BR112016013387B1 - Uso de pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que regula negativamente a expressão de um gene de vírus de abelha em um ácaro varroa destructor - Google Patents

Uso de pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que regula negativamente a expressão de um gene de vírus de abelha em um ácaro varroa destructor Download PDF

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Abstract

USO DE PELO MENOS UM POLINUCLEOTÍDEO QUE COMPREENDE UMA SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO QUE REGULA NEGATIVAMENTE A EXPRESSÃO DE UM GENE DE VÍRUS DE ABELHA EM UM ÁCARO VARROA DESTRUCTOR. A presente invenção refere-se a composições e métodos para proporcionar controle viral em ácaros Varroa e abelhas usando tecnologia com RNA de interferência e, mais particularmente, prevenção e tratamento de infecções virais em ácaros Varroa e abelhas, fornecendo polinucleotídeos desencadeadores que visam sequências virais.

Description

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência, a qual foi submetida por meio eletrônico no formato ASCII e é incorporada por meio deste documento por referência em sua totalidade. A listagem de sequências, criada em 2 de dezembro de 2014, é denominada P34159WO00_SL.TXT e tem 12,288 bytes de tamanho.
CAMPO
[002] A presente invenção refere-se, de modo geral, a composições e métodos de redução da suscetibilidade das abelhas a doenças infecciosas utilizando uma tecnologia de interferência de RNA e, mais precisamente, ao uso da tecnologia de interferência de RNA na redução da carga viral e na supressão da replicação viral do vetor do ácaro Varroa e em abelhas.
ANTECEDENTES
[003] As abelhas produtoras de mel, Apis mellifera, são necessárias para a polinização eficaz de colheitas e por isso são essenciais para a agricultura mundial. As abelhas produtoras de mel também produzem produtos economicamente importantes, incluindo mel e cera. A saúde e o vigor das colônias de abelhas ficam sob ameaça de inúmeros parasitas e patógenos, incluindo vírus, bactérias, protozoários e ácaros, cada um com modos de transmissão característicos.
[004] Em geral, a transmissão de vírus pode ocorrer por duas vias: por transmissão horizontal e vertical. Na transmissão horizontal, os vírus são transmitidos entre indivíduos da mesma geração, enquanto que a transmissão vertical ocorre de adultos para os seus descendentes. A transmissão pode ocorrer através de várias vias em organismos sociais (para uma análise detalhada, ver Chen Y P, et al (2006) Appl Environ Microbiol. 72(1):606-11). Recentemente, a transmissão horizontal de vírus de abelhas foi documentada em colônias de abelhas, por exemplo, a transmissão de vírus da asa deformada (DWV) e vírus de abelha Caxemira (KBV) pelo ácaro parasita Varroa destructor, bem como certas evidências do vírus em ovos de abelhas produtoras de bel e larvas jovens, fases da vida não parasitadas pelos ácaros Varroa.
[005] Os ácaros Varroa (Varroa destructor) são os principais parasitas das abelhas produtoras de mel controladas (Apis mellifera) e a maior ameaça global para a apicultura comercial (Rosenkranz et al. 2010). Os ácaros Varroa parasitam as crisálidas e as abelhas adultas e se reproduzem nas células sanguíneas das crisálidas. Os ácaros usam suas bocas para perfurar o exoesqueleto e se alimentam da hemolinfa das abelhas. Esses locais das feridas nas infecções no exoesqueleto abrigam infecções bacterianas, como Melissococcus pluton, causadora da loque europeia. Além disso, para os seus efeitos parasíticos, os ácaros Varroa são suspeitos de agir para uma série de patógenos de abelhas produtoras de mel, incluindo o vírus da asa deformada (DWV), o vírus das abelhas Caxemira (KBV), o vírus da paralisia aguda da abelha (ABPv) e o Vírus da Realeira Negra(BQCV), e podem enfraquecer os sistemas imunológicos de seus hospedeiros, deixando- os vulneráveis a infecções. Alguns vírus de abelha são conhecidos por replicar no ácaro, aumentando drasticamente a carga viral. Se deixadas sem tratamento, as infestações por Varroa costumam resultar em uma mortalidade no âmbito da colônia.
[006] Nos dias atuais, os apicultores utilizam uma variedade de métodos para controlar os níveis de Varroa que incluem vários acaricidas químicos, a maioria dos quais perderam a eficácia e são tóxicos e/ou deixam resíduos na cera e no mel. Outros métodos incluem a aplicação de ácido oxálico ou ácido fórmico, monoterpenos (timol) e uma variedade de outras práticas de controle, com resultados altamente variáveis, incluindo toxicidade às colônias tratadas. A criação de abelhas para a resistência a Varroa, como a seleção para o comportamento higiênico que resulta na remoção do suco infestado, proporcionou um sucesso prático limitado.
[007] Os métodos atuais de tratamento das infestações por Varroa estão se mostrando ineficazes, visto que os ácaros desenvolvem resistência aos acaricidas existentes. Além disso, a utilização desses acaricidas pode introduzir produtos químicos prejudiciais no mel que se destina ao consumo humano.
SUMÁRIO
[008] As presentes modalidades se relacionam a composições e métodos para controlar a carga viral e/ou replicação viral em ácaros Varroa e abelhas.
[009] A presente descrição prevê um método de redução da carga viral ou de supressão da replicação viral em um ácaro Varroa destructor ou em uma colônia de abelhas, o método caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento, ao ácaro Varroa destructor ou à colônia de abelhas, de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácido nucleico que seja essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha, reduzindo, desse modo, a carga viral ou suprimindo a replicação viral no ácaro Varroa destructor ou na colônia de abelhas. Em algumas modalidades, o vírus de abelha é selecionado dentre o grupo consistindo no Vírus da Paralisia Aguda em Abelhas (ABPV), Vírus da Asa Deformada (DWV), Vírus de Abelhas Caxemira (KBV), Vírus da Realeira Negra(BQCV), Vírus da Cria Ensacada (SBV), Vírus da Paralisia Crônica em Abelhas (CPV), Vírus Cloudy Wing (asa opaca) (CWV), Vírus Israelense da Paralisia Aguda (IAPV), Vírus Iridescente de Invertebrados Tipo 6 (IIV6), Vírus Varroa Destructor (VDV-1), Vírus Kakugo (KV) e Vírus Lake Sinai (LSV).
[0010] A presente descrição também prevê uma composição para ser administrada a um ácaro Varroa destructor, uma abelha, ou uma colônia de abelhas, compreendendo uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácido nucleico que seja essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha. Em algumas modalidades, a composição reduz a carga viral ou suprime a replicação viral no ácaro Varroa destructor, na abelha ou na colônia de abelhas. Em algumas modalidades, a composição aumenta a tolerância de uma abelha ou de uma colônia de abelhas a uma doença causada pelo vírus de abelha.
[0011] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador é DNA de fita simples (ssDNA), RNA de fita simples (ssRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), DNA de fita dupla (dsDNA) ou híbridos de DNA-RNA de fita dupla.
[0012] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador regula negativamente o gene viral. Em algumas modalidades, o gene viral codifica uma proteína de revestimento, RdRp, VP1, VP2 ou helicase. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou complementaridade ou com 100% de identidade de sequência ou complementaridade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:1-21 ou um fragmento seu. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma mistura de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 polinucleotídeos desencadeadores diferentes, que têm como alvo diferentes vírus ou diferentes genes do mesmo vírus ou diferentes fragmentos de um gene viral.
[0013] A presente descrição também prevê um método de redução da carga viral em uma colônia de abelhas por meio do fornecimento ao parasita de uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha, suprimindo, desse modo, a replicação viral no parasita e reduzindo a carga viral na colônia de abelhas. Em algumas modalidades, o parasita é um ácaro Varroa destructor.
[0014] A presente descrição prevê ainda um método para redução da suscetibilidade de uma abelha a uma doença causada por um vírus de abelha, o método caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento, a um parasita da abelha, de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácido nucleico que seja essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha, suprimindo, desse modo, a replicação viral no parasita e reduzindo a suscetibilidade da abelha a uma doença causada pelo vírus da abelha. Em algumas modalidades, a doença é o distúrbio de colapso da colônia (CCD). Em algumas modalidades, o parasita é um ácaro Varroa destructor.
[0015] Em algumas modalidades, a composição que compreende uma quantidade eficaz do polinucleotídeo desencadeador é fornecida pela pulverização do ácaro Varroa, administrando-se diretamente ao ácaro Varroa ou às abelhas em uma colônia de abelhas, ou uma combinação destes.
[0016] Em algumas modalidades, é fornecido um método de redução da carga viral em ácaros Varroa. Em algumas modalidades, o vírus de abelha é selecionado dentre o grupo consistindo no Vírus da Paralisia Aguda em Abelhas (ABPV), Vírus da Asa Deformada (DWV), Vírus de Abelhas Caxemira (KBV), Vírus da Realeira Negra (BQCV), Vírus da Cria Ensacada (SBV), Vírus da Paralisia Crônica em Abelhas (CPV), Vírus Cloudy Wing (asa opaca) (CWV), Vírus Israelense da Paralisia Aguda (IAPV), Vírus Iridescente de Invertebrados Tipo 6 (IIV6), Vírus Varroa Destructor (VDV-1) e Vírus Kakugo (KV). De acordo com algumas modalidades, um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácidos nucleicos com uma identidade essencial ou um complemento essencial a uma sequência de 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelhas é fornecido. De acordo com algumas modalidades, é fornecido um método para a expressão de regulação negativa de um gene viral em ácaros Varroa.
[0017] De acordo com algumas modalidades, são fornecidos métodos e composições para a prevenção da propagação de doenças das abelhas, tais como o distúrbio do colapso da colônia, por meio da aplicação de uma tecnologia de interferência de RNA aos ácaros Varroa, direcionados aos organismos e agentes infecciosos das abelhas, como DWV, IAPV, vírus da paralisia aguda das abelhas e vírus da paralisia das abelhas Da Caxemira.
[0018] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a tolerância de uma abelha a uma doença causada por um vírus de abelha, compreendendo o método a administração de uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que seja essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a um gene de vírus de abelhas para ácaros Varroa, reduzindo a carga viral no ácaro Varroa aumentando a tolerância da abelha à doença causada pelo vírus de abelha. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é essencialmente idêntico ou essencialmente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos do gene do vírus de abelha.
[0019] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a tolerância de uma colônia de abelhas a uma doença causada por um vírus de abelha que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a um gene de vírus de abelha para um ácaro Varroa, reduzindo assim a carga viral no ácaro Varroa e aumentando a tolerância da colônia de abelhas à doença causada pelo vírus de abelha. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é essencialmente idêntico ou essencialmente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos do gene do vírus de abelha.
[0020] Em um aspecto, a presente invenção prevê um método para reduzir a carga viral em um ácaro Varroa destructor, compreendendo o método o fornecimento ou administração de uma composição ao ácaro Varroa destructor, compreendendo a composição uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácidos nucleicos essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência de vírus de abelha, suprimindo a replicação viral no ácaro Varroa destructor. Em algumas modalidades, a sequência viral de abelha é uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha.
[0021] Em um aspecto, a presente descrição prevê um método de redução da carga viral em uma colônia de abelhas por meio do fornecimento ao parasita de uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência viral, suprimindo, desse modo, a replicação viral no parasita e reduzindo a carga viral na colônia de abelhas. Em algumas modalidades, o parasita é Varroa destructor. Em algumas modalidades, a sequência viral de abelha é uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha.
[0022] Em um aspecto, a presente descrição prevê um método de redução da carga viral ou de supressão da replicação viral em um ácaro Varroa destructor, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao ácaro Varroa destructor de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácido nucleico que regula negativamente a expressão de um gene de vírus de abelha no ácaro Varroa destructor, reduzindo, desse modo, a replicação viral no ácaro Varroa destructor. Em algumas modalidades, a sequência e ácidos nucleicos é um polinucleotídeo desencadeador que é essencialmente idêntico ou complementar ao gene viral ou a um fragmento seu. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é essencialmente idêntico ou essencialmente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos do gene do vírus de abelha.
[0023] Em um aspecto, a presente descrição prevê a redução da replicação viral em uma colônia de abelhas, o método para reduzir a replicação viral em um parasita da colônia de abelhas pelo fornecimento ao parasita de uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência viral, suprimindo, desse modo, a replicação viral no parasita e reduzindo a expressão viral na colônia de abelhas. Em algumas modalidades, o parasita é Varroa destructor. Em algumas modalidades, a sequência viral de abelha é uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha.
[0024] Em um aspecto, a presente descrição prevê um método para redução da suscetibilidade de uma abelha a uma doença causada por um vírus de abelha, o método caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento, a um parasita da abelha, de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácido nucleico que seja essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência viral de abelha, suprimindo, desse modo, a replicação viral no parasita e reduzindo a suscetibilidade da abelha a uma doença causada pelo vírus da abelha. Em algumas modalidades, o parasita é Varroa destructor. Em algumas modalidades, a doença é o distúrbio de colapso da colônia (CCD). Em algumas modalidades, a sequência viral de abelha é uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha.
