produto, reprodução, sabor, ou outras características desejáveis de plantas ou que se destina a produzir qualquer produto químico, bioquímica, biológica ou mudança física no solo" (Artigo 14513 do Código de Alimentos e Agricultura da Califórnia).
[0040] Uma "proteína moduladora" inclui qualquer proteína que, quando sobre-expressa em um membro da família Bacillus cereus que expressa qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, modula a expressão da proteína de fusão, de tal modo que a expressão da proteína de fusão é aumentada ou diminuída, em comparação com a expressão da proteína de fusão num membro da família Bacillus cereus que não sobre-expressa a proteína moduladora.
[0041] Um "meio de crescimento de planta" inclui qualquer material que seja capaz de suportar o crescimento de uma planta.
[0042] Um "uma proteína ou peptídeo potencializadores de siste-maimunológico de planta", tal como aqui utilizado, inclui qualquer pro-teína ou peptídeo que tem um efeito benéfico sobre o sistema imunológico de uma planta.
[0043] O termo "proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de planta", tal como aqui utilizado, inclui qualquer proteína ou peptídeo que aumenta o crescimento das plantas em uma planta expostaà proteína ou peptídeo.
[0044] O termo "probiótico", tal como aqui utilizado se refere a mi-crorganismos (por exemplo, bactérias) que fornecem benefícios para a saúde, quando consumidos por ou administrados a um animal.
[0045] Os termos "que promovem o crescimento da planta" e "es-timulantes do crescimento de plantas"são aqui utilizados indiferente-mente, e se referem à capacidade de aumentar ou aumentar, pelo menos, um de a altura da planta, o peso, o tamanho da folha, comprimento de raiz, ou tamanho do tronco, para aumentar a produção de proteína a partir da planta ou para aumentar a produção de grãos da planta.
[0046] Uma "proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico", tal como aqui utilizado, inclui qualquer proteína ou peptídeo que faz com que uma planta exposta à proteína ou peptídeo menos suscetível à infecção com um agente patogênico.
[0047] Uma "proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta" tal como aqui utilizado, inclui qualquer proteína ou peptídeo que faz com que uma planta exposta à proteína ou peptídeo sejam mais resistentes ao stress.
[0048] O termo "proteína de ligação a planta ou peptídeo"se refere a qualquer peptídeo ou proteína capaz de especificamente ou não especificamente ligar a qualquer parte de uma planta (por exemplo, raízes ou porções aéreas de uma planta, tais como folhas de folhagem, caules, flores ou frutos) ou matéria vegetal.
[0049] O termo "piretrinase" se refere a qualquer enzima que degrada uma piretrina ou um piretroide.
[0050] O termo "rizosfera"é utilizado alternadamente com "zona de raiz" para denotar aquele segmento do solo que rodeia as raízes de uma planta e é influenciado pelos mesmos.
[0051] O termo "sequência de direcionamento" tal como aqui utilizado se refere a uma sequência de polipeptídeo que, quando presente como parte de um polipeptídeo mais longo ou uma proteína, resulta na localização do polipeptídeo mais longo ou da proteína para uma localização subcelular específica. As sequências de direcionamento aqui descritas resultam na localização de proteínas para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO I.PROTEÍNAS DE FUSÃO PARA A EXPRESSÃO EM MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS E MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTES EXPRESSANDO TAIS PROTEÍNAS DE FUSÃO
[0052] A presente invenção se refere a proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium, ou um fragmento de proteína do exosporium direciona a proteína de fusão ao exosporium do membro da família Bacillus cereus e, pelo menos, uma proteína ou peptídeo de interesse. Quando expressa em membro da família Bacillus cereus, estas proteínas de fusão são dirigidas para a camada exosporium do esporo e estão fisicamente orientadas de tal modo que a proteína ou peptídeo de interesse está apresentada do lado de fora do esporo.
[0053] Este sistema de exposição de Bacillus exosporium (BEMD) pode ser usado para distribuir peptídeos, enzimas e outras proteínas de plantas (por exemplo, à folhagem das plantas, frutos, flores, caules ou raízes) ou para um meio de crescimento de plantas tal como o solo. Os peptídeos, enzimas e proteínas distribuídas no solo ou outro meio de crescimento da planta desta maneira persistem e exibem atividade no solo por longos períodos de tempo. Introdução de bactérias membras da família Bacillus cereus recombinantes que expressam as proteínas de fusão descritas aqui no solo ou a rizosfera de uma planta conduz a uma melhoria benéfica do crescimento das plantas em diversas condições do solo. O uso do BEMD para criar estas enzimas permite que estas continuem a exercer os seus resultados benéficos para a planta e a rizosfera durante os primeiros meses de vida das plantas.
A. Sequências de direcionamento, Proteínas do exosporium e Fragmentos de Proteína do exosporium para Segmentação de Proteínas ou Peptídeos de Interesse da Exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante
[0054] Para facilidade de referência, as descrições de sequências de aminoácidos para as sequências de direcionamento, proteínas do exosporium, e fragmentos de proteínas do exosporium que podem ser utilizadas para o direcionamento de proteínas ou peptídeos de interesse para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus são fornecidos na Tabela 1, juntamente com as suas SEQ ID NOs. TABELAI. AS SEQUÊNCIAS DE PEPTÍDEOS E DE PROTEÍNAS UTILIZADAS PARA O DIRECIONAMENTO DE PROTEÍNAS OU PEPTÍDEOS DE INTERESSE PARA O EXOSPORIUM DE MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS AA = aminoácidos 1 cepa Sterne de B. anthracis BclA tem 100% de identidade de se-quência com B. thuringiensis BclA. Assim, SEQ ID NOs: 1, 2, e 95 também representam os aminoácidos 1-41 de B. thuringiensis BclA, comprimento total de B. thuringiensis BclA, e aminoácidos 1-196 de B. thuringiensis BclA, respectivamente. De igual modo, a SEQ ID NO: 96 representa também um resíduo metionina mais aminoácidos 20-35 de B. thuringiensis BclA. 2 * B. mycoidesproteína hipotética TIGR03720 tem 100% de identidade de sequência com B. mycoidesproteína hipotética WP003189234. Assim, SEQ ID NOs: 57 e 58 representam também os aminoácidos 1-136 de B. mycoidesproteína hipotética WP003189234 e comprimento total de B. mycoidesproteína hipotética WP003189234, respectivamente.
[0055] Bacillusé um gênero de bactérias em forma de bastonete. A família de bactérias Bacillus cereus inclui qualquer espécie de Bacillus que é capaz de produzir um exosporium. Assim, a família de bactérias Bacillus cereus inclui as espécies Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, e Bacillus toyoiensis. Sob condições ambientais estressantes, família de bactérias Bacillus cereus passa por esporulação e formam endósporos ovais que podem permanecer dormentes por longos períodos de tempo. A camada mais exterior dos endósporos é conhecida como o exosporium e compreende uma camada basal rodeada por uma penugem externa de projeções semelhantes a cabelos. Os filamentos sobre a penugem semelhante a cabelo são predominantemente formados pela glicoproteína BclA semelhante a colágeno, enquanto que a camada basal é constituída por um número de proteínas diferentes. Uma outra proteína relacionada com o colágeno, BclB, também está presente no exosporium e exposta em endósporos de membros da família Bacillus cereus. BclA, o principal constituinte da penugem de superfície, tem sido mostrado como ligado ao exosporium com o seu amino-terminal (N-terminal) posicionado na camada basal e o seu carboxi-terminal (C-terminal) que se estende para fora a partir do esporo.
[0056] Foi constatado previamente que determinadas sequências das regiões N-terminais de BclA BclB e poderiam ser usadas para atingir um peptídeo ou proteína para o exosporium de um endósporo Bacillus cereus (ver Pedido de Patente US Nos. 2010/0233124 e 2011/0281316, e Thompson et al., Targeting of the BclA and BclB pro-teins to the Bacillus anthracis spore surface, Molecular Microbiology 70 (2): 421-34 (2008)). Verificou-se também que a proteína BetA/proteína BAS3290 de Bacillus anthracis localizada ao exosporium.
[0057] Em particular, os aminoácidos 20-35 de BclA de Bacillus anthracis cepa Sterne foram encontrados como sendo suficientes para o direcionamento para o exosporium. Um alinhamento de sequências de aminoácidos 1-41 de BclA (SEQ ID NO: 1) com as regiões corres-pondentes de terminal-N de várias outras proteínas do exosporium da família Bacillus cereus e proteínas Bacillus cereus da família possuin-dosequências relacionadas é mostrado nas Figuras 1A e 1B. Como pode ser visto a partir das Figuras 1A e 1B, existe uma região de alta homologia entre todas as proteínas na região correspondente aos aminoácidos 20-41 de BclA. No entanto, nestas sequências, os aminoácidos correspondentes aos aminoácidos 36-41 de BclA contêm es-truturasecundária e não são necessárias para a localização da proteína de fusão para o exosporium. A região conservada da sequência de direcionamento BclA (aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1) é mostrada em negrito nas figuras 1A e 1B e corresponde à sequência de dire-cionamentomínimas necessárias para a localização da exosporium. Uma região mais altamente conservada que abrange os aminoácidos 25-35 de BclA dentro da sequência de direcionamento é sublinhada nas sequências das Figuras 1A e 1B, e representa a sequência de re-conhecimento para ExsFA/BxpB/ExsFB e homólogos, que dirigem e montam as proteínas descritas na superfície do exosporium. As se-quências de aminoácidos da SEQ ID NOS. 3, 5, e 7 na Figura 1A são os aminoácidos 1-33 de cepa Sterne de Bacillus anthracis BetA/BAS3290, uma metionina seguida de aminoácidos 2-43 de cepa Sterne de Bacillus anthracis BAS4623, e aminoácidos 1-34 de cepa Sterne de Bacillus anthracis BclB, respectivamente. (Para BAS4623, verificou-se que a substituição da valina na posição 1 presente na pro-teína nativa com uma metionina resulta em melhor expressão.) Como pode ser visto a partir da Figura 1A, cada uma destas sequências contém uma região conservada correspondente aos aminoácidos 20-35 de BclA (SEQ ID NO: 1; mostrado em negrito), e uma região mais altamente conservada que corresponde aos aminoácidos 20-35 de BclA (sublinhado).
[0058] Proteínas adicionais de membros da família Bacillus cereus também contêm a região de direcionamento conservada. Em particular, nas Figuras 1A e 1B, SEQ ID NO: 9 é constituída pelos aminoácidos 1-30 de cepa Sterne de Bacillus anthracis BAS1882, SEQ ID NO: 11 é constituída pelos aminoácidos 1-39 do produto de gene Bacillus weihenstephensis KBAB4 2280, SEQ ID NO: 13 é constituída pelos aminoácidos 1-39 do produto de gene Bacillus weihenstephensis 3572 KBAB4, SEQ ID NO: 15 é constituída pelos aminoácidos 1-49 de Bacillus cereus VD200 peptídeo principal exosporium, SEQ ID NO: 17 é constituída pelos aminoácidos 1-33 de Bacillus cereus VD166 peptídeo principal exosporium, SEQ ID NO: 19 é constituída pelos aminoácidos 1-39 de Bacillus cereus VD200 proteína hipotética IKG_04663, SEQ ID NO: 21 é constituída pelos aminoácidos 1-39 de Bacillus weihenstephensis KBAB4 YVTN proteína e-hélice, SEQ ID NO: 23 é constituída pelos aminoácidos 1-30 de Bacillus weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2363, SEQ ID NO: 25 é constituída pelos aminoácidos 1-30 de Bacillus weihenstephensis KBAB4 proteína hipo-tética bcerkbab4_2131, SEQ ID NO: 27 é constituída pelos aminoácidos 1-36 de Bacillus weihenstephensis KBAB4 hélice tripla de repetição contendo colágeno, SEQ ID NO: 29 é constituída pelos aminoácidos 1-39 de Bacillus mycoides 2048 proteína hipotética bmyco0001_21660, SEQ ID NO: 31 é constituída pelos aminoácidos 130 de Bacillus mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_22540, SEQ ID NO: 33 é constituída pelos aminoácidos 1-21 de Bacillus mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_21510, SEQ ID NO: 35 é constituída pelos aminoácidos 1-22 de Bacillus thuringiensis 35646 colágeno proteína hélice tripla de repetição, SEQ ID NO: 43 é constituída pelos aminoácidos 1-35 de Bacillus cereusproteína hipotética WP_69652, SEQ ID NO: 45 é constituída pelos aminoácidos 1-41 de Bacillus cereus exosporium principal WP016117717, SEQ ID NO: 47 é constituída pelos aminoácidos 1-49 de Bacillus cereuspeptídeo exosporium WP002105192, SEQ ID NO: 49 é constituída pelos aminoácidos 1-38 de Bacillus cereus WP87353 proteína hipotética, SEQ ID NO: 51 é constituída pelos aminoácidos 1-39 de Bacillus cereuspeptídeo exosporium 02112369, SEQ ID NO: 53 é constituída pelos aminoácidos 1-39 de Bacillus cereus WP016099770 proteína do exosporium, SEQ ID NO: 55 é constituída pelos aminoácidos 1-36 de Bacillus thuringiensisproteína hipotética YP006612525, SEQ ID NO: 57 é constituída pelos aminoácidos 1-136 de Bacillus mycoidesproteína hipotética TIGR03720, SEQ ID NO: 59 é constituída pelos aminoácidos 1-36 de B. cereus ATCC 10987 proteína do domínio de repetição tripla hélice de colágeno, SEQ ID NO: 61 é constituída pelos aminoácidos 1-39 de B. cereus E33L proteína semelhante a colágeno, SEQ ID NO: 63 é constituída pelos aminoácidos 1-41 de B. weihenstephanensis KBAB4 hélice tripla de repetição contendo colágeno, SEQ ID NO: 65 é consti-tuída pelos aminoácidos 1-30 de B. thuringiensis str. Al Hakam proteí-nahipotética BALH_2230, SEQ ID NO: 67 é constituída pelos aminoácidos 1-33 de B. cereus ATCC 14579 hélice tripla de repetição conten-docolágeno, SEQ ID NO: 69 é constituída pelos aminoácidos 1-44 de B. cereuscolágeno hélice tripla de repetição, SEQ ID NO: 71 é constituída pelos aminoácidos 1-38 de B. cereus ATCC 14579 hélice tripla de repetição contendo colágeno, SEQ ID NO: 73 é constituída pelos aminoácidos 1-30 de B. cereus E33L proteína hipotética BCZK1835, SEQ ID NO: 75 é constituída pelos aminoácidos 1-48 de B. weihenstephanensis KBAB4 hélice tripla de repetição contendo colágeno, SEQ ID NO: 77 é constituída pelos aminoácidos 1-30 de B. cereushélice tripla de repetição contendo colágeno ATCC 14579, SEQ ID NO: 79 é constituída pelos aminoácidos 1-39 de B. cereusproteína hipotética ATCC 14579 BC4725, SEQ ID NO: 81 é constituída pelos aminoácidos 1-44 de B. cereusproteína hipotética E33L BCZK4476, SEQ ID NO: 83 é constituída pelos aminoácidos 1-40 de B. anthracis str. Hélice tripla repetição contendo colágeno ‘Ames Ancestor’, SEQ ID NO: 85 é constituída de aminoácidos 1-34 de B. thuringiensis serovar konkukian str. 97-27 proteína BclA, SEQ ID NO: 87 é constituída pelos aminoácidos 1-34 de B. cereusproteína hipotética conservada ATCC 10987, SEQ ID NO: 89 é constituída pelos aminoácidos 1-34 de B. cereushélice tripla de repetição contendo colágeno ATCC 14579, SEQ ID NO: 91 é constituída pelos aminoácidos 1-99 de B. cereuspeptídeo principal exosporium sequência parcial, e SEQ ID NO: 93 é dos aminoácidos 1136 de B. weihenstephanensisproteína hipotética ER45_27600. Tal como mostrado nas Figuras 1A e 1B, cada uma das regiões Nterminais destas proteínas contém uma região que é conservada com os aminoácidos 20-35 de BclA (SEQ ID NO: 1), e uma região mais altamente conservada que corresponde aos aminoácidos 25-35 de BclA.
[0059] Qualquer porção de BclA que inclui os aminoácidos 20-35 pode ser utilizada como alvo para uma proteína de fusão para o exosporium. Além disso, as proteínas do exosporium de comprimento completo ou fragmentos de proteínas do exosporium podem ser utilizadas para alvejar as proteínas de fusão para o exosporium. Assim, de comprimento completo de BclA ou um fragmento de BclA que inclui os aminoácidos 20-35 pode ser usado para o direcionamento para o exosporium. Por exemplo, comprimento completo de BclA (SEQ ID NO: 2) ou um fragmento de tamanho médio de BclA que carece de terminal carboxi, tais como SEQ ID NO: 95 (aminoácidos 1-196 de BclA) podem ser utilizados para direcionar para as proteínas de fusão o exosporium. Fragmentos de médio porte, tais como o fragmento da SEQ ID NO: 95 com menos do que a estrutura secundária de comprimento completo de BclA e foi encontrado para ser adequado para utilização como uma sequência de direcionamento. A sequência de dire-cionamentotambém pode compreender porções muito mais curtas de BclA que incluem os aminoácidos 20-35, tal como SEQ ID NO: 1 (aminoácidos 1-41), BclA de aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 96 (um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 20-35 de BclA). Mesmo fragmentos mais curtos de BclA que incluem apenas alguns dos aminoácidos 2035 também exibem a capacidade para direcionar proteínas de fusão para o exosporium. Por exemplo, a sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1.
[0060] Alternativamente, qualquer porção de BetA/BAS3290, BAS4623, BclB, BAS1882, o produto do gene KBAB4 2280, o produto do gene KBAB4 3572, B. cereuspeptídeo principal exosporium VD200, B. cereuspeptídeo principal exosporium VD166, B. cereus VD200 proteína hipotética IKG_04663, B. weihenstephensis KBAB4 YVTN proteína e-hélice, B. weihenstephensisKBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2363, B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2131, B. weihenstephensis KBAB4 repetição tripla hélice que contém colágeno, B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyco0001_21660, B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_22540, B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_21510, B. thuringiensis 35646 colágeno tripla hélice de re-petição da proteína, B. cereus proteína hipotética WP_69652, B. cereus exosporium principal WP016117717, B. cereuspeptídeo exosporium WP002105192, B. cereusproteína hipotética WP87353, B. cereus peptídeo exosporium 02112369, B. cereus WP016099770 proteína do exosporium, B. thuringiensisproteína hipotética YP006612525, B. mycoidesproteína hipotética TIGR03720, B. cereus ATCC 10987 proteína domínio de repetição tripla hélice de colágeno, B. cereus E33L proteína semelhante a colágeno, B. weihenstephanensis KBAB4 tripla hélice de repetição contendo colágeno, B. thuringiensis str. Al Hakam BALH_2230 proteína hipotética, B. cereus ATCC 14579 hélice tripla de colágeno contendo repetição, B. cereus tripla hélice de repetição de colágeno, B. cereus ATCC 14579 hélice tripla de repetição contendo colágeno, B. cereus E33L proteína hipotética BCZK1835, B. weihenstephanensis KBAB4 tripla hélice de repetição contendo colágeno, B. cereushélice tripla de repetição contendo colágeno ATCC 14579, B. cereus ATCC 14579 proteína hipotética BC4725, B. cereus E33L proteína hipotética BCZK4476, B. anthracis str. Hélice tripla de repetição contendo colágeno ‘Ames Ancestor’, B. thuringiensis serovar konkukian str. 97-27 proteína BclA, B. cereusproteína hipotética conservada ATCC 10987, B. cereus ATCC 14579 hélice tripla de repetição contendocolágeno, B. cereuspeptídeo principal exosporium sequência parcial, ou B. weihenstephanensis proteína hipotética ER45_27600 que inclui os aminoácidos correspondentes aos aminoácidos 20-35 de BclA podem servir como a sequência de direcionamento.
[0061] Como pode ser visto a partir da Figura 1A, os aminoácidos 12-27 de BetA/BAS3290, aminoácidos 23-38 de BAS4623, aminoácidos 13-28 de BclB, aminoácidos 9-24 de BAS1882, aminoácidos 18-33 de produto do gene KBAB4 2280, os aminoácidos 18-33 de produto do gene 3572 KBAB4, aminoácidos 28-43 de B. cereuspeptídeo principal VD200 exosporium, aminoácidos 12-27 de B. cereuspeptídeo principal VD166 exosporium, aminoácidos 18-33 de B. cereus VD200 proteína hipotética IKG_04663, aminoácidos 18-33 B. weihenstephensis KBAB4 YVTN proteína e-hélice, aminoácidos 9-24 de B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2363, aminoácidos 9-24 de B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2131, aminoácidos 15-30 de B. weihenstephensis KBAB4 triple helix de repetição contendo colágeno, aminoácidos 18-33 de B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyco0001_21660, aminoácidos 9-24 de B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_22540, aminoácidos 1-15 de B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_21510, aminoácidos 1-16 de B. thuringiensis 35646 proteína tripla hélice de repetição de colágeno, aminoácidos 14-29 de B. cereus proteína hipotética WP_69652, aminoácidos 20-35 de B. cereus exosporium principal WP016117717, aminoácidos 28-43 de B. cereus peptídeos exosporium WP002105192, aminoácidos 17-32 de B. cereus proteína hipotética WP87353, aminoácidos 18-33 de B. cereus peptídeo exosporium 02112369, aminoácidos 18-33 de B. cereus proteína do exosporium WP016099770, aminoácidos 15-30 de B. thuringiensis proteína hipotética YP006612525, e aminoácidos 115-130 de B. mycoides proteína hipotética TIGR03720 correspondendo à aminoácidos 20-35 de BclA. Como pode ser visto a partir da Figura 1B, aminoácidos 15-30 de B. cereus ATCC 10987 proteína colágeno tripla hélice de domínio de repetição, aminoácidos 18-33 de B. cereus E33L proteína semelhante a colágeno, aminoácidos 20-35 de B. weihenstephanensis KBAB4 tripla hélice de repetição contendo colágeno, aminoácidos 9-24 de B. thuringiensis str. Al Hakam proteína hipotética BALH_2230, aminoácidos 1227 de B. cereus ATCC 14579 tripla hélice de repetição contendo colágeno, aminoácidos 23-38 de B. cereus tripla hélice de repetição de colágeno, aminoácidos 17-32 de B. cereus ATCC 14579 tripla hélice de repetição contendo colágeno, aminoácidos 9-24 de B. cereus E33L proteína hipotética BCZK1835, aminoácidos 27-42 de B. weihenstephanensis KBAB4 tripla hélice de repetição contendo colágeno, aminoácidos 9-24 de B. cereus ATCC 14579 tripla hélice de repetição con-tendocolágeno, aminoácidos 18-33 de B. cereus ATCC 14579 proteí-nahipotética BC4725, aminoácidos 23-38 de B. cereus E33L proteína hipotética BCZK4476, aminoácidos 19-34 B. anthracis str. Tripla hélice de repetição contendo colágeno ‘Ames Ancestor’, aminoácidos 13-28 de B. thuringiensis serovar konkukian str. 97-27 de proteína BclA, aminoácidos 13-28 de B. cereusproteína hipotética conservada ATCC 10987, aminoácidos 13-28 de B. cereus ATCC 14579 tripla hélice repetição de contendo colágeno, aminoácidos 78-93 de B. cereuspeptídeo principal exosporium sequência parcial, e os aminoácidos 115-130 de B. weihenstephanensisproteína hipotética ER45_27600 correspondem aos aminoácidos 20-35 de BclA. Assim, qualquer parte destas proteínas, que inclui os aminoácidos correspondentes acima listados podem servir como a sequência de direcionamento.
[0062] Além disso, qualquer sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 20-35 de BclA, ou qualquer um dos aminoácidos correspondentes acima listados pode servir como a sequência de direcionamento.
[0063] Assim, a sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste de aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 96. Alternativamente, a sequência de direcionamento pode consistir nos aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1. Alternativamente, a proteína pode compreender exosporium BclA de comprimento completo (SEQ ID NO: 2), ou o fragmento de proteína do exosporium pode compreender um fragmento de tamanho médio de BclA que falta o carboxi-terminal, tal como SEQ ID NO: 59 (aminoácidos 1-196 de BclA). Alternativamente, o fragmento de proteína do exosporium pode consistir em SEQ ID NO: 59.
[0064] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; ou os aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1.
[0065] A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 3, ou a proteína pode compreender exosporium BetA de comprimento completo/BAS3290 (SEQ ID NO: 4). Também foi verificado que um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 12-27 de BetA/BAS3290 pode ser utilizado como uma sequência de direcio-namento. Assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 97. A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 14-23 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 3, ou os aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3.
[0066] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; ou os aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3.
[0067] A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 5, ou a proteína pode compreender exosporium BAS4623 de comprimento completo (SEQ ID NO: 6).
[0068] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; aminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5; aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; ou os aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5.
[0069] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos 1328 da SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 7 ou a proteína podem compreender exosporium BclB de comprimento completo (SEQ ID NO: 8).
[0070] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; ou os aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 7.
[0071] A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9, os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9, ou SEQ ID NO: 9, ou a proteína pode compreender exosporium BAS1882 de comprimento completo (SEQ ID NO: 10). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 9-24 de BAS1882 também pode ser utilizado como uma sequência de direcionamento. Assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 105.
[0072] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; ou os aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9.
[0073] A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 11, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 11, ou a proteína do exosporium pode compreender todo o comprimento do produto do gene B. weihenstephensis KBAB4 2280 (SEQ ID NO: 12). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 18-33 do produto do gene B. weihenstephensis KBAB4 2280 pode também ser utilizado como uma sequência de direcionamento. Assim, a sequência de direcionamento pode compre-ender SEQ ID NO: 98.
[0074] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; ou os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11.
[0075] A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13, ou SEQ ID NO: 13, ou a proteína do exosporium pode compreender todo o comprimento do produto do gene B. weihenstephensis KBAB4 3572 (SEQ ID NO: 14). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 18-33 do produto do gene B. weihenstephensis KBAB4 3572 pode também ser utilizado como uma sequência de direcionamento. Assim, a sequência de direcionamento pode compre-ender SEQ ID NO: 99.
[0076] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; ou os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13;
[0077] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15, aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 15, ou a proteína pode com-preender exosporium de comprimento completo B. cereuspeptídeo principal exosporium VD200 (SEQ ID NO: 16).
[0078] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; ou os aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15.
[0079] A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17, os aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17, ou SEQ ID NO: 17, ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereuspeptídeo principal exosporium VD166 (SEQ ID NO: 18). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 12-27 da B. cereuspeptídeo principal VD166 exosporium também pode ser utilizado como uma sequência de direcionamento. Assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 100.
[0080] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; ou os aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17.
[0081] A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19, ou SEQ ID NO: 19, ou a proteína pode compreender exosporium comprimento completo B. cereus VD200 proteína hipotética IKG_04663 (SEQ ID NO: 20).
[0082] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; ou os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19.
[0083] Alternativamente, a sequência de direcionamento compreende os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21, ou SEQ ID NO: 21, ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. weihenstephensis KBAB4 YVTN proteína e-hélice (SEQ ID NO: 22). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 18-33 da B. weihenstephensis KBAB4 YVTN proteína β^lice também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 101.
[0084] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; ou os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21.
[0085] A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23, aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23, ou SEQ ID NO: 23, ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. weihenstephensisproteína hipotética bcerkbab4_2363 KBAB4 (SEQ ID NO: 24). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 9-24 de B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2363 também pode ser utilizado como uma sequência de direcionamento. Assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 102.
[0086] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 23; aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; ou os aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23.
[0087] A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25, aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 25, ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2131 (SEQ ID NO: 26). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 9-24 de B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2131 também pode ser utilizado como uma sequência de direcionamento. Assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 103.
[0088] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; ou os aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25.
[0089] Alternativamente, a sequência de direcionamento compreende os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27, aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 27, ou a proteína pode compreender exosporium comprimento completo B. weihenstephensis KBAB4 hélice tripla de repetição contendo colágeno (SEQ ID NO: 28).
[0090] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 30; aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 30; aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 27; ou os aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 27.
[0091] A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29, ou SEQ ID NO: 29, ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyco0001_21660 (SEQ ID NO: 30).
[0092] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; ou os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29.
[0093] A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31, aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31, ou SEQ ID NO: 31, ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_22540 (SEQ ID NO: 32). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 9-24 de B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_22540 também pode ser utilizado como uma sequência de direcionamento. Assim, a sequência de direcionamento pode compre-ender SEQ ID NO: 104.
[0094] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; ou os aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31.
[0095] Alternativamente, a sequência de direcionamento compreende os aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33, ou a proteína do exosporium de comprimento completo compreende B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_21510 (SEQ ID NO: 34).
[0096] A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 35, ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. thuringiensis 35646 proteína de hélice tripla de repetição de colágeno (SEQ ID NO: 36).
[0097] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO: 43, aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 43, ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereusproteína hipotética WP_69652 (SEQ ID NO: 44).
[0098] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; aminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; ou os aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43.
[0099] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45, aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 45, ou a proteína pode com-preender exosporium de comprimento completo B. cereus exosporium principal WP016117717 (SEQ ID NO: 46). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 20-35 da B. cereuspeptídeo principal exosporium WP016117717 também pode ser utilizado como uma sequência de direcionamento. Assim, a sequência de direcionamento pode com-preender SEQ ID NO: 106.
[00100] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; ou os aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45.
[00101] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47, aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 47, ou a proteína pode com-preender exosporium de comprimento completo B. cereuspeptídeo principal exosporium WP002105192 (SEQ ID NO: 48).
[00102] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; aminoácidos 47-43 da SEQ ID NO: 47; aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; ou os aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15.
[00103] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49, aminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 49, ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereusproteína hipotética WP87353 (SEQ ID NO: 50).
[00104] A sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; ou os aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49.
[00105] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51, aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 51, ou a proteína pode com-preender exosporium de comprimento completo B. cereuspeptídeo exosporium 02112369 (SEQ ID NO: 52).
[00106] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; ou os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51;
[00107] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53, aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53 ou SEQ ID NO: 53, ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereusproteína do exosporium WP016099770 (SEQ ID NO: 54).
[00108] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; ou os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53.
[00109] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender ácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55, os aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 55, ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. thuringiensisproteína hipotética YP006612525 (SEQ ID NO: 56).
[00110] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; ou os aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55.
[00111] A sequência de direcionamento também pode compreender os aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57, aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57, ou SEQ ID NO: 57, ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. mycoidesproteína hipotética TIGR03720 (SEQ ID NO: 58).
[00112] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; aminoácidos 5-130 da SEQ ID NO: 57; os aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; os aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; os aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; os aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; os aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; os aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; os aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; os aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; os aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; aminoácidos 100130 da SEQ ID NO: 57; ou os aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57.
[00113] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 59; ou SEQ ID NO: 59; ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereus proteína de tripla hélice de domínio de repetição de colágeno ATCC 10987 (SEQ ID NO: 60).
[00114] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 59; aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59; ou os aminoácidos 6-30 da SEQ ID NO: 59.
[00115] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 61; aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 61; ou SEQ ID NO: 61; ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereusproteína semelhante a colágeno E33L (SEQ ID NO: 62).
[00116] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 61; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 61; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61; ou os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61.
[00117] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 63; ou SEQ ID NO: 63; ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. weihenstephanensis KBAB4 hélice tripla de repetição contendo colágeno (SEQ ID NO: 64).
[00118] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 63; aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 63; aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 63; aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 63; ou os aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63.
[00119] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 65; ácidos 9-24 da SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 65; ou SEQ ID NO: 107; ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. thuringiensis str. Al Hakam proteína hipotética BALH_2230 (SEQ ID NO: 66).
[00120] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 65; ou os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65.
[00121] A sequência de direcionamento pode compreender ácidos 1-27 da SEQ ID NO: 67; aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 67; ou SEQ ID NO: 67; ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereushélice tripla de repetição contendo colágeno ATCC 14579 (SEQ ID NO: 68).
[00122] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 67; aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67; ou os aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 67.
[00123] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 69; aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 69; ou SEQ ID NO: 69; ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereus de tripla hélice de repetição de colágeno (SEQ ID NO: 70).
[00124] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 69; aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69; aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 69; ou os aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69.
[00125] A proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereushélice tripla de repetição contendo colágeno ATCC 14579 (SEQ ID NO: 72).
[00126] A sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 73, ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereus E33L proteína hipotética BCZK1835 (SEQ ID NO: 74).
[00127] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-42 da SEQ ID NO: 75; aminoácidos 27-42 da SEQ ID NO: 75; ou SEQ ID NO: 75; ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. weihenstephanensis KBAB4 hélice tripla de repetição contendo colágeno (SEQ ID NO: 76).
[00128] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-42 da SEQ ID NO: 75; aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75; aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75; aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75; aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75; ou os aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75.
[00129] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 77; aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 77; ou SEQ ID NO: 77; ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereushélice tripla de repetição contendo colágeno ATCC 14579 (SEQ ID NO: 78).
[00130] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 77; ou os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77;
[00131] A proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereus ATCC 14579 proteína hipotética BC4725 (SEQ ID NO: 80).
[00132] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 81; aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 81; ou SEQ ID NO: 81; ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereus E33L proteína hipotética BCZK4476 (SEQ ID NO: 82).
[00133] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 81; ácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; ou os aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81.
[00134] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-34 da SEQ ID NO: 83; ou SEQ ID NO: 83; ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. anthracis str. Tripla hélice contendo repetição de colágeno ‘Ames Ancestor’ (SEQ ID NO: 84).
[00135] A proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. thuringiensis serovar konkukian str. 97-27 proteína BclA (SEQ ID NO: 86).
[00136] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 87; aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 87; ou SEQ ID NO: 87; ou a proteína pode compreender exosporium de comprimento completo B. cereusproteína hipotética conservada ATCC 10987 (SEQ ID NO: 88).
[00137] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 87; aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; ou os aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 87.
[00138] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 89; ou SEQ ID NO: 89; ou a proteína do exosporium pode compreender comprimento completo de B. cereus de hélice tripla de repetição contendo colágeno ATCC 14579 (SEQ ID NO: 90).
[00139] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 89; aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; ou os aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 89
[00140] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-93 da SEQ ID NO: 91; ou SEQ ID NO: 91; ou a proteína do exosporium pode compreender B. cereus exosporium peptídeo principal sequência parcial (SEQ ID NO: 92).
[00141] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-93 da SEQ ID NO: 91; aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91; aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91; aminoácidos 30-93 da SEQ ID NO: 91; aminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91; aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91; ou os aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91.
[00142] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 93; ou SEQ ID NO: 93; ou a proteína do exosporium pode compreender B. weihenstephanensis) proteína hipotética ER45_27600, a sequência parcial (SEQ ID NO: 94).
[00143] A sequência de direcionamento pode compreender os aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 93; os aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 93; os aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93; ou os aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93.
[00144] Além disso, como ilustrado nos exemplos fornecidos abaixo, verificou-se que sequências mais curtas do que os aminoácidos 20-35 de BclA podem ser utilizadas para direcionar uma proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. Em particular, os aminoácidos 20-33 de BclA, aminoácidos 20-31 de BclA, aminoácidos 21-33 de BclA, ou aminoácidos 23-31 de BclA podem ser utilizados para direcionar uma proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. Assim, a sequência de direcionamento pode ser composta de aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 23-31 da SEQ ID NO: 1. As regiões correspondentes de qualquer uma das SEQ ID NOs. Mostradas nas Figuras 1A e 1B podem também ser utilizadas para direcionar uma proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. Por "regiões correspondentes," pretende-se significar que, quando as sequências estão alinhadas com a SEQ ID NO: 1, como mostrado na Figura 1A e 1B, as regiões das outras sequências de aminoácidos que se alinham com os aminoácidos da SEQ ID NO: são as "regiões correspondentes" dessas sequências. Assim, por exemplo, os aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos 1326 da SEQ ID NO: 7, etc, podem ser utilizados para direcionar uma proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma vez que estas regiões se alinham com os aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 1 como mostrado na Figura 1A.
[00145] Mesmo dentro de regiões mais curtas de aminoácidos 2035 BclA pode também ser usado para o direcionamento de uma proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. Em particular, qualquer sequência de aminoácidos que inclui aminoácidos 25-30 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos cor-respondentes a partir de qualquer uma das sequências mostradas nas Figuras 1A e 1B podem ser utilizados. Uma pessoa especialista reco-nhecerá que começando com os aminoácidos 25-30 da SEQ ID NO: 1 ou da região correspondente de qualquer uma das sequências mostradas nas Figuras 1A e 1B, os aminoácidos adicionais podem ser adicionados ao terminal amino, no terminal carboxi ou ambos os terminais amino e carboxil para criar uma sequência de direcionamento que irão ser eficazes para o direcionamento de uma proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante.
[00146] Além disso, ele pode ser facilmente visto a partir do alinhamento de sequências nas Figuras 1A e 1B que, enquanto os aminoácidos 20-35 de BclA são conservados, e os aminoácidos 25-35 são mais conservadas, algum grau de variação pode ocorrer nesta região sem afetar a capacidade da sequência de direcionamento ao alvo de uma proteína para o exosporium. As Figuras 1A e 1B listam a percentagem de identidade de cada um dos aminoácidos correspondentes de cada sequência de aminoácidos de 20-35 BclA ("20-35% de identidade") e aos aminoácidos 25-35 de BclA ("25-35% de identidade"). Assim, por exemplo, em comparação com os aminoácidos 20-35 de BclA, os aminoácidos correspondentes de BetA/BAS3290 são cerca de 81,3% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS4623 são cerca de 50,0% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BclB são cerca de 43,8% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS1882 são cerca de 62,5% idênticos, os correspondentes aminoácidos do produto de gene KBAB4 2280 são cerca de 81,3% idênticos, e os correspondentes aminoácidos do produto de gene KBAB4 3572 são cerca de 81,3% idênticos. As identidades de sequência sobre esta região para as sequências restantes estão listadas nas Figuras 1A e 1B.
[00147] No que diz respeito aos aminoácidos 25-35 de BclA, os aminoácidos de BetA/BAS3290 correspondentes são cerca de 90,9% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS4623 são cerca de 72,7% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BclB são cerca de 54,5% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS1882 são cerca de 72,7% idênticos, os aminoácidos do produto de gene KBAB4 2280 correspondentes são cerca de 90,9% idênticos, e os aminoácidos do produto de gene KBAB4 3572 correspondentes são cerca de 81,8% idênticos. As identidades de sequência sobre esta região para as sequências restantes estão listadas nas Figuras 1A e 1B.
[00148] Assim, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 43% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 54%. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos, com pelo menos identidade de cerca de 43% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 54%.
[00149] Assim, a sequência de direcionamento também pode com-preender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 50% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63%. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos, com pelo menos identidade de cerca de 50% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63 %.
[00150] Assim, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 50% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos, com pelo menos identidade de cerca de 50% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%.
[00151] Assim, a sequência de direcionamento também pode com-preender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 56% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63%. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos, com pelo menos identidade de cerca de 56% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63 %.
[00152] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de amino com pelo menos identidade de cerca de 62% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%. A sequência de direcionamento também consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos, com pelo menos identidade de cerca de 62% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 da SEQ ID NO:1 é de pelo menos cerca de 72%.
[00153] Assim, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de 68% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos, com pelo menos identidade de 68% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81 %.
[00154] Assim, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de amino com pelo menos identidade de cerca de 75% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos, com pelo menos identidade de cerca de 75% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 da SEQ ID NO:1 é de pelo menos cerca de 72%.
[00155] Assim, a sequência de direcionamento também pode com-preender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 75% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos, com pelo menos identidade de 75% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81 %.
[00156] Assim, a sequência de direcionamento também pode com-preender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 81% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos, com pelo menos identidade de cerca de 81% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81 %.
[00157] Assim, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 81% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 90%. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos, com pelo menos identidade de cerca de 81% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 90 %.
[00158] O versado irá reconhecer que as variantes das sequências anteriores, também podem ser utilizadas como sequências de direcio-namento, desde que a sequência de direcionamento compreende os aminoácidos 20-35 de BclA, os aminoácidos de BetA/BAS3290, BAS4263, BclB, BAS1882 correspondente, o KBAB4 2280 produto do gene, ou o produto do gene KBAB 3572, ou uma sequência que com-preende qualquer uma das identidades de sequência acima mencionadas para os aminoácidos 20-35 e 25-35 de BclA está presente.
[00159] Certas proteínas do exosporium da família Bacillus cereus que não têm regiões com homologia com os aminoácidos 25-35 de BclA também podem ser utilizadas para atingir um peptídeo ou proteína para o exosporium membro da família Bacillus cereus. Em particular, as proteínas de fusão podem compreender uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 108 (B. mycoides InhA), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 109 (B. anthracis Sterne BAS1141 (ExsY)), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 110 (B. anthracis Sterne BAS1144 (BxpB/ExsFA)), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 111 (B. anthracis Sterne BAS1145 (COTY)), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 112 (B. anthracis Sterne BAS1140), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 113 (B. anthracis H9401 ExsFB), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 114 (B. thuringiensis HD74 InhA1), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 115 (B. cereus ATCC 10876 ExsJ), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 116 (B. cereus ExsH), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 117 (B. anthracis Ames YjcA), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 118 (B. anthracis YjcB), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 119 (B. anthracis Sterne BCLC), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 120 (Bacillus thuringiensis serovar konkukian str. 97-27 fosfatase ácida), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 121 (B. thuringiensis HD74 InhA2), ou uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 122 (B. mycoides InhA3). A inclusão de uma proteína do exosporium compreendendo qualquer uma da SEQ ID NOs: 108-122 nas proteínas de fusão aqui descritas irá resultar no direcionamento para o exosporium de um membro da família B. cereus.
[00160] Além disso, as proteínas do exosporium possuindo um elevado grau de identidade de sequência com qualquer uma das proteínas do exosporium de comprimento completo ou fragmentos de proteína do exosporium descritos acima também podem ser utilizadas para direcionar um peptídeo ou proteína para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus. Assim, a proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína do exosporium ou fragmento de proteína exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 e 122. Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, e 122.
[00161] Durante a esporulação de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, o motivo de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium é reconhecido pela maquinaria de montagem de esporos exosporium e dirigido para o exosporium, resultando na exibição da proteína ou do peptídeo da porção de interesse da fusão proteína no lado de fora do esporo.
[00162] Tal como ilustrado pelos exemplos fornecidos aqui a seguir, a utilização de sequências de direcionamento diferentes permite o controle do nível de expressão da proteína de fusão na superfície do esporo do membro da família Bacillus cereus. A utilização de algumas das sequências de direcionamento aqui descritas irá resultar num maiornível de expressão da proteína de fusão, enquanto que a utilização de outros das sequências de direcionamento vai resultar em mais baixosníveis de expressão da proteína de fusão na superfície do esporo.
[00163] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium pode compreender a sequência de aminoácidos GXT no seu terminal carboxi, em que X é qualquer aminoácido.
[00164] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a sequência de direcionamento, exosporium proteína, fragmento de pro-teína ou exosporium, podem compreender um resíduo de alanina na posição da sequência de direcionamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.
[00165] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium pode ainda compreender uma metionina, serina, ou resíduo de treonina na posição de aminoácidos que precede imediatamente o primeiro aminoácido da sequência de direcionamen-to,proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium ou na posição da sequência de direcionamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.
B. Proteínas de Fusão para Expressão em membros da Família Bacillus Cereus Recombinantes
[00166] A presente invenção se refere a proteínas de fusão com-preendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento ou proteína do exosporium. Quando a proteína ou peptídeo de interesse é qualquer proteína ou peptídeo de interesse, a proteína de fusão pode compreender: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 59; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 59; (3) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 60; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 59; (5) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 6-30 da SEQ ID NO: 59; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 61; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 61; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 61; (10) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 62; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 61; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 61; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 63; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 63; (17) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 64; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 63; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 63; (20) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 63; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 63; (22) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 65; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 65; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 65; (26) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 66; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 107; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 65; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 67; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 67; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 67; (33) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 68; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 67; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1027 da SEQ ID NO: 67; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 69; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 69; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 69; (40) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 70; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 69; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1038 da SEQ ID NO: 69; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69; (45) uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 72; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 73; (47) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO: 74; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-42 da SEQ ID NO: 75; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-42 da SEQ ID NO: 75; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 75; (51) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 76; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-42 da SEQ ID NO: 75; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75; (55) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75; (56) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 77; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 77; (60) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 77; (61) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 78; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 77; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77; (64) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 80; (65) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 81; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 81; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 81; (68) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 82; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 81; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; (71) uma sequência de direcionamento compreen-dendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; (73) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-34 da SEQ ID NO: 83; (75) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 83; (76) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 84; (77) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 86; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 87; (79) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 87; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 87; (81) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 88; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 87; (83) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; (84) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 87; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 89; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 89; (87) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 90; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 89; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; (90) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 89; (91) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-93 da SEQ ID NO: 91; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 91; (93) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 92; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-93 da SEQ ID NO: 91; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91; (96) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-93 da SEQ ID NO: 91; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 93; (102) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 93; (103) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 94; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 93; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 93; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93; ou (108) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 122.
[00167] Por exemplo, quando a proteína ou peptídeo de interesse é qualquer proteína ou peptídeo de interesse, a proteína de fusão pode compreender: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 59; (2) uma sequência de direcio-namento compreendendo aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 6-30 da SEQ ID NO: 59; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 61; (5) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 61; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 63; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 63; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 63; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 63; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 65; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65; (15) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 67; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 67; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 69; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69; (20) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 69; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69; (22) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-42 da SEQ ID NO: 75; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75; (24) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 77; (29) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 81; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; (34) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 87; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 87; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 89; (39) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; (40) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 89; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-93 da SEQ ID NO: 91; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91; (44) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-93 da SEQ ID NO: 91; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91; (47) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 93; (49) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 93; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93; ou (51) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93.
[00168] Alternativamente, quando a proteína ou peptídeo de interesse é qualquer proteína ou peptídeo de interesse, a proteína de fusão pode compreender: (1) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 1; (2) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 2331 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 96; (5) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 96; (6) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1225 da SEQ ID NO: 3; (7) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 3; (8) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 3; (9) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 115 da SEQ ID NO: 97; (10) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (11) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 5; (12) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 5; (13) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 5; (14) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 5; (15) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 7; (16) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 7; (17) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 7; (18) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 16-24 da SEQ ID NO: 7; (19) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 9; (20) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 9; (21) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 9; (22) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 9; (23) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 105; (24) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 105; (25) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 11; (26) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 11; (27) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 11; (28) uma sequência de di-recionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 98; (29) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 113 da SEQ ID NO: 98; (30) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 13; (31) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 13; (32) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 13; (33) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 13; (34) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 99; (35) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 99; (36) uma sequência de direcio-namento consistindo em aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 15; (37) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 15; (38) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 29-41 da SEQ ID NO: 15; (39) uma sequência de di-recionamento consistindo em aminoácidos 31-39 da SEQ ID NO: 15; (40) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 17; (41) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 17; (42) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 100; (43) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 19; (44) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 19; (45) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 19; (46) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 19; (47) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 21; (48) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 21; (49) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 21; (50) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 21; (51) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 101; (52) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 101; (53) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 23; (54) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 23; (55) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 23; (56) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 23; (57) uma sequência de direcionamento con sistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 102; (58) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 102; (59) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 25; (60) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 25; (61) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 25; (62) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 25; (63) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 103; (64) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 113 da SEQ ID NO: 103; (65) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-28 da SEQ ID NO: 27; (66) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-26 da SEQ ID NO: 27; (67) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 16-28 da SEQ ID NO: 27; (68) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-26 da SEQ ID NO: 27; (69) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 104; (70) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 104; (71) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 33; (72) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-11 da SEQ ID NO: 33; (73) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 3-11 da SEQ ID NO: 33; (74) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-14 da SEQ ID NO: 35; (75) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-12 da SEQ ID NO: 35; (76) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 2-14 da SEQ ID NO: 35; (77) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-27 da SEQ ID NO: 43; (78) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 43; (79) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-27 da SEQ ID NO: 43; (80) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 45; (81) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 45; (82) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 45; (83) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 106; (84) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 106; (85) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 47; (86) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 47; (87) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 53; (88) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 53; (89) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 53; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 61; (91) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1829 da SEQ ID NO: 61; (92) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 61; (93) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 65; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 65; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 65; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 107; (97) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 107; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 67; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 67; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 67; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 67; (102) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 69; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 69; (104) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 69; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 69; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-40 da SEQ ID NO: 75; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-38 da SEQ ID NO: 75; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 77; (109) uma sequência de direcionamento compre-endendoaminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 77; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 77; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 77; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 81; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 81; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 81; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 81; (116) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 87; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 87; ou (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 87. A sequência de direcionamento também pode consistir em qualquer uma dessas sequências.
[00169] A presente invenção se refere a proteínas de fusão com-preendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium. A proteína ou peptídeo de interesse pode ser uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou uma proteína ou um peptídeo de ligação do ácido nucleico. Quando a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou uma proteína de ligação do ácido nucleico ou peptídeo, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium pode ser qualquer sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exopsorium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. Por exemplo, a sequência de direcionamento de proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium pode ser qualquer das sequências de dire-cionamento,proteínas do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium listados acima nos parágrafos [00166] — [00168] para o uso com qualquer proteína ou peptídeo de interesse ou: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 43% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 54%; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 1; (5) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 2; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 235 da SEQ ID NO: 1; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 3; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 3; (14) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 4; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (17) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5; (20) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 5; (22) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 6; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (25) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 7; (30) uma sequência de direcionamento compreenden-doaminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 7; (31) uma sequência de dire-cionamento compreendendo SEQ ID NO: 7; (32) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 8; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 7; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 9; (40) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 10; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO:11; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 11; (47) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 12; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (51) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (53) uma se quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13; (55) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:13; (56) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:14; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (59) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2843 da SEQ ID NO: 15; (64) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:15; (65) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:16; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (68) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (73) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:17; (76) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:18; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19; (83) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:19; (84) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:20; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (87) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21; (91) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:21; (93) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:22; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (95) uma se quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23; (100) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:23; (102) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:24; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:25; (109) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:26; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:27; (116) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:28; (117) uma sequência de dire-cionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (119) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (120) uma sequênciade direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (121) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29; (122) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29; (123) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:29; (124) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequênciade aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:30; (125) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (126) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (127) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (128) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (129) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (130) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31; (131) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31; (132) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:31; (133) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequênciade aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:32; (134) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (135) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (136) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (137) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33; (138) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:33; (139) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:34; (140) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35; (141) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:35; (142) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:36; (143) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO:43; (144) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43; (145) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 43; (146) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 44; (147) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (148) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (149) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (150) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (151) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45; (152) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45; (153) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 45; (154) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 46; (155) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (156) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (157) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (158) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (159) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (160) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47; (161) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47; (162) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 47; (163) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 48; (164) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (165) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (166) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (167) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (168) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (169) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (170) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (171) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49; (172) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49; (173) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 49; (174) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 50; (175) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (176) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (177) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (178) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (179) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (180) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51; (181) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51; (182) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 51; (183) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 52; (184) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (185) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (186) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (187) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (188) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (189) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53; (190) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53; (191) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 53; (192) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 54; (193) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (194) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (195) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (196) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (197) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (198) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55; (199) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55; (200) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 55; (201) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 56; (202) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (203) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (204) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (205) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (206) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57; (207) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57; (208) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 57; (209) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 58; (210) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (211) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5130 da SEQ ID NO: 57; (212) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (213) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (214) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (215) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (216) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (217) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (218) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (219) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (220) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (221) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (222) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (223) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 95; (224) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 96; (225) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 97; (226) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 98; (227) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 99; (228) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 100; (229) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 101; (230) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 102; (231) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 103; (232) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 104; (233) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 105; (234) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 106; (235) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 108; (236) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 109; (237) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 110; (238) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 111; (239) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 112; (240) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 113; (241) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 114; (242) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 115; (243) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 116; (244) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 117; (245) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 118; (246) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 119; (247) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 120; (248) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 121; (249) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; (250) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; (251) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; (252) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-23 da SEQ ID NO: 3; (253) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1425 da SEQ ID NO: 3; ou (254) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3.
[00170] Por exemplo, quando a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou uma proteína de ligação do ácido nucleico ou peptídeo, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium pode ser: (1) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (5) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (12) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; (15) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 7; (20) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (22) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (26) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (35) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (40) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (45) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (46) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (47) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (50) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (51) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (55) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (56) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (59) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1030 da SEQ ID NO: 27; (64) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (65) uma sequên cia de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (68) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1533 da SEQ ID NO: 29; (69) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (73) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (74) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (76) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (78) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (79) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (83) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (84) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (87) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (88) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (89) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (91) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (93) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (94) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (98) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (99) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (102) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (104) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-130 da SEQ ID NO: 57; (109) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (116) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; ou (119) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57.
[00171] Uma proteína de fusão é fornecida, que compreende um antígeno ou uma enzima de reparação e uma sequência de direcionamento ou proteína do exosporium. A sequência de direcionamento ou proteína do exosporium pode compreender qualquer uma das sequências de direcionamento ou proteínas do exosporium listadas acima nos parágrafos [00166] — [00168] para o uso com qualquer proteína ou peptídeo de interesse ou: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (5) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; (7) uma sequência de direcio-namento compreendendo aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2031 da SEQ ID NO: 1; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-23 da SEQ ID NO: 3; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 3; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (18) uma sequência de direci-onamento compreendendo aminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1038 da SEQ ID NO: 5; (20) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (22) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (23) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 7; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 9; (29) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 10; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO:11; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 11; (36) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 12; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (40) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:13; (45) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:14; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (47) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (51) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:15; (54) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:16; (55) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (56) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (57) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2543 da SEQ ID NO: 15; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17; (64) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:17; (65) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:18; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (68) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:19; (73) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:20; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (76) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21; (80) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:21; (82) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:22; (83) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (84) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (87) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:23; (91) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:24; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (93) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:25; (98) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:26; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (102) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:27; (105) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:28; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (109) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:29; (113) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:30; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (116) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (119) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31; (120) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31; (121) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:31; (122) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:32; (123) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (124) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (125) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (126) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33; (127) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:33; (128) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:34; (129) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35; (130) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:35; (131) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:36; (132) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO:43; (133) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43; (134) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 43; (135) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 44; (136) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (137) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (138) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (139) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (140) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45; (141) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45; (142) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 45; (143) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 46; (144) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (145) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (146) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (147) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (148) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (149) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47; (150) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47; (151) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 47; (152) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 48; (153) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (154) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (155) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (156) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (157) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (158) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (159) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (160) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49; (161) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49; (162) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 49; (163) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 50; (164) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (165) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (166) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (167) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (168) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (169) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51; (170) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51; (171) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 51; (172) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 52; (173) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (174) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (175) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (176) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (177) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (178) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53; (179) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53; (180) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 53; (181) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 54; (182) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (183) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (184) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (185) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (186) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (187) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55; (188) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55; (189) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 55; (190) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 56; (191) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (192) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (193) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (194) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (195) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57; (196) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57; (197) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 57; (198) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 58; (199) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (200) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5130 da SEQ ID NO: 57; (201) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (202) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (203) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (204) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (205) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (206) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (207) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (208) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (209) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (210) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (211) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (212) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 97; (213) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 98; (214) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 99; (215) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 100; (216) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 101; (217) uma sequência de direciona-mento compreendendo SEQ ID NO: 102; (218) uma sequência de di-recionamento compreendendo SEQ ID NO: 103; (219) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 104; (220) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 105; (221) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 106; (222) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 108; (223) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 109; (224) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 110; (225) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 111; (226) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 112; (227) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 113; (228) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 114; (229) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 115; (230) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 116; (231) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 117; (232) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 118; (233) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 119; (234) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 120; ou (235) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 121.
[00172] Uma proteína de fusão é fornecida, que compreende uma enzima adequada para a quebra de uma emulsão de gel ou de um flu-idohidráulico de fraturamento ou uma proteína ou peptídeo antibacteriano e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium. A sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium pode compreender qualquer uma das sequências de direcionamento ou pro-teínas do exosporium listadas acima nos parágrafos [00166] — [00168] para o uso com qualquer proteína ou peptídeo de interesse ou: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 43% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 54%; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 1; (5) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 2; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (10) uma sequência de direcio namento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 3; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 3; (14) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 4; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5; (20) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5; (21) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 5; (22) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 6; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (25) uma sequência de direci-onamento compreendendo aminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1038 da SEQ ID NO: 5; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 7; (30) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 7; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 7; (32) uma prote ína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 8; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1028 da SEQ ID NO: 7; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 9; (40) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 10; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO:11; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 11; (47) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 12; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (51) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13; (55) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:13; (56) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:14; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (58) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (62) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15; (63) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15; (64) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:15; (65) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:16; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (68) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2543 da SEQ ID NO: 15; (73) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17; (74) uma sequên cia de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:17; (76) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:18; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (80) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19; (83) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:19; (84) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 20; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (87) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21; (91) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:21; (93) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:22; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23; (100) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:23; (102) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 24; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 23; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:25; (109) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:26; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:27; (116) uma proteína do exospo- rium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:28; (117) uma sequência de dire-cionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (119) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (120) uma sequênciade direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (121) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29; (122) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29; (123) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:29; (124) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequênciade aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:30; (125) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (126) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (127) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (128) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (129) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (130) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31; (131) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31; (132) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:31; (133) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequênciade aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:32; (134) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (135) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (136) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (137) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33; (138) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:33; (139) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:34; (140) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35; (141) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:35; (142) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:36; (143) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO:43; (144) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43; (145) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 43; (146) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 44; (147) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (148) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (149) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (150) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (151) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45; (152) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45; (153) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 45; (154) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 46; (155) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (156) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (157) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (158) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (159) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (160) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47; (161) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47; (162) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 47; (163) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 48; (164) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (165) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (166) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (167) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (168) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (169) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (170) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (171) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49; (172) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49; (173) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 49; (174) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 50; (175) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (176) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (177) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (178) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (179) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (180) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51; (181) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51; (182) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 51; (183) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 52; (184) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (185) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (186) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (187) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (188) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (189) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53; (190) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53; (191) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 53; (192) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 54; (193) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (194) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (195) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (196) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (197) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (198) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55; (199) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55; (200) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 55; (201) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 56; (202) uma sequênciade direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (203) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (204) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (205) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (206) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57; (207) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57; (208) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 57; (209) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 58; (210) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (211) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5130 da SEQ ID NO: 57; (212) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (213) uma sequênciade direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (214) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (215) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (216) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (217) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (218) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (219) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (220) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (221) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (222) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (223) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 95; (224) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 96; (225) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 97; (226) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 98; (227) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 99; (228) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 100; (229) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 101; (230) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 102; (231) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 103; (232) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 104; (233) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 105; (234) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 106; (235) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 108; (236) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 109; (237) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 110; (238) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 111; (239) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 112; (240) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 113; (241) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 114; (242) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 115; (243) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 116; (244) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 117; (245) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 118; (246) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 119; (247) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 120; (248) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 121; (249) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; (250) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; (251) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; (252) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-23 da SEQ ID NO: 3; (253) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1425 da SEQ ID NO: 3; ou (254) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3.
[00173] Quando a proteína ou peptídeo de interesse compreende um antígeno, uma enzima de reparação, uma enzima adequada para a quebra de uma emulsão ou gel em um fluido de fraturamento hidráulico ou uma proteína antibacteriana ou peptídeo, preferencialmente, a sequência de direcionamento ou proteína do exosporium compreende qualquer uma das sequências de direcionamento ou proteínas do exosporium listadas anteriormente no parágrafo [00167] para o uso com qualquer proteína ou peptídeo de interesse ou: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (5) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (19) uma sequência de direcionamento compreenden do aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 7; (20) uma sequência de dire-cionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (22) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (25) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (30) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (34) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (35) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (39) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (40) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (43) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (47) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1033 da SEQ ID NO: 19; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (51) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1033 da SEQ ID NO: 21; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (55) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (56) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (61) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (64) uma sequência de direciona-mento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (65) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (66) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (68) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (70) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (71) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (73) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (74) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (76) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (79) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (83) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (84) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (87) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (88) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (91) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (93) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (98) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (102) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-130 da SEQ ID NO: 57; (109) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (116) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (119) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57.
[00174] Quando a proteína ou peptídeo de interesse compreende um antígeno, uma enzima de reparação, uma enzima adequada para a quebra de uma emulsão ou gel em um fluido de fraturamento hidráulico ou uma proteína antibacteriana ou peptídeo, mais preferencialmente, a sequência de direcionamento ou proteína do exosporium compreende qualquer uma das sequências de direcionamento ou proteínas do exosporium listadas anteriormente no parágrafo [00167] para o uso com qualquer proteína ou peptídeo de interesse ou: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (3) uma sequência de direciona-mento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (5) uma sequência de direcionamento compreenden-doaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (6) uma sequência de direci-onamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1033 da SEQ ID NO: 11; (8) uma sequência de direcionamento compre-endendoaminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (11) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (16) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (20) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (21) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (22) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1033 da SEQ ID NO: 19; (29) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1033 da SEQ ID NO: 21; (34) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (39) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (40) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (42) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (47) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (51) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (55) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (56) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (64) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (65) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (68) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (69) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (70) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (73) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (74) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (75) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (76) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (79) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (80) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (83) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (84) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (85) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (87) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-130 da SEQ ID NO: 57; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (91) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (93) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57.
[00175] Quando a proteína ou peptídeo de interesse compreende um antígeno, uma enzima de reparação, uma enzima adequada para a quebra de uma emulsão de gel ou em um fluido de fraturamento hi-dráulico ou uma proteína ou peptídeo antibacteriano, ainda mais prefe-rencialmente, a sequência de direcionamento ou proteína do exosporium compreende: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (2) uma sequência de di-recionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 533 da SEQ ID NO: 11; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (5) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (9) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (12) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2543 da SEQ ID NO: 15; (17) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (20) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (22) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (26) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (27) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (30) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1030 da SEQ ID NO: 27; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (40) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (43) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (47) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1535 da SEQ ID NO: 45; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (51) uma sequência de direciona-mento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2043 da SEQ ID NO: 47; (53) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (55) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (56) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1532 da SEQ ID NO: 49; (58) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (63) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (64) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (65) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (67) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (68) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-130 da SEQ ID NO: 57; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (73) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (76) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (78) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 6-30 da SEQ ID NO: 59; (83) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 61; (84) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 63; (87) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 63; (88) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 63; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65; (91) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67; (92) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 67; (93) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 69; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75; (97) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77; (102) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1028 da SEQ ID NO: 87; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; (109) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 89; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-93 da SEQ ID NO: 91; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91; (116) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 93; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93; ou (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93.
[00176] A proteína ou peptídeo de interesse da proteína de fusão acima descrita pode compreender um antígeno.
[00177] A proteína ou peptídeo de interesse da proteína de fusão acima descrita pode compreender uma enzima de reparação.
[00178] A proteína ou peptídeo de interesse da proteína de fusão acima descrita pode compreender uma enzima adequada para a quebra de uma emulsão de gel ou em um fluido de fraturamento hidráulico.
[00179] A proteína ou peptídeo de interesse da proteína de fusão acima descrita pode compreender uma proteína ou peptídeo antibacteriano. C. Membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam proteínas de fusão
[00180] A presente invenção se refere ainda a membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão. A proteína de fusão pode ser qualquer uma das proteínas de fusão descritas acima na seção I.B.
II.MODULAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO EM MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTES QUE EXPRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO POR CO-SUPEREXPRESSÃO DE PROTEÍNAS MODULADORAS
[00181] Membros da família Bacillus cereus recombinante que expressam as proteínas de fusão aqui descritas exibem a proteína ou peptídeo de porção de interesse da proteína de fusão do lado de fora dos seus esporos. Verificou-se que a sobre-expressão de certas prote-ínas do exosporium (aqui referidas como "proteínas moduladoras") em um membro da família Bacillus cereus recombinante que também ex-pressa uma proteína de fusão permite a modulação (isto é, aumentar ou diminuir) o nível de expressão da proteína de fusão, aumentando assim ou diminuindo a quantidade da proteína ou do peptídeo de interesse que é apresentado na parte externa do esporo. A capacidade para o controle da quantidade da proteína ou do peptídeo de interesse que é apresentado na parte externa do esporo é benéfica, uma vez que, em alguns casos, será desejável aumentar a quantidade da proteína ou do peptídeo de interesse que é exibido. Por exemplo, onde a proteína de interesse é uma enzima que degrada uma fonte de nutrientes de plantas, pode ser desejável aumentar a quantidade da enzima exibida nos esporos, de modo a que uma maior atividade enzimática e uma maior estimulação do crescimento das plantas pode ser conseguida mediante a introdução dos esporos num meio de crescimento da planta ou aplicação dos esporos a uma semente de planta ou planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Em outros casos, será desejável diminuir a quantidade da proteína ou do peptídeo de interesse que é exibido. Por exemplo, onde a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo de potencialização de sistema imunológico de planta, pode ser desejável diminuir a quantidade da proteína ou do peptídeo apresentado no esporo, uma vez que o excesso de estimulação do sistema imunológico de uma planta pode levar a indesejáveis efeitos.
[00182] Como é aqui descrito mais abaixo, os membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína moduladora podem ser usados em qualquer dos vários campos e métodos aqui descritos, e para qualquer um dos usos aqui descritos. Por exemplo, os membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína moduladora podem ser usados em métodos para estimular o crescimento da planta; métodos para a proteção de uma planta a partir de um agente patogênico; métodos para melhorar a re-sistência ao estresse nas plantas; métodos para imobilizar esporos de membros da família Bacillus cereus recombinante em plantas; métodos para estimular a germinação de uma semente de planta; métodos para a distribuição de ácidos nucleicos de uma planta; métodos para a distribuição de ácidos nucleicos de animais, insetos, vermes (por exemplo, nemátodo), fungos ou protozoários; métodos para a distribuição de enzimas para uma planta; métodos para alterar uma propriedade de uma planta; métodos para a distribuição de proteínas ou peptídeos a um animal; vacinas e métodos de produção de uma resposta imunogênica num indivíduo; métodos para a redução de contaminantes num ambiente; métodos para a fitorremediação de solo contaminado;métodos de tratamento de um fluido de fraturamento hidráulico para quebrar uma emulsão ou gel dentro do fluido; métodos de desinfecçãode uma superfície; e para usos tais como graxa, óleo, ou tratamento gordura ou degomagem; processamento de peça de couro; formação de biocombustíveis, biodiesel ou bioetanol; processamento ou conversão de açúcar; tratamento de amido; transformação de papel ou roupa; tratamento de subprodutos animais ou fúngicos ou recuperação de aminoácidos; digestão direcionada de resíduos das instalações; aditivos de alimentos de consumo humano ou animal; suplementos alimentares; nutrição animal; limpeza industrial; processamento de grãos; fabricação cosmética; controle de odor; processamento de alimento ou bebida; potencializadores ou aditivos de cervejaria; aditivos detergentes; ou processamento de têxteis ou de novelo.
[00183] Para muitas aplicações de proteínas (por exemplo, enzimas),há uma curva de resposta biológica, em que uma concentração ótima de uma proteína ou enzima leva ao efeito desejado, e um excesso de proteína ou quantidade muito pequena da proteína leva à efeitos indesejáveis ou diminuídos. Um exemplo desta curva biológica é a demonstração de que uma droga biológica, tal como a droga proteica de insulina para o tratamento de diabetes, requer uma dose ótima, a fim de reduzir os níveis de açúcar no sangue em pacientes diabéticos. Muito pouca insulina leva a uma resposta insuficiente e manutenção dos níveis de açúcar no sangue elevados indesejáveis e potencial hipercalemia. Uma dose grande demais de insulina leva a níveis de açúcar no sangue baixos e potencial hipocalemia e morbidade relacionada.
[00184] Existem curvas de resposta biológica semelhantes para muitas das proteínas e peptídeos de interesse compreendidos nas proteínas de fusão aqui descritas. Assim, para os diversos campos de utilização e métodos para os membros da família Bacillus cereus recombinantes aqui descritos, pode ser desejável para modular o nível da proteína ou do peptídeo de interesse na expressão de exosporium. Aumentando ou diminuindo os níveis da proteína ou do peptídeo de interesse na expressão do membro da família Bacillus cereus recombinante, os níveis de expressão podem ser otimizados para manter o nível de expressão global da proteína ou do peptídeo de interesse na concentração mais eficaz.
[00185] Por exemplo, seria desejável para modular os níveis de ex-pressão da proteína de fusão nos casos em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou um peptídeo envolvido e sinalização direta em plantas, tais como o peptídeo flagelina flg22, e o membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa a proteína de fusão deve ser aplicado a uma planta para fornecer um efeito benéfico para a planta. Tal modulação poderia ser benéfica para evitar uma resposta de sinalização que é suficientemente grande que iria levar a respostas prejudiciais para a planta (por exemplo, demasiado grande de uma resposta a flg22 pode resultar em necrose), ou uma resposta de sinalização que é suficientemente baixa para que isso produziria uma resposta fraca ou insuficiente para o peptídeo.
[00186] A curva de resposta biológica também seria relevante para os membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende um antígeno. Em tais casos, seria desejável modular o nível de expressão da proteína de fusão que compreende o antígeno para alcançar uma gama ótima para a geração de uma resposta imuni-táriaadequada num animal. Uma dose muito grande poderia conduzir a edema no local da injeção e inflamação indesejada, ao passo que uma dose muito pequena pode levar a vacinação insuficiente ou uma resposta imune.
[00187] Modulação do nível de expressão de uma proteína de fusão sobre o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante também fornece benefícios, por exemplo, quando o membro da família Bacillus cereus recombinante é utilizado para quebrar uma emulsão ou gel num fluido de fraturamento hidráulico. Géis polissacarídeos são frequentemente utilizados nos géis de processamento de fraturamento hidráulico. Estes géis requerem quebra. Quando a solução de gel está pronta para quebrar, o operador deseja que a quebra, o que é uma reação enzimática, aconteça a uma velocidade otimizada em particular. Quebrando o gel muito rapidamente pode levar a efeitos colaterais indesejáveis, tais como reunião de fragmentos de gel não digeridos. Por outro lado, quebra do gel demasiado lenta leva a tempos de espera longos e aumento da despesa. Utilizando as técnicas descritas aqui a seguir, os níveis das enzimas no exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo uma enzima adequada para a quebra de uma emulsão ou gel em um fluido de fraturamento hidráulico pode ser modulado de modo a assegurar que um nível otimizado de enzima está presente para quebrar géis, conduzindo a resultados pre-feridos, quando utilizados no campo.
[00188] Um membro da família Bacillus cereus recombinante é fornecido que expressa: (i) uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante; e (ii) uma proteína moduladora, em que a expressão da proteína moduladora é aumentada em comparação com a expressão da proteína moduladora membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições. A proteína moduladora, quando co-expressa com a proteína de fusão no membro da família Bacillus cereus recombinante, resulta em aumento ou diminuição da expressão da proteína de fusão em comparação com o nível de expressão da proteína de fusão recombinante num membro da família Bacillus cereus recombinante que não expressa a proteína moduladora a um aumento do nível sob as mesmas condições, em comparação com a expressão da proteína moduladora membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem.
[00189] A proteína moduladora pode compreender uma proteína ExsY, uma proteína ExsFA/BxpB, uma proteína Coty, uma proteína Coto, uma proteína ExsFB, uma proteína InhA1, uma proteína InhA2, uma proteína ExsJ, uma proteína ExsH, uma proteína YjcA, uma proteína YjcB, uma proteína BCLC, uma proteína CCCC, uma proteína InhA3, uma alanina racemase 1, uma alanina racemase 2, uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína BxpA, uma proteína BclE, uma proteína beta/BAS3290, uma proteína Cote, uma Exsa proteína, uma proteína ExsK, uma proteína ExsB, uma proteína YabG, uma proteína Tgl, uma proteína SODA1, uma proteína SODA2, uma variante de qualquer uma das mesmas, ou uma combinação das mesmas.
[00190] Por exemplo, a proteína moduladora, quando co-expressa com a proteína de fusão no membro da família Bacillus cereus recombinante, resulta em aumento ou diminuição da expressão da proteína de fusão em comparação com o nível de expressão da proteína de fusão em um membro da família Bacillus cereus recombinante que não expressa a proteína moduladora a um nível aumentado sob as mesmascondições, em comparação com a expressão da proteína moduladora num membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem. Onde a proteína moduladora, quando co-expressa no membro da família Bacillus cereus recombinante com a proteína de fusão, resulta em tal aumento da expressão da proteína de fusão, a proteína moduladora pode compreender uma proteína BclB, uma proteína CotE, uma proteína BxpB, uma proteína CotO, uma proteína BclA, uma variante de qualquer dos mesmos, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos
[00191] Alternativamente, a proteína moduladora, quando coexpressa com a proteína de fusão no membro da família Bacillus cereus recombinante, resulta em aumento ou diminuição da expressão da proteína de fusão em comparação com o nível de expressão da proteína de fusão num membro da família Bacillus cereus recombinante que não expressa a proteína moduladora a um aumento do nível sob as mesmas condições, em comparação com a expressão da proteína moduladora num membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem. Onde a proteína moduladora, quando co-expressa no membro da família Bacillus cereus recombinante com a proteína de fusão, resulta em tal diminuição da expressão da proteína de fusão, a proteína moduladora pode compreender uma proteína BclC, uma proteína ApcC, uma proteína YjcB, uma variante de qualquer dos mesmos, ou uma combinação de qualquer dos mesmos.
[00192] Por exemplo, a proteína moduladora pode compreender uma proteína CotO, uma proteína BclB, uma proteína ExsFA/BxpB, uma proteína YjcB, uma variante de qualquer dos mesmos, ou uma combinação de qualquer dos mesmos.
[00193] Para facilidade de referência, as descrições das proteínas moduladoras e as suas SEQ ID NOs. Estão listadas na Tabela 2 abaixo. TABELA 2. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE PROTEÍNAS MODULADORAS
[00194] Muitas das proteínas moduladoras têm homólogos, parálogos, ou rearranjos genéticos. Assim, muitas proteínas que têm pelo menos 70% de homologia a qualquer uma das sequências moduladoras listadas acima na Tabela 2 irão reter a capacidade para atuar como proteínas moduladoras quando sobre-expressas em um membro da família Bacillus cereus recombinante que também expressa qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas que também expressam qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas. Além disso, muitas das proteínas moduladoras (por exemplo, BclA, BclB, e BclE) têm regiões de repetição internas que podem diferir significativamente entre cepas. As adições ou reduções no número de repetições da região de repetição interna afetariam homologia de sequência total, mas, desde que a homologia das regiões amino e carboxi-terminal da proteína retêm pelo menos 75% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de aminoácidos das proteínas moduladoras listadas na tabela acima, seria esperado que tais homólogos retivessem a capacidade de agir como proteínas moduladoras.
[00195] Assim, por exemplo, a proteína moduladora pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 70% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 123- 156.
[00196] A proteína moduladora pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 123-156.
[00197] A proteína moduladora pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 123-156.
[00198] Assim, por exemplo, a proteína moduladora pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 123156.
[00199] A proteína moduladora pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 123-156.
[00200] A proteína moduladora pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 123-156.
[00201] Assim, por exemplo, a proteína moduladora pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 123156.
[00202] A proteína moduladora pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 123-156.
[00203] Por exemplo, a proteína moduladora pode compreender SEQ ID NO: 124, 126, 134, 135, 143, ou 144.
[00204] Os membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína moduladora podem compreender um vetor que codifica a proteína moduladora. Por exemplo, o vetor pode compreender um plasmídeo de múltiplas cópias. Plasmídeos de múltiplas cópias permitem níveis de expressão elevados da proteína moduladora.
III.PROMOTORES PARA A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO E/OU PROTEÍNAS MODULADORAS EM MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTES
[00205] Quando a proteína de fusão compreende uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante, o DNA que codifica a proteína de fusão está adequadamente sob o controle de um promotor de esporulação que irá provocar a expressão da proteína de fusão no exosporium de um endosporo de um membro da família Bacillus cereus (por exemplo, um promotor bclA nativo a partir de um membro da família Bacillus cereus ).
[00206] Assim, qualquer uma das proteínas de fusão descritas acima na Seção 1.B pode ser expressa no membro da família Bacillus cereus recombinante sob o controle de um promotor de esporulação que é nativo à sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão, ou uma porção de um tal promotor.
[00207] Do mesmo modo, qualquer uma das proteínas moduladoras descritas acima na Seção II pode ser expressa sob o controle do seu promotor nativo ou uma porção da mesma.
[00208] Qualquer uma das proteínas de fusão ou proteínas moduladoras pode ser expressa sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão.
[00209] O promotor de esporulação de alta expressão compreende uma sequência promotora de polimerase específica de esporulação Sigma-K.
[00210] Para facilidade de referência, sequências de nucleotídeos para os promotores exemplificativos que podem ser usados para ex-pressar qualquer uma das proteínas de fusão ou qualquer uma das proteínas moduladoras num membro da família Bacillus cereus recombinante são fornecidas na Tabela 3, abaixo, juntamente com a sua SEQ ID NOs. A Tabela 3 também fornece sequências de promotor mí-nimas exemplificativas para muitos dos promotores. Na Tabela 3, se-quências promotoras de polimerase específicas de esporulação sigmaK nos promotores são indicadas pelo texto em negrito e sublinhado. Várias das sequências têm múltiplas sequências Sigma K que se sobrepõem umas às outras. As sobreposições são indicadas por sublinhado duplo na tabela. As sequências promotoras são imediatamente a montante do códon de início para cada um dos genes indicados. Em outras palavras, nas sequências apresentadas no Quadro 3 abaixo, o último nucleotídeo da sequência promotora imediatamente precede o primeiro nucleotídeo do códon de iniciação para a região de codificação do gene que codifica a proteína indicada. TABELA 3. SEQUÊNCIAS PROMOTORAS PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO E PROTEÍNAS MODULADORAS EM MEMBROS DA FAMÍLIA BACI-LLUSCEREUS RECOMBINANTES
[00211] As sequências promotoras de polimerase específicas de esporulação Sigma-K nas sequências promotoras apresentadas na Tabela 3 resultam em níveis de expressão elevados da proteína de fusão ou proteína moduladora durante esporulação tardia. A sequência de consenso para a sequência promotora de polimerase específica de esporulação Sigma-K é CATANNNTN; no entanto, esta sequência pode compreender até duas mutações e ainda ser funcional. A sequência promotora de polimerase específica de esporulação Sigma-K é geral-mente encontrada a montante do local de ligação ao ribossoma (RBS).
[00212] Promotores que têm um elevado grau de identidade de sequência com qualquer uma das sequências mostradas na Tabela 3 acima também podem ser utilizados para expressar as proteínas de fusão ou as proteínas moduladoras.
[00213] Por exemplo, a proteína de fusão ou a proteína moduladora podem ser expressas sob o controle de um promotor que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das ID SEQ NOs: 157-231.
[00214] Por exemplo, a proteína de fusão ou a proteína moduladora podem ser expressas sob o controle de um promotor que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das ID SEQ NOs: 157-231.
[00215] A proteína de fusão ou a proteína moduladora pode ser expressa sob o controle de um promotor que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 95% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das ID SEQ NOs: 157231.
[00216] Por exemplo, a proteína de fusão ou a proteína moduladora podem ser expressas sob o controle de um promotor que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 98% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das ID SEQ NOs: 157-231.
[00217] Por exemplo, a proteína de fusão ou a proteína moduladora podem ser expressas sob o controle de um promotor que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 99% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das ID SEQ NOs: 157-231.
[00218] A proteína de fusão ou a proteína moduladora pode ser expressa sob o controle de um promotor que compreende uma sequência de ácido nucleico com 100% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das ID SEQ NOs: 157-231.
[00219] Por exemplo, a proteína moduladora ou proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor BclA (por exemplo, SEQ ID NO: 189, 190, 215, 229 ou 230), um promotor CotY (por exemplo, SEQ ID NO: 161, 162 ou 221), um promotor ExsY (por exemplo, SEQ ID NO: 157, 158 ou 220), ou um promotor de ramnose (por exemplo, SEQ ID NO: 225). Por exemplo, a proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229, ou 230.
[00220] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 85% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229, ou 230.
[00221] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229, ou 230.
[00222] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 95% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229, ou 230.
[00223] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 98% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229, ou 230.
[00224] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 99% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229, ou 230.
[00225] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor que compreende uma sequência de ácido nucleico com 100% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229, ou 230.
[00226] A proteína de fusão ou a proteína moduladora pode ser expressa sob o controle de um promotor que compreende uma sequência promotora de polimerase específica de esporulação Sigma-K, em que a sequência ou sequências promotoras de polimerase específica de Sigma-K tem 100% de identidade com os nucleotídeos correspondentes de qualquer uma da SEQ ID NOs: 157-231.
[00227] As proteínas de fusão podem ser expressas sob o controle de um promotor que é nativo à sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão. Assim, por exemplo, onde a sequência de direcionamento é derivada de BclA, a proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor BclA nativo (por exemplo, SEQ ID NO: 189, 190, 215, 229 ou 230).
[00228] As proteínas moduladoras podem ser expressas sob o controle dos seus promotores nativos. Assim, por exemplo, onde a proteína moduladora compreende CotO, o CotO pode ser expresso sob o controle de um promotor CotO nativo (por exemplo, SEQ ID NO: 163 ou 226). Sequências promotoras nativas para cada uma das proteínas moduladoras acima são fornecidas na Tabela 3.
[00229] A Tabela 3 também fornece sequências promotoras mínimas exemplificativas para cada proteína moduladora. As proteínas moduladoras e proteínas de fusão podem ser expressas sob qualquer uma destas sequências promotoras mínimas. Por exemplo, a proteína moduladora pode ser expressa sob um promotor mínimo que compreende uma porção da sequência promotora nativa. Por exemplo, onde a proteína moduladora compreende CotO, o CotO pode ser expresso sob o promotor mínimo CotO (SEQ ID NO: 164).
[00230] Alternativamente, as proteínas moduladoras podem ser ex-pressas sob o controle de qualquer promotor que compreende uma sequência do promotor de polimerase específico de esporulação de Sigma-K, independentemente do fato do promotor ser o promotor nativo para a proteína moduladora. Como pode ser visto a partir da Tabela 3, cada um dos promotores nativos e os promotores mínimos para as proteínas moduladoras contém pelo menos uma sequência promotora de polimerase específica de esporulação Sigma-K. Assim, por exemplo, onde a proteína moduladora é BxpB, o BxpB pode ser expressa sob o controle de um promotor BclA (por exemplo, SEQ ID NO: 189, 190, 215, 229 ou 230) ou qualquer um dos outros promotores listados na Tabela 3.
[00231] Além disso, a proteína moduladora ou a proteína de fusão podem ser expressas sob uma porção de qualquer um dos promotores acima listados na Tabela 3, enquanto a porção do promotor inclui uma sequência promotora de polimerase específica de esporulação SigmaK. Por exemplo, a proteína moduladora pode ser expressa sob uma região promotora que compreende os primeiros 25, 50, 100, 150, 200, 250 ou 300 nucleotídeos a montante do códon de início, enquanto que a região compreende uma sequência promotora de polimerase específica de esporulação Sigma K.
IV.MUTAÇÕES E OUTRAS ALTERAÇÕES GENÉTICAS PARA O MEM- BRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE QUE PERMITEM A COLETA DE EXOSPORIUM LIVRE
[00232] Como é aqui descrito mais abaixo, o membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa proteínas de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium, ou um fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante poderá ser usado para administrar proteínas ou peptídeos de interesse para as plantas, sementes, um meio de crescimento de plantas, ou uma área em torno de uma semente ou de uma planta (por exemplo, por meio de rega do solo, aplicação foliar, ou como um tratamento de sementes).Além disso, o membro da família Bacillus cereus recombinante podem ser utilizados para distribuir as moléculas de ácido nucleico a animais, insetos, vermes (por exemplo, nemátodo), fungos e protozoários; para fornecer as proteínas ou peptídeos a um animal; em vacinas e para a produção de uma resposta imunogênica; para a remediação; para o tratamento de um fluido de fraturamento hidráulico para quebrar uma emulsão ou gel dentro do fluido; para desinfecção; e para várias outras utilizações aqui descritas abaixo. No entanto, em alguns casos, a presença de micro-organismos vivos pode não ser desejável, e em vez disso, seria desejável separar o esporo vivo de proteínas de fusão no exosporium na superfície exterior do esporo. Por exemplo, em al-gumasaplicações, será desejável aumentar a atividade da enzima sem a preocupação com a integridade de esporos. Em tais situações, os fragmentos exosporium podem ser preferidos sobre os microrganismos vivos que apresentam a enzima no seu exosporium.
[00233] Além disso, para algumas utilizações, pode ser desejável para reduzir a densidade do produto. Em tais casos, seria desejável separar o esporo denso do exosporium (contendo as proteínas de fusão). No campo das vacinas, pode ser desejável separar o esporo do exosporium (contendo proteínas de fusão que compreendem um antígeno), a fim de remover potenciais antígenos presentes no próprio esporo a partir da preparação da vacina. Além disso, em algumas circunstâncias, a presença de esporos vivos levaria a potencial para o crescimento bacteriano em um produto, o que seria indesejável para algumas aplicações (por exemplo, a suplementação de alimentos para animais e processamento de peças de couro).
[00234] As mutações ou outras alterações genéticas (por exemplo, a sobre expressão de uma proteína) pode ser introduzida no membro da família Bacillus cereus recombinante que permitem exosporium livre seja separado a partir de esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante. Este processo de separação produz fragmentos de exosporium que contêm as proteínas de fusão, mas que são subs-tancialmente livres dos próprios esporos. Por "substancialmente isento de esporos de" pretende-se dizer que uma vez que o exosporium livre é separado a partir dos esporos, uma preparação é obtida que contém menos do que 5% em volume de esporos, de preferência menos do que 3% em volume de esporos, ainda mais preferencialmente menos do que 1% em volume de esporos, e mais preferencialmente não contém esporos ou se esporos estão presentes, eles não são detectáveis. Estes fragmentos exosporium podem ser usados em lugar do membro da família Bacillus cereus recombinante em si e podem ser utilizados para distribuir as proteínas ou peptídeos de interesse para as plantas, sementes, um meio de crescimento de plantas, ou uma área em torno de uma semente ou uma planta, ou por qualquer dos outros fins aqui descritos.
[00235] Assim, um membro da família Bacillus cereus recombinante é fornecido que expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante. O membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação ou expressa uma proteína, em que a expressão da proteína é aumentada em com-paração com a expressão da proteína em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições. A mutação ou o aumento da expressão da proteína resulta em esporos de Bacillus cereus com um exosporium que é mais fácil de remover do esporo, em comparação com o exosporium de um tipo selvagem de esporos.
[00236] Um outro membro da família Bacillus cereus recombinante é fornecido que expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante. O membro da família Bacillus cereus recombinante: (i) compreende uma mutação num gene CotE; (ii) expressa uma proteína ExsY, em que a expressão da proteína ExsY é aumentada em comparação com a expressão da proteína ExsY membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições, e em que a proteína compreende uma marcação ExsY carboxi-terminal compreendendo uma proteína globular; (iii) expressa uma proteína BclB, em que a expressão da proteína BclB é aumentada em comparação com a expressão da proteína BclB num membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem nas mesmas condições; (iv) expressa uma proteína YjcB, em que a expressão da proteína YjcB é aumentada em comparação com a expressão da proteína YjcB num membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições; (v) compreende uma mutação num gene ExsY; (vi) compreende uma mutação num gene CotY; (vii) compreende uma mutação num gene ExsA; ou (viii) compreende uma mutação num gene CotO.
[00237] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação no gene CotE, como um knock-out do gene CotE ou uma forma negativa dominante do gene CotE. A mutação no gene CotE pode parcial ou totalmente inibir a capacidade de CotE para anexar o exosporium aos esporos.
[00238] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode expressar uma proteína ExsY. A proteína ExsY compreende uma eti-queta de carboxi-terminal que compreende uma proteína globular (por exemplo, uma proteína fluorescente verde (GFP) ou uma variante da mesma), e a expressão da proteína ExsY é aumentada em comparação com a expressão da proteína ExsY num membro da família Bacillus cereus recombinante de tipo selvagem sob as mesmas condições. A proteína globular pode ter um peso molecular compreendido entre 25 kDa e 100 kDa. A expressão da proteína ExsY compreendendo a etiqueta de carboxi-terminal que compreende uma proteína globular, também pode inibir a ligação da proteína para os seus objetivos ExsY no exosporium.
[00239] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode expressar uma proteína BclB, o que pode resultar na formação de um exosporium frágil. A expressão da proteína BclB pode ser aumentada em comparação com a expressão da proteína BclB num membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições.
[00240] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode expressar uma proteína YjcB, o que pode fazer com que o exosporium forme peças em vez de uma estrutura completa. A expressão da proteína YjcB pode ser aumentada em comparação com a expressão da proteína YjcB num membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições.
[00241] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação de um gene ExsY, tal como um knock-out do gene ExsY. A mutação no gene ExsY pode parcialmente ou totalmente inibir a capacidade de ExsY para completar a formação do exosporium ou anexar o exosporium ao esporo.
[00242] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação de um gene CotY, tal como um knock-out do gene CotY. A mutação no gene Coty pode resultar na formação de um exosporium frágil.
[00243] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação de um gene ExsA, tal como um knock-out do gene ExsA. A mutação no gene EXSA pode resultar na formação de um exosporium frágil.
[00244] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação no gene de CotO, como um knock-out do gene CotO ou uma forma negativa dominante do gene CotO. A mutação no gene CotO pode fazer com que o exosporium forme em tiras.
[00245] Fragmentos exosporium podem ser preparados a partir de qualquer um destes membro da família Bacillus cereus recombinante e usado para várias finalidades como mais adiante descrito. Os fragmentos exosporium compreendem as proteínas de fusão. Após a purificação dos fragmentos exosporium que contêm as proteínas de fusão a partir dos esporos, uma preparação de proteína livre de células é obtida, em que as proteínas de fusão são estabilizadas e suportadas por meio de ligações covalentes para os fragmentos exosporium.
[00246] Devido às fortes ligações covalentes entre as proteínas de fusão e os fragmentos de exosporium, as proteínas de fusão tornamse resistentes ao calor. A resistência ao calor das proteínas de fusão ligadas aos fragmentos exosporium lhes permite ser utilizados para aplicações que requerem proteínas resistentes ao calor ou enzimas (por exemplo, em aditivos para alimentação animal).
V.A INATIVAÇÃO DE ESPOROS DE BACTÉRIAS DO GÊNERO BACILLUS , INCLUINDO ESPOROS DE MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTES
[00247] Os esporos de bactérias do gênero Bacillus podem ser ge-neticamente inativados. Inativação genética dos esporos pode ser van-tajosa, por exemplo, porque permite a distribuição de esporos de uma planta ou de um meio de crescimento da planta, eliminando quaisquer efeitos prejudiciais que as bactérias vivas podem ter sobre uma planta. Além disso, o uso de esporos inativados pode fornecer muitas das mesmas vantagens (por exemplo, a prevenção do crescimento bacteriano num produto) como acima discutido na Seção IV, no que diz res-peito à utilização de fragmentos de exosporium. A. Inativação genética por sobre-expressão de uma protease ou uma nuclease
[00248] Uma bactéria recombinante do gênero Bacillus que expressa uma protease ou uma nuclease é fornecida. A expressão da protease ou a nuclease é aumentada em comparação com a expressão da protease ou a nuclease de uma bactéria do gênero Bacillus do tipo selvagem sob as mesmas condições. O aumento da expressão da protease ou a nuclease parcialmente ou completamente inativa os esporos da bactéria recombinante do gênero Bacillus ou torna esporos da bactéria recombinante do gênero Bacillus mais suscetíveis à inativação química ou física.
[00249] A bactéria recombinante do gênero Bacillusé de preferência um membro da família Bacillus cereus recombinante.
[00250] Assim, um membro da família Bacillus cereus recombinante também pode expressar uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante.
[00251] A bactéria recombinante do gênero Bacillus pode expressar tanto uma protease e uma nuclease, em que a expressão da protease é aumentada em comparação com a expressão da protease da bactéria do gênero Bacillus de tipo selvagem sob as mesmas condições e a expressão da nuclease é aumentada em comparação com a expressão da nuclease em uma bactéria do gênero Bacillus de tipo selvagem sob as mesmas condições.
[00252] A protease da bactéria recombinante pode compreender uma protease não específica.
[00253] A protease da bactéria recombinante pode compreender uma protease de serina, treonina uma protease, uma protease de cisteína, uma protease de aspartato, ácido glutâmico uma protease, uma protease alcalina, uma subtilisina, uma protease de histidina, ou uma metaloprotease.
[00254] A protease da bactéria recombinante pode compreender uma protease de germinação de esporos, como uma germinação de esporos de protease de Bacillus subtilis, uma germinação de esporos protease de Bacillus mycoides, ou uma germinação de esporos protease de Bacillus thuringiensis.
[00255] A germinação de esporos de protease pode compreender uma forma ativa da germinação dos esporos de protease. Esta protease é naturalmente inativa nos esporos. Após a germinação, a protease torna-se ativa devido à clivagem da protease para uma forma ativa pró-proteína. Assim, a bactéria recombinante pode compreender uma protease ativa, em vez da forma naturalmente inativa. A protease ativa pode digerir as proteínas protetoras SASP no esporo antes da germinação.
[00256] A nuclease da bactéria recombinante pode compreender uma endonuclease ou uma exonuclease. A nuclease pode compreender uma endonuclease não específica, tal como endonuclease 1 de Bacillus subtilis. Por exemplo, a protease e a germinação de esporos endonuclease 1 pode ter as sequências de aminoácidos indicadas abaixo na Tabela 4. TABELA 4. AS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE UMA PROTEASE DE GER-MINAÇÃODE ESPOROS E ENDONUCLEASE 1
[00257] Uma protease ou uma nuclease que tem um elevado grau de identidade de aminoácidos com as sequências listadas acima na Tabela 4 pode também ser usada.
[00258] Assim, por exemplo, a protease de germinação de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 233 ou 234.
[00259] A protease de germinação de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 233 ou 234.
[00260] A protease de germinação de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 233 ou 234.
[00261] A protease de germinação de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 233 ou 234.
[00262] A protease de germinação de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 233 ou 234.
[00263] A protease de germinação de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 233 ou 234.
[00264] Da mesma forma, a endonuclease não específica pode compreender um aminoácido possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 232.
[00265] A endonuclease não específica pode compreender um aminoácido possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 232.
[00266] A endonuclease não específica pode compreender um aminoácido possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 232.
[00267] A endonuclease não específica pode compreender um aminoácido possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 232.
[00268] A endonuclease não específica pode compreender um aminoácido possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 232.
[00269] A endonuclease não específica pode compreender um aminoácido possuindo pelo menos 100% de identidade com a SEQ ID NO: 232.
[00270] A protease ou nuclease pode ser expressa sob o controle de um promotor que compreende uma sequência promotora sigma G. Por exemplo, o promotor pode ter uma das sequências mostradas na Tabela 5 abaixo. A sequência de consenso para a ligação do fator de transcrição sigma G é CATNNTA, onde N é qualquer nucleotídeo. As sequências promotoras sigma G nos promotores da Tabela 5 são indicadas por texto em negrito e sublinhado. TABELA 5. AS SEQUÊNCIAS PROMOTORAS QUE POSSUEM SEQUÊNCIAS SIGMA
[00271] Expressão de uma nuclease ou protease sob um promotor sigma G permite a expressão específica do local da nuclease ou protease na forespore, onde a atividade da enzima é dirigida para o forespore e, a região onde o DNA alvo bacteriano está localizado. Clivagem extensa do DNA do forespore é letal para os esporos de bactérias quando se começa a germinar.
[00272] Por exemplo, como ilustrado adicionalmente nos exemplos fornecidos abaixo, a sobre-expressão de germinação de esporos de protease (GPR) na sua forma ativa no forespore de um membro da família Bacillus cereus durante a esporulação resulta na clivagem proteolítica das proteínas no forespore e inativação dos esporos e/ou torna o esporo mais sensível à inativação pela radiação ultravioleta ou por irradiação gama. Da mesma forma, a sobre-expressão de uma en-donuclease não específica no forespore durante a esporulação destrói o DNA nos esporos, conduzindo a um elevado número de esporos de partícula inativados. Estes métodos para a inativação de esporos membros da família Bacillus cereus esporos podem ser utilizados se-paradamente ou em conjunto uns com os outros e/ou com outros mé-todos de inativação de esporos.
[00273] A expressão de genes em esporos Bacillusé rigorosamente regulada pela expressão de fatores específicos esporulação sigma que dirigem a polimerase de RNA para os genes que precisam ser expressos durante cada fase de esporulação. Expressão tardia de genes no forespore, onde o DNA de bactérias e proteínas essenciais são emba-lados,é regulada pelo fator sigma G. Durante a esporulação tardia, o DNA bacteriano é embalado com proteínas protetoras chamadas proteínas pequenas solúveis em ácido (SASPs). Estas proteínas SASP incluem SASPα, SASPβ e SASPY,entre outras. As proteínas SASP protegem o DNA bacteriano a partir de irradiação UV e outros assaltos.Após a germinação, a protease de germinação de esporos próproteína é ativada e digere estas proteínas SASP.
[00274] Ao expressar uma GPR sob o controle de um promotor Sigma G, a GPR é expressa no forespore e as proteínas protetoras SASP são degradadas conforme a esporulação começa, deixando o DNA bacteriano mais suscetível à degradação. Do mesmo modo, a expressão de uma nuclease não específica sob o controle de um promotor sigma G leva à digestão do DNA do hospedeiro. Uma vez que o esporo é incapaz de reparar os danos em larga escala ao seu DNA, este acaba por conduzir a matança do esporo. A sobre-expressão de uma GPR e uma endonuclease não específica pode ser utilizada em conjunto para degradar tanto as proteínas SASP de proteção e o DNA do hospedeiro.
[00275] A protease ou nuclease pode ser expressa sob o controle de um promotor que compreende uma sequência promotora sigma G.
[00276] Assim, a protease ou a nuclease pode ser expressa sob o controle de qualquer um dos promotores listados na Tabela 5 acima. Além disso, a protease ou a nuclease pode ser expressa sob o controle de um promotor que tem um elevado grau de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de promotor listada acima na Tabela 5.
[00277] Por exemplo, o promotor pode compreender uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 95% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 235246.
[00278] O promotor pode compreender uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 98% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 235-246.
[00279] O promotor pode compreender uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 99% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 235-246.
[00280] Por exemplo, o promotor pode compreender uma sequência de ácido nucleico com 100% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 235-246.
[00281] Em qualquer uma das bactérias recombinantes do gênero Bacillus que expressam uma protease ou uma nuclease, esporos da bactéria recombinante do gênero Bacillus podem ser mais suscetíveis à inativação, por exemplo, por irradiação ultravioleta, radiação gama, ou por tratamento com lixívia, peróxido de hidrogênio, clorofórmio, fenol, ou ácido acético, em comparação com os mesmos esporos que não expressam a protease ou a nuclease de um nível aumentado em comparação com a expressão da protease ou a nuclease de uma bactéria do gênero Bacillus de tipo selvagem, tratada sob as mesmas condições.
B. Inativação genética por mutação de um gene que codifica um receptor de germinação, uma enzima lítica de esporos do núcleo, uma pequena proteína de esporos solúvel em ácido (SASP), ou uma proteína de revestimento de esporos
[00282] Os esporos de qualquer dos esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão que compreende uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium, ou um fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante pode também ser geneticamente inativado ou tornado mais suscetível à inativação química ou física por modificação do membro da família Bacillus cereus que compreendem uma mutação.
[00283] Tais mutações incluem knock-out ou outras mutações inativadoras em um ou mais genes que codificam um receptor de germinação. Os genes de receptores de germinação incluem, por exemplo, Gera, GERB, Gerk, GerH, Geri, gerg, GERL, GerQ, Gerr, Gers, Gern, geru ou GerX.
[00284] Tais mutações incluem também knock-out ou outras mutações de inativação em enzimas líticas de córtex de esporos. Por exemplo, as enzimas líticas do córtex de esporos e SleB CwJ podem ser mutadas para inativar os esporos. Tais mutações impedem supercrescimento do esporo sobre germinação e inativam eficazmente os esporos.
[00285] Tais mutações incluem ainda knock-out ou outras mutações de inativação de genes SASP (por exemplo, SASPα, SASPβ ou SASPY). Tais mutações eliminam a proteção UV dos esporos e torna-os mais suscetíveis à inativação pela radiação ultravioleta e outros métodos.
[00286] Tais métodos incluem também fazer knock-out ou outras mutações de inativação em genes que codificam revestimento de esporos ou proteínas do córtex (por exemplo, CotA, CotB ou CotC). Tais mutações tornam os esporos mais suscetíveis à inativação por méto-dosfísicos ou químicos tais como a exposição a irradiação ultravioleta, radiação gama, ou o tratamento com solventes, tais como lixívia, peróxido de hidrogênio, clorofórmio, fenol ou ácido acético.
[00287] Assim, a presente invenção se refere a um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante. O membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação que inativa parcialmente ou completamente esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante ou torna esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante mais suscetível à inativação química ou física, em comparação com os mesmos esporos que não compreendem a mutação. A mutação compreende uma mutação num gene que codifica um receptor de germinação, uma mutação num gene que codifica uma enzima lítica de córtex de esporos, uma mutação num gene que codifica a pequena proteína solúvel em ácido do esporo (SASP), ou uma mutação num gene que codifica um revestimento de esporos ou proteína córtex.
[00288] A presente invenção se refere ainda a um membro da famí-liaBacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão como descrito na Seção I acima. O membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação que inativa parcialmente ou completamente esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante ou torna esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante mais suscetível à inativação química ou física, em compa-ração com os mesmos esporos que não compreendem a mutação.
[00289] Qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante descrito acima na Seção V.A que expressam uma protease ou uma nuclease pode também compreender uma mutação que inativa parcialmente ou completamente esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante ou torna esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante mais suscetível à inativação química ou física, em comparação com os mesmos esporos que não compreendem a mutação. Por exemplo, a mutação pode compreender uma mutação num gene que codifica um receptor de germinação, uma mutação num gene que codifica uma enzima lítica de córtex de esporos, uma mutação num gene que codifica a pequena proteína solúvel em ácido do esporo (SASP), ou uma mutação num gene que codifica um revestimento de esporos ou proteína córtex.
