CN112175921B - 一种壳聚糖酶突变体g21r及其应用 - Google Patents

一种壳聚糖酶突变体g21r及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶技术领域，具体涉及一种壳聚糖酶突变体G21R及其应用。具体技术方案为，提供了一种壳聚糖酶突变体，将CsnMY002野生型壳聚糖酶的21位的甘氨酸突变为精氨酸。与野生株相比，本发明提供的壳聚糖酶突变体可更加针对性的将壳寡糖转化为壳二糖,分离更简单,目标产物得率更高。

Description

一种壳聚糖酶突变体G21R及其应用
技术领域
本发明属于酶技术领域，具体涉及一种壳聚糖酶突变体G21R及其应用。
背景技术
自然界中，几丁质是第二大类含量丰富的多糖，其自然存在量仅次于纤维素，来源十分广泛。几丁质由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)组成，是通过β-1，4糖苷键连接而成的多聚物。利用酶法或化学方法将几丁质进行N-脱乙酰化(脱乙酰度＞50％)，便可获得壳聚糖。壳聚糖经壳聚糖酶降解，可获得聚合度为2～20的壳寡糖(CHOs)。壳寡糖是一类具有生物活性的小分子物质，在治疗及预防人类疾病、诱导植物抗病性、畜牧业、食品工业等众多领域均具有重要应用。
目前，在壳寡糖的生理活性研究和应用中，壳寡糖多以混合物的形式存在，对特定单组分壳寡糖的生物活性研究极少。其根本原因在于，目前单一组分的壳寡糖的制备主要采用强酸水解的方法,存在严重的环境污染问题,且获得的水解产物组份复杂,纯化过程繁琐，最终获得的纯化壳寡糖产量低,价格昂贵，97％色谱纯的壳二糖市售价格高达130元/mg，极大限制了壳寡糖单组份的功能研究及应用。
蛋白质工程技术的快速发展，为高产特定组分的壳寡糖提供了可能。如果能提供一种酶活强、降解壳聚糖效率高、可将壳聚糖高效降解为某一特定壳寡糖的壳聚糖酶，则有望低成本生产特定壳寡糖纯品。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的壳聚糖酶突变体及其应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种壳聚糖酶，将CsnMY002野生型壳聚糖酶的21位的甘氨酸突变为精氨酸。
相应的，一种壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
相应的，所述壳聚糖酶在降解壳聚糖中的应用。
相应的，一种制备壳二糖的方法，利用所述壳聚糖酶进行。
优选的，以壳聚糖为底物，加入所述壳聚糖酶，在20～40℃下降解反应获得。
优选的，壳聚糖酶用量为：每mg壳聚糖添加5μg壳聚糖酶。
本发明具有以下有益效果：与野生株相比，本发明提供的壳聚糖酶突变体可更加针对性地将壳寡糖转化为壳二糖。水解产物中，壳二糖的转化率由49％增加到65％，相对含量由57％提高到88％，分离纯化后壳二糖相对含量大于95％，经质谱鉴定其结构为(GlcN)2。本发明提供的壳聚糖酶的产物单一性明显提高,分离更简单,目标产物得率更高。
附图说明
图1为CsnMY002野生型壳聚糖酶和G21R壳聚糖酶突变体电泳检测结果图；
图2为CsnMY002野生型壳聚糖酶和G21R壳聚糖酶对壳聚糖的降解曲线图；
图3为CsnMY002野生型壳聚糖酶降解壳聚糖的TLC结果示意图；
图4为G21R壳聚糖酶降解壳聚糖的TLC结果示意图；
图5为ELSD-UPLC分析CsnMY002野生型壳聚糖酶和G21R壳聚糖酶降解壳聚糖的降解产物结果示意图；
图6为ELSD-UPLC及ESI-MS鉴定G21R壳聚糖酶降解壳聚糖获得的壳二糖结果示意图；
图7为G21R壳聚糖酶与E235K、E235R分别降解壳聚糖的TLC结果比较图。
具体实施方式
本发明提供了一种新的壳聚糖酶突变体。
所述壳聚糖酶突变体为：对CsnMY002野生型壳聚糖酶进行G21R的点突变，全文将该突变体简称G21R。具体突变方式为：将CsnMY002野生型壳聚糖酶的21位的甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)。
所述CsnMY002野生型壳聚糖酶为发明人在先研究的枯草芽孢杆菌CGMCCNo.14841的代谢产物，其核苷酸序列记载于在先专利CN 108018245 A中，在此不再赘述；其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。为更好地体现本发明的实际改进点，本发明公开的氨基酸序列省略了在先专利公开的CsnMY002野生型壳聚糖酶氨基酸序列的信号肽部分(前35位)。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述.显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一：构建壳聚糖酶突变体