[0025] De acordo com algumas modalidades da invenção, a abelha é uma abelha produtora de mel.
[0026] De acordo com algumas modalidades da invenção, a abelha produtora de mel é forrageadora.
[0027] De acordo com algumas modalidades da invenção, a abelha produtora de mel é uma abelha de colmeia.
[0028] Várias modalidades se relacionam a uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais polinucleotídeos desencadeadores compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos essencialmente idêntica ou complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha. Em algumas modalidades, o vírus de abelha é selecionado dentre o grupo consistindo no Vírus da Paralisia Aguda em Abelhas (ABPV), Vírus da Asa Deformada (DWV), Vírus de Abelhas Caxemira (KBV), Vírus da Realeira Negra (BQCV), Vírus da Cria Ensacada (SBV), Vírus da Paralisia Crônica em Abelhas (CPV), Vírus Cloudy Wing (asa opaca) (CWV), Vírus Israelense da Paralisia Aguda (IAPV), Vírus Iridescente de Invertebrados Tipo 6 (IIV-6), Vírus Varroa Destructor (VDV-1), Vírus Kakugo (KV) e Vírus Lake Sinai (LSV). Em algumas modalidades, o vírus é IAPV. Em algumas modalidades, o vírus é DWV. Em algumas modalidades, o gene viral codifica uma proteína de revestimento, RdRp, VP1, VP2 ou helicase. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou complementaridade ou com 100% de identidade de sequência ou complementaridade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:1- 21 ou um fragmento seu. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma mistura de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 polinucleotídeos desencadeadores diferentes, que têm como alvo diferentes vírus ou diferentes genes do mesmo vírus ou diferentes fragmentos de um gene viral. Em algumas modalidades, a composição compreende um ou mais polinucleotídeos desencadeadores compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99 % de identidade de sequência ou de complementaridade, ou com 100% de identidade de sequência ou complementaridade com uma sequência de DWV e um ou mais polinucleotídeos desencadeadores compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou complementaridade ou com 100% de identidade de sequência ou complementaridade com uma sequência de IAPV. Várias modalidades se relacionam a uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais polinucleotídeos desencadeadores que compreendem um ácido nucleico com pelo menos cerca de 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou de complementaridade ou com 100% de identidade de sequência ou complementaridade com uma sequência de ácidos nucleicos selecionados a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 11, 13, 14, 17 e 18. Várias modalidades se relacionam a uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais polinucleotídeos desencadeadores que compreendem um ácido nucleico com pelo menos cerca de 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou de complementaridade ou com 100% de identidade de sequência ou complementaridade com uma sequência de ácidos nucleicos selecionados a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs:12, 15, 16, 19 e 20. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador é DNA de fita simples (ssDNA), RNA de fita simples (ssRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), DNA de fita dupla (dsDNA) ou híbridos de DNA-RNA de fita dupla. Em algumas modalidades, a composição compreende um ou mais polinucleotídeos desencadeadores e um ou mais excipientes. Em algumas modalidades, o excipiente compreende uma ou mais substâncias selecionadas a partir de: um açúcar, um solvente, uma proteína, uma ração de abelha ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, o açúcar é selecionado dentre: frutose, glicose, sacarose, trealose, lactose, galactose, ribose e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a ração de abelhas é selecionada dentre: mel, pólen, trigo, farinha de soja, levedura, produto de levedura, e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a composição é uma composição digerível por abelhas selecionadas dentre o grupo que consiste em uma composição líquida digerível por abelhas e uma composição sólida digerível por abelhas. Em algumas modalidades, a composição líquida digerível por abelhas é um xarope de açúcar. Em algumas modalidades, a composição sólida digerível por abelhas é uma mistura seca ou um bolo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0029] A Figura 1 retrata uma árvore filogenética de alguns vírus de abelha.
[0030] A Figura 2A representa um gráfico que mostra a taxa de sobrevivência de ácaros Varroa após o tratamento com a mistura do desencadeador de vírus de abelha.
[0031] A Figura 2B representa um gráfico que mostra os níveis de DWV no Varroa 72h após o tratamento em um experimento de administração direta ao Varroa avaliado por Q-PCR.
[0032] A Figura 3 mostra um gráfico que mostra os níveis de DWV em abelhas em comparação com os níveis de DWV em Varroa, a diferentes contagens (0-3 ou 4-62) de Varroa por 100 abelhas.
[0033] A Figura 4 representa um gráfico que mostra a replicação de DWV em abelhas 4 dias, 8 dias e 14 dias após as abelhas receberem a administração de uma mistura de dsRNA desencadeadores (MIX), um dsRNA não- específico (SCR) ou de nenhum dsRNA (CON).
[0034] A Figura 5A representa um gráfico que mostra os níveis de DWV no Varroa 3 dias após o tratamento em um experimento de administração direta ao Varroa avaliados por QuantiGene® .
[0035] A Figura 5B representa um gráfico que mostra os níveis de IAPV no Varroa 72h após o tratamento em um experimento de administração direta ao Varroa avaliados por QuantiGene® .
[0036] A Figura 6A retrata um gráfico que mostra a expressão de DWV em abelhas produtoras de mel 4 dias após o tratamento das abelhas, avaliada por QuantiGene®.
[0037] A Figura 6B retrata um gráfico que mostra a replicação de DWV em abelhas produtoras de mel 4 dias após o tratamento das abelhas, avaliada por QuantiGene®.
[0038] A Figura 7A retrata um gráfico que mostra a expressão de IAPV em abelhas produtoras de mel 4 dias após o tratamento das abelhas, avaliada por QuantiGene®.
[0039] A Figura 7B retrata um gráfico que mostra a replicação de IAPV em abelhas produtoras de mel 4 dias após o tratamento das abelhas, avaliada por QuantiGene®.
[0040] A Figura 8 retrata um gráfico que mostra a expressão de LSV em abelhas produtoras de mel 4 dias após o tratamento das abelhas, avaliada por QuantiGene®.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0041] A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa versada na técnica. Aqueles versados na técnica identificarão que vários métodos podem ser usados na prática da presente descrição. Com efeito, a presente descrição de nenhuma maneira se deixa limitar aos métodos e materiais descritos. Todas as referências aqui citadas são incorporadas por referência na sua totalidade. Para fins da presente descrição, os seguintes termos são definidos abaixo.
[0042] Conforme usado neste documento, o termo "cerca de" refere-se a ± 10%.
[0043] Como usado neste documento, a forma singular "uma", "um" e "a/o" inclui referências no plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo suas misturas.
[0044] Salvo indicação em contrário, as sequências de ácidos nucleicos no texto deste relatório descritivo são dadas, quando lidas da esquerda para a direita, na direção de 5' a 3'. Entende-se que qualquer número de identificação de sequência (SEQ ID NO) divulgado no presente pedido pode se referir a uma sequência de DNA ou de RNA, dependendo do contexto onde esse SEQ ID NO é mencionado, mesmo que o SEQ ID NO seja expresso apenas em um formato de sequência de DNA ou RNA. Além disso, a descrição de uma sequência de ácidos nucleicos traz a sequência de seu complemento inverso, visto que uma necessariamente define a outra, conforme é sabido por aqueles versados na técnica. Quando é fornecido um termo no singular, os inventores contemplam também aspectos da invenção descritos pelo plural desse termo.
[0045] As abelhas são suscetíveis a uma miríade de infecções virais. Até o momento, 24 vírus de abelha foram identificados. A maioria é composta de vírus de RNA de polaridade positiva, que contêm RNA polimerase RNA-dependente (RdRp). Duas famílias filogenéticas de vírus de abelha com dois formatos estruturais principais foram identificadas. Ver a Figura 1. As amostras de campo das abelhas nos EUA selecionadas entre 9 vírus de abelha diferentes, utilizando uma análise QuantiGene®, revelou uma elevada prevalência do vírus da asa deformada (DWV), do vírus Varroa Destructor (VDV-1), do vírus da paralisia israelense aguda (IAPV), da paralisia da abelha aguda (ABPV) e o vírus da abelha Caxemira (KBV). O vírus Lake Sinai (LSV), incluindo vírus Lake Sinai-1 (LSV-1), e o vírus Lake Sinai-2 (LSV-2) são o outro vírus encontrado em colmeias de abelhas. O tratamento de infecções virais pela regulação negativa de um produto genético viral específico mostrou-se bem-sucedido na eliminação de infecções de indução viral em abelhas (ver a publicação de pedido de patente U.S. US 2009/0118214). Os presentes inventores divulgam agora métodos e composições para tratar uma infecção viral em ácaros Varroa e em abelhas. Os inventores da presente invenção descrevem ainda o tratamento de uma infecção viral em abelhas através da redução da carga viral dos ácaros parasíticos Varroa.
[0046] De acordo com algumas modalidades, a tecnologia de interferência de RNA é usada para reduzir a carga viral nos ácaros Varroa destructore em abelhas. Os ácaros Varroa parasitam as crisálidas e as abelhas adultas e se reproduzem nas células sanguíneas das crisálidas. Os ácaros usam suas bocas para perfurar o exoesqueleto e se alimentam da hemolinfa das abelhas. Os agentes de polinucleotídeos administrados às abelhas para tratar as infestações com ácaros Varroa manifestaram-se na hemolinfa da abelha, ficando disponíveis aos ácaros (ver a publicação de pedido de patente US 2012/0258646).
[0047] Em várias modalidades da presente descrição, a tecnologia de interferência de RNA é usada para reduzir a replicação viral em ácaros Varroa destructor e em abelhas. Em várias modalidades da presente descrição, a tecnologia de interferência de RNA é usada para reduzir ou prevenir a transmissão de vírus de abelha de uma abelha ou de larvas de abelha para um ácaro Varroa destructor que se alimenta de abelha ou das larvas de abelha. Em várias modalidades da presente descrição, a tecnologia de interferência de RNA é usada para reduzir ou prevenir a transmissão de vírus de abelha de um ácaro Varroa destructor para uma abelha ou larvas de abelha que o ácaro parasita.
[0048] Em algumas modalidades da presente descrição, a tecnologia de interferência de RNA é utilizada para reduzir a carga viral em uma abelha. Em algumas modalidades, a tecnologia de interferência de RNA é utilizada para reduzir a carga viral em uma colônia de abelhas.
[0049] Em algumas modalidades da presente descrição, a tecnologia de interferência de RNA é utilizada para reduzir a replicação viral em uma abelha. Em algumas modalidades, a tecnologia de interferência de RNA é utilizada para reduzir a replicação viral em uma colônia de abelhas.
[0050] A interferência de RNA refere-se ao processo de silenciamento do gene pós-transcricional específica de sequência em animais mediado por RNAs pequenos. O processo correspondente em vegetais é normalmente denominado silenciamento de gene pós- transcricional ou silenciamento de RNA e também é denominado supressão em fungos. Embora não estando limitado a qualquer teoria em particular, pensa-se que o processo de silenciamento de gene pós- transcricional é um mecanismo de defesa celular conservado evolutivamente usado para impedir a expressão de genes estranhos e é normalmente compartilhado por diversos filos e floras. Essa proteção da expressão de gene estrangeiro pode ter evoluído na resposta à produção de RNAs de fita dupla (dsRNAs) derivados de infeção viral ou da integração aleatória de elementos de transposon num genoma do hospedeiro através de uma resposta celular que destrói especificamente o RNA de fita simples homólogo ou o RNA genômico viral. Em aspectos de acordo com a presente invenção, uma composição de ácido nucleico resulta na interferência de RNA em um organismo alvo. Em determinados aspectos, a composição de ácido nucleico resulta em uma interferência de RNA em Varroa destructor quando presente no organismo hospedeiro, na abelha ou nas larvas de abelha.
[0051] A frase "ácaro Varroa destructor" refere-se ao ácaro parasitário externo que ataca as abelhas europeias Apis cerana e Apis mellifera. O ácaro pode estar em uma fase adulta, alimentando-se da abelha, ou em uma fase larval, no interior da célula do sangue das abelhas.
[0052] Em algumas modalidades da presente descrição, o vírus de abelha é selecionado dentre o grupo consistindo no Vírus da Paralisia Aguda em Abelhas (ABPV), Vírus da Asa Deformada (DWV), Vírus de Abelhas Caxemira (KBV), Vírus da Realeira Negra (BQCV), Vírus da Cria Ensacada (SBV), Vírus da Paralisia Crônica em Abelhas (CPV), Vírus Cloudy Wing (asa opaca) (CWV), Vírus Israelense da Paralisia Aguda (IAPV), Vírus Iridescente de Invertebrados Tipo 6 (IIV-6), Vírus Varroa Destructor (VDV-1), Vírus Kakugo (KV) e Vírus Lake Sinai (LSV).