[00290] Por exemplo, a mutação pode compreender uma mutação num gene que codifica um receptor de germinação, tal como uma mutação de knock-out do gene que codifica o receptor de germinação. O receptor de germinação pode compreender GerA, GerB, GerK, GerH, GerI, GerG, GerL, GerQ, GerR, GerS, GerN, GerU ou GerX.
[00291] Por exemplo, a mutação pode compreender uma mutação num gene que codifica uma enzima lítica de córtex de esporo, tal como uma mutação de knock-out do gene que codifica a enzima lítica de córtex de esporo. A enzima lítica de córtex de esporo pode compreender SleB ou CwlJ.
[00292] Por exemplo, a mutação pode compreender uma mutação num gene que codifica uma SASP, tal como uma mutação num gene SspA, uma mutação num gene SspB, uma mutação num gene SspC, uma mutação num gene SspD, uma mutação numa gene SspE, uma mutação num gene SspF, uma mutação num gene SspG, uma mutação num gene SspH, uma mutação num gene SspI, uma mutação num gene SspJ, uma mutação num gene SspK, uma mutação num SspL do gene, uma mutação num gene SspM, uma mutação num gene SspN, uma mutação num gene SspO, uma mutação num gene SspP, ou uma combinação dos mesmos. O SASP pode compreender SASPα, SASPβ ou SASPY. Os esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante podem ser mais suscetíveis à inativação por irradiação gama ou irradiação ultravioleta, em comparação com os mesmos esporos que não compreendem a mutação no gene que codifica a SASP.
[00293] Por exemplo, a mutação pode compreender uma mutação num gene que codifica um revestimento de esporos ou proteína córtex, tal como uma mutação de knock-out do gene que codifica o revestimento de esporos ou proteína córtex. O revestimento de esporos ou proteína córtex pode compreender CotA, CotB ou CotC. Os esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante podem ser mais suscetíveis à inativação por irradiação ultravioleta, irradiação de raios gama ou por meio de tratamento com lixívia, peróxido de hidrogênio, o clorofórmio, o fenol, ou ácido acético, em comparação com os mesmos esporos que não compreendem a mutação no revestimento de esporos ou proteína córtex, tratado sob as mesmas condições.
VI.MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTES QUE SUPEREXPRESSAM ENZIMAS EXOSPORIUM QUE TÊM EFEITOS BENÉFICOS EM PLANTAS OU ATRASAM A GERMINAÇÃO DE ESPOROS MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS .
[00294] Membros da família Bacillus cereus recombinantes que sobre-expressam várias proteínas do exosporium para fornecer efeitos benéficos sobre as plantas ou atrasam a germinação de esporos são também fornecidos.
[00295] Um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína do exosporium é fornecido, em que a expressão da proteína do exosporium é aumentada em comparação com a expressão da proteína num exosporium de membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições. A proteína do exosporium pode compreender uma enzima exosporium, em que a enzima compreende uma enzima exosporium envolvida na solubilização de nutrientes, uma hidrolase de inosina-uridina, uma protease, uma enzima que catalisa a degradação de um radical livre, uma arginase, ou uma alanina racemase. Alternativamente, a proteína do exosporium pode compreender uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína Cote uma proteína Coto, uma proteína ExsY, uma proteína ExsFA/BxpB, uma proteína Coty, uma proteína ExsFB, uma proteína ExsJ, uma proteína ExsH, um YjcA proteína, uma proteína YjcB, uma proteína BCLC, uma proteína BxpA, uma proteína BclE, uma proteína beta/BAS3290, uma proteína Exsa, uma proteína ExsK, uma proteína ExsB, uma proteína YabG, ou uma proteína Tgl.
[00296] A proteína do exosporium não é de preferência parte de uma proteína de fusão.
[00297] Exemplos de sequências de aminoácidos para AcpC, InhA1, InhA2, InhA3, SODA1, e SODA2 são fornecidos acima nas Ta-belas 1 e 2. Sequências exemplificativas para alanina racemase 1, alanina racemase 2, arginase, IunH1, e IunH2 são fornecidas pela SEQ ID NOs. Referenciadas na Tabela 6 abaixo. TABELA 6. EXEMPLOS DE SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA AS ENZIMAS EXOSPORIUM
[00298] A sobre-expressão de hidrolases de inosina-uridina e racemases alanina dificulta a capacidade dos esporos para germinar e, assim, mantém os esporos numa fase dormente e aumenta a estabilidade dos esporos.
[00299] As enzimas de sódio e arginase degradam os radicais livres. Os esporos que sobre-expressam estas enzimas têm uma maior resistência ao stress causado por radicais livres.
[00300] Sempre que a proteína compreende uma enzima exosporium, e a enzima exosporium compreende uma enzima envolvida na solubilização de nutrientes, a enzima envolvida na solubilização de nu-trientes pode compreender uma enzima envolvida na solubilização de fosfato, tal como uma fosfatase ácida (por exemplo, AcpC). A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 137.
[00301] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 137.
[00302] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 137.
[00303] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 137.
[00304] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 137.
[00305] Sempre que a proteína compreende uma enzima exosporium, e a enzima hidrolase exosporium compreende uma inosinauridina, a hidrolase de inosina-uridina pode compreender IunH1 ou IunH2. A hidrolase de inosina-uridina pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 250 ou 251.
[00306] A hidrolase de inosina-uridina pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 250 ou 251.
[00307] A hidrolase de inosina-uridina pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 250 ou 251.
[00308] A hidrolase de inosina-uridina pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 250 ou 251.
[00309] A hidrolase de inosina-uridina pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 250 ou 251.
[00310] A hidrolase de inosina-uridina pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 250 ou 251.
[00311] Sempre que a proteína compreende uma enzima exosporium, e a enzima exosporium compreende uma protease, a protease pode ser uma metaloprotease (por exemplo, InhA1, InhA2 ou InhA3). A metaloprotease pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130, ou 138.
[00312] A metaloprotease pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130, ou 138.
[00313] A metaloprotease pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130, ou 138.
[00314] A metaloprotease pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130, ou 138.
[00315] A metaloprotease pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130, ou 138.
[00316] A metaloprotease pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130, ou 138.
[00317] A metaloprotease pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130, ou 138.
[00318] Onde a proteína do exosporium compreende uma enzima exosporium, e a enzima exosporium compreende uma enzima que ca-talisa a degradação de um radical livre, a enzima que catalisa a degra-dação de um radical livre pode compreender uma superóxido dismutase (por exemplo, superóxido-dismutase 1 (SODA1) ou superóxido dismutase 2 (SODA2)). A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00319] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00320] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00321] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00322] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00323] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00324] Sempre que a proteína compreende uma enzima exosporium, e a enzima compreende uma exosporium arginase, arginase pode compreender um Bacillus thuringiensis arginase. A arginase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 249.
[00325] A arginase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 249.
[00326] A arginase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 249.
[00327] A arginase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 249.
[00328] A arginase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 249.
[00329] A arginase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 249.
[00330] Sempre que a proteína compreende uma enzima exosporium, e a enzima exosporium compreende uma alanina racemase, a alanina racemase pode compreender a alanina racemase 1 (ALR1) ou alanina racemase 2 (ALR2). A alanina racemase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 247 ou 248.
[00331] A alanina racemase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 247 ou 248.
[00332] A alanina racemase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 247 ou 248.
[00333] A alanina racemase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 247 ou 248.
[00334] A alanina racemase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 247 ou 248.
[00335] A alanina racemase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 247 ou 248.
[00336] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína Cote uma proteína Coto, uma proteína ExsY, uma proteína ExsFA/BxpB, uma proteína Coty, uma proteína ExsFB, uma proteína ExsJ, uma proteína ExsH, um YjcA proteína, uma proteína YjcB, uma proteína BCLC, uma proteína BxpA, uma proteína BclE, uma proteína beta/BAS3290, uma proteína Exsa, uma proteína ExsK, uma proteína ExsB, uma proteína YabG, ou uma proteína Tgl. A proteína do exosporium compreende de preferência uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína Cote, ou uma proteína CotO. Exemplos de sequências de aminoácidos para estas proteínas do exosporium podem ser encontrados na Tabela 2 acima.
[00337] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína BclA. A proteína BclA pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 141 ou 142.
[00338] A proteína BclA pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 141 ou 142.
[00339] A proteína BclA pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 141 ou 142.
[00340] A proteína BclA pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 141 ou 142.
[00341] A proteína BclA pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 141 ou 142.
[00342] A proteína BclA pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 141 ou 142.
[00343] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína BclB. A proteína BclB pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 143 ou 144.
[00344] A proteína BclB pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 143 ou 144.
[00345] A proteína BclB pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 143 ou 144.
[00346] A proteína BclB pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 143 ou 144.
[00347] A proteína BclB pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 143 ou 144.
[00348] A proteína BclB pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 143 ou 144.
[00349] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína CotE. A proteína CotE pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 149.
[00350] A proteína CotE pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 149.
[00351] A proteína CotE pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 149.
[00352] A proteína CotE pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 149.
[00353] A proteína CotE pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 149.
[00354] A proteína CotE pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 149.
[00355] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína CotO. A proteína CotO pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 126.
[00356] A proteína CotO pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 126.
[00357] A proteína CotO pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 126.
[00358] A proteína CotO pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 126.
[00359] A proteína CotO pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 126.
[00360] A proteína CotO pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 100% de identidade com a SEQ ID NO: 126.
[00361] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína ExsY. A proteína ExsY pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 123.
[00362] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína ExsFA/BxpB. A proteína ExsFA/BxpB pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 124.
[00363] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína CotY. A proteína CotY pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 125.
[00364] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína ExsFB. A proteína ExsFB pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 127 ou 128.
[00365] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína ExsJ. A proteína ExJ pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 131.
[00366] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína ExsH. A proteína ExsH pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 132.
[00367] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína YjcA. A proteína YjcA pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 133.
[00368] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína YjcB. A proteína YjcB pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 134 ou 135.
[00369] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína BclC. A proteína BclB pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 136.
[00370] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína BxpA. A proteína BxpA pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 145.
[00371] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína BclE. A proteína BclE pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 146 ou 147.
[00372] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína BetA/BAS3290. A proteína BetA/BAS3290 pode compreender uma se-quência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 148.
[00373] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína ExsA. A proteína ExsA pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 150.
[00374] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína ExsK. A proteína ExsK pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 151.
[00375] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína ExsB. A proteína ExsB pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 152.
[00376] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína YabG. A proteína YabG pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 153.
[00377] A proteína do exosporium pode compreender uma proteína Tgl. A proteína Tjl pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 156.
[00378] Assim, um membro da família Bacillus cereus recombinante também pode expressar uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante.
VII.EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO DE MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUSENDOFÍTICOS, EM MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS CAPAZES DE DEGRADAR HERBICIDAS OU PESTICIDAS, OU MEM-BROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS PROBIÓTICOS
[00379] Qualquer uma das proteínas de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium, ou um fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium de um Bacillus cereus membro da família recombinante, pode ser expresso um membro da família Bacillus cereus endofítico, uma cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida, ou uma cepa de bactérias probióticas.
[00380] A expressão das proteínas de fusão numa cepa de bacté-riasendofíticas fornece a capacidade de distribuir a proteína ou peptídeo de interesse na própria planta. As cepas endofíticas pode ser distribuída para as plantas, utilizando vários métodos, por exemplo, as cepas endofíticas pode ser distribuída através de tratamento de sementes, tratamento do meio de crescimento da planta (por exemplo, do solo), de rega, aplicação à própria planta (por exemplo, aplicação foliar às porções aéreas de uma planta). Uma vez no interior da planta, as bactérias multiplicam-se e colonizam os tecidos internos da planta.
[00381] Tal como é explicado mais adiante, as cepas probióticas de bactérias que expressam as proteínas de fusão, e em particular cepas que são simultaneamente probióticas e endofíticas que expressam as proteínas de fusão, são úteis em métodos para a distribuição de proteínas ou peptídeos de interesse (por exemplo, enzimas) aos animais.
[00382] Embora qualquer uma das proteínas de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de di-recionamento, uma proteína do exosporium, ou um fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante pode ser expressa em uma cepa membro da família Bacillus cereus que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida, tal como se explica mais adiante, estas cepas são particularmente úteis em métodos para a descontaminação de um ambiente contaminado com um herbicida e/ou um pesticida.
[00383] A presente invenção se refere portanto a um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de inte-resse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium membro da família Bacillus cereus recombinante, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias endofíticas, uma cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida, ou uma cepa de bactérias probióticas.
[00384] A cepa de bactérias endofíticas podem compreender membros da família Bacillus cereus EE349, membros da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, ou Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, Bacillus cereus membro da família EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, ou Bacillus mycoides EE-B00363.
[00385] Por exemplo, a cepa de bactérias endofíticas pode compreender membros da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, ou Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, membros da família Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, ou Bacillus mycoides EE-B00363.
[00386] A cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida pode compreender membro da família Bacillus cereus EE349, membro da família Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, ou Bacillus mycoides EE-B00363.
[00387] A cepa de bactérias probióticas podem compreender membro da família Bacillus cereus EE349, membro da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, ou Bacillus cereus EE444.
[00388] A presente invenção se refere ainda a um membro da famí-liaBacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias endofíticas, e a proteína de fusão compreende qualquer uma das proteínas de fusão descritas na Seção I acima.
VIII.SEQUÊNCIAS DE DIRECIONAMENTO, PROTEÍNAS DO EXOSPORIUM E FRAGMENTOS DE PROTEÍNAS DO EXOSPORIUM PARA USO EM: (A) MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTES QUE EXPRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO E CO-SOBRE-EXPRESSAM UMA PROTEÍNA MODULADORA; (B) MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTES QUE COMPREENDEM UMA MUTAÇÃO OU OUTRA ALTERAÇÃO GENÉTICA QUE PERMITE A COLETA DE EXOSPORIUM LIVRE; (C) MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTES QUE SOBREXPRESSAM UMA PROTEASE OU UMA NUCLEASE; (D) MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTES QUE EXPRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO E SOBRE-EXPRESSAM UMA PROTEÍNA DO EXOSPORIUM QUE TEM EFEITOS BENÉFICOS EM PLANTAS; OU (E) OU MEMBRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTES ENDOFÍTICOS QUE EXPRESSAM PROTEÍNAS DE FUSÃO
[00389] Qualquer uma das sequências de direcionamento, proteínas, ou proteínas do exosporium descritas nesta seção podem estar em qualquer uma das proteínas de fusão em: (a) qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão e sobreexpressam uma proteína moduladora, descrito na Seção II acima; (b) qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão e compreendem uma mutação ou outra alteração genética que permite a coleta de exosporium livre, descrito na Seção IV acima; (c) qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão e sobreexpressam uma protease ou uma nuclease, acima descrito na Seção V.A; (d) qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão e sobreexpressam uma proteína do exosporium que tem efeitos benéficos sobre as plantas, descritos na Seção VI acima; e (e) qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes endofíticos que expressam uma proteína de fusão, descrita na Seção VII acima.
[00390] Em qualquer um dos membros Bacillus cereus recombinantes (a) a (e), a sequência de direcionamento, proteínas do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium podem compreender: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 43% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 54%; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 1; (5) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 2; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 3; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 3; (14) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 4; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5; (20) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5; (21) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 5; (22) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 6; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (25) uma sequência de direci-onamento compreendendo aminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1038 da SEQ ID NO: 5; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 7; (30) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 7; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 7; (32) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 8; (33) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (35) uma sequência de direci-onamento compreendendo aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1028 da SEQ ID NO: 7; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 9; (40) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 10; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO:11; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 11; (47) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 12; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (51) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13; (55) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:13; (56) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:14; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (58) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (62) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15; (63) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15; (64) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:15; (65) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:16; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (68) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2543 da SEQ ID NO: 15; (73) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:17; (76) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:18; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (80) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19; (83) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:19; (84) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:20; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (87) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21; (91) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:21; (93) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:22; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23; (100) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:23; (102) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:24; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:25; (109) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:26; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:27; (116) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:28; (117) uma sequência de dire-cionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (119) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (120) uma sequênciade direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (121) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29; (122) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29; (123) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:29; (124) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequênciade aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:30; (125) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (126) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (127) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (128) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (129) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (130) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31; (131) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31; (132) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:31; (133) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequênciade aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:32; (134) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (135) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (136) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (137) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33; (138) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:33; (139) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:34; (140) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35; (141) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:35; (142) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:36; (143) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO:43; (144) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43; (145) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 43; (146) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 44; (147) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (148) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (149) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (150) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (151) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45; (152) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45; (153) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 45; (154) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 46; (155) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (156) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (157) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (158) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (159) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (160) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47; (161) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47; (162) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 47; (163) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 48; (164) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (165) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (166) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (167) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (168) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (169) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (170) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (171) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49; (172) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49; (173) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 49; (174) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 50; (175) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (176) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (177) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (178) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (179) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (180) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51; (181) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51; (182) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 51; (183) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 52; (184) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (185) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (186) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (187) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (188) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (189) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53; (190) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53; (191) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 53; (192) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 54; (193) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (194) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (195) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (196) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (197) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (198) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55; (199) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55; (200) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 55; (201) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 56; (202) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (203) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (204) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (205) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (206) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57; (207) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57; (208) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 57; (209) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 58; (210) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (211) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5130 da SEQ ID NO: 57; (212) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (213) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (214) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (215) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (216) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (217) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (218) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (219) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (220) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (221) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (222) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (223) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 95; (224) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 96; (225) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 97; (226) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 98; (227) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 99; (228) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 100; (229) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 101; (230) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 102; (231) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 103; (232) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 104; (233) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 105; (234) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 106; (235) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 108; (236) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 109; (237) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 110; (238) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 111; (239) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 112; (240) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 113; (241) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 114; (242) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 115; (243) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 116; (244) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 117; (245) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 118; (246) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 119; (247) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 120; (248) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 121; (249) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; (250) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; (251) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; (252) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-23 da SEQ ID NO: 3; (253) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1425 da SEQ ID NO: 3; (254) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3; (255) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 59; (256) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 59; (257) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 60; (258) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 59; (259) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59; (260) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 6-30 da SEQ ID NO: 59; (261) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 61; (262) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 61; (263) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 61; (264) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 62; (265) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 61; (266) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 61; (267) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61; (268) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61; (269) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 63; (270) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 63; (271) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 64; (272) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 63; (273) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 63; (274) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 63; (275) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 63; (276) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63; (277) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 65; (278) uma sequência de direcionamento compreen dendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 65; (279) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 65; (280) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 66; (281) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 107; (282) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 65; (283) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65; (284) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 67; (285) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 67; (286) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 67; (287) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 68; (288) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 67; (289) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67; (290) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 67; (291) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 69; (292) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 69; (293) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 69; (294) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 70; (295) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 69; (296) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69; (297) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 69; (298) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69; (299) uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 72; (300) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 73; (301) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO: 74; (302) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-42 da SEQ ID NO: 75; (303) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-42 da SEQ ID NO: 75; (304) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 75; (305) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 76; (306) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-42 da SEQ ID NO: 75; (307) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75; (308) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75; (309) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75; (310) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75; (311) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75; (312) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 77; (313) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 77; (314) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 77; (315) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 78; (316) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 77; (317) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77; (318) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 80; (319) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 81; (320) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 81; (321) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 81; (322) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 82; (323) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 81; (324) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; (325) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; (326) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; (327) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81; (328) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-34 da SEQ ID NO: 83; (329) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 83; (330) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 84; (331) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 86; (332) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 87; (333) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1328 da SEQ ID NO: 87; (334) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 87; (335) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 88; (336) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 87; (337) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; (338) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 87; (339) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 89; (340) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 89; (341) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 90; (342) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 89; (343) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; (344) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 89; (345) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-93 da SEQ ID NO: 91; (346) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 91; (347) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 92; (348) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-93 da SEQ ID NO: 91; (349) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91; (350) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91; (351) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 30-93 da SEQ ID NO: 91; (352) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91; (353) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91; (354) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91; (355) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1130 da SEQ ID NO: 93; (356) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 93; (357) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 94; (358) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 93; (359) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10130 da SEQ ID NO: 93; (360) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93; (361) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93; (362) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 122; (363) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 1; (364) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 1; (365) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-31 da SEQ ID NO: 1; (366) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 96; (367) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 96; (368) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 3; (369) uma sequência de direci-onamento consistindo em aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 3; (370) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 3; (371) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 97; (372) uma sequência de di-recionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (373) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 5; (374) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 5; (375) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 5; (376) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 5; (377) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 7; (378) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 7; (379) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 7; (380) uma sequência de di-recionamento consistindo em aminoácidos 16-24 da SEQ ID NO: 7; (381) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 9; (382) uma sequência de direcionamento con-sistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 9; (383) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 9; (384) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 9; (385) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 105; (386) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 105; (387) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 11; (388) uma sequência de dire-cionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 11; (389) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 11; (390) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 98; (391) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (392) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 13; (393) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 13; (394) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 13; (395) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 13; (396) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 99; (397) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 99; (398) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 15; (399) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 15; (400) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 29-41 da SEQ ID NO: 15; (401) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 31-39 da SEQ ID NO: 15; (402) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 17; (403) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 17; (404) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 100; (405) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 19; (406) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 19; (407) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 19; (408) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 19; (409) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 21; (410) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 21; (411) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 21; (412) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 21; (413) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 101; (414) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 101; (415) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 23; (416) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 23; (417) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 23; (418) uma sequência de dire-cionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 23; (419) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 102; (420) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 102; (421) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 25; (422) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 25; (423) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 25; (424) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 25; (425) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 103; (426) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 103; (427) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-28 da SEQ ID NO: 27; (428) uma sequência de dire-cionamento consistindo em aminoácidos 15-26 da SEQ ID NO: 27; (429) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 16-28 da SEQ ID NO: 27; (430) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-26 da SEQ ID NO: 27; (431) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 104; (432) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 104; (433) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 33; (434) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-11 da SEQ ID NO: 33; (435) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 3-11 da SEQ ID NO: 33; (436) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-14 da SEQ ID NO: 35; (437) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-12 da SEQ ID NO: 35; (438) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 2-14 da SEQ ID NO: 35; (439) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-27 da SEQ ID NO: 43; (440) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 43; (441) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-27 da SEQ ID NO: 43; (442) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 45; (443) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 45; (444) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 45; (445) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 106; (446) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 106; (447) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 47; (448) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 47; (449) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 53; (450) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 53; (451) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 53; (452) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 61; (453) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 61; (454) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 61; (455) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 65; (456) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 65; (457) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 65; (458) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 107; (459) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 107; (460) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 67; (461) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 67; (462) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 67; (463) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 67; (464) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2336 da SEQ ID NO: 69; (465) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 69; (466) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 69; (467) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 69; (468) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-40 da SEQ ID NO: 75; (469) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-38 da SEQ ID NO: 75; (470) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 77; (471) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 77; (472) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 77; (473) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 77; (474) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 81; (475) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 81; (476) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 81; (477) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 81; (478) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 87; (479) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 87; ou (480) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 87.
[00391] Por exemplo, a sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 50% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63%.
[00392] Por exemplo, a sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 56% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63%.
[00393] Por exemplo, a sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 50% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%.
[00394] Por exemplo, a sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 62% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%.
[00395] Por exemplo, a sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 75% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%.
[00396] Por exemplo, a sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 68% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%.
[00397] Por exemplo, a sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 75% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%.
[00398] Por exemplo, a sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 81% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%.
[00399] Por exemplo, a sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 81% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 90%.
[00400] Por exemplo, a sequência de direcionamento pode consistir em: (a) uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos, com pelo menos identidade de cerca de 43% com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos com 25 35 é, pelo menos, cerca de 54%; (b) aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (c) aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (d) SEQ ID NO: 1; (e) SEQ ID NO: 96; ou (f) a SEQ ID NO: 120.
[00401] A sequência de direcionamento pode consistir na sequência de aminoácidos tal como descritos nestes exemplos.
[00402] A proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína do exosporium ou fragmento de proteína exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 e 122.
[00403] A proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína do exosporium ou fragmento de proteína exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 e 122.
[00404] A proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína do exosporium ou fragmento de proteína exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 e 122.
[00405] A proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína do exosporium ou fragmento de proteína exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 e 122.
[00406] A proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade com SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 e 122.
[00407] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 122.
[00408] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 122.
[00409] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 122.
[00410] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 122.
[00411] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade com a SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 122.
[00412] A sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão pode compreender a sequência de aminoácidos GXT no seu terminal carboxi, em que X é qualquer aminoácido.
[00413] A sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium, podem compreender um resíduo de alanina na posição da sequência de direcionamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.
[00414] A sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium pode ainda compreender uma metionina, serina, ou resíduo de treonina na posição de aminoácidos que precede imediatamente o primeiro aminoácido da sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium ou na posição da sequência de direcionamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.
IX.PROTEÍNAS DE FUSÃO COMPREENDENDO UMA PROTEÍNA OU PEPTÍDEO DE INTERESSE E UMA PROTEÍNA DE REVESTIMENTO DE ESPORO, BACTÉRIAS FORMADORAS DE REVESTIMENTO DE ESPORO RECOMBINAN-TES, E SEMENTES REVESTIDAS COM BACTÉRIAS FORMADORAS DE REVES-TIMENTO DE ESPORO RECOMBINANTES A. Proteínas de revestimento de esporos que podem ser utilizadas para segmentar uma proteína de fusão compreendendo a proteína de revestimento de esporos a uma superfície de um esporo de uma bactéria formadora de esporos recombinante
[00415] Um certo número de proteínas de revestimento de esporos pode ser utilizado para exibir as proteínas ou peptídeos de interesse sobre uma superfície de um esporo de uma bactéria formadora de esporos recombinante. Tais bactérias incluem todas as bactérias formadoras de esporos e, em particular incluem bactérias formadoras de esporos dos gêneros Bacillus, Lysinibacillus, Virginibacillus, Clostridia, e Paenibacillus. Bactérias formadoras de esporos do gênero Bacillusin-cluem membros da família Bacillus cereus bem como outras espécies de Bacillus que não sejam membros da família Bacillus cereus (por exemplo, bactérias da espécie Bacillus que não possuem um exosporium). Estas proteínas de revestimento de esporos incluem CotB, CotC, CgeA, CotB/H, CotG, proteína de revestimento de esporos X, e CotY. Para facilidade de referência, as descrições das sequências de aminoácidos para proteínas de revestimento de esporos exemplificativas que podem ser utilizadas para o direcionamento de proteínas ou peptídeos de interesse para uma superfície de esporos de uma bactéria formadora de esporos recombinante são fornecidos na Tabela 7 a seguir, em conjunto com os seus SEQ ID NOs. TABELA7. SEQUÊNCIAS DE PROTEÍNA DE REVESTIMENTO DE ESPOROS UTI-LIZADAS PARA O DIRECIONAMENTO DE PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS DE INTERESSE PARA UMA SUPERFÍCIE DE ESPOROS DE UMA BACTÉRIA FORMADORA DE ESPOROS RECOMBINANTE
B. As proteínas de fusão que compreendem uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos
[00416] A presente invenção também diz respeito a proteínas de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos, em que a proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína CotB/H, a uma proteína X proteína esporo, ou uma proteína CotY, em que a proteína CotY compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No: 258 ou 259.
[00417] Por exemplo, a proteína de revestimento de esporos pode compreender uma proteína CotB/H.
[00418] Por exemplo, a proteína de revestimento de esporos pode compreender uma proteína X proteína de esporos.
[00419] Por exemplo, a proteína de revestimento de esporos pode compreender uma proteína CotY, em que a proteína CotY compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identi-dade com a SEQ ID NO: 258 ou 259.
[00420] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 255, 257, 258, ou 259.
[00421] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 255, 257, 258, ou 259.
[00422] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 255, 257, 258, ou 259.
[00423] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 255, 257, 258, ou 259.
[00424] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 255, 257, 258, ou 259.
[00425] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade com a SEQ ID NO: 255, 257, 258, ou 259.
C. Bactérias formadoras de revestimento de esporos recombinantes que expressam proteínas de fusão e sementes de plantas revestidas com bactérias formadoras de revestimento de esporos recombinantes
[00426] Bactérias formadoras de esporos recombinantes que expressam qualquer uma das proteínas de fusão descritas na Seção IX.B são fornecidas. As bactérias formadoras de esporos recombinantes podem compreender uma cepa de bactérias endofíticas, uma cepa de bactérias promotora do crescimento de plantas, ou uma cepa de bactérias que é tanto endofítica e de promoção do crescimento de plantas.
[00427] A presente invenção se refere ainda a uma bactéria formadora de esporos recombinante que expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direciona a proteína de fusão à superfície de um esporo da bactéria, em que a proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína CotB, uma proteína CotC, uma proteína CgeA, uma proteína CotB/H, uma proteína CotG, uma proteína de revestimento de esporos X proteína, ou uma proteína CotY; e em que a bactéria formadora de esporos recombinante compreende uma cepa de bactérias endofítica, uma cepa de bactérias promotora do crescimento de plantas, ou de uma cepa de bactérias que é tanto endofítica e de promoção do crescimento de plantas.
[00428] Expressão da proteína de fusão numa cepa de bactérias endofítica permite a distribuição da proteína ou do peptídeo de interesse internamente para uma planta. As cepas endofíticas pode ser distribuída para as plantas, utilizando vários métodos, por exemplo, as ce-pasendofíticas podem ser distribuídas através de tratamento de se-mentes, tratamento do meio de crescimento da planta (por exemplo, do solo), de rega, aplicação à própria planta (por exemplo, aplicação foliar às porções aéreas de uma planta). Uma vez no interior da planta, as bactérias multiplicam-se e colonizam os tecidos internos da planta.
[00429] A presente invenção se refere também a sementes vegetais revestidas com uma bactéria formadora de esporos recombinante, em que a bactéria formadora de esporos recombinante expressa uma pro-teína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direciona a proteína de fusão à superfície de um esporo da bactéria, em que a proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína CotB, uma proteína CotC, uma proteína CgeA, uma proteína CotB/H, a uma proteína CotG, uma proteína X proteína esporo, ou uma proteína cotY.
[00430] A bactéria formadora de revestimento de esporos recombinante pode compreender uma bactéria do gênero Bacillus ou Lysinibacillus.
[00431] A presente invenção se refere ainda a uma bactéria recombinante do gênero Bacillus, em que a bactéria recombinante compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante e em que a bactéria formadora de esporos recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direciona a proteína de fusão à superfície de um esporo da bactéria, em que a proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína CotB, uma proteína CotC, uma proteína CgeA, uma proteína CotB/H, a uma proteína Cot G, uma proteína de revestimento de esporos X proteína, ou uma proteína CotY. A bactéria formadora de revestimento de esporos recombinante expressa uma protease ou uma nuclease, em que a expressão da protease ou a nuclease é aumentada em comparação com a expressão da protease ou a nuclease de um tipo selvagem de bactéria do gênero Bacillus sob as mesmas condições, e em que o aumento da expressão da protease ou a nuclease parcialmente ou completamente inativa os esporos da bactéria recombinante do gênero Bacillus ou torna esporos da bactéria recombinante do gênero Bacillus mais suscetíveis à inativação química ou física. A protease ou nuclease pode ser qualquer uma das proteases ou nucleases descritas acima na Seção V.A, e pode ser expressa sob o controle de qualquer um dos promotores descritos acima na Seção V.A. A invenção se refere a plantar sementes revestidas com tais bactérias formadoras de esporos. As bactérias recombinantes podem compreender uma cepa de bactérias endofíticas, uma cepa de bactérias promotora do crescimento de plantas, ou uma cepa de bactérias que é tanto endofítica e promotora do crescimento de plantas.
[00432] Em qualquer das sementes vegetais descritas nesta Seção, as bactérias formadoras de esporos recombinantes podem compreender uma cepa de bactérias endofíticas, uma cepa de bactérias promotora do crescimento de plantas, ou uma cepa de bactérias que é tanto endofítica e de promoção do crescimento de plantas.
[00433] Em qualquer uma das bactérias formadoras de esporos recombinantes ou sementes, a cepa de bactérias endofíticas, a cepa de bactérias de promoção do crescimento de plantas, ou a cepa de bactérias que é tanto endofítica e de promoção do crescimento da planta pode compreender Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, ou Lysinibacillus sphaericus EE443, Bacillus pumilus EE-B00143, Bacillus subtilis EE148, Bacillus subtilis EE218, ou Bacillus megaterium EE281. Por exemplo, a cepa de bactérias endofíticas pode compreender Bacillus subtilis EE405 ou Bacillus megaterium EE385.
[00434] Alternativamente, a cepa de endofíticos, a cepa de bactérias de promoção do crescimento de plantas, ou a cepa de bactérias que é tanto endofítica e de bactérias promotora do crescimento de plantas podem compreender membro da família Bacillus cereus EE349, membro da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, ou Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, membro da família Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, Bacillus mycoides EE-B00363, Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoides BT46-3, membro da família Bacillus cereus EE128, Bacillus thuringiensis BT013A, ou membro da família Bacillus cereus EE349.
[00435] Em qualquer uma das bactérias ou sementes formadoras de esporos recombinantes, a proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 252-259.
[00436] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 252-259.
[00437] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 252-259.
[00438] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 252-259.
[00439] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 252-259.
[00440] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 252-259.
[00441] Uma bactéria formadora de esporos recombinante que expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína que direciona a proteína de fusão à superfície de um esporo da bactéria também é fornecido. A bactéria formadora de esporos recombinante não é um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína que direciona a proteína de fusão à superfície de um esporo da bactéria compreende os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120, ou SEQ ID NO: 121.
[00442] A proteína que direciona a proteína de fusão da superfície de um esporo da bactéria pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120, ou SEQ ID NO: 121.
[00443] A proteína que direciona a proteína de fusão da superfície de um esporo da bactéria pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120, ou SEQ ID NO: 121.
[00444] A proteína que direciona a proteína de fusão da superfície de um esporo da bactéria pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120, ou SEQ ID NO: 121.
[00445] A proteína que direciona a proteína de fusão da superfície de um esporo da bactéria pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120, ou SEQ ID NO: 121.
[00446] A proteína que direciona a proteína de fusão da superfície de um esporo da bactéria pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade com a SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120, ou SEQ ID NO: 121.
[00447] Por exemplo, a proteína que direciona a proteína de fusão a uma superfície de um esporo da bactéria pode compreender os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 120 ou SEQ ID NO: 121.
[00448] As bactérias formadoras de esporos recombinantes com-preendem uma cepa de bactérias endofíticas, uma cepa de bactérias promotora do crescimento de plantas, ou uma cepa de bactérias que é tanto endofítica e de promoção do crescimento de plantas. Por exemplo, a cepa de bactérias endofíticas, a cepa de bactéria de promoção do crescimento de plantas, ou a cepa de bactérias que é tanto endofítica quanto de promoção do crescimento de plantas compreende Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, ou Lysinibacillus sphaericus EE443, Bacillus pumilus EE-B00143, Bacillus subtilis EE148, Bacillus subtilis EE218, ou Bacillus megaterium EE281. A cepa de bactérias endofíticas compreende, de preferência Bacillus sp. EE387.
X .MÉTODOS PARA FAZER AS PROTEÍNAS DE FUSÃO
[00449] Qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas pode ser feita usando clonagem standard e métodos de biologia molecular conhecidos na técnica. Por exemplo, um gene que codifica uma proteína ou peptídeo de interesse (por exemplo, um gene que codifica uma proteína ou peptídeo de estimulação do crescimento de planta) pode ser amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) e ligado a DNA que codifica para qualquer uma das sequências de direcionamento acima descritas, proteínas do exosporium, fragmentos de proteínas do exosporium, proteínas de revestimento ou de esporos, de modo a formar uma molécula de DNA que codifica a proteína de fusão. A molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser clonada em qualquer vetor adequado, por exemplo um vetor plasmídico. O vetor compreende, adequadamente, um local de clonagem múltipla em que a molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser facilmente inserida. O vetor também contém adequadamente um marcadorselecionável, tal como um gene de resistência aos antibióticos, de tal modo que as bactérias transformadas, transfectadas, ou acopladas com o vetor podem ser prontamente identificadas e isoladas. Quando o vetor é um plasmídeo, o plasmídeo adequadamente também compreende uma origem de replicação. Alternativamente, DNA que codifica para a proteína de fusão pode ser integrado no DNA cromossômico do membro da família Bacillus cereus recombinante ou hospedeiro de bactéria formadora de esporos.
XI .ETIQUETAS, MARCADORES, E LIGANTES QUE PODEM SER INCLUÍDOS EM PROTEÍNAS DE FUSÃO
[00450] Qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas podem também compreender sequências polipeptídicas adicionais que não fazem parte da sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína do exosporium, ou a proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento da planta, a proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta, a planta ou a proteína ou peptídeo de ligação. Por exemplo, a proteína de fusão pode incluir etiquetas ou marcadores para facilitar a purificação ou a vi-sualização da proteína de fusão (por exemplo, uma etiqueta de polihistidina ou uma proteína fluorescente tal como GFP ou YFP) ou a vi-sualização de esporos membro da família Bacillus cereus recombinante que expressam a proteína de fusão.
[00451] Expressão de proteínas de fusão no exosporium de um membro da família Bacillus cereus ou sobre uma superfície de um esporo de uma bactéria formadora de esporos utilizando as sequências de direcionamento, proteínas do exosporium, fragmentos de proteína do exosporium, e revestimento de esporos aqui descritos é melhorado devido a uma falta de estrutura secundária nos amino-terminais destas sequências, o que permite a dobragem nativa das proteínas fundidas e a retenção de atividade. Dobragem correta pode ser adicionalmente aumentada pela inclusão de um ligante de aminoácidos curto entre a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium, proteína de revestimento de esporos, e a proteína ou peptídeo de interesse.
[00452] Assim, qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas pode compreender um ligante de aminoácidos entre a sequência de direcionamento, a proteína do exosporium, o fragmento de proteína do exosporium, ou a proteína de revestimento de esporos e a proteína ou peptídeo de interesse.
[00453] O ligante pode compreender um ligante polialanina ou um ligante poliglicina. Um ligante que compreende uma mistura de ambos alanina e resíduos de glicina pode também ser usado.
[00454] Por exemplo, numa proteína de fusão, onde a sequência de direcionamento compreende a SEQ ID NO: 1, uma proteína de fusão pode ter uma das seguintes estruturas: Nenhuma ligante: SEQ ID NO: 1 POI Ligante Alanina: SEQ ID NO: 1-An-POI Ligante Glicina: SEQ ID NO: 1-Gn-POI Ligantes Alanina e Glicina Misturados: 1 (A/G)n POI onde An, Gn, e (A/G)n são qualquer número de alaninas, qualquer número de glicinas, ou qualquer número de uma mistura de alaninas e glicinas, respectivamente. Por exemplo, n pode ser 1 a 25, e é, de preferência 6 a 10. Onde o ligante compreende uma mistura de resíduos de alanina e glicina, qualquer combinação de resíduos de glicina e de alanina pode ser utilizada. Nas estruturas acima, "POI" representa a proteína ou peptídeo de interesse.
[00455] Em alternativa, ou além disso, o ligante pode compreender um local de reconhecimento para proteases. A inclusão de um local de reconhecimento de protease permite a remoção alvo, após exposição a uma protease que reconheça o local de reconhecimento de protease, da proteína ou do peptídeo de interesse.
XII .PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS DE INTERESSE
[00456] A proteína ou peptídeo de interesse pode compreender qualquer proteína ou peptídeo.
[00457] A proteína ou peptídeo de interesse nas proteínas de fusão aqui descritas podem compreender, por exemplo: (a) uma proteína ou peptídeo de estimulação do crescimento da planta; (b) uma proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico; (c) uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta; (d) uma proteína ou peptídeo de ligação a planta; (e) uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico; (f) uma proteína ou um peptídeo de ligação de ácido nucleico; ou (g) uma molécula de sinalização da planta ou uma proteína ou peptídeo que altera a composição de uma planta; (h) um antígeno; (i) uma enzima de reparação; (j) uma enzima adequada para a quebra de uma emulsão de gel ou em um fluido de fratura hidráulica; ou (k) uma proteína ou um peptídeo antibacteriano.
A. Proteínas ou peptídeos de estimulação de crescimento das plantas
[00458] A proteína ou peptídeo de interesse pode compreender uma proteína ou peptídeo de estimulação do crescimento de plantas.
[00459] A proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento da planta pode compreender um hormônio peptídico, de um peptídeo não hormonal, uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento da planta, ou uma enzima que degrada ou altera uma fonte bacteriana, fúngica, ou de nutrientes de plantas.
[00460] Por exemplo, a proteína estimuladora do crescimento de plantas ou o peptídeo pode compreender um hormônio peptídico.
[00461] O hormônio peptídico pode compreender um fitosulfoquina (por exemplo, fitosulfoquina-α), clavata 3 (CLV3), sistemina, ZmlGF, ou um SCR/SP11.
[00462] A proteína ou peptídeo estimuladora do crescimento de plantas pode compreender um peptídeo não hormonal.
[00463] O peptídeo não hormonal pode compreender uma RKN 16D10, Hg-Syv46, um peptíDEO eNOD40, melitina, mastoparano, Mas7, RHPP, POLARIS, ou inibidor de tripsina kunitz (KTI).
[00464] A proteína estimuladora do crescimento de plantas ou o peptídeo pode compreender uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação do crescimento das plantas. A enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de planta pode ser qualquer enzima que catalisa qualquer etapa de uma via de síntese biológica de um composto que estimula o crescimento de planta ou altera a estrutura da planta, ou qualquer enzima que catalisa a conversão de uma forma inativa ou derivado menos ativo de um composto que estimula o crescimento de planta ou altera estrutura de planta de uma forma ativa ou mais ativa do composto.
[00465] O composto de estimulação do crescimento das plantas pode compreender um composto produzido por bactérias ou fungos na rizosfera, por exemplo, 2,3-butanodiol.
[00466] Alternativamente, o composto de estimulação do crescimento das plantas pode compreender um hormônio de crescimento das plantas.
[00467] O hormônio do crescimento da planta pode compreender uma citocinina ou um derivado de citocinina, etileno, uma auxina ou um derivado de auxina, um ácido giberélico ou um derivado de ácido giberélico, ácido abscísico ou um derivado de ácido abscísico, ou um ácido jasmônico ou um derivado de ácido jasmônico.
[00468] Quando o composto de estimulação do crescimento da planta compreende uma citocinina ou um derivado de citocinina, a citocinina ou o derivado de citoquinina pode compreender cinetina, zeatina-cis, trans-zeatina, 6-benzilaminopurina, dihidroxizeatina, N6(D2isopentenil) adenina, ribosilzeatina, N6 (D2-isopentenil) adenosina, 2metiltio-cis-ribosilzeatina, cis-ribosilzeatina, trans-ribosilzeatina, 2metiltio-trans-ribosilzeatina, ribosilzeatina-5-monosfosfato, N6metilaminopurina, N6-dimetilaminopurina, 2'-deoxizeatina ribósido, 4hidroxi-3-metil-trans-2-butenilaminopurina, orto-topolina, meta-topolina, benziladenina, orto-metiltopolina, meta-metiltopolina, ou uma combinação dos mesmos.
[00469] Quando o composto de estimulação de crescimento da planta compreende uma auxina ou um derivado de auxina, auxina ou o derivado de auxina podem compreender uma auxina ativa, uma auxina inativa, um conjugado de auxina, uma auxina que ocorre naturalmente, ou uma auxina sintética, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, a auxina ou derivado de auxina pode compreender indol-3-acético, indol-3-pirúvico, ácido indol-3-acetaldoxima, indol-3-acetamida, indol3-acetonitril, indol-3-etanol, indol 3-piruvato, indol-3-acetaldoxima, áci-doindol-3-butírico, um ácido fenilacético, ácido 4-cloroindol-3-acético, uma auxina glicose-conjugado, ou uma combinação dos mesmos.
[00470] A enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação do crescimento da planta pode compreender uma acetoína redutase, uma hidrolase indol-3-acetamida, um monooxigenase de triptofano, uma sintetase de acetolactato, uma descarboxilase α-acetolactato, um piruvato descarboxilase, uma redutase de diacetil, um butanodiol desidrogenase, um aminotransferase (por exemplo, aminotransferase triptofano), um descarboxilase de triptofano, uma oxidase de amina, um descarboxilase indol-3-piruvato, uma desidrogenase indol-3-acetaldeído, uma oxidase de cadeia lateral de triptofano, uma hidrolase de nitril, uma nitrilase, uma peptidase, uma protease, uma isopenteniltransferase fosfato de adenosina, uma fosfatase, uma cinase de adenosina, um adenina fosforibosiltransferase, CYP735A, uma fosfohidrolase 5'ribonucleotídeo, uma nucleosidase adenosina, uma isomerase de cis-trans zeatina, zeatina um oglicosiltransferase, um β-glicosidase, um cis-hidroxilase, uma CK cishidroxilase, uma CK N-glicosiltransferase, um fosfohidrolase 2,5ribonucleotídeo, um nucleosidase adenosina, um nucleosídeo de purina fosforilase, uma redutase de zeatina, uma redutase de hidroxilamina, um 2-oxoglutarato dioxigenase, um giberélico 2B/3B hidrolase, uma giberelina 3-oxidase, uma giberelina 20-oxidase, quitosanase, quitinase, um β-1,3-glucanase, um β-1,4-glucanase, um β-1,6glucanase, uma desaminase de ácido aminociclopropano-1-carboxílico, ou uma enzima envolvida na produção de um fator nod (por exemplo, nodA, nodB, ou nodl).
[00471] Onde a enzima compreende uma protease ou peptidase, protease ou peptidase pode ser uma protease ou peptidase que cliva proteínas, peptídeos, pro-proteínas ou preproproteínas para criar um peptídeo bioativo. O peptídeo bioativo pode ser qualquer peptídeo que exerce uma atividade biológica.
[00472] Exemplos de peptídeos bioativos incluem RKN 16D10 e RHPP.
[00473] A protease ou peptidase que clivam proteínas, peptídeos, pro-proteínas ou preproproteínas para criar um peptídeo bioativo pode compreender subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma proteinase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, termolisina, papaina, pepsina, a tripsina, a pronase, a carboxilase, uma protease serina, uma protease glutâmico, uma protease de aspartato, uma protease de cisteína, treonina uma protease, ou uma metaloprotease.
[00474] A protease ou peptidase pode clivar proteínas em uma refeição rica em proteínas (por exemplo, farelo de soja ou extrato de levedura).
[00475] Onde a enzima compreende uma quitosanase, o quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 313.
[00476] A chitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 313.
[00477] A chitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 313.
[00478] A chitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 313.
[00479] A chitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 313.
[00480] A chitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade com a SEQ ID NO: 313.
[00481] Por exemplo, a proteína de fusão pode compreender os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1) como a sequência de direcionamento e uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO: 313 como a enzima que é específica para um componente celular de uma bactéria ou um fungo. A proteína de fusão pode ainda compreender um ligante (por exemplo, um ligante polialanina) entre a sequência de direcionamento e a enzima.
[00482] A proteína ou peptídeo de estimulação do crescimento de plantas pode compreender uma enzima que degrada ou altera uma fonte fúngica, bacteriana ou de nutrientes da planta.
[00483] A enzima que degrada ou altera uma fonte fúngica, bacteriana ou de nutrientes de plantas pode compreender uma celulase, uma lipase, uma oxidase de lignina, uma protease, uma beta-glicosidases, uma fosfatase, um nitrogenase, uma nuclease, uma amidase, uma redutase de nitrato, um nitrito redutase, uma amilase, uma oxidase de amoníaco, um ligninase, uma glicosidase, uma fosfolipase, uma fitase, uma pectinase, uma glucanase, uma sulfatase, uma urease, uma xilanase, ou um sideróforo.
[00484] Quando introduzido num meio de crescimento da planta ou aplicados a uma planta, semente, ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta, proteínas de fusão compreendendo enzimas que degradam ou modificam uma fonte bacteriana, fúngica, ou de nutrientes de plantas podem auxiliar no processamento de nutrientes na proximidade da instalação e resultar num aumento da absorção de nutrientes pela planta ou por bactérias ou fungos benéficos na vizinhança da planta.
[00485] A enzima que degrada ou altera uma fonte bacteriana, fúngica, ou de nutrientes de plantas pode compreender uma celulase.
[00486] A celulase pode compreender uma endocelulase (por exemplo, uma endoglucanase, tais como um Bacillus subtilis endoglucanase, uma Bacillus thuringiensis endoglucanase, uma Bacillus cereus endoglucanase, ou um Bacillus clausii endoglucanase), exocelulase um (por exemplo, uma Trichoderma reesei exocelulase), ou um βglucosidase (por exemplo, uma Bacillus subtilis β-glucosidase, uma Bacillus thuringiensis β-glucosidase, uma Bacillus cereus βglicosidase, ou um Bacillus clausii β-glucosidase). A celulase compreende de preferência um Bacillus subtilis endoglucanase.
[00487] A endoglucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 311.
[00488] A endoglucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 311.
[00489] A endoglucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 311.
[00490] A endoglucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 311.
[00491] A endoglucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 311.
[00492] A endoglucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade com a SEQ ID NO: 311.
[00493] Por exemplo, a proteína de fusão pode compreender os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1) como a sequência de direcionamento e uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO: 311 como a enzima que degrada ou altera a fonte bacteriana, fúngica, ou de nutrientes de plantas. A proteína de fusão pode ainda compreender um ligante (por exemplo, um ligante polialanina) entre a sequência de direcionamento e a enzima.
[00494] A enzima que degrada ou altera uma fonte bacteriana, fúngica, ou de nutrientes de plantas pode compreender uma lipase (por exemplo, uma Bacillus subtilis lipase, uma Bacillus thuringiensis lipase, uma Bacillus cereus lipase, ou uma Bacillus clausii lipase).
[00495] A enzima que degrada ou altera uma fonte bacteriana, fúngica, ou de nutrientes de plantas pode compreender uma oxidase de lignina. Por exemplo, a oxidase de lignina pode compreender uma peroxidase de lignina, uma lacase, uma oxidase de glioxal, um ligninase, ou uma peroxidase de manganês.
[00496] A enzima que degrada ou altera uma fonte bacteriana, fúngica, ou de nutrientes de plantas pode compreender uma protease. Por exemplo, a protease pode compreender uma subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma proteinase, uma peptidase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, uma termolisina, uma papaína, uma pepsina, uma tripsina, uma pronase, uma carboxilase, uma serina protease, uma protease glutâmica, uma protease de aspartato, uma protease de cisteína, treonina uma protease, ou uma metaloprotease.
[00497] A enzima que degrada ou altera uma fonte bacteriana, fúngica, ou de nutrientes de plantas pode compreender uma fosfatase. Por exemplo, a fosfatase pode compreender uma hidrolase fosfórica monoéster, uma fosfomonoesterase (por exemplo, PhoA4), uma hidrolase diéster fosfórica, uma fosfodiesterase, uma hidrolase monoéster trifosfórica, uma hidrolase anidrido de fosforil, uma pirofosfatase, uma fitase (por exemplo, uma Bacillus subtilis fitase ou um EE148 Bacillus thuringiensis BT013A fitase), um trimetafosfatase, ou uma trifosfatase.
[00498] A enzima que degrada ou altera uma fonte bacteriana, fúngica, ou de nutrientes de plantas pode compreender uma nitrogenase. Por exemplo, a nitrogenase pode compreender uma nitrogenase de família Nif (por exemplo, Paenibacillus massiliensis NifBDEHKNXV).
[00499] A enzima que degrada ou altera uma fonte bacteriana, fúngica, ou de nutrientes de plantas pode compreender uma fosfolipase. Por exemplo, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase A1, uma fosfolipase A2, uma fosfolipase C, uma fosfolipase D, ou uma lisofosfolipase. A fosfolipase compreende de preferência uma fosfolipase C.
[00500] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 312.
[00501] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 312.
[00502] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 312.
[00503] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 312.
[00504] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 312.
[00505] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade com a SEQ ID NO: 312.
[00506] Por exemplo, a proteína de fusão pode compreender os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1) como a sequência de direcionamento e uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO: 312 como a enzima que degrada ou altera a fonte bacteriana, fúngica, ou de nutrientes de plantas. A proteína de fusão pode ainda compreender um ligante (por exemplo, um ligante polialanina) entre a sequência de direcionamento e a enzima.
B. As proteínas ou peptídeos que protegem as plantas de agentes patogênicos
[00507] A proteína ou peptídeo de interesse pode compreender uma proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico.
[00508] A proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico pode compreender uma proteína ou peptídeo intensificadora de sistema imune de planta.
[00509] Por exemplo, a proteína ou peptídeo intensificadora de sistema imune de planta pode compreender um grampo de cabelo, uma proteína semelhante a grampo de cabelo, uma α-elastina, uma βelastina, uma sistemina, uma fenilalanina amônia-liase, uma elicitina, uma defensina, uma criptogeína, uma proteína flagelina, ou um peptídeo flagelina (por exemplo, flg22).
[00510] A proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico pode ser uma proteína ou peptídeo que possui atividade antibacteriana, atividade anti-fúngica, ou ambas as atividades antibacteriana e antifúngica. Exemplos de tais proteínas e peptídeos incluem bacteriocinas, lisozimas, peptídeos lisozima (por exemplo, LysM), sideróforos, avidinas, estreptavidinas, peptídeos ativos não ribossomais, conalbuminas, albuminas, lactoferrinas, peptídeos lactoferrina (por exemplo, LfcinB), e TasA.
[00511] A proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico pode ser uma proteína ou um peptídeo que tem atividade inseticida, a atividade helmíntica, suprime predação de insetos ou vermes, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, a proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico pode compreender uma toxina inseticida bacteriana (por exemplo, uma proteína inseticida VIP), uma endotoxina, uma toxina Cry (por exemplo, uma toxina Cry da Bacillus thuringiensis), uma proteína ou peptídeo inibidor de protease (por exemplo, um inibidor de tripsina ou um inibidor de protease de ponta de seta), uma protease de cisteína, ou uma quitinase. Quando a toxina Cry compreende uma toxina Cry da Bacillus thuringiensis, a toxina Cry pode ser uma proteína ou uma proteína Cry5B Cry21A. Cry5B e Cry21A têm ambos atividade inseticida e nematocida.
[00512] A proteína que protege uma planta a partir de um agente patogênico pode compreender uma enzima. Por exemplo, a enzima pode compreender uma protease ou uma lactonase. As proteases e lactonases podem ser específicas para uma molécula de sinalização bacteriana (por exemplo, uma molécula de sinalização bacteriana homoserina lactona).
[00513] Onde a enzima compreende uma lactonase, a lactonase pode compreender 1,4-lactonase, lactonase 2-pirona-4,6-dicarboxilato de dimetil, 3-enol-oxoadipato lactonase, actinomicina lactonase, desoxilimonato anel-A-lactonase, gluconolactonase L-rhamnono1,4lactonase, limonina-D-anel-lactonase, esteróide-lactonase, triacetatolactonase, ou xilono-1,4-lactonase.
[00514] A enzima pode compreender uma enzima que é específica para um componente celular de uma bactéria ou um fungo. Por exemplo, a enzima pode compreender uma β-1,3-glucanase, uma β-1,4glucanase, uma β-1,6-glucanase, uma quitosanase, quitinase, uma enzima semelhante a quitosanase, uma liticase, uma peptidase, uma proteinase, uma protease (por exemplo, uma protease alcalina, uma protease ácida, neutra ou uma protease), uma mutanolisina, uma stapholysin, ou uma lisozima.
[00515] Onde a enzima compreende uma quitosanase, o quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 313.
[00516] A chitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 313.
[00517] A chitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 313.
[00518] A chitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 313.
[00519] A chitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 313.
[00520] A chitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade com a SEQ ID NO: 313.
[00521] Por exemplo, a proteína de fusão pode compreender os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1) como a sequência de direcionamento e uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO: 313 como a enzima que é específica para um componente celular de uma bactéria ou um fungo. A proteína de fusão pode ainda compreender um ligante (por exemplo, um ligante polialanina) entre a sequência de direcionamento e a enzima.
[00522] Para qualquer uma das proteínas ou peptídeos acima que protegem uma planta a partir de um agente patogênico, o agente pa-togênico pode compreender uma proteína ou um peptídeo de interesse que protege uma planta a partir de um agente patogênico bacteriano, um agente patogênico fúngico, um agente patogênico de vermes, ou um agente patogênico de insetos.
[00523] Por exemplo, o agente patogênico bacteriano pode compreender uma Proteobactéria α-classe, uma Proteobactéria β-classe, uma Proteobactéria Y-classe, ou uma combinação destas; ou em que o agente patogênico bacteriano compreende Agrobacterium tumefaciens, Pantoea stewartii, carotovora Erwinia, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Pseudomonas aeruginosa, Xanthomonas campestris, ou uma combinação dos mesmos.
[00524] A proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico pode compreender uma proteína ou peptídeo protege a planta de predação por um verme ou um inseto patogênico.
[00525] O verme ou inseto patogênico pode compreender uma lagarta, uma lagarta-rosca, uma traça europeia do milho, a lagarta do cartucho, uma lagarta, um besouro japonês, uma lagarta elasmo, um besouro da raiz do milho, um díptero caliptrado, uma lagarta que tece teias, broca do pé de milho do sul, uma broca do colmo do milho do sul, uma conoderus falli, a broca de espiga, um besouro da cana, uma larva branca, a trichoplusia ni, um bicudo-do-algodoeiro, uma lagarta listrada amarela, um besouro de folha do cereal, um percevejo, um afídeo, uma lagarta da beterraba, um besouro de feijão mexicano, uma lagarta falsa-medideira, dectes texanus, ou uma combinação dos mesmos.
C. As proteínas ou peptídeos que aumentem a resistência ao stress em plantas
[00526] A proteína ou peptídeo de interesse pode compreender uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta.
[00527] Por exemplo, a proteína ou peptídeo que aumenta a resis tência ao stress de uma planta pode compreender uma enzima que degrada um composto relacionado com o stress. Compostos relacio-nados com o stress incluem, mas não estão limitados a, ácido aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico, oxilipinas e fenólicos. Espécies reativas de oxigênio específicas incluem hidroxil, o peróxido de hidrogênio, oxigênio e superóxido.
[00528] A enzima que degrada um composto relacionado com o stress pode compreender uma superóxido-dismutase, uma oxidase, catalase, uma desaminase de ácido aminociclopropano-1-carboxílico, uma peroxidase, uma enzima antioxidante, ou um peptídeo antioxidante.
[00529] Quando a enzima que degrada um composto relacionado com o stress compreende uma superóxido-dismutase, a superóxidodismutase pode compreender superóxido dismutase 1 (SODA1) ou superóxido dismutase 2 (SODA2).
[00530] Asuperóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85 % de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00531] Asuperóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90 % de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00532] Asuperóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95 % de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00533] Asuperóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00534] Asuperóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00535] Asuperóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00536] A proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta pode compreender uma proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de uma tensão ambiental. O stress ambiental pode compreender, por exemplo, seca, cheias, calor, congelamento, sal, metais pesadOS, pH baiXO, pH alto, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, a proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um stress ambiental pode compreender uma proteína de nucleação de gelo, uma prolinase, uma liase fenilalanina amônia, uma sintase isochorismate, uma liase isochorismate piruvato, ou uma desidrogenase de colina.
D. Proteínas ou peptídeos de ligação a planta
[00537] A proteína ou peptídeo de interesse pode compreender uma proteína ou peptídeo de ligação a planta. A proteína de ligação a planta ou peptídeo pode ser qualquer proteína ou peptídeo que é capaz de especificamente ou não especificamente ligar a qualquer parte de uma planta (por exemplo, uma raiz da planta ou uma parte aérea de tal planta como uma folha, caule, flor ou frutas) ou matéria de planta. Assim, por exemplo, a proteína de ligação a planta ou o peptídeo pode ser uma proteína ou peptídeo de ligação de raiz, ou uma proteína de ligação da folha ou peptídeo.
[00538] Proteínas e peptídeos de ligação a planta adequados incluem adesinas (por exemplo, rhicadhesina), flagelinas, omptinas, lectinas, expansinas, proteínas estruturais de biofilme (por exemplo, TasA ou YuaB) proteínas de pelos, proteínas curlus, intiminas, invasinas aglutininas e proteínas afimbriais.
E. As enzimas que catalisam a produção de óxido nítrico
[00539] Muitas espécies de plantas não têm inerentemente uma alta taxa de germinação. Para tais plantas, seria desejável aumentar a velocidade de germinação. O óxido nítrico é um poderoso germinativo que, quando presente na proximidade de uma semente de planta, au-menta a germinação.
[00540] A presente invenção se refere a proteínas de fusão que compreendem qualquer das sequências de direcionamento, proteínas do exosporium, fragmentos de proteínas do exosporium, ou proteínas de revestimento de esporos aqui descritos e uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico sintase. Assim, a proteína ou peptídeo de interesse pode compreender uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico. As proteínas de fusão que compreendem uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico pode ser expressa em membros da família Bacillus cereus recombinante ou de bactérias formadoras de esporos recombinantes para a finalidade de fornecer a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico a uma semente de planta, uma planta, um meio de crescimento de plantas, ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente da planta, e assim, estimulando a germinação.
[00541] Por exemplo, a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico pode compreender uma sintase de óxido nítrico (por exemplo, uma Bacillus thuringiensis da sintase do óxido nítrico ou um Bacillus subtilisóxido nítrico sintase, por exemplo um óxido nítrico sintase a partir de Bacillus thuringiensis BT013A ou Bacillus subtilis 168) ou um arginase.
[00542] Por exemplo, o óxido nítrico sintase podem compreender uma das sequências de aminoácidos descritas na Tabela 8 abaixo. TABELA 8. SEQUÊNCIAS DE ÓXIDO NÍTRICO SINTASE EXEMPLIFICATIVAS
[00543] A sintase do óxido nítrico também pode compreender uma sequência que tem um elevado grau de identidade de sequência com as sequências de sintase de óxido nítrico mostradas na Tabela 8 acima. Por exemplo, a sintase de óxido nítrico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00544] A sintase de óxido nítrico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00545] A sintase de óxido nítrico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00546] A sintase de óxido nítrico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00547] A sintase de óxido nítrico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00548] A sintase de óxido nítrico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00549] Quando a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma sintase de óxido nítrico, a proteína de fusão pode compreender uma das sequências de aminoácidos apresentadas na Tabela 9 abaixo. Nas sequências mostradas na Tabela 9 abaixo, a sequência de direcionamento é mostrada no texto em negrito, um ligante de seis amino ácido alanina é indicado a sublinhado e a sequência da sintase de óxido nítrico é mostrada em texto simples. Assim, a proteína de fusão pode compreender SEQ ID NO: 262 ou 263. TABELA 9. EXEMPLOS DE PROTEÍNAS DE FUSÃO COMPREENDENDO UMA SINTASE DE ÓXIDO NÍTRICO
[00550] Sintases de óxido nítrico a partir de um número de espécies, incluindo Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis e Bacillus mycoides podem ser usadas como a proteína ou peptídeo de interesse nas proteínas de fusão.
F. Proteínas e peptídeos de ligação de ácido nucleico
[00551] A distribuição de ácidos nucleicos para as plantas no campo seria desejável, mas tem sido dificultada pela instabilidade dos ácidos nucleicos, que se degradam rapidamente quando introduzidos no ambiente (por exemplo, em um meio de crescimento de plantas tal como o solo).
[00552] A presente invenção se refere a proteínas de fusão que compreendem qualquer das sequências de direcionamento, proteínas do exosporium, fragmentos de proteínas do exosporium, ou proteínas de revestimento de esporos aqui descritas e uma proteína ou peptídeo de ligação de ácido nucleico. Tais proteínas de fusão estabilizam os ácidos nucleicos e podem ser utilizadas para distribuir ácidos nucleicos para o solo e/ou às plantas.
[00553] Assim, a proteína ou peptídeo de interesse pode compreender uma proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico. Por exemplo, a proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico pode compreender uma proteína ou um peptídeo de ligação a RNA ou uma proteína ou peptídeo de ligação a DNA.
[00554] A proteína ou peptídeo de ligação a RNA pode compreender uma proteína ou peptídeo não específica de ligação a RNA ou uma proteína ou peptídeo específica de ligação a RNA.
[00555] Por exemplo, o peptídeo de ligação ao RNA pode compreender uma proteína Hfq (por exemplo, uma proteína Bacillus thuringiensis Hqf).
[00556] A proteína ou peptídeo de ligação ao DNA pode compreender uma pequena proteína de esporos solúvel em ácido (SASP). Por exemplo, a SASP pode compreender uma SASP codificada por um gene SspA, um gene SspB, um gene de SspC, um gene SspD, um gene SspE, um gene SspF, um gene SspG, um gene SspH, um gene SspI, um gene Sspj, um gene SspK, um gene SspL, um gene SspM, um gene SspN, um gene SspO, ou um gene SspP. Por exemplo, a SASP pode compreender um SASPα, um SASPβ, ou um SASPY. A SASP pode compreender uma SASP Bacillus thuringiensis.
[00557] A proteína de ligação de ácido nucleico pode compreender uma das sequências de aminoácidos descritas abaixo na Tabela 10. TABELA 10. SEQUÊNCIAS SASP E HFQ EXEMPLIFICATIVAS
[00558] A proteína de ligação de ácido nucleico também pode compreender uma sequência que tem um elevado grau de identidade de sequência com qualquer uma das sequências mostradas acima na Tabela 10. Por exemplo, a proteína de ligação de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 85% de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 264-266.
[00559] A proteína de ligação de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 264-266.
[00560] A proteína de ligação de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 95% de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 264-266.
[00561] A proteína de ligação de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 98% de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 264-266.
[00562] A proteína de ligação de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 99% de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 264-266.
[00563] A proteína de ligação de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 100% de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 264-266.
[00564] Por exemplo, quando a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico, a proteína de fusão pode compreender uma das sequências de aminoácidos apresentadas na Tabela 11 abaixo. Nas sequências mostradas na Tabela 11 abaixo, a sequência de direcionamento é mostrada no texto em negrito, um ligante alanina de seis aminoácidos ácido é indicado pelo sublinhado, e a sequência da proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico (SASPα, SASPβ, ou Hfq) é mostrada em texto simples. Assim, por exemplo, a proteína de fusão pode compreender SEQ ID NO: 267, 268, ou 269. TABELA 11. PROTEÍNAS DE FUSÃO EXEMPLIFICATIVAS COMPREENDENDO UMA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO
[00565] As nucleases podem também ser usadas para tanto ligar e clivar as moléculas de ácidos nucleicos. As nucleases têm elevada afinidade para moléculas de RNA e de DNA, e exercem a sua atividade enzimática por clivagem de RNA e/ou as moléculas de DNA em fragmentos de RNA e/ou DNA menores. As nucleases podem ser específicas, reconhecendo e clivando sequências de DNA ou de RNA específicas ou não específicas, clivando qualquer DNA e/ou RNA que eles entram em contato com. As nucleases podem ser categorizadas em exonucleases (nucleases que clivam nucleotídeos fora das extremidades do RNA e/ou moléculas de DNA), ou endonucleases (nucleases que clivam uma ligação fosfodiéster dentro de um polinucleotídeo de cadeia). Cada enzima nuclease tem um local ativo que compreende os aminoácidos particulares que atuam para catalisar a clivagem da mo-lécula de ácido nucleico. A mutação destes locais ativos pode inativar o local ativo e permitir a ligação da nuclease para o seu substrato de ácido nucleico de elevada afinidade, sem clivagem do substrato. Assim, tais mutantes podem ligar-se e estabilizar a molécula de ácido nucleico sem clivagem da molécula de ácido nucleico.
[00566] Assim, a proteína de ligação de ácido nucleico pode com-preender uma nuclease (por exemplo, uma nuclease que possui um local ativo inativado).
[00567] Quando a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico, uma molécula de ácido nucleico pode ser ligada à proteína ou peptídeo de ligação do ácido nucleico. O ácido nucleico pode compreender, por exemplo, uma molécula de RNA de modulação; uma molécula de RNAi; um microRNA; um aptâmero; ou uma molécula de DNA que codifica uma molécula de RNA de modulação, uma molécula de RNAi, um microRNA, ou um aptâmero.
XIII.MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTES HOSPEDEIROS
[00568] Como descrito acima, um membro da família Bacillus cereus pode servir como hospedeiro para a expressão de proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium, ou um fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus; servir como hospedeiro para a expressão de proteínas moduladoras que modulam a expressão de uma proteína de fusão; pode servir como um hospedeiro para a sobre-expressão de uma enzima exosporium; pode ser geneticamente inativada; ou pode compre-ender uma mutação ou a outra alteração genética que permite a coleta de exosporium livre.
[00569] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode co-expressar dois ou mais de qualquer das proteínas de fusão acima discutidas. Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode co-expressar pelo menos uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a planta, em conjunto com uma proteína de fusão compreendendo um crescimento da planta estimulando a proteína ou peptídeo, uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico, uma proteína de fusão compreendendo a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta, uma proteína de fusão que compreende uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico, ou uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de ligação do ácido nucleico.
[00570] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender qualquer espécie de Bacillus que é capaz de produzir um exosporium. Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreende Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Ba-cillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis, ou uma combinação dos mesmos. Em particular, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides.
[00571] Para gerar um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão, nenhum membro da famíliaBacillus cereus pode ser conjugado, transduzido ou transformado com um vetor que codifica a proteína de fusão utilizando métodos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, por eletroporação). As bactérias podem então ser pesquisadas para identificar os transformantes por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, onde o vetor inclui um gene de resistência a antibiótico, as bactérias podem ser rastreadas quanto a resistência a antibióticos. Alternativamente, o DNA que codifica a proteína de fusão pode ser integrado no DNA cromossômico de um membro da família B. cereus hospedeiro. O membro da família Bacillus cereus recombinante pode, em seguida, ser exposto a condições que irão induzir a esporulação. As condições adequadas para induzir a esporulação são conhecidas na técnica. Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode ser plaqueado em placas de ágar e incubados a uma temperatura de cerca de 30° C durante vários dias (por exemplo, 3 dias).
[00572] Cepas inativadas, cepas não tóxicas, ou cepas geneticamente manipuladas de qualquer das espécies acima podem também ser adequadamente utilizadas. Por exemplo, uma Bacillus thuringiensis que carece da toxina Cry pode ser usada. Alternativamente ou em adição, uma vez que os esporos do membro da família B. cereus recombinante que expressam a proteína de fusão foram gerados, eles podem ser inativados para evitar mais uma vez germinação uma vez em uso. Qualquer método para a inativação de esporos bacterianos que é conhecido na técnica pode ser utilizado. Os métodos adequados incluem, sem limitação, o tratamento com calor, irradiação gama, irradiação com raios-X, UV-A irradiação, irradiação com UV-B, tratamento químico (por exemplo, tratamento com glutaraldeído, formaldeído, peróxido de hidrogênio, ácido acético, lixívia, ou qualquer combinação dos mesmos), ou uma combinação dos mesmos. Em alternativa, os esporos obtidos a partir de cepas geneticamente não toxicogênicas, ou cepas ou fisicamente inativadas, podem ser usados.
[00573] Muitas cepas de membros da família Bacillus cereustêm atributos benéficos inerentes. Por exemplo, algumas cepas têm efeitos promotores de crescimento de plantas. Qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes aqui descritos podem compreender uma cepa de bactérias promotora de crescimento de plantas.
[00574] A cepa de bactérias promotora do crescimento de plantas pode compreender uma cepa de bactérias que produz uma toxina inseticida (por exemplo, uma toxina Cry), produz um composto fungicida (por exemplo, um β-1,3-glucanase, um quitosanase, um liticase, ou uma combinação dos mesmos), produz um composto nematocida (por exemplo, uma toxina Cry), produz um composto bactericida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou mais plasmídeos de replicação livre, liga-se às raízes das plantas, coloniza raízes das plantas, forma biofilmes, solubiliza nutrientes, secreta ácidos orgânicos, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00575] Por exemplo, onde o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias promotora de cresci-mento de plantas, a cepa de bactérias promotora de crescimento de plantas pode compreender (a) Bacillus mycoides BT155 (NRRL No. B50921), (b) Bacillus mycoides EE118 (NRRL No. B-50918), (c) Bacillus mycoides EE141 (NRRL No. B-50916), (d) Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No. B-50922), (e) membro da família Bacillus cereus EE128 (NRRL No. B-50917), (f) Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B50924), (g) membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B50928), (h) membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B67119), (i) Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), ou (j) Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121). Cada uma das amostras (a) a (g) foi depositada com o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) Agricultural Research Service (ARS), com o endereço 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EUA, em 10 de Março, de 2014, e é identificado pelo número de depósito NRRL em parênteses. Bacillus thuringiensis BT013A também é conhecido como Bacillus thuringiensis 4Q7. Cada uma das cepas (h) a (j) foram depositadas com o USDA ARS em 19 de Agosto, 2015, e é identificada pelo número de depósito NRRL em parênteses.
[00576] Estas cepas que promovem de crescimento para plantas foram isoladas a partir das rizosferas de diversas plantas vigorosas e foram identificadas pelas suas sequências DE rRNA 16S (listadas abaixo na Tabela 12), e por meio de ensaios bioquímicos. As cepas foram identificadas pelo menos quanto às suas designações de gênero por meio da bioquímica convencional e indicadores morfológicos. En-saiosbioquímicos para cepas Gram-positivas confirmadas tais como Bacillusincluídos na forma da ervilha e ágar nutriente, o exame mi-croscópico, o crescimento em 5 % e 7,5 % de meio de NaCl, o cresci-mento a Um pH 5 e pH 9, o crescimento a 42° C e 50° C, a capacidade de produzir ácido mediante fermentação com celobiose, lactose, glicerol, glucose, sacarose, d-manitol, e amido; a produção de pigmento fluorescente; hidrólise de gelatina; redução de nitrato; produção de ca-talase, a hidrólise de amido; reação oxidase, produção de urease e da motilidade. A identificação destas cepas e demonstração dos seus efeitos promotores de crescimento para plantas são descritas adicionalmente nos Exemplos adiante. TABELA 12. SEQUÊNCIAS DE16S RRNA PARCIAIS PARA MEMBROS DA FA-MÍLIA BACILLUS CEREUS PROMOTORES DE CRESCIMENTO DE PLANTAS
[00577] Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante que compreende uma cepa de bactérias promotora de crescimento de plantas pode compreender Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE141, ou Bacillus thuringiensis BT013A.
[00578] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma cepa de bactérias endofíticas. Por exemplo, a cepa de bactérias endofíticas pode compreender membros da família Bacillus cereus EE349, membros da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, ou Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, Bacillus cereus membro da família EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, ou Bacillus mycoides EE-B00363.
[00579] Membro da família Bacillus cereus EE349 é também uma cepa de bactérias promotora do crescimento de plantas e é descrito acima. Conforme discutido nos Exemplos abaixo, membro da família Bacillus cereus EE349 também foi constatado como sendo endofítico.
[00580] Bacillus cereus EE439 membro da família, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, membro da família Bacillus cereus EE-B00377; Bacillus pseudomycoides EE-B00366; ou Bacillus mycoides EE-B00363 são descritos mais abaixo na Seção XIV.
[00581] A cepa de bactérias endofíticas pode compreender membros da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, ou Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, membros da família Bacillus cereus EEB00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, ou Bacillus mycoides EE-B00363.
[00582] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida. Como discutido mais abaixo nos Exemplos, membro da família Bacillus cereus EE349, membro da família Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, e Bacillus mycoides EE-B00363 foram constatados como sendo capazes de de-gradar herbicidas e/ou pesticidas. Assim, quando o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida, a cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida pode compreender membro da família Bacillus cereus EE349, membro da família Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, ou Bacillus mycoides EE-B00363.
[00583] A cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida pode degradar um herbicida sulfonilureia (por exemplo, sulfentrazona), um herbicida de triazina aril, dicamba, 2,4-D, um herbicida de fenoxi, um piretrina, um piretroide, ou uma combinação dos mesmos.
[00584] A cepa de bactérias que é capaz de degradar um pesticida pode ser uma cepa de bactérias que é capaz de degradar uma piretrina.
[00585] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma cepa de bactérias probióticas. Por exemplo, a cepa de bactérias probióticas podem compreender membro da família Bacillus cereus EE349, membro da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, ou Bacillus cereus EE444.
[00586] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação de inativação em seu gene BclA, seu gene CotE, ou o seu gene CotO (por exemplo, um knock-out do gene BclA, gene CotE, ou gene CotO). Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação de inativação no seu gene BclA (por exemplo, um knock-out do gene BclA). Verificou-se que a expressão de proteínas de fusão num membro da família Bacillus cereus recombinante com esses resultados de mutação no aumento dos níveis de expressão da proteína de fusão.
XIV.CEPAS BACTERIANAS ENDOFÍTICAS
[00587] A presente invenção diz ainda respeito a cepas bacterianas endofíticas. Enquanto muitas bactérias da rizosfera têm uma relação simbiótica com a planta, apenas um pequeno subconjunto destas bac-térias é capaz de ser internalizado na planta e crescer endofiticamente. Como descrito adicionalmente nos Exemplos adiante, várias cepas de membro da família Bacillus cereus e várias cepas bacterianas de membro da família não Bacillus cereus foram isoladas a partir de plântulas de milho e verificadas como com a capacidade de crescer em plantas endofiticamente.
A. EndofíticosBacillus cereus membros da família
[00588] A presente invenção se refere a culturas bacterianas biolo-gicamente pura de bactérias que têm a capacidade de crescer endofiticamente. A cepa bacteriana em cada uma destas culturas bacterianas pode ser: (a) membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B50979); (b) Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50974); (c) Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977); (d) Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), (e) Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B67122); (f) membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B67119); (g) Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); ou (h) Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121). Cada uma das cepas (a) a (c) foi depositada com o Departamento de Agricultura dos EUA (USDA) Agricultural Research Service (ARS), com o endereço 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EUA, em 10 de Setembro, de 2014, e são identificados pelos números de NRRL fornecidos em parênteses a seguir os nomes de cada cepa. A cepa (d) foi depositada com a ARS USDA em 17 de Setembro de 2014, é identificada pelo número NRRL em parênteses após o nome da cepa. Cada uma das cepas (e) a (h) foi depositada com as ARS do USDA em 19 de agosto de 2015 e são identificadas pelos números NRRL em parênteses seguintes os nomes de cada cepa.
[00589] As novas cepas aqui reveladas foram identificadas pela sequenciação de RNA ribossomal 16s (rRNA). Portanto, membro da família Bacillus cereus EE439 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 277. Bacillus thuringiensis EE417 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 278. Bacillus cereus EE444 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 279. Bacillus thuringiensis EE319 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 280. Bacillus thuringiensis EE-B00184 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 301. Portanto, membro da família Bacillus cereus EE-B00377 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 304. Bacillus pseudomycoides EE-B00366 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 303. Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121) e a bactéria tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 302. As sequências DE rRNA 16S estão listadas abaixo na Tabela 13. TABELA 13. SEQUÊNCIAS DE RRNA 16S PARCIAIS PARA CEPAS DE MEM-BRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUSENDOFÍTICAS
[00590] A presente invenção diz aind a respeito a uma cultura bacteriana biologicamente pura, em que as bactérias em cultura bacteriana são mutantes de membro da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, membro da família Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, ou Bacillus mycoides EE-B00363 que compreende uma ou mais mutações, em que as bactérias são endofíticas.
B. Outras cepas bacterianas endofíticas
[00591] A presente invenção também se refere a outras culturas bacterianas biologicamente pura de bactérias (membros da família não Bacillus cereus), que têm a capacidade de crescer endofiticamente. Estas cepas foram isoladas a partir de plântulas de milho, tal como descrito em detalhe abaixo nos Exemplos.
[00592] A cepa bacteriana em cada uma destas culturas bacterianas podem ser (a) Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), (b) Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981), (c) Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), (d) Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978), (e) Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975), (f) Lysinibcaillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976), ou (g) Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123). Cada uma das cepas (a) a (f) foi depositada com o Departamento de Agricultura dos EUA (USDA) Agricultural Research Service (ARS), com o endereço 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EUA, em 10 de Setembro, de 2014, e são identificados pelos números de NRRL fornecidos em parênteses a seguir os nomes de cada cepa. A seguir ao depósito, Bacillus sp. EE387 estava determinada a ser uma cepa semelhante a Bacillus pumilus. cepa (g) foi depositada com as ARS do USDA em 19 de agosto de 2015 e é identificada pelo número NRRL em parênteses seguindo o seu nome.
[00593] As novas cepas aqui reveladas foram identificadas pela sequenciação de RNA ribossomal 16s (rRNA). Portanto, Bacillus megaterium EE385 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 281. Bacillus sp. EE387 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 282. Bacillus circulans EE388 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 283. Bacillus subtilis EE405 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 284. Lysinibacillus fusiformis EE442 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 285. Lysinibcaillus sphaericus EE443 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 286. Bacillus pumilus EE-B00143 tem uma sequência de RNA ribossômico 16S com pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 305. As sequências DE rRNA 16S estão listadas abaixo na Tabela 14. TABELA 14. SEQUÊNCIAS DE RRNA 16S PARCIAIS PARA CEPAS DE MEM BRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUSENDOFÍTICAS
[00594] A presente invenção diz ainda respeito a uma cultura bacteriana biologicamente pura, em que as bactérias em cultura bacteriana são mutantes de Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, ou Lysinibcaillus sphaericus EE443, que compreende uma ou mais mutações, em que as bactérias são endofíticas.
[00595] A presente invenção diz respeito também a uma cultura bacteriana biologicamente pura, em que as bactérias em cultura bacteriana são mutantes de Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, ou Lysinibcaillus sphaericus EE443, que compreende uma ou mais mutações, em que as bactérias são probióticas.
XV.INOCULANTES
[00596] A invenção se refere ainda a inóculos de qualquer das cepas bacterianas biologicamente puras descritas acima na seção anterior. Os inoculantes são para aplicação a plantas, sementes de plantas, um meio de crescimento de plantas, ou de uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta, em que o inoculante compreende uma quantidade eficaz de qualquer uma das culturas bacterianas biologicamente puras e um veículo aceitável em agricultura.
[00597] O inoculante pode compreender uma quantidade eficaz de uma mistura compreendendo, pelo menos, duas das culturas bacterianas biologicamente puras descritas acima na seção que precede ime-diatamente.
[00598] O inoculante pode ainda compreender uma quantidade eficaz de uma rizobactéria. A rizobactéria pode ser uma cultura bacteriana biologicamente pura de uma cepa rizobactérias. As rizobactérias podem compreender bactérias do gênero Bradyrhizobium (por exem-plo,Bradyrhizobium japonicum), bactérias do gênero Rhizobium (por exemplo, Rhizobium phaseoli, Rhizobium leguminosarum, ou uma combinação dos mesmos), ou uma combinação dos mesmos.
XVI.SEMENTES DE PLANTA REVESTIDAS COM UMA ENZIMA QUE CATALISA A PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO OU COM BACTÉRIAS RECOMBINANTES QUE SUPEREXPRESSAM UMA ENZIMA QUE CATALISA A PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO
[00599] Uma semente da planta também é fornecida a qual é revestida com: (i) uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico; (ii) uma superóxido-dismutase ou (iii) um microrganismo recombinante que expressa uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou uma superóxido-dismutase, em que a expressão da enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou a superóxido dismutase é aumentada em comparação para a expressão da enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou a superóxido dismutase num microrganismo de tipo selvagem sob as mesmas condições.
[00600] A enzima que catalisa a produção de óxido nítrico pode compreender uma sintase de óxido nítrico ou uma arginase.
[00601] A enzima que catalisa a produção de óxido nítrico pode compreender uma sintase de óxido nítrico, tal como uma sintase de óxido nítrico a partir de Bacillus thuringiensis BT013A ou Bacillus subtilis 168.
[00602] Por exemplo, a sintase de óxido nítrico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00603] A sintase de óxido nítrico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00604] A sintase de óxido nítrico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00605] A sintase de óxido nítrico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00606] A sintase de óxido nítrico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00607] A sintase de óxido nítrico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00608] A superóxido dismutase pode compreender uma superóxido dismutase 1 (SODA1) ou um superóxido dismutase 2 (SODA2).
[00609] A superóxido-dismutase compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00610] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00611] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00612] A superóxido-dismutase compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00613] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00614] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 100% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00615] Quando a semente da planta é revestida com o microrganismo recombinante, o microrganismo recombinante pode compreender uma espécie de Bacillus, Escherechia coli, uma espécie de Aspergillus tais como Aspergillus niger, ou uma espécie de Sacchromycestal tal como Sacchromyces cerevisiae.
[00616] Por exemplo, o microrganismo recombinante pode compreender um membro da família Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, ou Bacillus megaterium.
[00617] As sequências de aminoácidos para as enzimas sintetase de óxido nítrico exemplificativas são fornecidas acima na Tabela 8. As sequências de aminoácidos para superóxido dismutase exemplificativas são fornecidas acima na Tabela 2.
XVII.FORMULAÇÕES
[00618] As formulações são fornecidas, que compreendem um membro da família Bacillus cereus recombinante, tal como aqui descrito, fragmentos exosporium derivado de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante, tal como aqui descrito ou uma bactéria formadora de esporos recombinante tal como aqui descrito, e um veículo aceitável em agricultura.
[00619] O veículo agricolamente aceitável pode compreender um aditivo, tal como um óleo, uma goma, uma resina, uma argila, um polioxietileno-glicol, um terpeno, um, um éster de ácido graxo orgânico viscoso, um álcool sulfatado, um sulfonato de alquil, um sulfonato de petróleo, um sulfato de álcool, um alquilo de sódio diamate butano, um poliéster de dioato tiobutano de sódio, um derivado de benzeno acetonitril, um material proteináceo, ou uma combinação dos mesmos.
[00620] O veículo agricolamente aceitável pode compreender um espessante, tais como um alquilsulfonato de cadeia longa de polietileno-glicol, um oleato de polioxietileno, ou uma combinação destes; um tensoativo, tal como um óleo de petróleo pesado, um destilado de pe-tróleo pesado, um éster de ácido graxo de poliol, um éster polietoxilado do ácido graxo, um polioxietileno glicol de alquil-aril, um acetato de alquilamina, um sulfonato de alquilaril, um álcool poli-hídrico, um fosfato de alquil, ou uma combinação destes; ou um agente antiaglomeração, tal como um sal de sódio (por exemplo, um sal de sódio de sulfonato de monometil de naftaleno, um sal de sódio de sulfonato de dimetil naftaleno, um sulfito de sódio, um sulfato de sódio, ou uma combinação destes), um carbonato de cálcio, terra de diatomáceas, ou uma combinação dos mesmos.
[00621] O aditivo pode compreender um material proteináceo tal como um produto de leite, farinha de trigo, farelo de soja, o sangue, albumina, gelatina, farinha de alfafa, extrato de levedura, ou uma combinação dos mesmos;
[00622] O veículo agricolamente aceitável pode compreender vermiculite, carvão, torta de filtro de carbonatação de fábrica de açúcar, casca de arroz, carboximetil celulose, turfa, perlite, areia fina, carbona to de cálcio, farinha, o alúmen, um amido, talco, polivinilpirrolidona, ou uma combinação dos mesmos.
[00623] A formulação pode compreender uma formulação de reves-timento de sementes, uma formulação líquida para aplicação às plantas ou a um meio de crescimento da planta, ou uma formulação sólida para aplicação às plantas ou a um meio de crescimento da planta. A formulação de revestimento de sementes pode compreender uma so-lução aquosa ou à base de óleo para aplicação a sementes ou um pó ou formulação granular para aplicação para sementes. A formulação líquida para aplicação às plantas ou a um meio de crescimento de planta pode compreender uma formulação concentrada ou de uma formulação pronta para uso. A formulação sólida para aplicação às plantas ou a um meio de crescimento de planta pode compreender uma formulação granular ou um agente em pó.
[00624] A formulação pode compreender ainda um fertilizante, um material fertilizante de micronutrientes, um inseticida, um herbicida, uma alteração do crescimento de plantas, um fungicida, um inseticida, um moluscicida, um algicida, um inoculante bacteriano, um inoculante de fungos, ou uma combinação dos mesmos.
[00625] O inoculante bacteriano pode compreender um inoculante bacteriano do gênero Rhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Bradyrhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Mesorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Azorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Allorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Sinorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Kluyvera, um inoculante bacteriano do gênero Azotobacter, um inoculante bacteriano do gênero Pseudomonas, um inoculante bacteriano do gênero Azospirillium, um inoculante bacteriano do gênero Bacillus, um inoculante bacteriano do gênero Streptomyces, um inoculante bacteriano do gê-neroPaenibacillus, um inoculante bacteriano do gênero Paracoccus, um inoculante bacteriano do gênero Enterobacter, um inoculante bacteriano do género Alcaligenes, Um inoculante bacteriano do gênero Mycobacterium, um inoculante bacteriano do gênero Trichoderma, um inoculante bacteriano do gênero Gliocladium, um inoculante bacteriano do gênero Glomus, um inoculante bacteriano do gênero Klebsiella, ou uma combinação dos mesmos.
[00626] O inoculante bacteriano pode compreender uma planta de promoção de crescimento cepa de bactérias. A cepa de bactéria pro-motora do crescimento de plantas pode produzir uma toxina inseticida, produzir um composto fungicida, produzir um composto nematocida, produzir um composto bactericida, podem ser resistentes a um ou mais antibióticos, podem compreender um ou mais plasmídeos de replicação livre, ligar-se a planta raízes, colonizar as raízes das plantas, formar biofilme, solubilizar nutrientes, secretar ácidos orgânicos, ou combinações dos mesmos.
[00627] Por exemplo, o inoculante bacteriano pode compreender Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL No. B-50819), Bacillus aryabhattai CAP56 (NRRL No. B-50817), Bacillus flexus BT054 (NRRL No. B50816), Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL No. B-50820), Bacillus mycoides BT155 (NRRL No. B-50921), Enterobacter cloacae CAP12 (NRRL No. B-50822), Bacillus nealsonii BOBA57 (NRRL No. NRRL B50821), Bacillus mycoides EE118 (NRRL No. B-50918), Bacillus subtilis EE148 (NRRL No. B-50927), Alcaligenes faecalis EE107 (NRRL No. B-50920), Bacillus mycoides EE141 (NRRL NO. B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No. B-50922), membro da família Bacillus cereus EE128 (NRRL No. B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924), Paenibacillus massiliensis BT23 (NRRL No. B50923), membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B50928), Bacillus subtilis EE218 (NRRL No. B-50926), Bacillus megaterium EE281 (NRRL No. B-50925), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121), Ba-cillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123), ou Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122) ou uma combinação dos mesmos. Cada uma destas cepas foi depositada com o Departamento de Agricultura dos EUA (USDA) Agricultural Research Service (ARS), com o endereço 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EUA, em 11 de março de 2013 (Bacillus aryabhattai CAP53, Bacillus aryabhattai CAP56, Bacillus Flexus BT054, Paracoccus kondratievae NC35, Enterobacter cloacae CAP12, e Bacillus nealsonii BOBA57), em 10 de março de 2014 (Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus subtilis EE148, Alcaligenes faecalis EE107, Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoides BT46-3, membro da família Bacillus cereus EE128, Bacillus thuringiensis BT013A, Paenibacillus massiliensis BT23, membro da família Bacillus cereus EE349, Bacillus subtilis EE218, e Bacillus megaterium EE281), ou em 19 de agosto de 2015 (membro da família Bacillus cereus EE-B00377; Bacillus pseudomycoides EE-B00366, Bacillus mycoides EE-B00363, Bacillus pumilus EE-B00143, ou Bacillus thuringiensis EE-B00184) e é identificado pelo número NRRL nos parênteses.
[00628] Estas cepas que promovem de crescimento para plantas foram isoladas a partir das rizosferas de diversas plantas vigorosas e foram identificadas pelas suas sequências DE rRNA 16S, e por meio de ensaios bioquímicos. As cepas foram identificadas pelo menos a sua designação gênero por meio da bioquímica convencional e indica-doresmorfológicos. Ensaios bioquímicos para confirmadas cepas Gram-negativas, tais como Paracoccus kondratievae, Alcaligenes faecalis, e Enterobacter cloacae crescimento incluídos em MacConkey médio e ágar nutriente, o exame microscópico, o crescimento em 5 % e 7,5 % de meio de NaCl, o crescimento a Um pH 5 e pH 9, o crescimento a 42° C e 50° C, a capacidade de produzir ácido mediante fer-mentação com celobiose, lactose, glicerol, glucose, sacarose, dmanitol, e amido; a produção de pigmento fluorescente; hidrólise de gelatina; redução de nitrato; hidrólise do amido; reação de oxidase, produção de catalase, a produção de urease e da motilidade. Da mesma forma, os ensaios bioquímicos para cepas Gram-positivas confirmadas tais como Bacilo e Paenibacillus crescimento incluídos na forma da ervilha e ágar nutriente, o exame microscópico, o crescimento em 5 % e 7,5 % de meio de NaCl, o crescimento a Um pH 5 e pH 9, o crescimento a 42° C e 50° C, a capacidade de produzir ácido mediantefermentação com celobiose, lactose, glicerol, glucose, sacarose, d-manitol, e amido; a produção de pigmento fluorescente; hidrólise de gelatina; redução de nitrato; produção de catalase, a hidrólise de amido; reação oxidase, produção de urease e da motilidade. A identificação destas cepas e demonstração dos seus efeitos promotores de crescimento para plantas são descritas adicionalmente nos Exemplos adiante. Sequências de 16s rRNA parciais para as cepas Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoides BT46-3, membro da família Bacillus cereus EE128, Bacillus thuringiensis BT013A, e membro da família Bacillus cereus EE349 são fornecidas na Tabela 12 acima. Sequências de 16s rRNA parciais para as cepas Bacillus aryabhattai CAP53, Bacillus aryabhattai CAP56, Bacillus Flexus BT054, Paracoccus kondratievae NC35, Enterobacter cloacae CAP12, Bacillus nealsonii BOBA57, Bacillus subtilis EE148, Alcaligenes faecalis EE107, Paenibacillus massiliensis BT23, Bacillus subtilis EE218, e Bacillus megaterium EE281 são listadas na Tabela 15 abaixo. TABELA 15. SEQUÊNCIAS DE16S RRNA PARCIAIS PARA FÁBRICA DE CRESCIMENTO ADICIONAL PROMOVENDO CEPAS DE BACTÉRIAS
[00629] Por exemplo, a formu ação pode compreender uma cepa promotora de crescimento de bactérias compreendendo Paracoccus kondratievae NC35, Bacillus aryabhattai CAP53, ou Bacillus megaterium EE281, em que a formulação compreende ainda qualquer um dos recombinante Bacillus cereus membros da família aqui descrito, incluindo qualquer das cepas de membros da família de Bacillus cereus recombinantes que promovem o crescimento de plantas aqui (por exemplo, recombinante Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE141, ou Bacillus thuringiensis BT013A).
[00630] O inoculante de fungos pode compreender um inoculante de fungos da família Glomeraceae, um inoculante de fungos da família Claroidoglomeraceae, um inoculante de fungos da família Gigasporaceae, um inoculante de fungos da família Acaulosporaceae, um inoculante de fungos da família Sacculosporaceae, um inoculante de fungos do família Entrophosporaceae, um inoculante de fungos da família Pacidsporaceae, um inoculante de fungos da família Diversisporaceae, um inoculante de fungos da família Paraglomeraceae, um inoculante de fungos da família Archaeosporaceae, um inoculante de fungos da família Geosiphonaceae, um inoculante de fungos da família Ambisporaceae, um inoculante de fungos da família Scutellosporaceae, um inoculante de fungos da família Dentiscultataceae, um inoculante de fungos da família Racocetraceae, um inoculante de fungos do filo Basidiomycota, um inoculante de fungos de Ascomycota filo, um inoculante de fungos do filo Zygomycota, ou uma combinação dos mesmos.
[00631] A bactéria formadora de esporos, por si só ou em combinação com o inseticida, pode ainda compreender uma quantidade eficaz de pelo menos um fungicida.
[00632] Ingredientes fungicidas típicos incluem Captan (Ntriclorometil) tio-4-ciclo-hexano-1,2-dicarboximida), Fludioxoni 1(4-(2,2difluoro-1,3-benzodioxol-4-il)-1 H-pirrol-3-carbonitril; iprodiona carbendazima (comercialmente disponível sob o nome comercial Rovral.RTM), tebuconazole, tiabendazole, azoxistrobina, procloraz, e Oxadixil (N(2,6-dimetilfenil) -2-metoxi-N(2-oxo-3oxazolidinil) acetamida).
[00633] Se uma formulação, uma semente de planta ou um inóculo compreende um fungicida, o fungicida pode compreender aldimorfo, ampropilfos, ampropilfos potássio, andoprim, anilazina, azaconazole, azoxistrobina, benalaxil, benodanil, benomil, benzamacril, benzamacrilisobutil, bialafos, binapacril, bifenil, bitertanol, blasticidina-S, boscalid, bromuconazole, bupirimato, butiobato, polissulfureto de cálcio, capsimicina, captafol, captana, carbendazima, carvona, quinometionato, clobentiazona, clorfenazole, cloroneb, cloropicrina, clortalonil, clozolinato, clozilacona, cufranina, cmoxanil, ciproconazol, ciprodinil, ciprofuram, debacarbe, diclorofeno, diclobutrazole, diclofluanida, diclomezina, dicloran, dietofencarb, dimetirimol, dimetomorfo, dimoxistrobina, diniconazole, diniconazol-M, dinocape, difenilamina, dipiritiona, ditalimfos, ditianona, dodemorf, dodine, drazoxolon, edifenfos, epoxiconazol, eta- conazol, etirimol, etridiazol, famoxadon, fenapanil, fenarimol, fenbuconazole, fenfuram, fenitropan fenepiclonil, fenepropidina, fenepropimorfe, acetato de fentina, hidróxido de fentina, ferbam, ferimzona, fluazinam, flumetover, fluoromida, fluquinconazol, flurprimidol, flusilazol, flusulfamida, flutolanil, flutriafol, folpete, fosetil-alumínio, fosetil-sódio, fthalide, fuberidazole, furalaxilo, furametpir, furcarbonil, furconazol, furconazol-cis, furmecyclox, guazatina, hexaclorobenzeno, hexaconazol, himexazol, imazalil, imibenconazole, iminoctadine, albesilato de iminoctadina, iminoctadina triacetato, iodocarb, iprobenfos (IBP), iprodiona, irumamicina, isoprotiolano, isovalediona, casugamicina, cresoximametil, preparações de cobre, tais como: hidróxido de cobre, naftenato de cobre, oxicloreto de cobre, sulfato de cobre, óxido de cobre, oxina de cobre e Bordeaux mistura, mancopper, mancozeb, maneb, meferimzona, mepanipirime, mepronil, metalaxil, metconazol, metassulfocarb, methfuroxam, metirame, metomeclam, metsulfovax, mildiomicina, miclobutanil, miclozolina, dimetilditiocarbamato níquel, nitrotalisopropílico, nuarimol, ofurace, oxadixil, oxamocarb, ácido oxolínico, oxicarboxim, oxyfenthiin, Paclobutrazole, pefurazoato, penconazol, pencycuron, fosdifeno, pimaricina, piperalin, polioxina, polioxorim, probenazole, procloraz, procimidona, propamocarbe, propanosine de sódio, propiconazole, propinebe, protiocinazol, pirazofos, pirifenox, Pirimetanil, piroquilona, piroxifrina, quinconazol, quintozeno (PCNB), preparações de enxofre e enxofre, tebuconazol, tecloftalam, tecnazeno, tetciclosas, tetraconazol, tiabendazole, ticlof en, tifluzamida, tiofanatometilo, tioximida, tolclofosmetilo, tolilfluanida, triadimefon, triadimenol, Triazoxido, triclamida, triciclazole, tridemorf, trifloxistrobina, triflumizol, triforina, uniconazole, valamicina A, vinclozolina, viniconazole, zarilamida, zineb, ziram e também Dagger G, OK-8705, OK-8801, a-(1,1dimetiletil)-(3-(2-fenoxietil)-1H-1,2,4-triazol-1-etanol, a-(2,4diclorofenil)-[3-fluoro-3-propil-1 H--1,2,4-triazol-1-etanol, a-(2,4diclorofenil)-[3-metoxi-a-metil-1 H-1,2,4-triazol-1 -etanol, a-(5-metil 1,3-dioxan-5-il)-[3-[[4-(trifluorometil)-fenil]-metileno]-1 H-1,2,4-triazol-1 etanol, (5RS,6RS)-6-hidroxi-2,2,7,7-tetrametil-5-(1H-1,2,4-triazol-1-il)3-octanona, (E)-a-(metoxiimino)-N-metil-2-fenoxi-fenilacetamida, 1isopropil{2-metil-1-[[[1-(4-metilfenil)-etil]-amino]-carbonil]propil}carbamato, 1-(2,4-diclorofenil)-2-(1 H-1,2,4-triazol-1-il)-etanonaO-(fenil metil)-oxima, 1-(2-metil-1-naftalenil)-1 H-pirrol-2,5-diona, 1(3,5-diclorofenil)-3-(2-propenil)-2,5-pirrolidindiona, 1-[(diiodometil)sulfonil]-4-metil-benzeno, 1-[[2-(2,4-diclorofenil)-1, 3-dioxolan-2-il]metil]-1 H-imidazol, 1-[[2-(4-clorofenil)-3-feniloxiranil]-metil]-1 H-1,2,4triazol, 1-[1-[2-[(2,4-diclorofenil)-metoxi]-fenil]-etenil]-1 H-imidazol, 1metil -5-nonil-2-(fenilmetil)-3-pirroIidinol, 2',6'-dibromo-2-metil-4'trifluorometoxi-4'-trifluoro-metil-1, 3-tiazol -carboxanilida, 2,2-dicloro-N[1-(4-clorofenil)-etil]-1-etil-3-metil-ciclopropanecarboxamida, 2,6dicloro-5-(metiltio)-4-pirimidinil-tiocianato, 2,6-dicloro-N-(4trifluorometilbenzil)-benzamida, 2,6-dicloro-N-[[4-(trifluorometil)-fenil]metil]-benzamida, 2-(2,3,3-triiodo-2-propenil)-2H-tetrazol, 2-[(1metiletil)-sulfonil]-5-(triclorometil)-1,3,4-tiadiazol, 2-[[6-desoxi-4-O-(4-0metil-(3-D-glicopiranosil)-a-D-glucopiranosil]-amino]-4-metoxi-1Hpirrolo [2,3-d]pirimidina-5-carbonitrila, 2-aminobutano, 2-bromo-2(bromometil)-pentanedinitrila, 2-cloro-N-(2,3-dihidro-1,1,3-trimetil-1Hinden-4-il)-3-piridinecarboxamida, 2-cloro-N-(2,6-dimetilfenil)-N(isotiocianatometil)-acetamida, 2-fenilfenol (OPP), 3,4-dicloro-1-[4(difluorometoxi)-fenil]-pirrol-2,5-diona, 3,5-dicloro-N-[ciano[(1-metil-2propynil)-oxi]-metil]-benzamida, 3-(1,1-dimetilpropil-1-oxo-1H-indeno-2carbonitrila, 3-[2-(4-clorofenil)-5-etoxi-3-isoxazolidinil]-piridina, 4-cloro2-ciano-N,N-dimetil-5-(4-metilfenil)-1 H-imidazol-1-sulfonamida, 4metil-tetrazolo[1,5-a]quinazolin-5(4H)-ona, 8-(1,1-dimetiletil)-N-etil-Npropil-1,4-dioxaspiro[4,5]decano-2-metanamina, dulfato de 8hidroxiquinolina, hidrazida de 9H-xanteno-2-[(fenilamino)-carbonil]-9- carboxílico, bis-(1-metiletil)-3-metil-4-[(3-metilbenzoil)-oxi]-2,5tiofenodicarboxilato, cis-1-(4-clorofenil)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-il)cicloheptanol, cloridrato de cis-4-[3-[4-(1,1-dimetilpropil)-fenil-2metilpropil]-2,6-dimetil-morfolina, [(4-clorofenil)-azo]-cianoacetato de etil, bicarbonato de potássio, sal metanotetratiol-sódio, 1-(2,3-dihidro2,2-dimetil-inden-1-il)-1 H-imidazol-5-carboxilato de metil, N-(2,6dimetilfenil)-N-(5-isoxazolilcarbonil)-DL-alaninato de metil, N(cloroacetil)-N-(2,6-dimetilfenil)-DL-alaninato de metil, N-(2,3-dicloro-4hidroxifenil)-1-metil-ciclohexanecarboxamida, N-(2,6-dimetil fenil)-2metoxi-N-(tetrahidro-2-oxo-3-furanil)-acetamida, N-(2,6-dimetil fenil)-2metoxi-N-(tetrahidro-2-oxo-3-tienil)-acetamida, N-(2-cloro-4-nitrofenil)4-metil-3-nitro-benzenossulfonamida, N-(4-ciclohexilfenil)-1,4,5,6tetrahidro-2-pirimidinamina, N-(4-hexilfenil)-1,4,5,6-tetrahidro-2pirimidinamina, N-(5-cloro-2-metilfenil)-2-metoxi-N-(2-oxo-3oxazolidinil)-acetamida, N-(6-metoxi)-3-piridinil)ciclopropanocarboxamida, N-[2,2,2-tricloro-1-[(cloroacetil)-amino]-etil]benzamida, N-[3-cloro-4,5-bis(2-propiniloxi)-fenil]-N'-metoximethanimidamida, sal N-formil-N-hidroxi-DL-alanina-sódio, [2(dipropilamino)-2-oxoetil]-etilfosforamidotioato de 0,0-dietil, fenilpropilfosforamidotioato de 0-metil S-fenil, S-metil 1,2,3-benzotiadiazol-7carbotioato, e espiro[2H]-1-benzopirano-2,1'(3'H)-isobenzofuran]-3'ona, N-triclorometil)tio-4-ciclohexano-1,2-dicarboximida, tetrametiltioperoxidicarbônico diamida, N-(2,6-dimetilfenil)-N-(metoxiacetil)-DLalaninato de metil, 4-(2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-4-il)-1-H-pirrol-3carbonitril ou uma combinação dos mesmos.