1、采用依赖于DpnI酶的方法构建突变质粒：以质粒pET28a/BsuCsnMY002为模板，分别加入正反向引物进行扩增，获得含有突变位点的单链质粒，经DpnI酶在37℃消化4h降解模板质粒，将突变单链质粒混合后，于沸水浴中煮沸10min，冷却至室温。将质粒转化至宿主菌E.coil DH5α中，涂布于含卡那抗性的LB平板上，37℃过夜培养，挑取平板上的单菌落，预培养后进行测序。
2、将测序正确的质粒转化至表达宿主菌E.coil BL21中，用于突变体蛋白的表达。按1％接种量将转化后的宿主菌转接于含卡那抗性的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养4h，待OD600值达到0.4～0.6时，加入终浓度0.2mM的IPTG，16℃、180rpm过夜培养，获得表达了G21R的菌液。同时以相同的方法，将未突变的CsnMY002质粒转入宿主菌中，获得表达CsnMY002野生型的菌液。
实施例二：CsnMY002野生型、G21R的纯化和酶活测定
1、获得纯化的蛋白质：离心收集实施例一的两种菌液，分别超声破碎后，离心获得上清液。采用镍柱进行纯化，上样缓冲液为(50mM的MES，500mM的NaCl，pH＝6.0)，洗脱缓冲液为(50mM的MES，500mM的NaCl，100mM咪唑，pH＝6.0)，洗脱至G-250检测没有蓝色为止。将洗脱得到的各蛋白样品用0.22μm滤膜过滤，将获得的滤液超滤浓缩至10mg/ml，-80℃保存备用。将镍柱纯化后的壳聚糖酶进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，野生型及突变体分子量均约为27KDa。图1中，泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2代表CsnMY002野生型，泳道3代表G21R突变体。
2、测定酶活和转化率。酶解体系为：20mg/mL的壳聚糖100μL，5μg/mg底物的酶添加量，37℃条件下反应30min。将每小时产生1μmol还原糖所需酶量定义为1个酶活力单位。
DNS法测定还原糖含量：200μL酶解产物与200μL的DNS混匀后沸水浴反应5min，冷却离心(12000rpm、5min)，于540nm处测定吸光值。根据D-葡萄糖胺盐酸盐标曲计算还原糖(Y)的含量，计算公示为：Y(μmol/μL)＝(A+0.1467)/0.2493，R2＝0.991。转化率(％)＝100×(反应产生还原糖含量，μg/μL)/(初始壳聚糖含量，μg/μL)。
结果如表1所示。
表1野生型与G21R的酶活及转化率结果展示
壳聚糖酶 野生型 G21R
相对活性/％ 100.00 101.58±3.09
酶活/(u/μg) 0.81±0.06 0.82±0.03
转化率/％ 80.56±5.43 85.61±1.30
实施例三：CsnMY002野生型及G21R水解产物的TLC与ELSD-UPLC分析
20mg壳聚糖粉末溶于1mL 0.1M的乙酸铵缓冲液中(pH＝5.5)，壳聚糖酶的添加量为5μg/mg(每毫克壳聚糖需要的酶量)，于37℃下分别反应1、3、5、10、30、60、90min，采用DNS法测定还原糖含量，还原糖含量以每毫克壳聚糖可产生的还原末端计算(μmoL/mg)。
TLC分析：向酶解产物中添加终浓度为1M的氢氧化钠终止反应，12000rpm离心5min，吸取2μL上清点样于TLC板上(10×5cm)，将TLC层析板于层析缸中预平衡30min，采用展开体系展层约2h，所述展开体系为：按体积比，乙酸乙酯：乙醇：水：28％氨水＝5：5：4：0.5。展层结束后，将层析板吹干后于0.1％的茚三酮中浸泡，在90℃下保温5min显色。
壳聚糖酶对壳聚糖的降解曲线如图2所示，野生型降解壳聚糖的TLC结果如图3所示，G21R的TLC结果如图4所示。根据图2可以看出：随着酶解时间的延长，还原性低聚糖含量逐渐增多，10min后还原糖含量基本趋于稳定。通过TLC对不同时间点的降解产物进行分析发现：野生型在60min后降解产物种类趋于稳定，以壳二糖、壳三糖为主，G21R在30min后水解产物种类趋于稳定，以壳二糖为主。
ELSD-UPLC分析：采用蒸发光散射检测器检测野生型及G21R的降解产物。分离柱为Shodex的Asahipak NH2P-50 4E，流动相为乙腈：水＝30：70(v/v)，流速为1.0mL/min，柱温30℃，进样体积10μL，蒸发室温度为90℃，氮气流速1.4mL/min。壳寡糖的定量采用外标法，分别配置浓度为1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05mg/mL的壳寡糖标品，在上述色谱条件下获得峰面积与浓度之间的线性关系。ELSD-UPLC分析结果如图5所示(图5中的a为野生型，b为G21R)。可以看出，与野生型相比，突变体G21R的产物组分单一性提高，产物以壳二糖为主，含有少量的壳三糖。利用ELSD-UPLC对水解产物进行定量分析，采用外标法绘制标准曲线，得到壳寡糖浓度(X，μg/mL)与峰面积(Y)的线性关系(G2:Y＝11474X；G3：Y＝8725.1X；G2指壳二糖，G3指壳三糖)，水解产物的结果如表2所示。