[0053] Em algumas modalidades da presente descrição, o vírus de abelha é um vírus de RNA de polaridade positiva. Em algumas modalidades, o vírus de abelha é um vírus de RNA de polaridade negativa. Em algumas modalidades, o vírus de abelha é DWV. Em algumas modalidades, o vírus é IAPV. Em algumas modalidades, o vírus da abelha é LSV.
[0054] Conforme usados aqui, uma medida de "carga viral", "níveis virais" e "expressão viral" referem-se à detecção da fita sensode uma sequência de vírus de abelha e são usados de forma intercambiável na presente descrição. Inúmeros métodos de detecção são conhecidos na técnica, incluindo, sem se limitar a, PCR quantitativa (Q-PCR) e ensaio QuantiGene®. Em algumas modalidades, a carga viral ou a expressão viral são medidas como a intensidade de fluorescência mediana (MFI) e normalizadas com a MFI dos genes de manutenção para representar a presença do vírus em uma abelha, uma colônia de abelhas ou em ácaros Varroa. Em algumas modalidades, a carga viral é uma medida da severidade de uma infecção viral ativa.
[0055] Como utilizada aqui, uma medida da "replicação viral" se refere à detecção da fita negativa de uma sequência de vírus de abelha. Em algumas modalidades, replicação viral são medidas como a intensidade de fluorescência mediana (MFI) e normalizadas com a MFI dos genes de manutenção para representar a replicação do vírus em uma abelha, uma colônia de abelhas ou em ácaros Varroa. Em algumas modalidades, a replicação viral é uma medida da severidade de uma infecção viral ativa.
[0056] Conforme usado aqui, o termo "título viral" se refere à concentração de vírus em uma amostra. Em algumas modalidades, a carga viral é medida pelo título viral. Inúmeros métodos são conhecidos na técnica para calcular o título viral, e eles são contemplados pelo presente pedido.
[0057] Tal como aqui utilizado, o termo "hospedeiro" ou "organismo hospedeiro" refere-se a um organismo que abriga um parasita e fornece alimentação para o parasita. Um "parasita" é um organismo que tem uma relação simbiótica não mútua com um organismo hospedeiro e se beneficia às custas do organismo hospedeiro. Em algumas modalidades, o organismo hospedeiro é uma abelha. Em algumas modalidades, o parasita é um ácaro Varroa.
[0058] Tal como aqui utilizado, o termo "abelha" refere-se a uma abelha adulta e células de crisálidas desta. De acordo com um aspecto, a abelha está em uma colmeia. Uma abelha adulta é definida como uma dentre diversos insetos com asas, com pelos no corpo, geralmente urticantes da superfamília Apoidea na ordem Hymenoptera, incluindo as espécies solitárias e sociais, e caracteriza-se por ter partes da boca para sucção e mastigação para coletar néctar e pólen. Exemplos de espécies de abelhas incluem, mas não estão limitados a, Apis, Bombus, Trigona, Osmia e afins. Em um aspecto, as abelhas incluem, mas não estão limitadas a, abelhões (Bombus terrestris), abelhas europeias (Apis mellifera) (incluindo abelhas de colmeias e forrageiras) e Apis cerana. A presente descrição proporciona, e inclui, métodos e composições para o tratamento de insetos como um hospedeiro ou como parasita.
[0059] De acordo com um aspecto, uma abelha é parte de uma colônia. O termo "colônia" refere-se a uma população de abelhas que compreende tipicamente dezenas de milhares de abelhas que cooperam na construção do ninho, coleta de alimentos e criação da ninhada. A colônia normalmente tem uma única rainha, o restante das abelhas sendo ou "trabalhadores" (fêmeas) ou "zangões" (machos). A estrutura social da colônia é mantida pela rainha e pelas operárias, dependendo de um sistema de comunicação eficaz. A divisão de trabalho na casta das operárias depende sobretudo da idade das abelhas, mas varia conforme as necessidades da colônia. A reprodução e a força da colônia dependem da rainha, da quantidade de comida armazenada e da dimensão da força de trabalho. As abelhas também podem ser subdivididas nas categorias de "abelhas de colmeia", geralmente para a primeira parte de uma vida útil das operárias, durante a qual a "abelha de colmeia" realiza tarefas na colmeia e de "abelha forrageira", durante a última parte da vida útil da abelha, durante a qual a "forrageira" localiza e coleta pólen e néctar da parte de fora da colmeia e leva néctar ou pólen para dentro da colmeia para consumo e armazenamento. A presente descrição proporciona, e inclui, métodos e composições para o tratamento de colônias de insetos.
[0060] Conforme usado aqui, o termo "parasita" refere-se a formas adultas e imaturas de organismos que se beneficiam diretamente às custas de outro organismo hospedeiro, por exemplo, alimentando-se do sangue ou de fluidos do hospedeiro, vivendo intracelularmente em uma célula do organismo hospedeiro ou vivendo em um corpo de um organismo hospedeiro. A presente descrição proporciona, e inclui, métodos e composições para o tratamento de parasitas. Em um aspecto, o parasita pode ser um Varroa destructor.
[0061] Tal como usado aqui, o termo "silenciamento do RNA" refere- se a um grupo de mecanismos regulatórios (por exemplo, interferência do RNA (RNAi), silenciamento do gene transcricional (TGS), silenciamento do gene pós-transcricional (PTGS), supressão, co- supressão e repressão de tradução) mediados por moléculas de RNA que resultam na inibição ou "silenciamento" da expressão de um gene viral correspondente. O silenciamento do RNA foi observado em vários tipos de organismo, incluindo plantas, animais e fungos. Em alguns aspectos de acordo com a presente descrição, as composições de ácido nucleico proporcionam o silenciamento do RNA. Em certos aspectos, as composições de ácido nucleico proporcionam o silenciamento de genes virais em um parasita de abelhas.
[0062] A presente descrição prevê um método de redução da carga viral ou de supressão da replicação viral em um ácaro Varroa destructor ou em uma colônia de abelhas, o método caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento, ao ácaro Varroa destructor ou à colônia de abelhas, de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácido nucleico que seja essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha, reduzindo, desse modo, a carga viral ou suprimindo a replicação viral no ácaro Varroa destructor ou na colônia de abelhas. Em algumas modalidades, o vírus de abelha é selecionado dentre o grupo consistindo no Vírus da Paralisia Aguda em Abelhas (ABPV), Vírus da Asa Deformada (DWV), Vírus de Abelhas Caxemira (KBV), Vírus da Realeira Negra (BQCV), Vírus da Cria Ensacada (SBV), Vírus da Paralisia Crônica em Abelhas (CPV), Vírus Cloudy Wing (asa opaca) (CWV), Vírus Israelense da Paralisia Aguda (IAPV), Vírus Iridescente de Invertebrados Tipo 6 (IIV6), Vírus Varroa Destructor (VDV-1), Vírus Kakugo (KV) e Vírus Lake Sinai (LSV).
[0063] A presente descrição também prevê uma composição para ser administrada a um ácaro Varroa destructor, uma abelha, ou uma colônia de abelhas, compreendendo uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácido nucleico que seja essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha. Em algumas modalidades, a composição reduz a carga viral ou suprime a replicação viral no ácaro Varroa destructor, na abelha ou na colônia de abelhas. Em algumas modalidades, a composição aumenta a tolerância de uma abelha ou de uma colônia de abelhas a uma doença causada pelo vírus de abelha.
[0064] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador é DNA de fita simples (ssDNA), RNA de fita simples (ssRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), DNA de fita dupla (dsDNA) ou híbridos de DNA-RNA de fita dupla.
[0065] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador regula negativamente o gene viral. Em algumas modalidades, o gene viral codifica uma proteína de revestimento, RdRp, VP1, VP2 ou helicase. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou complementaridade ou com 100% de identidade de sequência ou complementaridade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:1-21 ou um fragmento seu. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma mistura de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 polinucleotídeos desencadeadores diferentes, que têm como alvo diferentes vírus ou diferentes genes do mesmo vírus ou diferentes fragmentos de um gene viral.
[0066] A presente descrição também prevê um método de redução da carga viral em uma colônia de abelhas por meio do fornecimento ao parasita de uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha, suprimindo, desse modo, a replicação viral no parasita e reduzindo a carga viral na colônia de abelhas. Em algumas modalidades, o parasita é um ácaro Varroa destructor.
[0067] A presente descrição prevê ainda um método para redução da suscetibilidade de uma abelha a uma doença causada por um vírus de abelha, o método caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento, a um parasita da abelha, de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácido nucleico que seja essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha, suprimindo, desse modo, a replicação viral no parasita e reduzindo a suscetibilidade da abelha a uma doença causada pelo vírus da abelha. Em algumas modalidades, a doença é o distúrbio de colapso da colônia (CCD). Em algumas modalidades, o parasita é um ácaro Varroa destructor.
[0068] Em algumas modalidades, a composição que compreende uma quantidade eficaz do polinucleotídeo desencadeador é fornecida pela pulverização do ácaro Varroa, administrando-se diretamente ao ácaro Varroa ou às abelhas em uma colônia de abelhas, ou uma combinação destes.
[0069] Em um aspecto, a presente invenção prevê um método para reduzir a carga viral ou suprimir a replicação viral em um ácaro Varroa destructor, compreendendo o método o fornecimento de uma composição ao ácaro Varroa destructor, compreendendo a composição uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácidos nucleicos essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência viral, suprimindo ou reduzindo a replicação viral no ácaro Varroa destructor.
[0070] Em um aspecto, a presente descrição prevê um método de redução da carga viral ou supressão da replicação viral em uma abelha ou em uma colônia de abelhas, o método compreendendo o fornecimento à abelha ou à colônia de abelhas de uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência viral, suprimindo a replicação viral ou reduzindo a carga viral na abelha ou na colônia de abelhas.
[0071] Em um aspecto, a presente descrição prevê um método de redução ou supressão da replicação viral em uma abelha ou colônia de abelhas, o método compreendendo a redução da carga viral ou a supressão da replicação viral em um parasita da abelha ou da colônia de abelhas por meio do fornecimento ao parasita de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácidos nucleicos essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência viral, suprimindo, assim, a replicação viral no parasita e reduzindo a carga viral na colônia de abelhas. Em algumas modalidades, o parasita é Varroa destructor.
[0072] Em um aspecto, a presente descrição prevê um método de redução da carga viral ou de supressão da replicação viral em um ácaro Varroa destructor, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao ácaro Varroa destructor de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácido nucleico que regula negativamente a expressão de um gene de vírus de abelha no ácaro Varroa destructor, reduzindo, desse modo, a carga viral ou suprimindo a replicação viral no ácaro Varroa destructor. Em algumas modalidades, a sequência e ácidos nucleicos é um polinucleotídeo desencadeador que é essencialmente idêntico ou complementar ao gene viral ou a um fragmento seu.
[0073] Em um aspecto, a presente descrição prevê a redução da carga viral ou supressão da replicação viral em uma colônia de abelhas, o método compreendendo a redução da carga viral ou a supressão da replicação viral em um parasita da colônia de abelhas por meio do fornecimento ao parasita de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácidos nucleicos essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência viral, suprimindo, assim, a replicação viral no parasita e reduzindo a expressão viral na colônia de abelhas. Em algumas modalidades, o parasita é Varroa destructor.
[0074] Em um aspecto, a presente descrição prevê um método para redução da suscetibilidade de uma abelha a uma doença causada por um vírus de abelha, o método caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento, a um parasita da abelha, de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que seja essencialmente idêntica ou essencialmente complementar a uma sequência viral, suprimindo, desse modo, a replicação viral no parasita e reduzindo a suscetibilidade da abelha a uma doença causada pelo vírus da abelha. Em algumas modalidades, o parasita é Varroa destructor. Em algumas modalidades, a doença é o distúrbio de colapso da colônia (CCD).
[0075] Tal como aqui utilizado, o termo "desencadeador" ou "polinucleotídeo desencadeador" refere-se a uma molécula de polinucleotídeo bioativo que é substancialmente homóloga ou complementar a uma sequência polinucleotídica de um gene alvo ou de um RNA expresso a partir do gene alvo ou um fragmento seu, e funciona para suprimir a expressão do gene alvo ou produzir um fenótipo knockdown. Os polinucleotídeo desencadeadores são capazes de inibir ou "silenciar" a expressão de um gene alvo. Os polinucleotídeos desencadeadores geralmente são descritos em relação à sua "sequência alvo". Os polinucleotídeos desencadeadores podem ser DNA de fita simples (ssDNA), um RNA de fita simples (ssRNA), um RNA de fita dupla (dsRNA), um DNA de fita dupla (dsDNA) ou híbridos DNA/RNA de fita dupla. Os polinucleotídeos desencadeadores podem compreender nucleotídeos de ocorrência natural, nucleotídeos modificados, análogos de nucleotídeos ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo desencadeador pode ser incorporado em um polinucleotídeo maior, por exemplo: uma molécula de pri-miRNA. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo desencadeador pode ser processamento em um RNA de interferência pequeno (siRNA). Em um aspecto, o polinucleotídeo desencadeador é capaz de inibir a expressão de um gene viral. Em um aspecto, o polinucleotídeo desencadeador é capaz de ser usado em métodos para inibir a expressão de um gene viral e, por conseguinte, reduzir a carga viral de um organismo hospedeiro. Em certos aspectos, o gene viral é um gene DWV, VDV-1, IAPV, ABPv, KBV ou LSV e o organismo hospedeiro é um Varroa destructor.