[00634] Além disso, fungicidas apropriados incluem: (1) um composto capaz de inibir a síntese de ácido nucleico como benalaxil, benalaxil-M, bupirimato, chiralaxil, clozilacon, dimetirimol, etirimol, furalaxil, himexazol, metalaxil, metalaxil-M, ofurace, oxadixil, ácido oxolínico; (2) um composto capaz de inibir a mitose e divisão celular como benomil, carbendazim, dietofencarb, etaboxam, fuberidazole, pencycuron, tiabendazol tiofanato-metil, zoxamida; (3) um composto capaz de inibir a respiração, por exemplo, como inibidor de respiração CI como diflumetorim; como inibidor de respiração CII como boscalid, fenfuram, flutolanil, furametpir, furmecyclox, mepronil, oxicarboxina, pentiopirade, tifluzamida; como inibidor de respiração CIII como amisulbrom, azoxistrobin, ciazofamida, dimoxistrobina, enestrobina, famoxadona, fenamidona, fluoxastrobina, cresoxim-metílico, metominostrobina, orisastrobina, picoxistrobina, trifloxistrobina; (4) um composto capaz de agir como um desacoplador comodinocap, fluazinam, meptildinocap; (5) um composto capaz de inibir produção de ATP como acetato de fentina, cloreto de fentina, hidróxido de fentina; (6) um composto capaz de inibir biossíntese de proteína e AA como andoprim, blasticidina-S, ciprodinil, kasugamicina, cloridrato hidratado de kasugamicina, mepanipirim, pirimetanil; (7) um composto capaz de inibir a transdução de sinal como fenpiclonil, quinoxifeno; (8) um composto capaz de inibir a síntese de lipídio e membrana como bifenil, clozolinato, edifenfós, etridiazol, iodocarb, iprobenfós, iprodiona, isoprotiolano, procimidona, propamocarb, cloridrato de propamocarb, pirazofos, tolclofos-metil, vinclozolina; (9) um composto capaz de inibir biossíntese de ergosterol como aldimorfe, azaconazol, bitertanol, bromuconazol, ciproconazol, diclobutrazol, diniconazol, diniconazol-M, dodemorfe, cacetato de dodemorfe, epoxiconazol, etaconazol, fenarimol, fenbuconazol, fenhexamid, fenpropidina, fenpropimorfe, fluquinconazol, flurprimidol, flusilazol, flutriafol, furconazol, furconazol-cis, hexaconazol, imazalil, imazalil sulfato, imibenconazol, metconazol, miclobutanil, naftifina, nuarimol, oxpoconazol, paclobutrazol, pefurazoato, penconazol, prochloraz, propiconazol, protioconazol, piributicarb, pirifenox, simeconazol, espiroxamina, tebuconazol, terbinafina, tetraconazol, triadimefon, triadimenol, tridemorfe, triflumizol, triforina, uniconazol, viniconazol, voriconazol; (10) um composto capaz de inibir a síntese de parede celular como bentiavalicarbe, bialafos, dimetomorfe, flumorfe, iprovalicarbe, mandipropamide, polioxinas, polioxorim, validamicina A; (11) um composto capaz de inibir aa biossíntese de melanina como carpropamida, diclocimet, fenoxanil, ftalida, piroquilon, triciclazol; (12) um composto capaz de induzir uma defesa de hospedeiro como acibenzolar-S-metil, probenazol, tiadinil; (13) um composto capaz de ter uma ação em múltiplos locais como mistura Bordeaux, captafol, captan, clorotalonil, naftenato de cobre, óxido de cobre, oxicloreto de cobre, preparações de cobre tais como hidróxido de sobre, sulfato de cobre, diclofluanida, ditianona, dodina, base livre de dodina, ferbam, fluorofolpete, folpete, guazatina, acetato de guazatina, iminoctadina, albesilato de iminoctadina, triacetato de iminoctadina, mancopper, mancozebe, manebe, metiram, zinco metiram, oxinacobre, propinebe, enxofre e preparações de enxofre incluindo polissulfeto de cálcio, tolylfluanid, zineb, ziram; (14) um composto selecionado a partir da seguinte lista: (2E)-2-(2-{[6-(3-cloro-2-metilfenoxi)-5fluoropirimidin-4-il]oxi}feni-l)-2-(metoxiimino)-N-metilacetamida, (2E)-2{2-[({[(1E)-1-(3-{[(E)-1-fluoro-2-fenilvinil]oxi}fenil)etilidene]amino}oxi)metil]fenil}-2-(metoxiimino)-N-metilacetamida, 1-(4clorofenil)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-il)cicloheptanol, 1-[(4metoxifenoxi)metil]-2,2-dimetilpropil-1H-imidazol-1-carboxilate, 2,3,5,6-tetracloro-4-(metilsulfonil)piridina, 2-butoxi-6-iodo-3-propil-4Hcromen-4-ona, 2-cloro-N-(1,1,3-trimetil-2,3-dihidro-1H-inden-4il)nicotinamida, 2-fenilfenol e sais, 3,4,5-tricloropiridina-2,6dicarbonitrila, 3,4-dicloro-N-(2-cianofenil)isotiazol-5-carboxamida, 3-[5(4-clorofenil)-2,3-dimetilisoxazolidin-3-il]piridina, 5-cloro-6-(2,4,6trifluorofenil)-N-[(1R)-1,2,2-trimetilpropil][1,2,4]triazolo[1,5-a]pirimidin7-amina, 5-cloro-7-(4-metilpiperidin-1-il)-6-(2,4,6-trifluorofenil) [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirimidina, 5-cloro-N-[(1R)-1,2-dimetilpropil]-6(2,4,6-trifluorofenil) [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina,sulfato de 8- hidroxiquinolina, bentiazol, bethoxazin, capsimicina, carvona, chinometionat, cufraneb, ciflufenamid, cimoxanil, dazomete, debacarb, diclorofeno, diclomezina, dicloran, difenzoquat, difenzoquat metilsulfato, difenilaminaa, ferimzona, flumetover, fluopicolida, fluoroimida, flusulfamida, fosetil-alumínio, fosetil-cálcio, fosetil-sódio, hexaclorobenzeno, irumamicina, isotianil, metasulfocarb, (2E)-2-{2-[({ciclopropil[(4metoxifenil)imino]metil}tio)metil]fenil}-3-metoxiacrilato de metil, 1-(2,2dimetil-2,3-dihidro-1H-inden-1-il)-1H-imidazol-5-carboxilato de metil, isotiocianato de metil, metrafenona, mildiomicina, N-[2-(1,3dimetilbutil)fenil]-5-fluoro-1,3-dimetil-1H-pirazol-4-carboxamida, N(3',4'-dicloro-5-fluorobifenil-2-il)-3-(difluorometil)-1-metil-1H-pyrazole4-carboxamida, N-(3-etil-3,5,5-trimetilciclohexil)-3-(formilamino)-2hidroxibenzamida, N-(4-cloro-2-nitrofenil)-N-etil-4metilbenzenesulfonamida, N-(4-clorobenzil)-3-[3-metoxi-4-(prop-2-yn1-iloxi)fenil]propanamida, N-[(4-clorofenil)(ciano)metil]-3-[3-metoxi-4(prop-2-in-1-iloxi)fenil]propanamida, N-[(5-bromo-3-cloropiridin-2il)metil]-2,4-dicloronicotinamida, N-[1-(5-bromo-3-cloropiridin-2-il)etil]2,4-dicloronicotinamida, N-[1-(5-bromo-3-cloropiridin-2-il)etil]-2-fluoro4-iodonicotinamida, N-[2-(4-{[3-(4-clorofenil)prop-2-in-1-il]oxi}-3metoxifenil)etil]-N<-(metilsulfonil)valinamida, N-{(Z)[(ciclopropilmetoxi)imino][6-(difluorometoxi)-2,3-difluorofenil]metil}-2fenilacetamida, N-{2-[1,1'-bi(ciclopropil)-2-il]fenil}-3-(difluorometil)-, 1metil-1H-pirazol-4-carboxamida, N-{2-[3-cloro-5-(trifluorometil)piridin-2il]etil}-2-(trifluorometil)benzamida, natamicina, N-etil-N-metil-N'-{2metil-5-(trifluorometil)-4-[3-(trimetilsilil)pr-poxi]fenil}imidoformamida, Netil-N-metil-N'-{2-metil-5-(difluorometil)-4-[3(trimetilsilil)propoxi]fenil}imidoformamida, dimetilditiocarbamato de níquel, nitrotal-isopropil, O-{1-[(4-metoxifenoxi)metil]-2,2-dimetilpropil}1Himidazol-1-carbotioato, octilinona, oxamocarb, oxyfenthiin, pentaclorofenol e sais, ácido fosforoso e sais do mesmo, piperalina, propamocarb fosetilato, propanosine-sódio, proquinazid, piribencarbe, pirrolnitrina, quintozeno, tecloftalam, tecnazeno, triazoxida, triclamida, valifenal, zarilamid.
[00635] O fungicida pode compreender um benzeno substituído, um tiocarbamato, um bis-ditiocarbamato de etileno, um tioftalidamida, um composto de cobre, um composto organomercúrio, um composto de organo-estanho, um composto de cádmio, anilazina, benomil, ciclohexamida, dodina, etridiazol, iprodiona, metlaxyl, thiamimefon, triforina, ou uma combinação dos mesmos.
[00636] Se uma formulação, sementes de plantas, ou inóculo com-preende um fungicida, o fungicida pode ser um fungicida foliar. Fungi-cidas foliares incluem o cobre, mancozeb, pentiopirade, triazóis, ciproconazol, metconazol, propiconazole, protioconazol, tebuconazole, azoxistrobina, pyraclastobin, fluoxastrobina, picoxistrobina, trifloxistrobina, enxofre, boscalide, tiofanato metílico, chlorothanonil, pentiopirade, difenconazole, flutriafol, ciprodinil, fluzinam, iprodione, penflufen, ciazofamide, flutolanil, cimoxanil, dimetomorfe, pirimetanil, zoxamida, mandipropamid, metrinam, propamocarbe, fenamidona, tetraconazol, chloronab, himexazol, tolclofos e fenbuconazole.
[00637] Se uma formulação, sementes de plantas, ou inóculo com-preende um inoculante bacteriano do gênero Bacillus, o inoculante bacteriano pode compreender Bacillus argri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus, Bacillus endorhythmos, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus, Bacillus lentimorbus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus Medusa, Bacillus metiens, Bacillus natto, Bacillus nigrificans, Bacillus popillae, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus sphearicus, Bacillus spp., Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus unifagellatu,ou uma combinação dos mesmos além das listadas na categoria de Bacillus Genus em Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, First Ed. (1986), aqui incorporado na íntegra por referência.
[00638] Se uma formulação, sementes de plantas, ou inóculo com-preende um insecticida, o insecticida pode ser um nematicida. Nematicidas adequados incluem antibióticos nematocidas tais como abamectina; nematocidas de carbamato tais como acetoprole, Bacillus chitonosporus, cloropicrina, benclotiazina, benomilo, Burholderia cepacia, carbofurano, carbosulfano e cleotocard; Dazomet, DBCP, DCIP, alanicarbe, aldicarb, aldoxicarbam, oxamilo, diamidafos, fenamifos, fostietano, fosfamidon, cadusafos, clorpirifos, diclofentio, dimetoato, etoporfos, fensulftio, fostiazato, harpinas, heterofos, imiciclos, isamidofos, isazofos, metomil, Myrothecium verrucaria, Paecilomyces lilacinus, forato, fosfocarbe, terbufos, tio-azina, triazofos, dazomet, 1,2dicloropropano, 1,3-dicloropropeno, furfural, iodometano, metam, brometo de metil, isotiocianato de metil, e xilenóis.
[00639] Por exemplo, e sem limitação, o nematicida e inseticida pode ser fornecido sob a forma do produto comercial Avicta Duo, que é uma mistura de abamectina e tiametoxame comercialmente disponível a partir de Syngenta.
[00640] Se uma formulação, sementes de plantas, ou inóculo com-preende um bactericida, pode incluir estreptomicina, penicilinas, tetraciclinas, ampicilina, e ácido oxolínico.
[00641] O fertilizante pode compreender um fertilizante líquido. O material de micronutrientes fertilizantes pode compreender o ácido bórico, um borato, um filtro poroso de boro, sulfato de cobre, uma frita de cobre, um quelato de cobre, um deca-hidrato de tetraborato de sódio, um sulfato de ferro, um óxido de ferro, o sulfato de amônio e ferro, uma frita de ferro, um ferro quelato, um sulfato de manganês, um óxido de manganês, um quelato de manganês, cloreto de manganês, uma frita de manganês, um molibdato de sódio, ácido molíbdico, um sulfato de zinco, um óxido de zinco, um carbonato de zinco, uma frita de zinco, fosfato de zinco, um zinco quelato, ou uma combinação dos mesmos.
[00642] O fertilizante pode compreender sulfato de amônio, nitrato de amônio, nitrato-sulfato de amônio, cloreto de amônio, bissulfato de amônio, polissulfureto de amônio, tiossulfato de amônio, amoníaco aquoso, amoníaco anidro, polifosfato de amônio, sulfato de alumínio, nitrato de cálcio, nitrato de amônio de cálcio, carbonato de cálcio, fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, nitrato de magnésio, sulfato de magnésio, nitrato de potássio, cloreto de potássio, sulfato de potássio e magnésio, sulfato de potássio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, sulfato de cálcio, cálcio calcítico, nitratos, calcário magnésio, magnésia, ureia, ureia-formaldeídos, ureia nitrato de amônio, ureia revestida com enxofre, ureia revestida com polímero, isobutilidenodiureia, K2SO4-2MgSO4, kainite, sylvinite, kieserite, sais de Epsom, enxofre elementar, marga, ostra moída Escória, farinha de ossos, cinzas de madeira, estrume, guano de morcego, musgo de turfa, adubo, areia verde, farelo de algodão, farinha de penas, farelo de caranguejo, farelo de peixe, emulsão de peixe, ácido húmico ou uma combinação destes.
[00643] Uma formulação, sementes de plantas, ou inóculo pode também incluir pelo menos um agente de controle biológico selecionado a partir de (1) as bactérias, em particular bactérias formadoras de esporos, (2) os fungos ou leveduras, e (3) as isoflavonas. É dada preferênciaa combinações que compreendem como agente de controle biológico uma bactéria, em particular uma bactéria formadora de esporos, colonizadora de raízes ou uma bactéria útil como biofungicida, selecionada do grupo que consiste em [Grupo (1)]: (1.1) Bacillus agri, (1.2) Bacillus aizawai, (1.3) Bacillus albolactis, (1.4) Bacillus amyloliquefaciens, (1.5) Bacillus cereus, (1.6) Bacillus coagulans, (1.7) Bacillus endoparasiticus, (1.8) Bacillus endorhythmos, (1.9), (1.10) Bacillus kurstaki, (1.11) Bacillus lacticola, (1.12) Bacillus lactimorbus, (1.13) Bacillus lactis, (1.14) Bacillus laterosporus, (1.15) Bacillus lentimorbus, (1.16) Bacillus licheniformis, (1.17) Bacillus medusa, (1.18) Bacillus megaterium, (1.19) Bacillus metiens, (1.20) Bacillus natto, (1.21) Bacillus nigrificans, (1.22) Bacillus popillae, (1.23) Bacillus pumilus, (1.24) Bacillus siamensis, (1.25) Bacillus sphaericus (produtos conhecidos como VectoLex.sup.S), (1.26) Bacillus subtilis, ou B. subtilis var. amyloliquefaciens, (1.27) Bacillus thuringiensis, in particular B. thuringiensis var. israelensis (produtos conhecidos como VectoBac.RTM.) ou cepas B. thuringiensis subsp. aizawai ABTS-1857 (produtos conhecidos como XenTari), ou cepas B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 (produtos conhecidos como Dipel ES), (1.28) Bacillus uniflagellatus, (1.29) Delftia acidovorans, em particular cepa RAY209 (produtos conhecidos como BioBoost), (1.30) Antibiótico Lysobacter, em particular cepa 13-1 (Biological Control 2008, 45, 288-296), (1.31) Lysobacter enzymogenes, em particular cepa 3.1T8, (1.32) Pseudomonas chlororaphis, em particular cepa MA 342 (produtos conhecidos como Cedomon), (1.33) Pseudomonas proradix (produtos conhecidos como Proradix.RTM.), (1.34) Streptomyces galbus, em particular cepa K61 (produtos conhecidos como Mycostop.RTM., cf. Crop Protection 2006, 25, 468-475), (1.35) Streptomyces griseoviridis (produtos conhecidos como Mycostop.RTM.).
[00644] A preferência é dada ainda mais a combinações que com-preendem como agente de controle biológico um fungo ou uma levedura selecionada de entre o grupo que consiste de [Grupo (2)]: (2.1) Ampelomyces quisqualis, em particular cepa AQ 10 (produto conhecido como AQ 10.RTM.), (2.2) Aureobasidium pullulans, em blastósporos particulares de DSM14940 cepa ou blastosporos de cepas DSM 14941 ou suas misturas (produto conhecido como Blossom Protect.RTM.), (2.3) Beauveria bassiana, cepa em particular ATCC 74040 (produtos conhecidos como Naturalis.RTM.), (2.4) Candida oleophila, em particular cepa O (produtos conhecidos como Nexy), (2,5) Cladosporium cladosporioides H39 (cf. Eur. J. Plant Pathol. 2009, 123, 401414), (2.6), (2.7) Dilophosphora alopecuri (produtos conhecidos como Twist Fungus), (2.8) Gliocladium catenulatum, em particular a cepa J1446 (produtos conhecidos como Prestop), (2.9) Lecanicillium lecanii (anteriormente Conhecida como Verticillium lecanii), em particular conídios da cepa KV01 (produtos conhecidos como Mycotal.RTM, Vertalec.RTM), (2.10) Metarhizium anisopliea (produtos conhecidos como BIO 1020), (2.11) Metschnikovia fructicola, em particular a cepa NRRL Y-30752 (produtos conhecidos como ShemerTM), (2.12) Microsphaeropsis ochracea (produtos conhecidos como Microx), (2.13), (2.14) Nomuraea rileyi, (2.15), (2.16) Penicillium bilaii, em particular a cepa ATCC22348 (Produtos conhecidos como JumpStart.RTM, PB-50, Provide), (2.17) Pichia anomala, em particular a cepa WRL-076, (2.18) Pseudozyma flocculosa, em particular a cepa PF-A22 UL (produtos conhecidos como Sporodex L) (2.19) Pythium oligandrum DV74 (produtos conhecidos como Polyversum), (2.20) Trichoderma asperellum, em particular a cepa ICC 012 (produtos conhecidos como Bioten), (2.21) Trichoderma harzianum, em particular T. harzianum T39 (produtos conhecidos por exemplo Como Trichodex).
[00645] A preferência é dada ainda mais a combinações que com-preendem como agente de controle biológico uma isoflavona selecionada de entre o grupo que consiste do [Grupo (3)]: (3.1) genisteína, (3.2) Biochanina A10, (3.3) formononetina, (3.4) daidzeína. (3.5) gliciteína, (3.6) hesperitina, (3.7) naringenina, (3.8) calcona, (3.9) cumarina, (3.10) Ambiol (2-metil-4-dimetilaminometil-5-Hidroxi benzimidazole dihidrocloreto) (3.11) ascorbato e (3.12) pratensein e os seus sais e ésteres.
[00646] Se uma formulação, sementes de plantas, ou inóculo com-preende um inseticida, o inseticida pode incluir piretroides, organofosfatos, caramoximoximas, pirazoles, amidinas, hidrocarbonetos halogenados, neonicotinoides, e os carbamatos e os seus derivados. Particu-larmente as classes de inseticidas adequados incluem organofosfatos, fenilpirazoles e piretroides. Inseticidas preferidos são aqueles conhecidos como terbufos, clorpirifos, cloretoxifos, teflutrina, carbofurano e tebupirimfos. Inseticidas comercialmente disponíveis incluem tiametoxame (comercialmente disponível a partir de Syngenta sob o nome comercial Cruiser.
[00647] O inseticida pode compreender um organofosfato, um carbamato, um piretroide, um acaricida, um ftalato de alquil, ácido bórico, um borato, um fluoreto, enxofre, uma ureia substituída haloaromático, um éster de hidrocarboneto, um inseticida de base biológica, ou uma combinação dos mesmos.
[00648] Inseticidas adequados para uso na presente invenção incluem o seguinte: (1) agonistas de receptor de acetilcolina/antagonistas, tais como cloronicotinilos/neonicotinoides, nicotina, bensultap ou cartap. Os exemplos adequados de cloronicotinilos/neonicotinoides incluem acetamiprid, dinotefuran, nitenpiram, nitiazina, tiaclopride, tiametoxame, imidaclothiz e (2E) -1 [(2-cloro-1,3tiazol-5-il) metil] -3,5dimetil-N-nitro-1,3,5-tri-azinan-2-imina; (2) inibidores de acetilcolinesterase (ACNE), tais como carbamatos e organofosforados. Os exemplos adequados de carbamatos incluem alanicarb, aldicarb, aldoxicarb, allyxicarbam, aminocarbe, bendiocarbe, benfuracarbe, bufencarb, butacarbo, butocarboxima, butoxicarbombo, carbarilo, carbofurano, carbosulfano, cloetocarbo, dimetilano, etiofccarb, fenobucarb, fenotiocarb, formetanato, furatiocarpo, isoprocarbo, metamMetolcarb, oxamilo, fosfocarb, pirimicarbe, promecarb, propoxur, tiofanox, triazamato, trimetacárb, XMC e xililcarb. Os exemplos adequados de organofosfatos incluem acefato, azametifós, azinfos (metil, etil), bromofos-etil, bromfenvinfos (metil), butatiofos, cadusafos, carbofenotião, cloretoxifos, clorfenvinfos, clormefos, clorpirifos (metil/etil), coumafos, cianofenfos, cianofos, demeton-S-metil, demeton-S-metilsulfon, dialifos, diazinon, diclofenato, diclorvos/DDVP, dicrotofos, dimetoato, dimetilvinfos, dioxabenzofos, disulfoton, EPN, ethion, etoprofos, etrimfos, famfur, fenamifos, fenitrotião, fensulfotião, fentião, flupirazofos, fonofos, formotião, fosmetilano, fostiazato, heptenofos, Iodofenfos, iprobenfos, isazofos, isofenfos, isopropílico O-salicilato, isoxation, malation, mecarbamo, metacrifos, metamidofos, metidato, mevinfos, monocrotofos, naled, ometoato, oxidemetão-metil, paratião (-metil/-etil), fentoato, forato, fosalona, fosmete, fosfamidão, fosfocarb, foxima, pirimifos (metil/etil), profenofos, propafos, propetamfos, protiofos, protoato, piraclofos, piridafentio, piridatio, quinalfos, sebufos, sulfotep, sulprofos, tebupirimfos, temefos, terbufos, tetraclorvinphos, tiometão, triazofos, triclorfon e vamidotião; (3) moduladores de canais de sódio/ bloqueadores de canais de sódio com tensão controlada tais como piretroides e oxadiazinas. Os exemplos adequados de piretroides incluem acrinatrina, aletrina (d-cis-trans, d-trans), beta-ciflutrina, bifentrina, bioaletrina, bioaletrina-S-ciclopentilo-isômero, bioetanometrina, biopermetrina, bioresmetrina, clovaportrina, cis-resmetrina, cispermetrina, clocitrina, cicloprotrina, ciflutrina, cialotrina, cifenotrina, DDT, deltametrina, empentrina (1R-isômero), esfenvalerato, etofenproxe, fenflutrina, fempropatrina, fenpiridina, fenvalerato, flubrocitrinato, flucitrinato, flufenprox, flumetrina, fluvalinato, fubfenprox, gama-cialotrina, imiprotrina, cadetrina, lambda-cialotrina, metoflutrina, permetrina (cis-, trans-), fenotrina (isômero 1R-trans), praletrina, proflutrina, protrifenbute, piresmetrina, resmetrina, RU 15525, silafluofeno, tau-fluvalinato, teflutrina, teralletrina, tetrametrina (1R-isômero), tralocitrina, tralometrina, transflutrina, ZXI 8901 e piretrinas (piretro). Um exemplo adequado de oxa-diazinas inclui indoxacarbe; (4) moduladores do receptor de acetilcolina, tais como as espinosinas. Um exemplo adequado de espinosinas inclui espinosade; (5) antagonistas do canal de cloreto bloqueados com GABA tais, como organoclorados de ciclodieno e fiproles. Os exemplos adequados de organoclorados ciclodienos incluem canfecloro, clordano, endossulfano, gama-HCH, HCH, heptacloro, lindano e metoxicloro. Os exemplos adequados de fiproles incluem acetoprole, e vaniliprole; (6) ativadores dos canais de cloreto, tais como mectinas. Os exemplos adequados de mectinas incluem abamectina, avermectina, emamectina, benzoato de emamectina-, ivermectina, lepimectin, milbemectina e milbemicina; (7) miméticos da hormona juvenil tais como diofenolan, epofenonane, fenoxicarbe, hidropreno, quinopreno, metopreno, piriproxifeno, tripreno; (8) agonistas de ecdisona/disruptores, como diacil. Os exemplos adequados de diacil incluem cromafenozida, halofenozida, metoxifenozida e tebufenozida; (9) inibidores da quitinbiossíntese como benzoilúreas, buprofezina e ciromazina. Os exemplos adequados de benzoilúreas incluem bistriflurão, clofluazurão, diflubenzurão, fluazurão, flucicloxurão, flufenoxurão, hexaflumurão, lufenurão, novalurão, noviflumurão, penflurão, teflubenzurão e triflumurão; (10) inibidores da fosforilação oxidativa, disruptores de ATP tais como organoestânicos e diafentiurão. Exemplos adequados de organoestanho incluem azociclotina, ciexatina e óxido de fenbutatina; (11) desacopladores de fosforilação oxidativa por ruptura do gradiente de próton H, tais como pirroles e dinitrofenóis. Um exemplo adequado de pirroles inclui clorfenapir. Os exemplos adequados de dinitrofenóis incluem binapacyrl, dinobuton, dinocap e DNOC; (12) inibidores de transporte de elétrons do local I, tais como METIs, hidrametilnona e dicofol. Os exemplos adequados de METIs incluem fenazaquina, fenpiroximato, pirimidifeno, piridabeno, tebufenepirade, tolfenpirad; (13) inibidores de transporte de elétrons do local II tais como rotenona; (14) Inibidores de transporte de electrões do local III tais como acequinoil e fluacrypyrim; (15) disruptores microbianos da membrana intestinal de insetos tais como cepas de Bacillus thuringiensis; (16) inibidores de síntese de lipídiostais como ácidos tetrânicos e ácidos tetramicos. Os exemplos adequados de ácidos tetrônicos incluem espirodiclofeno, espiromesifeno e espirotetramato. Como exemplos adequados de ácidos tetrâmicos incluem cis-3(2,5-dimetilfenil) -8-metoxi-2-oxo-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-4-il etil carbonato (alias: ácido carbônico, 3 (2,5-dimetilfenil) -8-metoxi-2-oxo-1-azaspiro [4.5] dec-éster 3-en-4-il-etil (CAS Reg. No.: 382608-10-8); (17) carboxamidas, tais como flonicamida; (18) agonistas octopaminérgico tais como amitraz; (19) Inibidores da ATPase estimulada por magnésio tal como propargito (20) agonistas do receptor de rianodina tais como ftalimidas ou rinaxipir. Um exemplo adequado de ftalamidas inclui N.sup.2[1,1-dimetil-2(metilsulfonil) etil] -3-iodoN.sup.1[2-metil-4[1,2,2,2-tetrafluoro-1(trifluorometil) etil] fenil] 1,2-benzenodicarboxamida (isto é, flubendiamida, CAS Reg. No.: 272451-65-7); (21) Análogos de nereistoxina tais como oxalato de hidrogênio de tiociclo e tiossultap-sódio; (22) biológicos, hormônios ou feromônios, como azadiractina, Bacillus spec, Beauveria spec, codlemone, Metarrhizium spec, Paecilomyces spec, thuringiensis e Verticillium spec., (23) compostos ativos com mecanismos desconhecidos ou não especificados de ação como fumigantes, inibidores de alimentação seletiva, inibidores de crescimento de ácaros, amidoflumet; benclothiaz, benzoximato, bifenazato, bromopropilato, buprofezina, chinomethioat, clordimeforme, clorbenzilato, cloropicrina, clothiazoben, ciclopreno, ciflumetofeno, diciclanil, fenoxacrim, fentrifanil, flubenzimina, flufenerim, flutenzin, gossiplure, hidrametilnona, japonilure, metoxadiazone, petróleo, butóxido de piperonil, potássio oleato, pirafluprole, piridalil, piriprol, sulfluramida, tetradifona, tetrasul, triarateno, verbutin, além disso, o composto propilcarbamato de 3-metilfenil (Tsumacide Z), o composto 3(5-cloro-3-piridinil) -8(2,2, 2-trifluoroetil) -8-azabiciclo [3.2.1] octa NE-3-carbonitrila (CAS reg. No. 185982-80-3) e os correspondentes 3-endo isômero (CAS reg. No. 185984-60-5) (cf. WO 96/37494, WO 98/25923), e também preparações que compreendem extratos de plantas inseticidas eficazes, nematoides, fungos ou vírus. Os exemplos adequados de fumigantes incluem o fosforeto de alumínio, brometo de metil e fluoreto de sulfuril. Os exemplos adequados de inibidores de alimentação seletiva incluem criolita, flonicamide e pimetrozina. Os exemplos adequados de inibidores de crescimento de ácaros incluem clofentezina, etoxazol e hexythiazox.
[00649] Comercialmente disponíveis incluem ingredientes nematicidas abamectina (Comercialmente disponível a partir de Syngenta sob o nome comercial Avicta).
[00650] Se uma formulação, uma semente de planta ou um inóculo compreender um herbicida, o herbicida pode compreender 2,4-D, 2,4DB, acetocloro, acifluorfeno, alacloro, ametrina, atrazina, aminopiralida, benefin, bensulfurão, bensulida, bentazona, bromacil, bromoxinil, butilato, carfentrazona, clorimurão, clorsulfurão, cletodim, clomazona, clopiralida, cloransulam, cicloato, DCPA, desmedifame, dicamba, diclobenil, diclofop, diclosulam, diflufenzopir, dimetenamida, diquat, diuron, DSMA, endotal, EPTC, etalfluralina, fenoxaprop, fluazifop-P, flucarbazona, flufenacet, flumetsulam, flumiclorac, flumioxazina, fluometurão, fluroxipir, fomesafeno, foramsulfurão, glufosinato, glifosato, halosulfurão, hexazinona, imazamatabenze, imazamato, imazapic, imazaquin, imazethapyr, isoxabeno, isoxaflutole, lactofena, linurão, MCPA, MCPB, mesotriona, metolacloro, metribuzina, metsulfurão, molinato, MSMA, napropamida, naptalam, nicossulfurão, norflurazão, orizazina, oxadiazão, oxifluorfeno, Paraquat, ácido pelargónico, pendimetalina, fenmedipam, picloram, primisulfurão, prodiamina, prometrina, pronamida, propanil, prosulfurão, pirazona, piritobac, quinclorac, quizalofop, rimsulfurão, setoxidim, sidurão, simazina, sulfentrazona, sulfometurão, sulfossulfurão, tebuturão, terbacil, tiazopir, tifensulfurão, tiobencarb, tralcoxidim, trialato, triasulfurão, tribenurão, triclopir, trifluralina, triflusulfurão, ou uma sua combinação.
[00651] O herbicida pode compreender um composto clorofenoxi, um composto nitrofenólico, um composto nitrocresólico, um composto de dipiridil, uma acetamida, um ácido alifático, uma anilida, uma benzamida, um ácido benzoico, um derivado de ácido benzoico, o ácido anísico, um derivado de ácido anísico, um benzonitril, dióxido de benzotiadiazinona, um tiocarbamato, um carbamato, um carbanilato, cloropiridinil, um derivado de ciclo-hexanona, um derivado dinitroaminobenzeno, um composto fluorodinitrotoluidina, isoxazolidinona, ácido nicotínico, isopropilamina, um derivado de isopropilamina, oxadiazolinone, um fosfato, um ftalato, um composto de ácido picolínico, uma triazina, um triazole, um uracil, um derivado de ureia, endotal, clorato de sódio, uma sulfonilureia, um aril de triazina, ou uma combinação dos mesmos.
[00652] A formulação pode compreender um herbicida e uma cepa de bactérias que é capaz de degradar o herbicida.
[00653] A cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida pode compreender o membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), o membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121), ou uma combinação dos mesmos.
[00654] O herbicida a ser degradado pode compreender uma sulfonilureia tal como sulfentrazona, uma triazina aril, dicamba, um herbicida fenoxi, 2,4-D, uma piretrina, um piretroide, ou uma combinação dos mesmos.
[00655] Os ligantes podem ser incluídos nas formulações, tais como carboximetilcelulose e polímeros naturais e sintéticos na forma de pós, grânulos ou látices, tais como goma arábica, quitina, álcool polivinílico e acetato de polivinil, assim como fosfolipídios naturais, tais como cefalinas e lecitinas, e fosfolipídios sintéticos. Ligantes incluem aqueles compostos de preferência de um polímero adesivo que pode ser natural ou sintético, sem efeito fitotóxico sobre a semente a ser revestida. Os aglutinantes adicionais que podem ser incluídos, sozinhos ou em combinação, incluem, por exemplo, poliésteres, ésteres de poliéter, polianidridos, poliuretanos de poliéster, amidas de poliéster; acetatos de polivinil; copolímeros de acetato de polivinilo; álcoois polivinílicos e tilose; copolímeros de álcool polivinílico; polivinilpirrolidonas; Polissacarídeos, incluindo amidos, amidos modificados e derivados de amido, dextrinas, maltodextrinas, alginatos, quitosanos e celuloses, ésteres de celulose, éteres de celulose e ésteres de éter de celulose incluindo etilceluloses, metilceluloses, hidroximetilceluloses, hidroxipropilceluloses e carboximetilcelulose; gorduras; óleos; proteínas, incluindo caseína, gelatina e zeínas; goma arábica; shellacs; Copolímeros de cloreto de vinilideno e cloreto de vinilideno; lignosulfonatos, em particular lignossulfonatos de cálcio; poliacrilatos, polimetacrilatos e copolímeros acrílicos; polivinilacrilatos; óxido de polietileno; polibutenos, poliisobutenos, poliestireno, polibutadieno, polietilenoaminas, polietilenamidas; polímeros e copolímeros de acrilamida; acrilato de polihidroxietil, monômeros de metilacrilamida; e policloropreno.
[00656] Uma variedade de corantes pode ser empregue, incluindo os cromóforos orgânicos classificados como nitroso, nitro, azo, incluindo monoazo, bisazo, e poliazo, difenilmetano, triarilmetano, xanteno, metano, acridina, tiazole, tiazina, indamine, indofenol, azina, oxazina, antraquinona e ftalocianina.
[00657] Outros aditivos que podem ser adicionados incluem nutrientes vestigiais tais como sais de ferro, manganês, boro, cobre, cobalto, molibdênio e zinco.
[00658] Um ou mais conservantes (por exemplo, agentes antimicrobianos ou de outros agentes biocidas) também podem ser incluídos para a preservação e estabilização da formulação. Exemplos de bactericidas adequados incluem aqueles baseados em diclorofeno e benzílico hemi formais (Proxel® de ICI ou Acticide® RS de Thor Chemie e Kathon® MK de Dow Chemical) e derivados de isotiazolinona como alquilisotiazolinonas e benzisotiazolinonas (MBS Acticide® de Thor Chemie). Como exemplos adicionais, conservantes adequados incluem MIT (2metil-4-isotiazolin-3-ona), BIT (1, 2-benzisotiazolin-3ona, que pode ser obtido a partir de Avecia, Inc. como Proxel GXL como uma solução em hidróxido de sódio e dipropileno-glicol), 5-cloro-2(4-clorobenzil) -3 (2H) -isotiazolona, a 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3ona, 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3-ona, 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3ona-cloridrato, de 4,5-dicloro-2-ciclo-hexil-4isotiazolin-3-ona, 4,5dicloro 2-octil-2H-isotiazol-3-ona, 2-metil-2Hisotiazol-3-ona, 2-metil2H-isotiazol-3-ona-cálcio complexo de cloreto, 2octil-2H-isotiazol-3e um álcool benzílico hemiformal.
[00659] Exemplos de agentes espessantes adequados para as for-mulações incluem polissacarídeos, argilas orgânicas, ou um polímero solúvel em água que exibe propriedades pseudoplásticas em um meio aquoso, tal como, por exemplo, goma arábica, goma de karaya, goma de tragacanto, goma de guar, goma de alfarroba, goma xantana, carragenina, alginato de sal, caseína, dextrano, pectina, agar, amido de 2hidroxietil, 2aminoetil amido, 2-hidroxi etil celulose, metil celulose, sal de carboximetil celulose, sal de sulfato de celulose, poliacrilamida, sais de metal alcalino do copolímeros de anidrido maleico, os seus sais de metais alcalinos de poli (met) acrilato.
[00660] Ingredientes anticongelantes adequados para a formulação incluem, por exemplo, e sem limitação, etileno glicol, 1, glicol, 1, 3propileno glicol, 1, 2-butanodiol, 1, 3-butanodiol, 1, 4-butanodiol, 1 2propileno, 4-pentanodiol, 3-metil-1, 5-pentanodiol, 2,3-dimetil-2,3butanodiol, trimetilolpropano, manitol, sorbitol, glicerol, pentaeritritol, 1,4-ciclo-hexanodimetanol, xilenol, bisfenóis, tais como bisfenol A ou semelhantes. Além disso, éter álcoois, tais como dietileno glicol, trietileno glicol, tetraetileno glicol, polioxietileno ou glicóis de polioxipropileno de peso molecular até cerca de 4000, dietileno glicol monometílico, éter monoetílico de dietilenoglicol, trietileno glicol monometílico, butoxietanol, butileno glicol monobutílico, dipentaeritritol, tripentaeritritol, tetrapentaeritritol, diglicerol, triglicerol, tetraglicerol, pentaglicerol, hexaglicerol, heptaglicerol, octaglicerol e suas combinações.
XVIII. SEMENTES DE PLANTAS
[00661] A presente invenção se refere ainda a sementes vegetais revestidas com qualquer dos recombinantes membros da família Bacillus cereus aqui descrito, com qualquer uma das bactérias formadoras de esporos recombinantes aqui descritos, com qualquer uma das culturas bacterianas biologicamente puras aqui descritas, com qualquer um dos inóculos aqui descritos, com qualquer enzima que catalisa a produção de óxido nítrico, com qualquer micro-organismo recombinante que expressa uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico, ou com qualquer das outras do que as vacinas formulações tal como aqui descrito.
XIX.MÉTODOS RELATIVOS AOS VEGETAIS E SEMENTES DE PLANTAS, MÉTODOS PARA ATRASAR GERMINAÇÃO DE UM ESPORO DE UM MEMBRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE, E MÉTODOS PARA PRODUZIR E UTILIZAR FRAGMENTOS EXOSPORIUM
[00662] A presente invenção se refere ainda a métodos para estimular o crescimento das plantas, os métodos para proteger uma planta a partir de um agente patogênico ou melhorar a resistência ao stress de uma planta, métodos para imobilizar esporos de membros da família Bacillus cereus recombinantes ou bactérias formadoras de es-poros recombinantes em uma planta, métodos para a estimulação de germinação de uma semente de planta, métodos para a entrega de ácidos nucleicos para as plantas, métodos para atrasar a germinação de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante, os métodos para produzir e utilizar fragmentos exosporium, e métodos para a entrega de bactérias benéficas para animais.
109.A. Métodos para a estimulação do crescimento das plantas
[00663] A presente invenção se refere a métodos para estimular o crescimento das plantas.
[00664] Um método para estimular o crescimento das plantas da presente invenção compreende introduzir um meio de crescimento de plantas de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante descrito acima ou qualquer uma das formulações compreendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante descrito acima. Em alternativa, qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes descrito acima ou qualquer uma das formulações compreendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante acima descrito pode ser aplicado a uma planta, uma semente de planta, ou a uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Em tais métodos, o membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende um estimulante do crescimento de plantas proteína ou peptídeo. O crescimento da planta estimulando a proteína ou peptídeo pode ser ligado fisicamente ao exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante.
[00665] Um outro método para estimular o crescimento de plantas compreende a introdução de um meio de crescimento de plantas de qualquer das bactérias formadoras de esporos recombinantes descritos acima ou qualquer uma das formulações que compreendem uma bactéria formadora de esporos recombinante descrito acima. Em alternativa, qualquer uma das bactérias formadoras de esporos recombinantes descritas acima ou qualquer uma das formulações que compreendem uma bactéria recombinante formadora de esporos descrita acima pode ser aplicada a uma planta, uma semente de planta, ou a uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Em tais métodos, a bactéria formadora de esporos recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende um estimulante do crescimento de plantas proteína ou peptídeo. A proteína estimuladora do crescimento de plantas ou peptídeo pode ser ligado fisicamente ao revestimento de esporos da bactéria formadora de esporos recombinante.
[00666] Ainda um outro método para estimular o crescimento da planta compreende introduzir um meio de crescimento de plantas num membro da família recombinante de Bacillus cereus ou de uma formulação compreendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante. Alternativamente, o membro da família Bacillus cereus recombinante ou a formulação pode ser aplicada a uma planta, uma semente de planta, ou a uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. O membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma enzima envolvida na solubilização de nutrientes, uma protease, uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína CotE uma proteína CotO, uma proteína ExsY, uma proteína ExsFA/BxpB, uma proteína CotY, uma proteína ExsFB, uma proteína ExsJ, uma proteína ExsH, uma proteína YjcA, uma proteína YjcB, uma proteína BclC, uma proteína BxpA, uma proteína BclE, uma proteína BetA/BAS3290, uma proteína ExsA, uma proteína ExsK, uma proteína ExsB, uma proteína YabG, ou uma proteína Tgl, em que a expressão da enzima, em que a expressão da enzima envolvida na solubilização de nutrientes, a pro tease, uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína CotE uma proteína CotO, uma proteína ExsY, uma proteína ExsFA/BxpB, uma proteína CotY, uma proteína ExsFB, uma proteína ExsJ, uma proteína ExsH, uma proteína YjcA, uma proteína YjcB, uma proteína BclC, uma proteína BxpA, uma proteína BclE, uma proteína BetA/BAS3290, uma proteína ExsA, uma proteína ExsK, uma proteína ExsB, uma proteína YabG, ou uma proteína Tgl é aumentada em comparação com a ex-pressão da enzima envolvida na solubilização de nutrientes, a protease, uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína CotE uma proteína CotO, uma proteína ExsY, uma proteína ExsFA/BxpB, uma proteína CotY, um ExsFB proteína, uma proteína ExsJ, uma proteína ExsH, uma proteína YjcA, uma proteína YjcB, uma proteína BCLC, uma proteína BxpA, uma proteína BclE, uma proteína beta/BAS3290, uma proteína ExsA, uma proteína ExsK, uma proteína ExsB, uma proteína YabG, ou uma proteína Tgl em um membro da família Bacillus cereus do tipo selvagem sob as mesmas condições.
[00667] Métodos adicionais para estimular o crescimento das plantas, que envolvem a utilização de fragmentos exosporium derivado de um membro da família Bacillus cereus recombinante, são descritos a seguir.
110. B. Métodos para proteger uma planta de um patógeno ou melhorar a resistência ao estresse em uma planta
[00668] A presente invenção também se refere a métodos para a proteger uma planta a partir de um agente patogênico ou melhorar a resistência ao stress de uma planta.
[00669] Um método para proteger uma planta a partir de um agente patogênico ou melhorar a resistência ao stress de uma planta compre-ende introduzir num meio de crescimento de plantas de quaisquer membros da família Bacillus cereus recombinantes descrito acima ou qualquer uma das formulações compreendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante descrito acima. Em alternativa, qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes descrito acima ou qualquer uma das formulações compreendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante acima descrito pode ser aplicado a uma planta, uma semente de planta, ou a uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Em tais métodos, o membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico ou de uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta. A proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um patógeno ou a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta pode ser fisicamente ligada ao exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante.
[00670] Outro método para proteger uma planta a partir de um agente patogênico ou melhorar a resistência ao stress de uma planta compreende a introdução de um meio de crescimento da planta qualquer das bactérias formadoras de esporos recombinantes descritos acima ou qualquer uma das formulações que compreendem umA bactéria recombinante formadora de esporos descrito acima. Em alternativa, qualquer uma das bactérias formadoras de esporos recombinantes descritas acima ou qualquer uma das formulações que compreendem uma bactéria recombinante formadora de esporos descrita acima pode ser aplicada a uma planta, uma semente de planta, ou a uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Em tais métodos, A bactéria recombinante formadora de esporos expressa uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico ou de uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta. A proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um patógeno ou a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta pode ser fisicamente ligada ao revestimento de esporos da bactéria recombinante formadora de esporos.
[00671] Em qualquer um dos métodos para a proteção de uma planta a partir de um agente patogênico, as plantas cultivadas no meio de crescimento de plantas que compreende o membro da família Bacillus cereus recombinante ou A bactéria recombinante formadora de esporos são, preferivelmente, menos susceptíveis à infecção com o agente patogênico, em comparação com as plantas crescidas sob as mesmas condições no meio de crescimento da planta idêntica que não contém o membro da família Bacillus cereus recombinante ou A bactéria recombinante formadora de esporos.
[00672] Em qualquer um dos métodos para aumentar a resistência ao stress em planta de plantas cultivadas no meio de crescimento de plantas que compreende o membro da família Bacillus cereus recombinante ou A bactéria recombinante formadora de esporos são, preferivelmente, menos susceptível ao stress, em comparação com as plantas crescidas sob as mesmas condições no meio de crescimento da planta idêntica que não contém o membro da família Bacillus cereus recombinante ou A bactéria recombinante formadora de esporos.
[00673] Outro método para melhorar a resistência ao stress de uma planta compreende introduzir num meio de crescimento de plantas um membro da família Bacillus cereus recombinante ou de uma formulação compreendendo o membro da família Bacillus cereus recombinante. Alternativamente, o recombinante Bacillus cereus ou a formulação pode ser aplicada a uma planta, uma semente de planta, ou a uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. O membro da família Bacillus cereus recombinante expressa um superóxidodismutase ou uma arginase, em que a expressão da superóxidodismutase ou arginase é aumentada como comparado com a expressão da superóxido-dismutase ou a arginase em um membro da família do tipo selvagem Bacillus cereus sob as mesmas condições.
[00674] Outro método para proteger uma planta de um agente patogênico compreende a introdução num meio de crescimento de plantas de um meio recombinante Bacillus cereus ou de uma formulação compreendendo o membro da família Bacillus cereus recombinante. Alternativamente, o recombinante Bacillus cereus ou a formulação pode ser aplicada a uma planta, uma semente de planta, ou a uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. O membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma protease, em que a expressão da protease é aumentada em comparação com a expressão da protease num membro da família de tipo selvagem Bacillus cereus sob as mesmas condições.
[00675] Métodos adicionais para proteger uma planta a partir de um agente patogênico ou melhorar a resistência ao stress de uma planta, que envolve a utilização de fragmentos exosporium derivado do membro da família Bacillus cereus recombinante, são descritos a seguir.
111. C. Métodos para imobilizar esporos de membros da famíliaBacillus cereus recombinantes ou bactérias formadoras de esporos recombinantes numa planta
[00676] A presente invenção se refere ainda a métodos para imobilizar esporos de membros da família Bacillus cereus recombinantes ou bactérias formadoras de esporos recombinantes numa planta.
[00677] Um método para imobilizar um esporo de membro da famí-liaBacillus cereus recombinante numa planta compreende a introdução num meio de crescimento de plantas de qualquer dos membros da família Bacillus cereus recombinante descritos acima ou quaisquer das formulações compreendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante descrito acima. Em alternativa, qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes descrito acima ou qualquer uma das formulações compreendendo um membro da família Ba-cillus cereus recombinante acima descrito pode ser aplicado a uma planta, uma semente de planta, ou a uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Em tais métodos, o membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo de ligação à planta. O cresci-mento da planta estimulando a proteína ou peptídeo pode ser ligado fisicamente ao exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante.
[00678] Outro método para a imobilização de um esporo de uma bactéria formadora de esporos recombinante numa instalação compreende a introdução num meio de crescimento de plantas de qualquer das bactérias formadoras de esporos recombinantes descritos acima ou qualquer uma das formulações que compreendem uma bactéria formadora de esporos recombinante descrito acima. Em alternativa, qualquer uma das bactérias formadoras de esporos recombinantes descritas acima ou qualquer uma das formulações que compreendem uma bactéria recombinante formadora de esporos descrita acima pode ser aplicada a uma planta, uma semente de planta, ou a uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Em tais métodos, a bactéria formadora de esporos recombinante expressa uma proteína de fusão compreendendo um peptídeo de ligação à planta e a proteína ou peptídeo de ligação à planta pode ser fisicamente ligada ao revestimento de esporos da bactéria formadora de esporos recombinante.
[00679] A planta proteína ou peptídeo de ligação de preferência se-letivamente alvejando e mantendo o membro da família Bacillus cereus recombinante ou a bactéria em forma de esporos recombinante em uma planta. Por exemplo, a proteína de ligação á planta ou peptídeo pode seletivamente alvejando e mantendo o membro da família Bacillus cereus recombinante em pelas raízes das plantas, as subestruturas de raízes, uma parte aérea de uma planta, ou a uma subestrutura de uma parte aérea de uma planta.
D.Métodos para estimular a germinação de uma semente da planta 1. Os métodos para a estimulação de germinação envolvendo a utilização de um membro da família Bacillus cereus recombinante de uma bactéria em forma de esporos recombinantes
[00680] A presente invenção também fornece métodos para a esti-mulação de germinação de uma semente da planta.
[00681] Um método para estimular germinação de uma semente de plantas compreende a introdução num meio de crescimento de plantas de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante descrito acima ou qualquer uma das formulações compreendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante descrito acima. Em alternativa, qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes descrito acima ou qualquer uma das formulações com-preendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante acima descrito pode ser aplicado a uma planta, uma semente de planta, ou a uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Em tais métodos, o membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico. A enzima que catalisa a produção de óxido nítrico, pode ser fisicamente ligada ao exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante.
[00682] Um outro método para estimular a germinação de uma semente de planta o crescimento de plantas compreendendo a introdução de um meio de crescimento de plantas de qualquer das bactérias formadoras de esporos recombinantes descritos acima ou qualquer uma das formulações que compreendem uma bactéria formadora de esporos recombinante descrito acima. Em alternativa, qualquer uma das bactérias formadoras de esporos recombinantes descritas acima ou qualquer uma das formulações que compreendem uma bactéria recombinante formadora de esporos descrita acima pode ser aplicada a uma planta, uma semente de planta, ou a uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Em tais métodos, a bactéria formadora de esporos recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico, e a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico, pode ser fisicamente ligada ao revestimento de esporos da bactéria recombinante formadora de esporos.
[00683] Os métodos acima para estimular a germinação de uma semente de planta de preferência compreendem a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, a bactéria formadora de esporos recombinante, ou a formulação de uma semente de planta.
[00684] Qualquer dos métodos acima mencionados para estimular a germinação de uma semente de planta pode ainda compreender a aplicação de um substrato para a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico para o meio de crescimento da planta, a semente da planta, a planta, ou a área que circunda a planta ou a semente da planta. Por exemplo, o método compreende a adição de ainda mais apropriadamente de L-arginina para o meio de crescimento da planta, a semente da planta, a planta, ou a área que circunda a planta ou a semente da planta. Por exemplo, a L-arginina pode ser aplicada a uma parte da aérea da planta. A L-arginina é de preferência aplicada à semente da planta.
[00685] A presença de L-arginina aumenta a reação e conduz a uma produção mais pronunciada de NO pela de sintase óxido nítrico. Além disso, a L-arginina em sementes de plantas, um meio de crescimento de plantas, ou uma área em torno de uma planta pode servir como um substrato para a produção de óxido nítrico por enzimas bacterianas nativas.
[00686] Em qualquer um dos métodos acima para estimular a germinação de uma semente de planta, sementes no meio de crescimento de plantas compreendendo o membro da família de Bacillus cereus recombinante ou a bactéria ou sementes recombinantes formadoras de esporos ao qual o membro da família de Bacillus cereus recombinante ou o formador de esporos recombinante preferencialmente têm uma taxa de germinação aumentada em comparação com as sementes cultivadas nas mesmas condições no meio de crescimento de planta idêntico que não contém o membro da família de Bacillus cereus recombinante ou a bactéria ou sementes recombinantes formadoras de esporos aos quais o membro da família Bacillus cereus recombinante ou a bactéria recombinante formadora de esporos não foi aplicada, cultivada nas mesmas condições.
[00687] Em qualquer um dos métodos acima para estimular a germinação de uma semente de planta, as sementes no meio de crescimento de plantas compreendendo o membro da família de Bacillus cereus recombinante ou a bactéria ou sementes recombinantes formadoras de esporos ao qual o membro da família de Bacillus cereus recombinante ou o formador de esporos recombinante preferencialmente têm uma raiz posterior mais longa depois da germinação em comparação com as sementes crescidas nas mesmas condições no meio de crescimento de planta idêntico que não contém o membro da família Bacillus cereus recombinante ou a bactéria ou sementes recombinantes formadoras de esporos aos quais o Bacillus cereus recombinante ou a bactéria recombinante formadora de esporos não foi aplicada nas mesmas condições.
[00688] Métodos adicionais para estimular a germinação de uma semente de plantas, envolvendo a utilização de fragmentos exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus recombinante, são descritos abaixo. 2. Métodos para estimular a germinação através da entrega de plantas enzimas que catalisam a produção de óxido nítrico ou micro-organismos recombinantes que sobre-expressam tais enzimas
[00689] Ainda outro método para estimular a germinação de uma semente de planta compreende a introdução num meio de crescimento de plantas ou a aplicação a uma planta, uma semente de planta ou uma área que rodeia uma planta ou uma semente de planta: (i) uma enzima que catalisa a produção de nítrico óxido; (ii) uma superóxidodismutase; ou (iii) um micro-organismo recombinante que expressa uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou uma superóxido-dismutase, em que a expressão da enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou a superóxido-dismutase é aumentada em comparação com a expressão da enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou a superóxido-dismutase num micro-organismo de tipo selvagem nas mesmas condições.
[00690] O método preferencialmente compreende a aplicação da enzima ou do micro-organismo a uma semente de planta.
[00691] Os métodos podem ainda compreender a aplicação de um substrato para a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico para o meio de crescimento da planta, a semente da planta, a planta, ou a área que circunda a planta ou a semente da planta. Por exemplo, o método compreende a adição de ainda mais apropriadamente de Larginina para o meio de crescimento da planta, a semente da planta, a planta, ou a área que circunda a planta ou a semente da planta. Por exemplo, a L-arginina pode ser aplicada a uma parte da aérea da planta. A L-arginina é de preferência aplicada à semente da planta.
[00692] As sementes no meio de crescimento de plantas compreendendo a enzima ou o micro-organismo ou sementes às quais a enzima ou o micro-organismo foram aplicados têm preferencialmente uma taxa de germinação aumentada em comparação com sementes crescidas nas mesmas condições no meio de crescimento de planta idêntico que não contém enzima ou o micro-organismo ou sementes aos quais a enzima ou o micro-organismo não foi aplicado, cresceu sob as mesmas condições.
[00693] As sementes no meio de crescimento de plantas compreendendo a enzima ou o micro-organismo ou sementes às quais a enzima ou o micro-organismo foram aplicados têm preferencialmente uma raiz posterior mais longa depois da germinação em comparação com sementes crescidas nas mesmas condições no meio de crescimento de planta idêntico que não contém a enzima ou o microorganismo ou sementes aos quais a enzima ou o micro-organismo não foi aplicado nas mesmas condições.
[00694] A enzima que catalisa a produção de sintase de óxido nítrico podem compreender uma sintase de óxido nítrico ou uma arginase. Quando a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico compreende uma sintase de óxido nítrico, a sintase de óxido nítrico pode com-preender, por exemplo, uma sintase de óxido nítrico de Bacillus thuringiensis BT013A ou Bacillus subtilis 168. Por exemplo, a sintase de óxido nítrico pode ter pelo menos 85 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00695] A sintase do óxido nítrico pode ter pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00696] A sintase do óxido nítrico pode ter pelo menos 95 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00697] Por exemplo, a sintase de óxido nítrico pode ter pelo menos 98 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00698] A sintase do óxido nítrico pode ter pelo menos 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00699] A sintase do óxido nítrico pode ter 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[00700] A superóxido-dismutase pode compreender uma superóxido-dismutase 1 (SODA1) ou um superóxido-dismutase 2 (SODA2). A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85 % de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00701] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90 % de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00702] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95 % de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00703] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00704] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00705] A superóxido-dismutase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 100 % de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[00706] O micro-organismo recombinante que expressa uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico pode compreender um Bacillusespécies (por exemplo, um membro da família Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, ou Bacillus megaterium), Escherechia coli, a Aspergillusespécies (por exemplo, Aspergillus niger), ou um Sacchromycesespécies (por exemplo, Sacchromyces cerevisiae).
[00707] Em qualquer dos métodos acima, a enzima ou o microorganismo recombinante pode ser introduzido no meio de crescimento de plantas, ou aplicado a uma planta, uma semente de planta ou uma área que rodeia uma planta ou uma semente de planta numa formulação compreendendo a enzima ou o micro-organismo recombinante e um transportador aceitável em agricultura. A formulação pode compreender qualquer um dos veículos aceitáveis em agricultura e os outros componentes aqui discutidos.
[00708] A enzima que catalisa a produção de óxido nítrico pode ser entregue purificada ou não purificada, e pode ser entregue por si só ou em combinação com outras proteínas benéficas, inoculantes, ou pro-dutosquímicos à semente da planta, o meio de crescimento da planta, ou uma área em torno da planta ou a semente da planta.
112. E. Métodos para a entrega de ácidos nucleicos para as plantas
[00709] Os métodos para a entrega de ácidos nucleicos para as plantas são também fornecidos pela presente invenção.
[00710] Um método para distribuir ácidos nucleicos a uma planta compreende a introdução num meio de crescimento de plantas de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante descrito acima ou qualquer uma das formulações compreendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante descrito acima. Em alternativa, qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes descrito acima ou qualquer uma das formulações com-preendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante acima descrito pode ser aplicado a uma planta, uma semente de planta, ou a uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Em tais métodos, o membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende uma proteína de ligação de ácido nucleico. A proteína ou peptídeo de ligação de ácido nucleico está ligado a uma molécula de ácido nucleico. O crescimento do ácido nucleico estimulando a proteína ou peptídeo pode ser ligado fisicamente ao exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante.
[00711] Em tais métodos, o membro da família Bacillus cereus recombinante podem compreender uma cepa endofíticos de bactérias. A cepa de bactérias endofíticas podem compreender membros da família Bacillus cereus EE349, membros da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, ou Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, membro da família Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, ou Bacillus mycoides EE-B00363. Por exemplo, a cepa endofítica de bactérias pode compreender membros da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, membro da família Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EEB00366 ou Bacillus Mycoides EE-B00363.
[00712] Outro método para distribuir ácidos nucleicos a uma planta compreende a introdução num meio de crescimento de plantas de qualquer das bactérias formadoras de esporos recombinantes descritos acima ou qualquer uma das formulações que compreendem uma bactéria formadora de esporos recombinante descrito acima. Em alternativa, qualquer uma das bactérias formadoras de esporos recombinantes descritas acima ou qualquer uma das formulações que compreendem uma bactéria recombinante formadora de esporos descrita acima pode ser aplicada a uma planta, uma semente de planta, ou a uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Em tais métodos, a bactéria formadora de esporos recombinante expressa uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de ligação do ácido nucleico. A proteína ou peptídeo de ligação de ácido nucleico está ligado a uma molécula de ácido nucleico. A proteína ou peptídeo de ligação do ácido nucleico pode ser fisicamente ligada ao revestimento de esporos da bactéria formadora de esporos recombinante.
[00713] A bactéria recombinante formadora de esporos pode com-preender uma cepa endofítica de bactérias. Por exemplo, a cepa endofítica de bactérias pode compreender Bacillus megaterium EE385, Ba-cillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, Lysinibacillus sphericus EE443, ou Bacillus pumilus EE-B00143.
[00714] Em qualquer dos métodos acima para distribuir ácidos nucleicos a uma planta, a molécula de ácido nucleico pode compreender uma molécula de RNA moduladora; uma molécula de RNAi; um microRNA; um aptâmero; ou uma molécula de DNA que codifica uma molécula de RNA moduladora, uma molécula de RNAi, um microRNA, ou um aptâmero.
[00715] As moléculas de ácido nucleico a serem fornecidas à planta podem ser produzidas por qualquer meio conhecido da técnica (por exemplo, síntese química, produção recombinante por um micro-organismo, etc). As moléculas de ácido nucleico podem então ser liga-dasà proteína de ligação a ácido nucleico ou à porção peptídica das proteínas de fusão aqui descritas na preparação para a distribuição de tais ácidos nucleicos a uma planta ou plantas. As proteínas e peptídeos de ligação a ácidos nucleicos imobilizam e estabilizam os ácidos nucleicos e permitem que sejam entregues intactos na planta. As mo-léculas de ácido nucleico a serem entregues à planta podem estar numa forma ativa, ou numa forma inativa que pode ser processada para uma forma ativa pela planta.
[00716] Para realizar a ligação das moléculas de ácido nucleico à proteína ou peptídeo de ligação de ácido nucleico, as moléculas de ácidos nucleicos podem ser incubadas com qualquer dos membros recombinantes de Bacillus cereus ou bactérias recombinantes formadoras de esporos aqui descritas que expressam uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou um peptídeo de ligação do ácido nucleico.
[00717] Métodos adicionais para distribuir ácidos nucleicos a uma planta, envolvendo a utilização de fragmentos exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus recombinante, são descritos abaixo.
113. F. Métodos para atrasar a germinação de um esporo de um membro da famíliaBacillus cereus recombinante
[00718] A presente invenção se refere ainda a um método para retardar a germinação de um esporo de um membro da família Bacillus cereus. O método compreende modificar o membro da família Bacillus cereus de expressar uma hidrolase de inosina-uridina ou uma alanina racemase, em que a expressão da hidrolase de inosina-uridina ou a alanina racemase é aumentada em comparação com a expressão da hidrolase de inosina-uridina ou a alanina racemase num membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem nas mesmas condições.
114. G. A inativação do membro da família Bacillus cereus ou bactéria formadora de esporos recombinante antes da utilização
[00719] Em qualquer dos métodos acima que utilizam um membro da família Bacillus cereus recombinante ou uma bactéria recombinante formadora de esporos, o método pode ainda compreender inativar o membro da família Bacillus cereus recombinante ou a bactéria recombinante formadora de esporos antes da introdução no meio de crescimento vegetal ou aplicação para uma planta, uma semente de planta, ou uma área que cerca uma planta ou uma semente de planta.
[00720] Por exemplo, a inativação pode compreender submeter o membro da família Bacillus cereus recombinante ou a bactéria formadora de esporos recombinante a tratamento térmico; irradiação gama; irradiação de raios-x; irradiação UV-A; irradiação UV-B; tratamento com glutaraldeído, formaldeído, peróxido de hidrogênio, ácido acético, água sanitária, clorofórmio, ou fenol, ou uma combinação dos mesmos.
[00721] Em alternativa, ou além disso, a inativação pode compreender modificar o membro da família Bacillus cereus recombinante ou uma bactéria formadora de esporos para expressar uma protease germinação de esporos ou uma endonuclease de não específica, em que a expressão da protease de germinação de esporos ou a endonuclease de não específica é aumentada em comparação com a expressão da protease de germinação de esporos ou a endonuclease de não específica em uma de tipo selvagem membro da famíliaBacillus cereus sob as mesmas condições, e em que a bactéria formadora de esporos recombinante compreende uma bactéria recombinante do gêneroBacillus.
115. H. Métodos para fazer e usar fragmentos exosporium
[00722] A presente invenção se refere ainda a métodos para produzir e utilizar fragmentos exosporium. Estes métodos se referem aos membros da família Bacillus cereus recombinantes descritos na Seção IV, acima, isto é, membros recombinantes da família Bacillus cereus que compreendem uma mutação ou outra alteração genética que permite a coleta de exosporium livre.
[00723] Deste modo, a presente invenção se refere a um método para remover exosporium de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante. O método compreende submeter uma suspensão compreendendo qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante descrito na Seção IV acima para centrifugação ou filtração para produzir fragmentos exosporium que são separados dos esporos. Os fragmentos exosporium compreendem a proteína de fusão.
[00724] O método para remover exosporium de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender submeter a suspensão compreendendo os esporos a centrifugação e coletando o sobrenadante, em que o sobrenadante compreende os fragmentos do exosporium e está substancialmente isento de esporos.
[00725] Em alternativa, o método para a remoção de exosporium a partir de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender submeter a suspensão compreendendo os esporos para filtração e coletando o filtrado, em que o filtrado compreende os fragmentos do exosporium e é substancialmente livre de esporos.
[00726] A suspensão de esporos pode ser agitada mecanicamente ou interrompida antes da centrifugação ou filtração.
[00727] Os fragmentos exosporium também podem ser separados a partir dos esporos por centrifugação em gradiente, de purificação por afinidade, ou deixando os esporos sedimentarem-se da suspensão.
[00728] A presente invenção se refere ainda a métodos para utilizar os fragmentos exosporium.
[00729] Um método para estimular o crescimento das plantas é fornecido. O método compreende a introdução de fragmentos exosporium ou uma formulação que compreende os fragmentos exosporium e um veículo aceitável em agricultura para um meio de crescimento da planta. Alternativamente, os fragmentos exosporium ou a formulação pode ser aplicada a uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Os fragmentos exosporium são derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína de fusão compreende um estimulante do crescimento de plantas proteína ou peptídeo.
[00730] Um método para proteger uma planta a partir de um agente patogênico ou melhorar a resistência ao stress de uma planta, também é fornecido. O método compreende a introdução de fragmentos exosporium ou uma formulação que compreende os fragmentos exosporium e um veículo aceitável em agricultura para um meio de crescimento da planta. Alternativamente, os fragmentos exosporium ou a formulação pode ser aplicada a uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Os fragmentos exosporium são derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico ou de uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta.
[00731] Quando o método é um método para proteger uma planta a partir de um agente patogênico, a proteína de fusão compreende a proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um agente patogênico.
[00732] Nos métodos para a proteção de uma planta a partir de um agente patogênico, plantas cultivadas no meio de crescimento de plantas que compreende os fragmentos exosporium são, de preferência menos susceptíveis à infecção com o agente patogênico, em comparação com as plantas crescidas sob as mesmas condições no meio de crescimento da planta idêntica que não contêm os fragmentos exosporium.
[00733] Quando o método é um método para melhorar a resistência ao stress de uma planta, a proteína de fusão compreende uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta.
[00734] Nos métodos para aumentar a resistência ao stress de uma planta, plantas cultivadas no meio de crescimento de plantas que compreende os fragmentos exosporium são, de preferência menos susceptível ao stress, em comparação com as plantas crescidas sob as mesmas condições do meio de crescimento da planta idêntica que não contém os fragmentos exosporium.
[00735] Um método para imobilizar os fragmentos exosporium em uma planta também é fornecido. O método compreende a introdução de fragmentos exosporium ou uma formulação que compreende os fragmentos exosporium e um veículo aceitável em agricultura para um meio de crescimento da planta. Alternativamente, os fragmentos exosporium ou a formulação pode ser aplicada a uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Os fragmentos exosporium são derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma proteína ou peptídeo de ligação à planta.
[00736] A planta proteína ou peptídeo de ligação de preferência alveja seletivamente e mantém os fragmentos exosporium em uma planta. Por exemplo, a proteína de ligação à planta ou peptídeo pode direcionar seletivamente e manter os fragmentos exosporium em raízes de plantas, as subestruturas de raízes, uma parte aérea de uma planta, ou a uma subestrutura de uma parte aérea de uma planta.
[00737] Um método para estimular a germinação de sementes de plantas, também é fornecido. O método compreende a introdução de fragmentos exosporium ou uma formulação que compreende os fragmentos exosporium e um veículo aceitável em agricultura para um meio de crescimento da planta. Alternativamente, os fragmentos exosporium ou a formulação pode ser aplicada a uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Os fragmentos exosporium são derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma superóxido-dismutase ou uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico.
[00738] Nos métodos para estimular a germinação, o método compreende, de preferência aplicar os fragmentos exosporium a uma se-mente de planta.
[00739] Os métodos acima mencionados para estimular a germinação podem ainda compreender a aplicação de um substrato para a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico para o meio de crescimento da planta, a semente da planta, a planta, ou a área que circunda a planta ou a semente da planta. Por exemplo, o método compreende a adição de ainda mais apropriadamente de L-arginina para o meio de crescimento da planta, a semente da planta, a planta, ou a área que circunda a planta ou a semente da planta. Por exemplo, a Larginina pode ser aplicada a uma parte da aérea da planta. A Larginina é de preferência aplicada à semente da planta.
[00740] A presença de L-arginina aumenta a reação e conduz a uma produção mais pronunciada de NO pela de sintase óxido nítrico. Além disso, a L-arginina em sementes de plantas, um meio de crescimento de plantas, ou uma área em torno de uma planta pode servir como um substrato para a produção de óxido nítrico por enzimas bacterianas nativas.
[00741] Nos métodos para estimular a germinação de uma semente de planta, as sementes no meio de crescimento de plantas compreendendo os fragmentos ou sementes de exosporium aos quais os fragmentos exosporium foram aplicados com preferencialmente uma taxa de germinação aumentada em comparação com as mesmas sementes cultivadas nas mesmas condições no meio de crescimento de plantas idêntico que não contém os fragmentos exosporium ou as mesmas sementes cultivadas nas mesmas condições às quais os fragmentos exosporium não foram aplicados.
[00742] Nos métodos para estimular a germinação de uma semente de planta, as sementes no meio de crescimento de plantas compreendendo os fragmentos ou sementes de exosporium aos quais os fragmentos exosporium foram aplicados com preferencialmente têm uma raiz posterior mais longa após a germinação em comparação com as mesmas sementes cultivadas nas mesmas condições no meio de crescimento de plantas idêntico que não contém os fragmentos exosporium ou as mesmas sementes cultivadas nas mesmas condições às quais os fragmentos exosporium não foram aplicados.
[00743] Um método para a entrega de ácidos nucleicos a uma planta também é fornecido. O método compreende a introdução de fragmentos exosporium ou uma formulação que compreende os fragmentos exosporium e um veículo aceitável em agricultura para um meio de crescimento da planta. Alternativamente, os fragmentos exosporium ou a formulação pode ser aplicada a uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta. Os fragmentos exosporium são derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma proteína ou um peptídeo de ligação do ácido nucleico. A proteína ou peptídeo de ligação de ácido nucleico está ligado a uma molécula de ácido nucleico.
[00744] No método acima para distribuir ácidos nucleicos a uma planta, a molécula de ácido nucleico pode compreender uma molécula de RNA moduladora; uma molécula de RNAi; um microRNA; um aptâmero; ou uma molécula de DNA que codifica uma molécula de RNA moduladora, uma molécula de RNAi, um microRNA, ou um aptâmero.
[00745] As moléculas de ácido nucleico a serem fornecidas à planta podem ser produzidas por qualquer meio conhecido da técnica (por exemplo, síntese química, produção recombinante por um microorganismo, etc). As moléculas de ácido nucleico podem então ser ligadasà proteína de ligação a ácido nucleico ou à porção peptídica das proteínas de fusão aqui descritas na preparação para a distribuição de tais ácidos nucleicos a uma planta ou plantas. As proteínas e peptídeos de ligação a ácidos nucleicos imobilizam e estabilizam os ácidos nucleicos e permitem que sejam entregues intactos na planta. As mo-léculas de ácido nucleico a serem entregues à planta podem estar numa forma ativa, ou numa forma inativa que pode ser processada para uma forma ativa pela planta.
[00746] Para realizar a ligação das moléculas de ácido nucleico para a proteína de ligação de ácido nucleico ou peptídeo, as moléculas de ácidos nucleicos podem ser incubadas com os fragmentos exosporium contendo uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de ligação do ácido nucleico.
116. I.Meio de Crescimento das Plantas
[00747] Em qualquer um dos métodos aqui descritos envolvendo o uso de um meio de crescimento da planta, o meio de crescimento de planta pode incluir o solo, água, uma solução aquosa, areia, cascalho, um polissacarídeo, cobertura morta, composto, turfa, palha, troncos, argila, farinha de soja, extrato de levedura, ou uma sua combinação.
[00748] Além disso, o meio de crescimento da planta pode ser su-plementado com um substrato ou um cofator para uma enzima. Por exemplo, o substrato ou o cofator pode compreender triptofano, um monofosfato de adenosina, um difosfato de adenosina, um trifosfato de adenosina (por exemplo, a adenosina-3-trifosfato), indole, um trimetafosfato, ferredoxina, acetoína, diacetil, piruvato, acetolactato, pectina, celulose, metilcelulose, amido, quitina, pectina, uma proteína refeição, um derivado de celulose, um fosfato, acetoína, quitosano, um derivado inativo do ácido indole-3-acético, um derivado inativo do ácido giberélico, xilano, um arabinoxilano, uma gordura, uma cera, um óleo, um ácido fítico, uma lignina, um ácido húmico, colina, um derivado de colina, prolina, um poliprolina, uma proteína rica em prolina, uma refeição rica em prolina, fenilalanina, corismato, L-arginina, NADH, NADPH, ATP, GTP, citocromo C, citocromo P450, ou uma combinação dos mesmos.
J. Métodos de Aplicação
[00749] Os métodos aqui descritos podem compreender sementes de revestimento com o membro da família Bacillus cereus recombinante. A bactéria recombinante formadora de esporos, ou os fragmentos exosporium ou uma formulação contendo o membro da família Bacillus cereus recombinante. A bactéria recombinante formadora de esporos, ou os fragmentos ou exosporium antes da plantação.
[00750] Os métodos aqui descritos podem compreender a aplicação a um membro da família Bacillus cereus recombinante. A bactéria recombinante formadora de esporos, ou os fragmentos exosporium, ou uma formulação contendo o membro da família Bacillus cereus recombinante. A bactéria recombinante formadora de esporos, ou os frag-mentos exosporium a uma porção aérea de uma planta.
[00751] Nos métodos aqui descritos, introduzindo o membro da família Bacillus cereus recombinante. A bactéria recombinante formadora de esporos, ou os fragmentos exosporium para o meio de crescimento da planta pode compreender a aplicação de uma formulação líquida ou sólida contendo o membro da família Bacillus cereus recombinante. A bactéria recombinante formadora de esporos, ou os fragmentos exosporium para o meio. O meio de crescimento vegetal pode compreender solo (por exemplo, solo de envasamento), composto, turfa musgo, areia, mistura de iniciador de sementes, ou uma combinação dos mesmos. O método pode compreender a aplicação da formulação para o meio de crescimento de plantas antes, concorrentemente com, ou após a plantação das sementes, mudas, estacas, bolbos, ou plantas no meio de crescimento da planta.
K. Agroquímicos
[00752] Nos métodos aqui descritos, o método pode ainda compreender a introdução de pelo menos um agroquímico para o meio de crescimento da planta ou aplicação de pelo menos um agroquímico para plantas ou sementes.
[00753] O agroquímico pode compreender um fertilizante (por exemplo, um fertilizante líquido), um material fertilizante com micronutriente (por exemplo, ácido bórico, um borato, uma frita borácica, sulfato de cobre, uma frita de cobre, um quelato de cobre, um tetraborato de sódio decahidratado, um sulfato de ferro, um óxido de ferro, sulfato de ferro e amônio, uma frita de ferro, um quelato de ferro, um sulfato de manganês, um óxido de manganês, um quelato de manganês, um cloreto de manganês, uma frita de manganês, um molibdato de sódio, ácido molibdico, um sulfato de zinco, um óxido de zinco, um carbonato de zinco, uma frita de zinco, fosfato de zinco, um quelato de zinco, ou uma combinação dos mesmos), um inseticida (por exemplo, um organofosfato, um carbamato, um piretroide, um acaricida, um ftalato de alquil, ácido bórico, um borato, um fluoreto, enxofre, uma ureia haloaromática substituída, um hidrocarboneto éster, um inseticida com base biológica, ou uma combinação dos mesmos), um herbicida (por exemplo, um composto clorofenoxi, um composto nitrofenólico, um compos-tonitrocresólico, um composto dipiridil, uma acetamida, um ácido alifático, uma anilida, uma benzamida, um ácido benzoico, um derivado de ácido benzoico, ácido anísico, um derivado de ácido anísico, uma benzonitrila, dióxido de benzotiadiazinona, um tiocarbamato, um carbamato, um carbanilato, cloropiridinil, um derivado de ciclohexenona, um derivado de dinitroaminobenzeno, um composto de fluorodinitrotoluidina, isoxazolidinona, ácido nicotínico, isopropilamina, derivados de isopropilamina, oxadiazolinona, um fosfato, um fhalato, um composto de ácido picolínico, uma triazina, um triazol, um uracil, um derivado de ureia, endotal, clorato de sódio, ou uma combinação dos mesmos), um fungicida (por exemplo, um benzeno substituído, um tiocarbamato, um etileno bis ditiocarbamato, maa tioftalidamida, um composto de sobre, um composto de organomercúrio, um composto de organotina, um composto de cádmio, anilazina, benomil, ciclohexamida, dodina, etridiazol, iprodiona, metlaxil, thiamimefon, triforina, ou uma combinação dos mesmos), um moluscicida, um algicida, uma correção de crescimento de planta, um inoculante bacteriano (por exemplo, um inoculante bacteriano do gênero Rhizobium, um inoculante bacteriano do gêne-roBradyrhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Mesorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Azorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Allorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Sinorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Kluyvera, um inoculante bacteriano do gênero Azotobacter, um inoculante bacteriano do gênero Pseudomonas, um inoculante bacteriano do gênero Azospirillium, um inoculante bacteriano do gênero Bacillus, um inoculante bacteriano do gênero Streptomyces, um inoculante bacteriano do gênero Paenibacillus, um inoculante bacteriano do gênero Paracoccus, um inoculante bacteriano do gênero Enterobacter, um inoculante bacteriano do gênero Alcaligenes, um inoculante bacteriano do gênero Mycobacterium, um inoculante bacteriano do gênero Trichoderma, um inoculante bacteriano do gênero Gliocladium, um inoculante bacteriano do gênero Glomus, um inoculante bacteriano do gênero Klebsiella, ou uma combinação dos mesmos), um inoculante fúngico (por exemplo, um inoculante fúngico da família Glomeraceae, um inoculante fúngico da família Claroidoglomeraceae, um inoculante fúngico da família Gigasporaceae, um inoculante fúngico da família Acaulosporaceae, um inoculante fúngico da família Sacculosporaceae, um inoculante fúngico da família Entrophosporaceae, um inoculante fúngico da família Pacidsporaceae, um inoculante fúngico da família Diversisporaceae, um inoculante fúngico da família Paraglomeraceae, um inoculante fúngico da família Archaeosporaceae, um inoculante fúngico da família Geosiphonaceae, um inoculante fúngico da família Ambisporaceae, um inoculante fúngico da família Scutellosporaceae, um inoculante fúngico da família Dentiscultataceae, um inoculante fúngico da família Racocetraceae, um inoculante fúngico do filo Basidiomycota, um inoculante fúngico do filo Ascomycota, um inoculante fúngico do filo Zygomycota, ou uma combinação dos mesmos), ou uma combinação dos mesmos.
[00754] O fertilizante pode compreender sulfato de amônio, nitrato de amônio, nitrato-sulfato de amônio, cloreto de amônio, bissulfato de amônio, polissulfureto de amônio, tiossulfato de amônio, amoníaco aquoso, amoníaco anidro, polifosfato de amônio, sulfato de alumínio, nitrato de cálcio, nitrato de amônio de cálcio, carbonato de cálcio, fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, nitrato de magnésio, sulfato de magnésio, nitrato de potássio, cloreto de potássio, sulfato de potássio e magnésio, sulfato de potássio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, sulfato de cálcio, cálcio calcítico, nitratos, calcário magnésio,magnésia, ureia, ureia-formaldeídos, ureia nitrato de amônio, ureia revestida com enxofre, ureia revestida com polímero, isobutilidenodiureia, K2SO4-2MgSO4, kainite, sylvinite, kieserite, sais de Epsom, enxofre elementar, marga, ostra moída Escória, farinha de ossos, cinzas de madeira, estrume, guano de morcego, musgo de turfa, adubo, areia verde, farelo de algodão, farinha de penas, farelo de caranguejo, farelo de peixe, emulsão de peixe, ácido húmico ou uma combinação destes.
[00755] O agroquímico pode compreender qualquer um dos inoculantes bacterianos, fungicidas, herbicidas, ou descritos acima na seção XVII.
L. Plantas e sementes
[00756] Em qualquer um dos métodos acima, relativamente a plantas, a planta pode ser uma dicotiledônea, uma monocotiledônea ou uma gimnosperma.
[00757] Por exemplo, quando a planta é uma dicotiledônea, a dicotiledônea pode ser selecionada do grupo que consiste em feijão, ervilha, tomate, pimenta, abóbora, alfafa, amêndoa, anis, maçã, damasco, arracha, alcachofra, abacate, bambara amendoim, beterraba, bergamota, pimenta preta, acácia negra, amora, mirtilo, laranja amarga, bokchoy, castanha do Brasil, fruta-pão, brócolis, feijão largo, couve de Bruxelas, trigo mourisco, repolho, camelina, repolho chinês, cacau, melão, sementes de alcaravia, cardo, alfarroba, cenoura, castanha de caju, mandioca, mamona, couve-flor, avelã, aipo, cereja, castanha, grão de bico, chicória, pimenta, crisântemo, canela, citron, clementina, colza, milho, algodão, semente de algodão, caupi, crambe, oxicoco, agrião, pepino, groselha, manjericão, baunilha, ervilha, beringela, endívia, erva-doce, feno-grego, figo, avelaneira, linho, gerânio, groselheira, abóbora, uva, toranja, goiaba, cânhamo, semente de cânhamo, henna, hop, feijão de cavalo, rábano, índigo, jasmim, alcachofra de Jerusalém, juta, couve, mafumeira, kenaf, couve-rábano, fortunella, lavanda, limão, lentilha, lespedeza, alface, lima, alcaçuz, nogueira, nêspera, nogueira, lupino, macadâmia, mace, tangerina, mangel, mango, medlar, melão, hortelã, amoreira, mostarda, nectarina, semente de niger, noz-moscada, quiabo, azeitona, ópio, laranja, papaya, pastinaca, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, noz pecã, caqui, ervilha-depombo, pistache, plátano, ameixa, romã, pomelo, semente de papoula, batata, batata doce, ameixa, abóbora, quebracho, marmelo, árvores do gênero Cinchona quinoa, Ramos, sementes de salsinha, satsuma, scorzonera, sésamo, árvore de carité, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba açucareira, cana-de-açúcar, girassol, sueco, Pimenta doce, tangerina, chá, teff, tabaco, tomate, trefoil, árvore de tung, nabo, urena, ervilhaca, noz, melancia, mate, wintercress (Barbarea vulgaris), a bolsa de pastor, agrião de jardim, agrião de jardim, agrião, pennycress, Louro de louro, cassia, jamun, endro, tamarindo, hortelãpimenta, orégano, alecrim, sálvia, graviola, centella, calophyllum, bálsamo pêra, castanha de kukui, castanha de Tahitiano, manjericão, murta-comum, hibisco, Cactus, erva de São João, loosestrife, espinheiro, coentro, planta de caril, kiwi, tomilho, abobrinha, ulluco, jicama, waterleaf, macaco espinhoso laranja, amarelo mombin, carambola, amaranto, wasabi, pimenta japonesa, ameixa amarela, mashua, chinês Toon, espinafre de Nova Zelândia, espinafre de bower, ugu, tansy, chickweed, jocote, maçã de Malay, paracress, sowthistle, batata chickweed chinesa, salsa de cavalo, mostarda de conversão, campion, ágata, cassod árvore, thistle, burnet, groselha branca, saltwort, salicornia, sorrel, rendas de prata fern, couve, prímula, primavera, beldroega, knotgrass, terebinto, alface de árvore, betel selvagem, pimenta da África Ocidental, erva santa, estragão, salsa, cerefólio, agrião, burnet saxifrage, honeyherb, petasites, shiso, Pimenta de água, perilla, amargo, oca, kampong, aipo chinês, manjericão, manjericão tailandês, água mimosa, cicely, repolho, moringa, mauka, samambaia de avestruz, erva de arroz, alface sawah amarelo, lovage, , Maca, gourd de garrafa, jacinto, espinafre da água, catsear, fishwort, espinafre Okinawan, lotus sweetjuice, soldado galante, culantro, arugula, cardo, caigua, mitsuba, chipilin, samphire, mampat, ebolo, gourd de hera, cardo de repolho, mar Couve, chaya, huauzontle, mostarda etíope, magenta spreen, bom rei henry, epazole, quartos de cordeiro, centella cockscomb plumado, alcaparra, rapini, repolho napa, mizuna, savoy chinês, kai-lan, mostarda, espinafre Malabar, acelga, marshmallow , Alperce de acácia, juta de China, paprika, semente do annatto, hortelã-verde, satureja, manjerona, cominhos, camomila, bálsamo de limão, pimenta da Jamaica, uva-do-monte, cherimoia, amora-branca-silvestre, damson, pitaya, durian, sabugueiro, feijoa, jaqueira, jambul, jujuba, físalis, mangostão roxo, rambutão, groselha, groselha preta, baga salal, satsuma, ugli, feijão de azuki, feijão preto, ervilha de olhos pretos, feijão de borlotti, feijão comum, feijão verde, feijão de rim, feijão de lima, feijão de mung, feijão de pinto, feijão de corredor, ervilha torta, ervilha instantânea, brocoflor, calabrese, urtiga, pimentão, chicória, rabanete, rabanete branco, Sium sisarum, tatsoi, broccolini, rabanete preto, raiz de bardana, fava, Mamoncillo, porca maya, mongongo, porca ogbono, porca paradisíaca, porca de parafina, e champedaque.
[00758] Onde a planta é uma monocotiledónea, a monocotiledónea pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, arroz, cevada, painço, banana, cebola, alho, espargos, azevém, painço, fonio, raishan, nipa, açafrão, açafrão, galangal, cebolinha, cardamomo, cebolinha, castanha de água, rampa, lágrimas de Jó, bambu, ragi, farinha de água sem mancha, orelha de elefante de seta, espinafre de Tahitiano, abacá, areca, bajra, castanha de bétula, vassoura de milheto, sorgo de vassoura, citronela, cocoyam, milho, dasheen, durra, trigo duro, edo, fique, formio, gengibre, grama de pomar, grama de esparto, grama de Sudão, milho de Guiné, cânhamo de Manila, henequen, milho híbrido, jowar, capim-limão, maguey, milho de espinheiro, milho proso, linho da Nova Zelândia, aveia, palma da palmeira, palmeira, palmeira do sagu, redtop, sisal, sorgo, trigo espelta, milho doce, sorgo doce, taro, teff, capim-tímpano, triticale, baunilha e trigo.
[00759] Onde a planta é uma gimnosperma, a gimnosperma pode ser de uma família selecionada do grupo que consiste em Araucariaceae, Boweniaceae, Cephalotaxaceae, Cupressaceae, Cycadaceae, Ephedraceae, Ginkgoaceae, Gnetaceae, Pinaceae, Podocarpaceae, Taxaceae, Taxodiaceae, Welwitschiaceae e Zamiaceae.
[00760] As plantas e sementes de plantas aqui descritas podem incluir plantas transgênicas ou sementes de plantas, como os cereais transgênicos (trigo, arroz), milho, soja, batata, algodão, tabaco, colza e plantas frutíferas (fruto de maçãs, pêras, frutas cítricas e uvas. Plantas transgênicas preferidas incluem milho, soja, batata, algodão, tabaco e colza.
[00761] Plantas e sementes transgênicos adequados podem ser caracterizadas pela formação da planta de toxinas, especialmente a partir do material genético Bacillus thuringiensis (por exemplo, por CrylA gene de (a), CrylA (b), CrylA (c), CrylIA, CrylIlA, CryIIlB2, Cry9c, Cry2Ab, Cry3Bb, CrylF ou uma combinação dos mesmos). A formação de toxinas nas plantas aumenta a resistência da planta a insetos, aracnídeos, nematoides e lesmas e caracóis (adiante designado como "plantas Bt"). Plantas Bt, por exemplo, encontram-se comercialmente disponíveis sob o nome comercial GARD YIELD ® (por exemplo, milho, algodão, soja), KnockOut ® (por exemplo, milho), StarLink ® (por exemplo, milho), Bollgard ® (algodão), Nucotn ® (algodão) e NewLeaf ® (batata) variedades de milho, variedades de algodão, variedades de soja e variedades de batata. Plantas de tolerância a herbicidas incluem plantas sob os nomes comerciais Roundup Ready ® (a tolerância ao glifosato, tais como milho, algodão, soja), Clearfield ® (por exemplo, milho), Liberty Link ® (tolerância com glufosinato, por exemplo colza), IMI ® (com tolerância a imidazolinona) e STS ® (tolerância a uma sulfonilureia, tais como o milho).
[00762] Sementes de plantas tal como aqui descrita podem ser ge-neticamente modificadas (por exemplo, qualquer semente que resulta numa planta ou parte de planta geneticamente modificada que expresse a tolerância a herbicidas, a tolerância a fatores ambientais tais como o stress água, seca, vírus, e produção de nitrogênio, ou resistência a toxinas bacterianas, de fungos ou de insetos). Sementes geneticamente modificadas adequadas incluem colheitas de colza, vegetais, frutos, árvores, cultivos de fibras, culturas oleaginosas, culturas de tubérculos, café, flores, leguminosas, cereais, bem como outras plantas das espécies monocotiledóneas e dicotiledóneas. De preferência, as sementes geneticamente modificadas incluem amendoim, tabaco, ervas, trigo, cevada, centeio, sorgo, arroz, colza, beterraba sacarina, girassol, tomate, pimenta, feijão, alface, batata e cenoura. Mais prefe-rencialmente, as sementes geneticamente modificadas incluem algodão, soja e milho (doce, campo, semente ou pipoca).
[00763] Plantas transgênicas úteis que podem ser tratadas de acordo com a invenção são particularmente as plantas que contêm os eventos de transformação, ou uma combinação de eventos de transformação, que são listados, por exemplo, nas bases de dados de várias agências reguladoras nacionais ou regionais (ver, por://gmoinfo.jrc.it/gmp_browhttp://www.agbios.com/dbase.php).
XX.MÉTODOS PARA A ENTREGA DE BACTÉRIAS BENÉFICAS E PROTEÍNAS OU PEPTÍDEOS PARA ANIMAIS
[00764] A presente invenção se refere ainda a métodos para a entrega de bactérias benéficas e/ou proteínas ou peptídeos de animais.
[00765] A administração de cepas bacterianas que são probióticas e também são endofíticas a uma planta permite a entrada das bactérias para a fábrica, onde se dividem e se multiplicam. As cepas endofíticas e probióticas podem ser distribuídas para as plantas, utilizando vários métodos, por exemplo, as cepas endofíticas e probióticas podem ser distribuídas através de tratamento de sementes, tratamento do meio de crescimento da planta (por exemplo, do solo), de rega, aplicação à própria planta (por exemplo, aplicação foliar às porções aéreas de uma planta). Uma vez no interior da planta, as bactérias multiplicam-se e colonizam os tecidos internos da planta. A planta pode em seguida ser alimentada a um animal, o que permite a entrega das bactérias probióticas para o animal. Os custos são diminuídos como com os métodos tradicionais para a entrega de bactérias probióticas para animais, uma vez que a natureza endófita das bactérias permite a sua divisão e se multiplica dentro da planta. Ao fornecer inicialmente uma pequena quantidade de uma cepa probiótica e endófita de uma planta para bactéria e permitindo que as bactérias aumentem em número dentro da planta, a dose aumenta. Além disso, a cepa probiótica e endofítica podem se espalhar por uma cultura alvo antes da coleta da digestão.
[00766] As cepas bacterianas que são capazes de colonizar o filoplano de uma planta e também são probióticas também podem ser utilizadas para estes fins. As cepas que são capazes de colonizar o filoplano de uma planta podem ser inicialmente distribuídas para as plantas em pequenas doses, e, em seguida, dividem-se e colonizam as superfícies externas das plantas.
[00767] As cepas bacterianas adequadas que são tanto endofíticas ou colonizadoras de filoplano como probióticas incluem aquelas cepas que podem tanto se replicar no campo em ou sobre uma planta e que proporcionam benefícios aos animais após a ingestão. Benefícios de bactérias probióticas em animais incluem, mas não estão limitados a regulação da microbiota do trato digestivo do animal, a secreção de enzimas que ajudam na digestão de material vegetal, e a estimulação do sistema imunológico dos animais. Exemplos de enzimas que aumentam a digestão que iria proporcionar benefícios incluem, mas não estão limitados a celulases, endoglucanases, exoglucanases, pglucosidases, amilases, proteases, pectinases, xilanases, xilosidases, lipases, fosfolipases e lignases.
[00768] Os gêneros Bacillus e Lysinibacillussão únicos na medida em que contêm um grande número de espécies que são ambos endófitos e, assim, colonizam plantas, mas que também podem atuar como probióticos em vertebrados. Portanto, espécies Bacillus e Lysinibacillussão altamente adequadas para entrega de probióticos para ani-maisatravés de passagens em crescimento e em plantas. As espécies de Bacillus comuns que podem ser tanto endofíticas como probióticas incluem Bacillus subtilis, Bacillus firmus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus toyocerin, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus e Bacillus licheniformis. EspéciesLysinibacillus que são ambos, endófito e probiótico também podem ser usados.
[00769] Um método para a entrega de bactérias benéficas para um animal é fornecido. O método compreende a alimentação de um animal uma planta modificada para compreender um nível de uma cepa probiótica e endófita e de bactérias que é maior do que o nível da cepa probiótica e endófita das bactérias da mesma planta que não tenha sido modificada cultivadas sob as mesmas condições.
[00770] A planta alimentada ao animal pode compreender uma planta cultivada num meio de crescimento de plantas contendo a cepa endofítica e probiótica de bactérias ou uma formulação compreendendo a cepa endofítica e probiótica de bactérias, uma planta à qual foi aplicada a cepa endofítica e probiótica de bactérias, uma planta cultivada a partir de uma semente de plantas à qual foi aplicada a cepa endofítica e probiótica de bactérias, uma planta crescida numa área à qual foi aplicada a cepa endofítica e probiótica de bactérias ou uma semente crescida na área à qual os endófilos e probióticos das bactérias.
[00771] A cepa endofítica e probiótica de bactérias pode compreender umas espécies Bacillus ou Lysinibacillus. Por exemplo, as espéciesBacillus podem compreender Bacillus subtilis, Bacillus firmus, Ba-cillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus Toyocerin, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, ou uma combinação dos mesmos.
[00772] A cepa endofítica e probiótica de bactérias pode compreender membro da família Bacillus cereus EE349, membro da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, Lysinibacillus sphericus EE443, Bacillus pumilus EE-B00143, ou uma combinação dos mesmos.
[00773] Além disso, as proteínas ou peptídeos (por exemplo, enzimas) podem ser entregues aos animais por alimentação dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão contendo a proteína ou peptídeo, fragmentos exosporium compreendendo tais proteínas de fusão, ou de bactérias formadoras de esporos recombinantes expressando tais proteínas de fusão para os animais. O membro da família Bacillus cereus recombinante ou as bactérias formadoras de esporos recombinantes pode ser uma cepa endófita de bactérias ou de uma cepa de bactérias que é capaz de co-lonizar o filoplano de uma planta, que permite a entrega da proteína ou do peptídeo para o animal através da ingestão de uma planta que foi colonizada por bactérias. Podem também ser utilizadas cepas de membros recombinantes da família Bacillus cereusprobióticas ou cepas recombinantes para que o animal que ingerir o membro da família Bacillus cereus recombinante ou A bactéria recombinante formadora de esporos obtenha tanto os benefícios das bactérias probióticas como os benefícios da proteína ou peptídeo. Cepas de membros da família de Bacillus cereus recombinantes e as cepas das bactérias formadoras de esporos recombinantes que são simultaneamente colonizadoras de endofíticos ou filoplanos e probióticas podem também ser utilizadas para administrar proteínas ou peptídeos aos animais.
[00774] Por conseguinte, um método para a entrega de proteínas ou peptídeos, a um animal, também é fornecido. O método compreende a alimentação para um animal num membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de di-recionamento,proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante. Alternativamente, o método compreende alimentação para um animal de fragmentos exosporium derivados a partir de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de di-recionamento,proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante.
[00775] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes aqui descritos, que expressam uma proteína de fusão.
[00776] Os fragmentos exosporium podem compreender fragmentos exosporium derivados de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus acima descrito na Seção IV.
[00777] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma cepa endofíticos de bactérias. A cepa de bactérias endofíticas podem compreender membros da família Bacillus cereus EE349, membros da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, ou Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, membro da família Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, ou Bacillus mycoides EE-B00363. Por exemplo, a cepa endofítica de bactérias compreende membro da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, membro da família Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 ou Bacillus Mycoides EE-B00363.
[00778] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma cepa de bactérias probióticas. A cepa de bactérias probióticas pode compreender membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924), ou uma combinação dos mesmos.
[00779] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode ser composto dentro de uma planta que é alimentada ao animal.
[00780] Alternativamente, a família recombinante Bacillus cereus pode compreender uma cepa de bactérias que é capaz de colonizar o filoplano de uma planta. Por exemplo, a cepa de bactérias que é capaz de colonizar o filoplano de uma planta pode compreender Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoides BT46-3, membro da família Bacillus cereus EE218, Bacillus thuringiensis BT013A, membro da família Bacillus cereus EEB00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, ou Bacillus mycoides EE-B00363.
[00781] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode estar presente no filoplano de uma planta que é alimentada ao animal.