表2野生型与G21R的水解产物结果展示
Figure BDA0002739152030000051
Figure BDA0002739152030000061
由表2可知：突变体G21R的水解产物以壳二糖为主，其相对含量达到87％以上，与野生型相比提高了30％，G21R壳二糖的转化率由48.62％增加到65.40％。
实施例四：壳二糖单组份的ESI-MS及相对含量鉴定
利用Bio-Gel P2聚丙烯酰胺凝胶柱(1.8×110mm，柱体积为140mL)分离制备壳二糖，分离得到的壳二糖采用四极杆飞行时间质谱仪联合电子喷雾离子源(ESI-MS)进行鉴定。质谱仪扫描的m/z范围是0-1000，每2s扫描一步，每步的内扫描间隔为0.1s。电子喷雾离子源的不锈钢毛细管尖端的电喷射电压为3Kv，离子源温度为80℃。壳聚糖单组份纯度的鉴定采用ELSD-UPLC。
分离得到的单组份壳二糖进行ELSD-UPLC及ESI-MS鉴定，其结果如图6所示。图6中，(a)为质谱鉴定结果，(b)为超高分辨液相色谱分离结果，(c)为壳二糖分子结构。根据出峰时间及m/z鉴定为(GlcN)2(m/z为[M+H]+341.15)，其相对含量大于95％，其它低聚糖组分因含量极少，采用Bio-Gel P2未能分离得到。最终，水解100mg壳聚糖，G21R水解产物中分离得到37.84mg高纯度壳二糖，而野生型水解产物中仅能分离到20.75mg高纯度壳二糖。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
对比例
参照实施例1、2制备G21R的方法，制备壳聚糖酶CsnMY002突变体E235R、E235K。即：将第235位的谷氨酸突变为精氨酸获得E235R，将第235位的谷氨酸突变为赖氨酸获得E235K。需要说明的是，发明人并非只进行了这些突变试验，而是进行了大量前期试验，并发现大部分突变都无法实现发明目的；此处只是任意举两个无法满足发明目的的突变作为对比例。
分别使用E235R和E235K，在与实施例2、3相同条件下水解壳聚糖，90分钟后，突变体E235R和E235K的水解产物TLC结果示意图如图7所示，仍然以壳二糖和壳三糖为主，与野生型壳聚糖酶类似。
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
<120> 一种壳聚糖酶突变体G21R及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> 野生型壳聚糖酶(CsnMY002)
<400> 1
Ala Gly Leu Asn Lys Asp Gln Lys Arg Arg Ala Glu Gln Leu Thr Ser
1 5 10 15
Ile Phe Glu Asn Gly Thr Thr Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr Val Glu Arg
20 25 30
Leu Asp Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Gly Phe Thr Thr
35 40 45
Ala Thr Gly Asp Ala Leu Glu Val Val Glu Val Tyr Thr Lys Ala Val
50 55 60
Pro Asn Asn Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Arg Arg Leu Ala
65 70 75 80
Lys Glu Glu Ser Asp Asp Thr Ser Asn Leu Lys Gly Phe Ala Ser Ala
85 90 95
Trp Lys Ser Leu Ala Asn Asp Lys Glu Phe Arg Ala Ala Gln Asp Lys
100 105 110
Val Asn Asp His Leu Tyr Tyr Gln Pro Ala Met Lys Arg Ser Asp Asn
115 120 125
Ala Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala Arg Ala Val Met Tyr Asp Thr Val
130 135 140
Ile Gln His Gly Asp Gly Asp Asp Pro Asp Ser Phe Tyr Ala Leu Ile
145 150 155 160
Lys Arg Thr Asn Lys Lys Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asp Gly Ile Asp