[0076] Tal como aqui utilizado, o termo "sequência alvo" ou "gene alvo" refere-se a uma sequência nucleotídica que ocorre em um produto de gene ou genes contra os quais um polinucleotídeo desencadeador é dirigido. Nesse contexto, o termo "gene" significa uma região localizável da sequência genômica, correspondendo a uma unidade hereditária, a qual inclui regiões reguladoras, como promotores, intensificadores, regiões não-traduzidas 5', regiões de íntrons, regiões não-traduzidas 3', regiões transcritas e outras regiões de sequência funcionais que podem existir na forma de genes nativos ou transgenes em um genoma vegetal. Dependendo das circunstâncias, o gene alvo ou a sequência alvo de termo podem ser referidos como sequência de nucleotídeos de comprimento total do gene ou produto do gene alvejado para a supressão da sequência de nucleotídeos de uma porção do gene ou do produto do gene alvejado para a supressão.
[0077] Tal como aqui utilizado, o termo "derivado de" refere-se a uma sequência de nucleotídeos que pode ser obtida a partir de uma fonte ou espécie especificada, embora não necessariamente diretamente daquela fonte ou espécie especificada.
[0078] Tal como aqui utilizados, os termos "sequência", "sequência de nucleotídeos" ou "sequência de polinucleotídeos" se refere a uma sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA, uma molécula de RNA ou uma porção destas.
[0079] O termo "polinucleotídeo" se refere a qualquer polímero de mononucleotídeos que são ligados por ligações internucleotídicas. Os polinucleotídeos podem ser compostos de ribonucleotídeos de ocorrência natural, deoxirribonucleotídeos de ocorrência natural, análogos de nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, formas enantioméricas dos nucleotídeos de ocorrência natural) ou combinações suas. Quando um polinucleotídeo é de fita simples, seu comprimento pode ser descrito em termos da quantidade de nucleotídeos. Onde um polinucleotídeo tem fita dupla, seu comprimento pode ser descrito em termos da quantidade de pares de bases.
[0080] Como utilizado, o termo "polinucleotídeo não-transcriptível" se refere a um polinucleotídeo que não compreende uma unidade de transcrição de polimerase II completa.
[0081] O termo "expressão de gene" se refere ao processo de conversão de informações genéticas codificadas no DNA genômico para RNA (por exemplo, mRNA, rRNA, tRNA ou snRNA) por meio da transcrição do gene através da ação enzimática de uma RNA polimerase e em proteína, através do mRNA. A expressão de genes pode ser regulada em muitos estágios no processo.
[0082] Nas modalidades aqui descritas, as sequências virais são selecionadas como alvos para polinucleotídeos desencadeadores. Em algumas modalidades, as sequências alvo são selecionadas por incluírem baixo teor de G/C, já que estes se mostraram mais efetivos no silenciamento do gene de mediação em comparação àqueles com teor de G/C superior a 55%. Em algumas modalidades, diversos locais alvo são selecionados ao longo do comprimento do gene alvo.
[0083] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma sequência de nucleotídeos que é essencialmente complementar ou essencialmente idêntica a um gene viral ou um fragmento seu. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende um ácido nucleico que é essencialmente complementar ou idêntico a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende um ácido nucleico que é essencialmente complementar ou idêntica a uma sequência com pelo menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 nucleotídeos contíguos de um gene de vírus de abelha. Em algumas modalidades, o gene viral codifica uma proteína de revestimento, proteína viral 1 (VP1), VP2 ou helicase. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma sequência de nucleotídeos que é essencialmente complementar ou essencialmente idêntica a um gene de DWV ou IAPV ou um fragmento deles. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma sequência de nucleotídeos que é essencialmente complementar ou essencialmente idêntica a um gene de LSV ou um fragmento seu. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma sequência de nucleotídeos que é essencialmente complementar ou essencialmente idêntica a um gene de paralisia de abelha aguda ou um fragmento seu. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma sequência de nucleotídeos que é essencialmente complementar ou essencialmente idêntica a um gene de vírus de abelha Caxemira ou um fragmento seu. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma sequência de nucleotídeos que é essencialmente complementar ou essencialmente idêntica a um gene de vírus de abelha da rainha negra ou um fragmento seu. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma sequência de nucleotídeos que é essencialmente complementar ou essencialmente idêntica a um gene do vírus da paralisia crônica ou um fragmento seu. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma sequência de nucleotídeos que é essencialmente complementar ou essencialmente idêntica a um gene de vírus da asa opaca ou um fragmento seu.
[0084] As sequências múltiplas de patógenos de abelhas podem ser concebidas de modo a incluir sequências adequadas para a produção de polinucleotídeos desencadeadores eficazes contra mais de um vírus de abelha. Esse dsRNA múltiplo de patógeno de abelha pode ser de uma variedade longa ou curta e pode incluir sequências correspondentes às sequências homólogas em uma classe de vírus de abelha. Além disso, as sequências múltiplas podem ser concebidas para incluir duas ou mais sequências de dsRNA do mesmo patógeno de abelha.
[0085] Por "essencialmente idêntica" ou "essencialmente complementar", pretende-se denotar que o desencadeador de polinucleotídeos bioativos (ou pelo menos uma fita de polinucleotídeo de fita dupla, ou uma porção sua, ou uma porção de um polinucleotídeo de fita simples) hibridiza sob condições fisiológicas para o gene endógeno, um RNA transcrito a partir dele ou um fragmento seu, de modo a efetuar a regulação ou supressão do gene endógeno. Por exemplo, em algumas modalidades, um desencadeador de polinucleotídeos bioativos tem 100 por cento de identidade de sequência ou pelo menos 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 de identidade de sequência em comparação a uma sequência de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 , 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 , 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 ou mais nucleotídeos contíguos no gene alvo ou RNA transcrito a partir do gene alvo. Em algumas modalidades, um desencadeador de polinucleotídeos bioativos tem 100 por cento de complementaridade de sequência ou pelo menos 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 de complementaridade de sequência em comparação a uma sequência de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 , 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 , 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 ou mais nucleotídeos contíguos no gene alvo ou RNA transcrito a partir do gene alvo. Em algumas modalidades, um desencadeador de polinucleotídeos bioativos tem 100 por cento de identidade de sequência ou complementaridade com um alelo ou um membro da família de um determinado gene alvo (sequência codificante ou não-codificante de um gene). Em algumas modalidades, um desencadeador de polinucleotídeos bioativos têm pelo menos cerca de 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade de sequência ou complementaridade de sequência com múltiplos alelos ou membros da família de um determinado gene alvo. Em algumas modalidades, um desencadeador de polinucleotídeos bioativos tem 100 por cento de identidade de sequência ou complementaridade com múltiplos alelos ou membros da família de um determinado gene alvo.
[0086] Tal como aqui utilizado, as moléculas da sequência de ácido nucleico, acredita-se, apresentam "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das sequências lidas entre 5' e 3' é complementar a cada nucleotídeo da outra sequência, quando lida de 3' a 5'. Uma sequência de nucleotídeos que é completamente complementar a uma sequência de nucleotídeos de referência apresentará uma sequência idêntica a uma sequência complementar inversa da sequência de nucleotídeos de referência.
[0087] Será apreciado que um polinucleotídeo desencadeador, por exemplo: dsRNA, da presente descrição não precisa estar limitado às moléculas que contêm apenas nucleotídeos naturais, mas abrange também os nucleotídeos modificados quimicamente e os não- nucleotídeos. Os agentes de polinucleotídeos desencadeadores da presente descrição também podem incluir modificações ou substituições de base. Conforme utilizado aqui, bases "não modificadas" ou "Naturais" inclui adenina (A) e guanina (G) de bases de purina e timina (T), citosina (C) e uracil (U) de base de pirimidina. As bases modificadas incluem, mas não estão limitadas a outras bases sintéticas e naturais, tais como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo e outros derivados alquila de adenina e guanina, outros derivados de alquil de adenina e guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracil e citosina, uracil de 5-propinilo e citosina, 6-azo uracila, citosina e timina de 2-propil e 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil e outras adeninas e guaninas substituídas em 8, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil e outras uracilas e citosinas substituídas em 5, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8- aza-adenina, 7-desazaguanina e 7-desaza-adenina e 3-desazaguanina e 3- deazaadenina. Outras bases incluem as reveladas na Pat. U.S. No. 3.687.808, aquelas descritas em The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pp. 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelas descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 613 e as descritas por Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisenso Research and Applications, pp. 289-2, Crooke, S. T. e Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Essas bases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos da descrição. Estas incluem pirimidinas substituídas em 5, 6-azapirimidinas e purinas substituídas em 0-6 e N- 2, N-6, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracil e 5- propinilcitosina. Mostrou-se que as substituições de 5-metilcitosina aumentam a estabilidade dúplex de ácido nucleico em 0,6-1,2 ° C. (Sanghvi YS et al. (1993) Antisenso Research and Applications, CRC Press, Boca Raton 276-278) e são substituições de base preferidas no momento, mais particularmente quando combinadas com modificações de açúcar de 2'-O-metoxietil.
[0088] Após a síntese, os polinucleotídeos desencadeadores da presente descrição podem opcionalmente ser purificados. Por exemplo, os polinucleotídeos podem ser purificados a partir de uma mistura por extração com um solvente ou uma resina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou uma combinação destas. Alternativamente, os polinucleotídeos desencadeadores podem ser usados com nenhuma purificação, ou um mínimo de, para evitar perdas por conta do processamento da amostra. Os polinucleotídeos desencadeadores podem ser secos para armazenamento ou dissolvidos em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover o recozimento e/ou a estabilização das fitas duplas.
[0089] Tal como aqui utilizados, os termos "homologia" e "identidade", quando utilizados em relação a ácidos nucleicos, descrevem o grau de semelhança entre duas ou mais sequências de nucleotídeos. A porcentagem de "identidade de sequência" entre duas sequências idealmente alinhadas em uma janela de comparação, em que a parte da sequência polinucleotídica na janela de comparação pode incluir adições ou exclusões (ou seja, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou exclusões) para o alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicar o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade de sequência. Afirma-se que uma sequência que é idêntica em todas as posições, em comparação a uma sequência de referência, é idêntica à sequência de referência e vice-versa. Um alinhamento de duas ou mais sequências pode ser realizado utilizando qualquer programa de computador adequado. Por exemplo, programa de computador amplamente utilizado e aceito para o desempenho de alinhamentos de sequência é CLUSTALW v1.6 (Thompson, et al. Nucl. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994).
[0090] Conforme usado neste documento, "organismo de controle" denota um organismo que não contém o polinucleotídeo desencadeador ou outro ácido nucleico que proporciona o controle de uma infecção viral ou uma replicação viral. Os organismos de controle são geralmente da mesma espécie e do mesmo estágio de desenvolvimento que é cultivado sob as mesmas condições de crescimento que o organismo tratado. Do mesmo modo, uma "colônia de controle" denota uma colônia de organismos que não contêm o polinucleotídeo desencadeador ou outro ácido nucleico que proporciona o controle da infecção ou da replicação viral. As colônias de controle de organismos são geralmente da mesma espécie e do mesmo estágio de desenvolvimento que são cultivados sob as mesmas condições de cultivo da colônia de organismos tratada.
[0091] Conforme usado aqui, o termo "tratamento" inclui a anulação, inibição substancial, retardo ou reversão da progressão de uma condição, melhorando substancialmente sintomas clínicos ou estéticos de uma doença ou impedindo substancialmente o aparecimento de sintomas clínicos ou estéticos de uma doença. Em um aspecto de acordo com a presente invenção, uma composição pode ser utilizada para tratar um organismo ou colônias de organismos contra infecção viral. Em um aspecto, uma composição de dsRNA pode ser usada no tratamento de um organismo hospedeiro ou parasita contra infecção viral. Em um aspecto, o organismo hospedeiro é uma abelha e o parasita é o ácaro, Varroa destructor. Em um aspecto, a presente invenção prevê um método para o tratamento do Distúrbio de Colapso da Colônia (CCD).
[0092] Tal como aqui utilizados, os termos "melhorar", "melhorado", "aumentar" e "aumento" referem-se a, pelo menos, cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou um maior aumento de uma população de organismos ou de colônias, um aumento da produtividade de um organismo ou de colônias (por exemplo, aumento das produções mel), um aumentar da taxa de crescimento de um organismo ou de colônias ou um aumento da taxa de reprodução em relação a um organismo de controle ou colônia. A presente descrição proporciona métodos para melhorar a saúde de um organismo ou de colônias proporcionando uma composição antiviral.