[00782] A sequência de direcionamento, a proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium podem compreender: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 43% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 54%; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 1; (5) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 2; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (10) uma sequência de direcio-namento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 3; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 3; (14) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 4; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5; (20) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5; (21) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 5; (22) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 6; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (25) uma sequência de direci-onamento compreendendo aminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1038 da SEQ ID NO: 5; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 7; (30) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 7; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 7; (32) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 8; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1028 da SEQ ID NO: 7; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 9; (40) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 10; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO:11; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 11; (47) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 12; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (51) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13; (55) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:13; (56) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:14; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (62) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15; (64) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:15; (65) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:16; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (68) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2543 da SEQ ID NO: 15; (73) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:17; (76) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:18; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19; (83) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:19; (84) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:20; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (87) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21; (91) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:21; (93) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de iden-tidade com SEQ ID NO:22; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (95) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23; (100) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:23; (102) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:24; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:25; (109) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:26; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:27; (116) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:28; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (119) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (120) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (121) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29; (122) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29; (123) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:29; (124) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:30; (125) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (126) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (127) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (128) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (129) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (130) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31; (131) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31; (132) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:31; (133) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:32; (134) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (135) uma sequência de direci-onamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (136) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (137) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33; (138) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:33; (139) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:34; (140) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35; (141) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:35; (142) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:36; (143) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO:43; (144) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43; (145) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 43; (146) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 44; (147) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (148) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (149) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (150) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (151) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45; (152) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45; (153) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 45; (154) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 46; (155) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (156) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (157) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (158) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (159) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (160) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47; (161) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47; (162) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 47; (163) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 48; (164) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (165) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (166) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (167) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (168) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (169) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (170) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (171) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49; (172) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49; (173) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 49; (174) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 50; (175) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (176) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (177) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (178) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (179) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (180) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51; (181) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51; (182) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 51; (183) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 52; (184) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (185) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (186) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (187) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (188) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (189) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53; (190) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53; (191) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 53; (192) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 54; (193) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (194) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (195) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (196) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (197) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (198) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55; (199) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55; (200) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 55; (201) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 56; (202) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (203) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (204) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (205) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (206) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57; (207) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57; (208) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 57; (209) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 58; (210) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (211) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5130 da SEQ ID NO: 57; (212) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (213) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (214) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (215) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (216) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (217) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (218) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (219) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (220) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (221) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (222) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (223) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 95; (224) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 96; (225) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 97; (226) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 98; (227) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 99; (228) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 100; (229) uma sequênciade direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 101; (230) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 102; (231) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 103; (232) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 104; (233) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 105; (234) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 106; (235) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 108; (236) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 109; (237) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 110; (238) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 111; (239) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 112; (240) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 113; (241) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 114; (242) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 115; (243) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 116; (244) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 117; (245) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 118; (246) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 119; (247) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 120; (248) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 121; (249) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; (250) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; (251) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; (252) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-23 da SEQ ID NO: 3; (253) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1425 da SEQ ID NO: 3; (254) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3; (255) uma sequên cia de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 59; (256) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 59; (257) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 60; (258) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 59; (259) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59; (260) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 6-30 da SEQ ID NO: 59; (261) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 61; (262) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 61; (263) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 61; (264) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 62; (265) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 61; (266) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 61; (267) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61; (268) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61; (269) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 63; (270) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 63; (271) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 64; (272) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 63; (273) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 63; (274) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 63; (275) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 63; (276) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63; (277) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 65; (278) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 65; (279) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 65; (280) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 66; (281) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 107; (282) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 65; (283) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65; (284) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 67; (285) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 67; (286) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 67; (287) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 68; (288) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 67; (289) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67; (290) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 67; (291) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 69; (292) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 69; (293) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 69; (294) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 70; (295) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 69; (296) uma sequência de direcionamento compreen- dendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69; (297) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 69; (298) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69; (299) uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 72; (300) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 73; (301) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO: 74; (302) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-42 da SEQ ID NO: 75; (303) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-42 da SEQ ID NO: 75; (304) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 75; (305) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 76; (306) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-42 da SEQ ID NO: 75; (307) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75; (308) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75; (309) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75; (310) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75; (311) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75; (312) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 77; (313) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 77; (314) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 77; (315) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 78; (316) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 77; (317) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77; (318) uma pro-teína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 80; (319) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 81; (320) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 81; (321) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 81; (322) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 82; (323) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 81; (324) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; (325) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; (326) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; (327) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81; (328) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-34 da SEQ ID NO: 83; (329) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 83; (330) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 84; (331) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 86; (332) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 87; (333) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1328 da SEQ ID NO: 87; (334) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 87; (335) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 88; (336) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 87; (337) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; (338) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 87; (339) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 89; (340) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 89; (341) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 90; (342) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 89; (343) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; (344) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 89; (345) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-93 da SEQ ID NO: 91; (346) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 91; (347) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 92; (348) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-93 da SEQ ID NO: 91; (349) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91; (350) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91; (351) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-93 da SEQ ID NO: 91; (352) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91; (353) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91; (354) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91; (355) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1130 da SEQ ID NO: 93; (356) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 93; (357) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 94; (358) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 93; (359) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10130 da SEQ ID NO: 93; (360) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93; (361) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93; (362) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 122; (363) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 1; (364) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 1; (365) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-31 da SEQ ID NO: 1; (366) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 96; (367) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 96; (368) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 3; (369) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 3; (370) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 3; (371) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 97; (372) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (373) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 5; (374) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 5; (375) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 5; (376) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 5; (377) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 7; (378) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 7; (379) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 7; (380) uma sequência de di-recionamento consistindo em aminoácidos 16-24 da SEQ ID NO: 7; (381) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 9; (382) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 9; (383) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 9; (384) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 9; (385) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 105; (386) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 105; (387) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 11; (388) uma sequência de dire-cionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 11; (389) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 11; (390) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 98; (391) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (392) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 13; (393) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 13; (394) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 13; (395) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 13; (396) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 99; (397) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 99; (398) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 15; (399) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 15; (400) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 29-41 da SEQ ID NO: 15; (401) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 31-39 da SEQ ID NO: 15; (402) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 17; (403) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 17; (404) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 100; (405) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 19; (406) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 19; (407) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 19; (408) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 19; (409) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 21; (410) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 21; (411) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 21; (412) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 21; (413) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 101; (414) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 101; (415) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 23; (416) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 23; (417) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 23; (418) uma sequência de dire-cionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 23; (419) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 102; (420) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 102; (421) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 25; (422) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 25; (423) uma sequência de direci-onamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 25; (424) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 25; (425) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 103; (426) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 103; (427) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-28 da SEQ ID NO: 27; (428) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-26 da SEQ ID NO: 27; (429) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 16-28 da SEQ ID NO: 27; (430) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-26 da SEQ ID NO: 27; (431) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 104; (432) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 104; (433) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 33; (434) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-11 da SEQ ID NO: 33; (435) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 3-11 da SEQ ID NO: 33; (436) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-14 da SEQ ID NO: 35; (437) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-12 da SEQ ID NO: 35; (438) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 2-14 da SEQ ID NO: 35; (439) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-27 da SEQ ID NO: 43; (440) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 43; (441) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-27 da SEQ ID NO: 43; (442) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 45; (443) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 45; (444) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 45; (445) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 106; (446) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 106; (447) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 47; (448) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 47; (449) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 53; (450) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 53; (451) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 53; (452) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 61; (453) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 61; (454) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 61; (455) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 65; (456) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 65; (457) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 65; (458) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 107; (459) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 107; (460) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 67; (461) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 67; (462) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 67; (463) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 67; (464) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2336 da SEQ ID NO: 69; (465) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 69; (466) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 69; (467) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 69; (468) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-40 da SEQ ID NO: 75; (469) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-38 da SEQ ID NO: 75; (470) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 77; (471) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 77; (472) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 77; (473) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 77; (474) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 81; (475) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 81; (476) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 81; (477) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 81; (478) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 87; (479) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 87; ou (480) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 87.
[00783] Por exemplo, a sequência de direcionamento também pode compreender ou consistir uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 50 % com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63 %.
[00784] A sequência de direcionamento também pode compreender ou consistir uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 50 % com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72 %.
[00785] A sequência de direcionamento também pode compreender ou consistir uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 56 % com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63 %.
[00786] A sequência de direcionamento também pode compreender ou consistir uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 62 % com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72 %.
[00787] A sequência de direcionamento também pode compreender ou consistir de uma sequência de aminoácido com pelo menos identidade de cerca de 68 % com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81 %.
[00788] A sequência de direcionamento também pode compreender ou consistir uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 75 % com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72 %.
[00789] A sequência de direcionamento também pode compreender ou consistir uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 75 % com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81 %.
[00790] A sequência de direcionamento também pode compreender ou consistir uma sequência de aminoácido com pelo menos identidade de cerca de 81 % com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81 %.
[00791] A sequência de direcionamento também pode compreender ou consistir uma sequência de aminoácido com pelo menos identidade de cerca de 81 % com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 90 %.
[00792] A sequência de direcionamento pode consistir em: (a) uma sequência de amino ácidos consistindo em 16 aminoácidos, com pelo menos identidade de cerca de 43 % com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos 25-35 é pelo menos cerca de 54 %; (b) aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (c) aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (d) SEQ ID NO: 1; (e) SEQ ID NO: 96; ou (f) a SEQ ID NO: 120.
[00793] A proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium pode compreender uma sequência de aminoácidos pos-suindo pelo menos 90 % de identidade com SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 e 122.
[00794] A proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95 % de identidade com SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 e 122.
[00795] A proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína do exosporium ou fragmento de proteína exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98 % de identidade com SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 e 122.
[00796] A proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium pode compreender uma sequência de aminoácidos pos-suindo pelo menos 99 % de identidade com SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 e 122.
[00797] A proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 100 % de identidade com SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 e 122.
[00798] A sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium pode compreender a sequência de aminoácidos GXT no seu terminal carboxi, em que X é qualquer aminoácido.
[00799] A sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium, podem compreender um resíduo de alanina na posição da sequência de direcionamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.
[00800] A sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium pode ainda compreender uma metionina, serina, ou resíduo de treonina na posição de aminoácidos que precede imediatamente o primeiro aminoácido da sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium ou na posição da sequência de direcionamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.
[00801] A proteína de fusão pode ainda compreender um ligante de aminoácidos entre a sequência de direcionamento, a proteína do exosporium, ou o fragmento de proteína do exosporium e a proteína ou peptídeo de interesse. O ligante pode ser qualquer um dos ligantes acima descritos na Seção XI.
[00802] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor de esporulação nativo da sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão ou uma porção da mesma e/ou sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão. O promotor pode ser qualquer um dos promotores descritos acima na Seção III.
[00803] Um outro método para a entrega de proteínas ou peptídeos, a um animal, também é fornecido. O método compreende a alimentação para um animal umA bactéria recombinante formadora de esporos. A bactéria recombinante formadora de esporos pode ser qualquer uma das bactérias formadoras de esporos recombinantes descritos acima na Seção IX.
[00804] A bactéria recombinante formadora de esporos pode ser composta dentro de uma planta que é alimentada ao animal.
[00805] A bactéria recombinante formadora de esporos pode com-preender uma cepa endofítica ou probiótica de bactérias. Por exemplo, a cepa endofítica e probiótica de bactérias podem compreender Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), Bacillus sp. EE387 (NRRL B50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978), Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B50975), ou Lysinibcaillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976), ou Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123), ou uma combinação dos mesmos.
[00806] Em qualquer um dos métodos acima, a planta pode ser processada antes de alimentar ao animal.
[00807] Em qualquer um dos métodos acima que envolvem a ali-mentação de uma planta, a um animal, o método pode ainda compre-ender a introdução da cepa endófita de bactérias ou de uma formulação compreendendo a cepa endófita de bactérias num meio de crescimento de plantas. Alternativamente, o método pode compreender a aplicação da cepa endófita de bactérias ou de uma formulação compreendendo a cepa de bactérias endófita de uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente da planta. A planta alimentada ao animal pode compreender uma planta cultivada num meio de crescimento de plantas contendo a cepa endofítica e probiótica de bactérias ou uma formulação compreendendo a cepa endofítica e probiótica de bactérias, uma planta à qual foi aplicada a cepa endofítica e probiótica de bactérias, uma planta cultivada a partir de uma semente de plantas à qual foi aplicada a cepa endofítica e probiótica de bactérias, uma planta crescida numa área à qual foi aplicada, ou uma semente crescida na área à qual foi aplicada a cepa endofítica e probiótica de bactérias.
[00808] Em qualquer um dos métodos acima para a entrega de proteínas ou peptídeos, a um animal, a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima. Por exemplo, a enzima pode compreender uma xilanase, um xilosidase, uma fitase, uma fosfatase, uma protease, uma celulase, uma endoglucanase, um exogluconase, uma glucanase, uma amilase (por exemplo, α-amilase ou uma β-amilase), uma lipase, uma fosfolipase, uma glicosilase, um galactanase, uma αgalactosidase, um β-glucosidase, uma amilase, uma pectinase, uma biotinase, uma poligalacturonase, um linhinase ou uma combinação dos mesmos. A lipase pode compreender uma fosfolipase A1, um fosfolipase A2, uma fosfolipase C, uma fosfolipase D, uma lisofosfolipase, ou uma combinação dos mesmos. A enzima compreende preferenci-almente uma xilanase ou uma fitase.
[00809] Em qualquer um dos métodos que compreendem a alimentação de uma planta, a um animal, a planta pode ser processada antes de alimentar ao animal.
[00810] Em qualquer um dos métodos acima, compreendendo a entrega de bactérias, proteínas ou peptídeos a um animal, o animal pode ser um mamífero (por exemplo, uma ovelha, cabra, vaca, porco, veado, alpaca, bisontes, camelos, burro, cavalo, mula, lhama, coelho, cão, ou gato), um pássaro (por exemplo, um frango, peru, pato, ganso, codorna, ou faisão), um peixe (por exemplo, salmão, truta, tilápia, atum, peixe-gato, ou uma carpa) ou um crustáceo (por exemplo, um camarão, camarão pitu, lagosta, caranguejo ou lagostas).
XXI.MÉTODOS PARA A ENTREGA DE ÁCIDOS NUCLEICOS BENÉFICOS PARA ANIMAIS, INSETOS, VERMES, FUNGOS E PROTOZOÁRIOS
[00811] A invenção se refere ainda a métodos para administrar uma molécula de ácido nucleico a um animal, inseto, verme, fungo ou pro-tozoário.
[00812] O método pode compreender alimentar a um animal, a um inseto ou verme numa planta modificada para compreender um nível da molécula de ácido nucleico que é maior do que o nível da molécula de ácido nucleico na mesma planta que não foi modificada, cultivada sob as mesmas condições.
[00813] Um outro método para a entrega uma molécula de ácido nucleico a um animal, inseto, ou verme é fornecido. O método pode compreender a alimentação, inseto, ou verme para um animal num membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante. Alternativamente, o método pode compreender alimentar a um animal, inseto ou verme uma bactéria recombinante formadora de esporos que expresse uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direcionam a proteína de fusão para a superfície de um esporo da bactéria. A proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo e a molécula de ácido nucleico de ligação é ligada para a proteína ou peptídeo de ligação ao DNA ou RNA. A proteína ou peptídeo de ligação do ácido nucleico pode ser fisicamente ligada ao exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante ou para o revestimento de esporos da bactéria formadora de esporos recombinantes.
[00814] Outro método para a entrega uma molécula de ácido nucleico a um animal, inseto, ou verme é fornecido. O método compreende a alimentação de um animal, de inseto ou vermes dos fragmentos exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus recombinante. Os fragmentos exosporium são derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma proteína de ligação do ácido nucleico ou peptídeo, e em que a proteína ou peptídeo de ligação de ácido nucleico é ligado a uma molécula de ácido nucleico.
[00815] O verme é de preferência um nematóide.
[00816] Um método para a entrega de uma molécula de ácido nucleico de um fungo ou um protozoário é fornecido. O método compreende o contacto de um fungo ou de um protozoário com um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante. Alternativamente, o método pode compreender alimentar a um animal, inseto ou verme uma bactéria recombinante formadora de esporos que expressa uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direcionam a proteína de fusão para a superfície de um esporo da bactéria. A proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo e a molécula de ácido nucleico de ligação é ligada para o ácido nucleico ou proteína de ligação de peptídeos.
[00817] Um método ainda para a entrega de uma molécula de ácido nucleico de um fungo ou um protozoário é fornecido. O método com-preende o contato de um fungo ou um protozoário com fragmentos exosporium. Os fragmentos exosporium são derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma proteína de ligação do ácido nucleico ou peptídeo, e em que a proteína ou peptídeo de ligação de ácido nucleico é ligado a uma molécula de ácido nucleico.
[00818] A molécula do ácido nucleico pode compreender, uma molécula de RNA de modulação; uma molécula de RNAi; um microRNA; um aptâmero; ou uma molécula de DNA que codifica uma molécula de RNA de modulação, uma molécula de RNAi, um microRNA, ou um aptâmero.
[00819] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão.
[00820] A proteína de fusão pode compreender qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas que incluem uma proteína de ligação do ácido nucleico.
[00821] A proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína CotB, uma proteína CotC, uma proteína AgeC, uma proteína CotB/H, uma proteína CotG, uma proteína de revestimento de esporos proteína X, ou uma proteína CotY.
[00822] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85 % de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 252-259.
[00823] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90 % de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 252-259.
[00824] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95 % de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 252-259.
[00825] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98 % de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 252-259.
[00826] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99 % de identidade com qualquer da SEQ ID NOs: 252-259.
[00827] A proteína de revestimento de esporos pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo 100 % de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 252-259.
[00828] Os métodos acima descritos podem ser utilizados para inúmeros fins. Por exemplo, estes métodos podem ser utilizados para administrar RNA ou DNA de animais com a finalidade de diminuir a susceptibilidade do animal a uma doença ou no tratamento de uma doença no animal (por exemplo, a doença orgânica, tais como acidente vascular cerebral, diabetes, doença cardíaca, e doenças degenerativas). Os DNA e RNA, também têm sido demonstrados como sendo eficazes para eliminar ou tratar a doença causada por patógenos animais, tais como bactérias, vírus, vermes (por exemplo, nemátodos) e fungos. Os RNA e DNA podem atuar diretamente sobre o agente patogênico, ou pode trabalhar com o sistema imunológico do animal para ativar ou aumentar a resposta imunitária.
[00829] Além disso, os métodos acima podem ser utilizados para a eliminação de pragas, incluindo insetos, vermes (por exemplo, nemátodos), fungos e protozoários. A administração de RNAs ou DNAs es-pecíficos à praga pode levar à diminuição da habilidade da praga de infectar um hospedeiro (por exemplo, um hospedeiro vegetal), diminuição da alimentação em hospedeiros-alvo ou plantas, matança direta através do bloqueio de genes-chave ou vários outros efeitos.
XXII. AS VACINAS E UM MÉTODO PARA PRODUZIR UMA RESPOSTA IMUNOGÊNICA
[00830] Uma vacina é fornecida a qual compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressam uma proteína de fusão como descrito acima nos parágrafos [00171], [00173] [00176] da Seção I em que a proteína ou peptídeo de interesse é um antígeno ou imunógeno.
[00831] Uma outra vacina é fornecida a qual compreende um trans-portador farmaceuticamente aceitável e fragmentos exosporium. Os fragmentos exosporium são derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína de fusão compreende um antígeno.
[00832] Ainda outra vacina proporcionada compreenda um transportador farmaceuticamente aceitável e um membro da família Bacillus cereus recombinante. O membro da família Bacillus cereus recombinante é um membro da família Bacillus cereus recombinante, como descrito acima na Seção II.
[00833] Nas vacinas que compreendem fragmentos exosporium ou um membro da família Bacillus cereus recombinante, tal como descrito acima na Seção II, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium pode compreender qualquer uma das sequências de direcionamento, proteínas do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium aqui descritos. Em particular, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium pode compreender qualquer uma das sequências de direcionamento da proteína do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium descritos acima nos parágrafos [00782] [00801].
[00834] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor de esporulação nativo da sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão ou uma porção da mesma e/ou sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão. O promotor pode ser qualquer um dos promotores descritos acima na Seção III.
[00835] Quando a proteína ou peptídeo de interesse é um antígeno, a apresentação do antígeno no exterior do esporo ou num fragmento de exosporium proporciona uma resposta do sistema imunitário para conseguir a vacinação contra vários agentes patogênicos ou doenças. Os antígenos adequados ou as moléculas pequenas são aqueles que são conhecidos ou esperados para ilicitar uma resposta imunitáriadesejada que é suficiente para produzir um efeito terapêutico ou protetor quando expressos no exterior de um esporo de Bacillus ou exibidos num fragmento de exosporium. Conveniência em grande par te será determinada pela dobragem da estrutura tridimensional de uma vez que o antígeno recombinante é incorporado no exosporium, isto é, a porção antigênica (s) da molécula recombinante tem de estar disponível para a detecção pelo sistema imunológico.
[00836] Os patógenos ou doenças das quais o antígeno pode ser derivado incluem, entre outras, infecções por Acinetobacter, causadas por Acinetobacter baumannii; Actinomicose, causada por Actinomyces israelii, Actinomyces gerencseriae, e Propionibacterium propionicus; doença do sono africana, causada por Trypanosoma brucei; síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), causada pelo virus da imunode-ficiência humana; amebíase, causada por Entamoeba histolytica; anaplasmose, causada pelo gênero Anaplasma, Anthrax, causada por Ba-cillus anthracis; infecção por Arcanobacterium haemolyticum, causada por Arcanobacterium haemolyticum; febre hemorrágica argentina, cau-sada pelo vírus Junin; ascaridíase, causada por Ascaris lumbricoides, infecção por Astrovírus, causada pela família Astroviradae; babesiose, gênero Babesia; infecção por Bacillus cereus, causada por Bacillus cereus; pneumonia bacteriana; vaginoses bacteriana; infecção por Bacteroides, causada pelo gênero Bacteriodes; balantidíase, causada por Balantidium coli; infecção por Baylisascaris, causada pelo gênero Baylisascaris; infecção pelo vírus BK, causada pelo vírus BK; piedra negra, causada por Piedraia hortae; infecção por Blastocystis hominis, causada por Blastocystis hominis; Blastomicose, causada por Blas-tomyces dermatitidis; febre hemorrágica bolivariana, causada pelo vírus Machupo; infecção por Borrelia, causada pelo gênero Borrelia; botulismo (e botulismo infantil), causada pela ingestão da toxina Clostridium botulinum; febre hemorrágica brasileira, causada por Sabia; brucelose, causada pelo gênero Brucella; infecção por Burkholderia, causada geralmente por Burkholderia cepacia e outras espécies Burkholderia; úlcera de Buruli, causada por Mycobacterium ulcerans; infecção por Calicivírus (Norovirus e Sapovirus), causada pela família Caliciviridae; Campilobacteriose, causada pelo gênero Campylobacter; candidíase (Monilíase; afta) geralmente causada por Candida albicans e outras espécies de Candida; doença da arranhadura do gato, causada por Bartonella henselae; celulite, causada geralmente por Streptococcus do Grupo A e Staphylococcus; doença de Chagas (tripanossomíase americana), causada por Trypanosoma cruzi; cancroide, causada por Haemophilus ducreyi; catapora, causada pelo vírus Varicella zoster (VZV); clamídia, causada por Chlamydia trachomatis; infecção por Chlamydophila pneumoniae, causada por Chlamydophila pneumoniae; cólera, causada por Vibrio cholerae; cromoblastomicose, causada ge-ralmente por Fonsecaea pedrosoi; clonorquiase, causada por Clonorchis sinensis; infecção por Clostridium difficile, causada por Clostridium difficile; coccidioidomicose, causada por Coccidioides immitis e Coccidioides posadasii; febre do carrapato do Colorado (CTF), causada pelo vírus da febre do carrapato do Colorado (CTFV); resfriado comum (rinofaringite viral aguda; coriza aguda), causada geralmente por rinovíruse e coronavírus; doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), causada por príon CJD; febre hemorrágica da Crimeia-Congo (CCHF), causada pelo vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo; Criptococcose, causada por Cryptococcus neoformans; Criptosporidiose, causada pe-logênero Cryptosporidium; larva migrans cutânea (CLM), causada ge-ralmente por Ancylostoma braziliense e vários outros parasitas; Ciclosporíase, causada por Cyclospora cayetanensis; Cisticercose, cau-sada por Taenia solium; infecção por Citomegalovírus, causada por Citomegalovírus; febre da dengue, causada por vírus da Dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4)-Flavivírus; Dientamebíase, causada por Dientamoeba fragilis; Difteria, causada por Corynebacterium diphtheriae; Difilobotríase, causada por Diphyllobothrium; Dracunculíase, causada por Dracunculus medinensis; febre hemorrágica do Ebola, causada pelo vírus Ebola (EBOV); Equinococcose, causada pelo gê-neroEchinococcus; Erliquiose, causada pelo gênero Ehrlichia; Enterobíase (infecção por oxiúros), causada por Enterobius vermicularis; in-fecção por Enterococcus, causada pelo gênero Enterococcus; infecção por Enterovírus, causada pelo gênero Enterovirus; tifo epidêmico, cau-sado por Rickettsia prowazekii; eritema infeccioso (a quinta doença), causada por Parvovírus B19; exantema súbito, causado pelo herpesvírus humano 6 (HHV-6) e herpesvirus humano 7 (HHV-7); Fasciolopsíase, causada por Fasciolopsis buski; Fasciolose, causada por Fasciola hepatica e Fasciola gigantica; insônia familiar fatal (FFI), causada por príon FFI; Filaríase, causada pela superfamília Filarioidea; envenena-mento alimentar, causado por Clostridium perfringens; infecção por amebas de vida livre; infecção por Fusobacterium, causada por Fusobacterium genus; gangrena gasosa (Clostridial myonecrosis), causada geralmente por Clostridium perfringens ou outras espécies de Clostri-dium; Geotricose, causada por Geotrichum candidum; síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), causada por prion GSS; Giardíase, causada por Giardia intestinalis; mormo, causada por Burkholderia mallei; Gnatostomíase, causada por Gnathostoma spinigerum e Gnathostoma hispidum; Gonorreia, causada por Neisseria gonorrhoeae; Granuloma inguinal (Donovanose), causada por Klebsiella granulomatis; infecção estreptocócica do Grupo A, causada por Streptococcus pyogenes; infecção estreptocócica do Grupo B, causada por Streptococcus agalactiae; infecção por Haemophilus influenzae, causada por Haemophilus influenzae; doença da mão, pé e boca (HFMD), causada por Enterovírus, principalmente vírus Coxsackie A e Enterovírus 71 (EV71); síndrome pulmonary por Hantavírus (HPS), causada pelo vírus Sin Nombre; infecção por Helicobacter pylori, causada por Helicobacter pylori; síndrome urêmica hemolítica (HUS), causada por Escherichia coli O157:H7; febre hemorrágica com síndrome renal (HFRS), causada pela família Bunyaviridae; Hepatite A, causada pelo vírus da Hepatite A; Hepatite B, causada pelo vírus da Hepatite B; He-patite C, causada pelo vírus da Hepatite C; Hepatite D causada pelo vírus da Hepatite D; Hepatite E, causada pelo vírus da Hepatite E; Herpes simplex, causada pelo vírus da Herpes simplex 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2); Histoplasmose, causada por Histoplasma capsulatum; infecção por ancilóstomo, causada por Ancylostoma duodenale e Necator americanus; infecção por bocavírus humano, causada pelo bocavírus humano (HBoV); erliquiose ewingii humana, causada por Ehrlichia ewingii; anaplasmose granulocítica humana (HGA), causada por Anaplasma phagocytophilum; infecção por metapneumovírus humano, causada por metapneumovíruS HUmano (hMPV); erliquiose monocítica humana, causada por Ehrlichia chaffeensis; infecção por papillomavirus humano (HPV), causada pelo papillomavirus humano (HPV); infecção pelo vírus parainfluenza humano, causada por vírus parainfluenza humanos (HPIV); Himenolepíase, causada por Hymenolepis nana e Hymenolepis diminuta; mononucleose infecciosa por vírus Epstein-Barr (Mono), causada pelo vírus Epstein-Ban (EBV); Influenza (gripe), causada pela família Orthomyxoviridae; Isosporíase, causada por Isospora Belli; doença de Kawasaki (causa desconhecida, mas evidências apoiam que seja infecciosa); ceratite; infecção por Kingella kingae, causada por Kingella kingae; Kuru, causada por prion Kuru; febre de Lassa, causada pelo vírus Lassa; Legionelose (doença de Legionnaires), causada por Legionella pneumophila; Legionelose (febre de Pontiac), causada por Legionella pneumophila; Leishmaniose, causada pelo gênero Leishmania; lepra, causada por Mycobacterium leprae e Mycobacterium lepromatosis; Leptospirose, causada pelo gêneroLeptospira; Listeriose, causada por Listeria monocytogenes; doença de Lyme (borreliose de Lyme), causada geralmente por Borrelia burgdorferi e outras espécies de Borrelia; filariose linfática (Elefantíase), causada por Wuchereria bancrofti e Brugia malayi; coriomeningite linfocítica, causada pelo vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV); Malária, causada pelo gênero Plasmodium; febre hemorrágica de Mar-burg (MHF), causada pelo vírus Marburg; sarampo, causada pelo vírus do sarampo; Melioidose (doença de Whitmore), causada por Burkholderia pseudomallei; Meningite; doença meningocócica, causada por Neisseria meningitidis; Metagonimíase, causada geralmente por Metagonimus yokagawai; Microsporidiose, causada pelo filo Microsporidia; Molusco contagioso (MC), causada pelo vírus do molusco contagioso (MCV); caxumba, causada pelo vírus da caxumba; tipo murino (tifo endêmico), causada por Rickettsia typhi; pneumonia por Micoplasma, causada por Mycoplasma pneumoniae; Micetoma, causada por inúmerasespécies de bactérias (Actinomycetoma) e fungos (Eumycetoma); Miíase, causada por larvas de mosca diptera parasítica; conjuntivite neonatal (Ophthalmia neonatorum), causada mais comumente por Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae; (nova) doença variante de CreutzfelDT-jakob (vCJD, nvCJD), causada POR prion vCJD; Nocardiose, causada geralmente por Nocardia asteroides e outras espécies de Nocardia; Oncocercíase (cegueira dos rios), causada por Onchocerca volvulus; Paracoccidioidomicose (blastomicose sul americana), causada por Paracoccidioides brasiliensis; Paragonimíase, causada geralmente por Paragonimus westermani e outras espécies de Paragonimus; Pasteurelose, causada pelo gênero Pasteurella; Pediculose capitis (piolhos da cabeça), causada por Pediculus humanus capitis; Pediculose corporis (piolhos do corpo), causada por Pediculus humanus corporis; Pediculose pubis (piolhos úbicos, chato), causada por Phthirus pubis; doença inflamatória pélvica (PID); Pertussis (coqueluche), causada por Bordetella pertussis; praga, causada por Yersinia pestis; infecção pneumocócica, causada por Streptococcus pneumoniae; pneumonia por Pneumocystis (PCP), causada por Pneumocystis jirovecii; Pneumonia; Poliomielite, causada por Poliovírus; infecção por Prevotella, causada pelo gênero Prevotella; meningoencefalite amebiana primária (PAM), causada geralmente por Naegleria fowleri; leucoencefalopatia multifocal progressiva, causada pelo vírus JC; Psittacose, causada por Chlamydophila psittaci; febre Q, causada por Coxiella burnetii; raiva, causada pelo vírus da raiva; febre da mordida de ratos, causada por Streptobacillus moniliformis e Spirillum minus; infecção pelo vírus sincicial respiratório, causada pelo vírus sincicial respiratório (RSV); Rinosporidiose, causada por Rhinosporidium seeberi; infecção por Rinovírus, causada por Rhinovirus; infecção por Rickettsial, causada pelo gênero Rickettsia; Rickettsialpox, causada por Rickettsia akari; febre do Vale do Rift (RVF), causada pelo vírus da febre do Vale do Rift; febre maculosa (RMSF), causada por Rickettsia rickettsii; infecção por Rotavírus, causada por rotavírus; Rubéola, causada pelo vírus da rubéola; Salmonelose, causada pelo gênero Salmonella; SARS (Síndrome Respiratória Aguda Grave), causada pelo coronavirus da SARS; Escabiose, causada por Sarcoptes scabiei; Esquistossomose, causada pelo gênero Schistosoma; Sepsis; Shigelose (Disenteria bacilar), causada pelo gênero Shigella; Cobreiro (Herpes-zóster), causada pelo vírus Varicela zoster (VZV); Bexiga (Varíola), causada por Variola major ou Variola minor; Sporotrichosis, causada por Sporothrix schenckii; Intoxicação alimentar por estafilococos, causada pelo gênero Staphylococcus; Infecção por estafilococos, causada pelo gê-neroStaphylococcus; Estrongiloidíase, causada por Strongyloides stercoralis; Sífilis, causada por Treponema pallidum; Teníase, causada pelo gênero Taenia; Tétano, causada por Clostridium tetani; Tinea barbae (Micose da barba), causada normalmente pelo gênero Trichophyton; Tinea capitis (Micose do couro cabeludo), causada normalmente por Trichophyton tonsurans; Tinea corporis (Micose do corpo), causada normalmente pelo gênero Trichophyton; Tinea cruris (Micose na Virilha), causada normalmente por Epidermophyton floccosum, Tri-chophyton rubrum, e Trichophyton mentagrophytes; Tinea manuum (Micose na mão), causada por Trichophyton rubrum; Tinea nigra, causada normalmente por Hortaea werneckii; Tinea pedis (Pé de atleta), causada normalmente pelo gênero Trichophyton Tinea unguium (Onicomicose), causada normalmente pelo gênero Trichophyton; Tinea versicolor (Pitiríase versicolor), causada pelo gênero Malassezia; Toxocaríase (Larva Migrans Ocular (OLM)), causada por Toxocara canis ou Toxocara cati; Toxocaríase (Larva Migrans Visceral (VLM)), causada por Toxocara canis ou Toxocara cati; Toxoplasmose, causada por Toxoplasma gondii; Triquinelose, causada por Trichinella spiralis; Tricomoníase, causada por Trichomonas vaginalis; Tricuríase (infecção por Trichuris trichiura), causada por Trichuris trichiura; Tuberculose, causada normalmente por Mycobacterium tuberculosis; Tularemia, causada por Francisella tularensis; Infecção por Ureaplasma urealyticum, causada por Ureaplasma urealyticum; Encefalite equina venezuelana, causada pelo vírus da encefalite equina venezuelana; Febre hemorrágica venezuelana, causada pelo vírus Guanarito; Pneumonia viral; Febre do Nilo Ocidental, causada pelo vírus do Nilo Ocidental; Piedra branca (Tinea blanca), causada por Trichosporon beigelii; infecção por Yersinia pseudotuberculosis, causada por Yersinia pseudotuberculosis; Yersiniosis, causada por Yersinia enterocolitica; febre amarela, causada pelo vírus da febre amarela; Zigomicose, causada pela ordem Mucorales (Mucormicose) e ordem Entomophthorales (Entomoftoromicose).
[00837] Quando a proteína ou peptídeo de interesse é um antígeno, qualquer um membro da família Bacillus cereuspoderá ser usado para expressar a proteína de fusão. Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides são preferidos.
[00838] Para preparar uma vacina, o antígeno de interesse é incorporado na proteína de fusão por métodos conhecidos, tais como o splicing PCR por extensão de sobreposição, digestão com endonu-cleases de restrição e ligação ou síntese de genes de novo. O gene da proteína de fusão é então introduzido num membro da família Bacillus cereus recombinante por transfecção, transformação, conjugação, eletroporação ou outros métodos conhecidos. O membro da família Bacillus cereus recombinante é, então, crescido no meio de cultura (por exemplo, meios mínimos de líquido) e deixou-se esporular. De preferência, a esporulação continua para conclusão antes dos esporos serem coletados e armazenados. Os esporos podem ser coletados por centrifugação ou por esfregaço de esporos das placas de crescimento e introdução em meio líquido (por exemplo, PBS ou água) seguido de centrifugação e lavagem do sedimento de esporos resultante em meio líquido. Antes de usar, o sedimento de esporos podem ser ressuspensos em meio líquido a uma concentração desejada para utilização ou injeção. Onda a vacina é para compreender fragmentos exosporium, os fragmentos exosporium podem ser preparados utilizando qualquer um dos métodos descritos na seção XIX.H acima.
[00839] A concentração desejada dos esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos exosporium numa vacina baseia-se no tamanho do sujeito, a quantidade de antígeno ativo sobre a superfície dos esporos, e a presença e a concentração dos adjuvantes na formulação de vacina. Uma vacina da invenção pode conter adjuvantes convencionais, incluindo transportadores farmaceuticamente aceitáveis.
[00840] Um método de produzir uma resposta imunogênica num indivíduo é proporcionado. O método compreende a administração de uma vacina recombinante contendo esporos membro da família Bacillus cereus que expressam proteínas de fusão ou fragmentos de proteínas de fusão compreendendo exosporium tal como aqui descrito para o sujeito.
[00841] A vacina como aqui descrita é adequada para administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, tópica, oral, intranasal, intradérmica, administração transepitelial ou por inalação.
[00842] A vacina pode ser administrada a um indivíduo humano que é, murina, aviária, suínos, bovinos, ovinos, felinos, caninos, equinos, caprinos, réptil ou um primata não humano. O sujeito é de preferência mamífero e mais preferencialmente humano.
XXIII. REMEDIAÇÃO
[00843] Quando a proteína ou peptídeo de interesse é uma proteína de reparação ou peptídeo, uma substância tóxica é cataliticamente convertida pela proteína de reparação ou peptídeo para uma substância não tóxica ou menos tóxicas.
[00844] Quando a proteína de reparação ou peptídeo compreende uma enzima, a enzima é exibida e estabilizada no lado de fora do esporo e pode ser entregue em solo contaminado ou água contaminada em uma forma que é ativa contra um alvo poluente químico ou alvo.
[00845] As enzimas apropriadas dependerão do poluente ou química a ser alvo de remediação.
[00846] Para preparar uma composição de remediação, a enzima de interesse é incorporada na proteína de fusão por métodos conhecidos, tais como o splicing PCR por extensão de sobreposição, digestão com endonucleases de restrição e ligação ou síntese de genes de novo. O gene da proteína de fusão é então introduzido num membro da família Bacillus cereus recombinante por transfecção, transformação, conjugação, eletroporação ou outros métodos conhecidos. O membro da família Bacillus cereus recombinante é, então, crescido no meio de cultura (por exemplo, meios mínimos de líquido) e deixou-se esporular. De preferência, a esporulação continua para conclusão antes dos esporos serem coletados e armazenados. Os esporos podem ser coletados por centrifugação ou por esfregaço de esporos das placas de crescimento e introdução em meio líquido (por exemplo, PBS ou água) seguido de centrifugação e lavagem do sedimento de esporos resultante em meio líquido. Antes de usar, o sedimento de esporos podem ser ressuspensos em meio líquido a uma concentração desejada para utilização. Alternativamente, o sedimento de esporos pode ser formulado em grânulos a uma concentração desejada para utilização e aplicação para o ambiente contaminado. Onde fragmentos exosporium são para ser utilizados para reparação, os fragmentos exosporium podem ser preparados utilizando qualquer um dos métodos descritos na seção XIX.H acima.
[00847] É proporcionado um método para reduzir contaminantes num ambiente. O método compreende expor um ambiente contaminado para um esporo do membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa a proteína de fusão como descrito acima nos parágrafos [00171]— [00173] [00175] e [00177] da Seção I, em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima de reparação.
[00848] É proporcionado um outro método para reduzir contaminantes num ambiente. O método compreende a exposição de um ambiente contaminado aos fragmentos exosporium. Os fragmentos exosporium são derivados de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma enzima de reparação.
[00849] Ainda um outro método para a redução dos contaminantes num ambiente é fornecida. O método compreende a exposição de um ambiente contaminado a esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante. O membro da família Bacillus cereus recombinante é um membro da família Bacillus cereus recombinante, como descrito acima na Seção II.
[00850] Nos métodos para reduzir contaminantes que compreendem a exposição de um ambiente contaminado a fragmentos exosporium ou a um membro da família Bacillus cereus recombinante, tal como descrito acima na Seção II, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium pode compreender qualquer uma das sequências de direcionamento, proteínas do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium aqui descritos. Em particular, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium pode compreender qualquer uma das sequências de direcionamento da proteína do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium descritos acima nos parágrafos [00782] [00801].
[00851] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor de esporulação nativo da sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão ou uma porção da mesma e/ou sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão. O promotor pode ser qualquer um dos promotores descritos acima na Seção III.
[00852] Quando a proteína ou peptídeo de interesse é uma enzima de remediação, qualquer um membro da família Bacillus cereuspoderá ser usado para expressar a proteína de fusão. Bacillus thuringiensis, Bacillus cereusou, ou Bacillus mycoidessão preferidos.
[00853] Os esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante podem compreender uma cepa de bactérias endofíticas de fitorremediação, como membro da família Bacillus cereus EE349, membro da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, ou Bacillus thuringiensis EE319.
[00854] O ambiente contaminado a ser tratado pode ter gás, líquido, semilíquido, gel, película, semissólido ou sólido. O ambiente sólido pode ser solo, como solo superficial e solo subterrâneo, composto, resíduo de cultura, folhas, cobertura morta, árvores cortadas, um biofilme, uma camada de limo, mofo, lodo, areia, escória, sedimento, esgoto, resíduos de rocha, resíduos nucleares, munições e engenhos explosi-vos,resíduos hospitalares, autopeças, desperdícios de lixo, resíduos de isolamento, resíduos de alimentos, amianto, baterias, sucata industrial, resíduos de aterros, resíduos de madeira, resíduos têxteis, resíduos de vidro, resíduos de couro, resíduos de borracha, resíduos plás-ticos,resíduos de componentes, resíduos agrícolas, resíduos fotográ-ficos,resíduos de cerâmica, resíduos farmacêuticos, cera, catalisadores usados ou uma combinação dos mesmos. O ambiente líquido pode ser água potável, águas subterrâneas, águas superficiais, salmoura, tanques de armazenamento, lagoas, um sistema aquático, águas residuais industriais, drenagem ácida de minas, autofluido gasto, banhos de revestimento gastado, soluções de desengorduramento, soluções de limpeza a seco, refrigerantes de máquina, fluido de perfuração, resíduos de fluidos de corte, resíduos de fluidos hidráulicos, resíduos de lubrificantes, tintas, águas residuais oleosas, efluentes de fábricas de celulose, sistema de tratamento de água, sistema séptico, sistema de esgoto, lagoa de precipitação, lagoa, rio, ou combinações dos mesmos. O ambiente gasoso pode ser ar, um gás de combustão, tais como as emissões das usinas de energia, incineradores de lixo, crematórios ou refinarias, um fluxo de escape do processo, gás de aterro sanitário, gás natural, gás propano, ou uma combinação destes.
[00855] O ambiente contaminado pode ser contaminado por vários contaminantes incluindo, mas não limitado a um agente de guerra química compreendendo sarin (GB, o-isopropil metilfosfonofluoridato); somano (GD; o-pinacolil metilfosfonofluoridato); ciclostatina (GF, ociclo-hexilmetilfosfonofluoridato); VX (O-etil S[2(di-isopropilamino) etil] metilfosfonotioato); tabun (GA; N, N-dimetiletil fosforoamidocianidato), DFP (fosforofluoridato di-isopropílico), ou um agente de mostar- da; um composto inorgânico que compreende arsênio, antimônio, bá-rio,berílio, cádmio, crômio, cobre, ferro, chumbo, manganês, mercúrio, níquel, selênio, prata, estanho, tálio, urânio, zinco ou uma combinação destes; um composto orgânico que compreende um hidrocarboneto aromático policíclico (PAH), um composto aromático clorado, um com-postoalifático clorado, um composto nitroaromático (NAC), um com-postofenólico, um composto de ciano, dioxina, ou uma combinação destes; um óleo bruto, um óleo refinado, um óleo combustível, um óleo diesel, uma gasolina, um óleo hidráulico e querosene, ou um seu com-ponentevolátil tal como benzeno, tolueno, etilbenzeno, xileno ou naftaleno; um explosivo, um fertilizante, um pesticida, um insecticida ou um herbicida
[00856] A concentração de esporos recombinantes ou fragmentos exosporium necessários para tratar um ambiente contaminado baseiase em fatores incluindo o volume ou área a ser tratada, a extensão do produto químico alvo, poluente ou matéria orgânica presente, a quan-tidade de tempo disponível para tratamento e a quantidade de enzima ativa na superfície dos esporos.
[00857] Os esporos membro da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos exosporium podem contactar o ambiente contaminado por incorporação dos esporos ou fragmentos exosporium numa corrente que contém o contaminante, o contato de uma corrente contendo o contaminante com um material de imobilização contendo os esporos ou fragmentos exosporium (por exemplo, um filtro, membrana, esponja ou cassete), incorporando os esporos ou fragmentos exosporium em grânulos a serem misturados com o ambiente contaminado, a pulveri-zação dos esporos ou fragmentos exosporium sobre ou dentro do am-biente contaminado, injetando os esporos ou fragmentos exosporium para o ambiente contaminado, ou encharcando o ambiente contaminado com os esporos ou fragmentos exosporium.
[00858] Os esporos podem ser combinados com inoculantes bacterianos, produtos químicos, solventes e outros produtos que podem acelerar o processo de decomposição.
[00859] A enzima de reabilitação inclui, mas não se limita a uma proteína de ligação a fosfato, uma protease, uma hidrolase de carboidrato, uma lipase, uma fosfolipase, uma nuclease, uma proteína de ligação de nutrientes, uma celulase, uma oxidoredutase, uma monoxigenase, uma dioxigenase, uma lacase, uma peroxidase de lignina, uma peroxidase de manganês, uma peroxidase, uma dehalogenase, uma catalase, uma amilase, uma redutase, uma oxidase, uma amidase, uma ligninase, uma xilanase, uma pectinase, uma xilosidase, uma endoglucanase, uma exoglucanase, uma glicosidase, um peptídeo inibidor de biofilme, uma enzima de degradação de herbicida, uma enzima degradante de pesticida (por exemplo, um piretrinase), ou uma combinação dos mesmos.
[00860] Quando a enzima compreende uma enzima de degradação de herbicida ou uma enzima de degradação de pesticida, o membro da família de Bacillus cereus recombinante compreende adequadamente uma cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida. Por exemplo, a cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida pode compreender membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[00861] Um método para fitoremediação de solo contaminado, também é fornecido. O método compreende a introdução de esporos de membros da família Bacillus cereus recombinantes em solo contaminado; ou a aplicação de esporos de membros da família Bacillus cereus recombinantes a uma planta plantada em solo contaminado, ou uma semente de planta para plantação em solo contaminado, ou uma área de solo contaminado que rodeia uma planta ou uma semente de planta; em que os esporos dos membros da família de Bacillus cereus recombinantes expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para a exosporium do esporo do membro da família Bacillus cereus recombinante, em que a proteína de fusão é a proteína de fusão como descrito acima, em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima de reparação, e em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa endofítica de bactérias ou uma cepa colonizadora de bactérias. Por exemplo, a bactéria recombinante formadora de esporos pode compreender uma cepa endofítica de bactérias.
[00862] Um método ainda para fitoremediação de solo contaminado,é fornecido. O método compreende a expressão de uma enzima de reparação de esporos membro da família Bacillus cereus, em que a expressão da enzima recombinante na reparação de esporos de um membro da família Bacillus cereusé aumentada em comparação com a expressão da enzima de reparação de um tipo selvagem de esporos do membro da família Bacillus cereus.
[00863] Outro método para fitoremediação de solo contaminado, também é fornecido. O método compreende a introdução de uma bactéria formadora de esporos recombinante em solo contaminado; ou aplicar a bactéria em forma de esporos recombinantes a uma planta plantada em solo contaminado, ou uma semente de planta a ser plantada em solo contaminado, ou uma área de solo contaminado em torno de uma planta ou uma semente de planta. A bactéria formadora de esporos recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direciona a proteína de fusão à superfície de um esporo da bactéria. A proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína CotB, uma proteína CotC, uma proteína AgeC, uma proteína CotB/H, uma proteína Cot G, uma proteína de revestimento de esporos proteína X, ou uma proteína CotY. A bactéria em forma de esporos recombinante compreende uma cepa de bactérias endofíticas ou uma linhagem colonizadora de bactérias. A proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima de reparação.
[00864] Outro método para fitoremediação de solo contaminado, também é fornecido. O método compreende a introdução de fragmentos exosporium em solo contaminado ou aplicando fragmentos exosporium a uma planta plantada em solo contaminado, ou uma semente de planta a ser plantada em solo contaminado, ou uma área de solo contaminado em torno de uma planta ou uma semente de planta. Os fragmentos exosporium são derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma enzima de reparação.
[00865] Outro método ainda para fitoremediação de solo contaminado,é fornecido. O método compreende a introdução de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante em solo contaminado. Alternativamente, o método compreende a aplicação de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante para uma planta plantada em solo contaminado, ou de uma semente da planta a ser plantada em solo contaminado, ou uma área de solo contaminado em torno de uma planta ou uma semente de planta. O membro da família Bacillus cereus recombinante é um membro da família Bacillus cereus recombinante, como descrito acima na Seção II, e a proteína de fusão compreende uma enzima de reparação.
[00866] Nos métodos de fitorremediação de solo contaminado que envolvem o uso de fragmentos exosporium ou um membro da família Bacillus cereus recombinante, tal como descrito acima na Seção II, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium pode compreender qualquer uma das sequências de direcionamento, proteínas do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium aqui descritos. Em particular, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium pode compreender qualquer uma das sequências de dire-cionamento das proteínas do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium descritos acima nos parágrafos [00782] [00801].
[00867] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor de esporulação nativo da sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão ou uma porção da mesma e/ou sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão. O promotor pode ser qualquer um dos promotores descritos acima na Seção III.
[00868] A enzima de reparação é exibida no lado de fora dos esporos e no interior da planta de forma que tanto a planta e esporos podem converter o contaminante alvo. A planta pode absorver o contaminante alvo enquanto os esporos convertem o contaminante numa forma não tóxica ou menos tóxica dentro da planta ou do seu sistema radicular.
[00869] Os esporos de membros da família Bacillus cereus recombinantes podem compreender uma cepa endofítica de bactérias, tal como Bacillus cereus EE349, membros da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, ou Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, membro da família Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EEB00366, ou Bacillus mycoides EE-B00363.
[00870] Os esporos ou os fragmentos exosporium podem ser aplicadosà planta ou à semente da planta, e a planta ou planta crescida a partir da semente da planta é tolerante a um contaminante alvo a ser remediado do solo contaminado
[00871] No método para a fitoremediação, membros da família Bacillus cereus recombinantes submete a esporulação dentro da planta.
[00872] Os esporos membro da família recombinantes Bacillus cereus podem ser introduzidos no meio de crescimento de plantas através de vários métodos, tais como a drenagem do solo no momento do plantio. Os esporos também podem ser revestidos sobre a semente da planta como um tratamento de semente.
[00873] De preferência, a planta a ser tratada com a enzima de reparação é tolerante para o contaminante alvo de modo que a planta não é ferida pelo contaminante alvo.
[00874] A concentração de esporos recombinantes necessária para o método fitorremediação se baseia em fatores incluindo o volume ou área a ser tratada, a capacidade das cepas de endófitos que colonizam as raízes das plantas, na medida em que o contaminante alvo está presente, e a quantidade de enzima ativa na superfície dos esporos.
[00875] É proporcionado um outro método para reduzir contaminantes num ambiente. O método compreende a exposição de um ambiente contaminado aos esporos de uma cepa do membro da família Bacillus cereus que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida. Os contaminantes do meio ambiente compreendem um herbicida, um pes-ticida, ou uma combinação dos mesmos. A cepa do membro da família Bacillus cereus que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida compreende membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B50928), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B67119), Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121), ou uma combinação deste.
[00876] A cepa de um membro da família Bacillus cereus que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida pode compreender um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa_uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium que direciona a proteína de fusão para a exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína ou peptídeo de interesse compreende de preferência uma enzima degradante de herbicida, uma enzima pesticida de degradação, ou uma combinação dos mesmos.
[00877] Desta forma, pesticida ou dupla atividade de degradação de herbicida pode ser obtida uma vez que tanto as cepas do membro da família Bacillus cereus e as enzimas degradantes herbicidas ou pesti-cidas que se degradam na proteína de fusão irá exercer atividade pes-ticidae/ou herbicida degradante. Os herbicidas e/ou pesticidas que são degradados pela cepa familiar Bacillus cereus que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida pode ser o mesmo que ou diferente a partir dos herbicidas e/ou pesticidas que são degradados pela enzima degradante do herbicida ou pela enzima que degrada o pesticida. Assim, onde um ambiente está contaminado com um único tipo de herbicida ou pesticida, pode ser obtida uma ação de degradação dupla contra esse único herbicida ou pesticida. Alternativamente, quando um ambiente é contaminado com mais de um tipo de herbicida ou pesticida, pode ser obtido uma ação de dupla degradação contra dois ou mais herbicidas ou pesticidas diferentes.
[00878] Nos métodos de redução de contaminantes que envolvem a utilização de uma das cepas dos membros da família Bacillus cereus aqui descritas que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium pode compreender qualquer uma das se-quências de direcionamento, proteínas do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium aqui descritos. Em particular, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium pode compreender qualquer uma das sequências de dire-cionamento das proteínas do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium descritos acima nos parágrafos [00782] [00801].
XXIV. QUEBRANDO EMULSÕES OU GÉIS EM UM FLUIDO DE FRATURAMENTO HIDRÁULICO
[00879] Um método de tratamento de um fluido de fratura hidráulica para quebrar uma emulsão ou gel dentro do fluido é fornecido. O método compreende a adição de esporos de esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante para um fluido de fraturamento hidráulico. Assim, um membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do esporo do membro da família Bacillus cereus recombinante. Tal proteína de fusão é descrita acima, em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima adequada para quebrar a emulsão ou gel.
[00880] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinantes aqui descritos, que expressam uma proteína de fusão.
[00881] Um outro método de tratamento de um fluido de fratura hidráulica para quebrar uma emulsão ou gel dentro do fluido é fornecido. O método compreende a adição de fragmentos exosporium para um fluido de fratura hidráulica. Os fragmentos exosporium são derivados de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma enzima adequada para quebrar a emulsão ou gel.
[00882] A enzima é selecionada com base na emulsão ou gel alvo a ser trATada e o pH do fluido da fratura hidráulica. As enzimas incluem, mas não estão limitadas a uma hemicelulase, uma amilase, uma pectinase, uma hidrolase de carboidrato, uma celulase, uma agarase, uma poligalacturonase, uma endoglucanase, ou uma combinação dos mesmos.
[00883] A emulsão ou gel contém um polímero ou outro componente que a enzima pode digerir. A emulsão ou gel pode compreender um polímero, goma arábica, ágar, goma de xantana, celulose, carboximetilcelulose, carboximetilhidroxietil celulose, hidroxietilmetilcelulose, guar, um derivado guar, ou uma combinação deste.
[00884] Quando a proteína ou peptídeo de interesse é uma enzima para quebrar uma emulsão ou gel, qualquer membro da família Bacillus cereus pode ser utilizado para expressar a proteína de fusão. Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides são preferidos.
[00885] Os esporos ou fragmentos de exosporium podem ser injetados num poço que está em contato com uma formação subterrânea contendo hidrocarbonetos tal como um reservatório de arenito ou um reservatório de carbonato.
[00886] A concentração de esporos ou fragmentos de exosporium necessários baseia-se em fatores incluindo o tamanho do poço a ser tratado, o tipo de emulsão ou gel, a quantidade de enzima ativa na su-perfície dos esporos ou fragmentos de exosporium e a presença e concentração de adjuvantes administrados com as enzimas.
[00887] As enzimas capazes de digerir polímeros ou outros componentes dentro da emulsão ou gel, ou pode dissolver esses componentes de modo que o fluido da fratura hidráulica pode ser bombeado para fora do poço.
[00888] Nos métodos de tratamento de um fluido de fratura hidráulica para quebrar uma emulsão ou gel no interior do fluido, qualquer uma das sequências de direcionamento, proteínas do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium aqui descritas podem ser utili-zadas. Em particular, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium pode compreender qualquer uma das sequências de direcionamento da proteína do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium descritos acima nos parágrafos [00759][00778].
[00889] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor de esporulação nativo da sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão ou uma porção da mesma e/ou sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão. O promotor pode ser qualquer um dos promotores descritos acima na Seção III.
XXV. PROCESSAMENTO DA MATÉRIA-PRIMA
[00890] Matéria-prima é gerada a partir de plantas que são coletadas para a sua biomassa, e processadas num alimento para animais (salvamento, silagem, extrusão, granulação, etc). A biomassa das plantas que constitui a matéria-prima é muitas vezes difícil de digerir devido à natureza fibrosa do material. A presença de enzimas pode ajudar muito na degradação deste material fibroso, que conduz a uma mais digerível e mais fácil para processar o material. Tradicionalmente, as enzimas são adicionadas depois da matéria-prima ter sido processada e no momento da entrega ao organismo que está a ingerir a matéria-prima. Enzimas entregues na matéria-prima podem melhorar a saúde e ganho de peso dos animais-alvo, bem como reduzir o impacto ambiental dos resíduos de produtos de animais alimentados com esses alimentos suplementados com enzima.
[00891] Esses mesmos sistemas podem ser utilizados para prétratamento de matéria-prima que é destinado para a produção de biocombustíveis, incluindo a transformação em bioetanol, biodiesel, ou outros biocombustíveis.
[00892] Muitas espécies de esporos têm a capacidade de persistir em superfícies foliares, tais como folhas, caules, frutos, e por longos períodos de tempo. Ao utilizar tecnologias de exibição de esporos, tal como aqui descrito para indicar as enzimas sobre estes esporos, enzima ativa é fornecida à matéria-prima que estará presente à medida que a matéria-prima é coletada. Estas enzimas alvo podem também ser fornecidas à planta de matéria-prima na plantação, quer através da libertação de esporos recombinantes nas sementes de plantas, quer pela entrega dos esporos recombinantes ao meio de crescimento da planta ou à área em torno da planta.
[00893] Um método para a entrega de enzimas a uma planta é fornecido. O método compreende a introdução num meio de crescimento de plantas de um membro da família recombinante de Bacillus cereus que expressa uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento,proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium do membro da família recombinante de Bacillus cereus ou uma formulação compreendendo um membro da família recombinante de Bacillus cereus como aqui descrito; ou aplicar a uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou uma semente da planta do membro da família recombinante de Bacillus cereus ou a formulação compreendendo um membro da família recombinante de Bacillus cereus. A proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima. A enzima pode ser ligada fisicamente ao exosporium do membro da família recombinante de Bacillus cereus.
[00894] Um outro método para a entrega de enzimas a uma planta é fornecido. O método compreende a introdução num meio de crescimento de plantas de uma bactéria formadora de esporos recombinante ou de uma formulação compreendendo a bactéria recombinante formadora de esporos; ou a aplicação a uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta da bactéria formadora de esporos recombinante ou uma formulação que compreende a bactéria formadora de esporos recombinantes. A bactéria formadora de esporos recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direciona a proteína de fusão à superfície de um esporo da bactéria. A proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína CotB, uma proteína CotC, uma proteína AgeC, uma proteína CotB/H, uma proteína Cot G, uma proteína de revestimento de esporos proteína X, ou uma proteína CotY. A bactéria recombinante formadora de esporos compreende uma cepa endofítica de bactérias. A proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima, e a enzima está fisicamente ligada ao revestimento de esporos da bactéria formadora de esporos recombinantes
[00895] Ainda outro método para a entrega de enzimas a uma planta é fornecido. O método compreende a introdução de fragmentos de exosporium ou uma formulação contendo os fragmentos de exosporium num meio de crescimento de plantas; ou a aplicação de fragmentos de exosporium ou uma formulação contendo os fragmentos de exosporium a uma planta, uma semente de planta ou uma área que rodeia uma planta ou uma semente de planta. Os fragmentos exosporium são derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima.
[00896] Quando o método para a entrega de enzimas para uma planta compreende a utilização de fragmentos exosporium, o método pode ainda compreender o tratamento da planta com um agente de penetração, um agente surfactante, um detergente, um óleo, ou uma combinação dos mesmos.
[00897] Cepas de bactérias óptimas para estes métodos incluem, mas não estão limitadas aos membros da família Bacillus cereus, in-cluindoBacillus cereus, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensise, Ba-cillus pseudomycoides, assim como outros Bacillus formadores de es-poros,incluindo Bacillus megaterium, Bacillus firmus, Bacillus flexus, membros clade Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformise e Bacilllus subtilis.
[00898] A aplicação pode ser diretamente sobre o material de planta, opcionalmente em conjunto com adjuvantes, tais como agentes surfactantes não iônicos ou outros. O membro da família Bacillus cereus recombinante pode ser aplicado à folhagem da planta antes da coleta, tais como por pulverização sobre a folhagem.
[00899] A aplicação à semente da planta é geralmente realizada como um mergulho de sementes, uma suspensão, ou um revestimento de sementes à base de polímero. Opcionalmente, a aplicação pode ser feita em conjunto com inoculantes aplicados em sementes, fungicidas, inseticidas ou nematocidas.
[00900] A aplicação ao meio de crescimento da planta ou área em torno da planta pode ser efetuada antes da plantação, durante a plantação ou após o plantio das sementes, opcionalmente em conjunto com fertilizantes, fungicidas, herbicidas ou inseticidas.
[00901] A enzima é apropriada para a degradação da biomassa, digerindo material celulósico, auxiliando na digestão num sistema di-gestivo de um animal alvo para o qual a planta pode ser alimentada, ou para a produção de biocombustíveis (por exemplo, para a produção de bioetanol ou biodiesel).
[00902] A enzima inclui, mas não está limitada a uma protease não específica, uma metaloprotease, uma celulase, uma xilanase, uma fosfatase, uma endoglucanase, uma exoglucanase, uma β-glucosidase, uma amilase, uma pectinase, uma xilosidase, uma lipase, uma fosfolipase, ou uma combinação dos mesmos.
[00903] A seleção de enzimas pode depender da matéria-prima e a utilização prevista para a matéria-prima. As enzimas são de preferência enzimas degradativas.
[00904] Enzimas de interesse na família de protease incluem proteases não específicas, tais como proteases da serina, proteases de aspartato, proteases de histidina, assim como metaloproteases.
[00905] Enzimas de interesse na família celulase incluiriam exoglucanases, endoglucanases, β-1,3 glicosidases, celulases, hemicelulases, a-glucosidases.
[00906] Enzimas de interesse na família xilanases incluem xilosidases, endoxilanases, exoxylanases, pectinases, pectinases metílicas, poligalacturonase.
[00907] As enzimas de interesse nas fosfatases incluem fosfatases ácidas, fosfatases alcalinas, polifosfatases, fitases, monofosfatases e difosfatases.
[00908] Muitas destas enzimas são também benéficas para o cres-cimento das plantas.
[00909] Estas enzimas podem não só "pré-digestão"algumas das matérias-primas para aumentar a absorção de nutrientes essenciais por um animal alvo para o qual a matéria-prima é alimentada, mas também podem auxiliar a digestão no sistema digestivo do animal alvo.
[00910] A "pré-digestão"do material celulósico na coleta pode libertar celulose livre durante o processamento para o bioetanol e produção de biocombustíveis, bem como pré-processamento de óleos destinadosà produção de biocombustíveis.
[00911] A bactéria pode ser uma bactéria endófita. A seleção de bactérias recombinantes endofíticas permitirá que as bactérias entrem na planta, mas também colonizem e cresçam dentro dos tecidos vegetais. Isto estabelecerá um número crescente de organismos formadores de esporos recombinantes dentro da planta à medida que cresce a partir da utilização de uma quantidade relativamente pequena de esporos recombinantes na semente ou com a semente ao plantio. Após a coleta do material de biomassa vegetal, a bactéria sofrerá esporulação, criando novas enzimas na planta, que são ativas na matériaprima à medida que são coletadas, transportadas e utilizadas, por exemplo, como ração animal ou para produção de biocombustíveis. Isto pode reduzir significativamente o custo de entrada de enzimas de degradação em comparação com as técnicas existentes. Este é um método único de fornecimento de enzimas digestivas para a biomassa, antes do processamento industrial.
[00912] Embora as cepas bacterianas óptimas são como descritas acima, a seleção de cepas de endófitos aumentará a eficácia. De preferência, as bactérias compreendem endófitos dos membros da família Bacillus cereus EE349, membro da família Bacillus cereus 439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus megaterium EE385, Bacilo sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, Lysinibacillus sphaericus EE443, ou uma combinação dos mesmos.
[00913] A planta pode ser uma cultura selecionada a partir do milho, alfafa, trigo, uma cultura de pastagem, uma colheita de forragem, soja, switchgrass (gramínea nativa da América do Norte cujo nome científico é Panicum virgatum), jicama, sorgo doce, cana de açúcar, ou uma combinação destes, e outras matérias-primas para biocombustíveis e bioetanol.
[00914] Para os métodos para a entrega de enzimas a uma planta, qualquer uma das sequências de direcionamento, proteínas do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium aqui descritos podem ser utilizados.
XXVI. USO DE ESPOROS NAS PROPRIEDADES DE ALTERAÇÃO DAS PLANTAS ALVO
[00915] Os membros da família Bacillus cereus recombinantes e a bactéria formadora de esporos recombinantes como aqui descrita permitem a interação das moléculas de sinalização exibidas na superfície que afetam vias bioquímicas e um número de outras proteínas que beneficiam a saúde das plantas. A presença das proteínas ou peptídeos de esporos exibida pode conduzir a uma alteração do metabolismo da planta alvo, levando a mudanças na composição da planta, seus frutos, ou outras propriedades ou características.
[00916] A expressão das proteínas de fusão pode ser diretamente utilizada para alterar a composição da planta alvo. Seleção de diferentes enzimas conduz aos efeitos variados na planta alvo.
[00917] Um método para alterar uma propriedade de uma planta é fornecido. O método compreende a introdução num meio de crescimento de plantas de um membro da família recombinante de Bacillus cereus que expressa uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium do membro da família recombinante de Bacillus cereus ou uma formulação compreendendo um membro da família recombinante de Bacillus cereus como aqui descrito; ou aplicar a uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou uma semente da planta do membro da família recombinante de Bacillus cereus ou a formulação compreendendo um membro da família recombinante de Bacillus cereus. A proteína ou peptídeo de interesse compreende uma molécula de sinalização da planta ou uma enzima que afeta a composição de planta, e a proteína ou peptídeo de interesse pode ser ligada fisicamente ao exosporium do membro da família recombinante de Bacillus cereus.
[00918] Outro método para alterar uma propriedade de uma planta é fornecido. O método compreende a introdução num meio de crescimento de plantas de uma bactéria formadora de esporos recombinante ou de uma formulação compreendendo a bactéria recombinante formadora de esporos; ou a aplicação a uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta da bactéria formadora de esporos recombinante ou uma formulação que compreende a bactéria formadora de esporos recombinantes. A bactéria formadora de esporos recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direciona a proteína de fusão à superfície de um esporo da bactéria. A proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína CotB, uma proteína CotC, uma proteína AgeC, uma proteína CotB/H, uma proteína Cot G, uma proteína de revestimento de esporos proteína X, ou uma proteína CotY. A bactéria recombinante formadora de esporos compreende uma cepa endofítica de bactérias. A proteína ou peptídeo de interesse compreende uma molécula de sinalização da planta ou uma enzima que afeta a composição de planta, e a proteína ou peptídeo de interesse pode ser fisicamente ligada ao revestimento de esporos da bactéria formadora de esporos recombinantes
[00919] Ainda outro método para alterar uma propriedade de uma planta é fornecido. O método compreende a introdução de fragmentos de exosporium ou uma formulação contendo os fragmentos de exosporium num meio de crescimento de plantas; ou a aplicação de fragmentos de exosporium ou uma formulação contendo os fragmentos de exosporium a uma planta, uma semente de planta ou uma área que rodeia uma planta ou uma semente de planta. Os fragmentos exosporium são derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína ou peptídeo de interesse compreende uma molécula de sinalização da planta ou uma enzima que afeta a composição de planta.
[00920] Quando o método para alterar uma propriedade de uma planta compreender utilização de fragmentos exosporium, o método pode ainda compreender o tratamento da planta com um agente de penetração, um agente surfactante, um detergente, um óleo, ou uma combinação dos mesmos.
[00921] A bactéria alvo sobrevive de preferência ou prospera no ambiente e sobre as raízes da planta-alvo. Cepas de bactérias óptimas para estes métodos incluem, mas não estão limitadas ao membro da família Bacillus cereus EE349, membro da família Bacillus cereus 439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, ou Lysinibacillus sphaericus EE443.
[00922] As moléculas de sinalização da planta ou enzimas também podem ser entregues à planta no plantio, quer através da libertação de esporos recombinantes nas sementes de plantas, quer pela entrega dos esporos recombinantes ao meio de crescimento da planta ou à área em torno da planta.
[00923] A aplicação pode ser diretamente sobre o material de planta, opcionalmente em conjunto com adjuvantes, tais como agentes surfactantes não iônicos ou outros. O membro da família Bacillus cereus recombinante, a bactéria formadora de esporos recombinantes, ou os fragmentos exosporium podem ser aplicados à folhagem da planta an tes da coleta, tal como por pulverização sobre a folhagem.
[00924] A aplicação à semente da planta é geralmente realizada como um mergulho de sementes, uma suspensão, ou um revestimento de sementes à base de polímero. Opcionalmente, a aplicação pode ser feita em conjunto com inoculantes aplicados em sementes, fungicidas, inseticidas ou nematocidas.
[00925] A aplicação ao meio de crescimento da planta ou área em torno da planta pode ser efetuada antes da plantação, durante a plantação ou após o plantio das sementes, opcionalmente em conjunto com fertilizantes, fungicidas, herbicidas ou inseticidas.
[00926] A enzima inclui, mas não está limitada a compreender endoglucanases, proteases, fosfolipases, aminocarboxy-1propanedeaminase, desaminases de ácido aminociclopropano-1carboxílico, lipases, ou uma combinação dos mesmos.
[00927] As moléculas de sinalização de plantas incluem, mas não estão limitadas a flagelina flg22 e peptídeos, criptografia, harpinas, proteínas tipo harpina, enzimas que degradam ou modificam uma origem bacteriana, fúngica, planta ou fonte nutriente, ou uma combinação dos mesmos.
[00928] As enzimas ou moléculas de sinalização vegetal podem causar alterações metabólicas desejadas na planta hospedeira, incluindo o aumento da absorção de macronutrientes e micronutrientes ou o conteúdo dos tecidos vegetais através do aumento dos sistemas radiculares, aumentando o teor de proteínas de plantas como grãos, colza, canola, soja e girassol, teor de açúcar (sacarose) em uvas, canade-açúcar, switchgrass, sorgo doce e outras matérias-primas de biocombustível, teor de compostos medicinais e teor de canabinoides em maconha. Estas alterações não só aumentam o valor das plantas de interesse, como também aumentam a utilidade dessas plantas em vários setores, como a formação de biocombustíveis, a produção de açúcar e a produção de matéria-prima.
[00929] Para os métodos para alterar uma propriedade de uma planta, qualquer uma das sequências de direcionamento, proteínas do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium aqui descritos podem ser utilizados.
XXVII. DESINFECÇÃO
[00930] Um método de desinfecção de uma superfície é fornecido. O método compreende expor uma superfície para um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão como descrita acima nos parágrafos [00170] [00.173] e [00.177] da seção I, em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou um peptídeo antibacteriano.
[00931] Um outro método para a desinfecção de uma superfície é fornecido. O método compreende expor uma superfície para fragmentos exosporium. Os fragmentos exosporium são derivados de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma proteína ou um peptídeo antibacteriano.
[00932] Ainda outro método de desinfecção de uma superfície é fornecido. O método compreende expor uma superfície para um membro da família recombinante de Bacillus cereus. O membro da família Bacillus cereus recombinante é um membro da família Bacillus cereus recombinante, como descrito acima na Seção II.
[00933] Nos métodos para desinfecção de uma superfície que com-preendem a exposição de uma superfície aos fragmentos exosporium ou a um membro da família Bacillus cereus recombinante, tal como descrito acima na Seção II, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium pode compreender qualquer uma das sequências de direcionamento, proteínas do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium aqui descritos. Em particular, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium pode compreender qualquer uma das sequências de direcionamento da proteína do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium descritos acima nos parágrafos [00759][00778].
[00934] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor de esporulação nativo da sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão ou uma porção da mesma e/ou sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão. O promotor pode ser qualquer um dos promotores descritos acima na Seção III.
[00935] A proteína ou peptídeo antibacteriano minimiza ou evita que agentes virais, bactérias, parasitas, amebas, ou moldes de formação ou de ligação à superfície.
[00936] A proteína ou peptídeo antibacteriano inclui, mas não está limitada a proteases, nucleases, peptídeos antimicrobianos, LysM, LfcinB, lisostafina, albumina, defensinas, bacteriocinas, lipopeptídeos, peptídeos do sistema imune inato, lisozima, liticase, ou uma combinação dos mesmos.
[00937] O membro da família recombinante de Bacillus cereusesporos poderá ser usado em conjunto com outros agentes antimicrobianos, incluindo produtos de limpeza, desinfectantes, antibióticos, antifúngicos e antivirais.
[00938] Embora qualquer uma família dos Bacillus cereus pode ser utilizada para expressar as proteínas de fusão, seja Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides é preferível.
[00939] Para esses métodos, qualquer uma das sequências de di-recionamento, proteínas do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium aqui descritos podem ser utilizados.
XXVIII. OUTROS USOS
[00940] As proteínas de fusão em que a proteína ou peptídeo do interesse é uma enzima ou recombinante Bacillus cereus membros em que a proteína ou peptídeo de interesse é uma enzima que pode ser utilizada para gordura, óleo, gordura ou tratamento ou desgomagem; couro hide transformação; biocombustíveis, biodiesel ou bioetanol for-mação; processamento de açúcar ou de conversão; tratamento de amido; papel ou roupa de transformação; animal ou tratamento subproduto fungos ou recuperação de aminoácidos; digestão específica de resíduos das instalações; aditivos de consumo humano ou animal; suplementos alimentares; nutrição animal; de limpeza industrial; processamento de grãos; fabricação cosmético; controle de odor; alimento ou bebida transformação; cerveja melhoramento ou aditivos; aditivos detergentes; ou têxteis ou fios de transformação.
[00941] Ao exibir uma enzima do lado de fora do esporo ou fragmentos de exosporium, a enzima pode ser estabilizada, imobilizada, e capaz de ser reutilizada.
[00942] Processos industriais geralmente envolvem condições severas, incluindo altas temperaturas, presença de solventes e grandes quantidades de matéria orgânica. Estas condições impedem enzimas tradicionais. A expressão da enzima alvo na superfície do esporo ou em fragmentos de exosporium permite a resistência a temperaturas elevadas e condições adversas e permite que as enzimas sejam reisoladas e reutilizadas.
[00943] Enzimas-chave de interesse para tais usos incluem: βlactamases, proteases, lipases, fosfolipases, celulases, endoglucanases, exogluconases, pectinases, ligninases, amilases (por exemplo, αamilases, β-amilases, ou glucoamilases), poligalacturonases, glucosi-dases, galactosidases, hidrolases de carboidratos, hidrolases de parede celular, nucleases, hemicelulases, xilanases, mannases, lacases, lactases, esterases (por exemplo, pectina metil esterase), fitases, fosfatases, invertases, oxidases de glicose, catalases, lyticases, Acetolactato decarboxilase, e urease.
[00944] Enzimas preferidas para graxa, óleo, ou tratamento ou degomagem de gordura, ou para a fabricação de cosméticos incluem li-pases, fosfolipases, esterases e proteases.
[00945] As enzimas preferidas para ocultar o processamento de couro incluem lipases, proteases, peptidases, colagenases e fosfolipases.
[00946] As enzimas preferidas para biocombustível, biodiesel, ou formação de bioetanol podem incluir, mas não estão limitados a lipases e esterases.
[00947] As enzimas preferidas para processamento ou conversão de açúcar, para processamento de grãos e para processamento de fios ou têxteis incluem carboidratos, amilases, manases, glucoamilases, invertases, celulases, hemicelulases, pectinases, pectina metilesterases, xilanases, endoglucanases, exoglucanases, glucosidases, ga-lactosidases, laccases, lactases, catalases e glucose oxidases.
[00948] As enzimas preferidas para o tratamento do amido incluem amilases e glucoamilases.
[00949] As enzimas preferidas para o papel ou a transformação de linho incluem celulases, hemicelulases, xilanases, endoglucanases, lacases, ligninases, exoglucanases, fitases, catalases e glucosidases.
[00950] As enzimas preferidas para tratamento de subprodutos animais ou fúngicos ou recuperação de aminoácidos incluem proteases, peptidases, lipases, líticases, hidrolases de parede celular, fosfolipases, endoglucanases, celulases, glucanases e hidrolases de carbohidratos.
[00951] As enzimas preferidas para a digestão seletiva de resíduos de instalações, limpeza industrial, aditivos de detergentes e controle de odores incluem lipases, fosfolipases, proteases, peptidases, amilases, líticases, hidrolases de parede celular, glucoamilases, celulases, hemicelulases, xilanases, esterases, glucosidases, galactosidases, laccases, lactases, ureases, fitases, fosfatases e hidrolases de carboi-dratos.
[00952] As enzimas preferidas para aditivos alimentares ou alimentares, suplementos dietéticos, nutrição animal, aditivos para fabricação de cerveja, aditivos para bebidas ou processamento de vinho incluem manases, lacases, liceas, proteases, peptidases, carboidratos, pecti-nases, pectina metilesterases, esterases, lipases, celulases, hemicelulases, xilanases, fitases, fosfatases, invertases, glucosidases, galacto-sidases, lactases, catalases, glucanases, endoglucanases, acetolactato descarboxilase e glucose oxidases.
[00953] Embora qualquer uma família dos Bacillus cereus pode ser utilizada para expressar as proteínas de fusão para esses usos, seja Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoidesé preferível.
[00954] A utilização das proteínas de fusão compreendendo uma enzima como a proteína ou peptídeo de interesse ou um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo uma enzima como a proteína ou peptídeo de interesse é fornecido. A proteína de fusão pode ser qualquer uma das proteínas de fusão acima descritas nos parágrafos [00169] [00173], [00175] e [00177] da Seção I. A utilização pode ser uma utilização de massa lubrificante, óleo ou gordura ou tratamento de degomagem; processamento de couro; Biocombustível, biodiesel ou bioetanol; processamento ou transformação de açúcar; tratamento de amido; processamento de papel ou linho; tratamento de subprodutos animais ou fúngicos ou recuperação de aminoácidos; digestão direcionada de resíduos de instalações; aditivos alimentares ou alimentares; suplementosdietéticos; nutrição animal; limpeza industrial; processamento de grãos; fabricação de cosméticos; controle de odor; processamento de alimentos ou bebidas; aperfeiçoamento de cerveja ou aditivos; aditivos detergentes; ou processamento têxtil ou fio.
[00955] A utilização de fragmentos exosporium também é fornecida. O uso pode ser para graxa, óleo, ou tratamento de gordura ou degomagem; processamento de couro; biocombustível, biodiesel ou bioetanol; processamento ou transformação de açúcar; tratamento de amido; processamento de papel ou linho; tratamento de subprodutos animais ou fúngicos ou recuperação de aminoácidos; digestão direcionada de resíduos de instalações; aditivos alimentares ou alimentares; suple-mentosdietéticos; nutrição animal; limpeza industrial; processamento de grãos; fabricação de cosméticos; controle de odor; processamento de alimentos ou bebidas; aperfeiçoamento de cerveja ou aditivos; de-tergentes aditivos; ou processamento têxtil ou fio. Os fragmentos exosporium são derivados de um membro da família Bacillus cereus recombinante descritos na Seção IV acima, e incluir a proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma enzima.
[00956] Uma outra utilização de membro da família Bacillus cereus recombinante é fornecida. O membro da família Bacillus cereus recombinante é um membro da família Bacillus cereus recombinante, como descrito acima na Seção II. O uso pode ser para graxa, óleo, ou tratamento de gordura ou degomagem; processamento de couro; biocombustível, biodiesel ou bioetanol; processamento ou transformação de açúcar; tratamento de amido; processamento de papel ou linho; tra-tamento de subprodutos animais ou fúngicos ou recuperação de aminoácidos; digestão direcionada de resíduos de instalações; aditivos alimentares ou alimentares; suplementos dietéticos; nutrição animal; limpeza industrial; processamento de grãos; fabricação de cosméticos; controle de odor; processamento de alimentos ou bebidas; aperfeiço-amento de cerveja ou aditivos; detergentes aditivos; ou processamento têxtil ou fio. A proteína de fusão compreende uma enzima.
[00957] Nas utilizações de fragmentos de exosporium ou os membros da família Bacillus cereus recombinantes, tal como descrito acima na Seção II, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium pode ser qualquer uma das sequências de direcionamento, proteínas do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium aqui descritos. Em particular, a sequência de direcionamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína ou exosporium pode compreender qualquer uma das sequências de direcionamento da proteína do exosporium, ou fragmentos de proteína do exosporium descritos acima nos parágrafos [00759][00778].
[00958] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor de esporulação nativo da sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão ou uma porção da mesma e/ou sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão. O promotor pode ser qualquer um dos promotores descritos acima na Seção III.
[00959] Tendo descrito a invenção em pormenor, será evidente que as modificações e variações são possíveis sem se afastarem do âmbito da invenção definido nas reivindicações anexas.
EXEMPLOS
[00960] Os seguintes exemplos não limitativos são proporcionados para ilustrar ainda mais a presente invenção.
EXEMPLO 1. A UTILIZAÇÃO DE UM MEMBRO DA FAMÍLIA RECOMBINANTE DE BACILLUS CEREUS EXIBINDO UMA LIPASE OU UMA ENDOGLUCANASE PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO DAS PLANTAS NA SOJA.
[00961] Os genes da lipase e endoglucanase de Bacillus subtilis foram amplificados através da reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os seguintes iniciadores apresentados abaixo na Tabela 16: TABELA 16
[00962] Para criar os construtos de fusão, os genes foram fundidos com o promotor nativo bclA de Bacillus thuringiensis que codifica o DNA dos primeiros 35 aminoácidos de BclA (aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1) usando a técnica de splicing por extensão de sobreposição (SOE) técnica. Os amplicons corretos foram clonados no vetor de transporte de E. coli/bAcillus pHP13 e os clones corretos foram rastreados por sequenciação de DNA. Os clones corretos foram eletroporados em Bacillus thuringiensis (Cry-, plasmídeos) e rastreados quanto à resistência ao cloranfenicol. Os transformantes corretos foram crescidos em caldo de infusão de coração cerebral durante a noite a 30° C, colocados em placas de agar nutritivo e incubados a 30° C durante 3 dias. Os esporos que expressam o construto de fusão (esporos BEMD) foram recolhidos fora das placas por lavagem em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e purificado por centrifugação e lavagens adicionais em PBS. Os esporos de Bacillus thuringiensis (B.t.) não transformados foram criados de forma idêntica.
[00963] Sojas (cepa Jake 011-28-04) foram plantadas 2,54 cm de profundidade em vasos de 10 cm de profundidade cheios com o solo topográfico normal. Os esporos foram diluídos até uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados a cada semente ao plantio. Os vegetais foram cultivados sob luz ideal utilizando lâmpadas T5, 54 watts, e expostos a 11 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada, entre 15,5-25,5° C. Os vegetais foram irrigados à saturação de três em três dias durante duas semanas de teste. Ao final de duas semanas, a altura de cada vegetal foi medida e as medidas foram normalizadas para controlar os esporos do Bacillus thuringiensis. Foram realizados dois ensaios independentes.
[00964] Os resultados são apresentados na Tabela 17, juntamente com o erro padrão da média. Em ambos os ensaios, a soja cultivada na presença de esporos de BEMD apresentou lipase ou endoglucanase cresceu significativamente mais alta do que o controle B.t. de soja tratada com esporos (análise estatística ensaiada através de um teste t). TABELA 17
EXEMPLO 2. A UTILIZAÇÃO DE UM MEMBRO DA FAMÍLIA RECOMBINANTE DE BACILLUS CEREUS EXIBINDO UMA LIPASE OU UMA ENDOGLUCANASE PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO DAS PLANTAS NO MILHO.
[00965] Esporos BEMD expressam endoglucanase foram criados de um modo idêntico, tal como descrito acima no Exemplo 1. O milho de campo foi plantado com 3,8 cm de profundidade em vasos de 10 cm de profundidade cheios de solo superficial. Esporos, controle e endoglucanase expressando BEMD, foram diluídos para uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados a cada planta no plantio. Um controle só de água também foi incluído. Os vegetais foram cultivados sob luz ideal utilizando lâmpadas T5, 54 watts, e expostos a 11 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada, entre 15,5-25,5° C. Os vegetais foram irrigados à saturação de três em três dias durante o teste de uma semana. Ao final de duas semanas, a altura de cada vegetal foi medida e as medidas foram normalizadas para controlar os esporos do Bacillus thuringiensis.
[00966] Os resultados são apresentados na Tabela 18, juntamente com o erro padrão da média. Milho cultivado na presença de esporos BEMD exibindo endoglucanase cresceu significativamente mais alto do que ambos controles B.t. de soja tratada com esporos e plantas de controle apenas aquosas (análise estatística ensaiada através de um teste t). TABELA 18.
EXEMPLO 3. A UTILIZAÇÃO DE UM MEMBRO DA FAMÍLIA RECOMBINANTE DE BACILLUS CEREUS EXIBINDO UMA LIPASE OU UMA ENDOGLUCANASE OU UMA PROTEASE PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO DAS PLANTAS NO TRIGO.
[00967] Esporos BEMD expressam endoglucanase foram criados de um modo idêntico, tal como descrito acima no Exemplo 1. Esporos BEMD expressando E. coli protease PtrB foram criados através de métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1 e os seguintes iniciadores: ggatccatgctaccaaaagcc (progressivo, SEQ ID NO: 41) e ggatccttagtccgcaggcgtagc (reverso, SEQ ID NO: 42).
[00968] O trigo duro de inverno foi plantado a 2,54 cm de profundidade em vasos de 10 cm de profundidade cheios de solo superficial. Esporos, controle e endoglucanase ou protease expressando BEMD, foram diluídos para uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados a cada planta no plantio. Um controle só de água também foi incluído. Os vegetais foram cultivados sob luz ideal utilizando lâmpadas T5, 54 watts, e expostos a 11 horas de luz por dia sob condi ções de temperatura controlada, entre 15,5-25,5° C. Os vegetais foram irrigados à saturação de três em três dias durante o teste de uma se-mana. No final de uma semana, a altura de cada vegetal foi medida e as medições foram normalizadas para controlar os vegetais apenas com água.
[00969] Os resultados são apresentados na Tabela 19, juntamente com o erro padrão da média. Trigo cultivado na presença de esporos BEMD exibindo endoglucanase ou protease cresceu significativamente mais alto do que o controle B.t. de esporos tratados ou de controle da água de soja (análise estatística ensaiada através de um teste t). TABELA 19.
EXEMPLO 4. A UTILIZAÇÃO DOS MEMBROS DA FAMÍLIA RECOMBINANTE DE BACILLUS CEREUS EXIBINDO UMA LIPASE OU UMA ENDOGLUCANASE PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO DAS PLANTAS NO AZEVÉM.
[00970] Esporos BEMD expressam endoglucanase foram criados de um modo idêntico, tal como descrito acima no Exemplo 1. O azevém perene foi plantado com 6,4 mm de profundidade em vasos de 10 cm de profundidade, cheios de manto franco-argiloso. Esporos, controle e endoglucanase expressando BEMD, foram diluídos para uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados a cada planta no plantio. Um controle só de água também foi incluído. Os vegetais foram cultivados sob luz ideal utilizando lâmpadas T5, 54 watts, e expostos a 11 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada, entre 15,5-25,5° C. Os vegetais foram irrigados à saturação de três em três dias durante o teste de duas semanas. Ao final de duas semanas, a altura de cada vegetal foi medida e as medições foram normalizadas para controlar os vegetais apenas com água.
[00971] Os resultados são apresentados na Tabela 20, juntamente com o erro padrão da média. Azevém cultivado na presença de esporos BEMD exibindo endocelulase cresceu significativamente mais alto do que o controle B.t. de esporos tratados ou de controle da água de azevém (análise estatística ensaiada através de um teste t). TABELA 20.
EXEMPLO 5. USO DOS MEMBROS DA FAMÍLIA RECOMBINANTES DE BACI-LLUSCEREUS EXIBINDO ENZIMAS ENVOLVIDAS NA SÍNTESE OU ATIVAÇÃO DE HORMONAS DE PLANTAS PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO DAS PLANTAS.
[00972] O sistema BEMD também pode ser utilizado para exibir as enzimas envolvidas na síntese de hormonas vegetais. Por exemplo, o ácido indole-3-acético hormona vegetal é um estimulador de crescimento vasonte em plantas. Ácido indole-3-acético é sintetizado in vivo a partir de triptofano pelas enzimas de mono-oxigenase de triptofano e hidrolase indol-3-acetamida. Ácido indole-3-acético e outros hormônios de auxina podem também ser sintetizados in vivo a partir de triptofano e/ou indol pela nitrilase de enzimas, aminotransferase triptofano, desidrogenase indol-3-acetaldeído, descarboxilase indol-3-piruvato, oxidase de amina, descarboxilase de triptofano, triptofano e oxidases de cadeia lateral.
[00973] O sistema BEMD também pode ser utilizado para exibir as enzimas envolvidas na modificação de hormônios de crescimento de plantas em formas bioativas ou inativas. Por exemplo, a nitrilase pode ser expressa no sistema BEMD para catalisar a conversão de indol-3acetonitrila no ácido indole-3-acético bioativo. Além disso, as formas inativas de hormônios de plantas, tais como indol-3-acetonitrila pode ser adicionado para o meio de crescimento de plantas com a nitrilase expressa em BEMD para proporcionar uma libertação gradual de hor-mônio ativo para o meio de crescimento da planta. Muitas outras formas inativas ou menos ativas de hormônios vegetais podem ser modificadas utilizando as suas enzimas correspondentes.
[00974] Os hormônios de crescimento das plantas (auxinas) relacionadas incluem o ácido indole-3-pirúvico, indol-3-acetaldoxima, indol3-acetamida, indol-3-acetonitrilo, indole-3-etanol, ácido indol-3piruvato, ácidos fenilacéticos, ácido 4-cloroindol-3-acético e indole-3acetaldoxima. Estes hormônios são sintetizados a partir de triptofano e/ou indole in vivoatravés das enzimas triptofano mono-oxigenase, indol-3-acetamida hidrolase, nitrilase, nitrilo hidrolase, acetolactato sintetase, alfa acetolactato decarboxilase, triptofano aminotransferase, indol-3acetaldeído desidrogenase, indole-3-piruvato descarboxilase, oxidase de amina, triptofano descarboxilase e oxidases de cadeia lateral de triptofano.
[00975] Hormônios de crescimento da família citocinina também podem ser sintetizados por enzimas expressas no sistema BEMD. Exemplos de citocininas incluem cinetina, zeatina (cis e trans), 6benzilaminopurina, di-hidroxialcina, N6(D2-isopentenil) adenina, ribosilzeatina, N6(D2-isopentenil) adenosina, 2 metiltio-cis-ribosilzeatina, cis ribosilzeatina, ribosilzeatina-5-monossfato, N6-metilaminopurina, N6-dimetilaminopurina, 2'-desoxiazeatina ribosídeo, 4-hidroxi-3-metiltrans-2-butenilaminopurina, orto-topolina, meta-topolina, benziladenina, orto-metiltopolina e meta -metiltopolin. Estes compostos estimuladores do crescimento de plantas são sintetizados in vivo a partir de mevalonato ou adenosina mono/di/trifosfato por enzimas incluindo adenosina fosfato isopenteniltransferases, fosfatases, adenosina quinases, adenina fosforibosiltransferase, CYP735A, 5'ribonucleotídeo fosfohidrolase, adenosina nucleosidases, zeatina cis-trans isomerase, zeatina O-glucosiltransferases, β-glucosidases, cis-hidroxilases, CK cis-hidroxilases, CK N-glucosiltransferases, 2,5-ribonucleotídeo fosfohidrolases, nucleosidases de adenosina, fosforilases de nucleosídeo de purina e reductases de zeatina.
[00976] Utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1, qualquer uma dessas enzimas pode ser incorporada no sistema BEMD para exibição em esporos BEMD através da criação de um construto de fusão compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima expressa para a exosporium quando o construto de fusão é expresso num membro da família de Bacillus cereus. Um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa tal construto pode então ser adicionado ao solo ou outro meio de crescimento de plantas ou aplicado diretamente à folhagem da planta utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1 para estimulação do crescimento da planta.
[00977] O meio de crescimento da planta pode ser suplementado com precursores ou substratos para as enzimas. Por exemplo, o meio de crescimento de plantas pode ser suplementado com triptofano, adenosina monofosfatos, adenosina difosfato, adenosina trifosfatos, ou indol. As concentrações adequadas destes substratos estão ENtre 100 nM e 100 DM.
EXEMPLO6. A UTILIZAÇÃO DE MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTES EXIBINDO AS PROTEASES OU PEPTIDASES QUE CLIVAM PROTEÍNAS, PEPTÍDEOS, PRO-PROTEÍNAS OU PEPTÍDEOS BIOATIVOS EM PREPROPROTEÍNAS PARA A ESTIMULAÇÃO DO CRESCIMENTO DAS PLANTAS.
[00978] As proteases e peptidases podem ser expressas no sistema BEMD que podem clivar enzimaticamente as proteínas disponíveis no meio de crescimento da planta para peptídeos bioativos que podem atuar na planta, direta ou indiretamente. Exemplos incluem a clivagem enzimática de farinha de soja, extrato de levedura, ou outras refeições ricas em proteínas adicionadas ao meio de crescimento da planta em peptídeos ativos que podem estimular diretamente o crescimento da planta. Peptídeos bioativos gerados por clivagem enzimática de ali-mentos proteicos incluem RHPP e RKN 16D10, vasontes estimuladores do desenvolvimento da raiz da planta. Adicionalmente, proproteínas ou preproproteínas podem ser clivadas em formas ativas por proteases expressas em BEMD e peptidases com as suas formas bioativas. Proproteínas inativas ou preproproteínas podem ser adicionadas no meio de crescimento da planta para facilitar a sua clivagem por proteases BEMD gradual e libertação lenta de proteínas bioativas.
[00979] Utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1, qualquer uma dessas proteases e peptidases pode ser incorporada no sistema BEMD para exibição em esporos BEMD através da criação de um construto de fusão compreendendo as proteases e peptidases e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima expressa para a exosporium quando o construto de fusão é expresso num membro da família de Bacillus cereus. Um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa tal construto pode então ser adicionado ao solo ou outro meio de crescimento de plantas suplementadas com farinha de soja, extrato de levedura ou outra refeição rica em proteínas para estimulação do crescimento da planta. A farinha de soja, o extrato de levedura ou outra farinha rica em proteínasé adequadamente adicionado ao meio de crescimento de plantas na forma de uma composição líquida compreendendo cerca de WDg/L a cerca de 100 mg/L da farinha de proteína, extrato de levedura ou outra refeição rica em proteínas.
EXEMPLO 7. USO DE ESPOROS BEMD QUE EXPRESSAM A PROTEASE PTRB PARA A ESTIMULAÇÃO DO CRESCIMENTO DAS PLANTAS.
[00980] Os esporos de BEMD que expressam a protease PtrB de E. coli foram criados como descrito acima no Exemplo 3. Sementes de soja foram plantadas a 2,54 cm de profundidade em vasos de 10 cm cheios de terra argilosa padrão. Esporos, tanto controle e protease ex-pressando BEMD, foram diluídos para uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados a cada planta no plantio. Um controle só de água também foi incluído. A farinha de soja a 25 mg/vaso foi adicionada em água ao plantio. Os vegetais foram cultivados sob luz ideal utilizando lâmpadas T5, 54 watts, e expostos a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada, entre 15,5-25,5° C. Os vegetais foram irrigados à saturação de três em três dias durante o teste de uma semana. Ao final de duas semanas, a altura de cada vegetal foi medida e as medições foram normalizadas para controlar os vegetais apenas com água.
[00981] Os resultados são apresentados na Tabela 21, juntamente com o erro padrão da média como uma porcentagem de controle de água. Soja cultivada na presença de esporos BEMD exibindo protease cresceu significativamente mais alto do que o controle B.t. de esporos tratados ou de controle da água de soja (análise estatística ensaiada através de um teste t). A adição de farinha de soja ao controle de água ou às plantas de controle de B. thuringiensis teve pouco efeito. Em contraste, na presença da farinha de soja e do sistema de protease BEMD, as plantas de soja respondem significativamente em relação a todos os outros tratamentos. TABELA 21.
EXEMPLO 8. USO DOS MEMBROS DA FAMÍLIA RECOMBINANTE DE BACILLUS CEREUS QUE APRESENTAM PROTEÍNAS OU PEPTÍDEOS ENVOLVIDOS NA ES-TIMULAÇÃO DO CRESCIMENTO DAS PLANTAS.
[00982] O sistema BEMD também pode ser utilizado para exibir as proteínas ou peptídeos que estão diretamente envolvidos na promoção do crescimento das plantas. Por exemplo, hormônios peptídicos da planta ou peptídeos não hormonais que estimulam o crescimento das plantas podem ser expressos no sistema BEMD. Por exemplo, peptídeos não hormonais que se ligam diretamente aos receptores de plantas ativas e podem ser expressos no sistema BEMD para atuar diretamente sobre os receptores na planta e as raízes de plantas alvo. Esses hormônios peptídicos e peptídeos não hormonais incluem phytosulfokine, calcalva 3 (CLV3), systemin, RKN 16D10, hG-syv46, eNOD40, proteínas da família NOD, ZmlGF, proteínas da família SCR/SP11 e peptídeos, RHPP, POLARIS e KTI. Estes peptídeos e peptídeos relacionados podem ser expressos no sistema BEMD e entregue ao meio de crescimento da planta ou aplicados diretamente à folhagem para estimular o crescimento das plantas.
[00983] Utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1, qualquer uma dessas proteínas ou peptídeos podem ser incorporados no sistema BEMD para exibição em esporos BEMD através da criação de um construto de fusão compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima expressa para a exosporium quando o construto de fusão é expresso num membro da família de Bacillus cereus. Um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa tal construto pode então ser adicionado ao solo ou outro meio de crescimento de plantas ou aplicado diretamente à folhagem da planta utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1 para estimulação do crescimento da planta.
EXEMPLO 9. USO DE ESPOROS BEMD EXPRESSANDOPOLARIS OU KTI PARA A ESTIMULAÇÃO DO CRESCIMENTO DAS PLANTAS.
[00984] Esporos BEMD que expressam o peptídeo da planta POLARIS e peptídeo de soja KTI foram criados pelos genes que sintetizam que codificam para peptídeos POLARIS ou KIT ligados à sequência de direcionamento da SEQ ID NO: 96. Os genes foram então introduzidos em genes Bacillus thuringiensis e os esporos foram feitos como descrito no Exemplo 1. Sementes de soja foram plantadas a 2,54 cm de profundidade em vasos de 10 cm cheios de terra argilosa padrão. Esporos BEMD expressam POLARIS ou KTI foram diluídos para uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicado a cada planta no plantio. Um controle só de água também foi incluído. Peptídeos POLARIS e KTI puros também foram testados quanto aos seus efeitos sobre a soja 0,05 mg/vaso. Os vegetais foram cultivados sob luz ideal utilizando lâmpadas T5, 54 watts, e expostos a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada, entre 15,5-25,5° C. Os vegetais foram irrigados à saturação de três em três dias durante as duas semanas de teste. Ao final de duas semanas, a altura de cada planta foi medida, as raízes medidas, e as medições foram normalizadas para controlar os vegetais apenas com água.
[00985] Os resultados são apresentados na Tabela 22, juntamente com o erro padrão da média como uma porcentagem de controle de água. Soja cultivada na presença de esporos BEMD exibindo POLARIS cresceu mais alto e tinha um ligeiro aumento no desenvolvimento radicular do que a soja de controle de água. A presença do peptídeo livre KTI levou a uma baixa estatura significativa das plantas, perdendo entre 6-8 % das suas alturas, mas a adição de 15 % para o comprimento das raízes. Expressão de KTI no sistema BEMD levou ao bene-fício o crescimento da raiz, mas sem o efeito de retardamento na altura da planta. É importante notar que a presença dos esporos de controle de Bacillus thuringiensis com o peptídeo KTI livre não impediu o efeito de retardamento do KTI, enquanto que o BEMD com KTI não apresentou tal retardamento. TABELA 22.
EXEMPLO 10. USO DOS MEMBROS DA FAMÍLIA RECOMBINANTES DE BACI-LLUSCEREUS INDICAM ENZIMAS QUE DEGRADAM OU MODIFICAM UMA FONTE DE NUTRIENTE BACTERIANO, FÚNGICO OU DE VEGETAL PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO DAS PLANTAS E/OU NUTRIENTES DO PROCESSO.
[00986] O sistema BEMD também pode ser usado para exibir enzimas que degradam ou modificam beneficamente uma fonte de nutrientes bacteriano, fúngico ou vegetal presente no solo ou em outro meio de crescimento de plantas. Estas enzimas degradam produtos presentes no meio do solo ou outro crescimento de plantas em formas que podem ser facilmente absorvidas pelas plantas e/ou as bactérias benéficas e/ou fungos da rizosfera. Tais enzimas incluem, por exemplo, hidrolases de glucosídeo para degradar carboidratos complexos, celulases para degradar celulose; lipases para degradar lipídios, incluindo óleo, gorduras e ceras; lignina oxidases para degradar lignina e ácidos húmicos; proteases para degradar polipeptídeos; fosfolipases para de-gradar membranas; amidases e nitrogenases para recuperar nitrogênio; amilases para processar amidos; nucleases para recuperar nucleotídeos, pectinases para quebrar a pectina, sulfatases para recuperar enxofre e xilanases para quebrar xilanos e arabinoxilanos. Os produtos resultantes, incluindo açúcares simples, aminoácidos, ácidos graxos e outros nutrientes estarão prontamente disponíveis para absorção direta por plantas e/ou para estimular bactérias benéficas e/ou fungos para crescerem e prosperarem nas rizosferas das plantas.
[00987] Além disso, as enzimas e outras moléculas biológicas podem ser utilizadas para libertar ou sequestrar fosfato, nitrogênio e outros nutrientes elementares essenciais para a absorção pelas plantas das suas várias formas orgânicas e inorgânicas em solo. Por exemplo, as fosfatases podem ser utilizadas para degradar fosfatos no ambiente em fosfatos inorgânicos utilizáveis para utilização em plantas. Os fosfatos podem ser fosfatos de ocorrência natural presentes num meio de crescimento de plantas. Alternativamente ou em adição, o meio de crescimento da planta pode ser suplementado com fosfatos, tais como o trimetafosfato, uma alteração agrícola comum. Exemplos de fosfatases úteis incluem os monoéster hidrolases fosfóricos, fosfomonoesterases, diéster hidrolases fosfóricos, fosfodiesterases, monoéster hidrolases trifosfóricos, hidrolases de anidrfosforil, pirofosfatases, fitase, trimetafosfatases e trifosfatases. Por exemplo, as enzimas trimeta-phosphatase, trifosfatase, e pirofosfatase sequencialmente quebram trimetafosfato em fosfato inorgânico utilizável.