165 170 175
Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe Leu Asp Val Arg Tyr Asp Asp Leu
180 185 190
Met Asn Pro Ala Asn His Asp Thr Arg Asp Glu Trp Arg Glu Ser Val
195 200 205
Ala Arg Val Asp Val Leu Arg Ser Ile Ala Lys Glu Asn Asn Tyr Asn
210 215 220
Leu Asn Gly Pro Ile His Val Arg Ser Asn Glu Tyr Gly Asn Phe Val
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 2
<211> 242
<212> PRT
<213> 壳聚糖酶(G21R)
<400> 2
Ala Gly Leu Asn Lys Asp Gln Lys Arg Arg Ala Glu Gln Leu Thr Ser
1 5 10 15
Ile Phe Glu Asn Arg Thr Thr Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr Val Glu Arg
20 25 30
Leu Asp Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Gly Phe Thr Thr
35 40 45
Ala Thr Gly Asp Ala Leu Glu Val Val Glu Val Tyr Thr Lys Ala Val
50 55 60
Pro Asn Asn Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Arg Arg Leu Ala
65 70 75 80
Lys Glu Glu Ser Asp Asp Thr Ser Asn Leu Lys Gly Phe Ala Ser Ala
85 90 95
Trp Lys Ser Leu Ala Asn Asp Lys Glu Phe Arg Ala Ala Gln Asp Lys
100 105 110
Val Asn Asp His Leu Tyr Tyr Gln Pro Ala Met Lys Arg Ser Asp Asn
115 120 125
Ala Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala Arg Ala Val Met Tyr Asp Thr Val
130 135 140
Ile Gln His Gly Asp Gly Asp Asp Pro Asp Ser Phe Tyr Ala Leu Ile
145 150 155 160
Lys Arg Thr Asn Lys Lys Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asp Gly Ile Asp
165 170 175
Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe Leu Asp Val Arg Tyr Asp Asp Leu
180 185 190
Met Asn Pro Ala Asn His Asp Thr Arg Asp Glu Trp Arg Glu Ser Val
195 200 205
Ala Arg Val Asp Val Leu Arg Ser Ile Ala Lys Glu Asn Asn Tyr Asn
210 215 220
Leu Asn Gly Pro Ile His Val Arg Ser Asn Glu Tyr Gly Asn Phe Val
225 230 235 240
Ile Lys

Claims (6)

1.一种壳聚糖酶，其特征在于：将CsnMY002野生型壳聚糖酶的21位的甘氨酸突变为精氨酸；所述CsnMY002野生型壳聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2. 一种壳聚糖酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.权利要求1或2所述的壳聚糖酶在降解壳聚糖中的应用。
4.一种制备壳二糖的方法，其特征在于：利用权利要求1或2所述壳聚糖酶进行。
5.根据权利要求4所述的制备壳二糖的方法，其特征在于：以壳聚糖为底物，加入所述壳聚糖酶，在20～40℃下降解反应获得。
6.根据权利要求4或5所述的制备壳二糖的方法，其特征在于：壳聚糖酶用量为：每mg壳聚糖添加5μg壳聚糖酶。
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