[0093] Tal como aqui utilizado, "carga viral", também conhecida como "título viral", "nível viral" ou "expressão viral", em algumas modalidades, é uma medida da gravidade de uma infecção viral e pode ser calculada estimando-se a quantidade de vírus de um organismo infectado, um fluido corporal envolvido ou uma colônia afetada. Ela também pode ser calculada pela estimativa ou medição da quantidade da fita senso de uma sequência de vírus de abelha em um organismo infectado, um fluido corporal envolvido ou uma colônia afetada.
[0094] Como usado aqui, "uma redução" de um nível de agente, como uma proteína ou mRNA, significa que o nível é reduzido em relação a um organismo ou colônia sem um polinucleotídeo desencadeador, por exemplo: uma molécula de dsRNA capaz de reduzir o agente. Conforme usado aqui, "uma redução", em referência a uma carga viral, denota que a carga viral é reduzida em relação a um organismo ou colônia sem um ácido nucleico ou outra molécula de dsRNA capaz de reduzir a carga viral. A presente descrição prevê, e inclui, métodos e composições de redução do nível de uma expressão de proteína viral ou gente viral e de redução da carga viral. A presente invenção também prevê métodos e composições para a redução do nível de uma replicação viral em um ácaro Varroa ou em uma abelha.
[0095] Tal como aqui utilizado, o termo "pelo menos uma redução parcial" do nível de um agente, tal como uma proteína ou mRNA, significa que o nível é reduzido de pelo menos 25% em relação a um organismo ou colônia sem um polinucleotídeo desencadeador, por exemplo: uma molécula de dsRNA capaz de reduzir o agente. Conforme usado aqui, "pelo menos uma redução parcial", em referência a uma carga viral, denota que o nível viral é reduzido em pelo menos 25% em relação a um organismo ou colônia sem um ácido nucleico ou outra molécula de dsRNA capaz de reduzir a carga viral. A presente descrição prevê, e inclui, métodos e composições de redução de para reduzir ao menos parcialmente o nível de uma expressão de proteína viral ou gene viral e reduzir pelo menos parcialmente a carga viral.
[0096] Conforme usado aqui, uma "redução substancial" do nível de um agente, como uma proteína ou mRNA, significa que o nível é reduzido em relação a um organismo ou colônia sem um polinucleotídeo desencadeador, por exemplo: uma molécula de dsRNA, capaz de reduzir o agente, onde a redução do nível do agente é de ao menos 75%. Conforme usado aqui, "uma redução substancial", em referência a uma carga viral, denota que a carga viral é reduzida em pelo menos 75% em relação a um organismo ou colônia sem um ácido nucleico ou outra molécula de dsRNA capaz de reduzir a carga viral. A presente descrição prevê, e inclui, métodos e composições de redução substancial do nível de uma expressão de proteína viral ou gente viral e de redução substancial da carga viral.
[0097] Tal como aqui utilizado, "uma eliminação efetiva" de um agente, tal como uma proteína ou mRNA, relaciona-se a um organismo ou colônias sem um polinucleotídeo desencadeador, por exemplo: uma molécula de dsRNA capaz de reduzir o agente, onde a redução do nível do agente é superior a 95%. Um polinucleotídeo desencadeador, preferencialmente uma molécula de dsRNA, é capaz de, preferencialmente, proporcionar pelo menos uma redução parcial, mais preferencialmente uma redução substancial ou, mais preferencialmente, a eliminação efetiva de outro agente, como a expressão de gene viral ou proteína viral, ou um vírus, onde o agente deixa o nível de expressão de um gene hospedeiro essencialmente inalterada, substancialmente inalterada ou parcialmente inalterada. Conforme usado aqui, uma "eliminação efetiva", em referência à carga viral, denota que a carga viral é reduzida em pelo menos 95% em relação a um organismo ou colônia sem um ácido nucleico ou outra molécula de dsRNA capaz de reduzir a proteína viral, expressão de gene viral ou carga viral. A presente descrição prevê, e inclui, métodos e composições para a eliminação efetiva da expressão de uma proteína ou gene viral e a eliminação efetiva de uma infecção viral.
[0098] Tal como aqui utilizados, os termos "suprimir", "reprimir" e "regular negativamente" ao se referir à expressão ou atividade de uma molécula de ácido nucleico em um organismo ou uma colônia são utilizados de forma equivalente neste documento e significam que o nível de expressão ou atividade da molécula de ácido nucleico em uma célula de um organismo ou uma colônia após a aplicação de um método da presente invenção é mais baixa do que a sua expressão ou atividade na célula de um organismo ou uma colônia, antes de aplicar o método, ou em relação a um organismo de controle sem uma molécula de ácido nucleico da descrição. A presente descrição proporciona, e inclui, métodos e composições para a supressão, repressão e regulação negativa do nível da expressão de uma proteína ou gene viral e supressão, repressão e regulação negativa do nível de infecção viral em um organismo ou em uma colônia. A presente invenção também prevê métodos e composições para suprimir, reprimir ou regular negativamente o nível de uma replicação viral em um organismo ou em uma colônia. Em algumas modalidades, o organismo é um ácaro Varroa. Em algumas modalidades, o organismo é uma abelha. Em algumas modalidades, a colônia é uma colônia de abelhas.
[0099] Os termos "suprimido", "reprimido" e "regulado negativamente", como usado aqui, são sinônimos e denota uma expressão ou atividade menor, preferencialmente significativamente menor da molécula de ácido nucleico alvejada. Ademais, conforme usados aqui, "suprimido", "reprimido" e "regulado negativamente", em referência à infecção ou carga viral, denota que o nível de infecção ou de carga viral é mais baixo, preferencialmente, de modo significativo, mais baixo em relação a um organismo ou uma colônia sem um ácido nucleico ou outra molécula de dsRNA apta a reduzir a expressão do gene viral. A presente descrição proporciona, e inclui, métodos e composições para a supressão, repressão e regulação negativa da expressão ou atividade de uma proteína ou gene viral e repressão e regulação negativa da infectividade dos vírus.
[00100] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador é DNA de fita simples (ssDNA), RNA de fita simples (ssRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), DNA de fita dupla (dsDNA) ou híbridos de DNA/RNA de fita dupla. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador é dsRNA.
[00101] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou com 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:1- 21 ou um fragmento seu. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de complementaridade de sequência ou com 100% de complementaridade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:1-21 ou um fragmento seu. Em algumas modalidades, a composição de polinucleotídeos desencadeadores compreendem uma sequência de ácidos nucleicos com identidade essencial ou complementaridade essencial a uma sequência que consiste em pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 nucleotídeos contíguos a partir de uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NOs: 1-21.
[00102] Em certos aspectos, a presente invenção proporciona uma composição de dsRNA que compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou complementaridade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 1 a 21 ou um fragmento seu. Em certos aspectos, a composição de dsRNA compreende uma sequência de nucleotídeos com 100% de identidade ou complementaridade a uma sequência selecionada dentre as SED ID NOs: 1-21 ou um fragmento seu. Em outro aspecto, a presente descrição prevê uma codificação de DNA em pelo menos um precursor de dsRNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos com 100% de identidade ou complementaridade com uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 21, ou um fragmento seu, ou com pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% , 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou complementaridade com uma sequência selecionada a partir das SEQ ID NOs: 1 a 21 ou um fragmento seu. Em outro aspecto, ainda, a presente descrição prevê um DNA recombinante que codifica pelo menos um precursor de dsRNA que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 21, ou são fornecidos um fragmento seu, um promotor heterólogo e uma sequência de terminação. Em outro aspecto, a presente descrição prevê um DNA recombinante que codifica pelo menos um precursor de dsRNA que compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou complementaridade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:1 a 21, ou um fragmento seu, e que compreende também um promotor heterólogo e um terminador de transcrição.
[00103] Em várias modalidades, a presente descrição prevê uma composição que compreende pelo menos um polinucleotídeo desencadeador. Em algumas modalidades, a composição compreende uma mistura de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 diferentes polinucleotídeos desencadeadores. Em algumas modalidades, a composição compreende uma mistura de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 diferentes polinucleotídeos desencadeadores. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos desencadeadores podem ter como alvo diferentes vírus. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos alvo podem ter como alvo diferentes genes do mesmo vírus. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos desencadeadores podem ter como alvo diferentes fragmentos de uma sequência viral ou gene viral.
[00104] Será apreciado que os polinucleotídeos desencadeadores, por exemplo: dsRNA, podem ser administrados à praga ou ao parasita em uma ampla variedade de maneiras. De acordo com um aspecto, os polinucleotídeos desencadeadores são administrados diretamente ao parasita (por exemplo, por pulverização de uma colmeia infestada de ácaros). Os polinucleotídeos desencadeadores ou construtos que codificam o os mesmos podem ingressar nos corpos dos ácaros através de difusão. Em outro aspecto, os polinucleotídeos desencadeadores são diretamente administrados por meio de um organismo hospedeiro (por exemplo, pelo fornecimento de uma ração de abelha compreendendo o polinucleotídeo desencadeador a uma abelha). Em um aspecto, o parasita pode ser um Varroa destructor. Em um aspecto, o organismo hospedeiro é uma abelha.
[00105] Será apreciado que uma vez que muitos parasitas usam suas bocas para perfurar o exoesqueleto do artrópode hospedeiro e alimentam-se da hemolinfa do artrópode, a presente descrição contempla a administração dos polinucleotídeos desencadeadores, por exemplo: dsRNA, da presente descrição para o artrópode hospedeiro, a partir do que eles são apresentados na hemolinfa do artrópode, tornando-se disponíveis ao parasita. Assim, de acordo com um outro aspecto, os agentes de ácido nucleico são administrados indiretamente ao parasita (por exemplo, a um ácaro por meio de uma abelha hospedeira). Em certos aspectos, a praga ou parasita é um Varroa destructor e o artrópode hospedeiro é uma abelha.
[00106] De acordo com um aspecto, os polinucleotídeos desencadeadores, por exemplo: dsRNA, são administrados aos hospedeiros infestados através de pulverização. Os polinucleotídeos desencadeadores, por exemplo: dsRNA, ou construtos que codificam os mesmos podem ingressar nos corpos dos ácaros através de difusão. Em certos aspectos, a praga ou parasita é um Varroa destructor e o artrópode hospedeiro é uma abelha.
[00107] De acordo com um outro aspecto, os polinucleotídeos desencadeadores, por exemplo: dsRNA, são administrados ao hospedeiro por meio de sua ração. Os presentes inventores consideram que após a ingestão dos polinucleotídeos desencadeadores da presente descrição, os polinucleotídeos desencadeadores podem ser apresentados, por exemplo, em um artrópode hospedeiro na hemolinfa do hospedeiro, a partir da qual ela é disponibilizada ao parasita, por exemplo, um ácaro Varroa.
[00108] Em um aspecto, os polinucleotídeos da presente descrição podem ser sintetizados in vitro e adicionados à ração. Por exemplo, o RNA de fita dupla pode ser sintetizado pela adição de dois promotores opostos (por exemplo, promotores de T7) nas extremidades dos segmentos de genes, em que o promotor é colocado imediatamente em 5' do segmento do gene na orientação oposta. O dsRNA pode ser transcrito in vitro com a RNA polimerase de T7.
[00109] Exemplos não limitativos de sequências para a sintetização do dsRNA, de acordo com aspectos da presente descrição, são fornecidos nas SEQ ID NOs: 1-21. O comprimento total ou um fragmento dessas sequências pode ser usado como modelo.
[00110] O presente pedido prevê e divulga composições que compreendem um polinucleotídeo desencadeador e uma substância excipiente. Em um aspecto, o excipiente pode ser uma combinação de um ou mais componentes inativos. Em alguns aspectos, o excipiente compreende um açúcar. Açúcares exemplificativos incluem hexoses, dissacarídeos, trissacarídeos e açúcares superiores. Os açúcares excipientes incluem, por exemplo, frutose, glicose, sacarose, trealose, lactose, galactose, ribose. Em outros aspectos o excipiente compreende um açúcar e um solvente. Em outros aspectos, o excipiente compreende uma proteína. Em um aspecto, a proteína é uma proteína de soja. Em outros aspectos, o excipiente é pólen. Em aspectos de acordo com a presente invenção, o excipiente é uma ração de abelha.
[00111] Em algumas modalidades, o excipiente compreende uma ou mais substâncias selecionadas a partir de: um açúcar, um solvente, uma proteína, uma ração de abelha ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, o açúcar é selecionado dentre: frutose, glicose, sacarose, trealose, lactose, galactose, ribose e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a ração de abelhas é selecionada dentre: mel, pólen, trigo, farinha de soja, levedura, produto de levedura, e qualquer combinação dos mesmos.