[00988] A família de enzimas nitrogenase converte o nitrogênio at-mosférico (N2) em amônia, convertendo assim nitrogênio que de outra forma seriam inacessíveis para as plantas em uma forma utilizável. As enzimas apropriadas pertencem à família Nif da nitrogenase.
[00989] A energia química também pode ser diretamente adicionada ao meio de crescimento de plantas como adenosina-trifosfato-3, ferredoxina, ou enzimas adicionais que criam uma energia para o sistema BEMD. Estes são co-fatores para os nitrogenases e são limitados no solo. Assim, estes cofatores podem ser adicionados ao solo para melhorar as reações descritas acima.
[00990] Outros suplementos que podem ser adicionados ao meio de crescimento de plantas incluem amidos, celulose e derivados de celulose, pectinas, xilanos e arabinoxilanos, gorduras, ceras, óleos, ácidos fítico, ligninas e ácidos húmicos, e outras fontes de nutrientes que as classes de enzimas acima exercem atividade a cima.
[00991] Utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1, qualquer uma dessas enzimas pode ser incorporada no sistema BEMD para exibição em esporos BEMD através da criação de um construto de fusão compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento para direcionar o construto de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus. O construto de fusão pode então ser expresso num membro da família de Bacillus cereus, e este membro da família Bacillus cereus recombinante pode ser adicionado ao solo ou outro meio de crescimento da planta utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1 para a estimulação do crescimento das plantas.
EXEMPLO 11. USO DE ESPOROS BEMD QUE EXPRESSAM UMA FOSFATASE PARA A ESTIMULAÇÃO DO CRESCIMENTO DAS PLANTAS.
[00992] Esporos BEMD expressando Bacillus subtilis Fosfatase A4 (PhoA4) foram criadas através da síntese de um gene que codifica para PhoA4 ligadas à sequência de direcionamento da SEQ ID NO: 96. Este gene foi então introduzido Bacillus thuringiensis e os esporos foram feitos como no Exemplo 1. O milho foi plantado a 2,54 cm de profundidade em vasos de 10 cm cheios de terra argilosa padrão. Os esporos de BEMD que expressam a PhoA4 foram diluídos até uma con centração de 1 X 104/ ml em 50 ml de água e aplicados a cada vegetal no plantio. Um controle só de água também foi incluído. Polifosfato foi adicionado aos vasos em líquido a uma taxa de 0,5 mg/vaso. Os vegetais foram cultivados sob luz ideal utilizando lâmpadas T5, 54 watts, e expostos a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura con-trolada, entre 15,5-25,5° C. Os vegetais foram irrigados à saturação de três em três dias durante as duas semanas de teste. Ao final de duas semanas, a altura de cada vegetal foi medida e as medições foram normalizadas para controlar os vegetais apenas com água.
[00993] Os resultados são mostrados na Tabela 23. Milho crescido na presença de esporos BEMD exibindo PhoA4 apresentou um melhor crescimento, especialmente na presença de polifosfato adicionado. Este efeito foi maior do que o efeito de somente o polifosfato. TABELA 23.
EXEMPLO 12. USO DOS MEMBROS DA FAMÍLIA RECOMBINANTES DE BACI-LLUSCEREUS QUE EXIBEM AS ENZIMAS ENVOLVIDAS NA SÍNTESE DE 2,3BUTANODIOL OU A SÍNTESE OU A ATIVAÇÃO DE ÁCIDO GIBERÉLICO PARA A ESTIMULAÇÃO DO CRESCIMENTO DAS PLANTAS.
[00994] O sistema BEMD também pode ser utilizado para mostrar enzimas envolvidas na síntese do composto promotor do crescimento das plantas 2,3-butanodiol. In vivo, 2,3-butanodiol é sintetizado por bactérias e fungos benéficos na rizosfera de acetoína, diacetil, acetolactato, piruvato ou pelas enzimas de sintetase de acetolactato, αacetolactato de descarboxilase, piruvato de descarboxilase, diacetil de redutase, butanodiol de desidrogenases e acetoína de redutase.
[00995] O sistema BEMD também pode ser utilizado para exibir enzimas envolvidas na síntese ou ativação do composto promotor do crescimento de plantas de ácido giberélico. Ácido giberélico pode ser produzido a partir de formas inativas ou menos ativas através da ação de enzimas, incluindo, mas não limitadas a hidroxilamina, redutases, dioxigenases 2-oxogluturate, hidrolases de giberelina 2B/3B, giberelina 3-oxidases, e giberelina 20-oxidase.
[00996] Qualquer destas enzimas pode ser incorporada no sistema BEMD para exibição em esporos BEMD utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado que compreende a enzima e uma sequência de direcio-namento que direciona a enzima à exosporium quando o construto de fusão é expresso num membro da família Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou outro meio de crescimento da planta para a estimulação do crescimento das plantas.
[00997] Para aumentar o efeito das enzimas indicadas em BEMD, o solo pode ser suplementado com substratos para as enzimas. Por exemplo, o solo ou outro meio de crescimento de plantas pode ser suplementado com acetoína, que é um substrato para acetoína redutase; piruvato, que é um substrato para piruvato descarboxilase; diacetil, que é um substrato para diacetil redutase; e/ou acetolactato, que é um substrato para acetolactato decarboxilase. Alternativamente ou adicionalmente, o solo ou outro meio de crescimento de plantas pode ser suplementado com formas menos potentes ou inativas de ácido giberélico, que se converterá em formas mais ativas pelas enzimas descritas acima no solo ou outro meio de crescimento de plantas.
EXEMPLO 13. USO DOS MEMBROS DA FAMÍLIA RECOMBINANTES DE BACI-LLUSCEREUS QUE SÃO VISUALIZADAS PROTEASES PARA PROTEGER AS PLANTAS DE AGENTES PATOGÊNICOS
[00998] O sistema BEMD também pode ser utilizado de exibição proteases que protegem as plantas de um ou mais agentes patogênicos. Por exemplo, certos agentes patogênicos bacterianos podem se comunicar entre membros individuais através da secreção de homoerinas de lactona bacterianas ou moléculas de sinalização relacionadas. Assim, proteases específicas para moléculas de sinalização de homo-serina de lactona bacteriana podem proteger plantas de tais patogênicos bacterianos, interrompendo a comunicação entre bactérias, uma etapa essencial para as bactérias segregarem toxinas e aumentarem os fatores de virulência. Proteases adequadas específicas para moléculas de sinalização de homoserina lactona bacteriana incluem endopeptidases e exopeptidases.
[00999] As proteases específicas para moléculas de sinalização de homoserina de lactona bacteriana podem ser incorporadas no sistema BEMD utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado que compreende a protease e uma sequência de direcionamento que direciona a protease à exosporium quando o construto de fusão é expresso num membro da família Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereus é adicionado ao solo ou outro meio de crescimento da planta. A protease pode então degradar as moléculas de sinalização de homoserina de lactona bacteriana, bloqueando uma etapa fundamental na virulência destes organismos e ajudando assim a proteger a planta destes patógenos. Outras proteases e peptidases trabalhar eficazmente nessa capacidade no sistema BEMD como demonstrado acima no Exemplo 6 e 7.
EXEMPLO 14. USO DOS MEMBROS DA FAMÍLIA RECOMBINANTES DE BACI-LLUSCEREUS QUE EXIBEM PROTEÍNAS ANTIMICROBIANAS E PEPTÍDEOS PARA PROTEGER AS PLANTAS A PARTIR DE AGENTES PATOGÊNICOS.
[001000] O sistema BEMD também pode ser usado exibir enzimas que exibem atividades antibacterianas e/ou antifúngicas que podem ajudar a proteger as plantas de um ou mais patógenos. Por exemplo, proteínas antimicrobianas e peptídeos, tais como bacteriocinas, lisozimas (por exemplo, LysM), sideróforos, avidinas, estreptavidinas, conalbumina, albumina, lactoferrinas (por exemplo, LfcinB), ou TasA podem todos ser expressos no sistema BEMD para exercer o seu efeito sobre agentes patogênicos bacterianos e fúngicos das plantas. Bacteriocinas, albumina, conalbumina, lisozimas, lactoferrina e exercem ação antimicrobiana direta sobre seus alvos, enquanto sideróforos, avidinas e estreptavidinas ligam nutrientes essenciais que agentes patogênicos necessitam para virulência. Por exemplo, o peptídeo de LfcinB lactoferrina, quando expresso na superfície do sistema BEMD lisaria as células das bactérias que são susceptíveis aos peptídeos de lactoferrina no meio de crescimento da planta. Estas proteínas e peptídeos têm uma ação específica em alguns micróbios, e podem direcionar seletivamente um grupo de agentes patogênicos, sem obstruir todos os micróbios em meio de crescimento de plantas.
[001001] Qualquer destas proteínas ou peptídeos podem ser incor-porados no sistema BEMD para exibição em esporos BEMD utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado que compreende a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima à exosporium quando o construto de fusão é expresso num membro da família Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereus é adicionado ao solo ou outro meio de crescimento da planta para a pro teção de plantas contra um ou mais agentes patogênicos.
EXEMPLO 15. USO DE ESPOROS BEMD EXPRESSA PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS PARA PROTEGER AS PLANTAS A PARTIR DE BACTÉRIAS.
[001002] Os genes foram sintetizados codificados por qualquer um dos dois peptídeos antimicrobianos, LfcinB (derivado de lactoferrina bovina) e LysM (derivada de galinha lisozima), ligada a uma sequência de direcionamento BclA (SEQ ID NO: 96), sob o controle do promotor BclA (SEQ ID NO: 215). Os genes foram introduzidos em Bacillus thuringiensis BT013A e os esporos foram produzidos cultivando uma cultura durante a noite do Bacillus transformado em caldo de infusão de coração cerebral, colocando em placas de ágar nutriente a 30° C e deixando crescer durante 3 dias. Os esporos foram lavados e as placas lavadas 3X em PBS. As culturas de Staphylococcus epidermidis foram cultivadas durante a noite em caldo TSB a 37° C. A cultura durante a noite foi em seguida sedimentada, lavada em PBS e ressuspensa em PBS a um Abs595 = 0,2. 1x104 BEMD que expressa os peptídeos LysM ou LfcinB foi incubado no PBS com o S. epidermidisdurante 3 horas a 37° C, com agitação. Uma amostra de controle S. epidermidis foi deixada sem tratamento (sem esporos BEMD). Após a incubação de 3 horas, as placas de diluição de a S. epidermidis foram feitas e incubadas a 37° C durante a noite. As culturas de S. epidermidis foram contadas no dia seguinte, e as percentagens de morte foram quantificadas. Na Tabela 24 abaixo, um registro da atividade de morte foi registrado. Os peptídeos BEMD expressos mataram um número significativo de células S. epidermidis. Isto traduz diretamente em morte de bactérias na rizosfera, semente, ou outro material vegetal. A seleção de peptídeos específicos para determinadas classes de bactéria também pode distorcer a população dos micro-organismos perto da planta de uma forma benéfica, ou pode direcionar seletivamente elementos patogênicos importantes. TABELA 24.
EXEMPLO 16. USO DOS MEMBROS DA FAMÍLIA RECOMBINANTES DE BACI-LLUSCEREUS QUE SÃO ENZIMAS VISUALIZADAS PARA PROTEGER AS PLANTAS DE AGENTES PATOGÊNICOS.
[001003] O sistema BEMD também pode ser utilizado para exibição de enzimas que protegem as plantas de um ou mais agentes patogênicos. Por exemplo, paredes de células de levedura e molde são degradados por enzimas tais como β-1,3-glucanases, β-1,4-glucanases, β-1,6-glucanases, quitinases, quitosanases, proteínas tipo quitosanase, e lyticases. Paredes das células das bactérias são degradadas por enzimas selecionadas a partir de proteinases, proteases, mutanolisina, estafilisina e lisozimas. Cada uma destas enzimas degradantes de parede celular pode ser expressa no sistema BEMD e adicionada no meio de crescimento das plantas para a inibição seletiva de micróbios patogênicos na rizosfera.
[001004] O sistema BEMD também pode ser utilizado para exibir as enzimas ou proteínas que protegem as plantas de agentes patogênicos para insetos ou vermes, por exemplo, suprimindo a predação de insetos e/ou vermes de plantas desejadas. Exemplos de tais proteínas e enzimas de interesse incluem endotoxinas, Cry toxinas, outras toxinas de proteína inseticida, inibidores de proteases, proteases de cisteína, a proteína Cry5B, a proteína Cry 21A, quitinase, proteínas inibidoras de protease, peptídeos inibidores de protease, inibidores de tripsina, e inibidores de protease de ponta de flecha.
[001005] Qualquer destas proteínas ou peptídeos podem ser incor-porados no sistema BEMD para exibição em esporos BEMD utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado que compreende a enzima e uma se-quência de direcionamento que direciona a enzima à exosporium quando o construto de fusão é expresso num membro da família Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou outro meio de crescimento da planta para a proteção de plantas contra patógenos.
EXEMPLO 17. USO DE ESPOROS BEMD EXPRESSANDO UMA ENZIMA ANTIFÚNGICA PARA A PROTEÇÃO DE PLANTAS, E DEMONSTRAÇÃO DA EFICÁCIA CONTRA SACCHROMYCES.
[001006] Um gene foi sintetizado codificando uma enzima antifúngica, β-1,3-glucanase de Bacillus subtilis, ligado a uma sequência de direcionamento BclA (SEQ ID NO: 96) sob o controle do promotor BclA (SEQ ID NO: 215). O gene foi e introduziu em Bacillus thuringiensis BT013A e os esporos foram produzidos cultivando uma cultura durante a noite do Bacillus transformado em caldo de infusão de coração cerebral, colocando em placas de ágar nutriente a 30° C, e deixando crescer durante 3 dias. Os esporos foram lavados e as placas lavadas 3X em PBS. As culturas de Saccharomyces cerevisiae foram crescidas durante a noite em caldo YZ a 37° C. A cultura durante a noite foi em seguida sedimentada, lavada em PBS e ressuspensa em PBS a um Abs595 = 0,2. 1x104 BEMD expressando β-1,3-glucanase foi incubada em PBS com Saccharomyces durante 1 hora a 37° C, com agitação. Uma amostra de controle Saccharomyces foi deixada sem tratamento (sem esporos BEMD). Após a incubação de 3 horas, as placas de diluição de a Saccharomyces foram feitas e incubadas a 37° C durante a noite. As culturas Saccharomyces foram contadas no dia seguinte, e as percentagens de morte foram quantificadas. Na Tabela 25 abaixo mostra a atividade de morte dos esporos BEMD que expressam β-1,3glucanase. A enzima expressa em BEMD matou um número significativo de células Saccharomyces. Isto traduz diretamente em morte de micro-organismos fungos na rizosfera, semente, ou outro material ve-getal. A seleção de proteínas específicas para determinadas classes de fungos também pode distorcer a população dos micro-organismos perto da planta de uma forma benéfica, ou podem seletivamente dire-cionarpatógenos fúngicos chave. TABELA 25.
EXEMPLO 18. USO DE MEMBROS DA FAMÍLIA RECOMBINANTES DE BACI-LLUSCEREUS QUE APRESENTAM PEPTÍDEOS OU PROTEÍNAS ESTIMULADORAS DA PLANTA DO SISTEMA IMUNOLÓGICO PARA PROTEGER AS PLANTAS A PARTIR DE AGENTES PATOGÊNICOS.
[001007] O sistema BEMD também pode ser utilizado para exibir pro-teínas e peptídeos potenciadores do sistema imunitário. Estas proteínas podem ser expressas no exterior do esporo de BEMD e administradas no meio de crescimento de plantas para estimular o sistema imunitário da planta para permitir que a planta se proteja de patógenos das plantas. Proteínas e peptídeos exemplares incluem harpina, αelastinas, β-elastinas, sisteminas, fenilalanina amônia-liase, elicitinas, defensinas, cryptogein e proteínas flagelina e peptídeos. A exposição das plantas a estas proteínas e peptídeos irá estimular a resistência a vários agentes patogênicos de plantas, em plantas.
[001008] Qualquer destas proteínas ou peptídeos podem ser incor-porados no sistema BEMD para exibição em esporos BEMD utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado que compreende a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima à exosporium quando o construto de fusão é expresso num membro da família Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso um membro da fa mília de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou outro meio de crescimento da planta para a pro-teção de plantas contra patógenos.
EXEMPLO 19. A UTILIZAÇÃO DE MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTES EXIBINDO UMA PROTEÍNA OU PEPTÍDEO DE LIGAÇÃO RAIZ OU FOLHA PARA IMOBILIZAR O MEMBRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE NUM SISTEMA DE RAIZ DE UMA PLANTA OU SOBRE AS FOLHAS DA PLANTA.
[001009] As proteínas e peptídeos de ligação de raiz e de folha também podem ser incorporadas no sistema BEMD para permitir que os esporos BEMD sejam imobilizados num sistema radicular ou em folhas de uma planta. Exibição de tais ligantes de ligação de raiz ou folha sobre os esporos BEMD permitem a segmentação dos esporos para o sistema de raiz de uma planta ou para sub-estruturas do sistema radicular ou das folhas ou subestruturas de folhas para manter os esporos BEMD numa localização óptima para que outras moléculas e enzimas biológicas exibidas sejam eficazes.
[001010] Por exemplo, a rhicadhesina é um ligante de ligação às raízes que se liga ás raízes radiculares. Assim, exibição de rhicadhesin sobre os esporos BEMD direciona, pois, os esporos para as raízes radiculares. Proteínas adicionais que poderiam ser utilizadas para raízes ou folhas de ligação seletiva para plantar incluem adesinas, flagelina, omptinas, lectinas, proteínas de pelos, proteínas curlus, intiminas, invasinas, aglutinina, proteínas afimbrial, a TasA, ou YuaB.
[001011] Tais proteínas e peptídeos de raiz ou folha de ligação podem ser integradas no sistema de BEMD utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado que compreende a proteína de ligação à raiz ou folha ou peptídeo e uma sequência de direcionamento que direciona a proteína ou peptídeo para a exosporium quando o construto é expresso num membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão con-tendo o ligante de raiz ou folha de ligação é então expresso num membro da família de Bacillus cereus. Estes construtos de fusão podem ser co-expressos com um ou mais construtos de fusão compreendendo qualquer uma das enzimas benéficas aqui discutidas (por exemplo, uma enzima envolvida na síntese de um hormônio da planta, uma enzima que degrada uma fonte de nutrientes, ou umas proteases que protegem uma planta a partir de um agente patogênico). O membro da família recombinante de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou outro meio de crescimento da planta, ou aplicado às folhas de uma planta. O ligante da ligação da raiz ou da folha dirige-se ao membro da família Bacillus cereus para o sistema radicular da planta ou para as folhas da planta e se imobiliza, permitindo assim que o construto de fusão coexpresso exerça os seus efeitos na proximidade imediata do sistema de raiz ou folha.
EXEMPLO 20. USO DOS MEMBROS DA FAMÍLIA RECOMBINANTES DE BACI-LLUSCEREUS QUE EXIBEM PROTEÍNAS OU ENZIMAS PARA AUMENTAR A RE-SISTÊNCIA AO ESTRESSE DAS PLANTAS.
[001012] Proteínas, peptídeos e enzimas que aumentam a resistência ao estresse em uma planta podem ser incorporados ao sistema BEMD e administrados às plantas-alvo por meio da adição de raízes, folhas ou o meio de crescimento vegetal. Durante períodos de estresse, as plantas liberam compostos relacionados ao estresse, incluindo ácido aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), espécies reativas de oxigênio e outros, resultando em um impacto negativo no crescimento da planta. O sistema BEMD pode ser utilizado para exibir enzimas que degradam tais compostos relacionados com o stress, tais como a desaminase de ácido aminociclopropano-1-carboxílico, superóxido dismutases, oxidases, catalases e outras enzimas que atuam sobre as espécies reativas de oxigênio. Tais enzimas reduzem a quantidade destes compostos relacionados com o stress e permitem que as plantas continuem a crescer e prosperar, mesmo em condições de tensão.
[001013] Qualquer destas proteínas ou peptídeos podem ser incor-porados no sistema BEMD para exibição em esporos BEMD utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado que compreende a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima à exosporium quando o construto de fusão é expresso num membro da família Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso num membro da família Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta ou aplicadosàs folhas de uma planta para aumentar a resistência ao stress de uma planta alvo.
EXEMPLO 21. PREPARAÇÃO DE ESPOROS BEMD QUE EXPRESSAM A ENZI-MADE CATALASE DE PROTEÇÃO.
[001014] Foi sintetizado um gene que codificava a enzima protetora catalase de Bacillus cereus ligada a uma sequência de direcionamento BetA (SEQ ID NO: 97) sob o controle do promotor BetA (SEQ ID NO: 197). Este gene foi introduzido em e Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos foram produzidos cultivando uma cultura durante a noite do Bacillus transformado e da cepa do tipo selvagem no caldo de infusão de coração cerebral, colocando em placas de ágar nutriente a 30° C e deixando crescer durante 3 dias. Os esporos foram lavados e as placas lavadas 3X em PBS. 3 gotas de peróxido de hidrogênio foi adicionada a cada sedimento de esporos. A enzima catalase converte o peróxido de hidrogênio em água e gás O2. Os esporos de controle não borbulharam, a etapa que os esporos de BEMD-catalase fizeram prontamente, demonstrando a atividade enzimática na superfície dos esporos. Outras enzimas de proteção podem ser apresentadas de um modo semelhante e entregue para a planta para agir de acordo com os radicais livres produzidos durante o stress pelas plantas.
EXEMPLO 22. USO DOS MEMBROS DA FAMÍLIA RECOMBINANTES DE BACI-LLUSCEREUS VISUALIZAM PROTEÍNAS OU ENZIMAS QUE PROTEGEM AS SEMENTES OU PLANTAS A PARTIR DE UM STRESS AMBIENTAL.
[001015] Proteínas, peptídeos e enzimas que protegem uma planta a partir de um stress ambiental pode ser incorporada no sistema BEMD e entregue às plantas-alvo através da adição de raízes, folhas, frutos, ou o meio de crescimento da planta. Durante os períodos de congelamento, as plantas podem ser danificadas pelo efeito de gelo. O sistema BEMD pode ser utilizado para apresentar peptídeos, proteínas ou enzimas que protegem as plantas de tais efeitos. Por exemplo, o sistema BEMD pode ser utilizado para exibir as desidrogenases de colina, as quais atuam através da produção de produtos de proteção que protegem a planta ou a semente da geada. Os substratos para estas enzimas (por exemplo, colina e/ou derivados de colina), também podem ser adicionados ao meio de crescimento da planta. As adições de tais substratos podem aumentar a quantidade do protetor (betaína e químicas relacionadas) produzida no meio ambiente da planta pelas enzimas expressas por BEMD. Sabe-se que os derivados da betaína protegem as sementes do estresse frio.
[001016] Qualquer destas proteínas ou peptídeos podem ser incor-porados no sistema BEMD para exibição em esporos BEMD utilizando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado que compreende a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima à exosporium quando o construto de fusão é expresso num membro da família Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso num membro da família Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereus é adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta ou aplicados às folhas de uma planta para proteger a planta de tensões e fatores ambientais.
EXEMPLO 23. EXPRESSÃO MELHORADA DOS CONSTRUTOS DE FUSÃO NO SISTEMA BEMD ATRAVÉS DA UTILIZAÇÃO DOS ELEMENTOS PROMOTORES MELHORADOS OU ALTERNATIVOS.
[001017] O sistema BEMD pode exibir uma vasta gama de proteínas, peptídeos e enzimas utilizando uma ou mais das sequências de direci-onamento aqui descritas. Algumas destas sequências de direcionamento têm uma elevada afinidade para o exosporium que seria benéfico para expressão de proteínas de fusão, mas o seu nível de expressão de proteína de fusão baixo limita a sua utilização no sistema BEMD. Para tais proteínas e sequências de fusão, podem ser utilizados promotores alternativos de esporulação de alta expressão em vez dos promotores nativos.
[001018] Por exemplo, a SEQ ID NO: 13 (aminoácidos 1-39 do gene KBAB4 de B. weihenstephensis 3572) proporciona uma sequência do terminal N muito eficaz para a distribuição de proteínas ao exosporium dos membros da família Bacillus cereus, como mostrado na Tabela 26 abaixo. Todos os genes foram sintetizados na sua forma completa (in-cluindo as regiões promotoras e regiões que codificam para proteínas de fusão), como aqui descrito. Quando os elementos promotores nativos do gene KBAB4 de B. weihenstephensis 3572 (SEQ ID NO: 217) foram utilizados para expressar uma proteína de fusão compreendendo a sequência de direcionamento da SEQ ID NO: 13 fundida com uma enzima β-galactosidase (de E. coli), foi expresso um baixo nível de proteína de fusão, conduzindo a uma redução da atividade enzimática na superfície do esporo. A atividade enzimática foi medida pela conversão de 0,5 M o-nitrofenilgalactosídeo em solução ao longo de 10 minutos. Conversão enzimática foi medida com um espectrofotômetro a ABS540. A substituição dos elementos promotores nativos do gene de B. weihenstephensis KBAB4 3572 com os promotores de alta ex pressão da SEQ ID NO: 197 (B. anthracis BetA/BAS3290) ou SEQ ID NO: 218 (proteína de B. weihenstephensis KBAB4 YVTN e-hélice) levou a um aumento dramático na atividade enzimática dos esporos. Por outro lado, a substituição dos elementos promotores nativos para o gene KBAB4 de B. weihenstephensis 3572 com o promotor nativo de B. anthracis Sterne BAS1882 (SEQ ID NO: 216) levou a uma diminuiçãona atividade enzimática dos esporos. O nível da sequência de di-recionamento de expressão da SEQ ID NO: 13 fundida com □-galactosidase foi muito menor (0,38X) quando conduzida pelo promotor da BAS1882 (SEQ ID NO: 216), e foi muito melhorada quando conduzida a partir do promotor BetA (SEQ ID NO: 197) ou promotor da proteína YVTN (SEQ ID NO: 218). TABELA26.
EXEMPLO24. ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DO CRESCIMENTO DO VEGETAL QUE PROMOVE AS CEPAS BACTERIANAS.
[001019] Foram coletadas amostras de solo de rizosferas das plantas mais saudáveis e resistentes (Solanum tuberosum), polpa amarela (Cucurbita pepo), tomate (Solanum lycopersicum) e do feijoeiro (Phaseolus coccineus), diluídos em água estéril e espalhadas em nu-trientes agar. Os isolados bacterianos que demonstraram taxas de crescimento elevadas e foram capazes de ser passados e propagados foram selecionados para um estudo mais aprofundado. As cepas sele-cionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl de 0,50 g, MgSO4 7H2O de 0,15 g, CaCl2 2H2O de 0,013 g e glicose de 1 g, por peso seco de L). Os cultivos durante a noite (30° C) de cepas selecionadas foram centrifugados, decantados nos meios e ressuspensos em uma quantidade igual de água destilada. Foram plantadas dez sementes de alface por tratamento a uma profundidade de 1 cm em solo de topo franco (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos. As sementes foram inoculadas ao plantio em vasos de 4 cm com 0,5 μl de bactérias ressuspensas em água misturada em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para administrar as bactérias em 3 de 3 (7,62 cm3) de solo bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65-75° F (18-24° C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de irrigação a cada 3 dias. Após uma semana, as alturas dos vegetais e os diâmetros das folhas, bem como a saúde em geral dos vegetais, foram coletados. A seleção inicial dos isolados de rizosfera resultou na obtenção de mais do que 200 espécies distintas de bactérias e fungos da rizosfera das quatro plantas. Algumas das espécies bacterianas estão descritas na Tabela 27. As cepas identificadas são indicadas por suas identificações bacterianas adequadas. Outras cepas são indicadas pelo seu número de identificação desconhecido. Os inoculantes que dão resultados próximos do de controle (+/2%) não foram incluídos na tabela. TABELA 27
[001020] As cepas bac terianas que produziram o maior efeito sobre a saúde geral da planta e sobre a altura da planta no teste inicial em alfaces foram submetidas a posterior identificação. As cepas bacterianas foram cultivadas durante a noite em caldo de Luria Bertani 37°C e durante a noite as culturas foram centrifugadas em uma centrífuga. O meio foi decantado e o sedimento bacteriano remanescente foi submetido a isolamento de DNA cromossômico utilizando o kit de isolamento de DNA cromossômico bacteriano Qiagen. O DNA cromossômico submetido a ampliação de PCR das regiões de codificação de RNA 16S que utilizam os iniciadores E338F 5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’ (SEQ ID NO: 298), E1099R A 5’-GGG TTG CGC TCG TTG C-3’ (SEQ ID NO: 299) e E1099R B 5’-GGG TTG CGC TCG TTA C-3’ (SEQ ID NO: 300). Os amplicons de PCR foram purificados utilizando um kit de purificação de PCR Promega e os produtos de ampli-ação resultantes foram diluídos e enviado para o núcleo de DNA da Universidade do Missouri para fazer o sequenciamento de DNA. As sequências de DNA foram comparadas ao banco de dados NCBI BLAST de isolados bacterianos, e os gêneros e espécies foram identificados por comparação direta com as cepas conhecidas. As principais espécies identificadas estão indicadas na Tabela 27. Em muitos casos, as sequênciAS De DNA rRNA 16S foram capazes de apenas delinear o gênero da cepa bacteriana selecionada. Em casos onde uma identi-ficação direta não se verificou, foram feitas análises bioquímicas adici-onais, utilizando métodos convencionais no campo, para diferenciar as cepas nas espécies e os níveis das cepas, e encontram-se listadas na Tabela 28. TABELA 28
EXEMPLO 25. ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DO CRESCIMENTO DO VEGETAL QUE PROMOVE AS CEPAS BACTERIANAS.
[001021] As amostras de solo de áreas agrícolas perto de Gas, Kansas, foram coletadas, diluídas em água estéril e espalhadas em placas de ágar de nutrientes. Os isolados bacterianos que demonstraram taxas de crescimento elevadas e foram capazes de ser passados e propagados foram selecionados para um estudo mais aprofundado. As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl a 0,50 g, MgSO4 7H2O a 0,15g, CaCl2 2H2O a 0,013g e glicose a 1 g, por peso seco de L). Os cultivos durante a noite (30 ° C) de cepas selecionadas foram centrifugados, decantados nos meios e ressuspensos em uma quantidade igual de água destilada. As sementes de milho foram revestidas com polímero comercial de sementes misturado somente com água (1,6 μL do total de sementes) ou com polímero de sementes comerciais contendo cepas bacterianas selecionadas (1,6 μl do total de sementes). As sementes revestidas foram plantadas em vasos de 7,62 cm de diâmetro (3 polegadas) a uma profundidade de 1 polegada (2,54 cm) em solo de superfície argilosa (Columbia, MO) que foi peneirado para remover detritos grandes. Os vegetais foram cultivados a temperaturas entre 1824oC (65-75oF) com 11 horas de luz/dia e 50 ml de irrigação no plantio a cada 3 dias. Após duas semanas, as alturas dos vegetais e os diâmetros das folhas, bem como a saúde em geral dos vegetais, foram coletados. Para os ensaios de germinação e para determinar o comprimento da raiz no dia 3, as sementes foram revestidas e dispersas uniformemente em 10 sementes por toalha de papel. As toalhas de papel foram umedecidas com 10 ml de água, enroladas, colocadas em um pequeno saco plástico e incubadas a 30 ° C ou colocadas em uma esteira de calor de germinação a 27-30 ° C (80-85 ° F). As medições da raiz foram registradas após 3 dias. A seleção inicial dos isolados de rizosfera resultou na obtenção de mais do que 100 espécies distintas de bactérias e fungos da rizosfera. Algumas das espécies bacterianas estão descritas na Tabela 29. As cepas identificadas são indicadas por suas identificações bacterianas adequadas. TABELA 29
[001022] As cepas bacterianas que produziram o maior efeito sobre a saúde dos vegetais são descritas na Tabela 29. As cepas bacterianas foram cultivadas durante a noite em caldo de Luria Bertani 37°C e durante a noite as culturas foram centrifugadas em uma centrífuga. O meio foi decantado e o sedimento bacteriano remanescente foi submetido a isolamento de DNA cromossômico utilizando o kit de isolamento de DNA cromossômico bacteriano Qiagen. O DNA cromossômico submetido a ampliação de PCR das regiões de codificação de RNA 16S que utilizam os iniciadores E338F 5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’ (SEQ ID NO: 298), E1099R A 5’-GGG TTG CGC TCG TTG C-3’ (SEQ ID NO: 299) e E1099R B 5’-GGG TTG CGC TCG TTA C-3’ (SEQ ID NO: 300). Os amplicons de PCR foram purificados utilizando um kit de purificação de PCR Promega e os produtos de ampliação resultantes foram diluídos e enviado para o núcleo de DNA da Universidade do Missouri para fazer o sequenciamento de DNA. As sequências de DNA foram comparadas ao banco de dados NCBI BLAST de isolados bacterianos, e os gêneros e espécies foram identificados por comparação direta com as cepas conhecidas. As principais espécies identificadas estão indicadas na Tabela 16. Em muitos casos, as sequênciAS De DNA rRNA 16S foram capazes de apenas delinear o gênero da cepa bacteriana selecionada. Em casos onde uma identificação direta não se verificou, foram feitas análises bioquímicas adicionais, utilizando métodos convencionais no campo, para diferenciar as cepas nas espécies e os níveis das cepas e as cepas diferenciadas encontram-se listadas na Tabela 30. TABELA 30wk = crescimento fraco ou baixo crescimento
EXEMPLO 26. O TESTE DAS CEPAS BACTERIANAS QUE PROMOVEM O CRES-CIMENTO DO VEGETAL NA ALFAFA.
[001023] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl de 0,50 g, MgSO4 7H2O de 0,15 g, CaCl2 2H2O de 0,013 g e glicose de 1 g, por peso seco de L). Os cultivos durante a noite (30 ° C) de cepas selecionadas foram centrifugados, decantados nos meios e as bactérias foram ressuspensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de alfafa revestidas com Zeba foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 0,6 cm em solo de superfície argilosa (Columbia, MO), que foi peneirado para remover detritos grandes. As sementes foram inoculadas no plantio com plantação, com 0,5 μl de bactérias ressuspensas em água misturadas em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para administrar as bactérias em 3 de 3 (7,62 cm3) de solo bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65-75 ° F (18-24 ° C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de irrigação a cada 3 dias. A alfafa foi deixada para cultivar por 1 semana para analisar a emergência e o crescimento inicial dos vegetais sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e os dados de altura final estão listados na Tabela 31. TABELA 31
EXEMPLO 27. O TESTE DAS CEPAS BACTERIANAS QUE PROMOVEM O CRES-CIMENTO DO VEGETAL EM PEPINOS.
[001024] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl de 0,50 g, MgSO4 7H2O de 0,15 g, CaCl2 2H2O de 0,013 g e glicose de 1 g, por peso seco de L). Os cultivos durante a noite (30 ° C) de cepas selecionadas foram centrifugados, decantados nos meios e ressuspensos em uma quanti-dade igual de água destilada. Dez sementes de pepino foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 1 cm em solo de superfície argilosa (Columbia, MO), que foi peneirado para remover detritos grandes. As sementes foram inoculadas no plantio com plantação, com 0,5 μl de bactérias ressuspensas em água misturadas em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para administrar as bactérias em 3 de 3 (7,62 cm3) de solo bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65-75 ° F (18-24 ° C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de irrigação a cada 3 dias. Os pepinos foram deixados para cultivo durante 2 semanas para analisar a emergência e o crescimento inicial dos vegetais sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e os dados de altura final estão listados na Tabela 32. TABELA 32
EXEMPLO 28. TESTES DO CRESCIMENTO DO VEGETAL QUE PROMOVE CEPAS BACTERIANAS EM POLPA AMARELA.
[001025] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl de 0,50 g, MgSO4 7H2O de 0,15 g, CaCl2 2H2O de 0,013 g e glicose de 1 g, por peso seco de L). Os cultivos durante a noite (30 °C) de cepas selecionadas foram centrifugados, decantados nos meios e ressuspensos em uma quanti-dade igual de água destilada. Dez sementes de polpa amarela foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 1 cm em solo de superfície argilosa (Columbia, MO), que foi peneirado para remover detritos grandes. As sementes foram inoculadas no plantio com plan-tação, com 0,5 μl de bactérias ressuspensas em água misturadas em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para administrar as bactérias em 3 de 3 (7,62 cm3) de solo bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65-75 ° F (18-24 ° C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de irrigação a cada 3 dias. As polpas foram deixadas para cultivo durante 2 semanas para analisar a emergência e o crescimento inicial dos vegetais sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas pelas suas identificações bacterianas apropriadas, pelos dados de altura final e pelos dados do diâmetro final das folhas (pela extensão de duas folhas) estão listados na Tabela 33. TABELA 33
EXEMPLO 29. O TESTE DAS CEPAS BACTERIANAS QUE PROMOVEM O CRES-CIMENTO DO VEGETAL EM AZEVÉM.
[001026] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl de 0,50 g, MgSO4 7H2O de 0,15 g, CaCl2 2H2O de 0,013 g e glicose de 1 g, por peso seco de L). Os cultivos durante a noite (30 ° C) de cepas selecionadas foram centrifugados, decantados nos meios e ressuspensos em uma quanti-dade igual de água destilada. Dez sementes de pepino foram planta- das para cada tratamento a uma profundidade de 0,3 cm em solo de superfície argilosa (Columbia, MO), que foi peneirado para remover detritos grandes. As sementes foram inoculadas no plantio com plan-tação, com 0,5 μl de bactérias ressuspensas em água misturadas em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para administrar as bactérias em 3 de 3 (7,62 cm3) de solo bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65-75 ° F (18-24 ° C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de irrigação a cada 3 dias. As polpas foram deixadas para cultivo durante 1,5 semana para analisar a emergência e o crescimento inicial dos vegetais sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e os dados de altura final estão listados na Tabela 34. TABELA 34
EXEMPLO 30. O TESTE DAS CEPAS BACTERIANAS QUE PROMOVEM O CRES-CIMENTO DO VEGETAL NO MILHO.
[001027] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl de 0,50 g, MgSO4 7H2O de 0,15 g, CaCl2 2H2O de 0,013 g e glicose de 1 g, por peso seco de L). Os cultivos durante a noite (30 ° C) de cepas selecionadas foram centrifugados, decantados nos meios e ressuspensos em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de pepino foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 2,5 cm em solo de superfície argilosa (Columbia, MO), que foi peneirado para remover detritos grandes. As sementes foram inoculadas no plantio com plan-tação, com 0,5 μl de bactérias ressuspensas em água misturadas em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para administrar as bactérias em 3 de 3 (7,62 cm3) de solo bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65-75 ° F (18-24 ° C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de irrigação a cada 3 dias. O milho foi deixado para cultivo durante 2 semanas para analisar a emergência e o crescimento inicial dos vegetais sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e os dados de altura final estão listados na Tabela 35. TABELA 35
EXEMPLO 31. O TESTE DAS CEPAS BACTERIANAS QUE PROMOVEM O CRES-CIMENTO DO VEGETAL NA SOJA.
[001028] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl de 0,50 g, MgSO4 7H2O de 0,15 g, CaCl2 2H2O de 0,013 g e glicose de 1 g por peso seco de L ou para Bradyrhizobium ou Rhizobium em meios de manitol de levedura). Os cultivos durante a noite (30 ° C) de cepas selecionadas foram centrifugados, decantados nos meios e ressuspensos em uma quanti-dade igual de água destilada. Dez sementes de soja foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 2,5 cm em solo de su-perfície argilosa (Columbia, MO), que foi peneirado para remover detritos grandes. As sementes foram inoculadas no plantio com plantação, com 0,5 μl de bactérias ressuspensas em água misturadas em 10 ml de H2O. Ao testar duas cepas bacterianas, 0,5 μl de cada bactéria ressuspensa foi misturado em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para administrar as bactérias em 3 de 3 (7,62 cm3) de solo bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65-75 ° F (18-24 ° C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de irrigação a cada 3 dias. A soja foi deixada para cultivo durante 2 semanas para analisar a emergência e o crescimento inicial dos vegetais sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e os dados de altura final estão listados na Tabela 36. A coinoculação de estipes bacterianas na presente invenção com membros da Bradyrhizobium sp. ou Rhizobium sp. levam a um aumento no crescimento dos vegetais em comparação com qualquer inoculante isoladamente. TABELA 36
EXEMPLO 32. OS MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS COM ATRIBUTOS DE PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO DO VEGETAL.
[001029] A cepa Bacillus mycoides BT155, cepa Bacillus mycoides EE118, cepa Bacillus mycoides EE141, cepa Bacillus mycoides BT463, cepa do membro da família Bacillus cereus EE349, cepa Bacillus thuringiensis BT013A e cepa Bacillus megaterium EE281 foram culti-vados em caldo de Luria Bertani a 37°C e os cultivos durante uma noite foram centrifugados, decantados em meios e ressuspensos em uma quantidade uniforme de água destilada. 20 sementes de pepino foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 2,5 cm em solo de superfície argilosa (Columbia, MO), que foi peneirado para remover detritos grandes. As sementes foram inoculadas no plantio com plantação, com 0,5 μl de bactérias ressuspensas em água misturadas em 50 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para administrar as bactérias em 29 de 3 (442,5 cm3) de solo bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65-72 ° F com 13 horas de luz/dia, e 5 ml de irrigação a cada 3 dias. As mudas foram deixadas para cultivo durante 2 semanas para analisar a emergência e o crescimento inicial dos vegetais sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e os dados de altura final estão listados na Tabela 37. TABELA 37
[001030] Todas as bacl érias que promovem o crescimento do vegetal testadas tiveram um efeito benéfico sobre a altura do vegetal a duas semanas sob as condições descritas. A cepa do membro da família Bacillus cereus EE128 teve o maior efeito neste teste, conferindo um estímulo superior a 14% na altura do milho.
EXEMPLO 33. A SELEÇÃO MELHORADA DOS MEMBROS DA FAMÍLIA DO BA-CILLUSCEREUS PARA SELECIONAR A PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO DO VEGETAL E OUTRAS ATIVIDADES BENÉFICAS COMO HOSPEDEIROS DA EXPRESSÃO DE BEMD.
[001031] O sistema de BEMD pode ser utilizado para exibir uma vasta gama de proteínas, peptídeos e enzimas que utilizam qualquer uma das sequências de direcionamento descritas aqui para proporcionar efeitos agrícolas benéficos. Os efeitos benéficos adicionais podem ser obtidos pela seleção de um hospedeiro de expressão (um membro da família Bacillus cereus) com atributos benéficos inerentes. Muitas cepas dos membros da família Bacillus cereus têm benefícios de promoção do crescimento do vegetal. Além disso, muitas cepas do membro da família Bacillus cereus apresentam efeitos de proteção, através de fungicidas, inseticidas, nematocidas ou outras atividades de proteção. Ao utilizar essas cepas como hospedeiro de expressão para o sistema de BEMD, o produto final dos esporos teria uma combinação de benefícios positivos na agricultura.
[001032] A Tabela 38 apresenta os resultados de uma experiência em que uma proteína de fusão foi expressa em várias cepas do membro da família Bacillus cereus. Todas as cepas são expressas em uma proteína de fusão compreendendo os aminoácidos de 1-35 da SEQ ID NO: 1 e a fosfatase PhoA4 do Bacillus subtilis, uma enzima benéfica para a absorção de fosfato melhorado em milho. O gene foi sintetizado, clonado NO vetor pMK4 e introduzido em cada uma das Bacilo spp. indicadas na Tabela 38, abaixo. As cepas foram cepas foram colocadas em esporulação de incubação a 30 ° C em placas de ágar de nutriente contendo cloranfenicol a 10 μg/ml durante três dias. Os esporos foram coletados, lavados e aplicados ao milho no plantio a uma taxa de 1x105 CFU/ml em 50 ml de água por vaso de 7,62 cm de diâmetro, com 5 mg de polifosfato por vaso. O milho foi cultivado em terra argilosa de sedimento por duas semanas. Os vegetais foram cultivados sob luz ideal utilizando lâmpadas T5, 54 watts, e expostos a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada, entre 15,5-25,5 ° C. Os vegetais foram irrigados à saturação de três em três dias durante duas semanas de teste. Ao final de duas semanas, a altura de cada vegetal foi medida e as medidas foram normalizadas para controlar os esporos do Bacillus thuringiensis. Expressão da SEQ—ID NO: 1 A proteína de fusão de fosfatase levou a um aumento na altura do milho em 2 semanas, independentemente da cepa hospedeira de expressão selecionada. Como mostrado na Tabela 38, o uso de um membro da família Bacillus cereus de promoção de crescimento do vegetal aumento anda mais a altura do milho. TABELA 38.
EXEMPLO 34. A UTILIZAÇÃO DE VÁRIAS SEQUÊNCIAS DE DIRECIONAMENTO PARA EXPRESSAR B-GALACTOSIDASE NA SUPERFÍCIE DO BACILLUS THU-RINGIENSIS .
[001033] Uma ampla variedade de sequências de direcionamento que têm um elevado grau de homologia com os aminoácidos de 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1) pode ser utilizada para exibir as enzimas, proteínas e peptídeos na superfície dos membros da família Bacillus cereus. Várias sequências de direcionamento foram comparadas fazendo proteínas de fusão contendo as sequências de direcionamento ligadas à lipase do Bacillus subtilis. Os construtos de fusão foram sintetizados pelo uso de promotores nativos da sequência de direcionamento, clonados em um plasmídeo rEPLicante pMK4 e inseridos no Bacillus thuringiensis BT013A. As cepas foram cepas foram colocadas em esporulação de incubação a 30 ° C em placas de ágar de nutriente contendo cloranfenicol a 10 μg/ml durante três dias. Os esporos foram coletados, lavados e ressuspensos em PBS a uma taxa de 1x108/ml. 1 X 105 esporos cada esporo do construto de fusão foi suspenSO em 400 μL de dH2O. As reações foram aquecidas com os componentes da reação à temperatura de reação desejada (40 ° C). 200 μl de tampão de força foram adicionados (9:1 Solução A:Solução B). A solução A foi de tRis A 50 mM, pH 10, e 13,6 mM de ácido desoxicólico e a Solução B foi de 3 mg/ml de palmitato de pnitrofenil em isopropanol. A reação foi incubada a 40 ° C durante 10 minutos e colocada em gelo, centrifugada para remover os esporos e uma absorvância de 420 nm foi registrada. Os resultados são apresentados na Tabela 39, abaixo. A atividade foi normalizada para uma proteína de fusão de controle compreendendo os aminoácidos de 1-35 da SEQ ID NO: 1 fundidos com a lipase do Bacillus subtilis. TABELA 39.
[001034] Várias sequências de direcionamento ligado à lipase resul- tam em níveis de expressão mais elevados e na atividade da enzima sobre a superfície dos esporos. Em particular, as SEQ ID NOs. 96, 98 e 100, cada uma contendo uma sequência de direcionamento mais curta, resultaram na expressão de fusão melhorada sobre a superfície dos esporos de BEMD. Todas as proteínas de fusão contendo sequências de direcionamento testadas resultaram na exposição da superfície da lipase.
EXEMPLO 35. A UTILIZAÇÃO DE VÁRIAS SEQUÊNCIAS DE EXOSPORIUM PARA EXPRESSAR A LIPASE NA SUPERFÍCIE DO BACILLUS THURINGIENSIS E A DE-MONSTRAÇÃO DA LOCALIZAÇÃO DA PROTEÍNA DE FUSÃO À SUPERFÍCIE DE EXOSPORIUM.
[001035] Uma ampla variedade de proteínas do exosporium pode ser utilizada para exibir as enzimas, proteínas e peptídeos na superfície do membro da família Bacillus cereus. Várias proteínas do exosporium diferentes foram comparadas fazendo proteínas de fusão contendo as proteínas do exosporium ligadas À lipase do Bacillus subtilis, tal como descrito no Exemplo 34. Os construtos de fusão foram sintetizados uti-lizando o promotor nativo à proteína do exosporium indicada na Tabela 40, abaixo, clonados no plasmídeo rEPLicante pMK4 e inseridos no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que apresentam as várias fusões da lipase da proteína do exosporium Bacillus subtilis 168 foram feitos cultivando-se as bactérias transformadas na infusão de cérebro e coração com pressão seletiva de 10 μg/m de cloranfenicol, por plaqueamento em placas de ágar de nutriente e por incubação 30 ° C du-rante 3 dias. Após 3 dias, os esporos foram lavados fora das placas, purificados por centrifugação e ressuspensos em PBS a 1 X 10 8 CFU/ml.
[001036] 1 X 105 esporos para cada construto de fusão foram ressuspensos em 400 μl de dH2O. As reações foram aquecidas com os componentes da reação à temperatura de reação desejada (40 ° C). 200 μl de tampão de força foram adicionados (9:1 Solução A:Solução B). A solução A foi de tRis A 50 mM, pH 10, e 13,6 mM de ácido desoxicólico e a Solução B foi de 3 mg/ml de palmitato de p-nitrofenil em isopropanol. A reação foi incubada a 40 ° C durante 10 minutos e colo-cada em gelo, centrifugada para remover os esporos e uma absorvância de 420 nm foi registrada. Os resultados são apresentados na Tabela 40, abaixo. A atividade foi normalizada para a SEQ ID NO: 109 ligadaà lipase. TABELA 40.
[001037] O uso das proteínas do exosporium da SEQ ID NOs. 109 e 110 resultou na maior atividade da enzima sobre o esporo. Todas as proteínas de fusão que contêm proteínas do exosporium resultaram na exposição da superfície ativa da lipase do Bacillus subtilis 168, ainda que a diferentes níveis.
[001038] Demonstrou-se que as proteínas do exosporium adicionais resultam no direcionamento das proteínas de fusão ao exosporium uti-lizando o repórter fluorescente mCherry. Foram criados construtos que continham as proteínas das SEQ ID NOs. 111, 120 e 110 ligadas ao repórter mCherry. Os esporos foram cultivados durante 1,5 dia, coletados e ressuspensos conforme descreveu-se acima. 7 μl dos esporos fluorescentes foram colocados em um microscópio Nikon E1000 e fo-tografados durante a esporulação posterior. A localização circular em um anel é indicativo da localização da camada externa do esporo e a aparência corresponde à de uma proteína do exosporium. Os resultados da microscopia de fluorescência são apresentados na Figura 2. Os painéis A, B e C da Figura 2 são imagens de microscopia de fluores-cência de esporos que expressam proteínas de fusão compreendendo as proteínas do exosporium das SEQ ID NOs. 111, 120 e 110, respec-tivamente, e o repórter mCherry. Todos as três fusões demonstraram altos níveis de fluorescência e a localização do exosporium, demons-trando a sua utilidade potencial para a expressão de proteínas estranhas na superfície do exosporium.
EXEMPLO 36. A UTILIZAÇÃO DE VÁRIAS SEQUÊNCIAS DE DIRECIONAMENTO E PROTEÍNAS DO EXOSPORIUM PARA EXPRESSAR FOSFATASE NOS ESPOROS DO BACILLUS SUBTILIS E OS EFEITOS DOS ESPOROS QUE EXPRESSAM FOSFATASE EM SOJA.
[001039] Os esporos de BEMD que expressam a fosfatase A4 (PhoA4) do Bacillus subtilis EE148 foram criados por síntese de genes dos genes que codificam em diferentes sequências de direcionamento e proteínas do exosporium sob o controle dos seus promotores nativos ligadas à PhoA4. Os genes sintetizados foram clONAdos em pMK4 e introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que apresentam as várias fusões da PhoA4 da proteína do exosporium do Bacillus subtilis EE148 foram feitos cultivando-se as bactérias transformadas na infusão de cérebro e coração com pressão seletiva de 10 μg/m de cloranfenicol, por plaqueamento em placas de ágar de nutriente e por incubação 30 ° C durante 3 dias. Após 3 dias, os esporos foram lavados fora das placas, purificados por centrifugação e ressuspensos em PBS a 1 X 10 8 CFU/ml.
[001040] A soja foi plantada a 2,54 cm de profundidade em vasos de 10 cm cheios de terra argilosa padrão. Os esporos de BEMD que ex-pressam a PhoA4 foram diluídos até uma concentração de 1 X 104/ Ml em 50 ml de água e aplicados a cada vegetal no plantio. Um controle só de água também foi incluído. Polifosfato foi adicionado aos vasos em líquido a uma taxa de 0,5 mg/vaso. Os vegetais foram cultivados sob luz ideal utilizando lâmpadas T5, 54 watts, e expostos a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada, entre 15,525,5 ° C. Os vegetais foram irrigados à saturação de três em três dias durante as duas semanas de teste. Ao final de duas semanas, a altura de cada vegetal foi medida e as medições foram normalizadas para controlar os vegetais apenas com água.
[001041] Os resultados são mostrados na Tabela 41. A soja cultivada na presença dos esporos de BEMD que expressam as proteínas de fusão contendo PhoA4 ligada a várias sequências de direcionamento e proteínas do exosporium com diferentes parceiros de fusão com PhoA4, todas apresentaram um aumento no crescimento, mas a extensão do efeito variou conforme a sequência de direcionamento ou a proteína do exosporium utilizada. TABELA 41.
EXEMPLO 37. CO-APLICAÇÃO DOS ESPOROS DE BEMD E TRATAMENTOS DE SEMENTES, FERTILIZANTES LÍQUIDOS E OUTROS ADITIVOS.
[001042] Os esporos de BEMD que expressam proteínas de fusão foram testados quanto à compatibilidade com diferentes tratamentos de sementes. Os esporos de BEMD expressaram proteínas de fusão compreendendo a sequência de direcionamento dos aminoácidos de 1-35 da SEQ ID NO: 1 ligados a uma fosfatase (PhoA4) do Bacillus subtilis EE148 ou do peptídeo POLARIS. Os genes sintetizados foram clONAdos em pMK4 e introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que apresentam as várias fusões da PhoA4 da proteína do exosporium do Bacillus subtilis EE148 ou das fusões de POLARIS foram feitos cultivando-se as bactérias transformadas na infusão de cérebro e coração com pressão seletiva de 10 μg/m de cloranfenicol, por plaqueamento em placas de ágar de nutriente e por incubação 30 ° C durante 3 dias. Após 3 dias, os esporos foram lavados fora das placas, purificados por centrifugação e ressuspensos em PBS a 1 X 10 8 CFU/ml.
[001043] Os vegetais foram cultivados sob luz ideal utilizando lâmpadas T5, 54 watts, e expostos a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada, entre 15,5-25,5 ° C. Os vegetais foram irrigados à saturação de três em três dias durante as duas semanas de teste. Ao final de duas semanas, a altura de cada vegetal foi medida e as medições foram normalizadas para controlar os vegetais apenas com água. Os resultados são apresentados na Tabela 42, abaixo. Aspersão = aplicada ao solo a 50 ml por vaso. Polímero = Apenas o polímero de revestimento de sementes ACCELERON. Os esporos de BEMD Bforam adicionados a 1 x 10 4células/50 ml para aplicações de aspersão. Os esporos de BEMD foram adicionados a 1,3x10 4/células/semente para aplicações de revestimento de sementes. 10-34-0 e 6-24-6 são composições comerciais padrão de fertilizantes de partida. 10-34-0 é o fosfato de amônio líquido. 6-24-6 é um fertilizante de fosfato de líquido com baixo nível de sal com uma formulação orto/poli. Corante = agente corante de revestimento de sementes vermelho Becker Underwood. MACHO, APRON e CRUISER são fungicidas comerciais utilizados em sementes. MACHO contém o ingrediente ativo imidacloprid, APRON contém o ingrediente ativo mefenoxam e CRUISER contém uma mistura de ingredientes ativos: tiametoxam, mefenoxam e fludioxonil. Constatou-se que os esporos são compatíveis com diversas aplicações de sementes e mantiveram sua capacidade de estimular o crescimento vegetal no milho. TABELA 42.
[001044] Constatou-se que os esporos de BEMD são compatíveis com todas as alterações de revestimentos de sementes testadas. Houve um ligeiro decréscimo na atividade quando os esporos da PhA4 de BEMD foram combinados com o corante e o polímero isoladamente, mas os esporos recuperaram completamente a atividade com o corante em combinação com outros fungicidas. Os esporos de BEMD também funcionaram bem com fertilizantes líquidos. Os fertilizantes de partida contribuíram com o crescimento vegetal muito provavelmente através da suplementação direta de nutrientes. Os esporos de BEMD funcionaram com ambos os fertilizantes de partida, o que sugere que a atividade da fosfatase pode ainda levar a um aumento do crescimento vegetal na presença de um excesso de nutrientes. As combinações dos esporos de BEMD com fungicidas apresentaram maiores aumentos no crescimento vegetal do que os esporos de BEMD isoladamente, provavelmente em função da proteção fornecida às plantações de milho jovens durante o crescimento inicial.
EXEMPLO 38. O USO DE ESPOROS DE BEMD COMO UMA ADIÇÃO FOLIAR PARA REDUZIR A INIBIÇÃO DE TENSÃO DO CRESCIMENTO SOBRE O MILHO.
[001045] O sistema de exibição de esporos de BEMD pode ser utilizado para administrar enzimas que podem aliviar parte da tensão do cultivo de vegetais no campo ou em uma estufa. Para se conseguir isso, foram selecionadas enzimas que atual seletivamente sobre as espécies de oxigênio reativas no solo. As espécies reativas de oxigêniosão um marcador essencial da tensão nos vegetais.
[001046] Foram gerados esporos de BEMD que expressam proteínas de fusão compreendendo a sequência de direcionamento de aminoácidos de 1-35 da SEQ ID NO: 1 ligadas a quitosanase, superóxido dismutase, catalase, ou D1,3 glucanase do Bacillus thuringiensis BT013A. Os genes sintetizados foram clONAdos em pMK4 e introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que apresentam as várias fusões da proteína foram feitos cultivando-se as bactérias transformadas na infusão de cérebro e coração com pressão seletiva de 10 μg/m de cloranfenicol, por plaqueamento em placas de ágar de nutriente e por incubação 30 ° C durante 3 dias. Após 3 dias, os esporos foram lavados fora das placas, purificados por centrifugação e ressuspensos em PBS a 1 X 10 8 CFU/ml.
[001047] As plantações de milho com três semanas na etapa V5 foram cultivadas sob luz ideal utilizando lâmpadas T5, 54 watts, e expostos a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada, entre 15,5-25,5 ° C. Os vegetais foram irrigados à saturação de três em três dias durante a duração do teste.. À medida que as plantas atingem a etapa V5, os esporos de BEMD ou os produtos químicos de controle positivo foram pulverizados sobre as folhas a 1 X 105 esporos de BEMD/ml ou às taxas recomendadas para os produtos químicos. Um total de 1 ml de pulverização foi aplicado a cada vegetal individualmente. As alturas dos vegetais foram tomadas antes da aplicação das pulverizações foliares. As plantações de milho foram tensionadas aquecendo-se até 32,2 ° C e diminuindo-se a irrigação para uma vez por semana. Os vegetais foram mantidos sob condições de tensão durante duas semanas. Ao final das duas semanas, as alturas dos vegetais foram medidas novamente e a aparência visual foi registrada. Sob essas condições de tensão, o crescimento vegetal foi mínimo nos tra-tamentos de controle. A capacidade de continuar a crescer sob condições de tensão foi medida por um aumento na altura dos vegetais durante o ciclo de duas semanas em comparação com o controle só com água. Os resultados são apresentados na Tabela 43, abaixo. TABELA 43.
[001048] Várias enzimas de tensão foram aplicadas ao milho utilizando-se o sistema de BEMD, como mostra a Tabela 43, acima. Os esporos de controle não tiveram efeito significativo (diminuição na altura do vegetal de -1,6%. A enzima de quitosanase de BEMD teve um efeito positivo quando combinados com o seu substrato, quitosano. As duas enzimas com melhor desempenho foram β-1,3-glucanase de BEMD e superóxido dismutase de BEMD. BEMD β-1,3-glucanase tem uma atividade antifúngica, principalmente, mas também podem ter efeitos diretos sobre os vegetais. O ácido SalIcílico e BTH foram controles positivos para o ensaio foliar e as respostas positivas foram ob-servadas para ambos. Este método de administração foliar pode ser usado para administrar as enzimas de tensão aos vegetais em várias épocas do ano.
EXEMPLO 39. NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE UTILI-ZAM VÁRIOS PROMOTORES CONTENDO SlGMA-K.
[001049] Como mostrado no Exemplo 23, acima, substituir o promotor nativo de uma sequência de direcionamento, a proteína do exosporium, um fragmento de proteína ou o exosporium pode afetar amplamente o nível de proteína de fusão expresso no exosporium de um esporo da família Bacillus cereus. Por exemplo, a substituição do promotor nativo BclA pelo promotor BclB reduz muito o nível da proteína de fusão na superfície dos esporos do membro da família Bacillus cereus. Alternativamente, a substituição do promotor nativo BclB pelo promotor de BclA aumenta drasticamente os níveis da proteína de fusão no exosporium.
[001050] Os níveis de expressão relativos do promotor de várias pro-teínas do exosporium sob o controle dos seus promotores nativos de esporulação foram obtidos a partir de dados do microensaio de Bergman et al., 2008. Os níveis de expressão relativos foram determinados durante a temporização da esporulação posterior (300 minutos depois do início do experimento), quando os promotores de sigma K estão mais ativos. Os promotores de sigma K são promotores essenciais para a expressão dos genes localizados no exosporium e proteínas associadas. A expressão relativa é o aumento do nível de expressão de um gene em comparação à média de todos os demais genes do cromossomo em todos os tempos fornecidos. A Tabela 44, abaixo, mostra os níveis de expressão relativos de uma variedade de genes de Sigma K conduzido em membros da família Bacillus cereus. TABELA 44.
EXEMPLO 40. PREPARAÇÃO E ENSAIO DE ESPOROS DE BEMD QUE EX-PRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO COMPREENDENDO UMA SINTASE DE ÓXIDO NÍTRICO E A UTILIZAÇÃO DESSES ESPOROS PARA ESTIMULAR A GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE VEGETAIS.
[001051] Foram gerados esporos de BEMD que expressam uma proteína de fusão que contém os aminoácidos de 20-35 de BclA, um ligante de 6-alanina e a enzima de sintase de óxido nítrico do Bacillus subtilis 168. A sintase do óxido nítrico (NOS) da enzima do Bacillus subtilis 168 passou por síntese genética em fusão com o promotor de BclA, com o local de ligação ribossômico (RBS), com o códon de partida e com os aminoácidos de 20-35 de BclA. Uma região ligante de seis alaninas foi incluída para separar a sequência de direcionamento de BclA das enzimas de NOS. As sequências de aminoácidos dessas proteínas de fusão, incluindo a metionina codificada pelo códon de partida de BclA, os aminoácidos de 20-35 de BclA, o ligante de ácido de seis aminos e a enzima de NOS são fornecidos acima, na Tabela 9. Esses clones foram subclonados no vetor de tRANsporte pHP13 através da digestão com Xhol e da ligação no locaL sall de pHP13. Os construtos corretos foram sequenciados e verificados, transformados em células E. coli. Os plasmídeos resultantes foram transformados em Bacillus thuringiensis BT013A e Bacillus mycoides EE155.
[001052] O recombinante Bacillus thuringiensis BT013A e Bacillus mycoides EE155 transformados com os plasmídeos que codificam as proteínas de fusão de NOS foram então induzidos a esporular esfregando as bactérias nas placas de ágar de nutriente e incubando as placas a 30 ° C durante 72 horas. Após 72 horas, os esporos bacterianos foram coletados da placa esfregando-se a salmoura tamponada com fosfato estéril (PBS) e foram purificados por centrifugação de densidade por três vezes.
[001053] Os esporos foram então aplicados às sementes de milho comerciais e híbridas de soja a taxas de 1x10 5 esporos/semente. A variedade híbrida de soja foi BECK 335NR, que contém o gene de pro-teção nematoide cística, o gene de resistência a glifosato ROUNDUP READY e o gene K para resistência a Phytophthora. A variedade de milho híbrido foi BECK 5540RR, que contém o gene de resistência a glifosato Roundup Ready. As sementes foram então ligeiramente pul-verizadas com L-arginina. Um conjunto de sementes de controle foi pulverizado com L-arginina, mas sem esporos. As sementes foram então colocadas entre duas toalhas de papel, que foram então umedecidas com 25 ml de H2O. As toalhas de papel foram então enroladas, colocadas em um saco pequeno e vedadas hermeticamente. Esses sacos foram colocados em uma incubadora a 30oC e deixada para germinar por 24 ou 48 horas. O número de sementes germinadas em cada ponto de tempo foi medido e os resultados foram comparados às sementes de controle e não tratadas. Os resultados desses experi-mentossão mostrados nas Tabelas 45 e 46, abaixo. TABELA 45. O AUMENTO DA TAXA DE GERMINAÇÃO EM SEMENTES DE SOJA HÍBRIDA TRATADAS COM ESPOROS DOS MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS QUE EXPRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO CONTENDO SINTASE DE ÓXIDO NÍTRICO. TABELA 46. O AUMENTO DA TAXA DE GERMINAÇÃO EM SEMENTES DE SOJA HÍBRIDA TRATADAS COM ESPOROS DOS MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS QUE EXPRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO CONTENDO SINTASE DE ÓXIDO NÍTRICO.
[001054] Como pode ser visto a partir das Tabelas 45 e 46, o tratamento de sementes com L-arginina e um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressam uma proteína de fusão que com- preende uma enzima de sintase de óxido nítrico levou a um aumento no número de sementes germinadas, tanto na soja quanto no milho.
EXEMPLO 41. PREPARAÇÃO E ENSAIO DE ESPOROS DE BEMD QUE EX-PRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO COMPREENDENDO PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
[001055] Os esporos de BEMD que expressam uma proteína de fusão que contém os aminoácidos de 20-35 de BclA, um ligante de oito alaninas e a proteína de ligação de DNA não específico de SASPα do Bacillus subtilis 168 ou a proteína de ligação de DNA não específico de SASPY do Bacillus subtilis 168. O DNA que codifica SASPα e SASPY passou por síntese genética enquadrado com o promotor de BclA, com RBS, com o BclA do códon de partida e com os aminoácidos de 20-35 de BclA. Uma região ligante de oito alaninas foi incluída entre a sequência de direcionamento de BclA e as proteínas de ligação de RNA/DNA. O ligante permite uma maior flexibilidade e dobragem proteica das proteínas de fusão. As sequências de aminoácidos para estas proteínas de fusão, incluindo a metionina codificada pelo códon de partida de BclA, pelos aminoácidos de 20-35 de BclA, o ligante de oito aminoácidos e a proteína SASPα ou SASPy são fornecidos acima, na Tabela 11. Os genes sintetizados foram digeridos com Xhol e ligados ao locaL salI de pHP13 para gerar os pLASmídeos pHP13-BclA20-35sASPα e pHP13-BclA20-25SASPy. pHP13 é um vetor de transporte de 5,5 Kpb devidamente caracterizado com cassetes de resistência a cloranfenicol e eritromicina. Eles foram construídos através da ligação dos pLAsmídeOS pE194, PC194 e pUC9.
[001056] Os clones corretos foram submetidos a sequenciamento de DNA e transformados na cepa SCS110 de E. coli. O DNA do plasmídeo foi então purificado e transformado no Bacillus thuringiensis BT013A. Essas bactérias foram então induzidas a esporular por raspagem sobre placas de ágar de nutriente durante 72 horas a 30 °C. Os esporos foram coletados e purificados como descrito acima, no exemplo imediatamente precedente.
[001057] Para avaliar a capacidade dos esporos recombinantes de se ligar a ácidos nucleicos, os membros da família Bacillus cereus recombinante transformados com os plasmídeos que codificam as prote-ínas de fusão SASPα e SASPY foram então incubados em PBS com iniciadores de DNA aleatórios contendo uma marcação de fluoresceína nas extremidades 5 '. Um controle utilizando esporos não recombinantes também foi incluído no experimento. Os esporos foram incubados durante dez minutOS com 50 mM de DNA marcado e então lavado por centrifugação por um minuto a 10.000 rpm. O sobrenadante foi removido e os esporos foram ressuspensos em 1 ml de PBS. Os esporos foram sedimentados novamente e o sobrenadante foi removido depois da centrifugação e, em seguida, submetido a análise. Os esporos tratados com DNA marcado com fluoresceína foram examinados sob um microscópio fluorescente Nikon E600 e a ligação ao DNA foi determinada pela mudança na fluorescência total em comparação aos esporos de controle que não continham as proteínas de fusão ao DNA. Os resultados desses ensaios são apresentados na Tabela 47, abaixo. TABELA 47. LIGAÇÃO AO DNA AOS ESPOROS DO MEMBRO DA FAMÍLIA BA-CILLUSCEREUS RECOMBINANTE QUE EXPRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO COMPREENDENDO UMA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO AO DNA
[001058] Além disso, a Figura 3 mostra a ligação ao DNA aos esporos, conforme medida pela ligação ao DNA marcado com fluoresceína. Na Figura 3, "controle" se refere aos esporos de B. thuringiensis BT013A(não recombinantes), "SASPa" se refere aos esporos de B. thuringiensis BT013A expressando a proteína de fusão BclA-SASPα e SASPc se refere aos esporos de B. thuringiensis BT013A que expressam a proteína de fusão BCIA-SASPY.
[001059] Como pode ser visto a partir dos dados mostrados na Tabela 47 e na Figura 3, os esporos que expressam as proteínas de fusão de SASPα ou SASPYse ligaram a uma quantidade significativamente maior de DNA do que os esporos não recombinantes, o que demonstra uma forte afinidade com esses esporos de DNA.
EXEMPLO 42. PREPARAÇÃO E TESTE DOS ESPOROS DE BEMD QUE EX-PRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO COMPREENDENDO UMA NUCLEASE
[001060] Além do DNA não específico e das proteínas de ligação ao RNA discutidos acima, no exemplo imediatamente precedente, as nucleases também podem ser usadas para se ligar a ou clivar moléculas de ácido nucleico. Os esporos de BEMD que expressam uma proteína de fusão que contém os aminoácidos de 20-35 de BclA e uma enzima de endonuclease foram gerados e testados quanto à sua capacidade de se ligar ao e clivar o DNA.
[001061] A endonuclease 1 do Bacillus subtilis foi ampliada por PCR e fundida a uma estrutura ao promotor de BclA, ao RBS, ao códon de partida e aos aminoácidos de 20-35 de BclA. Esse construto foi então clonado como o PLAsmídeo pHP13 para criar o PLAsmídeo pHP13BclA20-35-endonuclease. Esse construto foi sequenciado e transformado e propagado em E. coli. O DNA do plasmídeo foi então isolado do E. coli e introduzido no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos foram criados e purificados como descrito no Exemplo 40, acima.
[001062] A atividade de endonuclease foi testada pela incubação dos esporos recombinantes que expressam a proteína de fusão de endo-nuclease e os esporos de controle não recombinantes em PBS a uma concentração de 1x108 esporos/ml em PBS com 300 ng de DNA de esperma de salmão e 1 μg/ml de corante de DNa DAPI (4',6-diamidino2-fenilindol) A reação foi deixada prosseguir durante 10 minutos a 37 ° C. Após 10 minutos, o sobrenadante foi testado quanto ao DNA clivado utilizando um fluorômetro. Conforme o DNA é clivado, a coloração de DAPI é liberada dos nucleotídeos liberados individuais e, assim, a clivagem pode ser determinada pela perda da coloração de DAPI ao longo do tempo. Os resultados desse teste são mostrados abaixo, na Tabela 48. TABELA 48. A ATIVIDADE DA NUCLEASE E A LIGAÇÃO AO DNA POR PARTE DOS ESPOROS DE BEMD QUE EXPRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO DE ENDONUCLEASE
[001063] Os dados apresentados acima, na Tabela 48, mostram que a proteína de fusão de endonuclease foi expressa no exosporium dos esporos do Bacillus thuringiensis BT013A e foi capaz de clivar o DNA do esperma de salmão, conforme evidenciado pela perda do sinal de DAPI no sobrenadante. Surpreendentemente, uma porção da endonuclease ligou-se ao DNA firmemente sem clivá-lo, retendo o sinal de fluorescência de DAPI nos esporos, mesmo após a lavagem dos esporos para remover o DNA excedente. Isso demonstra que nem todo o DNA foi processado e que as nucleases expressas do lado de fora do esporo podem se ligar ao DNA firmemente. Para aumentar esse efeito, uma nuclease com um local ativo desativado poderia ser usada na proteína de fusão, o que levaria a uma menor clivagem do DNA e uma ligação ainda maior de DNA nos esporos.
EXEMPLO 43. A UTILIZAÇÃO AGRÍCOLA DE ESPOROS QUE EXPRESSAM AS PROTEÍNAS DE FUSÃO CONTENDO PROTEÍNAS OU PEPTÍDEOS LIGAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO
[001064] A família Bacillus cereus recombinante ou os membros de bactérias formadoras de esporos recombinantes que expressam prote-ínas de fusão compreendendo proteínas de ligação de ácido nucleico ou peptídeos podem ser usados na agricultura para administrar ácidos nucleicos a um meio de cultivo de vegetais (por exemplo, ao solo) e/ou aos vegetais. Por exemplo, os membros da família Bacillus cereus recombinante ou as bactérias formadoras de esporos recombinantes po-dem ser administradas aos vegetais através de um tratamento com sementes, em tratamento com irritação de solo/sulco ou em tratamento foliar. Além disso, as proteínas de fusão compreendendo proteínas ou peptídeos de ligação de ácido nucleico podem ser expressas em qual-quer um dos membros da família Bacillus cereus ou qualquer outra espécie endofítica de Bacillus descrita aqui, permitindo a administração de ácidos nucleicos ligados às proteínas de ligação de ácido nucleico internamente à planta, onde elas seriam mais efetivas para atingir suas células alvo. Por exemplo, as proteínas de fusão compreendendo proteínas de ligação de ácido nucleico podem ser expressas no membro da família Bacillus cereus EE349 de cepa endofítica. A expressão de uma outra proteína de fusão (compreendendo endoglucanase como proteína de interesse) na presente cepa é descrita no Exemplo 51 a seguir, demonstrando que as proteínas de fusão expressas nessa cepa endofítica são administradas aos vegetais internamente. Assim, a expressão das proteínas de fusão compreendendo SASPα, SASPY, HFQ ou uma nuclease que possui um local ativo desativado nas cepas do membro da família Bacillus cereus EE349, como o membro da família Bacillus cereus EE349, podem agir como meio de administração interna do RNA ou DNA (por exemplo, rnAi ou rDNA) ao vegetal. Outras proteínas ou peptídeos de ligação de ácido nucleico de ligação não específica também podem ser usados nas pro-teínas de fusão para essa finalidade.
EXEMPLO 44. PREPARAÇÃO DE ESPOROS DE BEMD QUE EXPRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUNÇÃO E TAMBÉM SUPER-EXPRESSAM UMA PROTEÍNA QUE MODULA A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO.
[001065] A super-expressão de várias proteínas do exosporium (aqui referidas como "proteínas moduladoras") em um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressam qualquer uma das prote-ínas de fusão descritas aqui pode modular (aumentar ou reduzir) o nível de expressão da proteína de fusão. Essas proteínas moduladoras incluem ExsY, ExsFA/BxpB, CotY, CotO, ExsFB, InhA1, InhA2, ExsJ, ExsH, YjcA, YjcB, BclC, AcpC, InhA3, alanina racemase 1, alanina ra-cemase 2, BclA, BclB, BxpB, BclE, BetA/BAS3290, CotE, ExsA, ExsK, ExsB, YabG, Tgl, superóxido dismutase 1 (SODA1) e superóxido dis-mutase 2 (SODA2).
[001066] A capacidade de controlar o nível de expressão da proteína de fusão permite o controle da quantidade de proteína ou peptídeo de interesse da proteína de fusão que é apresentado na parte externa do esporo do membro da família Bacillus cereus recombinante. Por exemplo, quando a proteína ou peptídeo de interesse da proteína de fusão compreende uma proteína ou um peptídeo estimulante de crescimento vegetal (por exemplo, uma enzima que degrada ou altera uma fonte bacteriana, fúngica ou de nutrientes vegetais), o membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa a proteína de fusão produz um esporo que, quando aplicado a uma semente, um vegetal ou um meio de cultivo de vegetais, tem um efeito benéfico sobre o vegetal em função da ação da proteína ou do peptídeo estimulante de crescimento vegetal. A modulação do nível de expressão da proteína da fusão resulta na modulação do nível do peptídeo ou da proteína de interesse que é mostrado(a) na parte externa do esporo do membro da família Bacillus cereus recombinante. Em alguns casos, aumentar o nível de expressão da proteína de fusão seria benéfico (por exemplo, quando pretende-se aumentar a expressão de uma enzima e, assim, aumentar a quantidade de enzima por esporo que pode ser administrada a um vegetal). Em outros casos, diminuir o nível de expressão da proteína de fusão seria benéfico (por exemplo, quando pretende-se reduzir a expressão de uma proteína e, assim, reduzir a quantidade de proteína por esporo que é administrada a um vegetal, por exemplo, quando os níveis elevados da proteína teriam efeitos determinantes sobre o vegetal).
[001067] Para gerar os plasmídeos de expressão de proteínas de fusão nos membros da família Bacillus cereus, foram gerados fragmentos de PCR contendo o promotor de BclA (SEQ ID NO: 85), o códon de partida e os aminoácidos de 20-35 de BclA fundidos na estrutura da endoglucanase do Bacillus subtilis 168 ou do gene da βgalactossidase do E. coli DH5α. Esses fragmentos de PCR foram digeridos com Xhol e ligados ao local de Sall do PLASMÍdeo pSUPER para gerar os pLASMÍDeos pSUPER-BclA 20-35-endoglUCANASe e pSUPER-BclA 20-35-βgal, respectivamente. O PLASMÍdeo pSUPER foi gerado através da fusão do PLAsmídeo pUC57 (que contém uma cassete de resistência à ampicilina) com o PLAsmídeo pBC16-1 de Bacillus (contendo uma resistência à tetraciclina). Esse plasmídeo de 5,5 Kpb pode se replicar em E. coli e Bacillus spp.
[001068] Os pLASMÍDeos pSUPER-BclA 20-35-endoglUCANASe e pSUPER-BclA 20-35-βgal foram transformados e propagados em ce-pasE. coli negativas para dam metilase. As sequências dos pLASMÍDeos pSUPER-BclA 20-35-endoglUCANASe e pSUPER-BclA 20-35βgal foram verificados por sequenciamento de DNA.
[001069] Os plasmídeos 20-35-Bgal pSUPER-BclA 20-35endoglUCANASe e pSUPER-BclA 20-35 foram transformados nos Ba-cillus thuringiensis BT013A de cepas hospedeiRAS (Para pSUPERBclA 20-35-Endo) ou Bacillus mycoidES bt155 (pSUPER-BclA 20-35βgal). Essas cepas transformadas expressaram a enzima βgalactosidase ou a enzima endoglucanase do lado de fora do esporo.
[001070] Para gerar plasmídeos para a super-expressão de proteínas moduladoras, os fragmentos de PCR contendo as regiões promotoras nativas para e genes que codificam ExsFA/BxpB, Coto, ExsFB, YjcB, BCLC, CCCC, BclA, BclB, BxpB e CotE foram gerados, digeridos com Sall e ligados ao PLAsmídeo pHP13. As sequências de nucleotídeos para as regiões promotoras nativas são fornecidas acima, na Tabela 3. O PLAsmídeo pHP13 é um plasmídeo de múltiplas cópias e, portanto, resulta em elevados níveis de expressão das proteínas codificadas moduladoras quando os plasmídeos são transformados em uma célula hospedeira do membro da família Bacillus cereus. Os pLASmídeos pHP13 contendo as regiões promotoras e genes que codificam ExsFA/BxpB, Coto, ExsFB, YjcB, BCLC, CCCC, BclA, BclB, BxpB, BclE, Beta/BAS3290 e CotE são aqui referIDOs como pHP13ExSfa/BxpB, pHP13 -CotO, pHP13-ExsFB, pHp13-YjcB, pHp13-BCLC, pHp13-CCCC, pHp13-BclA, pHp13-BclB, pHP13-BxpB e pHP13-CotE, respectivamente.
[001071] Os pLASmídeos pHP13 contendo as regiões promotoras e os genes que codificam as proteínas moduladoras foram transformados e propagadas em cepas de E. coli. As sequências desses plasmídeos foram verificadas por sequenciação de DNA.
[001072] Os pLASmídeos pHP13 que codificam as proteínas moduladores foram transformados em Bacillus thuringiensis BT013A CON-TEndo pSUPER-BclA 20-35-endoglucanase ou Bacillus mycoides BT155 CONTEndo pSUPER-BclA 20-35-βgal. As bactérias recombinantes resultantes foram plaqueadas em placas de ágar de nutriente contendo 10 μg/ml de cloranfenicol para selecionar os pLASmídeos pHP13 e 10 μg/ml de tetraciclina para selecionar os pLASMÍDeos pSUPER. As bactérias que contêm ambos os plasmídeos foram então cultivados em caldo de infusão de cérebro e coração durante uma noite com tetraciclina e cloranfenicol. Os cultivos durante uma noite foram então raspados em ágar de nutriente e as bactérias foral deixadas para esporular a 30 °C durante 72 horas. Após 72 horas, os esporos bacterianos foram coletados da placa esfregando-se em PBS estéril e foram purificados por centrifugação de densidade por três vezes. Os esporos puros foram então diluídos a 1x108 CFU/ml e testados quanto à atividade da enzima utilizando-os em uma população de 1x108 unidades formadoras de colônias (UFC).
EXEMPLO 45. A EXPRESSÃO AUMENTADA OU REDUZIDA DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO NO SISTEMA DE BEMD PELA SUPEREXPRESSÃO DE UMA PROTEÍNA QUE MODULA A EXPRESSÃO DO CONSTRUTO DE FUSÃO.
[001073] Os esporos do Bacillus mycoides EE155 recombinante gerados conforme descreve-se acima, no exemplo imediatamente anterior, foram avaliados quanto à atividade da β-galactosidase e os esporos Bacillus thuringiensis BT013A gerados conforme descrito acima, no exemplo imediatamente anterior, foram avaliados quanto à atividade de endoglucanase.
[001074] A atividade da β-galactosidase foi avaliada medindo-se a hidrólise do substrato cromogênico orto-nitrofenil-β-galact0sido (ONPG). Uma fonte comercial de β-galactosidase foi utilizada para preparar os padrões (0,2 μg, 0,4 μg e 0,8 μg de uma matéria-prima DE 100 μg/mL). 250 μl da preparação dos esporos foram sedimentados e os esporos foram ressuspenSOs em 50 μL de tampão de diluição da eNZima (10 MM TRIS, pH 7,6, 0,2 M NaCl2, 5% de glicerol). 600 μl de uma mistura de substrato pré-aquecida a 37°C (10 Mm KCl, 1 mM de MgSO4^7 h2O, 100 mM de naH2PO4, pH 7,5) contendO 1,14 mg/mL ONPG foi adicionado a cada amostra e padrão. Cada reação foi incu-badaà temperatura ambiente durante 2 minutos. 250 μl de carbonato de sódio de 1M foram adicionados para interromper a reação. A solução foi centrifugada durante 5 min a 14.000 x g para remover os esporos a partir da leitura da absorvância. A absorvância foi determinada a 420 nm usando um modelo nanospectrofotômetro IMPLEMEN modelo P330. As amostras foram realizadas em triplicado com um branco para cada reação. Os resultados desse ensaio são apresentados a seguir, na Tabela 49. TABELA49. EFEITOS DA SUPER-EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DO EXOSPORIUM SOBRE OS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE BCLA 20-35-BGAL.
[001075] Como pode ser visto a partir dos resultados mostrados na Tabela 49, a super-expressão de CotO, CotE, BclA, BclB e BxpB au-mentou a expressão da proteína de fusão contendo β-galactosidase, resultando em um aumento na atividade da enzima sobre os esporos. Em contraste, a super-expressão de YjcB ou CCCC diminuiu a expressão da proteína de fusão contendo β-galactosidase, resultando na diminuição da atividade da enzima sobre os esporos.
[001076] O ensaio para a atividade da endoglucanase foi realizada pela determinação da atividade de celulase utilizando um substrato de carboximetilcelulose (CMC) e um ácido dinitrossalicílico (reagente de DNS). Uma fonte comercial de enzima de celulase foi utilizada para preparar os padrões em tampão de citRAto A 50 mM, pH 4,8. 1% de CMC (sal de carboximetilcelulose de sódio) foi preparado em tampão de citRAto A 50 mM, pH 4,8 para servir como substrato para a reação. 250 μl da preparação de esporos foram sedimentados e os esporos foram ressuspensOS em 150 ML de 50 mM de tampão dE citado, pH 4,8. A reação foi levada a cabo com um reagente constituído por 1% de DNS, 1% de NaOH, 0,05% de Na2SO4, 0,2% de fenol e 18,2% de sais de Rochelle. 150 μl da amostra foram misturados com 250 μl do substrato a 1% de CMC e incubados em um banho d'água em 50°C por 15 minutos. 300 μl do reagente de DNS foram adicionados e as amostras foram fervidas a 100°C durante 10 minutos e depois arrefecidas no gelo. A solução foi centrifugada durante 5 minutos a 14.000 x g para remover os esporos a partir da leitura da absorvância. A absorvância foi determinada a 540 nm utilizando um modelo de nanoespectrofotômetro IMPLEN P330. As amostras foram realizadas em triplicado com um branco para cada reação. Os resultados desse teste são mostrados abaixo, na Tabela 50. TABELA 50.
[001077] Como mostrado na Tabela 50, a super-expressão de CotO, CotE, BclB e BxpB aumentou a expressão da proteína de fusão contendo endoglucanase, resultando em um aumento da atividade da enzima sobre os esporos. A super-expressão de YjcB, CCCC ou BCLC, por outro lado, reduziu a expressão da proteína de fusão, resultando em uma menor atividade da enzima sobre os esporos.
[001078] Em suma, a super-expressão de CotO, CotE, BclB ou BxpB aumentou a expressão de ambas as proteínas de fusão, resultando em uma menor atividade da β-galactosidase e da endogloconase em esporos que expressam as proteínas de fusão de BclA 20-35-βgal ou BclA 20-35-endoglucanase, respectivamente. A super-expressão de YjcB ou CCCC, por outro lado, reduziu a expressão de ambas as proteínas de fusão, resultando em uma menor atividade de βgalactosidase e endogloconase sobre os esporos que expressam as proteínas de fusão de BclA 20-35-βgal ou BclA 20-35-endoglucanase, respectivamente. A super-expRESSão de eGFP marcado com BclC e BclA20-35 também reduziram a expressão da proteína de fusão de BclC 20-35-endoglucanase, enquanto que a super-expressão de BclA aumentou a expressão da proteína de fusão de BclA 20-35-βgal.
EXEMPLO 46. EFEITOS DOS ESPOROS DE BEMD QUE EXPRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO E QUE SUPER-EXPRESSAM UMA PROTEÍNA MODULADORA SOBRE O CRESCIMENTO DO MILHO
[001079] A aplicação dos esporos de Bacillus thuringiensis BT103A e Bacillus mycoides BT155 que expressam uma proteína de fusão que compreende a endoglucanase do Bacillus subtilis 168 para o milho re-sulta em um maior vigor da muda e em uma maior resposta de cresci-mento ao longo de duas semanas. As alternâncias no nível da proteína de fusão compreendendo endoglucanase induzido pela superexpressão de uma proteína moduladora nesses esporos, conforme descreve-se acima, no exemplo imediatamente anterior, resultam em alternâncias correspondentes nos efeitos dos esporos de BEMD sobre o crescimento do milho.
[001080] Para demonstRAR ISso, pSUPER-BclA 20-35EndoglUCAnase e pHP13-cotO ou pHP13-BclB foram coexpressos no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos foram criados em ágar de nutriente, como descrito acima, no Exemplo 40. Os esporos foram diluídos a uma concentração de 1x104 esporos/50 ml de água e 50 ml de água foram adicionados a sementes comerciais de milho híbrido na terra dos vasos em plantio. A variedade de milho híbrido foi BECK 5540RR, que contém o gene de resistência a glifosato Roundup Ready. As sementes de milho foram revestidas com um fungicida e um inoculante biológico.
[001081] Os vegetais foram cultivados sob luz artificial por 14 horas por dia e os vegetais cultivados por um período de dez dias foram de-terminados. Os vegetais foram regados de três em três dias durante o período do experimento. Após dez dias, os vegetais foram medidos quanto à altura e normalizados em comparação à altura das plantações de milho não tratadas. Os resultados desses experimentos são mostrados na Tabela 51, abaixo. TABELA 51 EFEITOS DOS ESPOROS DE BEMD QUE EXPRESSAM UMA PRO-TEÍNA DE FUSÃO QUE COMPREENDE UMA ENDOGLUCANASE E QUE SUPEREXPRESSAM UMA PROTEÍNA MODULADORA SOBRE O CRESCIMENTO DO MI-LHO HÍBRIDO
[001082] Como mostrado na Tabela 51, a super-expressão das proteínas do exosporium CotO e BclB aumentou os efeitos da proteína de fusão 20-35-endoglucanase BclA sobre o crescimento das mudas de milho e sobre o vigor em 10 dias. Esses efeitos se correlacionam com os níveis da proteína de fusão nos esporos de BEMD expressando BclA 20-35-endoglUCAnase e pHP13-coto ou pHP13-BclB, indicando que os efeitos no crescimento das mudas e no vigor são atribuíveis à alteração dos níveis de expressão de proteína de fusão por parte das proteínas moduladoras
EXEMPLO 47. A INATIVAÇÃO GENÉTICA DOS MEMBROS DA FAMÍLIA BACI-LLUSCEREUS E O USO DESSES MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS DESATIVADOS PARA A EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO.
[001083] Como descrito acima, a super-expressão da protease de esporos de germinação (GPR) em sua forma ativa no esporo frontal de um membro da família Bacillus cereus durante os resultados de esporulação na clivagem proteolítica de proteínas no esporo frontal e da desativação do esporo. Da mesma forma, a super-expressão de uma endonuclease não específica no esporo frontal durante a esporulação destrói o DNA no esporo, levando a uma partícula desativada do esporo em um percentual da população de esporos.
[001084] Um plasmídeo que codifica uma endonuclease não específica sob o controle de um promotor de sigma G foi gerado. A endonuclease não específica de um Bacillus subtilis 168 e um promotor de sigma G (SEQ ID NO: 235) passaram por síntese genética e ligados no PLAsmídeo pHP13 usando o local Sall para gerar o PLAsmídeo pHP13-sigg-nuclease. Os clones corretos foram sequenciados e transformados e propagadas em células de E. coli. O DNA do plasmídeo foi isolado das células de E. coli e transformado em células de Bacillus thuringiensis BT013A. Os clones corretos foram verificados por PCR. A sequência de aminoácidos da endonuclease 1 do Bacillus subtilis 168 é fornecida acima, na Tabela 4.
[001085] As células do Bacillus thuringiensis BT013A que expressam a endonuclease de sigma G foram criadas e purificadas em placas de ágar de nutriente, como descrito acima, no Exemplo 40. Os esporos foram quantificados visualmente usando um hemocitômetro, diluídos e plaqueados por diluição em placas de ágar de nutriente. A proporção de esporos vivos por esporos mortos foi calculada pela determinação da alteração na contagem visual para contagens de placas. Os esporos de controle (não tratados) foram incluídos em cada ensaio. Além disso, 1x108 esporos receberam radiação UV por 10 minutos utilizando uma lâmpada de UV de mão, e o ensaio foi repetido. A contagem visual e a contagem de plaquetas foram comparadas novamente para avaliar a eliminação de esporos. Os resultados desses ensaios são apresentados na Tabela 52, abaixo. TABELA 52. A VIABILIDADE DOS ESPOROS DO MEMBRO DA FAMÍLIA BACI-LLUSCEREUS QUE EXPRESSAM UMA NUNCLEASE NÃO ESPECÍFICA SOB O CONTROLE DE UM PROMOTOR DE SIGMA G
[001086] Como pode ser visto na Tabela 52, a expressão de endo-nuclease 1 sob controle de um promotor de sigma G reduziu a viabilidade celular em cerca de 30% em esporos que não foram expostos à radiação UV e cerca de 75% em esporos que foram expostas à radiação UV.
[001087] Esperava-se que a co-expressão de uma protease de esporos por germinação e uma endonuclease não específica sob o controle dos promotores de sigma G reduzisse a viabilidade de esporos.
EXEMPLO 48. PREPARAÇÃO DE FRAGMENTOS DE EXOSPORIUM DE MEM-BROS DA FAMÍLIA DO BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE COMPREENDENDO UM NOCAUTE DO GENE COTE.
[001088] Foi construído um plasmídeo pUCpE que continha o esqUELeto de pUC19, que é capaz de se replicar em E. coli, bem como a origem do cassete de resistência à eritromicina de replICação de pE194. Esse construto é capaz de se replicar em E. coli e em Bacillus spp. Uma região de DNA de 1 kb correspondente à região à montante do gene CotE e uma região de 1 kb correspondente à região à jusante do gene CotE foram ampliadas por PCR a partir do Bacillus anthracis ΔSterne. As duas regiões de 1 kb foram então unidas utilizando splicing por sobreposição de extensão através de 15 pb de saliências homólogas que correspondiam aos amplicons de PCR opostos. Esse fragmento de 2 kb foi digerido com XhoI (em iniciadores externos) e foi ligado ao local de Sall de pUCpE. Esse construto de plasmídeo foi verificado através de digestão e pelo sequenciamento de DNA. Um gene de resistência à canamicina ômega Gram-positivo foi digerido com BamHI e colocado entre as duas regiões 1-kb. A construção final foi verificada novamente por PCR e sequenciada, e o plasmídeo final foi introduzida no Bacillus anthracis DSterne. Os clones corretos foram rastreados procurando-se pela resistência À eritromicina e à canamicina.
[001089] Os clones foram passados sob condições de temperatura elevada (40 ° C) em caldo de infusão de cérebro e coração na presença de canamicina (25 μg/ml) e foram rotineiramente selecionados para isolamento em placas de ágar de LB contendo canamicina a 5 μg/ml e cultivados a 30 °C. Os clones que mantiveram a resistência à canamicina mas perderam a resistência à eritromicina (implicando a perda do plasmídeo, mas a recombinação e a remoção do gene CotE) foram cultivados em caldo de infusão de cérebro e coração mais canamicina, e o DNA cromossômico foi isolado utilizando um kit Qiagen de isolamento de DNA cromossômico. A eliminação adequada do gene CotE foi determinada por ampliação por PCR da região do gene CotE e pela perda de CotE, e pelo ganho do cassete de resistência à canamicina.
[001090] Foi gerado um cONStruto (pHP13-CCCC-EGFP) que codificou a proteína do exosporium ApcC (fosfatase ácida) fundida na estrutura com a proteína repórter fluOREScente eGFP (proteína reforçada fluorescente verde). O CONstruto php13-APCC-eGFP incluiu o promotor nativo de ApcC, o local de ligação ribossômica e a sequência de códigos para ApcC (do B. anthracis DSterne), fundida na estRUTUra ao eGFP (de pGFPuv). Esse construto foi gerado por ampliação por PCR dos genes individuaIS acpC e eGFP com iniciadores correspondentes contendo uma região de sobreposição de 15 bp correspondente aos amplicons alternativos. Os dois amplicons de PCR foram então purificados e combinados em uma segunda reação por PCR, utilizando iniciadores externos contendo locais de Xhol. Os dois amplicons iniciam um ao outro com suas extremidades compatíveis e criam amplicons de PCR de fusão, os quais foram purificados e digeridos com Xhol por 1 hora a 37 °C. O produto dividido de PCR foi clonado no local dE sall de pHP13 e os clones corretos foram verificados por sequência e transformados em E. coli SCS110. O DNA de plasmídeo subsequentemente foi isolado do E. coli e introduzido no B. anthracis □ Sterne CotE:: Kan gerado como descrito acima, que foi cultivado em caldo de infusão de cérebro-coração contendo 10 μg/ml de cloranfenicol durante a noite a 30 °C. Um mililitro desse cultivo foi inoculado em caldo de nutrientes (50 ml) em um balão de Erlenmeyer com saliências e cultivado a 30 ° C durante 3 dias. Os esporos foram coletados através de centrifugação a 10.000 X g durante 5 minutos e o sobrenadante (contendo os fragmentos quebrados de exosporium) foi filtrado através de um filtro de membrana de 100000 Da para se obterem fragmentos de exosporium purificados contendo as proteínas de fusão.
[001091] Uma micrografia de transmissão de elétrons que mostra os esporos de nocaute de CotE é apresentada na Figura 4. As setas fe-chadas indicam fragmentos de exosporium que foram separados dos esporos e a seta aberta indica um esporo do qual o exosporium foi re-movido.
[001092] A purificação dos fragmentos de exosporium foi realizada como se segue: esporos de CotE::kan foram cultivados em caldo de infusão de cérebro e coração durante uma noite a 30 °C e raspados sobre placas de ágar de nutriente e cultivados a 30 °C durante 3 dias. Após 3 dias, os esporos foram coletados por raspagem das placas com cotonetes de algodão umedecidos com PBS e ressuspeNSos em 1 mL de PBS em um tubo de microcentrífuga. Os esporos foram separados do cultivo através de centrifugação e o sobrenadante contendo os fragmentos de exosporium foram filtrados através de um filtrO de 0,22 μM para remover todos os esporos residuais. O filtrado foi então filtrado por meio de um filtro de 100 kDa para coletar os fragmentos de exosporium, mas permitir que as proteínas livres passassem através do filtro. O filtro de 100 kDa foi lavado e os fragmentos de exosporium coletados foram fervidas em um tampão de SDS durante 5 minutos e separados através de eletroforese por SDS-PAGE. A Figura 5 apresenta uma fotografia de um gel de SDS-PAGE mostrando os fragmentos de exosporium (pista 2) purificados e um padrão de marcador de proteína (pista 1). Os fragmentos de exosporium mostrados na pista 2 representam as proteínas individuais que constituem os fragmentos de exosporium. Apenas um subconjunto das bandas que normalmente seriam vistas em uma preparação de esporos de SDS-PAGE completa está visível.
[001093] Dez microlitros da preparação do fragmento de exosporium contendo a proteína de fusãO DE AcpC-eGFP foi testado quanto à ati-vidade em um ensaio de fosfataSE Contra pNPP (p-nitrofenil polifosfato). A atividade da fosfatase ácida foi detectada por espectrofotometria com base na liberação de p-nitrofenol a partir de fosfato por meio da atividade de fosfatase. Em REsumo, 1 ML de 10 mM de pNPP em tampão de FOsfato a pH 6,0 foi incubado com fragmentos de exosporium em um tubo de microcentrífuga de 1 ml e deixou-se incubar a 37 ° C durante 10 minutos. Após 10 minutos, o tubo foi centrifugado durante 1 minuto para remover o excesso de esporos e o sobrenadante foi lido em um espectrofotômetro a 420 nm para livre p-nitrofenol. Verificou-se que os fragmentos de exosporium purificados foram capazes de libertar de modo eficaz os grupos fOSFAto de pNPP, demonstrando que a ApcC estava presente nos fragmentos de exosporium. Os resultados desse ensaio são mostrados na Figura 6. Na Figura 6, "esporos de controlo de CotE" se refere apenas aos esporos de nocaute de CotE (não expressando a proteína de fUSÃO AcpC-eGFP), "cOTE AcpeGFP" se refere aos esporos de nocaute de CotE que expressam a proteína de fUSÃO AcpC-eGFP e "fragmentos de cOTe AcpC-eGFP" se refere aos fragmentos de exosporium obtidos tal como descrito acima a partir dos esporos de nocaute de CotE que expressam a proteína de fUSÃO AcpC-eGFP.
[001094] Esses resultados demonstram que as mutações que rompem o exosporium, tal como uma mutação de nocaute no gene CotE, podem ser utilizadas para gerar fragmentos de exosporium que são substancialmente livres de esporos, e demonstra que esses fragmentos de exosporium contêm proteínas de fusão que são direcionadas ao exosporium.
EXEMPLO 49. EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO RECOMBINANTES EM MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS QUE SÃO CAPAZES DE DEGRADAR HERBICIDAS E OS USOS DESSES MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS PARA ESTÍMULO DO CRESCIMENTO VEGETAL
[001095] Os membros da família Bacillus cereus recombinante que expressam proteínas de fusão podem ter efeitos potentes sobre a saúde e o crescimento do vegetal, como ilustrado, por exemplo, nos Exemplos 1-4, 7, 9, 11, 33, 36, 37 e 38, acima. As proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium aqui descritas podem ser utilizadas em inúmeras espécies e cepas diferentes na família Bacillus cereus, incluindo Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensise e Bacillus toyoiensis. Muitos membros da Bacillus cereus família são potentes degradadores de material orgânico e inorgânico no meio ambiente, e alguns membros da família Bacillus cereus têm a capacidade de degradar herbicidas. A expressão das proteínas de fusão nessas cepas seria vantajosa, visto que proporcionaria uma atividade de de gradação de herbicidas, aliviando a tensão sobre os vegetais, que pode ser causado pelo uso de herbicidas, além da capacidade de estimular o crescimento do vegetal ou conferir outros benefícios à saúde do vegetal, dependendo do peptídeo ou da proteína de interesse selecionados para inclusão na proteína de fusão.
[001096] O membro da família Bacillus cereus EE349 foi isolado, identificado e caracterizado como descrito acima, no Exemplo 25, e verificou-se ter a capacidade de estimular o crescimento dos vegetais. Essa cepa foi identificada também como com a capacidade de degradar diversos herbicidas, incluindo sulfonilureias e aril triazinas.
[001097] Para demonstrar a capacidade do membro da família Bacillus cereus EE349 de degradar herbicidas, 1x105 esporos do membro da família Bacillus cereus EE349 foram revestidos em lentilhas plantadas em solo contendo várias concentrações de sulfentrazona. As sementes foram deixadas para cultivo a 24 ° C durante 3 semanas em um ciclo de dia/noite de 13 horas, com irrigação a cada 3 dias. Após 3 semanas, os vegetais foram medidos quanto ao crescimento das raízes. Um conjunto de controle de sementes sem o membro da família Bacillus cereus EE349 foi plantado em condições idênticas.
[001098] Os resultados desse experimento podem ser vistos na Figura 7. Na Figura 7, "protegido" se refere a sementes tratadas com o membro da família Bacillus cereus EE349 e "desprotegido" se refere a sementes não tratadas. O eixo y mostra o comprimento da raiz normalizada contra um controle só de água. A Figura 7 mostra que, na medida em que a concentração do herbicida foi aumentada, a inibição do crescimento da raiz também aumentou. No entanto, a aplicação do membro da família Bacillus cereus EE349 a sementes aliviou a maior parte dessa inibição, mesmo em plena força do herbicida no solo. Assim, como pode ser visto na Figura 7, o membro da família Bacillus cereus EE349 pode atuar como um agente de segurança.
[001099] Além disso, a capacidade do membro da família Bacillus cereus EE349 de expressar proteínas de fusão é demonstrada no Exemplo 51, abaixo. Portanto, o membro da família Bacillus cereus EE349 pode ser usado como um agente de segurança duplo e hospedeiro para expressão das proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium ou um fragmento da proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium.
EXEMPLO 50. PREPARAÇÃO DOS MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE QUE SUPEREXPRESSAM ENZIMAS DE EXOSPORIUM E OS EFEITOS DESSES MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE SOBRE OS VEGETAIS
[001100] Os exosporiums dos membros da família Bacillus cereus naturalmente contêm várias enzimas naturais que podem ter efeitos benéficos sobre os vegetais. Por exemplo, os exosporiums dos membros da família Bacillus cereus contêm enzimas envolvidas na solubilização de nutrientes (por exemplo, fosfatases ácidas, como AcpC), inosina uridina hidrolases, proteases (por exemplo, metaloproteases, como InhA1, InhA2 e InhA3), enzimas que catalisam a degradação de radicais livres (por exemplo, superóxido dismutase, como SODA1 e SODA2), arginases e alanina racemases. A super-expressão dessas enzimas em membros da família Bacillus cereus pode proporcionar membros da família Bacillus cereus recombinante que terão efeitos benéficos quando aplicados às sementes, vegetais, um meio de crescimento de vegetais ou uma área em torno de um vegetal ou semente de vegetal.
[001101] As metaloproteases InhA2 e InhA3, a fosfatase ácida (AcpC) e o superóxido dismutase 1 e 2 foram ampliados por PCR com os seus promotores nativos com iniciadores que continham locais de XhoI (as sequências de aminoácidos para InhA2, InhA3, CCCC, SODA1 e SODA 2 são fornecidas acima, nas Tabelas 1 e 2, e as sequências de nucleotídeos para os promotores nativos dessas proteínas são fornecidas acima, na Tabela 3). Os produtos de PCR foram digeridos com XhoI e clonado no E. coli/Bacillus do vetor tranSPOrtador pHP13 através do seu local de Sall. Os clones corretos foram verificados por PCR e por sequenciamento de DNA. Os plasmídeos foram introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A e Bacillus mycoides EE155. Os clones corretos foram rastreados por plaqueamento em placas de ágar de LB contendo cloranfenicol. Os cultivos durante uma noite dos clones corretos foram cultivados em caldo de infusão de cérebro e coração contendo cloranfenicol e 1 ml desse cultivo durante uma noite foi inoculado em 50 ml de caldo de nutrientes e cultivado durante 3 dias a 30 °C. A esporulação foi verificada através de microscopia de luz. Os esporos foram então submetidos a ensaios enzimáticos.
[001102] Os esporos do Bacillus mycoides EE155 super-expressam AcpC (isto é, esporos contendo o PLAsmídeo pHP13-AcpC (fosfatase ácida)) foram avaliados quanto à atividade da fosfatase. Um mililitro do cultivo de esporulação foi peletizado e o pelete foi ressuspenso em 1 ml de PBS e testado quanto à atividade em um ensaio de fosfataSE Contra pNPP (polifosfato de p-nitrofenil) como descrito acima, no Exemplo 48. Os esporos que super-expressam AcpC tiveram uma atividade de fosfatase muito maior, como ilustrado na Figura 8. Na Figura 8, o eixo Y mostra as unidades de atividade de fosfatase, indicados pela liberação de p-nitrofenol.
[001103] O aumento da atividade da fosfatase ácida observado para os esporos do Bacillus mycoides EE155 modificados para superexpressar EE155 pode solubilizar nutrientes do ambiente após a adição desses esporos a um meio de cultivo do vegetal ou a aplicação desses esporos a uma semente de vegetal, a um vegetal ou a uma área ao redor do vegetal ou de uma semente de vegetal. Visto que o fosfato é um nutriente muito importante para o cultivo e desenvolvimento de vegetais, isso pode aumentar o crescimento de vegetais e proporcionais efeitos benéficos sobre a saúde do vegetal.
[001104] Da mesma forma, o superóxido dismutase é uma proteína antioxidante muito poderosa. A super-expressão de uma superóxido dismutase em um membro da família Bacillus cereus geraria esporos com a capacidade de degradar radicais livres, que exerceria pressão sobre as plantas. A remoção dos radicais livres aliviaria parte dessa tensão e levaria a um maior vigor do vegetal sob condições de tensão. Os esporos de Bacillus thuringiensis BT013A super-expressam SODA1 e SODA2 (isto é, esporos transformados com os pLASmídeos pHP13-sODA1 e pHP13-SODA2, respectivamente) podem estar sujeitos a uma análise enzimática. Um mililitro do cultivo de esporulação pode ser peletizado e o pelete ressuspenso eM 1 ml de dH2 O contendo xantina. A xantina oxidase pode ser adicionada posteriormente à mistura de reação, assim como o citocromo C. A inibição da degradação do citocromo C nesse ensaio indica a atividade da superóxido dismutase.
[001105] Os esporos do Bacillus mycoides EE155 que superexpressam uma metaloprotease de zinco (ou seja, esporos transformados pelo PLAsmídeo pHP13-InhA2) foram submetidos a análise enzimática. Um mililitro do cultivo de esporulação foi peletizado e o pelete foi ressuspenso em 1 ml de PBS. Os esporos foram então reagidos com 0,5% de azocaseína, um substrato de protease, durante 5 minutos. Essas misturas de reação foram precipitadas com TCA (ácido tricloroacético) para remover a caseína não digerida e a absorvância do corante azo livre remanescente foi lido a ABS595. Os esporos com superexpressão de InhA2 geraram 211% a mais de atividade de protease em comparação com os esporos do Bacillus mycoides EE155 não recombinantes.
[001106] Os exemplos 3 e 7, acima, ilustram que a expressão de uma protease no exosporium de um membro da família Bacillus cereus pode proporcionar efeitos benéficos sobre os vegetais. Os esporos do Bacillus thuringiensis BT013A InhA1, InhA2 ou InhA3 teriam efeitos semelhantes sobre a introdução em um meio de cultivo de vegetais ou a aplicação a sementes, vegetais ou a uma área ao redor do vegetal ou da semente do vegetal.
EXEMPLO 51. A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO EM UMA CEPA DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUSENDOFÍTICA
[001107] Verificou-se que o membro da família Bacillus cereus EE349 tem a capacidade de crescer endofiticamente e de servir como cepa hospedeira para o sistema de BEMD. Para demonstrar a capacidade do membro da família Bacillus cereus EE349 de crescer endofiticamente e servir como uma cepa hospedeira para o sistema BEMD, o membro da família Bacillus cereus EE349 foi transformado pelo plasmÍDEO bclA pSUPER-20-35-endoglucanase (descrito acima, no Exemplo 44). Os esporos foram feitos e purificados como descrito acima, no Exemplo 40.
[001108] Esses esporos foram diluídos a uma concentração de 1x105 esporos/50 ml de água e 50 ml de água foram então adicionados a sementes comerciais de milho híbrido na terra dos vasos em plantio. As sementes de milho foram revestidas com um fungicida e um inoculante biológico. A variedade de milho híbrido foi BECK 5475RR, que contém o gene de resistência a glifosato ROUNDUP READY e o gene de resistência a seca AQUAMAX. Os vegetais foram cultivados sob luz artificial por 14 horas por dia e os vegetais cultivados por um período de dez dias foram determinados. Os vegetais foram regados de três em três dias durante o período do experimento. Após dez dias, os vegetais foram medidos quanto à altura e normalizados em comparação à altura das plantações de milho não tratadas. Os resultados desses experimentos são mostrados na Tabela 53. TABELA 53. OS EFEITOS DE UM MEMBRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS QUE EXPRESSA A PROTEÍNA DE FUSÃO DE 20-35-ENDOGLUCANASE BCLA NO CULTIVO DE PLANTAÇÕES DE MILHO
[001109] Como pode ser visto a partir dos dados mostrados na Tabela 53, a expRESSÃO de pSUPER-BclA 20-35-endoglucanase no membro da família Bacillus cereus de cepa endofítica EE349 resultou em um aumento do crescimento do milho em comparação com as plantas não tratadas ou tratadas apenas com o membro da família Bacillus cereus EE349.
[001110] O membro da família Bacillus cereus 349 que expressa BclA 20-35-endoglucanase foi então isolado do interior das plantações de milho. Os vegetais de dez dias foram extraídos do solo e lavados para remover os detritos excedentes. Os vegetais foram então invertidos, expostos a 5% de lixívia durante dez minutos, lavados em água, expostos a peróxido de hidrogênio (10%) durante dez minutos, lavados novamente com água e os talos foram divididos com uma lâmina de barbear estéril. As metades da divisão dos caules foram colocadas de cabeça para baixo nas placas de ágar de nutrientes por duas horas. Depois de duas horas, os caules foram removidos e as placas de ágar incubadas a 30 ° C durante 48 horas. Após 48 horas, as placas foram examinadas quanto à morfologia das colônias e as colônias de membros da família Bacillus cereus encontradas no interior do vegetal foram enxertadas no ágar de nutrientes mais placas de tetraciclina (para selecionar as bactérias contendo o plaSMÍDEO de pSUPER-20-35 BclA-endoglucanase). O aumento resultante nos números de colônias de membros da família Bacillus cereus 349 é indicado na Tabela 54. Esses resultados demonstram a capacidade do sistema de BEMD de ser introduzido no vegetal alvo por expressão de uma cepa endofítica da família Bacillus cereus. TABELA 54: ENSAIO ENDOFÍTICO NO MEMBRO DA FAMÍLIA BACILLUS CE-REUS EE349
[001111] Os clones de Bacillus resistente à tetraciclina foram cultivados durante uma noite a 30 ° C em caldo de infusão de cérebro e coração mais tetraciclina e centrifugados a 10000 xg durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e o pelete foi congelado durante uma noite a -20 °C. O DNA cromossômico foi extraído de cada clone e a presença do plaSMÍDEO de pSUPER-20-35 BclA-endoglucanase foi determinada pela transformação do DNA cromossômico (contendo o plasmídeo) em células DH5α de E. coli células e pelo plaqueamento em placas de LB mais ampicilina. Os clones corretos foram submetidos a análise sequencial de DNA, que verificou que o membro da família Bacillus cereus 349 era interno em relação ao vegetal (endofítico) e continha o plasmídeo.
[001112] Muitas bactérias endofíticas foram encontradas nas mudas de milho, com uma série de cepas e espécies diferentes na família Bacillus cereus encontradas no interior dos vegetais de controle e daqueles tratados com EE349. Os membros da família Bacillus cereusresistentesà tetraciclina (que indicam a presença do PLASMÍdeo pSUPER20-35 BclA-endoglucanase) só foram encontrados nas mudas de milho tratadas, e todos tinham a mesma morfologia da colônia do hospedeiro de expressão original, os membros da família Bacillus cereus EE349. A presença do PLASMÍdeo pSUPER 20-35 BclA-endoglucanase foi verificada por meio de ampliação por PCR utilizando iniciadores únicos.
EXEMPLO 52. O ISOLAMENTO, A IDENTIFICAÇÃO E A CARACTERIZAÇÃO DAS CEPAS BACTERIANAS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS
[001113] Além do membro da família Bacillus cereus da cepa endofítica 349 discutido acima, no exemplo imediatamente anterior, vários outros membros da família Bacillus cereus que têm a capacidade de crescer endofiticamente também foram identificados: Bacillus cereus membro da família EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EEB00184, Bacillus mycoides EE-B00363, Bacillus pseudomycoides EEB00366 e Bacillus cereus EE-B00377.
[001114] Para obter esses membros da família Bacillus cereus adicionais, sementes de milho híbrido comerciais foram plantadas em solo de envasamento e deixadas para crescer. As sementes de milho foram revestidas com um fungicida e um inoculante biológico. Os vegetais foram cultivados sob luz artificial por 14 horas por dia e os vegetais cultivados por um período de dez dias foram determinados. Os vegetais foram regados de três em três dias durante o período do experimento. Após 14 dias, os vegetais foram extraídos do solo e lavados para remover os detritos excedentes. Os vegetais foram então invertidos, expostos a 5% de lixívia durante dez minutos, lavados em água, expostos a peróxido de hidrogênio (10%) durante dez minutos, lavados novamente com água e os talos foram divididos com uma lâmina de barbear estéril. As metades da divisão dos caules foram colocadas de cabeça para baixo nas placas de ágar de nutrientes por duas horas. Depois de duas horas, os caules foram removidos e as placas de ágar incubadas a 30 ° C durante 48 horas. Após 48 horas, as placas foram examinadas quanto à morfologia das colônias e as colônias de membros da família Bacillus cereus encontradas na parte interna do vegetal foram enxertados em ágar de nutrientes. Em seguida, eles foram cultivados durante uma noite a 30 °C em caldo de infusão de cérebro e coração e centrifugados a 10000 X g durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e o pelete foi congelado durante uma noite a -20 °C. O DNA cromossômico foi então extraído de cada clone e a identidade de cada colônia foi verificada por PCR utilizando-se os iniciADORes de rRNA 16S e os amplicons foram enviados para o sequenciamento DNA e para a identificação. As sequÊNCIas de rRNA 16S para essas cepas são fornecidas acima, na Tabela 13.
EXEMPLO 53. ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E CEPAS BACTERIANAS ENDOFÍTICAS ADICIONAIS (MEMBROS DA FAMÍLIA NÃO BACILLUS CEREUS)
[001115] As cepas bacterianas endofíticas de Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, fusiformis Lysinibacillus EE442, Lysinibacillus spp. EE443 e Bacillus pumilus EE-B00143 foram isolados das mudas de milho. Inici-almente, as mudas de milho de duas semanas foram esterilizadas. Os vegetais foram extraídos do solo e lavados para remover os detritos excedentes. Os vegetais foram então invertidos, expostos a 5% de lixívia durante dez minutos, lavados em água, expostos a peróxido de hidrogênio (10%) durante dez minutos e lavados novamente com água. Os caules foram então divididos com uma lâmina estéril. As metades da divisão dos caules foram colocadas de cabeça para baixo nas placas de ágar de nutrientes por duas horas. Depois de duas horas, os caules das plantas foram removidos das placas e as placas fo-ramentão incubadas a 30 ° C durante 48 horas. As colônias de Bacilli que fossem endofíticas foram selecionados para posterior análise. Essas cepas foram cultivadas em caldo de infusão de cérebro e coração durante uma noite a 30 °C e os cultivos foram submetidos à extração de DNA utilizando um kit de DNA cromossômico Qiagen. O DNA foi ampliado por PCR para obter O GEne de rRNA 16S, que foi enviado para sequenciamento de DNA. As sequências de BLAST resultantes fizeram uma busca utilizando as databases de NCBI para estabelecer a identidade das espécies de Bacilli. As sequÊNCIas de rRNA 16S são fornecidas acima, na Tabela 14.
EXEMPLO 54. EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO COMPREENDENDO UMA PROTEÍNA DE REVESTIMENTO DE ESPOROS EM CEPAS BACTERIANAS DE BACILLUS ENDOFÍTICO
[001116] As cepas bacterianas endofíticas de Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus firmus A30 e Bacillus lichenformis A4 foram transfor-madas para conter vários plasmídeos que codificam proteínas de re-vestimento de esporos fundidas à endoglucanase. Os pLASmídeos pHP13-COTC-endoglUCAnase e pHP13-CGEA-endoglucanase foram criados. Cada um desses plasmídeos codificaram a proteína de reves-timento dos esporos (CotC ou CgeA) fundida na estrutura com um ligante de polialanina contendo oito resíduos de alanina e de endoglucanase. O ligante de polialanina e a endoglucanase foram fundidos ao terminal carboxi das proteínas de revestimento de esporos.
[001117] Para criar os plasmídeos que codificam as proteínas de fusão, o gene de endoglucanase do Bacillus subtilis 168 foi ampliado por PCR. Os genes que codificam as proteínas de revestimento de esporos CotC e CgeA também foram ampliados por PCR a partir do DNA cromossômico do Bacillus subtilis 168 (CotC) ou do Bacillus amyloliquefaciens (CgeA). Os amplicons corretos foram então submetidos a uma divisão por PCR por extensão de sobreposição para gerar o DNA da proteína de fusão através do emparelhamento das saliências de 15 bp homólogas. Os iniciadores externos foram, cada um, modificados para conter os locais de XhoI. Os produtos de ampliação foram limpos com um kit de limpeza por PCR Promega e o DNA foi digerido com XhoI e foi ligado no local dE sall de pHP13. Os DNAs do plasmídeo foram então sequenciados, transformados em células de E. coli e o DNA foi inserido nas várias cepas endofíticas de Bacillus.
[001118] Os esporos de cada espécie de Bacillus recombinante que expressa as proteínas de fusão foram gerados raspando-se os cultivos de uma noite nas placas de ágar de nutrientes, que foram então incubadas a 30 °C durante 72 horas. Após 72 horas, os esporos bacterianos foram coletados das placas raspando-se em PBS estéril. Os esporos foram purificados por centrifugação de densidade três vezes, diluídos1x108 CFU/ml e avaliados quanto à atividade da endogloconase, conforme descreve-se acima, no Exemplo 45. Os resultados desse ensaio são mostrados na Tabela 55, abaixo, e na Figura 9. TABELA 55. A ATIVIDADE DA ENDOGLOCONASE NOS ESPOROS DO BACI-LLUSQUE EXPRESSÃO PROTEÍNAS DE FUSÃO COTC-ENDOGLUCANASE OU CEA-ENDOGLUCANASE
[001119] Na Figura 9, CotC1, CotC2 e CotC3 são três cultivos de es- porulação experimental separados de Bacillus thuringiensis ee319 com pHP13-COTC-Endo.
EXEMPLO 55. OS EFEITOS DOS ESPOROS DO BACILLUS QUE EXPRESSAM PROTEÍNAS DE FUSÃO COTC-ENDOGLUCANASE, COTB-ENDOGLUCANASE OU CGEA-ENDOGLUCANASE NO CRESCIMENTO DE SEMENTES DE MILHO E SOJA.
[001120] Os esporos da espécie de Bacillus recombinante que ex-pressam as proteínas de fusão que compreendem uma proteína de revestimento de esporos e endoglucanase (por exemplo, as proteínas de fusão de COTC-endoglucanase, CotB-endoglucanase ou AGECendoglucanase descritas acima, no exemplo imediatamente anterior) podem ser testados quanto aos seus efeitos sobre o crescimento dos vegetais (por exemplo, milho e soja), como se segue. Os esporos podem ser gerados como descrito acima, no exemplo imediatamente anterior, lavados, diluídos a 1x108 CFU/ml em água e aplicados a sementes de vegetais (por exemplo, sementes de soja e milho) a uma taxa de 1x105-7 esporos/semente. Os esporos podem então ser aplicados como um tratamento para sementes ou como irrigação do solo. Os vegetais podem ser plantados a 1" do solo em vasos de 4" e cultivados a 18,3 ° C com um ciclo de luz/escuridão de 13 horas. Depois de duas semanas, a altura do vegetal e o comprimento da raiz podem ser determinados.
EXEMPLO 56. ADMINISTRAÇÃO DE BACTÉRIAS PROBIÓTICAS A ANIMAIS PE-LA ADMINISTRAÇÃO DE VEGETAIS QUE COMPREENDEM ESSAS BACTÉRIAS AO ANIMAL
[001121] As bactérias probióticas podem ser administradas a animais (por exemplo, gado, peixe ou outros animais) aplicando-se as bactérias probióticas a uma semente de vegetal, a um meio de crescimento de vegetais (por exemplo, por em aplicação sulco no solo), a um vegetal (por exemplo, por aplicação foliar) ou a uma área em torno de um vegetal ou de uma semente de vegetal e, subsequentemente, adminis-trando-se esses vegetais ou vegetais cultivados a partir das sementes do vegetal ao animal. As bactérias podem ser aplicadas às folhas ou caules dos vegetais enquanto os vegetais estão em crescimento e colonizar o filoplano (a superfície das folhas e do caule). Os vegetais podem ser submetidos a um processamento em rações para o animal antes de administrá-los.
[001122] O uso de cepas de bactérias endofíticas em tais métodos permite que as bactérias sobrevivam e permaneçam no tecido do vegetal, de tal forma que elas serão ingeridas em números significativos pelo animal após a ingestão da matéria vegetal do vegetal. Por exemplo, as cepas dos membros da família Bacillus cereus EE349, Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, fusiformis Lysinibacillus EE442, Lysinibacillus spp. Acredita-se que EE443 e o Bacillus pumilus EE-B00143 sejam probióticos e endofíticos e podem ser usados nesses métodos.
[001123] Qualquer uma dessas cepas ou outras cepas probióticas e endofíticas podem ser cultivadas e os esporos gerados como descrito acima, no Exemplo 40. Os esporos podem então ser aplicado a um meio de cultivo, uma semente de vegetal, um vegetal ou uma área em volta de um vegetal ou semente de vegetal. Os vegetais cultivados no meio de cultivo de vegetais, os vegetais cultivados a partir das sementes de vegetais, os vegetais a que as bactérias foram aplicadas ou vegetais ou sementes de vegetais cultivados em uma área a que as bactérias foram aplicadas podem ser cultivados e ser subsequentemente administrados a um animal. As bactérias endofíticas podem colonizar o tecido interno do vegetal e se replicar a amplos números dentro do vegetal. As bactérias esporularão a partir do uso de métodos tradicionais de colheita, permitindo um armazenamento prolongado de matéria ve getal (por exemplo, na forma de feno ou silagem), que mais tarde pode ser administrada ao animal desejado.
[001124] Apenas uma pequena quantidade de bactérias deve ser usada nesses métodos, uma vez que as bactérias endofíticas serão naturalmente colonizadas e proliferadas nos vegetais.
EXEMPLO 57. ADMINISTRAÇÃO DE ENZIMAS BENÉFICAS POR ADMINISTRA-ÇÃO AOS ANIMAIS DE VEGETAIS QUE COMPREENDEM UM MEMBRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE OU OUTRAS BACTÉRIAS RECOMBINANTES QUE EXPRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO COMPREENDENDO A ENZIMA BENÉFICA
[001125] Os membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou um peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium que são descritos aqui também podem ser usados para administrar aos animais as enzimas benéficas. Os membros da família Bacillus cereus recombinantes podem ser administrados diretamente aos animais (por exemplo, misturando-se um membro da família Bacillus cereus recombinante em uma ração para o animal e administrando-o subsequentemente ao animal). Alternativamente, os métodos descritos acima, no exemplo imediatamente anterior, para a administração de bactérias aos animais podem ser usados juntamente com o membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou um peptídeo que têm efeitos benéficos em um animal (por exemplo, uma enzima que auxilia a digestão da matéria vegetal).
[001126] As enzimas presentes nas rações para animais, peixes e outros animais pode afetar a absorção de nutrientes, o rendimento e a saúde do animal que ingere as enzimas. As enzimas que são benéficas para a saúde dos animais incluem, por exemplo, xilanases, fitases, fosfatases, proteases, celulases, endoglucanases, glucanases, amilases, lipases, fosfolipases, glicosilases, galactanases, α-galactosidases, amilases, pectinases, biotinases e poligalacturonases, entre outras. O sistema de BEMD pode ser utilizado para expressar essas enzimas na superfície do exosporium. Os membros da família Bacillus cereus recombinante que expressam uma proteína de fusão que compreendem uma dessas enzimas podem ser aplicados a um meio de cultivo de vegetais, a uma semente de vegetal, a um vegetal ou a uma área em torno de um vegetal ou de uma semente de vegetal. De modo seme-lhante, as bactérias recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo uma dessas enzimas e uma proteína de revestimento de esporos que direciona a proteína de fusão a uma superfície de um esporo da bactéria podem ser usados nesses métodos. As bactérias recombinantes podem ser aplicadas a um meio de cultivo, uma semente de vegetal, um vegetal ou uma área em volta de um vegetal ou semente de vegetal. Os vegetais cultivados no meio de cultivo de vegetais, os vegetais cultivados a partir das sementes de vegetais, os vegetais a que as bactérias foram aplicadas ou vegetais ou sementes de vegetais cultivados em uma área a que as bactérias foram aplicadas podem ser cultivados e ser subsequentemente administrados a um animal, e a enzima benéfica pode então ser administrada ao animal. As bactérias esporularão a partir do uso de métodos tradicionais de colheita, permitindo um armazenamento prolongado de matéria vegetal (por exemplo, na forma de feno ou silagem), que mais tarde pode ser administrada ao animal desejado.
[001127] As cepas endofíticas dos membros da família Bacillus cereus podem ser usadas como hospedeiras para expressão das proteínas de fusão que compreendem uma proteína ou um peptídeo de interesse (por exemplo, uma enzima com efeitos benéficos em animais) e uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium. Por exemplo, as cepas endofíticas do membro da família Bacillus cereus EE349, Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444 e Bacillus thuringiensis EE319 aqui descrita podem ser utilizadas como hospedeiras.
[001128] Membros adicionais da família Bacillus cereus podem ser selecionados para serem aplicados às porções aéreas do vegetal, visto que essas bactérias não precisam ser endofíticas para colonizar o filoplano. Por exemplo, podem ser usados para esse fim os membros da família Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoides BT46-3, Bacillus cereus family member EE218, Bacillus thuringiensis BT013A, Bacillus thuringiensis EE-B00184, Bacillus mycoides EE-B00363, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 ou Bacillus cereus EE-B00377.
[001129] De modo semelhante, as cepas endofíticas de bactérias recombinantes podem ser usadas como hospedeiras para a expressão de proteínas de fusão que compreendem uma proteína ou um peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direciona a proteína de fusão a uma superfície de um esporo da bactéria. Por exemplo, as cepas bacterianas endofíticas do Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, fusiformis Lysinibacillus EE442, Lysinibacillus spp. EE443 ou Bacillus pumilus EE-B00143 podem ser usadas como hospedeiras.
[001130] O uso de cepas de bactérias endofíticas em tais métodos permite que as bactérias sobrevivam e permaneçam no tecido do vegetal, de tal forma que as bactérias e as proteínas de fusão expressas pelas bactérias serão ingeridas em números significativos pelo animal após a ingestão da matéria vegetal do vegetal. Assim, através de uma simples adição do membro da família Bacillus cereus recombinante ou de outras bactérias recombinantes no plantio, as enzimas benéficas podem ser espalhadas por todo o tecido do vegetal e administras aos animais após a ingestão de matéria vegetal.
EXEMPLO 58: A UTILIZAÇÃO DE VÁRIAS SEQUÊNCIAS DE DIRECIONAMENTO PARA EXPRESSAR FOSFOLIPASE, LIPASE E ENDOGLUCANASE NA SUPERFÍCIE DOS ESPOROS DO MEMBRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS E O USO DESSES ESPOROS PARA PROMOVER O CRESCIMENTO DO VEGETAL
[001131] O PLASMÍdeo pSUPER foi modificado pela clonagem de um fragmento gerado por PCR por meio de recombinação homóloga que fundiu o promotor de BclA, um códon de partida e os aminoácidos de 20-35 de BclA (aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1) em enquadramento com a endoglucanase do Bacillus subtILIS 168 (pSUPER-BclA 20-35-Endo), como descrito anteriormente, no Exemplo 44. Esses plasmídeos foram então submetidos a uma PCR inversa para ampliar todo o esqueleto do plasmídeo, mas deixado de fora a sequência que corresponde aos aminoácidos de 20-35 de BclA. Esse produto de PCR inversa foi combinado por um produto de PCR que ampliou a região equivalente de cada uma das SEQ ID NOs.: 5, 15, 25, 81, 85, 87 ou dos aminoácidos de 20-33 da SEQ ID NO: 1. Desse modo, foram criados construtos contendo cada uma das sequências de direcionamento a seguir, fundidas na estrutura com a endoglucanase do Bacillus subtilis 168: (1) aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1; (2) aminoácidos de 23-38 da SEQ ID NO: 5; (3) aminoácidos de 2843 da SEQ ID NO: 15; (4) aminoácidos de 9-24 da SEQ ID NO: 25; (5) aminoácidos de 23-38 da SEQ ID NO: 81; (6) aminoácidos de 13-28 da SEQ ID NO: 85; (7) aminoácidos de 13-28 da SEQ ID NO: 87; e (8) aminoácidos de 20-33 da SEQ ID NO: 1. Cada construto continha o promotor de BclA de tipo selvagem e uma metionina no códon de partida, seguido da sequência de direcionamento fundida na estrutura ao gene da endoglucanase do Bacillus subtilis. Cada uma desses construtos foi transformado em E. coli e plaqueado para obter colônias indi-viduais em placas de Luria mais ampicilina (100 μg/ml). Os plasmídeos de cada colônia individual foram cultivados em cultivos de uma noite em caldo de Luria mais ampicilina e purificados utilizando um kit WIZARD SV miniprep e as sequências foram verificadas por sequenciamento de Sanger O DNA também foi quantificado por meio de espectrofotometria e o DNA foi inserido no Bacillus thuringiensis BT013A. Além disso, o CONSTRuto pSUPER-BclA-20-35 Endo foi introduzido no Bacillus thuringiensis BT013A que tinha a proteína nativa BclA removida do seu genoma através de recombinação homóloga (BclA de nocaute, "BclA KO"). As colônias corretas foram selecionadas pelo plaqueamento em placas de caldo de nutrientes contendo antibiótico (tetraciclina a 10 μg/ml). Cada colônia positiva foi cultivada em caldo de infusão de cérebro e coração a 30 °C durante uma noite a 300 rpm, com antibiótico, e o DNA genômico foi purificado e re-sequenciado para verificar a pureza genética. As colônias verificadas foram cultivadas por uma noite em caldo de infusão de cérebro e coração com 10 μg/ml de tetraciclina e induzidas a esporular através de esporulação em meios à base de extrato de levedura.
[001132] Cada um dos ciclos de produção dos meios à base de extrato de levedura foi coletado a 48 horas da pós-produção de esporos e submetido a comparação enzimática dos esporos resultantes pelo uso da metodologia descrita acima, no Exemplo 45. A absorvância foi determinada a 540 nm utilizando um modelo de nanofotômetro IMPLEN P330. Havia três amostras e um branco para cada reação. Os resultados das leituras enzimáticas são apresentados na Tabela 56.
[001133] Para o milho, 1 μl de cada totalidade do caldo para cada construto foi colocado em cada semente. Para a abóbora, 2 μl da tota-lidade do caldo para cada construto foi colocado em cada semente. Para se obter isso, 50 sementes foram colocadas em um tubo de polipropileno de fundo cônico e agitadas suavemente utilizando um mistu-rador em vórtice. Para essa agitação das sementes, 50 μl (para o milho) ou 100 μl (para a abóbora) do caldo contendo os esporos recombinantes foram pipetados suavemente no tubo e a ação do vórtice revestiu as sementes com um revestimento uniforme da totalidade do caldo das células de cada construto. Essas sementes foram plantadas a 1" no solo nativo utilizando um vaso de planta de 39,6cm3 (15,6 em3), com duas sementes por vaso. Os vasos foram regados até a saturação e os vegetais foram deixados para germinar. Os vegetais foram cultivados em uma câmara de cultivo controlada, ajustada a 70 °F durante o dia e 60 °F durante a noite, com um período de luz de 14 horas/dia, sob condições de luz artificial, durante 14 dias. Após 14 dias, os vegetais foram medidos quanto à sua altura e os resultados foram normalizados a um grupo de controle que recebeu apenas água como tratamento de sementes. TABELA 56. NÍVEIS DE ENZIMAS E FENÓTIPOS DO CRESCIMENTO DO VEGE-TAL. AA = aminoácidos ND = não determinado
[001134] Os dados acima demostram que cada um desses construtos foi capaz de estimular o crescimento do vegetal e mostram que o uso de diferentes sequências de direcionamento permite o controle do nível de expressão da enzima no lado de fora do esporo.
[001135] O uso dos aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1 ou AA de 13-28 da SEQ ID NO: 85 como sequência de direcionamento resultou em níveis mais elevados de produção de enzimas. Isso é surpreendente, considerando-se o baixo grau de identidade entre essas sequências de direcionamento (43,8% de identidade ao longo de todo o comprimento da sequência de direcionamento). O uso dos aminoácidos de 28-43 da SEQ ID NO: 15 ou os aminoácidos de 9-24 da SEQ ID NO: 25 resultou na maior resposta do vegetai entre os dois tipos de vegetais. A expressão da proteína de fusão que contém os aminoácidos de 20-25 da SEQ ID NO: 1 como sequência de direcionamento no hospedeiro de nocaute da BclA BT013A levou a um aumento muito grande (263,8%) na quantidade da atividade enzimática na superfície dos esporos em comparação à expressão da mesma proteína de fusão na cepa de tipo selvagem.
EXEMPLO 59: A UTILIZAÇÃO DE VÁRIAS SEQUÊNCIAS DE DIRECIONAMENTO E DAS PROTEÍNAS DO EXOSPORIUM PARA EXPRESSAR FOSFOLIPASE, LIPASE E ENDOGLUCANASE NA SUPERFÍCIE DOS ESPOROS DO MEMBRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS E O USO DESSES ESPOROS PARA PROMOVER O CRESCI-MENTO DO VEGETAL
[001136] o PLasmídeo pSUPER foi modificado pela clonagem de um fragmento gerado por PCR (digestão e ligação de XhoI) que se fundiu ao promotor de BclA, ao códon de partida e aos aminoácidos de 20-35 da BclA (aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1), seguido de uma sequência de seis alanina em enquadramento com o gene da fosfolipase específica da fosfatidilcolina do Bacillus thuringiensIS c(pC-PLC) (pSUPER-BclA 20-35-PL) ou ums lipsdr lipA do BacilLUS SUbtilis (pSUPER-BclA-20-35-Lipase) ou a endoglucanase do Bacillus sUBTILIs eglS (pSUPER-BclA-20-35-Endo), conforme descreve-se acima, no Exemplo 44. Esses plasmídeos foram então submetidos a uma PCR inversa para ampliar todo o esqueleto do plasmídeo, mas deixado de fora a sequência que corresponde aos aminoácidos de 20-35 de BclA. Esse produto de PCR inversa foi combinado com o produto de PCR que ampliou a região equivalente de cada uma das SEQ ID NOs. 5 (isto é, os aminoácidos de 23-38 da SEQ ID NO: 5), 15 (isto é, os aminoácidos de 28-43 da SEQ ID NO: 15) e 25 (isto é, os aminoácidos de 9-24 da SEQ ID NO: 25; as proteínas do exosporium de comprimento total das SEQ ID nOs 120, 111, 121, 108 e 114; ou os aminoácidos de 20-33, 20-31, 21-33, 23-33 ou 2331 da SEQ ID NO:1. Cada um desses construtos continha o promotor da BcIA de tipo selvagem, uma metionina no códon de partida, seguida da sequência de direcionamento ou da proteína do exosporium fundida em enquadramento ao gene da fosfolipase C específica da fosfatidilcolina, da LipA da lipase do Bacillus subtilis 168 ou da endoglucanase da eglS do Bacillus subtilis 168. Cada um desses construtos foi selecionado para os transformantes corretos, como descrito acima, no Exemplo 58.
[001137] Cada um dos ciclos de produção dos meios à base de extrato de levedura foi coletado a 48 horas da pós-produção de esporos e submetido a comparação enzimática dos esporos resultantes. A de-terminação dos dados de enzimas para a endoglucanase foi realizada conforme descrito acima, no Exemplo 58. Para o ensaio enzimático da fosfolipase C, 1 ml dos esporos recombinantes foi peletizado a 10.000 x g por 3 minutos e o sobrenadante foi removido e descartado. O pelete de esporo foi então ressuspenso em μl do tampão de Reação (0,25 mM de Tris-HCL, 60% de Glicerol, 20 mM de o-nitrofenil foSForilcolina, pH 7,2). Um controle negativo para os ensaios enzimáticos continha esporos BT013A sem expressão da enzima. Cada amostra foi incubada a 37 °C durante 18 horas, centrifugada novamente para remover os esporos, diluída 1:1 em água e lida em Abs540 utilizando um espectrofotômetro. Elas foram comparadas a uma curva padrão em relação a controles de lipase e fosfolipase adquiridos comercialmente para estabelecer o U/ml de atividade. Os resultados das leituras das enzimas são mostrados nas Tabelas 57 e 58. TABELA 57. NÍVEIS ENZIMÁTICOS DA ENDOGLUCANASEAA = aminoácidos
[001138] Muitas das sequências de direcionamento e proteínas do exosporium foram capazes de exibir uma grande quantidade de enzimas ativas na superfície dos esporos, incluindo as SEQ ID NOs. 108, 111, 114, 120 e 121. Os aminoácidos de 20-31, 21-33 e 23-31 da SEQ ID NO: 1 forneceram níveis de expressão de enzimas similares aos dos aminoácidos da SEQ ID NO: 1, o que indica que os fragmentos menores são adequados para a exibição de enzimas na superfície dos esporos. Apenas os aminoácidos 23-33 da SEQ ID NO: 1 apresentaram um nível de visualização de enzima reduzido nos esporos. TABELA 58. NÍVEIS DA ENZIMA DE FOSFOLIPASE AA = aminoácidos
[001139] De modo semelhante aos resultados apresentados acima, na Tabela 57, os maiores níveis de fosfolipase ou lipase na superfície dos esporos foram observados quando os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos de 23-38 da SEQ ID NO: 5 ou a sequência de proteínas do exosporium da SEQ ID NO: 120 foram utilizados.
[001140] Os efeitos desses esporos que expressam vários desses construtos sobre a nodulação em soja são mostrados abaixo, na Tabela 59. TABELA 59. RESPOSTAS DOS VEGETAIS DA FOSFOLIPASE
[001141] Os vegetais de soja foram revestidos conforme citado acima, mas o ensaio foi realizado pelo período de 3 semanas. Os vege- tais foram removidos com cuidado, a sujeira foi removida delicadamente com água das raízes e os nódulos foram contados para cada vegetal. Como mostrado na Tabela 59, a adição de esporos exibindo fosfolipase as sementes de soja permitem uma quantidade acelerada de nódulos sobre os vegetais, que é uma indicação positiva de crescimento precoce, bem como de eventuais aumentos no rendimento da soja.
EXEMPLO 60: LIGAÇÃO DO RNA DEMIR319 E DO RNA 1 ALEATÓRIO AOS ESPOROS DO BACILLUS CEREUS QUE EXPRESSAM A PROTEÍNA DE FUSÃO CONTENDO UMA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO A ÁCIDOS NUCLEICOS E O USO DESSES ESPOROS PARA ADMINISTRAR O RNA AOS VEGETAIS
[001142] O DNA e o RNA podem estar ligados aos esporos do membro da família Bacillus cereus que expressam proteínas de fusão contendo uma sequência de direcionamento e uma proteína de ligação de ácido nucleico ou um peptídeo em seu exosporium, como descrito acima, nos exemplos e na descrição. Os esporos atuam como um mecanismo de administração, administrando o ácido nucleico alvo (por exemplo, um miRNA) ao vegetal alvo. Para demonstrar essa capacidade dos esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante, um miRNA comum, MIR319, foi administrado às sojas utilizando esporos que expressam uma proteína de fusão que contém aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1 fundidos na estrutura com o gene de ligação de DNA conhecido, SspC. O MIR319 tem diferentes efeitos no fenótipo do vegetal em diferentes vegetais e mesmo em diferentes partes do mesmo vegetal. Por exemplo, em algumas espécies, o tratamento das folhas com MIR319 leva a uma ondulação das folhas, enquanto que em outras espécies, a aplicação de MIR319 leva a uma resistência à tensão. O MIR319 é ubíquo em todos os genomas de vegetais, é um regulador universal de vias, e sua administração em vários vegetais leva a vários fenótipos. TABELA 60: OS RNAS USADOS NESTE ESTUDO
[001143] O microRNA MIR319 sintético da Glicina máx. (soja) foi concebido para corresponder à sequência de MIR319 disponível na miRBase (miRBase.org, repositório central das sequências de microRNA). Duas sequências de cadeia simples parcialmente comple-mentares foram sintetizadas por tecnologias integradas de DNA (IDT, Iowa) que representam os produtos de gene maduro 3' e 5' que, sabese, existem in vivo (foram usadas duas versões diferentes da sequência 5'). Da mesma forma, dois RNAs de fita simples foram sintetizadas com sequências aleatórias que não correspondem ao genoma da soja como controle. Os produtos genéticos de fita dupla (ds) foram feitos combinando-se dois produtos de fita simples (ss) a 95 °C durante 10 min e, em seguida, arrefecendo-se lentamente à temperatura ambiente para permitir o recozimento. O Bacillus thuringiensis que expressa uma proteína de fusão que contém o promotor de BclA, um resíduo de metionina como códon de partida e os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO:1 fundidos na estrutura ao gene de ligação do DNA conhecido SspC (um SASP de tipo α/β, uma proteína C de esporos solúveis em ácido pequena de Bacillus thuringiensis BT013A) foram produzidos por procedimentos padrão de clonagem como descrito acima, no Exemplo 58. Esse construto (SspC-BclA) foi criado em E. coli, transformado em Bacillus thuringiensis BT013A e os clones foram verificados por sequenciamento de DNA. Os esporos de B. thuringiensis que expressam SspC-BclA foram obtidos por um cultivo de uma noite de bactérias transformadas em caldo de infusão de cérebro e coração (BHI) por 2 dias em meios à base de extrato de levedura até uma densidade de 2 x 108 esporos por mililitro (ml) foi obtido com menos de 1% de células vegetativas. O DNA foi extraído de uma alíquota do cultivo parental de BHI e enviado para sequenciamento para confirmar a incorporação do plasmídeo deSspC-BcIA. Para preparar os esporos para o tratamento das sementes, 1 ml do cultura de esporos nos meios à base de extrato de levedura foi peletizado por centrifugação e ressuspenso em 100 μl de água. Essa suspensão concentrada foi contada e os esporos foram usados a 6 x 108 esporos/ml. Para cada semente de soja, 1 μl dos es-poros foi combinado com 10 μl de RNA a 10 μM e incubado a 30 °C durante 2 horas (intensificado para várias sementes). Após esses es-poros de incubação foram peletizados (transportando o RNA ligado) e o RNA excedente foi desligado no sobrenadante e descartado e o peletizado foi ressuspenso em 10 μl de água. As amostras foram aplica-dasàs sementes como se segue: 39,6 cm3 (15,63 em 3) de solo superficial da marca comercial Timberline foram preparados em cada vaso e uma indentação foi feita, onde 2ml de água foram aplicados e uma única semente foi colocada no topo. 10 μl da amostra de esporos + RNA ligado foram aplicados por micropipetagem direta no topo da semente. As sementes foram deixadas em repouso durante 30 min e, em seguida, o solo adjacente foi empurrado para cobrir superficialmente a semente. As sementes foram deixadas para germinar durante 4 dias em uma câmara de cultivo de vegetais com luz artificial em um ciclo de luz/dia de 13/11 hora e um intervalo de temperatura de 21 C dia/15 °C noite. No dia 14, os vegetais de soja foram arrancados, fotografados e medidos. As alturas foram normalizadas às dos vegetais tratados com controle de água (ver Tabela 61).
[001144] O Exemplo 41, acima, descreve a capacidade dos esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante SspC-BclA de se ligar ao e manter o DNA. Para avaliar a capacidade de ligação do RNA dos esporos que expressam SspC-BclA, as sequências de RNA aleatório marcadas com biotina foram sintetizadas por IDT e incubadas com os esporos exatamente como foi feito com os tratamentos descritos acima (1 μl de esporos a 6 x 108 esporos/ml + 10 μl de 10 μM de RNA durante 2 horas a 30 °C, sedimentados e ressuspensos em 10 μl de água). A avidina conjugada com fluoresceína (FITC) (Life Technologies) foi adicionada à amostra de esporos de 10 μl + amostra de RNA a 20 μg/ml de concentração final e incubada por 1 hora à temperatura ambiente no escuro. A avidina é conhecida por se ligar à biotina e FITC é um marcador fluorescente. Os esporos foram sedimentados mais uma vez para remover o excesso de avidina-FITC e ressuspensos em 4% de paraformaldeído feito em PBS e armazenados durante uma noite a 4 °C no escuro. Os esporos foram inspecionados por fluorescência e fotografados (ver Tabela 62). Além disso, como mostrado na Figura 10, os esporos marcados com SSPC-BclA foram capazes de se ligar e reter o ssRNA e o dsRNA, como mostrado na marcação de FITC-avidina dos esporos na presença do ssRNA ou do dsRNA ligados com a biotina. Para gerar os resultados ilustrados na Figura 10, os esporos foram incubados com RNA de fita simples ou dupla (de uma sequência aleatória) marcado com biotina e detectados com avidina conjugada à fluoresceína (FITC). Nenhuma fluorescência foi detectada nos esporos incubados apenas com água. Imagens fluorescentes claras e correspondentes foram tiradas com lentes 40x objetivas e 10x oculares.
[001145] Como pode ser visto na Tabela 61, abaixo, o principal efeito de MIR319 como tratamento de sementes de soja é sobre crescimento radicular e sobre o comprimento total. As raízes frisadas foram definidas como com pelo menos duas voltas de 180°. Os comprimentos foram medidos ao longo do caule principal. Quando os vegetais de soja foram arrancados e avaliados quanto à presença de "raízes frisadas", um fenótipo observado pelo nosso grupo específico de sojas, não foram encontradas evidências de raízes frisadas no controle com água, no controle com a cepa BT013A, com o controle apenas com o RNA de fita dupla (dsRNA) ou apenas com os esporos (controle transportador). A única evidência de raízes frisadas é notada quanto os esporos de SspC-BclA (o transportador) foi administrado à semente com o dsRNA (60% de raízes frisadas) (ver também a Figura 10). A Figura 11 também mostra as mudanças fenotípicas nos vegetais de soja quando expostos aos esporos de SspC-BclA combinados com ds MIR319 RNA. Quando os esporos são utilizados para administrar o RNA, o impacto do RNA é ampliado, levando a um aumento no fenótipo de atrofia e de raízes frisadas, na FIgura 11. Para gerar os resultados ilustrados na Figura 11, as sementes de soja foram tratadas com cadeia dupla (ds) de MIR319, com ou sem ligação anterior aos esporos de B. thuringiensis que expressam SspC-BclA. A aplicação de dsMIR319 resultou em vegetais ligeiramente maiores, em média; no entanto, a aplicação de dsMIR319 ligado a esporos resultou em raízes "frisadas", definidas como com pelo menos duas voltas de 180°° e um menor altura total. A amostra média de cada condição experimental é mostrada. As imagens foram tiradas com uma câmera digital com os vegetais juntos em uma única imagem.
[001146] Como um controle de RNA, um conjunto aleatório de ssRNA (de cadeia simples) e dsRNA foi aplicado à soja. Nesses experimentos, o ssRNA aleatório não teve efeito quando aplicado isoladamente, enquanto que o dsRNA teve um efeito de atrofia sobre a altura dos vegetais quando administrado às sementes. Em ambos os casos, quando os esporos (de transporte) foram utilizados em conjunto com o ssRNA aleatório ou com a versão de dsRNA, o fenótipo para atrofia aumentou significativamente (33% e 27,8% atrofiado, respectivamente). A atrofia não fica evidente apenas no esporo (controle de transpor-tador). Esses dados, quando tomados em conjunto, demonstram a ca-pacidade dos esporos de ampliar e administrar especificamente o ssRNA e o dsRNA aos vegetais pela aplicação à semente e demonstra a capacidade de dois RNAs diferentes (Aleatório #1 e MIR319) afetarem o fenótipo quando administrar através de esporos de Bacillus cereus que expressam uma proteína de fusão contendo uma proteína de ligação ao DNA/RNA. TABELA 61: EFEITO SOBRE A RAIZ E SOBRE A ALTURA DEMIR319 SOBRE O DESENVOLVIMENTO DA SOJA TABELA 62: DETECÇÃO DA FLUORESCÊNCIA EM EXPOROS DE EXPRESSÃO DE SSPC-BCLA COM RNA MARCADO COM BIOTINA LIGADA
[001147] Como pode ser visto na Tabela 62, não foi detectada fluo- rescência nos esporos sem a presença de RNA. Tanto a cadeia simples (ss) como a cadeia dupla (ds) de RNA foram detectadas nos esporos.
EXEMPLO 61: ADMINISTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS A NEMATOIDES CAENORHABDITIS ELEGANS POR INGESTÃO DE ESPOROS DE BACILLUS THU-RINGIENSIS RECOMBINANTES QUE EXPRESSAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO
[001148] Administração de RNA e de DNA a nematoides tem uma grande quantidade de aplicações na ciência dos vegetais, na saúde do animal e em pesquisas básicas. Os nematoides causam um dano considerável e rendem uma perda de rendimento a operações de cultivo comerciais e não comerciais para os principais cultivos e os nematoides parasíticos causam uma elevada morbidez em humanos e em outros animais em diversas áreas empobrecidas do mundo. A administração de RNA e DNA tem o potencial de aliviar e tratar diversos problemas de nematoides e a administração de construtos de RNA e DNA demonstrou-se útil no impacto aos nematoides alvo. Este exemplo ilustra a utilidade do mecanismo de administração de RNA/DNA descrito acima, no Exemplo 60, na administração de esporos aos nematoides.
[001149] Os nematoides C. elegans de tipo selvagem foram adquiridos junto à Carolina Biological (Carolina do Norte) e mantidos a 23 ° C em placas de ágar NGM-Lite revestidas com E. coli OP50 para ração. Duas cepas diferentes de Bacillus thuringiensis BT013A foram manipuladas por meio de procedimentos de clonagem padrão para expressar os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1 fundidos na estrutura com a proteína verde fluorescente (GFP) ou mCherry para rastrear a presença de esporos no intestino. Esses esporos verdes ou vermelhos marcados com fluorescência foram obtidos por um cultivo de uma noite em um meio de BHI (infusão de cérebro e coração), seguido de três dias em meios à base de extrato de levedura até uma densidade de aproximadamente 2 x 108 esporos por mililitro (ml) foi obtido com menos de 1% de células vegetativas. Para preparar esporos para admi-nistração a nematoides, 1 ml do cultivo de esporos nos meios foi peletizado por centrifugação e ressuspenso em 100 μl de água para remover os meios excedentes. Essa suspensão concentrada foi contada e diluída a 1 x 108 esporos/ml. Para administrar esporos aos parasitas, 1 μl da suspensão de esporos contendo os esporos marcados com fluorescência vermelha ou verde foi adicionado a 60 mm de placa de ágar NGM-Lite com 10 μl de PBS (salmoura tamponada com fosfato) para auxiliar na difusão. Nenhuma outra fonte de administração foi disponibilizada. Vinte nematoides de tipo selvagem de várias idades foram transferidos imediatamente para as placas. Os nematoides vivos foram verificados 5 horas mais tarde quanto à ingestão de esporos utilizando microscopia de fluorescência padrão.
[001150] Como pode ser visto na Figura 12 e na Tabela 63, o intestino centralizado dos nematoides fluoresceu quando alimentados com esporos do membro da família Bacillus cereus que expressam a proteína de fusão contendo a sequência de direcionamento e GFP, enquanto que o intestino não fluoresceu quando alimentado com E. coli OP50 (ração normal). Foram tiradas imagens dos nematoides vivos com lentes 4x objetivas e 10x oculares. Isto demonstra a capacidade desses esporos de serem ingeridos e de administrar uma "carga" de proteínas alvo, exemplificada pela proteína de fluorescência verde. Outras proteínas do exosporium e proteínas de segmentação também podem ser utilizadas alternadamente com uma sequência de direcionamento para administrar o RNA e o DNA a um nematoide ou a outro organismo alvo. Outros esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante também podem ser usados devido ao alto grau da natureza conservada do exosporium e à sua criação na superfície do esporo. TABELA 63: FLUORESCÊNCIA DE C. ELEGANS DETECTADA NO INTESTINO
EXEMPLO 62: CONSTRUÇÃO, PURIFICAÇÃO E USOS DE FRAGMENTOS DE EXOSPORIUM
[001151] Mutantes de nocaute (KO): Para produzir as cepas mutantes de nocaute (KO) de exsY e cotE de Bacillus thuringiensis BT013A, foram construídOS UM transporte de pKOKI de plasmídeo e um vetor de integração contENDo o esqueleto de pUC57, que é capaz de se replicar em E. coli, bem como a origem de replicação do cassete de resistênciA á eritromicina de pE194. Esse construto é capaz de se replicar em E. coli e em Bacillus spp. Uma região de DNA de 1 kb que correspondia à região à montante do gene cotE e uma região de 1 kb que correspondia à região à jusante do gene cotE foram ampliadas por PCR do Bacillus thuringiensis BT013A. Foi produzido um segundo construto que continha 1kb da região do DNA que correspondia à região à montante do gene exsY e uma região de 1kb que correspondia à região à jusante do gene exsY, ambas foram ampliadas por PCR do Bacillus thuringiensis BT013A. Para cada construto, as duas regiões de 1 kb foram divididas em conjunto utilizando uma recombinação homóloga com duas regiões em sobreposição COM o plasmídeo de pKOKI. Esse construto de plasmídeo foi verificado através de digestão e pelo sequenciamento de DNA. Os clones foram rastreados buscando-se a resistência à eritromicina.
[001152] Os clones foram passados por condições de temperatura elevada (40 °C) em caldo de infusão de cérebro e coração. As colônias individuais foram encertadas em placas de ágar de LB contendo eritromicina 5 μg/ml, cultivadas a 30 °C e testadas quanto à preseNÇA Do plasmídeo de pKOKI como um plasmídeo livre por PCR de colônias. As colônias que tinham um evento de integração foram prosseguidas pela passagem para selecionar colônias individuais que perderam a resistência à eritromicina (implicando a perda do plasmídeo, mas a recombinação e a remoção do gene exsY ou do gene cotE). As exclusões verificadas foram confirmadas por ampliação por PCR e o sequenciamento da região alvo do cromOSSOMO. O plasmídeo pSUPER-BclA 20-35 Endo (descrito acima, no Exemplo 58) foi transformado em cada um dos seus mutantes de nocaute exsY e cotE. Tal como descrito acima, no Exemplo 48, o mutante de cotE de nocaute também foi transforMADO Pelo plasmídeO PsUPER BclA 20-35 eGFP (preparado como descrito acima, no Exemplo 44, mas com endoglUCANase raspado por eGFP por recombinação homóloga).
[001153] Os mutantes dominantes negativos: Para criar um mutante negativo dominante, ampliamos por PCR a metade de terminal N e a metade de terminal C de cotO (SEQ ID NO: 126), contendo os aminoácidos de 1-81 e de 81-199, respectivamente, e clonamos esses fragmeNTOs em um vetor de pHP13 utilizando recombinação hOMÓloga (o vetor de pHP13 é descrita acima, no Exemplo 1). Os clones corretos foram verificados por sequenciamento de Sanger. Cada um dos dois mutantes negativos de cotO foi inserido no Bacillus thuringiensis BT013A que cONTINHa o construto pSUPER-BclA 20-35 Endo, que produz endoglucanase na superfície do esporo conforme ilustrado acima, no Exemplo 58.
[001154] Criação de fragmento de exosporium: Para cada um dos dois mutantes de nocaute, e ambos os mutantes negativos mutantes, um cultivo de uma noite foi cultivado em meios de BHI a 30 ° C, 300 rpm, em balões de Erlenmeyer com saliências com seleção de antibiótico. Um mililitro desse cultivo durante uma noite foi inoculado em meiosà base de extrato de levedura (50 ml) em um balão de Erlenmeyer com saliências e cultivado a 30 °C durante 3 dias. Uma alíquota de esporos foi removida, foi adicionado 1% de Tween e os esporos foram agitadas em vórtice durante um minuto. Os esporos foram coletados através de centrifugação a 10.000 X g durante 5 minutos e o sobrenadante contendo os fragmentos de exosporium foi filtrado através dE um filtro de 0,22 μM para remover todos os esporos residuais. O sobrenadante (contendo os fragmentos quebrados de exosporium) foi filtrado através de um filtro de membrana de 100000 Da para se obterem fragmentos de exosporium purificados contendo as proteínas de fusão. As proteínas menores de MW foram removidas passando-se através do filtro de 100 kDa. Nenhum esporo foi encontrado no filtrado ou retentado do sobrenadante.
[001155] As micrografias de elétrons de transmissão são fornecidas na Figura 15 mostrando esporos intactos de Bacillus thuringiensis BT013A (painel A) rodeados por um exosporium ligado e os esporos do mutante de nocaute de cotE do Bacillus thuringiensis BT013A (painel B), a partir do qual o exosporium se desligou. As setas no painel A da Figura 15 indicam o exosporium de esporos intactos, enquanto que setas no painel B da Figura 15 indicam o exosporium que se separou dos esporos. O painel C da Figura 15 mostra uma micrografia de transmissão de elétrons de uma preparação de um fragmento de exosporium purificado derivado do nocaute de cotE do Bacillus thuringiensis BT013A (preparada tal como descrito acima: em vórtice, por centrifugação e filtração do sobrenadante), visualizada por coloração negativa. As imagens foram tiradas em um microscópio de elétrons de transmissão JEOL JEM 1400. Nenhum fragmento visível de exosporium foi observado quando os esporos de controle (Bacillus thuringiensis BT013A sem o nocaute de cotE, expressando a proteína de fusão BclA 20-35 Endo, nenhum dado apresentado) foram submetidos ao mesmo vórtice, à centrifugação e aos procedimentos de filtração descritos acima.
[001156] Presença de BclA 20-35 endoglucanase em uma coleção de fragmentos de exosporium do nocaute de cotE e de ExsY e os mutantes negativos dominantes de cotO: Os fragmentos de exosporium foram criados e purificados conforme descrito acima, cONTENDo o plasmídeo pSUPER BclA 20-35-Endo que cria um exosporium que contém as enzimas de endoglucanase na superfície dos esporos. Os fragmentos de exosporium contendo esse construto foram criados a partir dos esporos do mutante de nocaute de cotE, dos esporos do mutante de nocaute de exsY, dos esporos do mutante dominante de terminal N de cotO ou esporos dominantes de terminal C de cotO. Em cada um desses experimentos, a quantidade de atividade da endoglucanase sobre os fragmentos de exosporium foi quantificada como um percentual dos níveis totais de enzima. Esses resultados foram comparados com um construto de tipo selvagem que não continha mutantes, mas cONTINHa o plasmídeo pSUPER BclA 20-35-Endo.
[001157] Efeitos dos fragmentos de exosporium sobre o crescimento do vegetal: Esses fragmentos de exosporium foram então administrados como um tratamento de sementes em sementes de soja (como descrito acima, no Exemplo 59). Um controle de tipo selvagem (B. thuringiensis BT013A expressando o construto de BclA 20-35 Endo) também foi usado para revestir sementes de soja. Para cada experimento, 1 μl de fragmentos de exosporium de cada construto, uma diluição em 1:2, 1:4 ou 1:8 dos fragmentos, foi aplicado a cada semente. TABELA 64: ATIVIDADE ENZIMÁTICA DO FRAGMENTO DE EXOSPORIUM E RESPOSTA AO CRESCIMENTO DO VEGETAL
[001158] Esses resultados demonstram que as mutações que rompem o exosporium, tal como uma mutação de nocaute no gene cotE ou exsY ou uma mutação negativa dominante na proteína de cotO, podem ser utilizadas para gerar fragmentos de exosporium que são substancialmente livres de esporos, e demonstra que esses fragmentos de exosporium contêm proteínas de fusão que são direcionadas ao exosporium. Esses fragmentos podem ser utilizados para promover o crescimento do vegetal e em outras aplicações. Houve uma pequena quantidade de atividade de endoglucanase de fundo na preparação do fragmento de exosporium a partir da cepa de BT013 sem mutações e expressando o construto de BclA 20-25 Endo (BT013A BclA 20-35 Endo). Isso foi inesperado e pode representar um nível baixo de exosporium instável que está sendo liberado dos esporos e capturados durante o processo de coleta de fragmentos de exosporium. As cepas de nocaute de cotE e de exsY contêm a maior quantidade de enzimas na fração do fragmento de exosporium. Os mutantes negativos dominantes de cotO que expressam uma proteína de fusão também têm um nível elevado de enzimas na fração do fragmento de exosporium.
[001159] Os fragmentos de exosporium dos mutantes de cotE e de exsY (não expressam BclA 20-35 Endo) aplicados diretamente aos vegetais tiveram um efeito negativo sobre o crescimento e foram re-movidos deste experimento. Quando os fragmentos de exosporium de BT013A BclA 20-35 Endo foram aplicados à soja, houve um fenótipo de crescimento negativo. Quando os fragmentos dos mutantes de cotE ou exsY que expressam a proteína de fusão de BclA 20-35 Endo foram adicionados à soja, deu-se um aumento substancial na taxa de crescimento (+28,3% e +14,8% nos fragmentos de BT013A BclA 2035 Endo). Os fragmentos mutantes de exosporium de cotE ainda estavam ativos na diluição em 1:4, mas os fragmentos de exosporium de exsY não estavam mais apresentando um benefício de crescimento às sojas nessa diluição. Os mutantes negativos dominantes de cotO que expressam a proteína de fusão de BclA 20-35 Endo geraram um ligeiro aumento no crescimento da soja em comparação aos fragmentos de BT013A BclA 20-35 Endo, gerando +6,5% e +2,7% de crescimento, respectivamente.
EXEMPLO 63: DEMONSTRAÇÃO ADICIONAL DA UTILIDADE DOS MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS ENDOFÍTICA E OUTRAS ESPÉCIES DE BACILLUS PARA ADMINISTRAR PEPTÍDEOS, PROTEÍNAS E ENZIMAS ENDOFITICAMENTE AO VEGETAL
[001160] Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus thuringiensis EEB00184, Bacillus cereus EE439 e Bacillus sp. Constatou-se que EE387 tem a capacidade de crescer endofiticamente e que é capaz de servir como uma cepa hospedeira para o sistema de BEMD (ver os Exemplos 52 e 53). Para demonstrar a capacidade desses Bacilli de crescer endofiticamente e servir como uma cepa hospedeira para o sistema de BEMD, cada uma dessas cepas foi transfORMada pelo plasmídeo pMK4 BclA-20-35-EGFP (descrito acima, no Exemplo 62). Os esporos foram feitos e purificados como descrito acima, no Exemplo 40.
[001161] Esses esporos foram diluídos a uma concentração de 1x108/ml e 1 μl de caldo de célula total foi adicionado a uma semente de milho híbrido comercial em solo de envasamento no plantio. As sementes de milho foram revestidas com um fungicida e um inoculante biológico. A variedade de milho híbrido foi BECK 6175RR, que contém o gene de resistência a glifosato ROUNDUP READY e o gene de resistência a seca AQUAMAX. Os vegetais foram cultivados sob luz artificial por 14 horas por dia e os vegetais cultivados por um período de dez dias foram determinados. Os vegetais foram regados de três em três dias durante o período do experimento.
[001162] Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus thuringiensis EEB00184, Bacillus cereus EE439 e Bacillus sp. EE387, eXPREssando BclA 20-35-eGFP foram então isolados do interior das plantações de milho. Os vegetais de dez dias foram extraídos do solo e lavados para remover os detritos excedentes. Os vegetais foram então invertidos, lavados em água, expostos a 5% de lixívia, lavados em água, expostos a 70% de etanol por dez minutos, lavados em água novamente e os caules foram divididos com uma lâmina de barbear estéril. As metades do caule divididas foram colocadas com a face para baixo nas placas de ágar de nutrientes por duas horas a 30 °C. Depois de duas horas, os caules foram removidos e as placas de agar incubadas a 30 ° C durante 48 horas. Após 48 horas, as placas foram examinadas quanto à morfologia das colônias e as colônias de Bacillusencontradas no interior do vegetal foram enxertadas no ágar de nutrientes e placas de ágar de nutrientes mais cloranfenicol (para selecionar as bactérias coNTEndo o plasmídeo de pMK4-20-35 BclAendoglucanase). Os resultados são mostrados na Tabela 65. Esses resultados demonstram a capacidade do sistema de BEMD de ser introduzido no vegetal alvo por expressão de uma cepa endofítica da família Bacillus cereus. A Figura 13 também demonstra a capacidade do Bacillus thuringiensis EE-B00184 de expressar EGFP nos esporos, conforme evidenciado por microscopia fluorescente. Na Figura 13, as setas indicam os esporos individuais. A Figura 14 demonstra a capaci-dade das colônias de bactérias isoladas dos vegetais de fluorescência verde, demonstrando que eles de fato administram a proteínA DE inte-resse (aqui, eGFP) no interior dos vegetais. A Figura 14 mostra a fluo-rescência das colônias de bactérias endofíticas do interior das plantações de milho em placas, iluminadas com uma lâmpada de GFP filtrada. TABELA 65: ADMINISTRAÇÃO ENDOFÍTICA DE PROTEÍNAS DE "CARGA"
[001163] Para demonstrar ainda mais a capacidade dessas cepas endofíticas de expressar proteínas na superfície dos esporos, os construtos a seguir foram inseridos no Bacillus sp. eE387: plasmídeo de pHP13 com endoglucanase fundida com: BclA 20-35, CotB, CotG, CotC, CgeA, InhA, InhA2, InhA1, CotY ou AcpC (aminoácidos de 2025 da SEQ ID NO: 1 ou das SEQ ID Nos. 252, 256, 253, 254, 108, 121, 114, 111 e 120, respectiVAMENTe). O construto pSUPER-BclA 20-35 Endo descrito acima, no Exemplo 58, também foi inserido no Bacillus thuringiensis EE-B00184, outra cepa endofítica. As células transformadas foram selecionadas por PCR e sequenciamento de Sanger. Os esporos de cada um desses construtos foram produzidos cultivando-se um cultivo de uma noite em BHI mais uma seleção (cloranfenicol), e 500 μl de cada cultivo foi raspado sobre placas de ágar de caldo de nutrientes e deixados para incubar a 30 ° C durante 3 dias. Após 3 dias, os esporos foram raspados em PBS, diluídos a uma concentração de 1x108/ml, centrifugados para recuperar os esporos e foi feita a medição de enzimas dos esporos tal como descrito acima, no Exemplo 58. A concentração da enzima foi calculado como mU/ml para cada construto. A capacidade do Bacillus sp. EE387 para expressar proteínas de fusão na sua superfície de esporos é indicada pelos níveis de enzima. Bacillus sp. EE387 foi capaz de expressar todas as proteínas de fusão de esporos sobre a sua superfície, mas CCCC (SEQ ID NO: 120) foi uma proteína de fusão superior para essa cepa. Essa constatação foi surpreendente, visto que o Bacillus sp. EE387 não é uma cepa do membro da família Bacillus cereus e não tem um exosporium, mas apresentou uma expressão superficial de proteínas de fusão contendo proteínas do exosporium ou sequências de direcionamento derivadas de proteínas do exosporium (por exemplo, CotY, AcpC e os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1). TABELA 66: CEPAS ENDOFÍTICAS DO BACILLUS SP. EE387 (EE387) E BA-CILLUS THURINGIENSIS EE-B00184 (EE-B00184) QUE EXPRESSAM PROTEÍNAS DE FUSÃO
[001164] Essas cepas endofíticas também podem ser administradas ao vegetal através da adição ao meio de crescimento do vegetal, incluindo solo, irritação e formulações granulares. As linhagens endofíticas também podem entrar no vegetal alvo por meio de porções aéreas dos vegetais. Elas criam um mecanismo único e eficaz de administrar proteínas e peptídeos de interesse ao vegetal ou, no caso das proteínas de ligação ao DNA ou RNA, administrado o RNA ou o DNA ao vegetal.
[001165] Esses dados, no Bacillus sp. EE387, também demonstram que os aminoácidos de 20-35 de BclA (SEQ ID NO: 1) e das SEQ ID NOs. 108, 121 e 120 têm, todos, dados visivelmente positivos em cepas do Bacillus fora da família Bacillus cereus. Bacillus thuringiensis EE-B00184 é também um sistema de expressão excepcional em hospedeiros. Esses níveis são ambos perceptíveis e positivos, indicando que um mecanismo conservado para ligação pode estar presentes em outras espécies de Bacillus para essas proteínas.
[001166] Expressão superficial de esporos do Bacillus thuringiensis EE-B00184. O Bacillus thuringiensis EE-B00184 Foi transformADO por pSUPER BclA 20-35 eGFP e foi deixado para esporular como descrito acima. Os esporos foram sedimentados, lavadas e submetidos a microscopia de fluorescência para demonstrar a superfície dos esporos cARREgada com proteínas de eGFP na Figura 13.
EXEMPLO 64: EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO EM CEPAS DO MEMBRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS DEGRADANTES EM HERBICIDAS E PESTICIDAS
[001167] Os Exemplos 49 e 51 acima demonstram a capacidade do membro da família Bacillus EE349 de degradação em herbicidas de degradar herbicidas e servir como cepa hospedeira para expressão de uma proteína de fusão ligada ao exosporium de seus esporos. Para demonstrar ainda mais a capacidade das cepas de degradação de herbicidas de produzir exosporium carregado com enzimas eM Seus esporos, inserimos pHP13 COtc-eNDo (SEQ ID NO: 253), pSUPER CCcc-eNDo (SEQ ID NO: 120), pSUPER InhA2-eNDO (SEQ ID NO: 121) e pSUPER 23-38 SEQ ID NO: 5-Endo) no membro da família Ba-cillus cereus EE-b00377. Uma descrição de pHP13 COTC-Endo pode ser encontrada no ExeMPLO 54, uma descriÇÃO DE pSUPER CCCCEndo e pSUPER-InhA2 Endo pode ser encontrada no ExemPLO 59 e uma descrição de pSUPER 23-38 SEQ ID NO: 5-Endo pode ser encontrada no Exemplo 58. O membro da família Bacillus cereus EEB00377 foi identificado como um potente degradador de piretrina, dicamba e 2,4-D. A degradação de herbicidas e pesticidas foi verificada tanto pelo cultivo no herbicida ou pesticida como fonte do nutriente como pela redução de dicamba e 2,4-D na presença da cepa de degradação de herbicidas ou pesticidas. Os plasmídeos foram produzidos e as células transformadas de forma idêntica ao Exemplo 48, acima. Cada construto foi verificado por sequenciamento de Sanger. Os esporos foram criados usando os meios de esporulação e as condições descritas no Exemplo 48. A atividade enzimática também foi efetuada como no Exemplo 58 acima. TABELA 67: NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE ENZIMAS DE PROTEÍNAS DE FUSÃO EM MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS EE-B00377 DA CEPA DE DE-GRADAÇÃO DE PESTICIDAS.
[001168] Como pode ser visto na Tabela 67, o membro da família Bacillus cereus EE-B00377 é capaz de produzir endoglucanase e exibir a endoglucanase no seu exosporium usando várias proteínas do exosporium diferentes ou sequências de direcionamento. Dos construtos testados, os aminoácidos de 23-38 da SEQ ID NO: 5 ou da SEQ ID NO: 253 geraram os níveis mais alto de enzimas nessa cepa.
[001169] Esse exemplo demonstra a capacidade do esporo apresentado no sistema de ser expresso em cepas de degradação de herbicidas e pesticidas. Esse sistema pode ser usado para expressar outras proteínas alvo na superfície dos esporos, incluindo as que atuam sobre os próprios herbicidas ou as próprias pesticidas, como enzimas de degradação de herbicidas, enzimas de degradação de pesticidas, enzimas metabólicas, reductases, oxidases e outras enzimas úteis para a repartição dos pesticidas isoladamente ou na presença dos vegetais.
EXEMPLO 65: USO DE SINTASE DE ÓXIDO NÍTRICO LIVRE (NOS) E NOS LI-GADO A ESPOROS PARA AUMENTAR A GERMINAÇÃO DE VEGETAIS
[001170] O Exemplo 40 demonstra a capacidade da sintase de óxido nítrico (NOS) do Bacillus subtilis 168 de estimular a germinação quando ligado ao exosporium de membros da família Bacillus cereus e de administrar essa proteína de fusão de NOS-esporos às sementes ou nas proximidades das sementes. Nesse exemplo, a NOS livre do Bacillus thuringiensis bt013A (SEQ ID NO: 261) e a eNOS livres (NOS epitelial de neutrófilos bovinos, Sigma-Aldrich, Cat No N1533) também pode ajudar a induzir a germinação ou o aumento do crescimento das sementes exposTAS à NOS. Os plasmÍDEos de pHP13 BclA bt-NOS, pHP13 BclA BS-NOS e pHP13 BclA-Soda (superóxido dismutase) foram FEitos de forma idêntica à pHP13 BclA BS-NOS descrita no Exemplo 40 e foram transformados em BacilLUS thuringiensis BT013A. A pHP13 BclABT NOS contém o promotor de BclA, o códon de partida, os aminoácidos de BclA de 20-35, um ligante de 6-alanina e o gene do Bacillus thuringiensis BT013A NOS (ver TABEla 9, SEQ ID NO: 263). A pHP13 BclA BS-NOS contém o promotor de BclA, o códon de partida, os aminoácidos de 20-35 de BclA, um ligante de 6alanina e os gene do Bacillus subtilis 168 NOS (ver tAbela 9, SEQ ID NO: 264). pHP13 BclA-SODA contém o promotor de BclA, os aminoácidos de BclA de 20-35, um ligante de 6-alanina e o gene do Bacillus cereussuperóxido dismutase (SODA1) (SEQ ID NO: 155).
[001171] A Tabela 68 mostra os resultados de um ensaio de germinação no solo. Nesse ensaio, a variedade comercial Beck 294NR (Roundup ready) foi revestida com 1 μL de água (controle) ou 1 μl de água Enriquecida com 34,2 mU de eNOS de neutrófilos bovinos. 50 sementes de cada foram plantadas e cultivadas como descrito no Exemplo 58, mas com 4 sementes por vaso. Após 7 dias, as plantas foram medidas quanto à sua altura. Como pode ser visto NA Tabela 68, a presença das eNOS permitiu um maior crescimento das sementes, o que conduz a um aumento de 30,7% na altura da parte aérea da soja tratada. TABELA 68: INFLUÊNCIA DA ENOS LIVRE NA ALTURA DO VEGETAL DA SO JA.
[001172] Além do teste de germinação do solo descrito acima, ensaios de germinação padrão foram realizados conforme descrito no Exemplo 40. Para a soja, escolhemos sementes de dois anos com uma taxa de germinação mais baixa e revestidas com 1 μl em cada uma das 50 sementes com o tratamento. Os tratamentos foram com controle de H2O controlo (água), L-arginina, Bacillus thuringiensis BT013A (controle de tensão), BaCILlus thuringiensis BT013A com pHP13 BclA -BT NOS e BaCILlus thuringiensis BT013A com pHP13 BclA BS NOS. Os resultados da soja são mostrados na Tabela 69, abaixo. TABELA 69: INFLUÊNCIA DA NOS APRESENTADA NOS ESPOROS SOBRE A TAXA DE GERMINAÇÃO NA SOJA
[001173] Os ensaios de germinação também foram realizados como descrito acima para os híbridos comerciais de sorgo. Cada semente de sorgo foi revestida com 0,5 μll de cada uma das 50 sementes com os tratamentos. Os tratamentos foram com controle de H2O controlo (água), L-arginina, Bacillus thuringiensis BT013A (controle de tensão), BaCILlus thuringiensis BT013A com pHP13 BclA -BA NOS e BaCILlus thuringiensis BT013A com pHP13 BclA BS NOS. Após 4 dias, as se-mentes foram medidas quanto à altura da parte aérea e ao comprimento das raízes para analisar o maior crescimento das sementes e todos os dados normalizados para o controle de água. Os resultados são apresentados na Tabela 70, abaixo. A adição da NOS de BT ou da NOS de BS levou a um comprimento de raiz consideravelmente maior e um crescimento da parte aérea, com a diferença mais evidente sendo no tratamento com a NOS de BS. TABELA 70: NOS LIGADA A ESPOROS E AUMENTO DO CRESCIMENTO DE SORGO
[001174] O experimento com sorgo acima foi repetido, mas com tra-tamentos ligeiramente diferentes. Os tratamentos foram por controle de H2O (água), Bacillus thuringiensis BT013A (controle de cepa), BaCILlus thuringiensis bt013A com pHP13 BclA -SODA ou eNOS bovina livre. Após 4 dias, as sementes foram medidas quanto à altura da parte aérea e ao comprimento das raízes para analisar o maior crescimento das sementes e todos os dados normalizados para o controle de água. Os resultados são apresentados na Tabela 71, abaixo. A adiÇÃO de BT SODA ou da NOS livre (eNOS) conduz a um comprimento de raízes e a um crescimento da parte aérea amplamente maior. TABELA 71: NOS LIGADA A ESPOROS E AUMENTO DO CRESCIMENTO DE SORGO
[001175] Tomados em conjunto, esses resultad os demonstram que a super-expressão de sintases de óxido nítrico a partir de várias fontes pode ser adicionada a sementes e aumentar a sua taxa de germinação e crescimento das sementes em métodos de germinação tradicional e em solo. Esse efeito também pode ser encontrado ao adicionar NOS livre às sementes. A adição de superóxido dismutase com os esporos também leva a um aumento no crescimento das sementes. A Larginina auxiliou no aumento da taxa de germinação quando utilizada isoladamente ou auxiliou em menor medida quando misturada às enzimas da NOS.
[001176] Os genes da NOS são predominantes em uma variedade de microrganismos, e esses microrganismos podem ser geneticamente modificados para aumentar a sua capacidade de expressar a NOS sobre a semente ou na da semente no meio de cultivo do vegetal. A expressão da NOS em esporos resulta em um sistema de administração superior, na medida em que os microrganismos vegetativos são mais frágeis e não sobrevivem na semente por longos períodos de tempo. A expressão em esporos que usam as sequências de direcionamento, as proteínas do exosporium, os fragmentos de proteínas do exosporium e as proteínas de revestimento de esporos aqui descritos seriam, todos, formas viáveis de administração da NOS a sementes.
EXEMPLO 66: MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DA ENZIMA E DO CRESCIMENTO DOS VEGETAIS
[001177] Tal como demonstrado nos Exemplos 44, 45 e 46, a superexpressão de uma proteína moduladora em um membro da família Bacillus cereus recombinante que co-expressa uma proteína de fusão pode fazer com que níveis maiores e menores dessa proteína sejam incorporados ao exosporium. As proteínas de fusão e os construtos foram produzidos e os esporos foram produzidos conforme descrito acima, nos Exemplos 44 e 45. Os ensaios de cultivo foram realizados conforme descrito acima, no Exemplo 46.
[001178] Como pode ser visto na Tabela 72, a expressãO DAS proteínas de fusão de 20-35 pSUPER BclA Endo na superfície dos esporos do Bacillus thuringiensis BT013A utilizando aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1 como a sequência de direcionamento levou a um aumento do crescimento do milho, da soja e da abóbora. Esse efeito pode ser aumentado quando uma segunda proteína do exosporium é super-expressa. Cada uma das cepas de super-expressão de coTo, BxpB e YjcB teve um efeito pronunciado sobre o crescimento do milho, da soja e/ou da abóbora, com os aumentos mais proeminentes sendo os do milho. TABELA 72: NOS LIGADA A ESPOROS E AUMENTO DO CRESCIMENTO DE SORGO
[001179] A super-expressão de outras proteínas moduladoras tam- bém pode modular os níveis de expressão da proteína de fusão, bem como os efeitos do crescimento do vegetal, incluindo os descritos aqui, acima, nos Exemplos 44 e 45. Cada um deles pode ser utilizado para alterar ou modificar os níveis de enzimas aos níveis eficazes almejados.
EXEMPLO 67: SUPER-EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DO EXOSPORIUM E EFEI-TOS SOBRE OS VEGETAIS
[001180] A super-expressão de esporos de ocorrência natural e proteínas do exosporium pode influenciar o efeito que a promoção do crescimento do vegetal, endofítico e outros membros da família Bacillus cereus têm sobre os vegetais. A expressão de várias proteínas do exosporium como parte de uma proteína de fusão ou como uma enzima livre pode ter efeitos benéficos sobre os vegetais, como ilustrado acima, para as fosfatases (Exemplos 11 e 36), para a sintatase de óxido nítrico (Exemplo 65) e para as proteases, tais como InhA (Exemplos 3, 6, 7 e 13). Outras proteínas do exosporium e de esporos, como a alanina racemase e as hidrolases de preferência de inosina uridina, podem evitar ou retardar a germinação de esporos, e sua superexpressão fará com que os esporos tendam a uma germinação rápida, um efeito colateral indesejável no uso de diversos tipos de esporos. Por fim, os esporos que super-expressam determinadas proteínas do exosporium podem alterar o conjunto global do exosporium, levando a alterações na ligação dos esporos aos vegetais. Um exemplo disso pode ser visto na Tabela 73, abaixo.
[001181] Os esporos foram criados como descrito quanto ao Bacillus thuringiensis BT013A, no Exemplo 58. Os ensaios de crescimento foram realizados por colocação de 1 μl do total de caldo celular de cada construto por semente de milho ou 2 μl por semente de abóbora. O tratamento, plantação ou registro de dados de sementes foi realizado conforme o Exemplo 58.
[001182] A cepa de Bacillus mycoides EE155, uma cepa de promoção de crescimento de vegetais da família Bacillus cereus, foi transformada pelos plasmídeos de super-expressão, como descrito no Exemplo 44. A super-expressão de proteínas do exosporium nessa cepa levou diretamente a um aumento na ligação dos esporos ao vegetal, e leva a uma maior promoção do crescimento do vegetal. Especificamente, a super-expressão de BclB, BclA, CotO, CotE levou a uma promoção reforçada do crescimento do vegetal. Outras proteínas do exosporium pode ser super-expressas, que pode conduzir a alterações na estrutura do exosporium, incluindo ExsY, ExsFA/BxpB, CotY, CotO, ExsFB, InhA1, InhA2, ExsJ, ExsH, YjcA, YjcB, BclC, AcpC, InhA3, alanina racemase 1, alanina racemase 2, BclA, BclB, BxpA, BclE, BetA/BAS3290, CotE, ExsA, ExsK, ExsB, YabG, Tgl, superóxido dismutase 1 (SODA1) e superóxido dismutase 2 (SODA2). A superexpressão ou a mutação de qualquer um desses genes leva a alterações na estrutura do exosporium e leva à potencialização dos benefícios do crescimento do vegetal associado a membros da família Bacillus cereus. TABELA 73: SUPER-EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DO EXOSPORIUM NO BACI-LLUSMYCOIDES EE155
EXEMPLO 68: TECIDOS VEGETAIS QUE SE LIGAM PELO USO DE EXOSPORIUM APRESENTARAM PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO
[001183] Os esporos que são úteis para a apresentação de proteínas exógenas e endógenas podem ser utilizados como parceiros de fusão para reforçar a ligação dos esporos às superfícies, incluindo o tecido do vegetal. Para demonstrar esse atributo, os esporos do Bacillus thuringiensis BT013A foram transformados pelos plasmídeos psuper BclA 20-35 TASa, PSUPER BclA 20-35 exPANSINa, pSUPER BclA 20-35 Endo e pSUPER BclA 20-35 de controle. TasA e expansina são prote-ínas de ligação a vegetais. O plasmídeo de controle continha o promotor de BclA, um códon de partida e os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, mas não incluem um parceiro de fusão. Esses construtos foram preparados de maneira idêntica aos demais, descritos acima, no Exemplo 58.
[001184] Para realizar o ensaio de ligação do tecido, plantações de milho de 2 semanas e plantações de soja de 3 semanas foram cultivadas conforme descreve-se no exemplo 58, mas sem nenhum tratamento de sementes. A folha principal e o primeiro trifólio dos vegetais foi então raspado com 1 ml de esporos contendo cada um dos construtos acima. As folhas foram deixadas para secar, cortadas dos vegetais e colocadas em um tubo cônico de 50 ml com 10 ml de água e agitado intensamente. Os esporos que foram liberados da folha para a água foram contados em um hemacitômetro e as contagens foram comparadas às esperadas se nenhum esporo estivesse ligado às folhas. Esse experimento foi repetido dez vezes, e um segundo experimento foi feito, envolvendo o plaqueamento da água em placas de antibiótico (tetraciclina mais ágar de nutrientes) durante uma noite a 30 ° C. As contagens finais são mostradas na Tabela 74. TABELA 74: A LIGAÇÃO AO TECIDO É AUMENTADA COM A EXPRESSÃO DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO SOBRE OS ESPOROS
[001185] Como pode ser visto a partir da Tabela 74, os esporos de controle BT013A têm uma elevada afinidade com os esporos BT013A de soja, com 58,3% e 65,2% dos esporos ligados aos controles. Apesar disso, a expressão de endoglucanase, expansina ou TasA sobre a superfície dos esporos levou a um aumento na ligação dos esporos às folhas da soja, com diversas preparações de esporos de aproximando de 100% de ligação às folhas. No caso do milho, existia muito menos ligação aos esporos de controle, especialmente no ensaio de placas. O resultado do ensaio de placas é o mais impressionante, com um aumento em cada um dos construtos de expressão, com TasA a 100% de esporos ligados nesse ensaio.
[001186] Essas proteínas de ligação também podem ser usadas em qualquer um dos microrganismos de formação de esporos recombinantes, usando qualquer um dos sistemas de expressão ou parceiros de fusão descritos neste documento. Esse sistema também seria útil em conjunto com as tiras de exosporium, a fim de criar um sistema de administração de proteínas que cela livre de células e se ligue forte-menteàs folhas.
EXEMPLO 69: O USO DE BACTÉRIAS DE FORMAÇÃO DE ESPOROS RECOMBI-NANTES QUE EXPRESSAM PROTEÍNAS DE FUSÃO CONTENDO PROTEÍNAS COT/CGE E UMA ENZIMA PARA PROMOVER O CRESCIMENTO DO VEGETAL
[001187] As proteínas de revestimento formam camadas de proteínas que são encontradas em todas as espécies de Bacillus descritas até o momento, bem como relacionadas aos gêneros Virginibacillus, Lysinibacillus, Clostridiae e Paenibacillus. A fusão de proteínas ou peptídeos de interesse às proteínas de revestimento possibilita a ex-pressão de proteínas estranhas sobre a superfícies do esporo, e a administração dessas proteínas ou peptídeos de interesse aos vegetais. Para demonstrar a capacidade das proteínas de revestimento de proporcionar enzimas para os vegetais, foi criada uma SÉrie de construtos. O plasmídeo pHP13 da coleção de cultivo de matéria genética do Bacillus foi usado para clonar cada construto descrito abaixo em vários locais de clonagem, utilizando uma recombinação homóloga que utiliza seus elementos promotores nativos.
[001188] CotB, CotG e CotC do Bacillus subtilis M01099 ou CgeA do Bacillus amyloliquefaciens foram fundidos ao gene da endoglucanase eglS gene do Bacillus subtilis 168, ao gene da lipase lipA do Bacillus subtilis 168 ou ao gene pc-plc do Bacillus thuringiensis BT013A. ESSEs construtos foram clonados em pHP13 por meio de recombinação homóloga, verificados por sequenciamento de Sanger e transformados em Bacillus subtilis EE405, Bacillus subtilis A09, membro da família Bacillus cereus EE439, Bacill-nos sp. EE398 ou Bacillus thuringiensis EE-B00184. Cada transformante também foi selecionado quanto aos clones corretos por sequenciamento de Sanger. Após a confirmação dos clones, cada clone foi cultivado em caldo de infusão de cérebro e coração (BHI) mais tetraciclina (10 μg/ml) durante uma noite a 30 ° C e 100 μl do cultivo durante uma noite foram raspados em placas de ágar de nutrientes mais tetraciclina. Essas placas foram incubadas a 30 ° C durante 3 dias e os esporos foram coletados por raspagem com uma raspagem com cotonete umedecido em água e ressuspensos em água.
[001189] Os esporos para os ensaios de endoglucanase foram então diluídos a 1x108 CFU/ml em água e avaliados quanto à atividade enzimática com o uso do cromóforo 4-cloro-2-Nitrofenil celotetrose (4C2NC, 3 mM em água). Para este método, 50 μl de esporos foram colocados em uma placa de 96 Poços e 50 μl de uma solução 300 nM de 4C2NC foram adicionados a cada placa. A placa foi então incubada a 30 ° C e a absorvância a 410 nm foi lida após 0,5 hora. Em todos os casos, a respectiva absorvância de controle de cepas foi subtraída da absorvância total de cada clone a fim de anular toda atividade de fundo.
[001190] Os esporos para ensaios de lipases foram diluídos a 1x108 CFU/ml em água e avaliados quanto à atividade enzimática da enzima em um segundo método que utiliza o cromófoRO 4-nitrofenil palmitato (4NP, 3 mM em água). Para este método, 50 μl de esporos foram co- locados em uma placa de 96 Poços e 50 μl de uma solução 300 nM de 4NP foram adicionados a cada placa. A placa foi então incubada a 30 °C e a absorvância a 410 nm foi lida após 0,5 hora. Em todos os casos, a respectiva absorvância de controle de cepas foi subtraída da absorvância total de cada clone a fim de anular toda atividade de fundo.
[001191] Os esporos dos ensaios de fosfolipase foram diluídos a 1x108 CFU/ml em água e analisados quanto à atividade enzimática, como descrito acima, para a fosfolipase, no Exemplo 58. Em todos os casos, a respectiva absorvância de controle de cepas foi subtraída da absorvância total de cada clone a fim de anular toda atividade de fundo.
[001192] As respostas e tratamentos de crescimento de vegetais foram aplicados e coletados conforme descreve-se para a abóbora, acima, no Exemplo 58. Todas as alturas foram normalizadas em comparação a uma cepa sem enzimas mostradas nos esporos. TABELA 75: FUSÕES DE PROTEÍNAS DE REVESTIMENTO E SEUS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE ENZIMAS. N/A = Não aplicável ND = não determinado
[001193] Os dados na Tabela 75 demonstram que as proteínas de revestimento atuam amplamente em uma série de enzimas de benefício a vegetais, em membros da família Bacillus cereus (EE184, EE439) e em membros da família não Bacillus cereus (EE405, A09 e EE387, daqui e do Exemplo 65). A adição de enzimas que apresentaram esporos, a endoglucanase neste exemplo, leva a um fenótipo de maior crescimento do vegetal na maioria dos casos.
MODALIDADES
[001194] Para uma ilustração mais aprofundada, são apresentadas abaixo modalidades adicionais não limitativas da presente divulgação.
[001195] A modalidade 1 é uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou um peptídeo de interesse e: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 59; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 59; (3) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 60; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 59; (5) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 630 da SEQ ID NO: 59; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 61; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 61; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 61; (10) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 62; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 61; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 61; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 63; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 63; (17) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 64; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 63; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 63; (20) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 63; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 63; (22) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 65; (24) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 65; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 65; (26) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 66; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 107; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 65; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 67; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 67; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 67; (33) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 68; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos ds 2-27 da SEQ ID NO: 67; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 67; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 69; (38) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 69; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 69; (40) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 70; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 69; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 69; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69; (45) uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 72; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 73; (47) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO: 74; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-42 da SEQ ID NO: 75; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-42 da SEQ ID NO: 75; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 75; (51) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 76; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-42 da SEQ ID NO: 75; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75; (55) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75; (56) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 77; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 77; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 77; (61) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 78; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 77; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77; (64) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 80; (65) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 81; (66) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 81; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 81; (68) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 82; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 81; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; (73) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-34 da SEQ ID NO: 83; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 83; (76) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 84; (77) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 86; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 87; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 87; (80) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 87; (81) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 88; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 87; (83) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; (84) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 87; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 89; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 89; (87) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 90; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 89; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; (90) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 89; (91) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-93 da SEQ ID NO: 91; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 91; (93) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 92; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-93 da SEQ ID NO: 91; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91; (96) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91; (97) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 30-93 da SEQ ID NO: 91; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 93; (102) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 93; (103) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 94; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 93; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 93; (106) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93; ou (108) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 122.
[001196] A modalidade 2 é uma proteína de fusão da modalidade 1, onde a proteína de fusão compreende: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 59; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59; (3) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 6-30 da SEQ ID NO: 59; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 61; (5) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 533 da SEQ ID NO: 61; (6) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 63; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 63; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 63; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 63; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 65; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65; (15) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 67; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 67; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 69; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69; (20) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 69; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69; (22) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-42 da SEQ ID NO: 75; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75; (24) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75; (27) uma sequência de direciona-mento compreendendo aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 77; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 81; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81; (35) uma sequência de direciona-mento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 87; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; (37) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 87; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 89; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; (40) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 89; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-93 da SEQ ID NO: 91; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 3093 da SEQ ID NO: 91; (45) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91; (47) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91; (48) uma sequência de direciona-mento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 93; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10130 da SEQ ID NO: 93; (50) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93; ou (51) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93.
[001197] A modalidade 3 é uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou um peptídeo de interesse e: (1) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 1; (2) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-31 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 96; (5) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 96; (6) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 3; (7) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 3; (8) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 3; (9) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 97; (10) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (11) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 5; (12) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 5; (13) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 5; (14) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 5; (15) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 7; (16) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 7; (17) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 7; (18) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 16-24 da SEQ ID NO: 7; (19) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 9; (20) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 9; (21) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 9; (22) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 9; (23) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 105; (24) uma sequência de di-recionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 105; (25) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 11; (26) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 11; (27) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 11; (28) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 98; (29) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (30) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 13; (31) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 13; (32) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 13; (33) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 13; (34) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 99; (35) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 99; (36) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 15; (37) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 15; (38) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 29-41 da SEQ ID NO: 15; (39) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 31-39 da SEQ ID NO: 15; (40) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 17; (41) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 17; (42) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 100; (43) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 19; (44) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 19; (45) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 19; (46) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 19; (47) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 21; (48) uma sequência de di-recionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 21; (49) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 21; (50) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 21; (51) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 101; (52) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 101; (53) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 23; (54) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 23; (55) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 23; (56) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 23; (57) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 115 da SEQ ID NO: 102; (58) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 102; (59) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 25; (60) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 25; (61) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 25; (62) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 25; (63) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 103; (64) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 103; (65) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-28 da SEQ ID NO: 27; (66) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-26 da SEQ ID NO: 27; (67) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 16-28 da SEQ ID NO: 27; (68) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-26 da SEQ ID NO: 27; (69) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 104; (70) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 104; (71) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 33; (72) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-11 da SEQ ID NO: 33; (73) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 311 da SEQ ID NO: 33; (74) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-14 da SEQ ID NO: 35; (75) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-12 da SEQ ID NO: 35; (76) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 214 da SEQ ID NO: 35; (77) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-27 da SEQ ID NO: 43; (78) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 43; (79) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-27 da SEQ ID NO: 43; (80) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 45; (81) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 45; (82) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 45; (83) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 106; (84) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 113 da SEQ ID NO: 106; (85) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 47; (86) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 47; (87) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 53; (88) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 53; (89) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 53; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 61; (91) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 61; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 61; (93) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 65; (94) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 65; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 65; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 107; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 107; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 67; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 67; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 67; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 67; (102) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 69; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 69; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2436 da SEQ ID NO: 69; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 69; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-40 da SEQ ID NO: 75; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-38 da SEQ ID NO: 75; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 77; (109) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 77; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10---22 da SEQ ID NO: 77; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 77; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 81; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 81; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 81; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 81; (116) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1326 da SEQ ID NO: 87; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 87; ou (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 87.
[001198] A modalidade 4 é uma proteína de fusão que compreende uma enzima que catalisa a produção do óxido nítrico ou uma proteína de ligação de ácido nucleico ou um peptídeo e: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 43% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 54%; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 1; (5) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 2; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (11) uma sequência de dire-cionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1227 da SEQ ID NO: 3; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 3; (14) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 4; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (17) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5; (20) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 5; (22) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 6; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (25) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 7; (30) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 7; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 7; (32) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 8; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 7; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 9; (40) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 10; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO:11; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 11; (47) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 12; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (51) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (53) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13; (55) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:13; (56) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:14; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (59) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2843 da SEQ ID NO: 15; (64) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:15; (65) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:16; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (68) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (73) uma sequência de direcionamento compreen dendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:17; (76) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:18; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19; (83) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:19; (84) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:20; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (87) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21; (91) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:21; (93) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:22; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (95) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23; (100) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:23; (102) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:24; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:25; (109) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:26; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:27; (116) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:28; (117) uma sequência de dire-cionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (119) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (120) uma sequênciade direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (121) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29; (122) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29; (123) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:29; (124) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequênciade aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:30; (125) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (126) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (127) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (128) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (129) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (130) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31; (131) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31; (132) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:31; (133) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequênciade aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:32; (134) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (135) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (136) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (137) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33; (138) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:33; (139) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:34; (140) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35; (141) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:35; (142) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:36; (143) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO:43; (144) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43; (145) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 43; (146) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 44; (147) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (148) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (149) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (150) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (151) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45; (152) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45; (153) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 45; (154) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 46; (155) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (156) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (157) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (158) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (159) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (160) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47; (161) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47; (162) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 47; (163) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 48; (164) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (165) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (166) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (167) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (168) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (169) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (170) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (171) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49; (172) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49; (173) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 49; (174) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 50; (175) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (176) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (177) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (178) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (179) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (180) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51; (181) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51; (182) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 51; (183) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 52; (184) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (185) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (186) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (187) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (188) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (189) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53; (190) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53; (191) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 53; (192) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 54; (193) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (194) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (195) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (196) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (197) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (198) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55; (199) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55; (200) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 55; (201) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 56; (202) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (203) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (204) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (205) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (206) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57; (207) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57; (208) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 57; (209) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 58; (210) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (211) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5130 da SEQ ID NO: 57; (212) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (213) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (214) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (215) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (216) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (217) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (218) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (219) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (220) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (221) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (222) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (223) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 95; (224) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 96; (225) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 97; (226) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 98; (227) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 99; (228) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 100; (229) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 101; (230) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 102; (231) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 103; (232) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 104; (233) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 105; (234) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 106; (235) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 108; (236) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 109; (237) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 110; (238) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 111; (239) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 112; (240) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 113; (241) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 114; (242) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 115; (243) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 116; (244) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 117; (245) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 118; (246) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 119; (247) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 120; (248) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 121; (249) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; (250) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; (251) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; (252) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-23 da SEQ ID NO: 3; (253) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1425 da SEQ ID NO: 3; ou (254) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3.
[001199] A modalidade 5 é uma proteína de fusão que compreende um antígeno ou uma enzima de reparação e: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 535 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (5) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1423 da SEQ ID NO: 3; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 3; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5; (20) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; (21) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (22) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (23) uma sequência de direci onamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 7; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 9; (29) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 10; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO:11; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1833 da SEQ ID NO: 11; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 11; (36) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 12; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (40) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:13; (45) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:14; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (47) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (51) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:15; (54) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:16; (55) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (56) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17; (64) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:17; (65) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:18; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (67) uma sequência de direcio-namento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (68) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (69) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:19; (73) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:20; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (76) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21; (80) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:21; (82) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:22; (83) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (84) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (85) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (87) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23; (89) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:23; (91) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:24; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (93) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:25; (98) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:26; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (102) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:27; (105) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:28; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (109) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:29; (113) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:30; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (116) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (119) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31; (120) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31; (121) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:31; (122) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:32; (123) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (124) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (125) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (126) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33; (127) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:33; (128) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:34; (129) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35; (130) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:35; (131) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:36; (132) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO:43; (133) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43; (134) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 43; (135) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 44; (136) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (137) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (138) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (139) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (140) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45; (141) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45; (142) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 45; (143) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 46; (144) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (145) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (146) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (147) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (148) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (149) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47; (150) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47; (151) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 47; (152) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 48; (153) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (154) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (155) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (156) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (157) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (158) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (159) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (160) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49; (161) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49; (162) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 49; (163) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 50; (164) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (165) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (166) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (167) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (168) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (169) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51; (170) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51; (171) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 51; (172) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 52; (173) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (174) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (175) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (176) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (177) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (178) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53; (179) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53; (180) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 53; (181) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 54; (182) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (183) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (184) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (185) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (186) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (187) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55; (188) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55; (189) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 55; (190) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 56; (191) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (192) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (193) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (194) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (195) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57; (196) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57; (197) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 57; (198) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 58; (199) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (200) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5130 da SEQ ID NO: 57; (201) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (202) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (203) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (204) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (205) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (206) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (207) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (208) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (209) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (210) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (211) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (212) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 97; (213) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 98; (214) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 99; (215) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 100; (216) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 101; (217) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 102; (218) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 103; (219) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 104; (220) uma sequênciade direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 105; (221) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 106; (222) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 108; (223) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 109; (224) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequênciade aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 110; (225) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 111; (226) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 112; (227) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 113; (228) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 114; (229) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 115; (230) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 116; (231) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 117; (232) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 118; (233) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 119; (234) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 120; ou (235) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 121.
[001200] A modalidade 6 é a proteína de fusão de qualquer uma das modalidade de 1-3, onde a proteína ou o peptídeo de interesse com-preendem um antígeno ou uma enzima de reparação.
[001201] A modalidade 7 é a proteína de fusão de qualquer uma das modalidades de 1-3, onde a proteína ou o peptídeo de interesse com-preendem uma enzima adequada para quebra de uma emulsão ou gel em um fluido hidráulico de fratura ou um peptídeo ou uma proteína antibacterianos.