[00112] A ração de abelhas é uma prática comum entre os apicultores, visando proporcionar nutrição e outras necessidades suplementares. As abelhas normalmente se alimentam de mel e pólen, mas também podem digerir alimentos não naturais. As abelhas podem ser alimentadas com vários produtos alimentares, incluindo, mas não se limitando, trigo (uma levedura cultivada em lacticínios de queijo cottage), farinha de soja, levedura (por exemplo, levedura de cerveja, levedura de torula) e produtos de levedura alimentados individualmente ou em combinação e farinha de soja administrada na forma de uma mistura seca ou bolo úmido dentro da colmeia ou na forma de uma mistura seca em alimentadores abertos do lado de fora da colmeia. Também pode ser usado açúcar ou um xarope de açúcar. A adição de 10 a 12 por cento de pólen a um suplemento alimentar para as abelhas melhora a palatabilidade. A adição de 25 a cento de pólen aumenta a qualidade e quantidade de nutrientes essenciais que são necessários às abelhas para a atividade vital. Cana ou de beterraba, xarope de milho isomerizado e xarope de açúcar tipo 50 são substitutos satisfatórios para mel na dieta natural de abelhas europeias. Os dois últimos podem ser fornecidos apenas como um líquido para as abelhas. A alimentação por líquido pode ser dada às abelhas dentro da colmeia, por exemplo, por qualquer um dos seguintes métodos: balde de fricção superior, pentes no interior da câmara de alimentação, alimentador de quadro de divisão, alimentador boardman, etc. O açúcar seco pode ser administrado pela colocação de uma libra ou duas na tampa invertida interna. Uma fonte de água deve ser disponibilizada às abelhas a todo momento. Em um aspecto, uma panela ou bandejas em que os suportes flutuantes - como aparas de madeira, cortiça ou esponja plástica plástico esponja - estão presentes são previstas. As descrições detalhadas das rações suplementares para as abelhas podem ser encontradas em, por exemplo, na publicação USDA Standifer, et al. 1977, intitulada "Supplemental Feeding of Honey Bee Colonies" (USDA, Agriculture Information Bulletin No. 413).
[00113] Em algumas modalidades, a ração das abelhas compreende o fornecimento de uma composição digerível por abelhas selecionada do grupo consistindo em uma composição líquida digerível por abelhas e uma composição sólida digerível por abelhas para a abelha hospedeira.
[00114] Nos aspectos de acordo com a presente descrição, um polinucleotídeo desencadeador, por exemplo: um dsRNA, é combinado com um excipiente. Em um aspecto, o polinucleotídeo desencadeador, por exemplo: dsRNA, pode ser fornecido como uma razão de polinucleotídeo desencadeador por excipiente. Em um aspecto, a razão é um polinucleotídeo desencadeador de uma parte por um excipiente de 4 partes. Em um aspecto, a proporção de polinucleotídeo desencadeador por excipiente é de 1:1, 1:2, 1:5 ou 1:10. Em outros aspectos, a razão de polinucleotídeo desencadeador por excipiente é de é 1:20, 1: 25, 1:30, 1:40 ou mais. Em um aspecto, a razão de polinucleotídeo desencadeador por excipiente é de 1:50. Em aspectos de acordo com a presente invenção, a proporção pode ser determinada como uma razão de volume por volume (v/v), uma razão de peso:peso (w/w) ou uma razão de peso:volume (w/v) Em certos aspectos, a razão é expressa como uma razão de volume por volume (v/v), peso:peso (w/w) ou peso:volume (w/v).
[00115] Nos aspectos de acordo com a presente descrição, a composição pode compreender um polinucleotídeo desencadeador, por exemplo: um dsRNA, combinado com um excipiente. Em um aspecto, o polinucleotídeo desencadeador compreende uma porcentagem do peso total da composição. Em um aspecto, o polinucleotídeo desencadeador compreende cerca de 0,1% por peso da composição. Em um aspecto, o polinucleotídeo desencadeador compreende cerca de 0,2% por peso da composição. Em um aspecto, o polinucleotídeo desencadeador compreende cerca de 0,3% por peso da composição. Em outro aspecto, o polinucleotídeo desencadeador compreende cerca de 0,4% por peso da composição. Em um aspecto, o polinucleotídeo desencadeador compreende aproximadamente até 0,5% por peso da composição. Em um aspecto, o polinucleotídeo desencadeador compreende aproximadamente até 0,6% por peso da composição. Em um aspecto, o polinucleotídeo desencadeador compreende aproximadamente até 0,7% por peso da composição. Em um aspecto, o polinucleotídeo desencadeador compreende aproximadamente até 0,8% por peso da composição. Em outro aspecto, o polinucleotídeo desencadeador compreende aproximadamente até 1,0% por peso da composição. Em outro aspecto, o polinucleotídeo desencadeador compreende aproximadamente até 1,5% por peso da composição. Em outros aspectos, o polinucleotídeo desencadeador compreende até 2,0% em peso ou 2,5% em peso da composição.
[00116] A presente descrição prevê, e inclui, composições com cerca de 0,1% a 5% em peso de polinucleotídeos desencadeadores. Em outros aspectos, uma composição compreende de 0,1 a 4%, 0,1 a 3%, 0,1 a 2%, 0,1 a 1%, 0,1 a 2%, 0,1 a 3% ou de 0,1 a 4% em peso de polinucleotídeos desencadeadores. Em um aspecto, uma composição compreende entre 0,2% e 5% empeso de polinucleotídeos desencadeadores. Em outros aspectos, uma composição compreende de 0,2 a 4%, 0,2 a 3%, 0,2 a 2%, 0,2 a 1%, 0,2 a 2%, 0,2 a 3% ou de 0,2 a 4% em peso de polinucleotídeos desencadeadores. Em outros aspectos, uma composição compreende até 1%, até 2%, até 3%, até 4% ou até 5% de polinucleotídeos desencadeadores. Em outros aspectos, uma composição compreende até 7,5%, até 10%, ou até 15% de polinucleotídeos desencadeadores.
[00117] A presente descrição prevê, e inclui, composições com cerca de 0,01% a 20% em peso de polinucleotídeos desencadeadores. Em alguns aspectos, uma composição compreende de 0,01-0,1 mg/ml, 0,01 a 1,0 mg/ml, 0,01 a 2,0 mg/ml, 0,01 a 2,5 mg/ml, 0,01 a 5 mg/ml, 0,01 a 10 mg/ml, 0,01 a 15 mg/ml ou 0,01 a 20 mg/ml de polinucleotídeos desencadeadores. Em outros aspectos, uma composição compreende de 0,1 a 1,0 mg/ml, 0,1 a 2,0 mg/ml, 0,1 a 2,5 mg/ml, 0,1 a 5 mg/ml, 0,1 a 10 mg/ml, 0,1 a 15 mg/ml ou 0,1 a 20 mg/ml de polinucleotídeos desencadeadores. Em certos aspectos, uma composição compreende pelo menos 0,01 μg/ml de polinucleotídeos desencadeadores. Em certos aspectos, uma composição compreende pelo menos 0,1 μg/ml de polinucleotídeos desencadeadores. Em determinados outros aspectos, uma composição compreende pelo menos 1,0 μg/ml de polinucleotídeos desencadeadores. Em determinados outros aspectos, ainda, uma composição compreende pelo menos 10 μg/ml de polinucleotídeos desencadeadores. Em determinados outros aspectos, ainda, uma composição compreende pelo menos 15 μg/ml de polinucleotídeos desencadeadores. Em determinados outros aspectos, ainda, uma composição compreende pelo menos 20 μg/ml de polinucleotídeos desencadeadores. Em um aspecto, uma composição compreende entre 0,01 e 0,5 mg/ml de polinucleotídeos desencadeadores. Em um aspecto, uma composição compreende entre 0,5 e 10 mg/ml de polinucleotídeos desencadeadores. Em outros aspectos, uma composição compreende de 0,5 a 1,0 mg/ml, 0,5 a 2,0 mg/ml, 0,5 a 2,5 mg/ml, 0,5 a 5 mg/ml, 0,5 a 10 mg/ml, 0,5 a 15 mg/ml ou 0,5 a 20 mg/ml de polinucleotídeos desencadeadores. Em um aspecto, uma composição compreende entre 1,0 e 10 mg/ml de polinucleotídeos desencadeadores. Em outros aspectos, uma composição compreende de 0,01 e 0,02 mg/ml, 0,02 a 0.03 mg/ml, 0,030,04 mg/ml, 0,04-0,05 mg/ml, 0,05-0,06 mg/ml, 0,06-0,07 mg/ml, 0,07 a 0,08 mg/ml, 0,08 a 0,09 mg/ml, 0,09 a 0,1 mg/ml, 0,1 a 0,2 mg/ml, 0,2 a 0,3 mg/ml, 0,3 a 0,4 mg/ml, 0,4 a 0,5 mg/ml, de 0,5 a 0,6 mg/ml, 0,6 a 0,7 mg/ml, 0,7 a 0,8 mg/ml, 0,8 a 0,9 mg/ml, 0,9 a 1,0 mg/ml, 1,0 a 2,0 mg/ml, 1,0 a 2,5 mg/ml, 2,0 a 3,0 mg/ml, 3,0 a 4,0 mg/ml, 4,0 a 5,0 mg/ml, 5,0 a 6,0 mg/ml, 6,0 a 7,0 mg/ml, 7,0 a 8,0 mg/ml, 8,0-9,0 mg/ml , 9,0 a 10,0 mg/ml, 10,0-12,0 mg/ml, 12,0-13,0 mg/ml, 13,0-14,0 mg/ml, 14,0-15,0 mg/ml, 15,0-16,0 mg/ml, 16,0-17,0 mg/ml, 17,0-18,0 mg/ml, 18,0-19,0 mg/ml, 19,0-20,0 mg/ml, 1,0 a 5 mg/ml, de 1,0 a 10 mg/ml, 1,0 a 15 mg/ml ou 1,0 a 20 mg/ml de polinucleotídeos desencadeadores Em alguns aspectos, uma composição compreende cerca de 0,1 mg/ml, cerca de 0,2 mg/ml, cerca de 0,5 ug/ml, cerca de 1,0 ug/ml, cerca de 2,0 ug/ml, cerca de 5,0 ug/ml, cerca de 10 ug/mL, sobre 0,02 mg/ml, cerca de 0,05 mg/ml, cerca de 0,1 mg/ml, cerca de 0,125 mg/ml, cerca de 0,2 mg/ml, cerca de 0,25 mg/ml, cerca de 0,3 mg/ml, cerca de 0,4 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 0,6 mg/ml, cerca de 0,7 mg/ml, cerca de 0,8 mg/ml, cerca de 0,9 mg/ml, cerca de 1,0 mg/ml, cerca de 1,5 mg/ml, cerca de 2,0 mg/ml, cerca de 2,5 mg/ml , cerca de 3,0 mg/ml, cerca de 3,5 mg/ml, cerca de 4,0 mg/ml, cerca de 4,5 mg/ml, cerca de 5,0 mg/ml, cerca de 5,5 mg/ml, cerca de 6,0 mg/ml, cerca de 6,5 mg/ml, cerca de 7,0 mg/ml, cerca de 7,5 mg/ml, cerca de 8,0 mg/ml, cerca de 8,5 mg/ml, cerca de 9,0 mg/ml, cerca de 9,5 mg/ml, cerca de 10 mg/ml, cerca de 11 mg/ml, cerca de 12 mg/ml, cerca de 13 mg/ml, cerca de 14 mg/ml, cerca de 15 mg/ml, cerca de 16 mg/ml, cerca de 17 mg/ml, cerca de 18 mg/ml, cerca de 19 mg/ml ou cerca de 20 mg/ml de polinucleotídeos desencadeadores.