[001202] A modalidade 8 é uma proteína de fusão que compreende uma enzima adequada para a quebra de uma emulsão ou de um gel em um fluido hidráulico de fratura ou um peptídeo ou uma proteína antibacteriana e: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 43% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 54%; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 1; (5) uma proteína do exosporium compre-endendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 2; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1535 da SEQ ID NO: 1; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 3; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 3; (14) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 4; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5; (20) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2338 da SEQ ID NO: 5; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 5; (22) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 6; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (26) uma sequência de direci-onamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1538 da SEQ ID NO: 5; (28) uma sequência de direcionamento compre-endendoaminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 7; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 7; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 7; (32) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 8; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (35) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 7; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9; (38) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 9; (40) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 10; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO:11; (45) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 11; (47) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 12; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (51) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13; (55) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:13; (56) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:14; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15; (63) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15; (64) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:15; (65) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:16; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (68) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (72) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (73) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:17; (76) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:18; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19; (83) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:19; (84) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:20; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (87) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21; (91) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:21; (93) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:22; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (96) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:23; (102) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:24; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (105) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:25; (109) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:26; (110) uma sequência de direciona-mento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:27; (116) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:28; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (119) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (120) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (121) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29; (122) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29; (123) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:29; (124) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:30; (125) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (126) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (127) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (128) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (129) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (130) uma sequência de direcionamento compreen dendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31; (131) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31; (132) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:31; (133) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:32; (134) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (135) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (136) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (137) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33; (138) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:33; (139) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:34; (140) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35; (141) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:35; (142) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:36; (143) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO:43; (144) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43; (145) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 43; (146) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 44; (147) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (148) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (149) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (150) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (151) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45; (152) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45; (153) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 45; (154) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 46; (155) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (156) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (157) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (158) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (159) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (160) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47; (161) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47; (162) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 47; (163) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 48; (164) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (165) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (166) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (167) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (168) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (169) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (170) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (171) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49; (172) uma sequência de direcionamento compre-endendo aminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49; (173) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 49; (174) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 50; (175) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (176) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (177) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (178) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (179) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (180) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51; (181) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51; (182) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 51; (183) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 52; (184) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (185) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (186) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (187) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (188) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (189) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53; (190) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53; (191) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 53; (192) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 54; (193) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (194) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (195) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (196) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (197) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (198) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55; (199) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55; (200) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 55; (201) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 56; (202) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (203) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (204) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (205) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (206) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57; (207) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57; (208) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 57; (209) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 58; (210) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (211) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5130 da SEQ ID NO: 57; (212) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (213) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (214) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (215) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (216) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (217) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (218) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (219) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (220) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (221) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (222) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (223) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 95; (224) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 96; (225) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 97; (226) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 98; (227) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 99; (228) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 100; (229) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 101; (230) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 102; (231) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 103; (232) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 104; (233) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 105; (234) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 106; (235) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 108; (236) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 109; (237) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 110; (238) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 111; (239) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 112; (240) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 113; (241) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 114; (242) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 115; (243) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 116; (244) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 117; (245) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 118; (246) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 119; (247) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 120; (248) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 121; (249) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; (250) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; (251) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; (252) uma sequência de direciona-mento compreendendo aminoácidos 14-23 da SEQ ID NO: 3; (253) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1425 da SEQ ID NO: 3; ou (254) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3.
[001203] A modalidade 9 é a proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 5-8, em que a sequência de direcionamento compreende: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 235 da SEQ ID NO: 1; (2) uma sequência de direcionamento compre-endendoaminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (5) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (8) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (13) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (16) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 7; (20) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (22) uma sequência de direci-onamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (28) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (33) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (38) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (40) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (42) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (47) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (51) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (55) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (56) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (60) uma sequência de direcionamento com preendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (64) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (65) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (68) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (69) uma se-quênciade direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (70) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (73) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (76) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (78) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (83) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (84) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (87) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (91) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (93) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (100) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (102) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (106) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-130 da SEQ ID NO: 57; (109) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20130 da SEQ ID NO: 57; (111) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (113) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (116) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; ou (119) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110130 da SEQ ID NO: 57.
[001204] A modalidade 10 é a proteína de fusão da modalidade 9, em que a sequência de direcionamento compreende: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (5) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (6) uma sequência de direci-onamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1033 da SEQ ID NO: 11; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (11) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (20) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (22) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (24) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1033 da SEQ ID NO: 19; (29) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1033 da SEQ ID NO: 21; (34) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (39) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (40) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (42) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (47) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (51) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (55) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (56) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (64) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (65) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (68) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (69) uma se quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (73) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (74) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (76) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (79) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (83) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (84) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (87) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (89) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-130 da SEQ ID NO: 57; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (91) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (93) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; ou (100) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57.
[001205] A modalidade 11 é a proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 5-10, em que a sequência de direcionamento compreende: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (5) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1533 da SEQ ID NO: 11; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (11) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (16) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (20) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (21) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (22) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (26) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (30) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1030 da SEQ ID NO: 27; (35) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (40) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (43) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (47) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1535 da SEQ ID NO: 45; (48) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (51) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2043 da SEQ ID NO: 47; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (55) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (56) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1532 da SEQ ID NO: 49; (58) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (63) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (64) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (65) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (67) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (68) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-130 da SEQ ID NO: 57; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (73) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (76) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (78) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 6-30 da SEQ ID NO: 59; (83) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 61; (84) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 63; (87) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 63; (88) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 63; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65; (91) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67; (92) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 67; (93) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 69; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75; (97) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77; (102) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1028 da SEQ ID NO: 87; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; (109) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 89; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-93 da SEQ ID NO: 91; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91; (116) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 93; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93; ou (118) uma sequência de direcio-namento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93.
[001206] A modalidade 12 é a proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 5 e 9-11, em que a proteína ou o peptídeo de interesse compreendem o antígeno.
[001207] A modalidade 13 é a proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 5 e 9-11, em que a proteína ou o peptídeo de interesse compreendem a enzima de reparação.
[001208] A modalidade 14 é a proteína de fusão de qualquer uma das modalidades de 7-11, onde a proteína ou o peptídeo de interesse compreendem uma enzima adequada para quebra de uma emulsão ou gel em um fluido hidráulico de fratura.
[001209] A modalidade 15 é a proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 7-11, em que a proteína ou o peptídeo de interesse compreendem a proteína ou o peptídeo antibacterianos.
[001210] A modalidade 16 é um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 1-15.
[001211] A modalidade 17 é um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa: (i) uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou um peptídeo de interesse e uma sequência de direciona-mento, uma proteína do exosporium ou um fragmento da proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante; e (ii) uma proteína moduladora, onde a expressão da proteína moduladora é aumentada em comparação à expressão da proteína moduladora em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições; e em que a co-expressão da proteína moduladora com a proteína de fusão no membro da família Bacillus cereus recombinante resulta em aumento ou diminuição da expressão da proteína de fusão em compa-ração com o nível de expressão da proteína de fusão recombinante num membro da família Bacillus cereus recombinante que não expressa a proteína moduladora a um aumento do nível sob as mesmas condições, em comparação com a expressão da proteína moduladora membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem.
[001212] A modalidade 18 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 17, em que a proteína moduladora com-preende uma proteína ExsY, uma proteína ExsFA/BxpB, uma proteína Coty, uma proteína Coto, uma proteína ExsFB, uma proteína InhA1, uma proteína InhA2, uma proteína ExsJ, uma proteína ExsH, uma proteína YjcA, uma proteína YjcB, uma proteína BCLC, uma proteína CCCC, uma proteína InhA3, uma alanina racemase 1, uma alanina racemase 2, uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína BxpA, uma proteína BclE, uma proteína betA/baS3290, uma proteína Cote, uma eXSA proteína, uma proteína ExsK, uma proteína ExsB, uma proteína YabG, uma proteína Tgl, uma proteína SODA1, uma proteína SODA2, uma variante de qualquer uma das mesmas ou uma combinação delas.
[001213] A modalidade 19 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 17 ou 18, em que a proteína moduladora, quando co-expressa com a proteína de fusão no membro da família Bacillus cereus recombinante, resulta em aumento ou diminuição da expressão da proteína de fusão em comparação com o nível de ex-pressão da proteína de fusão em um membro da família Bacillus cereus recombinante que não expressa a proteína moduladora a um nível aumentado sob as mesmas condições, em comparação com a expressão da proteína moduladora num membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem.
[001214] A modalidade 20 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 19, em que a proteína moduladora com-preende uma proteína BclB, uma proteína CotE, uma proteína BxpB, uma proteína CotO, uma proteína BclA, uma variante de qualquer uma destas ou uma combinação delas.
[001215] A modalidade 21 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 17 ou 18, onde a proteína moduladora, quando co-expressa com a proteína de fusão no membro da família Bacillus cereus recombinante, resulta em uma diminuição da expressão da proteína de fusão em comparação com o nível de expressão da proteína de fusão num membro da família Bacillus cereus recombinante que não expressa a proteína moduladora a um aumento do nível sob as mesmas condições, em comparação com a expressão da proteína moduladora num membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem.
[001216] A modalidade 22 é um membro da família Bacillus cereus da modalidade 21, onde a proteína moduladora compreende uma proteína de BclC, uma proteína de ApcC, uma proteína de YjcB, um variante de qualquer uma destas ou uma combinação delas.
[001217] A modalidade 23 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 17 ou 18, em que a proteína moduladora compreende uma proteína de CotO, uma proteína de BclB, uma proteína de ExsFA/BxpB, uma proteína de YjcB, uma variante ou uma com-binação de qualquer uma das anteriores.
[001218] A modalidade 24 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades de 17-23, onde a pro-teína moduladora compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos, 99% ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs:123- 156.
[001219] A modalidade 25 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades de 17-24, onde a pro-teína moduladora compreende a SEQ ID NO: 124, 126, 134, 135, 143 ou 144.
[001220] A modalidade 26 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades de 17-25, compreen-dendo um vetor que codifica a proteína moduladora.
[001221] A modalidade 27 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 26, onde o vetor compreende um vetor de plasmídeo de múltiplas cópias.
[001222] A modalidade 28 é um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante; onde o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação que desativa total ou parcialmente os esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante ou tornam os esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante mais suscetíveis à desativação física ou química em comparação aos mesmos esporos que não compreendem a mutação e onde a mutação compreende uma mutação em um gene que codifica um receptor de germinação, uma mutação em um gene que codifica a enzima lítica do córtex do esporo, uma mutação em um gene que codifica uma proteína de esporo solúvel em ácido pequena (SASP) ou uma mutação em um gene que codifica um revestimento de esporo ou proteína de córtex.
[001223] A modalidade 29 é um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão de qualquer modalidade de 1-15; onde o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação que desativa total ou parcialmente os esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante ou torna os esporos da família Bacillus cereus recombinante mais suscetíveis à desativação física ou química em comparação aos mesmos esporos que não compreendem a mutação.
[001224] A modalidade 30 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus que expressa uma protease ou uma nuclease, em que a ex-pressão da protease ou a nuclease é aumentada em comparação com a expressão da protease ou a nuclease de um tipo selvagem de bactéria do gênero Bacillus sob as mesmas condições, e em que o aumento da expressão da protease ou a nuclease parcialmente ou completamente inativa os esporos da bactéria recombinante do gênero Bacillus ou torna esporos da bactéria recombinante do gênero Bacillus mais suscetíveis à inativação química ou física.
[001225] A modalidade 31 é uma bactéria recombinante da modalidade 30, onde a bactéria recombinante do gênero Bacilluscompreende um membro da família Bacillus cereus recombinante.
[001226] A modalidade 32 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus da modalidade 30 ou 31, onde a bactéria recombinante do gê-neroBacillus expressa uma protease e uma nuclease, em que a ex-pressão da protease é aumentada em comparação com a expressão da protease da bactéria do gênero Bacillus de tipo selvagem sob as mesmas condições e a expressão da nuclease é aumentada em comparação com a expressão da nuclease em uma bactéria do gênero Bacillus de tipo selvagem sob as mesmas condições.
[001227] A modalidade 33 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus de qualquer modalidade de 30-32, onde a protease compreende uma protease não específica.
[001228] A modalidade 34 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus de qualquer modalidade de 30-33, em que a protease com-preende uma serina protease, uma treonina protease, uma cisteína protease, um aspartato protease, uma protease de ácido glutâmico, uma protease alcalina, uma subtilisina, uma histidina protease ou uma metaloprotease.
[001229] A modalidade 35 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus de qualquer modalidade dentre 30, 32 e 34, onde a protease compreende uma protease de esporos de germinação.
[001230] A modalidade 36 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus da modalidade 35, onde a protease de esporos de germinação compreende uma forma ativa da protease de esporos de germinação.
[001231] A modalidade 37 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus da modalidade 35 ou 36, onde a protease de esporos de ger-minação compreende uma protease de esporos de germinação Bacillus subtilis, uma protease de esporos de germinação Bacillus mycoides ou uma protease de esporos de germinação Bacillus thuringiensis.
[001232] A modalidade 38 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus de uma das modalidades 35-37, onde a protease de esporos de germinação compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 233 ou 234.
[001233] A modalidade 39 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus de qualquer modalidade de 30-38, onde a nuclease compreende uma endonuclease ou uma exonuclease.
[001234] A modalidade 40 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus da modalidade 39, em que a nuclease compreende uma en-donuclease não específica.
[001235] A modalidade 41 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus da modalidade 40, em que a endonuclease não específica compreende uma endonuclease 1 do Bacillus subtilis.
[001236] A modalidade 42 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus da modalidade 40 ou 41, em que a endonuclease não específica compreende um aminoácido que possui pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 232.
[001237] A modalidade 43 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus de qualquer modalidade de 30-42, onde a nuclease ou protease é expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de promotores de sigma G.
[001238] A modalidade 44 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus da modalidade 43, onde o promotor compreende uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com uma sequência de ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 235-246.
[001239] A modalidade 45 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus de qualquer modalidade de 30-44, onde os esporos da bactéria recombinante do gênero Bacillussão mais suscetíveis à desativação por radiação ultravioleta, radiação gama ou por tratamento com lixívia, peróxido de hidrogênio, clorofórmio, fenol ou ácido acético em comparação com os mesmos esporos que não expressam a protease ou a nuclease a um nível maior em comparação a uma expressão da protease ou da nuclease em uma bactéria de tipo selvagem do gênero Bacillus, tratada sob as mesmas condições.
[001240] A modalidade 46 é um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão de qualquer moda-lidade de 31-45; onde o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação que desativa total ou parcialmente os esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante ou torna os esporos da família Bacillus cereus recombinante mais suscetíveis à desativação física ou química em comparação aos mesmos esporos que não compreendem a mutação.
[001241] A modalidade 47 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 46, em que a mutação compreende uma mutação num gene que codifica um receptor de germinação, uma mu-tação num gene que codifica uma enzima lítica de córtex de esporos, uma mutação num gene que codifica a pequena proteína solúvel em ácido do esporo (SASP), ou uma mutação num gene que codifica um revestimento de esporos ou proteína córtex.
[001242] A modalidade 48 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 28, 29 ou 47, onde a mutação compreende uma mutação em um gene que codifica um receptor de germinação.
[001243] A modalidade 49 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 48, onde a mutação no gene que codifica o receptor de germinação compreende uma mutação de nocaute do gene que codifica o receptor de germinação.
[001244] A modalidade 50 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 48 ou 49, onde o receptor de germinação compreende GerA, GerB, GerK, GerH, GerI, GerG, GerL, GerQ, GerR, GerS, GerN, GerU ou GerX.
[001245] A modalidade 51 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer modalidade dentre 28, 29 e 47-50, onde a mutação compreende uma mutação em um gene que codifica uma en-zimalítica do córtex do esporo.
[001246] A modalidade 52 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 51, onde a mutação no gene que codifica a enzima lítica do córtex do esporo compreende uma mutação de nocaute do gene que codifica a enzima lítica do córtex do esporo.
[001247] A modalidade 53 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 51 ou 52, em que a enzima lítica do córtex do esporo compreende SleB ou CwlJ.
[001248] A modalidade 54 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer modalidade dentre 28, 29 e 47-53, onde a mutação compreende uma mutação em um gene que codifica SASP.
[001249] A modalidade 55 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 54, onde a mutação no gene que codifica a SASP compreende uma mutação de nocaute do gene que codifica a SASP.
[001250] A modalidade 56 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 54 ou 55, em que a mutação no gene que codifica a SASP compreende uma mutação em um gene SspA, uma mutação em um gene SspB, uma mutação em um gene SspC, uma mutação em um gene SspD, uma mutação em um gene SspE, uma mutação em um gene SspF, uma mutação em um gene SspG, uma mutação em um gene SspH, uma mutação em um gene SspI, uma mutação em um gene SspJ, uma mutação em um gene SspL, uma mutação em um gene SspM, uma mutação em um gene SspN, uma mutação em um gene SspO, uma mutação em um gene SspP ou uma combinação dos anteriores.
[001251] A modalidade 57 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades de 54-56, em que a SASP compreende SASPα, SASPβ ou SASPY.
[001252] A modalidade 58 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de uma das modalidades 54-57, onde os esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante são mais suscetíveis à desativação por radiação ultravioleta ou gama em comparação aos mesmos esporos que não compreendem a mutação no gene que codifica a SASP.
[001253] A modalidade 59 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer modalidade dentre 28, 29 e 47-58, onde a mutação compreende uma mutação em um gene que codifica um re-vestimento de esporo ou proteína de córtex.
[001254] A modalidade 60 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 59, onde a mutação do que gene codifica o revestimento do esporo ou a proteína do córtex compreende uma mutação de nocaute do gene que codifica o revestimento do esporo ou a proteína do córtex.
[001255] A modalidade 61 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 59 ou 60, onde o revestimento do esporo ou a proteína do córtex compreende CotA, CotB ou CotC.
[001256] A modalidade 62 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de uma das modalidades de 59-61, onde os esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante são mais suscetíveis à desativação por radiação ultravioleta, radiação gama ou por meio de tratamento com lixívia, peróxido de hidrogênio, clorofórmio, fenol ou ácido acético em comparação com os mesmos esporos que não compreendem a mutação no revestimento do esporo ou na proteína do córtex, tratados sob as mesmas condições.
[001257] A modalidade 63 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de uma das modalidades de 31-62, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante também expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou um peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante.
[001258] A modalidade 64 é um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína do exosporium é fornecido, em que a expressão da proteína do exosporium é aumentada em comparação com a expressão da proteína num exosporium de mem bro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condi-ções e onde a proteína do exosporium compreende: uma enzima exosporium, em que a enzima compreende uma enzima exosporium envolvida na solubilização de nutrientes, uma hidrolase de inosina-uridina, uma protease, uma enzima que catalisa a degradação de um radical livre, uma arginase, ou uma alanina racemase; ou uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína Cote uma proteína Coto, uma proteína ExsY, uma proteína ExsFA/BxpB, uma proteína Coty, uma proteína ExsFB, uma proteína ExsJ, uma proteína ExsH, um YjcA proteína, uma proteína YjcB, uma proteína BCLC, uma proteína BxpA, uma proteína BclE, uma prOTEÍna beta/BAS3290, uma proteína eXSA, uma proteína ExsK, uma proteína ExsB, uma proteína YabG ou uma proteína Tgl.
[001259] A modalidade 65 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 64, onde a proteína do exosporium não faz parte da proteína de fusão.
[001260] A modalidade 66 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 64 ou 65, onde a proteína do exosporium compreende uma enzima de exosporium, onde a enzima de exosporium compreende uma enzima envolvida na solubilização de nutrientes, uma inosina-uridina hidrolase, uma protease, uma enzima que catalisa a degradação de um radical livre, uma arginase ou uma alanina racemase.
[001261] A modalidade 67 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 66, em que a enzima envolvida na solubilização de nutrientes compreende uma enzima envolvida na solubilização de fosfato.
[001262] A modalidade 68 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 67, em que a enzima envolvida na solubilização de fosfato compreende uma fosfatase ácida.
[001263] A modalidade 69 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 68, onde a fosfatase ácida compreende AcpC.
[001264] A modalidade 70 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 68 ou 69, em que a fosfatase ácida com-preende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 137.
[001265] A modalidade 71 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 64 ou 65, em que a enzima de exosporium compreende uma inosina-uridina hidrolase.
[001266] A modalidade 72 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 71, onde a inosina-uridina hidrolase compreende IunH1 ou IunH2.
[001267] A modalidade 73 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 71 ou 72, em que a inosina-uridina hidrolase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 250 ou 251.
[001268] A modalidade 74 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 64 ou 65, em que a enzima de exosporium compreende uma protease.
[001269] A modalidade 75 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 74, em que a protease compreende uma metaloprotease.
[001270] A modalidade 76 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 75, onde a metaloprotease compreende InhA1, InhA2 ou InhA3.
[001271] A modalidade 77 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 75 ou 76, onde a metaloprotease com-preende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade com a SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130 ou 138.
[001272] A modalidade 78 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 64 ou 65, onde a enzima que catalisa a degradação de um radical livre compreende um superóxido dismutase.
[001273] A modalidade 79 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 78, onde a superóxido dismutase com-preendesuperóxido dismutase 1 (SODA1) ou superóxido dismutase 2 (SODA2).
[001274] A modalidade 80 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 78 ou 79, em que a superóxido dismutase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[001275] A modalidade 81 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 64 ou 65, em que a enzima de exosporium compreende uma arginase.
[001276] A modalidade 82 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 82, onde a arginase compreende uma arginase do Bacillus thuringiensis.
[001277] A modalidade 83 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 81 ou 82, em que a arginase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 249.
[001278] A modalidade 84 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 64 ou 65, em que a enzima de exosporium compreende uma alanina racemase.
[001279] A modalidade 85 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 84, onde a alanina racemase compreende uma alanina racemase 1 (ALR1) ou alanina racemase 2 (ALR2).
[001280] A modalidade 86 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 84 ou 85, em que a arginase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 247 ou 248.
[001281] A modalidade 87 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 64 ou 65, onde a proteína do exosporium pode compreender uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína Cote uma proteína Coto, uma proteína ExsY, uma proteína ExsFA/BxpB, uma proteína Coty, uma proteína ExsFB, uma proteína ExsJ, uma proteína ExsH, um YjcA proteína, uma proteína YjcB, uma proteína BCLC, uma proteína BxpA, uma proteína BclE, uma prOTEÍna beta/BAS3290, uma proteína eXSA, uma proteína ExsK, uma proteína ExsB, uma proteína YabG ou uma proteína Tgl.
[001282] A modalidade 88 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 87, onde a proteína do exosporium com-preende uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína CotE ou uma proteína CotO.
[001283] A modalidade 89 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 87 ou 88, em que a proteína do exosporium compreende uma proteína BclA.
[001284] A modalidade 90 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 89, em que a proteína BclA compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 141 ou 142.
[001285] A modalidade 91 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 87 ou 88, em que a proteína do exosporium compreende uma proteína BclB.
[001286] A modalidade 92 é um membro da família Bacillus cereus da modalidade 91, em que a proteína BclB compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 143 ou 144.
[001287] A modalidade 93 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 87 ou 88, em que a proteína do exosporium compreende uma proteína BclA.
[001288] A modalidade 94 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 93, em que a proteína CotE compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 149.
[001289] A modalidade 95 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 87 ou 88, em que a proteína do exosporium compreende uma proteína CotO.
[001290] A modalidade 96 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 95, em que a proteína CotO compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 126.
[001291] A modalidade 97 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 87, onde a proteína do exosporium pode compreender uma proteína ExsY, uma proteína ExsFA/BxpB, uma pro-teína Coty, uma proteína ExsFB, uma proteína ExsJ, uma proteína ExsH, um YjcA proteína, uma proteína YjcB, uma proteína BCLC, uma proteína BxpA, uma proteína BclE, uma prOTEÍna beta/BAS3290, uma proteína eXSA, uma proteína ExsK, uma proteína ExsB, uma proteína YabG ou uma proteína Tgl.
[001292] Uma modalidade 98 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 97, onde a proteína do exosporium compreende: uma proteína ExsY, onde a proteína ExsY pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 123; uma proteína ExFA/BxpB, onde a proteína ExFA/BxpB compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 124; uma proteína CotY, onde a proteína CotY compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 125; uma proteína ExsFB, onde a proteína ExsFB pode compre-ender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 127 ou 128; uma proteína ExsJ, onde a proteína ExsJ pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 131; uma proteína ExsH, onde a proteína ExsH pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 132; uma proteína YjcA, onde a proteína YjcA compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 133; uma proteína YjcB, onde a proteína YjcB compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 134 ou 135; uma proteína BclC, onde a proteína BclC compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 136; uma proteína BxpA, onde a proteína BxpA compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 145; uma proteína BclE, onde a proteína BclE compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 146 ou 147; uma proteína BetA/BAS3290, onde a proteína BetA/BAS3290 compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 148; uma proteína ExsA, onde a proteína ExsA pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 150; uma proteína ExsK, onde a proteína ExsK pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 151; uma proteína ExsB, onde a proteína ExsB pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 152; uma proteína YabG, onde a proteína YabG compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 153; ou uma proteína Tjl, onde a proteína Tjl compreende uma se-quência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 156.
[001293] A modalidade 99 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de uma das modalidades de 64-98, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante também expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou um peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante.
[001294] A modalidade 100 é um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou um peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, uma proteína do exosporium ou um fragmento da proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante; em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação ou expressa uma proteína, onde a expressão da proteína é aumentada em comparação à expressão da proteína em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições e onde a mutação ou a maior expressão da proteína resulta em esporos de Bacillus cereus com um exosporium que é mais fácil de se remover do esporo em comparação ao exosporium de um esporo de tipo selvagem.
[001295] A modalidade 101 é um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante; em que o membro da família Bacillus cereus recombinante: (i) compreende uma mutação em um gene CotE; (ii) expressa uma proteína de ExsY, em que a expressão da proteína ExsY é aumentada em comparação com a expressão da pro-teína em uma proteína ExsY em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições e em que a proteína ExsY compreende uma marcação de terminal carboxi que compreende uma proteína globular; (iii) expressa uma proteína BclB, onde a expressão da pro-teína BclB é aumentada em comparação à expressão da proteína BclB em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições; (iv) expressa uma proteína YjcB, onde a expressão da pro-teína YjcB é aumentada em comparação à expressão da proteína YjcB em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições; (v) compreende uma mutação em um gene ExsY; (vi) compreende uma mutação em um gene CotY; (vii) compreende uma mutação em um gene ExsA; ou (viii) compreende uma mutação em um gene CotO.
[001296] A modalidade 102 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 100 ou 101, onde o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação em um gene CotE.
[001297] A modalidade 103 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 102, onde a mutação no gene CotE inibe parcial ou completamente a capacidade de CotE de ligar o exosporium ao esporo.
[001298] A modalidade 104 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 102 ou 103, onde a mutação no gene CotE compreende um nocaute do gene CotE ou uma forma negativa dominante do gene CotE.
[001299] A modalidade 105 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades de 100-104, onde o membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína ExsY, em que a pressão da proteína ExsY é aumentada em comparação à expressão da proteína ExsY em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições e onde a proteína ExsY compreende uma marcação de terminal carboxi que compreende uma proteína globular.
[001300] A modalidade 106 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 105, onde a proteína globular tem um peso molecular entre 25 kDa e 100 kDa.
[001301] A modalidade 107 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 105 ou 106, onde a proteína globular compreende uma proteína fluorescente verde (GFP) ou uma variante sua.
[001302] A modalidade 108 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de uma das modalidades de 105-107, onde a expressão da proteína ExsY que compreende a marcação de terminal carboxi que compreende uma proteína globular inibe a ligação da proteína ExsY ao seu alvo no exosporium.
[001303] A modalidade 109 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de uma das modalidades de 100-108, onde o membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína BclB, onde a expressão da proteína BclB é aumentada em comparação à expressão da proteína BclB em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições.
[001304] A modalidade 110 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 109, onde a expressão da proteína BclB resulta na formação do exosporium frágil.
[001305] A modalidade 111 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de uma das modalidades de 100-110, onde o membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína YjcB, onde a expressão da proteína YjcB é aumentada em comparação à expressão da proteína YjcB em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições.
[001306] A modalidade 112 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 111, onde a expressão da proteína YjcB faz com que o exosporium se forme em pedaços em vez de em uma estrutura completa.
[001307] A modalidade 113 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades de 100-112, onde o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação do gene ExsY.
[001308] A modalidade 114 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 113, onde a mutação no gene ExsY inibe total ou parcialmente a capacidade do EsY de completar a formação do exosporium ou de ligar o exosporium ao esporo.
[001309] A Modalidade 115 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 113 ou 114, em que a mutação no gene ExsY compreende um nocaute do gene ExsY.
[001310] A modalidade 116 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades de 100-115, onde o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação do gene CotY.
[001311] A modalidade 117 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 116, em que a mutação no gene CotY compreende um nocaute do gene CotY.
[001312] A modalidade 118 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 116 ou 117, onde a mutação no gene CotY resulta na formação de um exosporium frágil.
[001313] A modalidade 119 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades de 100-118, onde o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação do gene ExsA.
[001314] A modalidade 120 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 119, em que a mutação no gene ExsA compreende um nocaute do gene ExsA.
[001315] A modalidade 112 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 119 ou 120, onde a mutação no gene ExsA resulta na formação de um exosporium frágil.
[001316] A modalidade 122 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades de 100-121, onde o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação do gene CotO.
[001317] A modalidade 123 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 122, onde a mutação no gene CotO compreende um nocaute do gene CotO ou uma forma negativa dominante do gene CotO.
[001318] A modalidade 124 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 122 ou 123, em que a mutação no gene CotO faz com que o exosporium se forme em tiras.
[001319] A modalidade 125 é um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão para o exosporium membro da família Bacillus cereus recombinante, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias endofíticas, uma cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida ou uma cepa de bactérias probióticas.
[001320] A Modalidade 126 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 125, em que a cepa de bactérias endofíticas compreende o membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977) ou Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) ou Bacillus mycoides EEB00363 (NRRL B-67121).
[001321] A Modalidade 127 é um membro da família Bacillus cereus da modalidade 125, em que a cepa de bactérias endofíticas compreende membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001322] A Modalidade 128 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 125, em que a cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida compreende um membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001323] A Modalidade 129 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 125, em que a cepa de bactérias endofíticas compreende o membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979) ou Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977).
[001324] A modalidade 130 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de uma das modalidades de 16-28, 48-63 e 99-129, em que a sequência de direcionamento, a proteína do exosporium ou o fragmento de proteína do exosporium compreendem: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 43% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 54%; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 1; (5) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 2; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 235 da SEQ ID NO: 1; (7) uma sequência de direcionamento compre endendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (10) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 3; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 3; (14) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 4; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (17) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5; (20) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 5; (22) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 6; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (25) uma sequência de direcionamento com-preendendoaminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 7; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 7; (31) uma sequência de dire-cionamento compreendendo SEQ ID NO: 7; (32) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 8; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 7; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 9; (40) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 10; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO:11; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 11; (47) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 12; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (51) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (53) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13; (55) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:13; (56) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:14; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (59) uma sequência de direcionamento com-preendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2843 da SEQ ID NO: 15; (64) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:15; (65) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:16; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (68) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (72) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (73) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:17; (76) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:18; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19; (83) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:19; (84) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:20; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (87) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21; (91) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21; (92) uma sequência de direcionamento compreen- dendo SEQ ID NO:21; (93) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:22; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:23; (102) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:24; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:25; (109) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:26; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:27; (116) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:28; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (119) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (120) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (121) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29; (122) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29; (123) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:29; (124) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:30; (125) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (126) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (127) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (128) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (129) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (130) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31; (131) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31; (132) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:31; (133) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:32; (134) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (135) uma sequência de direci-onamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (136) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (137) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33; (138) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:33; (139) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:34; (140) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35; (141) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:35; (142) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:36; (143) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO:43; (144) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43; (145) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 43; (146) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 44; (147) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (148) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (149) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (150) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (151) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45; (152) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45; (153) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 45; (154) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 46; (155) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (156) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (157) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (158) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (159) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (160) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47; (161) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47; (162) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 47; (163) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 48; (164) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (165) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (166) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (167) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (168) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (169) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (170) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (171) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49; (172) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49; (173) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 49; (174) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 50; (175) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (176) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (177) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (178) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (179) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (180) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51; (181) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51; (182) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 51; (183) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 52; (184) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (185) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (186) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (187) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (188) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (189) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53; (190) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53; (191) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 53; (192) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 54; (193) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (194) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (195) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (196) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (197) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (198) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55; (199) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55; (200) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 55; (201) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 56; (202) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (203) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (204) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (205) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (206) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57; (207) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57; (208) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 57; (209) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 58; (210) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (211) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5130 da SEQ ID NO: 57; (212) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (213) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (214) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (215) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (216) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (217) uma sequência de direcio-namento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (218) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (219) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (220) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (221) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (222) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (223) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 95; (224) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 96; (225) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 97; (226) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 98; (227) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 99; (228) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 100; (229) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 101; (230) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 102; (231) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 103; (232) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 104; (233) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 105; (234) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 106; (235) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 108; (236) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 109; (237) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 110; (238) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 111; (239) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 112; (240) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 113; (241) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 114; (242) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 115; (243) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 116; (244) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 117; (245) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 118; (246) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 119; (247) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 120; (248) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 121; (249) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; (250) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; (251) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; (252) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-23 da SEQ ID NO: 3; (253) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1425 da SEQ ID NO: 3; (254) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3; (255) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 59; (256) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 59; (257) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 60; (258) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 59; (259) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59; (260) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 6-30 da SEQ ID NO: 59; (261) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 61; (262) uma sequênciade direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 61; (263) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 61; (264) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 62; (265) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 61; (266) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 61; (267) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61; (268) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61; (269) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 63; (270) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 63; (271) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 64; (272) uma sequênciade direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 63; (273) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 63; (274) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 63; (275) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 63; (276) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63; (277) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 65; (278) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 65; (279) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 65; (280) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 66; (281) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 107; (282) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 65; (283) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65; (284) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 67; (285) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 67; (286) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 67; (287) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 68; (288) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 67; (289) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67; (290) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 67; (291) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 69; (292) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 69; (293) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 69; (294) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 70; (295) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 69; (296) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69; (297) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 69; (298) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69; (299) uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 72; (300) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 73; (301) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO: 74; (302) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-42 da SEQ ID NO: 75; (303) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-42 da SEQ ID NO: 75; (304) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 75; (305) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 76; (306) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-42 da SEQ ID NO: 75; (307) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75; (308) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75; (309) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75; (310) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75; (311) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75; (312) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 77; (313) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 77; (314) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 77; (315) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 78; (316) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 77; (317) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77; (318) uma pro-teína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 80; (319) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 81; (320) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 81; (321) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 81; (322) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 82; (323) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 81; (324) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; (325) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; (326) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; (327) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81; (328) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-34 da SEQ ID NO: 83; (329) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 83; (330) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 84; (331) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 86; (332) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 87; (333) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1328 da SEQ ID NO: 87; (334) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 87; (335) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 88; (336) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 87; (337) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; (338) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 87; (339) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 89; (340) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 89; (341) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 90; (342) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 89; (343) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; (344) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 89; (345) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-93 da SEQ ID NO: 91; (346) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 91; (347) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 92; (348) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-93 da SEQ ID NO: 91; (349) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91; (350) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91; (351) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-93 da SEQ ID NO: 91; (352) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91; (353) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91; (354) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91; (355) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1130 da SEQ ID NO: 93; (356) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 93; (357) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 94; (358) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 93; (359) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10130 da SEQ ID NO: 93; (360) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93; (361) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93; (362) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 122; (363) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 1; (364) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 1; (365) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-31 da SEQ ID NO: 1; (366) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 96; (367) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 96; (368) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 3; (369) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 3; (370) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 3; (371) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 97; (372) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (373) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 5; (374) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 5; (375) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 5; (376) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 5; (377) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 7; (378) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 7; (379) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 7; (380) uma sequência de di-recionamento consistindo em aminoácidos 16-24 da SEQ ID NO: 7; (381) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 9; (382) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 9; (383) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 9; (384) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 9; (385) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 105; (386) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 105; (387) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 11; (388) uma sequência de dire-cionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 11; (389) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 11; (390) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 98; (391) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (392) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 13; (393) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 13; (394) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 13; (395) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 13; (396) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 99; (397) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 99; (398) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 15; (399) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 15; (400) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 29-41 da SEQ ID NO: 15; (401) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 31-39 da SEQ ID NO: 15; (402) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 17; (403) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 17; (404) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 100; (405) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 19; (406) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 19; (407) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 19; (408) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 19; (409) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 21; (410) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 21; (411) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 21; (412) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 21; (413) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 101; (414) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 101; (415) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 23; (416) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 23; (417) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 23; (418) uma sequência de dire-cionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 23; (419) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 102; (420) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 102; (421) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 25; (422) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 25; (423) uma sequência de direci-onamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 25; (424) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 25; (425) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 103; (426) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 103; (427) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-28 da SEQ ID NO: 27; (428) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-26 da SEQ ID NO: 27; (429) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 16-28 da SEQ ID NO: 27; (430) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-26 da SEQ ID NO: 27; (431) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 104; (432) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 104; (433) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 33; (434) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-11 da SEQ ID NO: 33; (435) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 3-11 da SEQ ID NO: 33; (436) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-14 da SEQ ID NO: 35; (437) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-12 da SEQ ID NO: 35; (438) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 2-14 da SEQ ID NO: 35; (439) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-27 da SEQ ID NO: 43; (440) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 43; (441) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-27 da SEQ ID NO: 43; (442) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 45; (443) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 45; (444) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 45; (445) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 106; (446) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 106; (447) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 47; (448) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 47; (449) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 53; (450) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 53; (451) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 53; (452) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 61; (453) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 61; (454) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 61; (455) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 65; (456) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 65; (457) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 65; (458) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 107; (459) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 107; (460) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 67; (461) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 67; (462) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 67; (463) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 67; (464) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2336 da SEQ ID NO: 69; (465) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 69; (466) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 69; (467) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 69; (468) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-40 da SEQ ID NO: 75; (469) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-38 da SEQ ID NO: 75; (470) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 77; (471) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 77; (472) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10--—22 da SEQ ID NO: 77; (473) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 77; (474) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 81; (475) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 81; (476) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 81; (477) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 81; (478) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1326 da SEQ ID NO: 87; (479) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 87; ou (480) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 87.
[001325] A modalidade 131 é uma proteína de fusão de uma das modalidades de 4, 8 e 12-15 ou um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 16 ou 130, onde a sequência de direcio-namento compreende: uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 50% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 63%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 50% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 72%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 56% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 63%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 62% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 72%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 68% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 81%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 75% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 72%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 75% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 81%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 81% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 81%; ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 81% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 90%.
[001326] A modalidade 132 é uma proteína de fusão de uma das modalidades de 4, 8 e 12-15 ou um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 16 ou 130, onde a sequência de direcio-namento consiste em: (a) uma sequência de amino ácidos consistindo em 16 aminoácidos com pelo menos cerca de 43% de identidade com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 54%; (b) os aminoácidos de 1-35 da SEQ ID NO: 1; (c) aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1; (d) SEQ ID NO: 1; (e) SEQ ID NO: 96; ou (f) SEQ ID NO: 120.
[001327] A modalidade 133 é uma proteína de fusão ou um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 131, onde a sequência de direcionamento compreende a sequência de aminoácidos.
[001328] A modalidade 134 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades de 4, 8 e 12-15 ou um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 16 ou 130, onde a proteína de fusão compreende uma proteína do exosporium ou um fragmento da proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 e 121.
[001329] A modalidade 135 é uma proteína de fusão da modalidade 1 ou um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 16 ou 130, onde a proteína de fusão compreende uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 122.
[001330] A modalidade 136 é uma proteína de fusão de uma das modalidades de 1-15 e de 131-135 ou um membro da família Bacillus cereus recombinante de uma das modalidades de 16-29, 48-63 e 99135, em que a sequência de direcionamento, a proteína do exosporium ou o fragmento da proteína do exosporium compreendem sequência de aminoácidos GXT no seu terminal carboxi, em que X é um aminoácido.
[001331] A modalidade 137 é uma proteína de fusão de uma das modalidades de 1-15 e 131-136 ou um membro da família Bacillus cereus recombinante de uma das modalidades de 16-29, 48-63 e 99-136, em que a sequência de direcionamento, a proteína do exosporium ou o fragmento de proteína do exosporium compreende um resíduo de alanina na posição da sequência de direcionamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.
[001332] A modalidade 138 é uma proteína de fusão de uma das modalidades de 1-15 e de 131-137, ou um membro da família Bacillus cereus recombinante de uma das modalidades de 16-29, 48-63 e 99137, em que a sequência de direcionamento, a proteína do exosporium ou o fragmento da proteína do exosporium compreendem ainda uma metionina, serina, treonina ou resíduo na posição de aminoácido imediatamente anterior ao primeiro dos aminoácidos da sequência de direcionamento, da proteína do exosporium ou do fragmento de proteína do exosporium da posição da sequência de direcionamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.
[001333] A modalidade 139 é uma proteína de fusão de qualquer modalidade de 1-15 e de 131-138, ou um membro da família Bacillus cereus recombinante de uma das modalidades de 16-29, 48-63 e 99138, em que a proteína de fusão compreende ainda um ligante de aminoácidos entre a sequência de direcionamento, a proteína do exosporium ou o fragmento de proteína do exosporium e a proteína ou peptídeo de interesse.
[001334] A modalidade 140 é uma proteína de fusão ou um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 139, em que o ligante compreende um ligante de polialanina, um ligante de poliglicina ou um ligante que compreende uma mistura de resíduos de alanina e glicina.
[001335] A modalidade 141 é uma proteína de fusão ou um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 139 ou 140, em que o ligante compreende um local de reconhecimento de protease.
[001336] A modalidade 142 é uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos, em que a proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína CotB/H, a uma proteína X proteína esporo, ou uma proteína CotY, em que a proteína CotY compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NOs: 258 ou 259.
[001337] A modalidade 143 é uma proteína de fusão da modalidade 142, em que a proteína de revestimento de esporo compreende uma proteína CotB/H.
[001338] A modalidade 144 é uma proteína de fusão da modalidade 142, onde a proteína de revestimento de esporo compreende uma pro-teína de esporo x uma proteína.
[001339] A modalidade 145 é uma proteína de fusão da modalidade 142, em que a proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína CotY, em que a proteína CotY compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 258 ou 259.
[001340] A modalidade 146 é uma proteína de fusão de uma das modalidades de 142-145, onde a proteína de revestimento de esporos compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 255, 257, 258 ou 259.
[001341] A modalidade 147 é uma bactéria formadora de esporos recombinantes que expressa uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades de 142-146.
[001342] A Modalidade 148 é uma bactéria formadora de esporos recombinante da modalidade 147, em que a bactéria formadora de esporo recombinantes compreendem uma cepa de bactérias endofíticas, uma cepa de bactérias promotoras do crescimento de plantas ou uma cepa de bactérias que é tanto endofítica como promotora do crescimento de vegetais.
[001343] A modalidade 149 é uma bactéria formadora de esporos recombinante que expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direciona a proteína de fusão à superfície de um esporo da bactéria, em que a proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína CotB, uma proteína CotC, uma proteína CgeA, uma proteína CotB/H, uma proteína CotG, uma proteína de revestimento de esporos X proteína, ou uma proteína CotY; e em que a bactéria formadora de esporos recombinante compreende uma cepa de bactérias endofítica, uma cepa de bactéria de promoção do cresci-mento de plantas, ou de uma cepa de bactérias que é tanto endofítica e de promoção do crescimento de plantas.
[001344] A modalidade 150 é uma semente de vegetal revestida com uma bactéria formadora de esporos recombinante, em que a bactéria formadora de esporos recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direciona a proteína de fusão à superfície de um esporo da bactéria, em que a proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína cotB, uma proteína CotC, uma proteína CgeA, uma proteína CotB/H, a uma proteína Cot G, um esporo de proteína X proteína ou uma proteína cotY.
[001345] A modalidade 151 é uma bactéria formadora de esporos recombinantes da modalidade 147, 148 ou 149, ou uma semente de vegetal da modalidade 150, onde a bactéria formadora de esporos recombinante compreende uma bactéria do gênero Bacillus, Lysinibacillus, Virginibacillus, Clostridia ou Paenibacillus.
[001346] A modalidade 152 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus de uma das modalidades de 30-45, em que a bactéria recombinante compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante e em que a bactéria formadora de esporos recombinante também expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direciona a proteína de fusão à superfície de um esporo da bactéria, em que a proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína CotB, uma proteína CotC, uma proteína CgeA, uma proteína CotB/H, a uma proteína Cot G, uma proteína de revestimento de esporos X proteína ou uma proteína CotY.
[001347] A Modalidade 153 é uma bactéria recombinante do gênero Bacillus da modalidade 152, em que a bactéria recombinante compreende uma cepa de bactérias endofíticas, uma cepa de bactérias pro-motoras do crescimento de plantas ou uma cepa de bactérias que é tanto endofítica como promotora do crescimento de vegetais.
[001348] A Modalidade 154 é uma semente vegetal revestida com uma bactéria formadora de esporos da modalidade 152 ou 153.
[001349] A modalidade 155 é uma semente vegetal da modalidade 150, 151 ou 154, em que a bactéria formadora de esporos recombinantes compreende uma cepa de bactérias endofíticas, uma cepa de bactérias promotoras do crescimento de plantas ou uma cepa de bactérias que é tanto endofítica como promotora do crescimento de plantas.
[001350] A Modalidade 156 é uma bactéria formadora de esporos recombinante da modalidade 148, 149 ou 153 ou uma semente da modalidade 155 onde a cepa de bactérias endofíticas, a cepa de bac-térias promotoras do crescimento de plantas ou a cepa de bactérias que é tanto endofítica como promotora do crescimento de plantas compreende Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978), Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975), Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B50976), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123), Bacillus subtilis EE148 (NRRL B-50927), Bacillus subtilis EE218 (NRRL B-50926) ou Bacillus megaterium EE281 (NRRL B-50925).
[001351] A Modalidade 157 é uma bactéria formadora de esporos recombinante ou semente da modalidade 156, em que a cepa de bac-térias endofíticas compreende Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978) ou Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980).
[001352] A Modalidade 158 é uma bactéria formadora de esporos recombinante da modalidade 148, 149 ou 153 ou uma semente da modalidade 155 onde a cepa de bactérias endofíticas, a cepa de bactérias promotoras do crescimento de plantas ou a cepa de bactérias que é tanto endofítica como promotora do crescimento de plantas compreende um membro da família Bacillus cereus EE385 (NRRL N° B-50928), membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B67121), Bacillus mycoides BT155 (NRRL No. B-50921), Bacillus mycoides EE118 (NRRL No. B-50918), Bacillus mycoides EE141 (NRRL No. B-50921), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No. B-50922), membro da família Bacillus cereus EE128 (NRRL No. B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924), ou membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928).
[001353] A Modalidade 159 é uma bactéria formadora de esporos recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 149, 151, 152, 153, e 156-158 ou uma semente da modalidade 150, 151, e 154-158, em que a proteína revestida de esporos compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com qualquer das SEQ ID NOs: 252-259.
[001354] A Modalidade 160 é uma bactéria formadora de esporos recombinante que expressa a proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína que di-reciona a proteína de fusão para a superfície de um esporo de bactéria, em que a bactéria formadora de esporos recombinante não é um membro da família de Bacillus cereus recombinante e a proteína que direciona a proteína de fusão para a superfície de um esporo da bactéria que compreende aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO:1, SED ID NO:96 ou uma sequência de aminoácidos contendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden-tidade com SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120 ou SEQ ID NO: 121.
[001355] A Modalidade 161 é uma bactéria formadora de esporos recombinante da modalidade 160, em que a proteína que direciona a proteína de fusão a uma superfície de um esporo da bactéria compreende os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 120 ou SEQ ID NO: 121.
[001356] A Modalidade 162 é uma bactéria formadora de esporos recombinante da modalidade 160 ou 161, em que a bactéria formadora de esporo recombinantes compreendem uma cepa de bactérias endofíticas, uma cepa de bactérias promotoras do crescimento de plantas ou uma cepa de bactérias que é tanto endofítica como promotora do crescimento de plantas.
[001357] A Modalidade 163 é uma bactéria formadora de esporos recombinante da modalidade 162 onde a cepa de bactérias endofíticas, a cepa de bactérias promotoras do crescimento de plantas ou a cepa de bactérias que é tanto endofítica como promotora do crescimento de plantas compreende Bacillus megaterium EE385 (NRRL B50980), Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978), Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975), Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B67123), Bacillus subtilis EE148 (NRRL B-50927), Bacillus subtilis EE218 (NRRL B-50926) ou Bacillus megaterium EE281 (NRRL B50925)
[001358] A Modalidade 164 é uma bactéria formadora de esporos recombinante da modalidade 163, em que a cepa de bactérias endofíticas compreende Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981).
[001359] A Modalidade 165 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 142-146, uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153 e 156-164 ou uma semente de qualquer uma das modalidades 150, 151 e 154-159, em que a proteína de fusão compreende ainda um ligante de aminoácido entre a proteína revestida de esporos e a proteína ou peptídeo de interesse.
[001360] A Modalidade 166 é uma proteína de fusão, bactéria formadora de esporos recombinante ou semente da modalidade 165, em que o ligante compreende um ligante de polialanina, um ligante de poliglicina ou um ligante compreendo uma mistura de resíduos de alanina e glicina.
[001361] A Modalidade 167 é uma proteína de fusão, bactéria formadora de esporos recombinante ou semente da modalidade 165 ou 166, em que o ligante compreende um sítio de reconhecimento de protease.
[001362] A Modalidade 168 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 1-3, e 142-146, um membro da família de Bacillus cereus de qualquer uma das modalidades 16-29, 48-63, e 99141, uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153 e 156-167, ou uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 150, 151 e 154-167, em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência à tensão em uma planta, uma proteína ou peptídeo de ligação de planta, uma enzima que cataliza a produção de óxido nítrico ou uma proteína ou peptídeo de ligação à ácido nucleico.
[001363] A Modalidade 169 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 168, em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas.
[001364] A Modalidade 170 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 169, em que a proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas compreende um hormônio peptídico, um peptídeo não hormonal, uma enzima envolvida na produção ou ativação de composto de estimulação de crescimento de plantas ou uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutrientes bacteriana, fúngica ou vegetal.
[001365] A Modalidade 171 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 170, em que a proteína ou peptídeo estimulador de crescimento de plantas compreende um hormônio peptídico.
[001366] A Modalidade 172 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 171, em que o hormônio peptídico compreende uma fitosulfoquina, clavata 3 (CLV3), sistemina, ZmlGF ou uma SCR/SP11.
[001367] A Modalidade 173 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 172, em que a fitosulfoquina compreende uma fitosulfoquina-α.
[001368] A Modalidade 174 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 170, em que a proteína ou peptídeo estimulador de crescimento de plantas compreende um peptídeo não hormonal.
[001369] A Modalidade 175 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 174, em que o peptídeo não hormonal compreende UM RKN 16D10, HgSyv46, um peptídeo eNOD40, melittina, mastoparano, Mas7, RHPP, POLARIS ou inibidor de tripsina kunitz (KTI).
[001370] A Modalidade 176 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 170, em que a proteína ou peptídeo estimulador de crescimento de plantas compreende uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento de plantas.
[001371] A Modalidade 177 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 176, em que o compostos estimulador de crescimento de plantas compreende um composto produzido por bactérias ou fungos na rizosfera.
[001372] A Modalidade 178 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 177, em que o composto produzido por bactérias ou fungos na rizosfera compreende 2,3-butanediol.
[001373] A Modalidade 179 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 176, em que o composto estimulador de crescimento de plantas compreende um hormônio de crescimento de plantas.
[001374] A Modalidade 180 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 179, em que o hormônio de crescimento de plantas compreende uma citocinina ou um derivado de citocinina, etileno, uma auxina ou um derivado de auxina, um ácido giberélico ou um derivado de ácido giberélico, um ácido abscísico ou um derivado de ácido abscísico, um ácido jasmônico ou um derivado de ácido jasmônico.
[001375] A Modalidade 181 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 180, em que o hormônio de crescimento de plantas compreende uma citocinina ou um derivado de citocinina e a citocinina ou o derivado de citocinina compreende cinetina, cis-zeatina, trans-zeatina, 6benzilaminopurina, dihidroxizeatina, N6-(D2-isopentenil) adenina, ribosilzeatina, N6-(D2-isopentenil) adenosina, 2-metiltio-cis-ribosilzeatina, cis-ribosilzeatina, trans-ribosilzeatina, 2-metiltio-trans-ribosilzeatina, ribosilzeatina -5-monosfosfato, N6-metilaminopurina, N6dimetilaminopurina, ribosídeo de 2'-deoxizeatina, 4-hidróxi-3-metiltrans-2-butenilaminopurina, orto-topolina, meta-topolina, benziladenina, orto-metiltopolina, meta-metiltopolina ou uma combinação destes; ou em que o hormônio de crescimento de plantas compreende uma auxina ou um derivado de auxina e a auxina ou derivado de auxina compreende uma auxina ativa, uma auxina inativa, uma auxina conjugada, uma auxina de ocorrência natural, uma auxina sintética ou uma combinação dos mesmos.
[001376] A Modalidade 182 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 180 ou 181, em que o hormônio de crescimento de plantas compreende uma auxina ou um derivado de auxina, e a auxina ou o derivado de auxina compreende indol-3-ácido acético, indol-3-ácido pirúvico, indol-3- acetaldoxima, indol-3-acetamida, indol-3-acetonitrila, indol-3-etanol, indol-3-piruvato, indol-3-acetaldoxima, indol-3-ácido butírico, um ácido fenilacético, 4-cloroindol-3-ácido acético, uma auxina conjugada a glicose ou uma combinação destes.
[001377] A Modalidade 183 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta das modalidades 176-182, em que a proteína ou peptídeo estimulador de crescimento de plantas compreende uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento de plantas, e a enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento de plantas compreende uma acetoína redutase, uma indol-3-acetamida hidrolase, um triptofano monooxigenase, uma acetolactase sintetase, uma α-acetolactato decarboxilase, um piruvato decarboxilase, um diacetil redutase, um butanediol dehidrogenase, uma aminotransferase, um triptofano decarboxilase, uma amina oxidase, um indol-3-piruvato decarboxilase, um indol-3-piruvato decarboxilase, um indol-3-acetaldeído dehidrogenase, uma oxidase de cadeia lateral de triptofano, uma nitrila hidrolase, uma nitrilase, uma peptidase, uma protease, uma adenosina fosfato isopenteniltransferase, uma fosfatase, uma adenosina cinase, uma adenina fosforribosiltransferase, CYP735A, uma 5'ribonucleotídeo fosfohidrolase, uma adenosina nucleosidade, uma zeatina cis-trans isomerase, uma zeatina Oglicosiltransferase, uma β-glicosidase, uma cis-hidroxilase, um CK cishidroxilase, uma CK N-glicosiltransferase, um 2,5-ribonucleotídeo fosfohidrolase, uma adenosina nucleosidase, uma purina nucleosídeo fosforilase, uma zeatina redutase, uma hidroxilamina redutase, um 2oxoglutarato dioxigenase, uma hidrolase 2B/3B giberélica, uma giberelina 3-oxidase, uma giberelina 20-oxidase, uma quitosanase, uma quitinase, uma β-1,3-glucanase, uma β-1,4-glucanase, uma β-1,6glucanase, um aminociclopropano-1-ácido carboxílico deaminase ou uma enzima envolvida na produção de um fator nod.
[001378] A Modalidade 184 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 183, em que a enzima envolvida na produção ou ativação de um compostos de estimulação de crescimento de plantas compreende uma enzima envolvida na produção de um fator nod e a enzima envolvida na produção de um fator nod compreende nodA, nodB ou nodI; ou em que a enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento de plantas compreende uma aminostransferase e a aminotransferase compreende um triptofano aminotransferase.
[001379] A Modalidade 185 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 183, em que a enzima envolvida na produção ou ativação de um compostos estimulador de crescimento de plantas compreende uma protease ou peptidase que cliva proteínas, peptídeos, pró-proteínas ou préproteínas para criar um peptídeo bioativo.
[001380] A Modalidade 186 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 183, em que a protease ou peptidase compreende subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma proteinase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, termolisina, papaina, pepsina, tripsina, pronase, uma carboxilase, uma serina protease, uma protease glutâmica, uma aspartato protease, uma cisteína protease, uma treonina protease ou metaloprotease.
[001381] A Modalidade 187 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 185 ou 186, em que o peptídeo bioativo compreende RKN 16D10 ou RHPP.
[001382] A Modalidade 188 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 185-187, em que a protease ou peptidase cliva proteínas em uma refeição rica em proteínas.
[001383] A Modalidade 189 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 188, em que a refeição rica em proteínas é farinha de soja ou extrato de levedura.
[001384] A Modalidade 190 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 183, em que a enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento de plantas compreende uma quitosanase, em que a quitosanase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:313.
[001385] A Modalidade 191 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 170, em que a proteína ou peptídeo estimulador de crescimento de plantas compreende uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutri-entes bacteriana, fúngica ou vegetal.
[001386] A Modalidade 192 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 191, em que a enzima que degrada ou altera uma fonte fúngica, bacteriana ou de nutrientes de plantas compreende uma celulase, uma lipase, uma oxidase de lignina, uma protease, um glicosídeo hidrolase, uma fosfatase, um nitrogenase, uma nuclease, uma amidase, uma redutase de nitrato, um redutase de nitrito, uma amilase, uma oxidase de amônia, um ligninase, uma glicosidase, uma fosfolipase, uma fitase, uma pectinase, uma glucanase, uma sulfatase, uma urease, uma xilanase ou um sideróforo.
[001387] A Modalidade 193 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 192, em que a fosfolipase compreende uma fosfolipase A1, uma fosfolipase A2, uma fosfolipase C, uma fosfolipase D ou uma lisofosfolipase.
[001388] A Modalidade 194 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 193, em que a fosfolipase compreende uma fosfolipase C e a fosfolipase C compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:312.
[001389] A Modalidade 191 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 192, em que a enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutrientes bacteriana, fúngica ou vegetal compreende uma celulase, e a celulase compreende uma endocelulase, uma exocelulase ou uma βglicosidase.
[001390] A Modalidade 196 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 195, em que a celulase compreende uma endocelulase e a endocelulase compreende uma endoglucanase.
[001391] A Modalidade 197 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 195 ou 196, em que a celulase compreende uma endocelulase e a endocelulase compreende uma endoglucanase de Bacillus subtilis, uma endoglucanase de Bacillus thuringiensis, uma endoglucanase de Bacillus cereus ou uma endoglucanase de Bacillus clausii.
[001392] A Modalidade 198 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 197, em que a celulase compreende uma endoglucanase de Bacillus subtilis e a endoglucanase de Bacillus subtilis compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:311.
[001393] A Modalidade 199 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 195, em que a celulase compreende uma exocelulase e a exocelulase compreende uma exocelulase de Trichoderma reesei.
[001394] A Modalidade 200 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 195, em que a celulase compreende uma β-glicosidase e a β-glicosidase compreende uma β-glucosidase de Bacillus subtilis, uma βglucosidase de Bacillus thuringiensis, uma β-glucosidase de Bacillus cereus ou uma β-glucosidase de Bacillus clausii.
[001395] A Modalidade 201 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 192, em que a enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutrientes bacteriana, fúngica ou vegetal compreende uma lipase e a lipase com-preende uma lipase de Bacillus subtilis, uma lipase de Bacillus thuringiensis, uma lipase de Bacillus cereus ou uma lipase de Bacillus clausii.
[001396] A Modalidade 202 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 192, em que a enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutrientes bacteriana, fúngica ou vegetal compreende uma lignina oxidase, e a lignina oxidase compreende uma lignina peroxidase, uma lacase, uma glioxal oxidase, uma ligninase ou uma peroxidase de manganês.
[001397] A Modalidade 203 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 192, em que a enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutrientes bacteriana, fúngica ou vegetal compreende uma protease, e a protease compreende uma subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma proteinase, uma peptidase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, uma termolisina, uma papaina, uma pepsina, uma tripsina, uma pronase, uma carboxilase, uma serina protease, uma protease glutâmica, uma aspartato protease, uma cisteína protease, uma treonina protease ou metaloprotease.
[001398] A Modalidade 204 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 192, em que a enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutrientes bacteriana, fúngica ou vegetal compreende uma fosfatase, e a fosfatase compreende uma hidrolase monoéster fosfórica, uma fosfomonoesterase, uma hidrolase diéster fosfórica, uma fosfodiesterase, uma hidrolase monoéster trifosfórica, uma hidrolase anidrida fosforila, uma pirofosfatase, uma fitase, uma trimetafosfatase ou uma trifosfatase.
[001399] A Modalidade 205 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 204, em que a enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutrientes bacteriana, fúngica ou vegetal compreende uma fosfomonoesterase, e a fosfomonoesterase compreende PhA4; ou em que a enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutrientes bacteriana, fúngica ou vegetal compreende uma fitase e a fitase compreende uma fitase de Bacillus subtilis EE148 ou uma fitase de Bacillus thuringiensis BT013A.
[001400] A Modalidade 191 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 192, em que a enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutrientes bacteriana, fúngica ou vegetal compreende uma nitrogenase e a nitro-genase compreende uma nitrogenase da família Nif.
[001401] A Modalidade 207 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 206, em que a nitrogenase da família Nif compreende NifBDEHKNXV de Paenibacillus massiliensis.
[001402] A Modalidade 208 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 168, em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno.
[001403] A Modalidade 209 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 208, em que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno compreende uma proteína ou peptídeo potencializador do sistema imune de plantas.
[001404] A Modalidade 2010 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 209, em que a proteína ou peptídeo potencializador do sistema imune de plantas compreende uma harpina, uma proteína semelhante à harpina, uma α-elastina, a β-elastina, uma sistemina, uma fenilalanina amônia-liase, uma elicitina, uma defensina, uma criptogeína, uma proteína de flagelina ou um peptídeo de flagelina.
[001405] A Modalidade 211 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 2010, em que o peptídeo de flagelina compreende flg22.
[001406] A Modalidade 212 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 208, em que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno possui atividade antibacteriana ou tanto atividade antibacteriana como antifúngica.
[001407] A Modalidade 213 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 212, em que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno compreende uma bacteriocina, uma lisozima, um peptídeo de lisozima, um sideróforo, uma avidina, uma estreptavidina, um peptídeo ativo não ribossômico, uma conalbumina, uma albumina, uma lactoferrina, um peptídeo de lactoferrina ou TasA.
[001408] A Modalidade 214 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 213, em que o peptídeo de lisozima compreende LysM ou em que o peptídeo de lactoferrina compreende LfcinB.
[001409] A Modalidade 215 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 208, em que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno possui atividade inseticida, atividade helminticida, suprime a predação por insetos ou vermes ou uma combinação dos mesmos.
[001410] A Modalidade 216 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 215, em que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno compreende uma toxina bacteriana, uma endotoxina, uma toxina Cry, uma proteína ou peptídeo inibidor de protease, uma cisteína protease ou uma quitinase.
[001411] A Modalidade 217 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 216 em que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno compreende uma toxina bacteriana inseticida e a toxina bacteriana in-seticida compreende uma toxina inseticida VIP; em que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno compreende uma proteína ou peptídeo inibidor de protease e a proteína ou peptídeo inibidor de protease compreende um inibidor de tripsina ou um inibidor de protease de ponta de seta; ou em que a proteína ou peptídeo que protege a planta de um patógeno compreende uma toxina Cry e a toxina Cry compreende uma toxina Cry de Bacillus thuringiensis.
[001412] A Modalidade 218 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 217, em que a toxina Cry compreende uma toxina Cry de Bacillus thuringiensis e a toxina Cry compreende uma toxina Cry de Bacillus thuringiensis que compreende uma proteína Cry5B ou uma proteína Cry21A.
[001413] A Modalidade 219 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 208, em que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno compreende uma enzima.
[001414] A Modalidade 220 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 219, em que a enzima compreende uma protease ou uma lactonase.
[001415] A Modalidade 221 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 220, em que a protease ou lactonase é específica para uma molécula de sinalização bacteriana.
[001416] A Modalidade 222 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 221, em que a molécula de sinalização bacteriana compreende uma molécula de sinalização de homoserina lactona bacteriana.
[001417] A Modalidade 223 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 220-222, em que a enzima compreende uma lactonase e a lactonase compreende 1,4-lactonase, 2-pirona-4,6-dicarboxilato lac tonase, 3-oxoadipato enol-lactonase, actinomicina lactonase, deoxilimonato A-anel-lactonase, gluconolactonase L-rhamnono-1,4lactonase, limonina-D-anel-lactonase, esteroide-lactonase, triacetatolactonase ou xilono-1,4-lactonase.
[001418] A Modalidade 224 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 219, em que a enzima é específica para um componente celular de uma bactéria ou fungo.
[001419] A Modalidade 225 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 224, em que a enzima compreende uma β-1,3-glucanase, uma β-1,4glucanase, uma β-1,6-glucanase, uma quitosanase, uma quitinase, uma enzima tipo quitosanase, uma liticase, uma peptidase, uma proteinase, uma protease, uma mutanolisina, uma estafolisina ou uma lisozima.
[001420] A Modalidade 226 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 225, em que a enzima compreende quitosanase, em que a quitosanase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:313.
[001421] A Modalidade 227 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 225, em que a protease compreende uma protease alcalina, uma protease ácida ou uma protease neutra.
[001422] A Modalidade 228 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 208-227, em que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno protege a planta de um patógeno bacteriano, um patógeno fúngico, um patógeno de vermes ou um patógeno de insetos.
[001423] A Modalidade 229 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 228, em que o patógeno bacteriano compreende uma Proteobactéria classe α, uma Proteobactéria classe β, uma Proteobactéria classe You uma combinação destas; ou em que o agente patogênico bacteriano com-preendeAgrobacterium tumefaciens, Pantoea stewartii, Erwinia carotovora, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Pseudomonas aeruginosa, Xanthomonas campestris ou uma combinação das mesmas.
[001424] A Modalidade 230 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 228, em que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno protege a planta da predação por um patógeno de um verme ou de um inseto.
[001425] A Modalidade 231 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 228 ou 230, em que verme ou inseto patogênico pode compreender uma lagarta, uma lagarta-rosca, uma traça europeia do milho, a lagarta do cartucho, uma lagarta, um besouro japonês, uma lagarta elasmo, um besouro da raiz do milho, um díptero caliptrado, uma lagarta que tece teias, broca do pé de milho do sul, uma broca do colmo do milho do sul, uma conoderus falli, a broca de espiga, um besouro da cana, uma larva branca, uma trichoplusia ni, um bicudo-do-algodoeiro, uma lagarta listrada amarela, um besouro de folha do cereal, um percevejo, um afídeo, uma lagarta da beterraba, um besouro de feijão mexicano, uma lagarta falsa-medideira, dectes texanus, ou uma combinação dos mesmos.
[001426] A Modalidade 232 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 168, em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta.
[001427] A Modalidade 233 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 232, em que a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta compreende uma enzima que degrada um composto relacionado ao estresse.
[001428] A Modalidade 234 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 233, em que o composto relacionado ao estresse compreende aminociclopropano-1-ácido carboxílico (ACC), uma espécie de oxigênio reativo, óxido nítrico, uma oxilipina, um fenólico ou uma combinação dos mesmos.
[001429] A Modalidade 235 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 233 ou 234, em que a enzima que degrada um composto relacionado com o stress compreende um superóxido-dismutase, uma oxidase, uma catalase, uma desaminase de aminociclopropano-1-ácido carboxílico, uma peroxidase, uma enzima antioxidante ou um peptídeo antioxidante.
[001430] A Modalidade 236 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 235, em que a enzima que degrada um composto relacionado ao estresse compreende um superóxido dismutase.
[001431] A Modalidade 237 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 235 ou 236, em que o superóxido desmutase compreende superóxido desmutase 1 (SODA1) ou superóxido desmutase 2 (SODA2).
[001432] A Modalidade 238 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 237 em que o superóxido desmutase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:155 ou 156.
[001433] A Modalidade 239 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 232, em que a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta compreende uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um estresse ambiental.
[001434] A Modalidade 240 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 239, em que o estresse ambiental compreende secas, inundações, calor, congelamENto, sal, metais pesados, pH baixo, pH alto ou uma combi-nação dos mesmos.
[001435] A Modalidade 241 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 239 ou 240, em que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um estresse ambiental compreende uma proteína de nucleação de gelo, uma prolinase, uma fenilalanina aminia liase, uma isocorismata sintase, uma isocorismata piruvato liase ou uma colina desidrogenase
[001436] A Modalidade 242 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 168, em que a proteína de fusão compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação a planta.
[001437] A Modalidade 243 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 242, em que a proteína ou peptídeo de ligação a planta compreende uma adesina, uma flagelina, uma omptina, uma lectina, uma expansina, uma proteína estrutural de biofilme, uma proteína de pilus, uma proteína de curlus, uma intimina, uma invasina, uma aglutinina, uma proteína afimbrial.
[001438] A Modalidade 244 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 243, em que a proteína de ligação à planta compreende uma adesina e a adesina compreende uma ricadesina; ou em que a proteína de ligação à planta compreende uma proteína estrutural de biofilme e a proteína estrutural de biofilme compreende TasA ou YuaB.
[001439] A Modalidade 245 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 168, em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima que cataliza a produção de óxido nítrico.
[001440] A Modalidade 246 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 245, em que a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico compreende uma sintase ou arginase de óxido nítrico.
[001441] A Modalidade 247 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 245, em que a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico compreende uma sintase de óxido nítrico.
[001442] A Modalidade 248 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 247, em que a sintase de óxido nítrico compreende uma sintase de óxido nítrico de Bacillus thuringiensis ou uma sintase de óxido nítrico de Bacillus subtilis.
[001443] A Modalidade 249 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 248, em que a sintase de óxido nítrico compreende uma sintase de óxido nítrico de Bacillus thuringiensis BT013A ou Bacillus subtilis 168.
[001444] A Modalidade 238 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta das modalidades 245249, em que a sintase de óxido nítrico compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:260 ou 261.
[001445] A Modalidade 251 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 245-250, em que a proteína de fusão compreende SED ID NO: 262 ou 263.
[001446] A Modalidade 252 é uma proteína de fusão da modalidade 4 ou uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 168, em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico.
[001447] A Modalidade 253 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 252, em que a proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a RNA ou uma proteína ou peptídeo de ligação a DNA.
[001448] A Modalidade 254 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 253, em que a proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a RNA.
[001449] A Modalidade 255 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 254, em que a proteína ou peptídeo de ligação a RNA compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a RNA não específico.
[001450] A Modalidade 256 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 254, em que a proteína ou peptídeo de ligação a RNA compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a RNA específico.
[001451] A Modalidade 257 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 254, em que a proteína ou peptídeo de ligação a RNA compreende uma proteína Hfq.
[001452] A Modalidade 258 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 257, em que a proteína Hfq compreende uma proteína Hfq de Bacillus thuringiensis.
[001453] A Modalidade 259 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 253, em que a proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a DNA.
[001454] A Modalidade 260 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 259, em que a proteína ou peptídeo de ligação a DNA compreende uma pequena proteína de ácido solúvel de esporo (SASP).
[001455] A Modalidade 261 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 260, em que SASP compreende uma SASP codificada por um gene SspA, um gene SspB, um gene SspC, um gene SspD, um gene SspE, um gene SspF, um gene SspG, um gene SspH, um gene SspI, um gene SspJ, um gene SspK, um gene SspL, um gene SspM, um gene SspN, um gene SspO ou um gene SspP.
[001456] A Modalidade 262 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 261, em que SASP compreende uma SASPα, uma SASPβ ou uma SASPY.
[001457] A Modalidade 263 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 260-262, em que SASP compreende uma SASP de Bacillus thuringiensis.
[001458] A Modalidade 264 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 252-263, em que a proteína de ligação a ácido nucleico compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:264-266.
[001459] A Modalidade 265 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 252-264, em que a proteína de fusão compreende SED ID NO: 267, 268 ou 269.
[001460] A Modalidade 266 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 252-254 e 259, em que a proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico compreende uma nuclease com um sítio ativo inativado.
[001461] A Modalidade 267 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 252-266, compreendendo ainda uma molécula de ácido nucleico ligada a proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico.
[001462] A Modalidade 268 é uma proteína de fusão, um membro da família de Bacillus cereus recombinante, uma bactéria formadora de esporos recombinante ou uma semente de planta da modalidade 267, em que a molécula do ácido nucleico compreende uma molécula de RNA de modulação; uma molécula de RNAi; um microRNA; um aptâmero; ou uma molécula de DNA que codifica uma molécula de RNA de modulação, uma molécula de RNAi, um microRNA ou um aptâmero.
[001463] A Modalidade 269 é uma proteína de fusão da modalidade 4 ou um membro da família Bacillus cereus recombinante ou uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 16-29, 48-63, 99141 e 168-268, em que a sequência de direcionamento compreende SED ID NO: 96.
[001464] A Modalidade 270 é um membro da família Bacillus cereus recombinante que co-expressa pelo menos uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, um proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao es-tresse em uma planta, uma enzima que cataliza a produção de óxido nítrico ou uma proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico de qualquer uma das modalidades 168-241 e 245-269 e pelo menos uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de ligação à planta de qualquer uma das modalidades 242-244 e 269.
[001465] A Modalidade 271 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-270, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreen-deBacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis ou uma combi-nação destes.
[001466] A Modalidade 272 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 271, em que o membro da família Baci llus cereus recombinante compreende Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides.
[001467] A Modalidade 273 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 271 ou 272, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias promotoras de crescimento de plantas.
[001468] A Modalidade 274 é um membro da família de Bacillus cereus recombinante da modalidade 273, em que a cepa de bactérias promotoras do crescimento de plantas produz uma toxina inseticida, produz um composto fungicida, produz um composto nematocida, produz um composto bactericida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou mais plasmídeos de replicação livre, liga-se a raízes de plantas, coloniza as raízes das plantas, forma biofilme, solubiliza nutrientes, secreta ácidos orgânicos ou combinações dos mesmos.
[001469] A Modalidade 275 é um membro da família de Bacillus cereus recombinante da modalidade 274, em que a toxina inseticida compreende uma toxina Cry; em que o composto fungicida compreende uma β-1,3-glucanase, uma quitosanase, uma liticase ou uma combinação dos mesmos; ou em que o composto nematicida compreende uma toxina Cry.
[001470] A Modalidade 276 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 273-275, em que a cepa de bactérias promotoras de crescimento de plantas compreende Bacillus mycoides BT155 (NRRL No. B-50921), Bacillus mycoides EE118 (NRRL No. B-50918), Bacillus mycoides EE141 (NRRL No. B50921), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No. B-50922), membro da família Bacillus cereus EE128 (NRRL No. B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924), membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928); membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001471] A Modalidade 277 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 276, em que a cepa de bactérias promo-toras de crescimento de plantas compreende Bacillus mycoides BT155 (NRRL No. B-50921), Bacillus mycoides EE141 (NRRL No.B-50921)ou Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924).
[001472] A Modalidade 278 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141, e 168-275, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias endofíticas.
[001473] A Modalidade 279 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 278, em que a cepa de bactérias endofíticas compreende o membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977) ou Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) ou Bacillus mycoides EEB00363 (NRRL B-67121).
[001474] A Modalidade 280 é um membro da família Bacillus cereus da modalidade 279, em que a cepa de bactérias endofíticas compreende membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001475] A Modalidade 281 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 186-275, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida.
[001476] A Modalidade 282 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 281, em que a cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida compreende um membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001477] A Modalidade 283 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 125, 128, 281 e 282, em que a cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida degrada um herbicida de sulfoniluréia, um herbicida de aril triazina, dicamba, 2,4-D, um herbicida de fenóxi, uma piretrina, uma pireteroide ou uma combinação destes.
[001478] A Modalidade 284 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 283, em que o herbicida de sulfoniluréia compreende sulfentrazona.
[001479] A Modalidade 285 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 282 ou 283, em que a cepa de bactérias que é capaz de degradar um pesticida degrada uma piretrina.
[001480] A Modalidade 286 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 186-275, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias probióticas.
[001481] A Modalidade 287 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 286, em que a cepa de bactérias probióticas compreende o membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B50979) ou Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977).
[001482] A Modalidade 288 é um membro da família de Bacillus cereus recombinante das modalidades 16-141 e 168-287, em que o membro da família de Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação de inativação em seu gene BcIA.
[001483] A Modalidade 289 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 288, em que a mutação de inativação no gene BcIA compreende um knock-out do gene BcIA.
[001484] A Modalidade 290 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-29, 48-63, 99-141 e 168-289, em que a proteína de fusão é expressa sob o controle de um promotor de esporulação que é nativo à sequência de direciona-mento,proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão ou uma porção do mesmo.
[001485] A Modalidade 291 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 17-27, em que a pro-teína moduladora é expressa sob o controle do seu promotor nativo ou uma porção do mesmo.
[001486] A Modalidade 292 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-29, 48-63, 99141 e 168-291, em que a proteína de fusão ou proteína moduladora é expressa sob o controle do seu promotor de esporulação de alta expressão.
[001487] A modalidade 293 é um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 292, em que o promotor de esporulação de alta expressão compreende uma sequência de promotor de polimerase específico de esporulação de sigma K.
[001488] A Modalidade 294 é um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 290-293, em que o promotor de esporulação compreende uma sequência de ácidos nucleicos contendo pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com uma sequência de ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157-231.
[001489] A Modalidade 295 é um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 290-293, em que o promotor compreende uma sequência de ácidos nucleicos contendo pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com SEQ ID NO: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229 ou 230.
[001490] A Modalidade 296 é um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 293-295, em que a sequência ou sequências do promotor de polimerase específico de esporulação de sigma-K possui 100% de identidade com os nucleotídeos correspondentes de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157-231
[001491] A Modalidade 297 é uma cultura bacteriana biologicamente pura em que a bactéria na cultura bacteriana é: (a) Membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B50979); (b) Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979); (c) Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977); (d) Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983); (e) Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122); (f) Membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); (g) Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); ou (h) Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001492] A Modalidade 298 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 297, em que as bactérias na cultura bacteriana são um membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979) e a bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 277.
[001493] A Modalidade 299 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 297, em que as bactérias na cultura bacteriana são Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979) e a bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 278.
[001494] A Modalidade 300 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 297, em que as bactérias na cultura bacteriana são Bacillus cereus EE444(NRRL B-50977) e a bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 279.
[001495] A Modalidade 301 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 297, em que as bactérias na cultura bacteriana são Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983) e a bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 280.
[001496] A Modalidade 302 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 297, em que as bactérias na cultura bacteriana são Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122) e a bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 301.
[001497] A Modalidade 303 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 297, em que as bactérias na cultura bacteriana são um membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B67119) e as bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 304.
[001498] A Modalidade 304 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 297, em que as bactérias na cultura bacteriana são Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) e a bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 303.
[001499] A Modalidade 305 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 297, em que as bactérias na cultura bacteriana são Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121) e a bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 302.
[001500] A Modalidade 297 é uma cultura bacteriana biologicamente pura em que as bactérias na cultura bacteriana são mutantes das bactérias de qualquer uma das modalidades 294-305, compreendendo uma ou mais mutações, em que as bactérias são endofíticas.
[001501] A Modalidade 307 é uma cultura bacteriana biologicamente pura em que as bactérias na cultura bacteriana são: (a) Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980); (b) Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981); (c) Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982); (d) Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978); (e) Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975); (f) Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976); or (g) Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123).
[001502] A Modalidade 301 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 307, em que as bactérias na cultura bacteriana são Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980) e a bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 281.
[001503] A Modalidade 309 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 307 em que as bactérias na cultura bacteriana são Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981) e as bactérias possuem uma se-quência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 282.
[001504] A Modalidade 301 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 307, em que as bactérias na cultura bacteriana são Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982) e a bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 283.
[001505] A Modalidade 311 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 307, em que as bactérias na cultura bacteriana são Bacillus subtilis EE405(NRRL B-50978) e a bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 284.
[001506] A Modalidade 312 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 307, em que as bactérias na cultura bacteriana são Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975) e a bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 285.
[001507] A Modalidade 313 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 307, em que as bactérias na cultura bacteriana são Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976) e as bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 286.
[001508] A Modalidade 314 é uma cultura bacteriana biologicamente pura da modalidade 307, em que as bactérias na cultura bacteriana são Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123) e a bactérias possuem uma sequência de RNA ribossômico 16S contendo pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 305.
[001509] A Modalidade 315 é uma cultura bacteriana biologicamente pura em que as bactérias na cultura bacteriana são mutantes das bactérias de qualquer uma das modalidades 307-314, compreendendo uma ou mais mutações, em que as bactérias são endofíticas.
[001510] A Modalidade 297 é uma cultura bacteriana biologicamente pura em que as bactérias na cultura bacteriana são mutantes das bactérias de qualquer uma das modalidades 307-315, compreendendo uma ou mais mutações, em que as bactérias são probióticas.
[001511] A Modalidade 317 é um inoculante para aplicação em plantas, sementes de plantas, um meio de crescimento de plantas, ou de uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta, em que o inoculante compreende uma quantidade eficaz de uma cultura bacteriana biologicamente pura de qualquer uma das modalidades 297-316 e um veículo aceitável em agricultura.
[001512] A Modalidade 318 é um inoculante da modalidade 317, em que o inoculante compreende uma quantidade eficaz de uma mistura que compreende pelo menos duas culturas bacterianas biologicamente puras de qualquer uma das realizações 297-316.
[001513] A Modalidade 319 é um inoculante da modalidade 317 ou 318, em que o inoculante compreende ainda uma quantidade eficaz de um rizobactéria.
[001514] A Modalidade 320 é um inoculante da modalidade 319, em que a rizobactéria é uma cultura bacteriana biologicamente pura de uma cepa de rizobactéria.
[001515] A Modalidade 321 é um inoculante da modalidade 319 ou 320, em que as rizobactérias compreendem bactérias do gênero Bradyrhizobium, bactérias do gênero Rhizobium ou uma combinação destes.
[001516] A Modalidade 322 é um inoculante da modalidade 321, em que gênero de bactérias Bradyrhizobium compreende Bradyrhizobium japonicum.
[001517] A Modalidade 323 é um inoculante da modalidade 322, em que o gênero de bactérias Rhizobium compreende Rhizobium phaseoli, Rhizobium leguminosarum ou uma combinação destas.
[001518] A Modalidade 324 é uma semente da planta revestida com: (i) uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico; (ii) uma superóxido-dismutase ou (iii) um microrganismo recombinante que expressa uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou uma superóxido-dismutase, em que a expressão da enzima que catalisa a pro-dução de óxido nítrico ou a superóxido dismutase é aumentada em comparação com a expressão da enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou a superóxido dismutase em um microrganismo de tipo selvagem sob as mesmas condições.
[001519] A Modalidade 325 é uma semente de planta da modalidade 324, em que a semente de planta é revestida com a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico.
[001520] A Modalidade 326 é uma semente de planta da modalidade 324 ou 325, em que a semente de planta é revestida com o microor-ganismo recombinante que expressa uma enzima que cataliza a pro-dução de óxido nítrico.
[001521] A Modalidade 327 é uma semente de planta de qualquer uma das Modalidades 324-326, em que a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico compreende uma sintase ou arginase de óxido nítrico.
[001522] A Modalidade 328 é uma semente de planta da modalidade 327, em que a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico compreende uma sintase de óxido nítrico.
[001523] A Modalidade 329 é uma planta da modalidade 328, em que a sintase de óxido nítrico compreende uma sintase de óxido nítrico de Bacillus thuringiensis BT013A ou Bacillus subtilis 168.
[001524] A Modalidade 330 é uma semente de planta da modalidade 328 ou 329, em que a sintase de óxido nítrico compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[001525] A Modalidade 331 é uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 324-330, em que a semente de planta é revestida com a superóxido dismutase.
[001526] A Modalidade 332 é uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 324-330, em que a semente de planta é revestida com o microrganismo recombinante que expressa uma superóxido dismutase.
[001527] A Modalidade 333 é uma semente de planta de qualquer uma das formas de realização 324-332, em que a superóxido dismutase compreende superóxido dismutase 1 (SODA1) ou superóxido dismutase 2 (SODA2).
[001528] A modalidade 334 é uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 331-333, em que a superóxido dismutase com-preende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[001529] A Modalidade 335 é uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 324-334, em que o microrganismo recombinante compreende uma espécie de Bacillus, Escherechia coli, uma espécie de Aspergillus ou uma espécie de Sacchromyces.
[001530] A Modalidade 336 é uma semente de planta da modalidade 335, em que a espécie de Bacillus compreende um membro da família de Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis ou Bacillus megaterium.
[001531] A Modalidade 337 é uma semente de planta da modalidade 335, em que a espécie Aspergillus compreende Aspergillus niger ou em que a espécie Sacchromyces compreende Sacchromyces cerevisiae.
[001532] A Modalidade 338 é uma formulação compreendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296 ou uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 152-154 e 156-268 e um veículo aceitável em agricultura.
[001533] A Modalidade 339 é uma formulação compreendendo frag-mentos de exosporium derivados de esporos de um membro da família de Bacillus cereus de qualquer uma das modalidades 100-124, 130141 e 168-296 e um veículo aceitável em agricultura.
[001534] A Modalidade 340 é uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 150, 151 e 154-268, em que a semente é revestida com uma formulação que compreende a bactéria formadora de esporos recombinante e um veículo aceitável em agricultura.
[001535] A Modalidade 340 é uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 324-337, em que a semente é revestida com uma formulação que compreende a enzima ou o micro-organismo recombinante e um veículo aceitável em agricultura.
[001536] A Modalidade 342 é uma formulação da modalidade 338 ou 339, uma semente de planta da modalidade 340 ou 341, ou um inoculante de qualquer uma das modalidades 317-323, em que o veículo aceitável em agricultura compreende um dispersante, um surfactante, um aditivo, água, uma agente espessante, um agente antiaglomerante, desagregação de resíduo, uma formulação de compostagem, uma aplicação de granulado, terra de diatomáceas, um óleo, um agente co-rante, um estabilizador, um conservante, um polímero, um revestimento ou uma combinação dos mesmos.
[001537] A Modalidade 343 é uma formulação, sementes de planta ou inoculante da modalidade 342, em que o veículo aceitável em agricultura compreende um aditivo, e o aditivo compreende um óleo, uma goma, uma resina, uma argila, um polioxietileno-glicol, um terpeno, um viscosa orgânica, um éster de ácido graxo, um álcool sulfatado, um sulfonato de alquila, um sulfonato de petróleo, um sulfato de álcool, um sódio alquil butano diamato, um poliéster de sódio tiobutano dioato, um derivado de benzeno acetonitrila, um material proteináceo ou uma combinação destes; o veículo aceitável em agricultura compreende um agente espessante e o agente espessante compreende um alquilsulfonato de cadeia longa de polietilenoglicol, um oleato de polioxietileno ou uma combinação destes; o veículo aceitável em agricultura compreende um agente surfactante, e o surfactante compreende um óleo de petróleo pesado, um destilado de petróleo pesado, um éster poliol ácido graxo, um éster de ácido graxo polietoxilado, um aril alquil polioxietilenoglicol, um acetato de alquilamina, um sulfonato de alquil aril, um álcool poli-hídrico, um fosfato de alquila ou uma combinação destes; ou o veículo aceitável em agricultura compreende um agente antiaglomerante e o agente antiaglomerante compreende um sal de sódio, um carbonato de cálcio, terra de diatomáceas ou uma combinação dos mesmos.
[001538] A Modalidade 344 é uma formulação, semente de plantas ou inoculante da modalidade 343, em que o aditivo compreende um material proteináceo e o material proteináceo compreende um produto de leite, farinha de trigo, farelo de soja, sangue, albumina, gelatina, farinha de alfalfa, extrato de levedura ou uma combinação destes; ou o agente antiaglomerante compreende um sal de sódio e o sal de sódio compreende um sal de sódio de sulfonato de naftaleno de monometila, um sal de sódio de sulfonato de naftaleno de dimetila, um sulfito de sódio, um sulfato de sódio ou uma combinação dos mesmos.
[001539] A Modalidade 345 é uma formulação, semente de plantas, de qualquer uma das modalidades 338-344 ou um inoculante de qualquer uma das modalidades 317-323 e 342-344, em que o veículo aceitável em agricultura compreende vermiculite, carvão, torta de filtro de carbonação de fábrica de açúcar, casca de arroz, carboximetil celulose, turfa, perlite, areia fina, carbonato de cálcio, farinha, alúmen, um amido, talco, polivinilpirrolidona ou uma combinação dos mesmos.
[001540] A Modalidade 346 é uma formulação, semente de plantas, de qualquer uma das modalidades 338-345 ou um inoculante de qualquer uma das modalidades 317-323 e 342-345, em que a formulação ou inoculante compreende uma formulação de revestimento de sementes, uma formulação líquida para aplicação em plantas ou um meio de crescimento de plantas, ou uma formulação sólida para aplicação em plantas ou um meio de crescimento de plantas.
[001541] A Modalidade 347 é uma formulação, semente de plantas ou inoculante da modalidade 346, em que a formulação de revestimento de sementes compreende uma solução aquosa ou à base de óleo para aplicação em sementes ou um pó ou formulação granular para aplicação em sementes.
[001542] A Modalidade 348 é uma formulação, semente de plantas ou inoculante da modalidade 346, em que a formulação líquida para aplicação em plantas ou em um meio de crescimento de plantas pode compreender uma formulação concentrada ou uma formulação pronta para uso.
[001543] A Modalidade 349 é uma formulação, semente de plantas ou inoculante da modalidade 346, em que a formulação líquida para aplicação em plantas ou em um meio de crescimento de plantas com-preende uma formulação granular ou agente em pó.
[001544] A Modalidade 350 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 338 e 342-349, uma semente de plantas da modalidade 340 ou 341, ou um inoculante de qualquer uma das modalidades 317323 e 342-349, em que a formulação ou inoculante compreende ainda um agroquímico, o agroquímica compreendendo um fertilizante, um material fertilizante de micronutrientes, um insecticida, um herbicida, uma alteração do crescimento de plantas, um fungicida, um inseticida, um moluscicida, um algicida, um inoculante bacteriano, um inoculante de fungos ou uma combinação dos mesmos.
[001545] A Modalidade 351 é uma formulação, sementes de plantas ou inoculantes da modalidade 350, em que a formulação ou inóculo compreende um inoculante bacteriano e o inoculante bacteriano com-preende uma cepa de bactérias de promoção de crescimento de plantas.
[001546] A Modalidade 352 uma formulação, semente de plantas ou inóculo da modalidade 351, em que a cepa de bactérias promotoras do crescimento de plantas produz uma toxina inseticida, produz um com-posto fungicida, produz um composto nematocida, produz um composto bactericida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou mais plasmídeos de replicação livre, liga-se a raízes de plantas, coloniza as raízes das plantas, forma biofilme, solubiliza nutrientes, secreta ácidos orgânicos ou combinações dos mesmos.
[001547] A Modalidade 353 é uma formulação, semente de plantas ou inóculo da modalidade 352, em que a toxina inseticida compreende uma toxina Cry; em que o composto fungicida compreende uma β-1,3glucanase, uma quitosanase, uma liticase ou uma combinação dos mesmos; ou em que o composto nematicida compreende uma toxina Cry.
[001548] A Modalidade 354 é uma formulação, semente de plantas ou inóculo de qualquer uma das modalidades 351-353, em que a cepa de bactérias promotoras de crescimento de plantas compreende Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL No. B-50819), Bacillus aryabhattai CAP56 (NRRL No. B-50817), Bacillus flexus BT054 (NRRL No. B50816), Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL No. B-50820), Bacillus mycoides BT155 (NRRL No. B-50921), Enterobacter cloacae CAP12 (NRRL No. B-50822), Bacillus nealsonii BOBA57 (NRRL No. NRRL B50821), Bacillus mycoides EE118 (NRRL No. B-50918), Bacillus subtilis EE148 (NRRL No. B-50927), Alcaligenes faecalis EE107 (NRRL No. B-50920), Bacillus mycoides EE141 (NRRL NO. B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No. B-50922), membro da família Bacillus cereus EE128 (NRRL No. B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924), Paenibacillus massiliensis BT23 (NRRL No. B50923), membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B50928), Bacillus subtilis EE218 (NRRL No. B-50926), Bacillus megaterium EE281 (NRRL No. B-50925), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123) ou Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122) ou uma combinação dos mesmos.
[001549] A Modalidade 355 é uma formulação, semente de plantas ou inóculo da modalidade 354, em que a cepa de bactérias promotoras de crescimento de plantas compreende Bacillus kondratievae NC35 (NRRL No. B-50820), Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL No. B-50819) ou Bacillus megaterium EE281 (NRRL No. B-50925) e a formulação compreende ainda um membro da família de Bacillus cereus recombinante da modalidade 276 ou 277.
[001550] A Modalidade 356 é uma semente da planta revestida com um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296, fragmentos de exosporium derivados de esporos de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124, 130-141, 168296 e uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153 e 156-268, uma cultura bacteriana biologicamente pura de qualquer uma das modalidades 297-316, um inóculo de qualquer uma das modalidades 317-323 e 342-355 ou uma formulação de qualquer uma das modalidades 338, 339 e 342355.
[001551] A Modalidade 357 é um método para estimular o crescimento de plantas que compreende: a introdução em um meio de crescimento de plantas de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou uma semente de planta um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que o membro da família recombinante Bacillus cereus expressa uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo estimulador de crescimento de plantas.
[001552] A Modalidade 358 é um método para estimular o crescimento de plantas que compreende: introduzir em um meio de crescimento de plantas uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que a bactéria formadora de esporos recombinante ex-pressa uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo estimulador de crescimento de plantas.
[001553] A Modalidade 359 é um método para proteger uma planta a partir de um patógeno ou melhorar a resistência ao stress em uma planta compreendendo: a introdução em um meio de crescimento de plantas de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou uma semente de planta um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que o membro da família recombinante Bacillus cereus expressa uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo que protege uma planta a partir de um patógeno ou uma pro-teína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta.
[001554] A Modalidade 360 é um método para proteger uma planta a partir de um patógeno ou melhorar a resistência ao stress em uma planta, compreendendo: introduzir em um meio de crescimento de plantas uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que a bactéria formadora de esporos recombinantes expressa uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno ou uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta.
[001555] A Modalidade 361 é um método da modalidade 359 ou 360, em que o método é um método para proteger uma planta de um agen-tepatógeno e as plantas cultivadas no meio de crescimento de plantas que compreende o membro da família Bacillus cereus recombinante ou a bactéria formadora de esporos recombinantes são menos susceptíveis à infecção com o patógeno em comparação com as plantas cultivadas sob as mesmas condições no meio de crescimento de plantas idêntico que não contém o membro da família Bacillus cereus recombinante ou a bactéria formadora de esporos recombinante.
[001556] A Modalidade 362 é um método da modalidade 359 ou 360, em que o método é um método para aumenta a resistência ao estresse em uma planta e plantas cultivadas no meio de crescimento de plantas que compreende o membro da família Bacillus cereus recombinante ou a bactéria formadora de esporos recombinantes são menos susceptíveis à estresse em comparação com as plantas cultivadas sob as mesmas condições no meio de crescimento de plantas idêntico que não contém o membro da família Bacillus cereus recombinante ou a bactéria formadora de esporos recombinante.
[001557] A Modalidade 363 é um método para a imobilização de um esporo de membro da família Bacillus cereus recombinante em uma planta, compreendendo: a introdução em um meio de crescimento de plantas de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou uma semente de planta um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que o membro da família recombinante Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a plantas.
[001558] A Modalidade 364 é um método para a imobilização de um esporo de uma bactéria formadora de esporos recombinante em uma planta, compreendendo: introduzir em um meio de crescimento de plantas uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que a bactéria formadora de esporos recombinante ex-pressa uma proteína de fusão que compreende um peptídeo de ligação a plantas.
[001559] A Modalidade 365 é um método para estimular a germinação de uma semente de planta, compreendendo: a introdução em um meio de crescimento de plantas de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta ou em uma área em torno de uma planta ou uma semente de planta um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296 ou uma formulação que compreende um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que o membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende uma superóxido dismutase ou uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico.
[001560] A Modalidade 366 é um método para estimular a germinação de uma semente de planta, compreendendo: introduzir em um meio de crescimento de plantas uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que a bactéria formadora de esporos recombinante ex-pressa uma proteína de fusão compreendendo uma superóxidodismutase ou uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico.
[001561] A Modalidade 367 é um método de qualquer uma das modalidades 357-360 e 363-366, em proteína ou peptídeo estimulador de crescimento de plantas, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress em uma planta, a proteína ou peptídeo de ligação a planta, ou a superóxido-dismutase ou a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico está fisicamente ligada ao exosporium do membro da família de Bacillus cereus recombinante ou ao revestimento de esporos da bactéria formadora de esporos recombinante.
[001562] A Modalidade 368 é um método de qualquer uma das modalidades 365-367, em que o método compreende a aplicação de um membro da família de Bacillus cereus, bactéria formadora de esporos recombinante ou a formulação para uma semente de planta.
[001563] A Modalidade 369 é um método de qualquer uma das modalidades 365-371, compreendendo ainda a aplicação de L-arginina ao meio de crescimento da planta, à semente da planta, à planta ou a área que circunda a planta ou a semente da planta.
[001564] A Modalidade 370 é um método da modalidade 369 em que o método compreende a aplicação de L-arginina na porção aérea da planta.
[001565] A Modalidade 371 é um método da modalidade 369, em que o método compreende a aplicação de L-arginina na semente da planta.
[001566] A Modalidade 372 é um método de qualquer uma das modalidades 365-371, em que as sementes no meio de crescimento de plantas compreendendo o membro da família de Bacillus cereus recombinante ou a bactéria formadora de esporos recombinante ou se-mentes as quais o membro da família de Bacillus cereus recombinante ou a bactéria formadora de esporos recombinante foi aplicada tem uma taxa de germinação ou tem uma raiz principal mais longa depois da germinação em comparação com as sementes cultivadas nas mesmas condições no meio de crescimento de planta idêntico que não contém o membro da família Bacillus cereus recombinante ou a bactéria formadora de esporos recombinante ou sementes as quais o membro da família Bacillus cereus recombinante ou a bactéria formadora de esporos recombinante não foi aplicado e cultivado sob as mesmas condições.
[001567] A Modalidade 373 é um método para a entrega de ácidos nucleicos a uma planta que compreende: a introdução em um meio de crescimento de plantas de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta ou em uma área em torno de uma planta ou uma semente de planta um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296 ou uma formulação que compreende um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que o membro da família Bacillus cereus recombinante expressa a proteína de fusão que compreende uma proteína de ligação a ácido nucleico e em que a proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico é ligada a uma molécula de ácido nucleico.
[001568] A Modalidade 374 é um método de 373, em que o membro da família de Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias endofíticas.
[001569] A Modalidade 375 é um método da modalidade 374, em que a cepa de bactérias endofíticas compreende um membro da família de Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977) ou Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EEB00184 (NRRL B-67122), membro da família Bacillus cereus EEB00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001570] A Modalidade 376 é um método da modalidade 375, em que a cepa de bactérias endofíticas compreende membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977) ou Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EEB00184 (NRRL B-67122), membro da família Bacillus cereus EEB00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001571] A Modalidade 377 é um método para a entrega de ácidos nucleicos a uma planta que compreende: introduzir em um meio de crescimento de plantas uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que a bactéria formadora de esporos recombinante ex-pressa a proteína de fusão que compreende uma proteína de ligação a ácido nucleico e em que a proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico é ligada a uma molécula de ácido nucleico.
[001572] A Modalidade 378 é um método da modalidade 377, em que a bactéria formadora de esporos recombinante compreende uma cepa de bactérias endofíticas.
[001573] A Modalidade 379 é um método da modalidade 378, em que a cepa de bactérias endofíticas compreende Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), Bacillus subtilis EE405 (NRRL B50978), Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975) ou Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976) ou Bacillus pumilus EEB00143 (NRRL B-67123).
[001574] A Modalidade 380 é um método para a entrega de uma mo-lécula de ácido nucleico a um animal, inseto ou verme que compreende alimentar um animal, um inseto ou verme com uma planta modificada para compreender um nível da molécula de ácido nucleico que é maior do que o nível da molécula de ácido nucleico na mesma planta que não tenha sido modificada, cultivada sob as mesmas condições.
[001575] A Modalidade 381 é um método para a entrega de uma mo-lécula de ácido nucleico a um animal, inseto ou verme de alimentação, compreendendo alimentar um animal, inseto ou verme: um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante; ou uma bactéria formadora de esporos recombinante que ex-pressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direciona a proteína de fusão para a superfície de um esporo da bactéria; em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico e a molécula de ácido nucleico é ligada à proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico.
[001576] A Modalidade 382 é o método da modalidade 380 ou 381, em que o verme é um nemátodo.
[001577] A Modalidade 383 é um método para a entrega de uma mo-lécula de ácido nucleico para um fungo ou um protozoário, compreen-dendo o contato de um fungo ou um protozoário com: um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante; ou uma bactéria formadora de esporos recombinante que ex-pressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporos que direciona a proteína de fusão para a superfície de um esporo da bactéria; em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico e a molécula de ácido nucleico é ligada à proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico.
[001578] A Modalidade 384 é um método de qualquer uma das modalidades 373-379, e 381-383, em que a proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico está fisicamente ligada ao exosporium do membro da família de Bacillus cereus recombinante ou ao revestimento de esporos da bactéria formadora de esporos recombinante.
[001579] A Modalidade 385 é um método de qualquer uma das modalidades 373-384, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma molécula de RNA moduladora; uma molécula de RNAi, um microRNA, uma aptâmero; ou uma molécula de DNA que codifica uma molécula de RNA moduladora, uma molécula de RNAi, um microRNA ou um aptâmero.
[001580] A Modalidade 386 é um método de qualquer uma das modalidades 381-385, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-29, 48-63, 100-141, e 186-296.
[001581] A Modalidade 387 é um método de qualquer uma das modalidades 381-386, em que a proteína de fusão compreende uma pro-teína de fusão de qualquer uma das modalidades 252-266.
[001582] A Modalidade 388 é um método de qualquer uma das modalidades 381-385, em que a proteína de revestimento de esporos compreende uma proteína CotB, uma proteína CotC, uma proteína CgeA, uma proteína CotB/H, uma proteína CotG, uma proteína X, uma proteína de revestimento de esporos ou uma proteína CotY.
[001583] A Modalidade 389 é um método da modalidade 388, em que a proteína de revestimento de esporos compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 252-259.