[00118] Em alguns aspectos, uma composição compreende entre cerca de 1 mg a cerca de 2000 mg de polinucleotídeos desencadeadores por colônia de abelha. Em certos aspectos, uma composição compreende entre cerca de 1 mg a cerca de 100 mg, desde cerca de 1 mg a cerca de 200 mg, desde cerca de 1 mg a cerca de 300 mg, desde cerca de 1 mg a cerca de 400 mg, desde cerca de 1 mg a cerca de 500 mg, de cerca de 1 mg a cerca de 600 mg, desde cerca de 1 mg a cerca de 700 mg, desde cerca de 1 mg a cerca de 800 mg, desde cerca de 1 mg a cerca de 900 mg, desde cerca de 1 mg a cerca de 1000 mg, de cerca de 1 mg a cerca de 1200 mg, de cerca de 1 mg a cerca de 1500 mg, de cerca de 1 mg a cerca de 1800 mg, de cerca de 10 mg a cerca de 100 mg, desde cerca de 10 mg a cerca de 200 mg, desde cerca de 10 mg a cerca de 300 mg , desde cerca de 10 mg a cerca de 400 mg, desde cerca de 10 mg a cerca de 500 mg, desde cerca de 10 mg a cerca de 600 mg, desde cerca de 10 mg a cerca de 700 mg, desde cerca de 10 mg a cerca de 800 mg, desde cerca de 10 mg a cerca de 900 mg, desde cerca de 10 mg a cerca de 1000 mg, de cerca de 10 mg a cerca de 1200 mg, de cerca de 10 mg a cerca de 1500 mg, de cerca de 10 mg a cerca de 1800 mg, ou desde cerca de 10 mg a cerca de 2000 mg de polinucleotídeo desencadeador por colônia de abelhas. Em outros aspectos, a composição compreende cerca de 1 mg, cerca de 5 mg, cerca de 10 mg, cerca de 15 mg, cerca de 20 mg, cerca de 25 mg, cerca de 30 mg, cerca de 35 mg, cerca de 40 mg, cerca de 45 mg, cerca de 50 mg , cerca de 60 mg, cerca de 70 mg, cerca de 80 mg, cerca de 90 mg, cerca de 100 mg, cerca de 125 mg, cerca de 150 mg, cerca de 175 mg, cerca de 200 mg, cerca de 250 mg, cerca de 300 mg, cerca de 350 mg, sobre 400 mg, cerca de 450 mg, cerca de 500 mg, cerca de 550 mg, cerca de 600 mg, cerca de 650 mg, cerca de 700 mg, cerca de 750 mg, cerca de 800 mg, cerca de 850 mg, cerca de 900 mg, cerca de 950 mg, cerca de 1000 mg de , cerca de 1100 mg, cerca de 1200 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg, ou cerca de 2000 mg de polinucleotídeo desencadeador por colônia de abelhas.
[00119] A presente descrição proporciona e inclui métodos para reduzir a carga viral de um organismo hospedeiro. Em algumas formas de realização, o organismo é um parasita. Em um aspecto, a carga viral refere-se ao número de vírus por hospedeiro individual. Em um aspecto, a carga viral refere-se ao número médio de vírus por 100 organismos hospedeiros. Em um aspecto, a carga viral refere-se ao número de vírus por colônia de hospedeiros de parasitas. Num outro aspecto, a carga viral é determinada através da medição da expressão viral num hospedeiro, tal como uma abelha ou um ácaro Varroa. Em aspectos de acordo com a presente invenção, o parasita é um Varroa destructor e o hospedeiro é a abelha europeia, Apis mellifera.
[00120] Em um aspecto, os métodos de reduzir a infecção viral compreendem o fornecimento de uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA, a um organismo hospedeiro em que se alimenta um parasita. Noutro aspecto, os métodos de reduzir a infecção viral compreendem o fornecimento de uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA, diretamente a um organismo parasita. Em aspectos de acordo com a presente invenção, o parasita é um Varroa destructor e o hospedeiro é a abelha europeia, Apis mellifera. Uma quantidade eficaz de uma composição da presente descrição resulta numa diminuição da infecção viral no hospedeiro e/ou parasita ao longo de um período de tempo. Num aspecto, uma diminuição da infecção viral pode ser medida dentro de um dia ou de dois dias após o fornecimento de uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA. Em um aspecto, a infecção viral pode ser medida após dois dias. Em um aspecto, a infecção viral pode ser medida depois de 3 dias. Em outros aspectos, a infecção viral pode ser medida depois de 4 dias, após 5 dias, após 6 dias, após 7 dias, após uma semana, após duas semanas, após 3 semanas, ou após um mês. Em outro aspecto, a infecção viral pode ser medida mais de uma vez, por exemplo, a cada dia, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias, a cada 7 dias, a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, uma vez por semana, duas vezes por semana, três vezes por semana, uma vez por mês, duas vezes por mês, ou três vezes por mês. Em certos aspectos, de acordo com a presente descrição, uma diminuição da infecção viral pode ser medida e comparada com um controle não tratado de organismo hospedeiro, parasita ou colônia. Em aspectos de acordo com a presente invenção, o parasita é um Varroa destructor e o hospedeiro é a abelha europeia, Apis mellifera.
[00121] Em um aspecto, os métodos de reduzir a replicação viral compreendem o fornecimento de uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA, a um organismo hospedeiro em que se alimenta um parasita. Noutro aspecto, os métodos de reduzir a replicação viral compreendem o fornecimento de uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA, diretamente a um organismo parasita. Em aspectos de acordo com a presente invenção, o parasita é um Varroa destructor e o hospedeiro é a abelha europeia, Apis mellifera. Uma quantidade eficaz de uma composição da presente descrição resulta numa diminuição da expressão de gene viral no hospedeiro e/ou parasita ao longo de um período de tempo. Num aspecto, uma diminuição da expressão de gene viral pode ser medida dentro de um dia ou de dois dias após o fornecimento de uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA. Em um aspecto, a replicação viral pode ser medida após dois dias. Em um aspecto, a replicação viral pode ser medida depois de 3 dias. Em outros aspectos, a replicação viral pode ser medida depois de 4 dias, após 5 dias, após 6 dias, após 7 dias, ou após uma semana, após duas semanas, após 3 semanas, ou após um mês. Em outro aspecto, a replicação viral pode ser medida mais de uma vez, por exemplo, a cada dia, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias, a cada 7 dias, a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, uma vez por semana, duas vezes por semana, três vezes por semana, uma vez por mês, duas vezes por mês, ou três vezes por mês. Em certos aspectos, de acordo com a presente descrição, uma diminuição da replicação viral pode ser medida e comparada com um controle não tratado de organismo hospedeiro, parasita ou colônia. Em aspectos de acordo com a presente invenção, o parasita é um Varroa destructor e o hospedeiro é a abelha europeia, Apis mellifera.
[00122] Em um aspecto, os métodos de reduzir uma carga viral compreendem o fornecimento de uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA, a um organismo hospedeiro em que se alimenta um parasita. Noutro aspecto, os métodos de reduzir uma carga viral compreendem o fornecimento de uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA, diretamente a um organismo parasita. Em aspectos de acordo com a presente invenção, o parasita é um Varroa destructor e o hospedeiro é a abelha europeia, Apis mellifera. Uma quantidade eficaz de uma composição da presente descrição resulta numa diminuição da carga viral no hospedeiro e/ou parasita ao longo de um período de tempo. Num aspecto, uma diminuição da carga viral pode ser medida dentro de um dia ou de dois dias após o fornecimento de uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA. Em um aspecto, a carga viral pode ser medida após dois dias. Em um aspecto, a carga viral pode ser medida depois de 3 dias. Em outros aspectos, a carga viral pode ser medida depois de 4 dias, após 5 dias, após 6 dias, após 7 dias, após uma semana, após duas semanas, após 3 semanas, ou após um mês. Em outro aspecto, a carga viral pode ser medida mais de uma vez, por exemplo, a cada dia, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias, a cada 7 dias, a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, uma vez por mês, duas vezes por mês, ou três vezes por mês. Em certos aspectos, de acordo com a presente descrição, uma diminuição da carga viral pode ser medida e comparada com um controle não tratado de organismo hospedeiro, parasita ou colônia. Em aspectos de acordo com a presente invenção, o parasita é um Varroa destructor e o hospedeiro é a abelha europeia, Apis mellifera.
[00123] Em alguns aspectos, de acordo com a presente invenção, uma redução da carga viral ou uma redução da infecção após um período de tempo significa uma diminuição no título viral. Em um aspecto, título viral é diminuído em cerca de 10%, 20%, 30% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, título viral é diminuído em cerca de 40% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, título viral é diminuído em cerca de 50% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, título viral é diminuído em cerca de 60% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, título viral é diminuído em cerca de 70% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, título viral é diminuído em cerca de 80% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, título viral é diminuído em cerca de 90% ou mais entre as medições. Em algumas formas de realização, o título viral num organismo hospedeiro ou um parasita fornecido com uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador é reduzido em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% em comparação com o título viral num organismo hospedeiro ou um parasita que não é fornecido com o polinucleotídeo desencadeador. Em algumas formas de realização, o titulo viral é medido no prazo de 1 dia, em 2 dias, após 2 dias, ao fim de 3 dias, após 4 dias, após 5 dias, após 6 dias, após 7 dias, ou depois de uma semana, após 2 semanas, após 3 semanas, ou após um mês proporcionando o polinucleotídeo desencadeador. Em algumas formas de realização, o titulo viral é medido mais do que uma vez. Em algumas modalidades, o título viral pode ser medido a cada dia, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias, a cada 7 dias, a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, uma vez por mês, duas vezes por mês, ou três vezes por mês. Num aspecto, o organismo hospedeiro é uma abelha. Em um aspecto, o parasita pode ser um Varroa destructor.
[00124] Em alguns aspectos, de acordo com a presente invenção, uma redução da carga viral ou uma redução da infecção após um período de tempo significa uma diminuição na expressão viral. Em um aspecto, expressão viral é diminuída em cerca de 10%, 20%, 30% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, expressão viral é diminuída em cerca de 40% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, expressão viral é diminuída em cerca de 50% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, expressão viral é diminuída em cerca de 60% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, expressão viral é diminuída em cerca de 70% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, expressão viral é diminuída em cerca de 80% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, expressão viral é diminuída em cerca de 90% ou mais entre as medições. Em algumas formas de realização, a expressão viral num organismo hospedeiro ou um parasita fornecido com uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador é reduzido em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% em comparação com a expressão viral num organismo hospedeiro ou um parasita que não é fornecido com o polinucleotídeo desencadeador. Em algumas formas de realização, a expressão viral é medida no prazo de 1 dia, em 2 dias, após 2 dias, ao fim de 3 dias, após 4 dias, após 5 dias, após 6 dias, após 7 dias, ou depois de uma semana, após 2 semanas, após 3 semanas, ou após um mês proporcionando o polinucleotídeo desencadeador. Em algumas formas de realização, a expressão viral é medida mais do que uma vez. Em algumas modalidades, a expressão viral pode ser medida a cada dia, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias, a cada 7 dias, a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, uma vez por mês, duas vezes por mês, ou três vezes por mês. Num aspecto, o organismo hospedeiro é uma abelha. Em um aspecto, o parasita pode ser um Varroa destructor.
[00125] Em alguns aspectos, de acordo com a presente invenção, uma redução da carga viral ou uma redução da infecção após um período de tempo significa uma diminuição na replicação viral. Em um aspecto, replicação viral é diminuída em cerca de 10%, 20%, 30% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, replicação viral é diminuída em cerca de 40% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, replicação viral é diminuída em cerca de 50% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, replicação viral é diminuída em cerca de 60% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, replicação viral é diminuída em cerca de 70% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, replicação viral é diminuída em cerca de 80% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, replicação viral é diminuída em cerca de 90% ou mais entre as medições. Em algumas formas de realização, a replicação viral num organismo hospedeiro ou um parasita fornecido com uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador é reduzido em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% em comparação com a replicação viral num organismo hospedeiro ou um parasita que não é fornecido com o polinucleotídeo desencadeador. Em algumas formas de realização, a replicação viral é medida no prazo de 1 dia, em 2 dias, após 2 dias, ao fim de 3 dias, após 4 dias, após 5 dias, após 6 dias, após 7 dias, ou depois de uma semana, após 2 semanas, após 3 semanas, ou após um mês proporcionando o polinucleotídeo desencadeador. Em algumas formas de realização, a replicação viral é medida mais do que uma vez. Em algumas modalidades, a replicação viral pode ser medida a cada dia, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias, a cada 7 dias, a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, uma vez por mês, duas vezes por mês, ou três vezes por mês. Num aspecto, o organismo hospedeiro é uma abelha. Em um aspecto, o parasita pode ser um Varroa destructor.
[00126] Em aspectos de acordo com a presente invenção, uma redução da carga viral depois de um período de tempo resulta numa diminuição da mortalidade das abelhas. Em um aspecto, a mortalidade das abelhas é diminuída em 10%, 20%, 30% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, a mortalidade das abelhas é diminuída em 40% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, a mortalidade das abelhas é diminuída em 50% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, a mortalidade das abelhas é diminuída em 60% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, a mortalidade das abelhas é diminuída em 70% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, a mortalidade das abelhas é diminuída em 80% ou mais entre as medições. Num outro aspecto, a mortalidade das abelhas é diminuída em 90% ou mais entre as medições. Em algumas formas de realização, a mortalidade das abelhas em uma colônia de abelhas fornecida com uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo desencadeador é reduzida em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% em comparação com a mortalidade das abelhas em uma colônia de abelhas que não é fornecida com o polinucleotídeo desencadeador. Em algumas formas de realização, a mortalidade de abelha é medida no prazo de 1 dia, em 2 dias, após 2 dias, ao fim de 3 dias, após 4 dias, após 5 dias, após 6 dias, após 7 dias, ou depois de uma semana, após 2 semanas, após 3 semanas, ou após um mês proporcionando o polinucleotídeo desencadeador. Em algumas formas de realização, a mortalidade das abelhas é medida mais do que uma vez. Em algumas modalidades, a mortalidade de abelha pode ser medida a cada dia, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias, a cada 7 dias, a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, uma vez por mês, duas vezes por mês, ou três vezes por mês.