[001584] A Modalidade 390 é um método para estimular o crescimento de plantas que compreende: a introdução em um meio de crescimento de plantas de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou uma semente de planta um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 64-70, 74-77 e 87-99, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma enzima envolvida na solubilização de nutrientes, uma protease, uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína CotE uma proteína CotO, uma proteína ExsY, uma proteína ExsFA/BxpB, uma proteína CotY, uma proteína ExsFB, uma proteína ExsJ, uma pro-teína ExsH, uma proteína YjcA, uma proteína YjcB, uma proteína BclC, uma proteína BxpA, uma proteína BclE, uma proteína BetA/BAS3290, uma proteína ExsA, uma proteína ExsK, uma proteína ExsB, uma pro-teína YabG, ou uma proteína Tgl, em que a expressão da enzima, em que a expressão da enzima envolvida na solubilização de nutrientes, a protease, uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína CotE uma proteína CotO, uma proteína ExsY, uma proteína ExsFA/BxpB, uma proteína CotY, uma proteína ExsFB, uma proteína ExsJ, uma proteína ExsH, uma proteína YjcA, uma proteína YjcB, uma proteína BclC, uma proteína BxpA, uma proteína BclE, uma proteína BetA/BAS3290, uma proteína ExsA, uma proteína ExsK, uma proteína ExsB, uma proteína YabG, ou uma proteína Tgl é aumentada em comparação com a expressão da enzima envolvida na solubilização de nutrientes, a pro-tease, uma proteína BclA, uma proteína BclB, uma proteína CotE uma proteína CotO, uma proteína ExsY, uma proteína ExsFA/BxpB, uma proteína CotY, um ExsFB proteína, uma proteína ExsJ, uma proteína ExsH, uma proteína YjcA, uma proteína YjcB, uma proteína BCLC, uma proteína BxpA, uma proteína BclE, uma proteína beta/BAS3290, uma proteína ExsA, uma proteína ExsK, uma proteína ExsB, uma proteína YabG, ou uma proteína Tgl em um membro da família Bacillus cereus do tipo selvagem sob as mesmas condições.
[001585] A Modalidade 391 é um método para melhorar a resistência ao stress de uma planta compreendendo: a introdução em um meio de crescimento de plantas de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 64, 65 e 78-83, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou ou aplicar em uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou uma semente de planta um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 64, 65 e 78-83, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que membro da família recombinante Bacillus cereus expressa um superóxido dismutase ou uma arginase, em que a ex-pressão da superóxido dismutase ou arginase é aumentada como comparado com a expressão da superóxido dismutase ou a arginase em um membro da família Bacillus cereus do tipo selvagem sob as mesmas condições.
[001586] A Modalidade 392 é um método para proteger uma planta de um patógeno, compreendendo: a introdução em um meio de crescimento de plantas de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 64, 65 e 74-7, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta, ou uma área em torno de uma planta ou uma semente de planta um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 64, 65 e 74-77, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que o membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma protease, em que a expressão da protease é aumentada em comparação com a expressão da protease em um membro da família Bacillus cereus do tipo selvagem sob as mesmas condições.
[001587] A Modalidade 393 é um método para retardar a germinação de um esporo de um membro da família Bacillus cereus compreendendo a modificação do membro da família de Bacillus cereus para expressar uma hidrolase de inosina-uridina ou uma alanina racemase, em que a expressão da hidrolase de inosina-uridina ou a alanina racemase é aumentada em comparação com a expressão da hidrolase de inosina-uridina ou a alanina racemase em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem nas mesmas condições.
[001588] A Modalidade 394 é um método de qualquer uma das modalidades 357-379 e 381-393, que compreende ainda a inativação do membro da família Bacillus cereus recombinante ou a bactéria formadora de esporos recombinante antes da introdução do meio de crescimento de plantas ou aplicação em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta.
[001589] A Modalidade 395 é um método da modalidade 394, em que a inativação compreende submeter o membro da família Bacillus cereus recombinante ou a bactéria formadora de esporos recombinante a tratamento térmico; irradiação gama; irradiação de raios-x; irradiação UV-A; irradiação UV-B; tratamento com glutaraldeído, formaldeído, peróxido de hidrogênio, ácido acético, água sanitária, clorofórmio, ou fenol ou uma combinação dos mesmos.
[001590] A Modalidade 396 é um método da modalidade 394 ou 395, em que a inativação compreende modificar o membro da família Bacillus cereus recombinante ou uma bactéria formadora de esporos recombinante para expressar uma protease de esporo de germinação ou uma endonuclease de não específica, em que a expressão da protease de esporo de germinação ou a endonuclease não específica é aumentada em comparação com a expressão da protease de esporo de germinação ou a endonuclease de não específica em um membro da família Bacillus cereus do tipo selvagem sob as mesmas condições, e em que a bactéria formadora de esporos recombinante compreende uma bactéria recombinante do gênero Bacillus.
[001591] A Modalidade 397 é um método para a remoção de exosporium de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante que compreende: submeter uma suspensão compreendendo esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 à centrifugação ou filtração para produzir frag-mentos de exosporium que são separados dos esporos; em que os fragmentos de exosporium compreende a proteína de fusão.
[001592] A Modalidade 398 é um método da modalidade 397, em que o método compreende submeter a suspensão compreendendo os esporos a centrifugação e compreende ainda a coleta do sobrenadante, em que o sobrenadante compreende os fragmentos do exosporium sendo significativamente livre de esporos.
[001593] A Modalidade 399 é um método da modalidade 397, em que o método compreende submeter a suspensão compreendendo os esporos a centrifugação e compreende ainda a coleta do filtrado, em que o filtrado compreende os fragmentos do exosporium sendo significativamente livres de esporos.
[001594] A Modalidade 400 é um método para estimular o crescimento de plantas que compreende: introdução de fragmentos de exósporo ou uma formulação da modalidade 399 em um meio de crescimento de plantas; ou aplicação de fragmentos de exosporium ou uma formulação da modalidade 399 em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta; em que os fragmentos de exosporium são derivados de es-poros de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende a proteína de fusão e a proteína de fusão compreende uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas.
[001595] A Modalidade 401 é um método para proteger uma planta a partir de um patógeno ou melhorar a resistência ao stress em uma planta, compreendendo: introdução de fragmentos de exósporo ou uma formulação da modalidade 399 em um meio de crescimento de plantas; ou aplicação de fragmentos de exosporium ou uma formulação da modalidade 399 em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou uma semente de planta; em que os fragmentos de exosporium são derivados de es-poros de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende a proteína de fusão e a proteína de fusão compreende uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno ou uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta.
[001596] A Modalidade 402 é um método da modalidade 401, em que o método é um método para proteger uma planta de um patógeno e em que a proteína de fusão compreende proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno.
[001597] A Modalidade 403 é um método para proteção de uma planta de um patógeno da modalidade 402, em que a planta é cultivada em um meio de crescimento de plantas compreendendo os fragmentos de exosporium que são menos suscetíveis à infecções com o patógeno em comparação com plantas cultivadas sob as mesmas condições no meio de crescimento de plantas que não contém os fragmentos de exosporium.
[001598] A Modalidade 404 é um método da modalidade 401, em que o método é um método para melhorar a resistência ao stress de uma planta e em que a proteína de fusão compreende uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta.
[001599] A Modalidade 405 é um método para aumentar a resistência ao stress de uma planta da modalidade 404, em que plantas cultivadas no meio de crescimento de plantas que compreende os fragmentos de exosporium são menos suscetíveis ao stress em comparação com as plantas cultivadas sob as mesmas condições no meio de crescimento de planta idêntico que não contém os fragmentos de exosporium.
[001600] A Modalidade 406 é um método para a imobilização de fra-gmentos de exosporium em uma planta que compreende: introdução de fragmentos de exósporo ou uma formulação da modalidade 399 em um meio de crescimento de plantas; ou aplicação de fragmentos de exosporium ou uma formulação da modalidade 399 em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta; em que os fragmentos de exosporium são derivados de es-poros de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende a proteína de fusão e a proteína de fusão compreende uma proteína ou peptídeo de ligação em plantas.
[001601] A Modalidade 407 é um método de qualquer uma das modalidades 363, 364 e 406, em que a proteína ou peptídeo de ligação em plantas direciona seletivamente e mantém o membro da família de Bacillus cereus recombinante, a bactéria formadora de esporos recombinante ou os fragmentos de exosporium em uma planta.
[001602] A Modalidade 408 é um método da modalidade 407, em que a proteína ou peptídeo de ligação em plantas direciona seletivamente e mantém o membro da família de Bacillus cereus recombinante, a bactéria formadora de esporos recombinante ou o fragmento de exosporium nas raízes de plantas, subestruturas de raízes, uma porção aérea de uma planta ou uma subestrutura de uma porção aérea de uma planta.
[001603] A Modalidade 409 é um método para estimular a germinação de uma semente de planta, compreendendo: introdução de fragmentos de exósporo ou uma formulação da modalidade 399 em um meio de crescimento de plantas; ou aplicação de fragmentos de exosporium ou uma formulação da modalidade 399 em uma planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta; em que os fragmentos de exosporium são derivados de es-poros de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende a proteína de fusão e a proteína de fusão compreende uma superóxido desmutase ou uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico.
[001604] A Modalidade 410 é um método da modalidade 409, em que o método compreende a aplicação de fragmentos de exosporium em uma semente de planta.
[001605] A Modalidade 411 é um método da modalidade 409 ou 410, compreendendo ainda a aplicação de L-arginina no meio de crescimento de plantas, a semente de planta ou área em torno da semente de planta.
[001606] A Modalidade 412 é um método da modalidade 411, em que o método compreende a aplicação de L-arginina na semente da planta.
[001607] A Modalidade 413 é um método de qualquer uma das modalidades 409-412, em que as sementes no meio de crescimento de plantas compreendendo os fragmentos ou sementes de exosporium aos quais os fragmentos de exosporium foram aplicados com uma taxa de germinação maior ou com uma raiz principal mais longa após a germinação em comparação com as mesmas sementes cultivadas sob as mesmas condições no meio de crescimento da planta idêntico que não contém os fragmentos de exosporium ou as mesmas sementes cultivadas sob as mesmas condições nas quais os fragmentos de exosporium não foram aplicados.
[001608] A Modalidade 414 é um método para a entrega de ácidos nucleicos em uma planta, compreendendo: introdução de fragmentos de exósporo ou uma formulação da modalidade 399 em um meio de crescimento de plantas; ou aplicação de fragmentos de exosporium ou uma formulação da modalidade 399 em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta; em que os fragmentos de exosporium são derivados de es-poros de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende a proteína de fusão e a proteína de fusão compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a ácidos nucleicos e em que a proteína ou peptídeo de ligação a ácidos nucleicos é ligada a uma molécula de ácido nucleico.
[001609] A Modalidade 415 é um método para a entrega de uma mo-lécula de ácido nucleico a um animal, inseto ou verme compreendendo alimentar um animal, inseto ou verme com fragmentos de exosporium, em que os fragmentos de exosporium são derivados de um membro da família da Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende a proteína de fusão, em que a proteína de fusão compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico e em que a proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico é ligado a uma molécula de ácido nucleico.
[001610] A Modalidade 416 é o método da modalidade 415, em que o verme é um nemátodo.
[001611] A Modalidade 417 é um método para a entrega de uma mo-lécula de ácido nucleico a um fungo ou protozoário, compreendendo o contato de um fungo ou um protozoário com fragmentos de exosporium, em que os fragmentos de exosporium são derivados de uma membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende a proteína de fusão, em que a proteína de fusão compreende uma proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico, e em que a proteína ou peptídeo de ligação a ácido nucleico é ligada a uma molécula de ácido nucleico.
[001612] A Modalidade 418 é um método de qualquer uma das modalidades 414-417, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma molécula de RNA moduladora; uma molécula de RNAi, um microRNA, uma aptâmero; ou uma molécula de DNA que codifica uma molécula de RNA moduladora, uma molécula de RNAi, um microRNA ou um aptâmero.
[001613] A Modalidade 419 é um método de qualquer uma das modalidades 414-418, em que a proteína de fusão compreende uma pro-teína de fusão de qualquer uma das modalidades 253-266.
[001614] A Modalidade 410 é um método para estimular a germinação de uma semente de planta que compreende a introduzir num meio de crescimento de plantas ou a aplicação a uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta: (i) uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico; (ii) uma superóxido dismutase; ou (iii) um micro-organismo recombinante que expressa uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou uma superóxido dismutase, em que a expressão da enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou a superóxido dismutase é aumentada em comparação com a expressão da enzima que catalisa a produção de óxido nítrico ou a superóxido dismutase num micro-organismo de tipo selvagem nas mesmas condições.
[001615] A Modalidade 421 é um método da modalidade 420, em que o método compreende a aplicação da enzima ou do microorganismo em uma semente de planta.
[001616] A Modalidade 422 é um método da modalidade 420 ou 421, compreendendo ainda a aplicação de L-arginina no meio de crescimento de plantas, a semente de planta ou área em torno da semente de planta.
[001617] A Modalidade 413 é um método da modalidade 42, em que o método compreende a aplicação de L-arginina na semente da planta.
[001618] A Modalidade 424 é um método de qualquer uma das modalidades 420-423, em que as sementes no meio de crescimento de plantas compreendendo a enzima ou o micro-organismo ou sementes às quais a enzima ou o micro-organismo foram aplicados têm uma taxa de germinação aumentada ou uma raiz principal mais longa após a germinação em comparação com sementes cultivadas nas mesmas condições no meio de crescimento de planta idêntico que não contém enzima ou o micro-organismo ou sementes aos quais a enzima ou o micro-organismo não foi aplicado, cultivado sob as mesmas condições.
[001619] A Modalidade 425 é uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 420-424, em que a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico compreende uma sintase ou arginase de óxido nítrico.
[001620] A Modalidade 426 é um método da modalidade 327, em que a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico compreende uma sintase de óxido nítrico.
[001621] A Modalidade 427 é um método da modalidade 328, em que a sintase de óxido nítrico compreende uma sintase de óxido nítrico de Bacillus thuringiensis BT013A ou Bacillus subtilis 168.
[001622] A Modalidade 330 é um método da modalidade 428 ou 427, em que a sintase de óxido nítrico compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 260 ou 261.
[001623] A Modalidade 429 é um método de qualquer uma das modalidades 420-438, em que a superóxido dismutase compreende uma superóxido dismutase 1 (SODA1) ou uma superóxido dismutase 2 (SODA2).
[001624] A modalidade 430 é um método das modalidades 429, em que a superóxido dismutase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 155 ou 156.
[001625] A Modalidade 431 é um método de qualquer uma das modalidades 420-430, em que o micro-organismo recombinante compreende uma espécie de Bacillus, Escherechia coli, uma espécie de Aspergillus ou uma espécie de Sacchromyces.
[001626] A Modalidade 432 é um método da modalidade 431, em que a espécie de Bacillus compreende um membro da família de Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis ou Bacillus megaterium.
[001627] A Modalidade 433 é um método da modalidade 431, em que a espécie Aspergillus compreende Aspergillus niger ou em que a espécie Sacchromyces compreende Sacchromyces cerevisiae.
[001628] A Modalidade 434 é um método de qualquer uma das modalidades 420-433, em que a enzima ou o micro-organismo recombinante é introduzido no meio de crescimento de plantas, ou aplicado a uma planta, uma semente de planta ou uma área que rodeia uma planta ou uma semente de planta numa formulação compreendendo a enzima ou o micro-organismo recombinante e um transportador aceitável em agricultura.
[001629] A Modalidade 435 é um método para a entrega de enzimas a uma planta que compreende: a introdução em um meio de crescimento de plantas de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta ou em uma área em torno de uma planta ou uma semente de planta um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296 ou uma formulação que compreende um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima.
[001630] A Modalidade 436 é um método para a entrega de enzimas a uma planta que compreende: introduzir em um meio de crescimento de plantas uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima.
[001631] A Modalidade 437 é um método para a entrega de enzimas para uma planta da modalidade 435 ou 436, em que a enzima está ligada fisicamente ao exosporium do membro da família de Bacillus cereus recombinante ou para o revestimento de esporos da bactéria formadora de esporos recombinante.
[001632] A Modalidade 438 é um método para a entrega de enzimas a uma planta que compreende: introdução de fragmentos de exósporo ou uma formulação da modalidade 399 em um meio de crescimento de plantas; ou aplicação de fragmentos de exosporium ou uma formulação da modalidade 399 em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta; em que os fragmentos de exosporium são derivados de es-poros de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende a proteína de fusão e a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima.
[001633] A Modalidade 439 é um método da modalidade 438, em que o método compreende ainda o tratamento da planta com um agente de penetração, um surfactante, um detergente, um óleo ou uma combinação dos mesmos.
[001634] A Modalidade 440 é o método de qualquer uma das moda-lidades 435-441, em que a enzima é apropriada para a degradação da biomassa, digerindo material celulósico, auxiliando na digestão em um sistema digestivo de um animal alvo para o qual a planta pode ser ali-mentada ou para a produção de biocombustíveis.
[001635] A Modalidade 441 é um método da modalidade 440, em que a enzima compreende uma protease não específica, uma metaloprotease, uma celulase, uma xilanase, uma fosfatase, uma endoglucanase, uma exoglucanase, uma β-glucosidase, uma amilase, uma pectinase, uma xilosidase, uma lipase, uma fosfolipase, ou uma combinação dos mesmos.
[001636] A Modalidade 442 é o método de qualquer uma das modalidades 434-441, em que a planta é uma colheita selecionada a partir de milho, alfafa, trigo, uma cultura de pasto, uma colheita de forragem, soja, gramíneas, jicama, sorgo doce, cana de açúcar, ou uma combinação dos mesmos.
[001637] A Modalidade 443 é um método para alterar uma propriedade de uma planta compreendendo: a introdução em um meio de crescimento de plantas de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296, ou uma formulação que compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta ou em uma área em torno de uma planta ou uma semente de planta um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-141 e 168-296 ou uma formulação que compreende um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma molécula de sinalização da planta ou uma enzima que afeta a composição de planta.
[001638] A Modalidade 444 é um método para alterar uma propriedade de uma planta compreendendo: introduzir em um meio de crescimento de plantas uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que compreende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; ou aplicar em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-268, ou uma formulação que com-preende uma bactéria formadora de esporos recombinante de qualquer uma das modalidades 338 e 342-355; em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma molécula de sinalização da planta ou uma enzima que afeta a composição de planta.
[001639] A Modalidade 445 é um método da modalidade 443 ou 444, em que a proteína ou peptídeo de interesse está ligada fisicamente ao exosporium do membro da família de Bacillus cereus recombinante ou para o revestimento de esporos da bactéria formadora de esporos recombinante.
[001640] A Modalidade 446 é um método para alterar uma propriedade de uma planta compreendendo: introdução de fragmentos de exósporo ou uma formulação da modalidade 399 em um meio de crescimento de plantas; ou aplicação de fragmentos de exosporium ou uma formulação da modalidade 399 em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente de planta; em que os fragmentos de exosporium são derivados de es-poros de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende a proteína de fusão e a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma molécula de sinalização de planta ou uma enzima que afeta a composição da planta.
[001641] A Modalidade 447 é um método da modalidade 446, em que o método compreende ainda o tratamento da planta com um agente de penetração, um surfactante, um detergente, um óleo ou uma combinação dos mesmos.
[001642] A Modalidade 448 é o método de qualquer uma das moda-lidades 435-447, em que o membro da família de Bacillus cereus recombinante, a bactéria formadora de esporos recombinante ou os fra-gmentos de exosporium são aplicados a folhagem da planta antes da colheita.
[001643] A Modalidade 449 é o método de qualquer uma das moda-lidades 443-450, em que a enzima compreende uma endoglucanase, uma protease, uma fosfolipase, uma aminociclopropano-1-ácido carboxílico desaminase, uma lipase ou uma combinação dos mesmos.
[001644] A Modalidade 450 é o método de qualquer uma das moda-lidades 443-448, em que a molécula de sinalização da planta compre-ende um peptídeo de flagelina, um criptogeína, um harpina, uma proteína semelhante a harpina, uma enzima que degrada ou altera uma fonte de nutrientes bacteriana, fúngica ou vegetal ou uma combinação dos mesmos.
[001645] A Modalidade 451 é o método de qualquer uma das moda-lidades 443-450, em que a planta é selecionada a partir de uva, cana de açúcar, Panicum virgatum, sorgo doce, um grão, um cereal, sementes de colza, canola, soja, girassol, maconha ou uma combinação dos mesmos.
[001646] A Modalidade 452 é o método de qualquer uma das moda-lidades 443-451, em que a propriedade da planta que será alterada compreende uma alteração metabólica.
[001647] A Modalidade 453 é o método da modalidade 452, em que a alteração metabólica compreende absorção aumentada de macronutrientes ou micronutrientes ou teor de tecido de planta através do alar-gamento dos seus sistemas de raízes, aumento do teor de proteína, aumento da absorção de nitrogênio, teor de óleo modificado, teor de açúcar ou sacarose modificado, aumento no teor de composto medicinal, aumento no teor de canabinoide ou uma combinação dos mesmos.
[001648] A Modalidade 454 é um método de qualquer uma das mo- dalidades 357-379, 390-396, 400-414 e 420-453, em que o meio de crescimento de plantas é suplementado com um substrato ou um cofactor para uma enzima.
[001649] A Modalidade 455 é um método da modalidade 454, em que o substrato ou o cofator compreende triptofano, um monofosfato de adenosina, um difosfato de adenosina, um trifosfato de adenosina (por exemplo, a adenosina-3-trifosfato), indol, um trimetafosfato, ferredoxina, acetoína, diacetil, piruvato, acetolactato, pectina, celulose, metilcelulose, amido, quitina, pectina, uma proteína refeição, um derivado de celulose, um fosfato, acetoína, quitosano, um derivado inativo do indol-3-ácido acético, um derivado inativo do ácido giberélico, xilano, um arabinoxilano, uma gordura, uma cera, um óleo, um ácido fítico, uma lignina, um ácido húmico, colina, um derivado de colina, prolina, um poliprolina, uma proteína rica em prolina, uma refeição rica em prolina, fenilalanina, corismato, L-arginina, NADH, NADPH, ATP, GTP, citocromo C, citocromo P450, ou uma combinação dos mesmos.
[001650] A Modalidade 456 é um método da modalidade 455, em que a adenosina trifosfato compreende adenosina-3-trifosfato.
[001651] A Modalidade 457 é um método de qualquer uma das modalidades 357-379, 390-396, 400-414, e 420-456, compreendendo sementes de revestimento com o membro da família Bacillus cereus recombinante, a bactéria formadora de esporos recombinante ou os fragmentos de exosporium ou uma formulação contendo o membro da família Bacillus cereus recombinante, a bactéria formadora de esporos recombinante ou os fragmentos de exosporiums antes da plantação.
[001652] A Modalidade 458 é um método de qualquer uma das modalidades 357-379, 390-396, 400-414, e 420-456, compreendendo a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, a bactéria formadora de esporos recombinante ou os fragmentos de exosporium ou uma formulação contendo o membro da família Bacillus cereus recombinante, a bactéria formadora de esporos recombinante ou os fragmentos de exosporiums em uma porção aérea da planta.
[001653] A Modalidade 459 é um método de qualquer uma das modalidades 357-379, 390-396, 400-414, e 420-458, em que a introdução do membro da família de Bacillus cereus recombinante, a bactéria formadora de esporos recombinante ou os fragmentos de exosporium no meio de crescimento de planta compreende a aplicação de uma formulação líquida ou sólida contendo o membro da família de Bacillus cereus recombinante, a bactéria formadora de esporos recombinante ou os fragmentos de exosporium no meio.
[001654] A Modalidade 460 é um método da modalidade 459, em que o método compreende a aplicação da formulação para o meio de crescimento de plantas antes, concorrentemente com, ou após a plan-tação das sementes, mudas, estacas, bolbos, ou plantas no meio de crescimento da planta.
[001655] A Modalidade 461 é um método de qualquer uma das modalidades 357-379, 390-396, 400-414, e 420-460, que compreende ainda a introdução de pelo menos um agrotóxico no meio de crescimento de plantas ou a aplicação de pelo menos um agroquímico em plantas ou sementes.
[001656] A Modalidade 462 é um método da modalidade 461, em que o agrotóxico compreende um fertilizante, um material fertilizante de micronutrientes, um inseticida, um herbicida, um fungicida, um moluscicida, um algicida, um alterador do crescimento de plantas, um inoculante bacteriano, um inoculante fúngico ou uma combinação dos mesmos.
[001657] A Modalidade 463 é uma formulação, sementes de plantas ou inóculo da modalidade 350 ou um método da modalidade 462, em que o agrotóxico compreende um fertilizante e o fertilizante compreende um fertilizante líquido; em que o agrotóxico compreende um materi al fertilizante de micronutrientes e o material fertilizante de micronutrientes compreende ácido bórico, um borato, frita borácica, sulfato de cobre, frita de cobre, um quelato de cobre, um tetraborato de sódio decahidratado, um sulfato de ferro, um óxido de ferro, um sulfato de amônio de ferro, frita ferrosa, um quelato de ferro, um sulfato de manganês, um óxido de manganês, um quelato de manganês, um cloreto de manganês, uma frita de manganês, um molibdato de sódio, um ácido molibdico, um sulfato de zinco, um óxido de zinco, um carbonato de zinco, uma frita de zinco, um fosfato de zinco, um quelato de zinco ou uma combinação dos mesmos; em que o agrotóxico compreende um inseticida e o inseticida compreende um organofosfato, um carbamato, um piretroide, um acaricida, um alquil ftalato, ácido bórico, um borato, um fluoreto, um enxofre, uma ureia substituída haloaromática, um éster de hidrocarboneto, um inseticida com base biológica ou uma combinação dos mesmos; em que o agrotóxico compreende um herbicida, e o herbicida compreende um compostos clorofenóxi, um composto nitrofenólico, um composto nitrocresólico, um composto dipiridil, uma acetamida, um ácido alifático, uma anilida, uma benzamida, um ácido benzoico, um derivado de ácido benzoico, ácido anisico, um derivado de ácido anisico, uma benzonitrila, dióxido de benzotiadiazinona, um tiocarbamato, um carbamato, um carbanilato, cloropiridinila, um derivado de ciclohexanona, um derivado de dinitroaminobenzeno, um composto de fluorodinitrotoluidina, isoxazolidinona, ácido nicotínico, isopropilamina, um derivado de isopropilamina, oxadiazolinona, um fosfato, um ftalato, um composto de ácido picolínico, uma triazina, um triazol, uma uracila, um derivado de ureia, endotal, clorato de sódio, ou uma combinação destes; em que o agrotóxico compreende um fungicida, e que o fungicida compreende um benzeno substituído, um tiocarbamato, um etileno bis-ditiocarbamato, uma tioftalidamida, um composto de cobre, um composto de organomercúrio, um composto de organo-estanho, um composto de cádmio, anilazina, benomil, ciclohexamida, dodina, etridiazol, iprodiona, metlaxil, tiamimefon, triforina, ou uma combinação destes; em que o agrotóxico compreende um inoculante de fungos e o inoculante de fungos compreende um inoculante de fungos da família Glomeraceae, um inoculante de fungos da família Claroidoglomeraceae, um inoculante de fungos da família Gigasporaceae, um inoculante de fungos da família Acaulosporaceae, um inoculante de fungos da família Sacculosporaceae, um inoculante de fungos da família Entrophosporaceae, um inoculante de fungos da família Pacidsporaceae, um inoculante de fungos da família Diversisporaceae, um inoculante de fungos da família Paraglomeraceae, um inoculante de fungos da família Archaeosporaceae, um inoculante de fungos da família Geosiphonaceae, um inoculante de fungos da família Ambisporaceae, um inoculante de fungos da família Scutellosporaceae, um inoculante de fungos da família Dentiscultataceae, um inoculante de fungos da família Racocetraceae, um inoculante de fungos do filo Basidiomycota, um inoculante de fungos do filo Ascomycota, um inoculante fúngico inoculante do filo Zygomycota, ou uma combinação destes; ou em que o agrotóxico compreende um inoculante bacteriano e o inoculante bacteriano compreende um inoculante bacteriano do gênero Rhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Bradyrhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Mesorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Azorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Allorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Sinorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Kluyvera, um inoculante bacteriano do gênero Azotobacter, um inoculante bacteriano do gênero Pseudomonas, um inoculante bacteriano do gênero Azospirillium, um inoculante bacteriano do gênero Bacilo, um inoculante bacteriano do gênero Streptomyces, um inoculante bacteriano do gênero Paenibacillus, um inoculante bacteriano do gênero Paracoccus, um inoculante bacteriano do gênero Enterobacter, um inoculante bacteriano do gênero Alcaligenes, um inoculante bacteriano do gênero Mycobacterium, um inoculante bacteriano do gênero Trichoderma, um inoculante bacteriano do gê-neroGliocladium, um inoculante bacteriano do gênero Glomus, um inoculante bacteriano do gênero Klebsiella, ou uma combinação dos mesmos.
[001658] A Modalidade 464 é uma formulação, semente de plantas ou inóculo da modalidade 350, ou um método da modalidade 462, em que o agrotóxico compreende um fungicida, e que o fungicida compreende aldimorf, ampropilfos, potássio de ampropilfos, andoprim, anilazina, azaconazol, azoxistrobina, benalaxil, benodanil, benomil, benzamacril, benzamacril-isobutila, bialafos, binapacril, bifenila, bitertanol, blasticidina-S, boscalida, bromuconazol, bupirimato, butiobato, polissulfeto de cálcio, capsimicina, captafol, captano, carbendazima, carvon, quinometionato, clobentiazona, clorfenazol, cloroneb, cloropicrina, clorotalonil, clozolinato, clozilacona, cufraneba, cimoxanil, ciproconazol, ciprodinil, cyprofuram, debacarb, diclorfena, diclobutrazol, diclofluanid, diclomezina, diclorana, dietofencarba, dimetirimol, dimetomorfa, dimoxistrobina, diniconazol, diniconazol-M, dinocape, difenilamina, dipiritiona, ditalimfos, ditianona, dodemorf, dodina, drazoxolona, edifenfos, epoxiconazol, etaconazol, etirimol, etridiazol, famoxadona, fenapanil, fenarimol, fenbuconazol, fenfuram, fenitropan, fenepiclonil, fenepropidina, fenepropimorfa, acetato de fentina, hidróxido de fentina, ferbam, ferimzona, fluazinam, flumetover, fluoromida, fluquinconazol, flurprimidol, flusilazol, flusulfamida, flutolanil, flutriafol, folpete, fosetilalumínio, fosetil-sódio, ftalida, fuberidazol, furalaxila, furametpir, furcarbonil, furconazol, furconazol-cis, furmeciclox, guazatina, hexaclorobenzeno, hexaconazol, himexazol, imazalil, imibenconazol, iminoctadina, albesilato de iminoctadina, triacetato de iminoctadina, iodocarbe, iprobenfos (IBP), iprodiona, irumamicina, isoprotiolano, isovalediona, casugamicina, cresoxima-metila, preparações de cobre, tais como: hi-dróxido de cobre, naftenato de cobre, oxicloreto de cobre, sulfato de cobre, óxido de cobre, oxina de cobre e mistura de Bordeaux, mancopper, mancozebe, manebe, meferimzona, mepanipirima, mepronil, metconazol, metasulfocarbe, metfuroxamo, metirama, metomeclam, metsulfovax, mildiomicina, miclobutanil, miclozolina, dimetilditiocarbamato de níquel, nitrotal-isopropílico, nuarimol, ofurace, oxadixil, oxamocarbe, ácido oxolínico, oxicarboxima, oxifentiina, paclobutrazol, pefurazoato, penconazol, pencicuron, fosdifeno, pimaricina, piperalina, polioxina, polioxorim, probenazol, procloraz, procimidona, propamocarbe, propanosine-sódio, propiconazol, propinebe, protiocinazol, pirazofos, pirifenox, pirimetanil, piroquilona, piroxifur, quinconazol, quintozeno (PCNB), enxofre e preparações de enxofre, tebuconazol, tecloftalam, tecnazeno, tetciclasis, tetraconazol, tiabendazol, ticiofeno, tifluzamida, tiofanato-metila, tioximida, tolclofos-metila, tolilfluanida, triadimefon, triadimenol, triazbutil, triazoxida, triclamida, triciclazol, tridemorfe, trifloxistrobina, triflumizol, triforina, uniconazol, validamicina A, vinclozolina, viniconazol, zarilamida, zineb, ziram e também Dagger G, OK-8705, OK-8801, a-(1,1-dimetiletil)-(3-(2-fenoxietil)-1H-1,2,4-triazol1-etanol, a-(2,4-diclorofenil)-[3-fluoro-3-propil-1 H--1,2,4-triazol-1etanol, a-(2,4-diclorofenil)-[3-metoxi-a-metil-1 H-1,2,4-triazol-1 -etanol, a-(5-metil -1,3-dioxan-5-il)-[3-[[4-(trifluorometil) -fenil]-metileno]-1 H1,2,4-triazol-1-etanol, (5RS,6RS)-6-hidroxi-2,2,7,7-tetrametil-5-(1 H1,2,4-triazol-1-il)-3-octanona, (E)-a-(metoxiimino)-N-metil-2-fenoxifenilacetamida, 1-isopropil{2-metil-1-[[[1-(4-metilfenil)-etil]-amino]carbonil]-propil}carbamato, 1-(2,4-diclorofenil)-2-(1 H-1,2,4-triazol-1-il)etanona-O-(fenil metil)-oxima, 1-(2-metil-1-naftalenil)-1 H-pirrol-2,5diona, 1-(3,5-diclorofenil)-3-(2-propenil)-2,5-pirrolidindiona, 1[(diiodometil)-sulfonil]-4-metil-benzeno, 1-[[2-(2,4-diclorofenil)-1, 3dioxolan-2-il]-metil]-1 H-imidazol, 1-[[2-(4-clorofenil)-3-feniloxiranil]- metil]-1 H-1,2,4-triazol, 1-[1-[2-[(2,4-diclorofenil)-metoxi]-fenil]-etenil]-1 H-imidazol, 1-metil -5-nonil-2-(fenilmetil)-3-pirroIidinol, 2',6'-dibromo-2metil-4'-trifluorometoxi-4'-trifluoro-metil-1, 3-tiazol -carboxanilida, 2,2dicloro-N-[1-(4-clorofenil)-etil]-1-etil-3-metil-ciclopropanocarboxamida, 2,6-dicloro-5-(metiltio)-4-pirimidinil-tiocianato, 2,6-dicloro-N-(4trifluorometilbenzil)-benzamida, 2,6-dicloro-N-[[4-(trifluorometil)-fenil]metil]-benzamida, 2-(2,3,3-triiodo-2-propenil)-2H-tetrazol, 2-[(1metiletil)-sulfonil]-5-(triclorometil)-1,3,4-tiadiazol, 2-[[6-desoxi-4-O-(4-0metil-(3-D-glicopiranosil)-a-D-glucopiranosil]-amino]-4-metoxi-1 Hpirrolo [2,3-d]pirimidina-5-carbonitrila, 2-aminobutano, 2-bromo-2(bromometil)-pentanedinitrila, 2-cloro-N-(2,3-dihidro-1,1,3-trimetil-1 Hinden-4-il)-3-pyridinecarboxamida, 2-cloro-N-(2,6-dimetilfenil)-N(isotiocianatometil)-acetamida, 2-fenilfenol (OPP), 3,4-dicloro-1-[4(difluorometoxi)-fenil]-pirrol-2,5-diona, 3,5-dicloro-N-[ciano[(1-metil-2propinil)-oxi]-metil]-benzamida, 3-(1,1-dimetilpropil-1-oxo-1H-indeno-2carbonitrila, 3-[2-(4-clorofenil)-5-etoxi-3-isoxazolidinil]-piridina, 4-cloro2-ciano-N,N-dimetil-5-(4-metilfenil)-1 H-imidazol-l-sulfonamida, 4-metiltetrazolo[1,5-a]quinazolin-5(4H)-ona, 8-(1,1-dimetiletil)-N-etil-N-propil1,4-dioxaspiro[4, 5]decano-2-metanamina, sulfato de 8hidroxiquinolina, 9Hhidrazida de xanteno-2-[(fenilamino)-carbonil]-9carboxílico, bis-(1-metiletil)-3-metil-4-[(3-metilbenzoil)-oxi]-2,5tiofenodicarboxilato, cis-1-(4-clorofenil)-2-(1 H-1,2,4-triazol-1-il)cicloheptanol, cloridrato de cis-4-[3-[4-(1,1-dimetilpropil)-fenil-2metilpropil]-2,6-dimetil-morfolina, [(4-clorofenil)-azo]-cianoacetato de etil, bicarbonato de potássio, sal metanotetratiol-sódio, 1-(2,3-dihydro2,2-dimetil-inden-1-il)-1 H-imidazol-5-carboxilato de metil, N-(2,6dimetilfenil)-N-(5-isoxazolilcarbonil)-DL-alaninato de metil, N(cloroacetil)-N-(2,6-dimetilfenil)-DL-alaninato de metil, N-(2,3-dicloro-4hidroxifenil)-1-metil-coclohexanecarboxamida, N-(2,6-dimetil fenil)-2metoxi-N-(tetra hidro-2-oxo-3-furanil)-acetamida, N-(2,6-dimetilfenil)-2- metoxi-N-(tetrahidro-2-oxo-3-tienil)-acetamida, N-(2-cloro-4-nitrofenil)4-metil-3-nitro-benzenossulfonamida, N-(4-ciclohexilfenil)-1,4,5,6tetrahidro-2-pirimidinamina, N-(4-hexilfenil)-1,4,5,6-tetrahidro-2pirimidinamina, N-(5-cloro-2-metilfenil)-2-metoxi-N-(2-oxo-3oxazolidinil)-acetamida, N-(6-metoxi)-3-piridinil)ciclopropanecarboxamida, N-[2,2,2-tricloro-1-[(cloroacetil)-amino]-etil]benzamida, N-[3-cloro-4,5-bis(2-propiniloxi)-fenil]-N'-metoximethanimidamida, sal N-formil-N-hidroxi-DL-alanina-sódio, [2(dipropilamino)-2-oxoetil]-etilfosforamidotioato de 0,0-dietil, fenilpropilfosforamidotioato de 0-metil S-fenil, 1,2,3-benzotiadiazol-7-carbotioato de S-metil, e espiro[2H]-1-benzopirano-2,1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-ona, N-triclorometil)tio-4ciclohexano-l,2-dicarboximida, diamida tetrametiltioperoxidicarbônico, N-(2,6-dimetilfenil)-N-(metoxiacetil)-DL-alaninato de metil, 4-(2,2-difluoro-l,3-benzodioxol-4-il)-l-H-pirrol-3-carbonitril ou uma combinação dos mesmos.
[001659] A Modalidade 465 é uma formulação, semente de plantas ou inóculo da modalidade 350, ou um método da modalidade 462, em que o agrotóxico compreende um inoculante bacteriano do gênero Bacilo, e o inoculante bacteriano do gênero Bacillus compreende Bacillus argri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus, Bacillus endorhythmos, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus, Bacillus lentimorbus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus medusa, Bacillus metiens, Bacillus natto, Bacillus nigrificans, Bacillus popillae, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus sphearicus, Bacillus spp., Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus unifagellatu, ou uma combinação dos mesmos.
[001660] A Modalidade 466 é uma formulação, uma semente de planta ou inóculo da modalidade 350 ou um método da modalidade 462, em que o agrotóxico compreende um herbicida, e o herbicida compreende 2,4-D, 2,4-DB, acetocloro, acifluorfeno, alacloro, ametrina, atrazina, aminopiralida, benefina, bensulfurona, bensulida, bentazona, bromacil, bromoxinil, butilato, carfentrazona, clorimurona, clorosulfurona, cletodim, clomazona, clopiralida, cloransulam, cicloato, DCPA, desmedifam, dicamba, diclobenila, diclofop, diclosulam, diflufenzopir, dimetenamida, diquat, diuron, DSMA, endotal, EPTC, etalfluralina, etofumesato, fenoxaprop, fluazifop-P, flucarbazona, flufenacet, flumetsulam, flumiclorac, clumioxazina, fluometurona, fluroxipir, fomesafen, foramsulfurona, glufosinato, flifosato, halosulfurona, hexazinona, imazametabenzo, imazamox, imazapic, imazaquina, imazetapir, isoxabeno, isoxaflutol, lactofeno, linuron, MCPA, MCPB, mesotriona, metolacloro-s, metribuzina, metsulfurona, molinato, MSMA, napropamida, naptalam, nicosulfurona, norflurazona, oryzalina, oxadiazona, oxifluorfeno, paraquat, ácido pelargônico, pendimetalina, fenmedifam, picloram, primisulfurona, prodiamina, prometrina, pronamida, propanil, prosulfurona, pirazona, piritiobac, quinclorac, quizalofop, rimsulfurona, setoxidim, sidurona, simazina, sulfentrazona, sulfometurona, sulfosul-furona, tebutiurona, terbacil, tiazopir, tifensulfurona, tiobencarb, tralcoxidim, trialato, triasulfurona, tribenuron, triclopir, trifluralina, triflusulfurona ou uma combinação dos mesmos.
[001661] A Modalidade 467 é uma formulação, semente de planta ou inóculo da modalidade 350 ou um método da modalidade 463, em que a formulação ou inóculo compreende um herbicida ou uma cepa de bactérias que é capaz de degradar o herbicida.
[001662] A Modalidade 468 é uma formulação, semente de plantas, inóculo ou método da modalidade 467, em que a cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida compreende membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), Bacillus cereus membro da família EE-B00377 (NRRL B-67119), Bacillus pseudomycoides EEB00366 (NRRL B-67120), ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B67121), ou uma combinação dos mesmos.
[001663] A Modalidade 469 é uma formulação, semente de planta, inóculo ou método de qualquer uma das modalidades 463-468, em que o herbicida compreende uma sulfonilurea, uma aril triazina, dicamba, um herbicida de fenóxi, 2,4-D, uma piretrina, um piretroide ou uma combinação dos mesmos.
[001664] A Modalidade 470 é uma formulação, semente de planta, inóculo ou método da modalidade 469, em que a sulfonilureia compre-ende sulfentrazona.
[001665] A Modalidade 471 é uma formulação, semente de planta ou inóculo de qualquer uma das modalidades 350 a 463-470 ou método de qualquer uma das modalidades 461-470, em que o fertilizante pode compreende sulfato de amônio, nitrato de amônio, nitrato-sulfato de amônio, cloreto de amônio, bissulfato de amônio, polissulfureto de amônio, tiossulfato de amônio, amoníaco aquoso, amoníaco anidro, polifosfato de amônio, sulfato de alumínio, nitrato de cálcio, nitrato de amônio de cálcio, sulfato de cálcio, magnesita calcificada, calcário calcítico, óxido de cálcio, nitrato de cálcio, calcário dolomítico, cal hidratada, carbonato de cálcio, fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, nitrato de magnésio, sulfato de magnésio, nitrato de potássio, cloreto de potássio, sulfato de potássio e magnésio, sulfato de potássio, nitrato de sódio, calcário magnesiano, magnésia, ureia, ureiaformaldeídos, ureia nitrato de amônio, ureia revestida com enxofre, ureia revestida com polímero, isobutilideno-diureia, K2SO4-2MgSO4, cainita, silvinita, kieserita, sais de Epsom, enxofre elementar, marga, concha de ostra moída, farinha de peixe, óleos de torta, esterco de peixe, farinha de sangue, fosfato de rocha, superfosfatos, escória, farinha de ossos, cinzas de madeira, estrume, guano de morcego, musgo de turfa, adubo, areia verde, farelo de algodão, farinha de penas, farelo de caranguejo, farelo de peixe, emulsão de peixe, ácido húmico ou uma combinação destes.
[001666] A Modalidade 472 é um método para a entrega de bactérias benéficas para um animal compreendo alimentar um animal com uma planta modificada para compreender um nível de uma cepa de bacté-riasendofíticas e probióticas que é maior do que o nível da cepa de bactérias endofíticas e probióticas na mesma planta que não foi modi-ficada no cultivo sob as mesmas condições.
[001667] A Modalidade 473 é um método da modalidade 472, em que a planta que serve de alimento para o animal compreende uma planta cultivada em um meio de cultivo de planta contendo a cepa de bactérias endofíticas e probióticas ou uma formulação compreendendo a cepa de bactérias endofíticas e probióticas, uma planta na qual a cepa de bactérias endofíticas e probióticas foi aplicada, uma planta cultivada a partir de uma semente de planta na qual a cepa de bactérias endofíticas e probióticas foi aplicada, uma planta cultivada em uma área na qual a cepa de bactérias endofíticas e probióticas foi aplicada ou uma semente cultivada em uma área na qual a cepa de bactérias endofíticas e probióticas foi aplicada.
[001668] A Modalidade 474 é um método da modalidade 472 ou 473, em que a cepa de bactérias endofíticas e probióticas compreende uma espécie de Bacillus ou Lysinibacillus.
[001669] A Modalidade 475 é um método da modalidade 474, em que a espécie de Bacillus compreende Bacillus subtilis, Bacillus firmus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus toyocerin, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis ou uma combinação dos mesmos.
[001670] A Modalidade 476 é um método de qualquer uma das modalidades 472-475, em que a cepa de bactérias endofíticas e probióticas compreende um membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL N° B-50928), membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978), Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975) ou Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123) ou uma combinação dos mesmos.
[001671] A Modalidade 477 é um método para entrega de proteínas ou peptídeos a um animal compreendendo alimentar um animal com um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exósporo do membro da família de Bacillus cereus recombinante ou alimentar um animal com fragmentos de exosporiums derivados de um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium do membro da família de Bacillus cereus recombinante.
[001672] A Modalidade 478 é o método da modalidade 477, em que o membro da família de Bacillus cereus recombinante compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-29, 48-63, 125-141 e 186-296 ou em que os fragmentos de exosporium compreendem fragmentos de exosporium derivados de um membro da família de Bacillus cereus de qualquer uma das modalidades 100-124.
[001673] A Modalidade 479 é um método da modalidade 477 ou 478, em que o membro da família de Bacillus cereus recombinante com-preende uma cepa de bactérias endofíticas.
[001674] A Modalidade 480 é um método da modalidade 479, em que a cepa de bactérias endofíticas compreende um membro da família de Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EEB00184 (NRRL B-67122), membro da família Bacillus cereus EEB00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001675] A Modalidade 481 é um método da modalidade 480, em que a cepa de bactérias endofíticas compreende um membro da famíliaBacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977) ou Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), membro da família Bacillus cereus EEB00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001676] A Modalidade 482 é um método de qualquer uma das modalidades 477-479, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias probióticas.
[001677] A Modalidade 483 é um método da modalidade 482, em que a cepa de bactérias probióticas compreende um membro da família de Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924), ou uma combinação dos mesmos.
[001678] A Modalidade 484 é um método de qualquer uma das modalidades 479-482, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante está compreendido dentro de uma planta que serve de alimento para um animal.
[001679] A Modalidade 485 é um método da modalidade 477 ou 478, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias que é capaz de colonizar o filoplano de uma planta.
[001680] A Modalidade 486 é um método da modalidade 485, em que a cepa de bactérias que é capaz de colonizar o filoplano de uma planta compreende Bacillus mycoides BT155 (NRRL No. B-50921), Bacillus mycoides EE118 (NRRL No. B-50918), Bacillus mycoides EE141 (NRRL NO. B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No. B50922), membro da família Bacillus cereus EE218 (NRRL No. B50926), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) ou Bacillus mycoides EEB00363 (NRRL B-67121).
[001681] A Modalidade 487 é um método de qualquer uma das modalidades 485 ou 486, em que o membro da família de Bacillus cereus recombinante está presente no filoplano de uma planta que serve de alimento para um animal.
[001682] A Modalidade 488 é uma vacina compreendendo um trans-portador farmaceuticamente aceitável e um membro da família de Ba-cillus cereus recombinante que expressa a proteína de fusão da moda-lidade 12.
[001683] A Modalidade 489 é uma vacina compreendendo um trans-portador farmaceuticamente aceitável e fragmentos de exosporium, em que os fragmentos de exosporium são derivados de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende uma proteína de fusão e a proteína de fusão compreende um antígeno.
[001684] A Modalidade 490 é uma vacina compreendendo um trans-portador farmaceuticamente aceitável e um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 17-27, em que a proteína de fusão compreende um antígeno.
[001685] A Modalidade 491 é a vacina de qualquer uma das modalidades 488-490, em que a vacina é adequada para administração intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, tópica, oral, intranasal, intradérmica, transepitelial ou por inalação.
[001686] A Modalidade 492 é a vacina de qualquer uma das modalidades 488-490, em que a vacina é adequada para administração oral ou transepitelial.
[001687] A Modalidade 493 é um método de produção de uma res-postaimunogênica em um indivíduo, o método compreendendo a ad-ministração da vacina de qualquer uma das modalidades 488-492 a um sujeito.
[001688] A Modalidade 494 é um método de redução de contaminantes em um ambiente compreendendo a exposição de um ambiente contaminada aos esporos de um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão da modalidade 13.
[001689] A Modalidade 495 é um método de redução de contaminantes em um ambiente compreendendo a exposição do ambiente contaminado aos fragmentos de exosporium, em que os fragmentos de exosporium são derivados de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende a proteína de fusão e em que a proteína de fusão compreende uma enzima de reparo.
[001690] A Modalidade 496 é um método de redução de contaminantes em um ambiente compreendendo a exposição de um ambiente contaminado aos esporos de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 17-27, em que a pro-teína de fusão compreende uma enzima de reparo.
[001691] A Modalidade 497 é o método de qualquer uma das moda-lidades 494-496, em que o ambiente contaminado compreende um gás, líquido, semilíquido, gel, película, semissólido ou sólido.
[001692] A Modalidade 498 é o método da modalidade 497, em que o sólido compreende solo superficial, solo subterrâneo, composto, resíduo de cultura, folhas, cobertura morta, árvores cortadas, um biofilme, uma camada de limo, mofo, lodo, areia, escória, sedimento, esgoto,resíduos de rocha, resíduos nucleares, munições e engenhos explosivos,resíduos hospitalares, autopeças, desperdícios de lixo, resíduos de isolamento, resíduos de alimentos, amianto, baterias, sucata industrial, resíduos de aterros, resíduos de madeira, resíduos têxteis, resíduos de vidro, resíduos de couro, resíduos de borracha, resíduos plásticos, resíduos de componentes, resíduos agrícolas, resíduos fotográficos, resíduos de cerâmica, resíduos farmacêuticos, cera, catalisadores usados ou uma combinação dos mesmos.
[001693] A Modalidade 499 é o método da modalidade 497, em que o líquido compreende água potável, águas subterrâneas, águas super-ficiais, salmoura, tanques de armazenamento, lagoas, um sistema aquático, águas residuais industriais, drenagem ácida de minas, autofluido gasto, banhos de revestimento gastado, soluções de desengorduramento, soluções de limpeza a seco, refrigerantes de máquina, fluido de perfuração, resíduos de fluidos de corte, resíduos de fluidos hi-dráulicos, resíduos de lubrificantes, tintas, águas residuais oleosas, efluentes de fábricas de celulose, sistema de tratamento de água, sis-temaséptico, sistema de esgoto, lagoa de precipitação, lagoa, rio, ou combinações dos mesmos.
[001694] A Modalidade 500 é o método da modalidade 497, em que o gás compreende ar, gás de combustão, uma corrente de escape de processo, um gás de aterro, gás natural, gás propano ou uma combi-nação dos mesmos.
[001695] A Modalidade 501 é o método de qualquer uma das moda-lidades 494-500, em que o contaminante compreende um agente de guerra química compreendendo sarina (GB; o-isopropil metilfosfonofluoridato); somano (GD; o-pinacolil metilfosfonofluoridato); ciclosarina (GF; o-ciclohexil metilfosfonofluoridato); VX (O-etil S-[2(diisopropilamino)etil]metilfosfonotioato); tabun (GA; N,N-dimetiletil fosforoamidocianidato), DFP (diisopropol foforofluoridato) ou um agente de mostarda.
[001696] A Modalidade 502 é o método de qualquer uma das moda-lidades 494-500, em que o contaminante compreende um composto inorgânico compreendendo arsênio, antimônio, bário, berílio, cádmio, cromo, cobre, ferro, chumbo, manganês, mercúrio, níquel, selênio, prata, estanho, tálio, urânio, zinco ou uma combinação destes.
[001697] A Modalidade 503 é o método de qualquer uma das moda-lidades 494-500, em que o contaminante compreende um composto orgânico que compreende um hidrocarboneto aromático policíclico (HAP), um composto aromático clorado, um composto alifático clorado, um composto nitroaromático (NAC), um composto fenólico, um composto de ciano, dioxina ou uma combinação dos mesmos.
[001698] A Modalidade 504 é o método de qualquer uma das moda-lidades 494-500, em que o contaminante compreende um óleo bruto, um óleo refinado, um óleo de combustível, um óleo diesel, uma gasolina, um óleo hidráulico e querosene, ou um constituinte volátil do mesmo.
[001699] A Modalidade 505 é o método de qualquer uma das moda-lidades 494-500, em que o contaminante compreende um explosivo, um fertilizante, um pesticida, um inseticida ou um herbicida.
[001700] A Modalidade 506 é o método de qualquer uma das moda-lidades 494-500, em que a enzima compreende uma proteína de ligação a fosfato, uma protease, uma hidrolase de carboidrato, uma lipase, uma fosfolipase, uma nuclease, uma proteína de ligação a nutrientes, uma celulase, uma oxidoredutase, uma monooxigenase, uma diooxigenase, uma laccase, uma peroxidase de lignina, uma peroxidade de manganês, uma peroxidase, uma dehalogenase, uma catalase, uma amilase, uma redutase, uma oxidase, uma amidase, uma ligninase, uma xilanase, uma pectinase, uma xilosidase, uma endoglucanase, uma exoglucanase, uma glicosidade, um peptídeo inibidor de biofilme, uma enzima de degração de herbicida, uma enzima de degração de pesticida ou uma combinação destes.
[001701] A Modalidade 507 é o método da modalidade 506, em que a enzima de degração de pesticida compreende uma piretrinase.
[001702] A Modalidade 508 é o método da modalidade 506, em que a enzima compreende uma enzima de degradação de herbicida ou uma enzima de degradação de pesticida e o membro da família de Bacillus cereus recombinante compreende adequadamente uma cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida.
[001703] A Modalidade 509 é o método da modalidade 508, em que a cepa de bactérias que é capaz de degradar um herbicida compreende membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001704] A Modalidade 510 é o método de qualquer uma das moda-lidades 494-509, em que os esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos de exosporium entram em contato com o ambiente contaminado por incorporar os esporos ou fragmentos de exosporium na corrente contendo o contaminante, entram em contato com uma corrente contendo o contaminante com um material de imobilização contendo os esporos ou fragmentos de exosporium, in-corporando os esporos ou fragmentos de exosporium nos grânulos a serem misturados com o ambiente contaminado, pulverizando os esporos ou fragmentos de exosporium sobre ou no ambiente contaminado, injetando os esporos ou fragmentos de exosporium no ambiente contaminado ou encharcando o ambiente contaminado com os esporos ou fragmentos de exosporium.
[001705] A Modalidade 511 é o método para fitorremediação de solo contaminado, o método compreendendo: introduzir os esporos do membro da família de Bacillus cereus recombinante no solo contaminado; ou aplicar os esporos do membro da família de Bacillus cereus recombinante em uma planta plantada em solo contaminado ou uma semente de planta para plantio em solo contaminado ou uma área de solo contaminado em torno de uma planta ou uma semente de planta; em que os esporos do membro da família de Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium do esporo de membro da família de Bacillus cereus recombinante, em que a proteína de fusão compreende a proteína de fusão da modalidade 13 e em que o membro da família de Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias endofíticas ou uma cepa de bactérias de colonização de raiz.
[001706] A Modalidade 512 é um método para fitorremediação de solo contaminado, o método compreendendo a expressão de uma enzima de reparação em um esporo de membro da família Bacillus cereus, em que a expressão da enzima de reparação no esporo do membro da família de Bacillus cereus recombinante é aumentada em comparação com a expressão da enzima de reparação em um esporo de membro da família de Bacillus cereus do tipo selvagem.
[001707] A Modalidade 513 é o método para fitorremediação de solo contaminado, o método compreendendo: introduzir uma bactéria formadora de esporos recombinante em solo contaminado; ou aplicar a bactéria formadora de esporos recombinante em uma planta plantada em solo contaminado ou uma semente de planta a ser plantada em solo contaminado, ou uma área de solo contaminado em torno de uma planta ou semente de planta, em que a bactéria formadora de esporos recombinante expressa uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de revestimento de esporo que direciona a proteína de fusão para a superfície de um esporo de bactéria, em que a proteína de revestimento de esporo de bactéria compreende uma proteína CotB, uma proteína CgeA, uma proteína CotB/H, uma proteína Cot G, uma proteína X de proteína de revestimento de esporo ou uma proteína CtY; a bactéria formadora de esporos recombinante compreende uma cepa de bactérias endofíticas ou uma cepa de bactérias de colonização de raiz; e a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima de reparo.
[001708] A Modalidade 514 é um método da modalidade 513, em que a bactéria formadora de esporos recombinante compreende uma cepa de bactérias endofíticas.
[001709] A Modalidade 515 é um método para fitorremediação de solo contaminado, o método compreendendo introduzir fragmentos de exosporium em solo contaminado ou aplicar fragmentos de exosporium em uma planta plantada em solo contaminado ou semente de planta a ser plantada em solo contaminado ou uma área de solo contaminado em torno de uma planta ou uma semente de planta, em que os fragmentos de exosporium são derivados de esporos de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende a proteína de fusão, em que a proteína de fusão compreende uma enzima de reparo.
[001710] A Modalidade 516 é um método para fitorremediação de solo contaminado compreendendo introduzir esporos de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 17-27 em solo contaminado ou aplicar esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 17-27 em uma planta plantada em solo contaminado ou uma semente de planta a ser plantada em solo contaminado ou uma área de solo contaminado em torno de uma planta ou uma semente de planta, em que a proteína de fusão compreende uma enzima de reparo.
[001711] A Modalidade 517 é o método de qualquer uma das moda-lidades 511-516, em que os esporos ou fragementos de exosporium são aplicados na planta ou na semente de planta e a planta ou planta cultivada pela semente de planta é tolerante a um contaminante alvo a ser remediado pelo solo contaminado.
[001712] A Modalidade 518 é o método de qualquer uma das moda-lidades 494-517, em que os esporos do membro da família de Bacillus cereus recombinante compreendem uma cepa de bactérias endofíticas.
[001713] A Modalidade 519 é um método da modalidade 518, em que a cepa endofítica compreende um membro da família de Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977) ou Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B67120) ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001714] A Modalidade 520 é o método de redução de contaminantes em um ambiente compreendendo expor um ambiente contaminado aos esporos de uma cepa de membro da família de Bacillus cereus que é capaz de degradar um herbicida ou pesticida; em que os contaminantes no ambiente compreendem um herbicida, um pesticida ou uma combinação destes; e em que a cepa de membro da família Bacillus cereus que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida compreende membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B50928), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B67119), Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121), ou uma combinação deste.
[001715] A Modalidade 521 é o método da modalidade 520, em que a cepa de membro da família de Bacillus cereus que é capaz de degradar um herbicida ou um pesticida compreende um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão em pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium do membro da família de Bacillus cereus recombinante.
[001716] A Modalidade 522 é o método da modalidade 521, em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima de de-gradação de herbicida, uma enzima de degradação de pesticida ou uma combinação dos mesmos.
[001717] A Modalidade 523 é um método de tratamento de um fluído de fraturamento hidráulico para quebrar uma emulsão ou gel dentro do fluído, o método compreendendo adicionar esporos de um membro da família de Bacillus cereus recombinante em um fluído de fraturamento hidráulico, em que o membro da família de Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcio-namento,proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que direciona a proteína de fusão ao exosporium do membro da família de Bacillus cereus recombinante e a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima adequada para a quebra da emulsão ou gel.
[001718] A Modalidade 524 é um método da modalidade 523, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 16-29, 48-63, 125-141 e 168-296.
[001719] A Modalidade 525 é um método de tratamento de um fluído de fraturamento hidráulico para quebrar uma emulsão ou gel dentro do fluído, o método compreendendo adicionar fragmentos de exosporium em um fluído de fraturamento hidráulico, em que os fragmentos de exosporium são derivados de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende a proteína de fusão, e em que a proteína de fusão compreende uma enzima adequada para quebra da emulsão ou gel.
[001720] A Modalidade 526 é o método de qualquer uma das moda-lidades 523-525, em que a proteína de fusão compreende uma proteína de fusão da modalidade 14.
[001721] A Modalidade 527 é o método de qualquer uma das moda-lidades 523-526, em que a enzima compreende uma hemicelulase, uma amilase, uma pectinase, uma hidroliase de carboidrato, uma celulase, uma agarase, uma poligalacturonase, uma endoglucanase ou uma combinação destes.
[001722] A Modalidade 528 é o método de qualquer uma das modalidades 523-527, em que a emulsão ou gel compreende um polímero, goma arábica, ágar, goma de xantana, celulose, carboximetilcelulose, carboximetilhidroxietil celulose, hidroxietilmetilcelulose, guar, um derivado de guar ou uma combinação destes.
[001723] A Modalidade 529 é o método de qualquer uma das moda-lidades 523-528, em que os esporos são injetados em um poço que está em contato com uma formação subterrânea contendo hidrocarboneto.
[001724] A Modalidade 520 é um método de desinfecção de uma su-perfície compreendendo expor uma superfície a um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão da modalidade 15.
[001725] A Modalidade 531 é um método de desinfecção de uma su-perfície compreendendo expor uma superfície a fragmentos de exosporium, em que os fragmentos de exosporium são derivados de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreende a proteína de fusão, e em que a proteína de fusão compreende uma proteína ou peptídeo antibacteriano.
[001726] A Modalidade 523 é um método de desinfecção de uma su-perfície compreendendo expor uma superfície a um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 17-27, em que a proteína de fusão compreende uma proteína ou peptídeo antibacteriano.
[001727] A Modalidade 533 é o método de qualquer uma das moda-lidades 530-532, em que a proteína ou peptídeo antibacteriano minimiza ou evita que agentes virais, bactérias, amebas, parasitas ou bolores se formem sobre ou ligados a superfície.
[001728] A Modalidade 534 é o método de qualquer uma das moda-lidades 530-533, em que a proteína ou peptídeo antibacteriano compreende uma protease, uma nuclease, um peptídeo antimicrobiano, LysM, LfcinB, uma lisostafina, uma albumina, uma defensina, uma bacteriocina, um lipopeptídeo, um peptídeo do sistema imunológico inato, uma lisozima, uma liticase ou uma combinação destes.
[001729] A Modalidade 535 é o uso de proteínas de fusão que com-preendem uma enzima como a proteína ou peptídeo do interesse de qualquer uma das modalidades 13-ou 15 ou um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão que compreende uma enzima como a proteína ou peptídeo de interesse de qualquer uma das modalidades 13 ou 15 para tratamento ou desgomagem de graxa, óleo ou gordura; processamento de pele de couro; biocombustíveis, formação de biocombustível, biodiesel ou bioetanol, processamento ou conversão de açúcar; tratamento de amido, proces-samento de papel ou linho, tratamento de subprodutos animais ou fún-gicos ou recuperação de aminoácidos; digestão direcionada de resíduos industriais; aditivos de ração e alimentos; suplementos dietéticos, nutrição animal; limpeza industrial; processamento de grãos; fabricação de cosméticos; controle de odores; processamento de alimentos e bebidas; melhoramento ou aditivos do processo de cervejaria; aditivos de detergentes; ou processamento de têxteis ou fios.
[001730] A Modalidade 536 é o uso de fragmentos de exosporium para tratamento ou desgomagem de graxa, óleo ou gorduras; processamento de pele de couro; formação de biocombustível, biodiesel ou bioetanol; processamento ou conversão de açúcar, tratamento de amido; processamento de papel ou linho; tratamento de subprodutos animais ou fúngicos ou recuperação de aminoácidos; digestão direcionada de resíduos industriais; aditivos de ração ou alimentos; suplemen-tosdietéticos, nutrição animal; limpeza industrial; processamento de grãos; fabricação de cosméticos; controle de odores; processamento de alimentos e bebidas; melhoria ou aditivos de processo cervejeiro; aditivos de detergentes; ou processamento de têxteis ou fios; em que os fragmentos de exosporium são derivados de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 100-124 e compreendem a proteína de fusão, e em que a proteína de fusão compreende uma enzima.
[001731] A Modalidade 537 é o uso de um membro da família de Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 17-27 para tratamento ou desgomagem de graxa, óleo ou gorduras; processamento de pele de couro; formação de biocombustível, biodiesel ou bioetanol; processamento ou conversão de açúcar; tratamento de amido; processamento de papel ou linho; tratamento de subprodutos animais ou fúngicos ou recuperação de aminoácidos; digestão direcionada de resíduos industriais; aditivos de ração ou alimentos; suplemen-tosdietéticos, nutrição animal; limpeza industrial; processamento de grãos; fabricação de cosméticos; controle de odores; processamento de alimentos e bebidas; melhoria ou aditivos de processo cervejeiro; aditivos de detergentes; ou processamento de têxteis ou fios; em que a proteína de fusão compreende uma enzima.
[001732] A Modalidade 538 é o uso de qualquer uma das modalidades 535-537, em que a enzima compreende uma β-lactamase, uma protease, uma lipase, uma fosfolipase, uma celulase, uma endoglucanase, um exogluconase, uma pectinase, uma ligninase, uma amilase, uma poligalacturonase, uma glicosidase, uma galactosidase, uma hidroliase de carboidrato, uma hidrolase da parede da célula, uma nuclease, uma hemicelulase, uma xilanase, uma manase, uma lacase, uma lactase, uma esterase, uma fitase, uma fosfatase, uma invertase, uma oxidase de glicose, catalase, uma liticase, uma acetolactato descarboxilase ou uma urease.
[001733] A Modalidade 539 é a utilização da modalidade 538, em que a amilase compreende um α-amilase, uma β-amilase ou uma glicoamilase; em que a esterase compreende uma pectina metil esterase.
[001734] A Modalidade 540 é um método de qualquer uma das modalidades 447-487, 493, 495-510, 515-519, 521-529, e 531-534, uma vacina de qualquer uma das modalidades 489-492 ou o uso de qualquer uma das modalidades 536-539, em que a sequência de direcio-namento,proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium compreende: (1) uma sequência de direcionamento compreen-dendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 43% de iden-tidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 54%; (2) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de direcio-namento compreendendo SEQ ID NO: 1; (5) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 2; (6) uma sequência de direcio-namento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (9) uma sequência de di-recionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 3; (13) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 3; (14) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 4; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (16) uma sequência de direcio-namento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (18) uma sequência de direcionamento compreen-dendoaminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5; (20) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5; (21) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 5; (22) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 6; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (25) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1538 da SEQ ID NO: 5; (28) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 7; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 7; (31) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 7; (32) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 8; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (35) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 7; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9; (39) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 9; (40) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 10; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO:11; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11; (46) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 11; (47) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 12; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (51) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13; (55) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:13; (56) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:14; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15; (63) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15; (64) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:15; (65) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:16; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (68) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (73) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17; (75) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:17; (76) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:18; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19; (83) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:19; (84) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:20; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (87) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21; (91) uma se-quência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21; (92) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:21; (93) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:22; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23; (101) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:23; (102) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:24; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO:23; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25; (108) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:25; (109) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:26; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27; (115) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:27; (116) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:28; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (119) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (120) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (121) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29; (122) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29; (123) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:29; (124) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:30; (125) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (126) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (127) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (128) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (129) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (130) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31; (131) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31; (132) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:31; (133) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:32; (134) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (135) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (136) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (137) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33; (138) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:33; (139) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:34; (140) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35; (141) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:35; (142) uma proteína do exosporium compre-endendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:36; (143) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO:43; (144) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43; (145) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 43; (146) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 44; (147) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (148) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (149) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (150) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (151) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45; (152) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45; (153) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 45; (154) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 46; (155) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (156) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (157) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (158) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (159) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (160) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47; (161) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47; (162) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 47; (163) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 48; (164) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (165) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (166) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (167) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (168) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (169) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (170) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (171) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49; (172) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49; (173) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 49; (174) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 50; (175) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (176) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (177) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (178) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (179) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (180) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51; (181) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51; (182) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 51; (183) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 52; (184) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (185) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (186) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (187) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (188) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (189) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53; (190) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53; (191) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 53; (192) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 54; (193) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (194) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (195) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (196) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (197) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (198) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55; (199) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55; (200) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 55; (201) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 56; (202) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (203) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (204) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (205) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (206) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57; (207) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57; (208) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 57; (209) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 58; (210) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (211) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5130 da SEQ ID NO: 57; (212) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (213) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (214) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (215) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (216) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (217) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (218) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (219) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (220) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (221) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (222) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (223) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 95; (224) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 96; (225) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 97; (226) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 98; (227) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 99; (228) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 100; (229) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 101; (230) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 102; (231) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 103; (232) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 104; (233) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 105; (234) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 106; (235) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 108; (236) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 109; (237) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 110; (238) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 111; (239) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 112; (240) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 113; (241) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 114; (242) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 115; (243) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 116; (244) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 117; (245) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 118; (246) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 119; (247) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 120; (248) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 121; (249) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; (250) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; (251) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; (252) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-23 da SEQ ID NO: 3; (253) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1425 da SEQ ID NO: 3; (254) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3; (255) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 59; (256) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 59; (257) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 60; (258) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 59; (259) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59; (260) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 6-30 da SEQ ID NO: 59; (261) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 61; (262) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 61; (263) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 61; (264) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 62; (265) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 61; (266) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 61; (267) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61; (268) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61; (269) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 63; (270) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 63; (271) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 64; (272) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 63; (273) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 63; (274) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 63; (275) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 63; (276) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63; (277) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 65; (278) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 65; (279) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 65; (280) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 66; (281) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 107; (282) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 65; (283) uma sequência de direcionamento compre-endendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65; (284) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 67; (285) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 67; (286) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 67; (287) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 68; (288) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 67; (289) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67; (290) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 67; (291) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 69; (292) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 69; (293) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 69; (294) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 70; (295) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 69; (296) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69; (297) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 69; (298) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69; (299) uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 72; (300) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 73; (301) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO: 74; (302) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-42 da SEQ ID NO: 75; (303) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-42 da SEQ ID NO: 75; (304) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 75; (305) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 76; (306) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-42 da SEQ ID NO: 75; (307) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75; (308) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75; (309) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75; (310) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75; (311) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75; (312) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 77; (313) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 77; (314) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 77; (315) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 78; (316) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 77; (317) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77; (318) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 80; (319) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 81; (320) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 81; (321) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 81; (322) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 82; (323) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 81; (324) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; (325) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; (326) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; (327) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81; (328) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-34 da SEQ ID NO: 83; (329) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 83; (330) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 84; (331) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 86; (332) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 87; (333) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1328 da SEQ ID NO: 87; (334) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 87; (335) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 88; (336) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 87; (337) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; (338) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 87; (339) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 89; (340) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 89; (341) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 90; (342) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 89; (343) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; (344) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 89; (345) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-93 da SEQ ID NO: 91; (346) uma se-quência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 91; (347) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 92; (348) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-93 da SEQ ID NO: 91; (349) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91; (350) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91; (351) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 30-93 da SEQ ID NO: 91; (352) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91; (353) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91; (354) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91; (355) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1130 da SEQ ID NO: 93; (356) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 93; (357) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 94; (358) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 93; (359) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10130 da SEQ ID NO: 93; (360) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93; (361) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93; (362) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 122; (363) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 1; (364) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 1; (365) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-31 da SEQ ID NO: 1; (366) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 96; (367) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 96; (368) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 3; (369) uma sequência de direci-onamento consistindo em aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 3; (370) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 3; (371) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 97; (372) uma sequência de di-recionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (373) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 5; (374) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 5; (375) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 5; (376) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 5; (377) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 7; (378) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 7; (379) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 7; (380) uma sequência de di-recionamento consistindo em aminoácidos 16-24 da SEQ ID NO: 7; (381) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 9; (382) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 9; (383) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 9; (384) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 9; (385) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 105; (386) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 105; (387) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 11; (388) uma sequência de dire-cionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 11; (389) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 11; (390) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 98; (391) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (392) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 13; (393) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 13; (394) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 13; (395) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 13; (396) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 99; (397) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 99; (398) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 15; (399) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 15; (400) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 29-41 da SEQ ID NO: 15; (401) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 31-39 da SEQ ID NO: 15; (402) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 17; (403) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 17; (404) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 100; (405) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 19; (406) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 19; (407) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 19; (408) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 19; (409) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 21; (410) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 21; (411) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 21; (412) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 21; (413) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 101; (414) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 101; (415) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 23; (416) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 23; (417) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 23; (418) uma sequência de dire-cionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 23; (419) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 102; (420) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 102; (421) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 25; (422) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 25; (423) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 25; (424) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 25; (425) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 103; (426) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 103; (427) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-28 da SEQ ID NO: 27; (428) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-26 da SEQ ID NO: 27; (429) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 16-28 da SEQ ID NO: 27; (430) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-26 da SEQ ID NO: 27; (431) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 104; (432) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 104; (433) uma sequência de dire-cionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 33; (434) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-11 da SEQ ID NO: 33; (435) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 3-11 da SEQ ID NO: 33; (436) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-14 da SEQ ID NO: 35; (437) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-12 da SEQ ID NO: 35; (438) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 2-14 da SEQ ID NO: 35; (439) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-27 da SEQ ID NO: 43; (440) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 43; (441) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 15-27 da SEQ ID NO: 43; (442) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 45; (443) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 45; (444) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 45; (445) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 106; (446) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 106; (447) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 47; (448) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 47; (449) uma se-quência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 53; (450) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 53; (451) uma sequência de direcionamento consistindo em aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 53; (452) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 61; (453) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 61; (454) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 61; (455) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 65; (456) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 65; (457) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 65; (458) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 107; (459) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 107; (460) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 67; (461) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 67; (462) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 67; (463) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 67; (464) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2336 da SEQ ID NO: 69; (465) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 69; (466) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 69; (467) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 69; (468) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-40 da SEQ ID NO: 75; (469) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 27-38 da SEQ ID NO: 75; (470) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 77; (471) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 77; (472) uma sequência de direcionamento compre-endendo aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 77; (473) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 77; (474) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 81; (475) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 81; (476) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 81; (477) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 81; (478) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 87; (479) uma sequência de direcionamento compreendendoaminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 87; ou (480) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 87.
[001735] A Modalidade 541 é um método da modalidade 540, em que a sequência de direcionamento compreende: uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 50% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 63%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 50% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 72%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 56% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 63%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 62% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 72%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 68% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 81%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 75% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 72%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 75% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 81%; uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 81% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 81%; ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos identidade de cerca de 81% com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 90%.
[001736] A Modalidade 542 é um método da modalidade 540, em que a sequência de direcionamento consiste em: (a) uma sequência de amino ácidos consistindo em 16 aminoácidos com pelo menos cerca de 43% de identidade com os aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade de aminoácidos de 25-35 é de pelo menos cerca de 54%; (b) os aminoácidos de 1-35 da SEQ ID NO: 1; (c) aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1; (d) SEQ ID NO: 1; (e) SEQ ID NO: 96; ou (f) SEQ ID NO: 120.
[001737] A Modalidade 543 é um método da modalidade 541, em que a sequência de direcionamento consiste na sequência de aminoácidos.
[001738] A Modalidade 544 é um método da modalidade 540, em que a proteína do exosporium ou fragmento da proteína do exosporium compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, e 122.
[001739] A Modalidade 545 é um método de qualquer uma das modalidades 477-544, em que a sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium compreende a sequência de aminoácidos GXT no seu terminal carbóxi, em que X é qualquer aminoácido.
[001740] A Modalidade 546 é um método de qualquer uma das modalidades 477-545, em que a sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium compreende um resíduo de alanina na posição da sequência de direcionamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO:1.
[001741] A Modalidade 547 é um método de qualquer uma das modalidades 477-546, em que a sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium compreende uma metionina, serina ou resíduo de treonina na posição do aminoácido imediatamente anterior ao primeiro aminoácido da sequência de direcionamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium ou na posição da sequência de direcionamento que cor-respondem ao aminoácido 20 da SEQ ID NO:1.
[001742] A Modalidade 548 é um método de qualquer uma das modalidades 477-547, em que a proteína de fusão compreende ainda um ligante de aminoácido entre a sequência de direcionamento, a proteína do exosporium ou o fragmento de proteína do exosporium e a proteína ou peptídeo de interesse.
[001743] A Modalidade 549 é um método da modalidade 548, em que o ligante compreende um ligante de polialanina, um ligante de poliglicina ou um ligante compreendendo uma mistura de resíduos de alanina e glicina.
[001744] A Modalidade 550 é um método da modalidade 548 ou 549, em que o ligante compreende um sítio de reconhecimento de protease.
[001745] A Modalidade 551 é um método de qualquer uma das modalidades 447-550, em que a proteína de fusão é expressa sob o controle de um promotor de esporulação nativo à sequência de direciona-mento,proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão ou uma porção desta.
[001746] A Modalidade 552 é um método de qualquer uma das modalidades 447-551, em que a proteína de fusão é expressa sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão.
[001747] A Modalidade 553 é um método de qualquer modalidade 552, em que o promotor de esporulação de alta expressão compreende uma sequência do promotor de polimerase específico de esporulação de sigma-K.
[001748] A Modalidade 554 é um método de qualquer uma das modalidades 551-553, em que o promotor de esporulação compreende uma sequência de ácidos nucleicos contendo pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com uma sequência de ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157-231.
[001749] A Modalidade 555 é um método da modalidade 553 ou 554, em que a sequência ou sequências do promotor de polimerase específico de esporulação de sigma-K possui 100% de identidade com os nucleotídeos correspondentes de qualquer uma da SEQ ID NOs:157231.
[001750] A Modalidade 556 é um método para a entrega de proteínas ou peptídeos para um animal compreendendo alimentar um animal com uma bactéria formadora de esporos recombinantes de qualquer uma das modalidades 147-149, 151-153, e 156-167.
[001751] A Modalidade 557 é um método da modalidade 556, em que a bactéria formadora de esporos recombinante compreende uma cepa de bactérias endofíticas e probióticas.
[001752] A Modalidade 558 é um método da modalidade 557, em que a cepa de bactérias endofíticas e probióticas compreende Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), Bacillus sp. EE387 (NRRL B50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978), Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B50975), ou Lysinibcaillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976), ou Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123), ou uma combinação dos mesmos.
[001753] A Modalidade 559 é um método de qualquer uma das modalidades 556-558, em que a bactéria formadora de esporos recombinante é compreendida dentro de uma planta que serve de alimento para um animal.
[001754] A Modalidade 560 é um método de qualquer uma das modalidades 474-487 e 540-559, em que a planta foi processada antes de servir de alimento para o animal.
[001755] A Modalidade 561 é um método da modalidade 472-487 e 540-560, em que o método compreende ainda: introduzir uma cepa de bactérias endofíticas ou uma formu-lação compreendendo a cepa de bactérias endofíticas em um meio de cultivo de plantas; ou aplicar a cepa de bactérias endofíticas ou uma formulação compreendendo a cepa de bactérias endofíticas em uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou semente de planta; em que a planta que serve de alimento para o animal com-preende uma planta cultivada em um meio de cultivo de plantas contendo a cepa de bactérias endofíticas e probióticas ou uma formulação compreendendo a cepa de bactérias endofíticas e probióticas, uma planta na qual a cepa de bactérias endofíticas e probióticas foi aplicada, uma planta cultivada por uma semente de planta na qual a cepa de bactérias endofíticas e probióticas foi aplicada, uma planta cultivada em uma área na qual a cepa de bactérias endofíticas e probióticas foi aplicada ou uma semente cultivada na área na qual a cepa de bactériasendofíticas e probióticas foi aplicada.
[001756] A Modalidade 562 é um método de qualquer uma das modalidades 477-487 e 540-561, em que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma enzima.
[001757] A Modalidade 563 é um método da modalidade 562, em que a enzima compreende uma xilanase, uma xilosidase, uma fitase, uma fosfatase, uma protease, uma celulase, uma endoglucanase, uma exogluconase, uma glucanase, uma amilase, uma lipase, uma fosfolipase, um glicosilase, um galactanase, uma α-galactosidase, uma βglucosidase, uma amilase, uma pectinase, uma biotinase, uma poligalacturonase, uma ligninase ou uma combinação dos mesmos.
[001758] A Modalidade 564 é um método da modalidade 563, em que a lipase compreende uma fosfolipase A1, um fosfolipase A2, uma fosfolipase C, uma fosfolipase D, uma lisofosfolipase ou uma combinação dos mesmos.
[001759] A Modalidade 565 é um método da modalidade 563, em que a amilase compreende uma α-amilase ou uma β-amilase.
[001760] A Modalidade 566 é um método da modalidade 563, em que a enzima compreende uma xilanase ou uma fitase.
[001761] A Modalidade 567 é um método de qualquer uma das modalidades 472-487 e 540-566, em que o animal compreende um mamí-fero, uma ave, um peixe ou crustáceo.
[001762] A Modalidade 568 é um método da modalidade 567, em que o mamífero compreende uma ovelha, cabra, vaca, porco, veado, alpaca, bisão, camelo, asno, cavalo, mula, lhama, coelho, cão, ou gato; em que o pássaro compreende um frango, peru, pato, ganso, codorna ou faisão; em que o peixe compreende salmão, truta, tilápia, atum, peixe-gato ou uma carpa; ou em que o crustáceo compreende um camarão, camarão, lagosta, caranguejo ou lagostim.
[001763] Em vista do exposto acima, será notado que os vários objetos da invenção são alcançados e outros resultados vantajosos são obtidos.
[001764] Visto que várias alterações podem ser feitas nos produtos, composições e métodos supracitados sem sair do escopo da invenção, é pretendido que toda a matéria contida na descrição acima e mostrada nas figuras em anexo sejam interpretadas como ilustrativas e não em um sentido limitante.

Claims (14)

1. Método Para Fornecimento De Enzimas A Uma Planta, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir em um meio de crescimento de plantas uma bac-téria de Bacillus recombinante que expressa uma proteína de exosporium, sendo que a expressão da proteína de exosporium é aumentada em comparação com a expressão da proteína de exosporium em uma bactéria de Bacillus de tipo selvagem sob as mesmas condições, sen-do que a bactéria de Bacillus recombinante compreende Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Baci-llus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis ou uma combinação dos mes-mos, e sendo que a proteína de exosporium compreende: uma enzima envolvida na solubilização de nutrientes ou uma protease, e sendo que a proteína de exosporium não é parte de uma proteína de fusão; ou aplicar a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área ao redor de uma planta ou de uma semente de planta uma bacté-ria de Bacillus recombinante que expressa uma proteína de exosporium, sendo que a expressão da proteína de exosporium é aumentada em comparação com a expressão da proteína de exosporium em uma bactéria de Bacillus de tipo selvagem sob as mesmas condições, sen-do que a bactéria de Bacillus recombinante compreende Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Baci-llus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis ou uma combinação dos mes-mos, e sendo que a proteína de exosporium compreende: uma enzima envolvida na solubilização de nutrientes ou uma protease, e sendo que a proteína de exosporium não é parte de uma proteína de fusão.
2. Método para fornecimento de enzimas a uma planta, ca-racterizado pelo fato de que compreende: introduzir fragmentos de exosporium ou de uma formulação dos mesmos em um meio de cultura vegetal; ou aplicar fragmentos de exosporium ou de uma formulação dos mesmos em uma planta, em uma semente de planta ou em uma área ao redor de uma planta ou de uma semente de planta; sendo que os fragmentos de exosporium são derivados de esporos de uma bactéria de Bacillus recombinante que expressa uma proteína de exosporium, sendo que a expressão da proteína de exosporium é aumentada em comparação com a expressão da proteína de exosporium em uma bactéria Bacillus de tipo selvagem sob as mes-mascondições, sendo que a bactéria Bacillus recombinante compre-endeBacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis ou uma combi-nação dos mesmos, e sendo que a proteína exosporium compreende: uma enzima envolvida na solubilização de nutrientes ou uma protease, e sendo que a proteína de exosporium não é parte de uma proteína de fusão; e sendo que o método compreende ainda tratar a planta com um agente penetrante, um surfactante, um detergente, um óleo ou uma combinação dos mesmos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: a enzima de exosporium compreende: uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 137; ou uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130, ou 138.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria de Bacillus recombinante expressa ainda uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína de exosporium, ou fragmento de proteína de exosporium que tem como alvo a proteína de fusão para o exosporium da bactéria de Bacillus recombinante.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria de Bacillus recombinante expressa uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma sequência de direcionamento, proteína de exosporium ou fragmento de proteína de exosporium que tem como alvo a proteína de fusão para o exosporium da bactéria de Bacillus recombinante, sendo que a bactéria de Bacillus recombinante compre-ende: uma estirpe endofítica de bactéria, um membro da família de Bacillus cereus EE349 (NRRL N° B-50928), um membro da família de Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Ba-cillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EEB00184 (NRRL B-67122), um membro da família de Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121); uma estirpe de bactéria que é capaz de degradar um herbi-cida ou um pesticida, um membro da família de Bacillus cereus EE349 (NRRL N° B-50928), membro da família de Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B67120); ou Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121); ou uma estirpe probiótica de bactéria, um membro da família de Bacillus cereus EE349 (NRRL N° B-50928), membro da família de Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), ou Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977).
6. Método, de acordo com a reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que, na referida bactéria de Bacillus recombinante, a sequência de direcionamento, proteína exosporium, ou fragmento de proteína de exosporium compreende: (1) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (2) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 1; (4) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; (5) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1; (6) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; (7) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; (8) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; (9) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (10) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3; (11) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 3; (12) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 3; (13) uma proteína exosporium compreendendo uma se quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; (14) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (15) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (16) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; (17) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3; (18) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5; (19) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5; (20) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 5; (21) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (22) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (23) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (24) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (25) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5; (26) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; (27) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (28) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 7; (29) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 7; (30) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 7; (31) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (32) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; (33) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (34) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; (35) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 7; (36) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9; (37) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9; (38) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 9; (39) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; (40) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9; (41) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (42) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9; (43) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 11; (44) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11; (45) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 11; (46) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; (47) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; (48) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (49) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (50) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (51) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (52) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13; (53) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13; (54) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 13; (55) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; (56) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (57) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (58) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (59) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (60) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (61) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15; (62) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15; (63) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 15; (64) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; (65) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (66) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (67) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (68) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (69) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (70) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (71) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (72) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17; (73) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17; (74) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 17; (75) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (76) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (77) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (78) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; (79) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17; (80) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19; (81) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19; (82) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 19; (83) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; (84) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (85) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (86) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (87) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (88) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (89) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21; (90) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21; (91) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 21; (92) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (93) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (94) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (95) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (96) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (97) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (98) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23; (99) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23; (100) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 23; (101) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24; (102) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 23; (103) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (104) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23; (105) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25; (106) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25; (107) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 25; (108) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; (109) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (110) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (111) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25; (112) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27; (113) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27; (114) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 27; (115) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28; (116) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (117) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (118) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (119) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (120) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29; (121) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29; (122) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 29; (123) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30; (124) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (125) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (126) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (127) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (128) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (129) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31; (130) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31; (131) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 31; (132) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; (133) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (134) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (135) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31; (136) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33; (137) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 33; (138) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34; (139) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35; (140) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 35; (141) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36; (142) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO: 43; (143) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43; (144) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 43; (145) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44; (146) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (147) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (148) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43; (149) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43; (150) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45; (151) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45; (152) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 45; (153) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46; (154) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (155) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; (156) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; (157) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (158) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (159) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47; (160) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47; (161) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 47; (162) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48; (163) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (164) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (165) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (166) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (167) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (168) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (169) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (170) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49; (171) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49; (172) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 49; (173) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50; (174) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (175) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (176) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (177) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (178) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (179) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51; (180) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51; (181) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 51; (182) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52; (183) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (184) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (185) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (186) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (187) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (188) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53; (189) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53; (190) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 53; (191) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54; (192) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (193) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (194) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (195) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (196) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (197) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55; (198) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55; (199) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 55; (200) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56; (201) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (202) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (203) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (204) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (205) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57; (206) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57; (207) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 57; (208) uma proteína exosporium compreendendo uma se quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58; (209) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (210) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-130 da SEQ ID NO: 57; (211) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (212) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (213) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (214) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (215) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (216) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; (217) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (218) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (219) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (220) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (221) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (222) um fragmento de proteína exosporium compreen-dendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 95; (223) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 96; (224) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 97; (225) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 98; (226) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 99; (227) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 100; (228) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 101; (229) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 102; (230) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 103; (231) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 104; (232) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 105; (233) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 106; (234) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 108; (235) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 109; (236) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 110; (237) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111; (238) uma proteína exosporium compreendendo uma se quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 112; (239) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113; (240) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114; (241) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115; (242) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 116; (243) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 117; (244) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 118; (245) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 119; (246) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 120; (247) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 121; (248) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; (249) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; (250) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; (251) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 14-23 da SEQ ID NO: 3; (252) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 3; (253) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3; (254) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 59; (255) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 59; (256) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60; (257) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 59; (258) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59; (259) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 6-30 da SEQ ID NO: 59; (260) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 61; (261) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 61; (262) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 61; (263) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62; (264) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 61; (265) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 61; (266) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61; (267) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61; (268) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 63; (269) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 63; (270) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 64; (271) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 63; (272) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 63; (273) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 63; (274) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 63; (275) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63; (276) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 65; (277) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 65; (278) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 65; (279) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66; (280) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 107; (281) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 65; (282) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65; (283) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 67; (284) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 67; (285) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 67; (286) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68; (287) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 67; (288) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67; (289) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 67; (290) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 69; (291) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 69; (292) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 69; (293) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70; (294) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 69; (295) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69; (296) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 69; (297) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69; (298) uma proteína exosporium que compreende a SEQ ID NO: 72; (299) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 73; (300) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74; (301) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-42 da SEQ ID NO: 75; (302) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 27-42 da SEQ ID NO: 75; (303) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 75; (304) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76; (305) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-42 da SEQ ID NO: 75; (306) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75; (307) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75; (308) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75; (309) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75; (310) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75; (311) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 77; (312) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 77; (313) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 77; (314) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78; (315) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 77; (316) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77; (317) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80; (318) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 81; (319) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 81; (320) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 81; (321) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82; (322) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 81; (323) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; (324) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; (325) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; (326) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81; (327) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-34 da SEQ ID NO: 83; (328) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 83; (329) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84; (330) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 86; (331) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 87; (332) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 87; (333) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 87; (334) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88; (335) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 87; (336) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; (337) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 87; (338) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 89; (339) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 89; (340) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 90; (341) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 89; (342) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; (343) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 89; (344) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-93 da SEQ ID NO: 91; (345) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 91; (346) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92; (347) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-93 da SEQ ID NO: 91; (348) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91; (349) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91; (350) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 30-93 da SEQ ID NO: 91; (351) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91; (352) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91; (353) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91; (354) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 93; (355) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 93; (356) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 94; (357) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 93; (358) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 93; (359) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93; (360) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93; (361) uma proteína exosporium compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 122; (362) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 1; (363) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 1; (364) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 23-31 da SEQ ID NO: 1; (365) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 96; (366) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 96; (367) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 3; (368) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 3; (369) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 3; (370) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 97; (371) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (372) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 5; (373) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 5; (374) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 5; (375) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 5; (376) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 7; (377) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 7; (378) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 7; (379) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 16-24 da SEQ ID NO: 7; (380) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 9; (381) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 9; (382) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 9; (383) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 9; (384) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 105; (385) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 105; (386) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 11; (387) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 11; (388) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 11; (389) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 98; (390) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (391) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 13; (392) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 13; (393) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 13; (394) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 13; (395) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 99; (396) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 99; (397) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 15; (398) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 15; (399) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 29-41 da SEQ ID NO: 15; (400) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 31-39 da SEQ ID NO: 15; (401) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 17; (402) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 17; (403) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 100; (404) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 19; (405) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 19; (406) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 19; (407) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 19; (408) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 21; (409) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 21; (410) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 21; (411) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 21; (412) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 101; (413) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 101; (414) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 23; (415) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 23; (416) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 23; (417) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 23; (418) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 102; (419) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 102; (420) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 25; (421) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 25; (422) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 25; (423) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 25; (424) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 103; (425) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 103; (426) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 15-28 da SEQ ID NO: 27; (427) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 15-26 da SEQ ID NO: 27; (428) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 16-28 da SEQ ID NO: 27; (429) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 18-26 da SEQ ID NO: 27; (430) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 104; (431) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 104; (432) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 33; (433) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-11 da SEQ ID NO: 33; (434) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 3-11 da SEQ ID NO: 33; (435) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-14 da SEQ ID NO: 35; (436) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-12 da SEQ ID NO: 35; (437) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 2-14 da SEQ ID NO: 35; (438) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 14-27 da SEQ ID NO: 43; (439) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 43; (440) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 15-27 da SEQ ID NO: 43; (441) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 45; (442) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 45; (443) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 45; (444) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 106; (445) uma sequência de direcionamento que consiste de aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 106; (446) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 47; (447) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 47; (448) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 53; (449) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 53; (450) uma sequência de direcionamento que consiste nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 53; (451) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 61; (452) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 61; (453) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 61; (454) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 65; (455) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 65; (456) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 65; (457) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 107; (458) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 107; (459) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 67; (460) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 67; (461) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 67; (462) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 67; (463) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 69; (464) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 69; (465) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 69; (466) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 69; (467) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 27-40 da SEQ ID NO: 75; (468) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 27-38 da SEQ ID NO: 75; (469) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 77; (470) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 77; (471) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 77; (472) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 77; (473) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 81; (474) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 81; (475) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 81; (476) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 81; (477) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 87; (478) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 87; ou (479) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 87.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo estimulador do crescimento de planta, uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um agente patogênico, uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta, proteína ou peptídeo que se liga à planta, uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico, ou uma proteína ou peptídeo de ligação do ácido nucleico.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo estimulador do crescimento de planta, a proteína ou peptídeo estimulador do crescimento de planta compreendendo: um hormônio peptídico, o hormônio peptídico compreen-dendo uma fitossulfoquina (por exemplo, fitossulfoquina-α), clavata 3 (CLV3), sistemina, ZmlGF, ou um SCR / SP11; um peptídeo não-hormonal, o peptídeo não-hormonal com-preendendo um RKN 16D10, Hg-Syv46, um peptídeo eNOD40, melitina, o mastoparan, Mas7, RHPP, polar, ou inibidor de tripsina de Kunitz (KTI); uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento da planta, a enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento da planta compreendendo uma acetoína redutase, uma indol-3acetamida hidrolase, uma triptofano monooxigenase, uma acetolactato sintetase, uma α-acetolactato descarboxilase, uma piruvato descarboxilase, uma diacetilo redutase, uma butanodiol desidrogenase, uma aminotransferase, uma triptofano descarboxilase, uma amina oxidase, uma indol-3-piruvato descarboxilase, uma indol-3-acetaldeido desidrogenase, uma cadeia lateral de triptofano oxidase, uma nitrilo hidrolase, uma nitrilase, uma peptidase ou uma protease, uma adenosina isopenteniltransferase fosfato, uma fosfatase, uma adenosina cinase, uma adenina fosforibosiltransferase, CYP735A, uma 5’ribonucleotide fosfohidrolase, uma adenosina nucleosidase, uma zeatina cis-trans isome-rase, uma zeatina O-glucosiltransferase, uma β-glucosidase, uma cishidroxilase, uma CK cis0hidroxilase, uma CK N-glucosiltransferase, uma 2,5-ribonucleotídeo fosfohidrolase, uma adenosina nucleosidase, uma purina núcleosídeo fosforilase, uma redutase de zeatina, uma redutase de hidroxilamina, um 2-oxoglutarato dioxigenase, uma hidrolase giberélica 2B/3B, uma giberelina 3-oxidase, uma giberelina 20oxidase, uma quitosanase, uma quitinase, uma β-1,3-glucanase, uma β-1,4-glucanase, uma β-1,6-glucanase, uma desaminase de ácido aminociclopropano-1-carboxilico, ou uma enzima envolvida na produ-ção de um fator nod; ou uma enzima que degrada ou altera uma fonte de nutrientes de fungos, ou bactérias ou plantas, a enzima que degrada ou altera uma fonte de nutrientes de fungos, ou bactérias ou plantas compreen-dendo uma celulase, uma lipase, uma lignina oxidase, uma protease, uma glicosídeo hidrolase, uma fosfatase, uma nitrogenase, uma nu-clease, uma amidase, uma nitrato redutase, uma nitrito redutase, uma amilase, uma amônia oxidase, uma ligninase, uma glucosidase, uma fosfolipase, uma fitase, uma pectinase, uma glucanase, uma sulfatase, uma urease ou uma xilanase.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a enzima que degrada ou altera uma fonte de nutrien-tes de fungos, ou bactérias ou plantas compreende: uma fosfolipase, a fosfolipase compreendendo uma fosfolipase A1, um fosfolipase A2, uma fosfolipase C, uma fosfolipase D, ou uma lisofosfolipase; uma celulase, a celulase compreendendo uma endocelulase, uma exocelulase ou uma β-glucosidase ; uma lipase, a lipase compreendendo uma lipase de Bacillus subtilis, uma lipase de Bacillus thuringiensis, uma lipase de Bacillus cereus, ou uma lipase de Bacillus clausii; uma lignina oxidase, a lignina oxidase compreendendo uma peroxidase de lignina, lacase, uma glioxal oxidase, uma ligninase ou uma manganês peroxidase; uma protease, a protease compreendendo uma subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma proteinase, uma pep-tidase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, uma termolisina, uma papaína, uma pepsina, uma tripsina, uma pronase, uma carboxilase, uma serina protease, uma glutâmico protease, uma aspartato protease, uma cisteína protease, uma treonina protease, ou uma metaloprotease; uma fosfatase, a fosfatase compreendendo uma monoéster fosfórico hidrolase, um fosfomonoesterase, uma fosfórico diéster hidrolase, uma fosfodiesterase, uma trifosfórico monoéster hidrolase, uma fosforil anidrido hidrolase, uma pirofosfatase, uma fitase, uma trimetafosfatase ou uma trifosfatase; ou uma nitrogenase, a nitrogenase compreendendo uma nitro-genase da família Nif.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que: a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma quitosanase, a quitosanase compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 313; a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma fosfolipase, a fosfolipase compreendendo uma fosfolipase C e a fosfolipase C compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 312; ou a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma celulase, a celulase compreendendo uma endoglucanase de Bacillus subtilis, uma endoglucanase de Bacillus subtilis compreendendo uma se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 311.
11. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um agente patogênico, sendo que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um agente patogênico: compreende uma proteína ou peptídeo potenciador do sis-tema imune de plantas; apresenta atividade antibacteriana, atividade anti-fúngica, ou ambas as atividades antibacteriana e antifúngica e, compreende uma bacteriocina, uma lisozima, um peptídeo de lisozima, um sideróforo, um avidina, estreptavidina, um peptídeo ativo não-ribossomal, uma conalbumina, uma albumina, uma lactoferrina, um peptídeo de lactoferrina, ou TasA; apresenta uma atividade inseticida, atividade helminticida, suprime insetos ou vermes de predação, ou uma combinação das mesmas, e compreende uma toxina inseticida bacteriana, uma endotoxina, uma toxina Cry, um inibidor de protease de proteína ou peptídeo, uma cisteína protease, ou uma quitinase; ou compreende uma enzima, a enzima compreendendo: uma protease ou uma lactonase específica para uma molé-cula de lactona bacteriana de sinalização por homoserina; ou uma enzima específica para um componente celular de uma bactéria ou fungo, uma β-1,3-glucanase, uma β-1,4-glucanase, uma β-1,6-glucanase, uma quitosanase, uma quitinase, uma enzima tipo quitosanase, uma liticase, uma peptidase, uma proteinase, uma protease (por exemplo, uma protease alcalina, uma protease ácida, ou uma protease neutra), uma mutanolisina, uma stafolisina, ou uma lisozima.
12. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a proteína ou peptídeo de interesse compreen-de: uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta, sendo que a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao stress de uma planta compreende: uma enzima que degrada um composto relacionado com o stress, sendo que: o composto relacionado com o stress compreende ácido aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), uma espécie reativa de oxigê-nio,óxido nítrico, uma oxilipina, um fenólico, ou uma combinação dos mesmos; e/ou a enzima que degrada um composto relacionado com o stress compreende uma superóxido dismutase, uma oxidase, uma ca-talase, uma ácido aminociclopropano-1-carboxílico desaminase, uma peroxidase, uma enzima antioxidante, ou um peptídeo antioxidante; ou uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um stress ambiental, sendo que: o stress ambiental compreende seca, cheias, calor, conge-lamento, sal, metais pesados, pH baixo, pH alto, ou uma combinação dos mesmos; e/ou a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um stress ambiental compreende uma proteína de nucleação de gelo, uma prolinase, uma fenilalanina amônia liase, uma isocorismato sintase, uma isocorismato piruvato liase, ou uma desidrogenase de colina; uma proteína ou peptídeo de ligação a planta, a proteína ou peptídeo de ligação a planta compreendendo uma adesina, uma flagelina, uma omptina, uma lectina, um expansina, uma proteína estrutural de biofilme , uma proteína de pilus, uma proteína de curlus, uma inti-mina, uma invasina, uma aglutinina, ou uma proteína afimbrial; uma enzima que catalisa a produção de óxido nítrico, a en-zima compreendendo uma óxido nítrico sintase, ou uma arginase; ou um peptídeo de ligação de ácido nucleico, a proteína ou o peptídeo compreendendo uma proteína de ligação de ácido nucleico Hfq, uma pequena proteína de esporo solúvel em ácido (SASP) ou uma nuclease que possui um sítio ativo inativado.
13. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que: a enzima que degrada um composto relacionado com o stress compreende uma superóxido dismutase, a superóxido dismutase compreendendo superóxido dismutase 1 (SODA1) ou superóxido dismutase 2 (SODA2) e compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 155 ou 156; a enzima que catalisa a produção de óxido nítrico compre-ende uma óxido nítrico sintase, a óxido nítrico sintase compreendendo uma óxido nítrico sintase de Bacillus thuringiensis BT013A ou de Baci-llus subtilis 168 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 260 ou 261; ou a proteína de ligação de ácido nucleico compreende: uma SASP, a SASP compreendendo uma SASP de Baci-llus thuringiensis e/ou uma SASP codificada por um gene SspA, um gene SspB, um gene SspC, um gene SspD, um gene de SspE, um gene SspF, um gene SspG, um gene SspH, um gene SspI, um gene SspJ, um gene SspK, um gene SspL, um gene SspM, um gene SspN, um gene SspO, ou um gene SspP; uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 264-266; ou uma molécula de ácido nucleico ligada à proteína ou peptídeo de ligação de ácido nucleico, a molécula de ácido nucleico com-preendendo uma molécula de RNA moduladora; uma molécula de RNAi; um microRNA; um aptâmero; ou uma molécula de DNA que co-difica uma molécula de RNA moduladora, uma molécula de RNAi, um microRNA, ou um aptâmero.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão compreende a SEQ ID NO: 262, 263, 267, 268 ou 269.
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