[00127] Em aspectos de acordo com a presente invenção, uma quantidade eficaz de polinucleotídeo desencadeador, por exemplo, dsRNA, pode ser fornecida periodicamente ou continuamente. Num aspecto, uma quantidade eficaz de um desencadeador, por exemplo, dsRNA, a composição pode ser fornecida uma vez, duas vezes ou três vezes por dia. Em outros aspectos, uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA, pode ser proporcionada uma vez por dia. Noutro aspecto, uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA, pode ser fornecida uma ou mais vezes em dias alternados. Num aspecto, uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA, pode ser fornecida a cada dois dias, três em três dias, de quatro em quatro dias, de cinco em cinco dias, a cada seis dias, ou uma vez por semana. Em um aspecto, uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA, pode ser fornecida continuamente a um organismo com necessidade, por exemplo, pelo fornecimento de uma fonte contínua de alimentos. Num aspecto, uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA, pode ser fornecida de forma contínua como uma composição ingerível-por-abelha. Num aspecto, uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA, pode ser fornecida a um organismo hospedeiro. Noutro aspecto, uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA, pode ser fornecida diretamente a um organismo parasita. Em aspectos de acordo com a presente invenção, o parasita é um Varroa destructor e o hospedeiro é a abelha europeia, Apis mellifera.
[00128] A presente descrição proporciona métodos de reduzir a carga viral de uma colônia de abelhas mel que compreende proporcionar a uma colônia de abelhas uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA. Uma quantidade eficaz de uma composição de polinucleotídeo desencadeador da presente descrição resulta numa redução da expressão do gene viral e replicação viral ao longo de um período de tempo. Num aspecto, uma redução da replicação viral ou expressão viral é medida no prazo de um dia ou dentro de dois dias após o fornecimento de uma quantidade eficaz de uma composição desencadeadora, por exemplo, dsRNA. Em um aspecto, a redução da replicação viral ou a expressão viral pode ser medida após dois dias. Em um aspecto, a redução da replicação viral ou a expressão viral pode ser medida depois de 3 dias. Em outros aspectos, a redução da replicação viral ou expressão viral pode ser medida depois de 4 dias, após 5 dias, após 6 dias, após 7 dias, após uma semana, após duas semanas, após 3 semanas, ou após um mês. Em outro aspecto, a redução da replicação viral ou expressão viral pode ser medida mais de uma vez, por exemplo, a cada dia, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias, a cada 7 dias, a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, uma vez por mês, duas vezes por mês, ou três vezes por mês. Em certos aspectos, de acordo com a presente descrição, uma diminuição da replicação viral ou expressão viral pode ser medida e comparada com um controle não tratado de organismo hospedeiro, parasita ou colônia.
[00129] Em um aspecto, a presente descrição proporciona métodos e composições para reduzir a susceptibilidade de abelhas à infecção viral. Em outros aspectos, a presente descrição fornece métodos e composições para prevenir a infestação viral das colônias de abelhas. Num outro aspecto, a presente descrição fornece métodos para reduzir a infecção viral das abelhas transmitida pelo ácaro Varroa destructor.
[00130] Os Exemplos a seguir são apresentados somente para fins de ilustração e não devem ser interpretados como limitações.
EXEMPLO 1
[00131] Para testar o efeito dos vírus de abelhas direcionados a dsRNA, em Varroa, os ácaros foram colocados em placas de dieta suplementadas com uma mistura de dsRNA desencadeadores. Um dsRNA não específico não tendo identidade de sequência acima de 19 pb para genes Varroa foi utilizado como um controle não específico (SCRAM; SEQ ID NO: 24). Os ácaros Varroa foram coletados, e extraiu- se RNA e expressão de DWV ou IAPV analisada usando PCR de transcrição reversa quantitativa (Q-PCR).
Processo experimental:
[00132] Em primeiro lugar, uma dieta artificial foi preparada como se segue na Tabela 1: Tabela 1: Componentes de dieta artificial
Figure img0001
[00133] Numa experiência, a mistura de dsRNA desencadeador continha uma mistura das SEQ ID NOs: 1-10 das seguintes sequências de dsRNA: Tabela 2: Sequências de dsRNA desencadeadores utilizados em ensaios de alimentação direta de Varroa
Figure img0002
Figure img0003
[00134] Após placas arrefecerem, 15 ácaros Varroa foram colocados em cada placa. Em seguida, as placas foram vedadas com papel de absorbância, parafilme e incubadas durante 72 h numa incubadora a 290C. Após 72 horas em ágar LB contendo tratamento, ácaros mortos/vivos foram contados. Como mostrado na Figura 2A, a mistura desencadeadora de vírus de abelha não foi observada tendo um efeito sobre a mortalidade do ácaro Varroa.
[00135] Ambos Varroa vivos e mortos foram coletados para extração de RNA e níveis de vírus de abelha e replicação foram analisados por Q-PCR ou QuantiGene® Plex 2,0 (plataforma de ensaio de RNA da Affymetrix). A Figura 2B mostra diminuição dos níveis de DWV em Varroa 72h após o tratamento com a mistura desencadeadora de vírus de abelha em comparação com o controle, tal como analisado por Q- PCR.
EXEMPLO 2
[00136] Para testar o efeito de vírus de abelhas direcionado a dsRNA na carga viral (IAPV ou DWV) em abelhas e ácaros Varroa em um ambiente minicolmeia, as abelhas são colocadas numa dieta suplementada com um ou mais dsRNA desencadeadores (por exemplo, SEQ ID NOS: 1-10 e 21) direcionados a genes do vírus de abelha. Um dsRNA não específico não tendo identidade de sequência acima de 19 pb para genes Varroa é utilizado como um controle não específico (SCRAM, por exemplo, SEQ ID NOs: 22, 23, ou 24). O controle em branco não contém dsRNA.
[00137] Colmeias de abelhas com alta carga viral e carga de Varroa são identificadas. Minicolmeias são então montadas com 400-600 abelhas (2 xícaras) das colmeias de alta carga viral e alto ácaro Varroa, quadros de fundação, e célula rainha em rainha com algumas abelhas acompanhantes. A célula da rainha é vedada com doce. Ao preencher as colmeias, amostras de tempo zero de abelhas e Varroa são coletadas (1 copo de abelhas de cada colmeia). As amostras são congeladas (70° C), os ácaros Varroa são coletados de copos congelados e amostras de abelhas e Varroa são preparadas por análise Q-PCR ou QuantiGene®. As cargas virais nas abelhas e ácaros Varroa são determinadas no ponto de tempo inicial.
[00138] As minicolmeias são alimentadas com solução de sacarose 66% e bolos de proteína e colocadas em uma casa sob cobertura escura durante 24 horas para melhorar a habitação da rainha. Seguindo habitação de rainha, a cobertura escura é removida e as abelhas são alimentadas com uma solução de açúcar que contém uma mistura de dsRNA direcionado a vários vírus de abelha (concentração de 1 μg/abelha a 10 μg/abelha).
[00139] Amostras de abelhas são coletadas, 10 abelhas de cada colmeia a cada 4-5 dias. As abelhas recolhidas são analisadas por QG (QuantiGene® Plex 2.0, plataforma de ensaio de RNA da Affymetrix) para determinar a carga viral. A carga viral é diminuída em abelhas alimentadas com dsRNA direcionado a vírus de abelhas em comparação com as abelhas alimentadas com uma dieta suplementada com não específico dsRNA.
[00140] Varroa são coletados de cada colmeia a cada 4-5 dias por trepidação de açúcar: um copo de abelhas de cada minicolmeia e duas colheres de açúcar em pó são colocados em um recipiente com um vedador puncionado. O copo é agitado e virado de cima para baixo - os ácaros Varroa caem através dos orifícios no vedador e abelhas ficam no copo. As abelhas são retornadas na minicolmeia e Varroa são analisados por QG (QuantiGene® Plex 2.0, plataforma de ensaio de RNA da Affymetrix) para determinar a carga viral. A carga viral é diminuída em Varroa coletados a partir de abelhas alimentadas com dsRNA direcionado a vírus de abelha comparado com Varroa coletado de abelhas alimentadas com uma dieta suplementada com não específico dsRNA.
[00141] Quantigene®, uma análise de detecção de ácido quantitativa, não baseada em amplificação de ácidos nucleicos, é executada no lisado total proveniente das abelhas congeladas ou amostras de ácaros Varroa para medir a expressão viral e replicação viral. As sondas de oligonucleotídeos utilizadas para o ensaio QuantiGene® Plex 2.0 são projetadas e fornecidas pela Affymetrix, usando a fita senso de sequências de vírus de abelha como modelo ou fita negativa para replicar vírus. Sondas de genes housekeeping são projetadas a partir de sequências de actina de Apis mellifera, subunidade 5 da proteína ribossomal (RPS5) e proteína ribossomal 49 (RP49). O ensaio QuantiGene® é realizado de acordo com as instruções do fabricante (Affymetrix, Inc., Manual do Usuário, 2010) com a adição de um passo de desnaturação por calor antes da hibridação da amostra com as sondas de oligonucleotídeos. As amostras num volume de 20 μL são misturadas com 5 μl do conjunto de sonda fornecido situado no poço de uma microplaca de PCR seguido por aquecimento durante 5 minutos a 95 ° C utilizando um termociclador. As amostras tratadas termicamente são mantidas a 46 ° C até à sua utilização. As amostras de 25 μl são transferidas para uma placa de hibridação Affymetrix para a hibridação durante a noite. Antes de remover a placa do termociclador, 75 μl de tampão de hibridação contendo os restantes componentes são adicionados a cada poço de amostra. A microplaca de PCR é então removida do termociclador e o conteúdo de cada poço (~ 100 μL) é transferido para o poço correspondente de uma placa de hibridação (Affymetrix) para a hibridação durante a noite. Após a amplificação do sinal, a intensidade de fluorescência média (IFM) de cada amostra é captada em uma máquina Luminex 200 (Luminex Corporation).
EXEMPLO 3:
[00142] Para testar o efeito de dsRNA direcionado a DWV ou IAPV em abelhas e ácaros Varroa, as abelhas foram colocadas com uma dieta suplementada com uma mistura de dsRNA desencadeadores selecionados a partir de SEQ ID NOs: 5-9 direcionadas a DWV, e SEQ ID NOs: 1-4 e 10 de direcionamento a IAPV. Um dsRNA não específico não tendo identidade de sequência acima de 19 pb para genes Varroa foi utilizado como um controle não específico (SCRAM; SEQ ID NO: 22 ou 23).
[00143] Colmeias de abelhas com alta carga viral e carga de Varroa são identificadas. A Figura 3 mostra uma amostra de quantificação de carga de Varroa e nível de DWV. Minicolmeias são então montadas com 400-600 abelhas (2 xícaras) das colmeias de alta carga viral e alto ácaro Varroa, quadros de fundação, e célula rainha em rainha com algumas abelhas acompanhantes. A célula da rainha foi vedada com doce.
[00144] As minicolmeias foram alimentadas com solução de sacarose 66% e bolos de proteína e colocadas em uma casa sob cobertura escura durante 24 horas para melhorar a habitação da rainha. Após 2 dias de aclimatização, as abelhas foram alimentadas com uma solução de açúcar única (CON), uma solução de açúcar contendo controle não específico de dsRNA (SCR), ou uma solução de açúcar que contém uma mistura de dsRNA de direcionamento a vários vírus de abelha (SEQ ID NOs: 1 -10; MIX) na concentração de 1 μg/abelha a 10 μg/abelha.
[00145] 10 abelhas de cada colmeia foram coletadas a cada 4-5 dias após colmeias terem sido infectadas. As abelhas recolhidas foram analisadas por QuantiGene® tal como descrito no Exemplo 2 para determinar a replicação viral como intensidade de fluorescência média (IFM).
[00146] A Figura 4 mostra que a replicação de DWV foi diminuída em todas as abelhas alimentados com uma mistura de dsRNA de direcionamento a vírus (MIX) em comparação com as abelhas alimentadas com uma solução de açúcar única (CON) ou uma dieta suplementada com dsRNA não específico (SCR). A replicação do vírus foi medida utilizando DWV QuantiGene® Análise 4, 8, e 14 dias após o tratamento em abelhas. Os resultados mostram que a partir do dia 8, a replicação de DWV aumentou nos dois controles (Con e SCR), mas não em abelhas tratadas com a mistura de dsRNA direcionado a vírus (MIX), indicando que a mistura de dsRNA de direcionamento a vírus foi eficaz na supressão viral replicação.
EXEMPLO 4
[00147] Este é outro exemplo da experiência de alimentação direta de Varroa, tal como descrito no Exemplo 1. Para testar o efeito dos vírus de abelhas direcionados a dsRNA, em Varroa, os ácaros foram colocados em placas de dieta suplementadas com uma mistura de dsRNA desencadeadores. Um dsRNA não específico não tendo identidade de sequência acima de 19 pb para genes Varroa foi utilizado como um controle não específico (SEQ ID NO: 22 ou 23). O controle em branco não continha dsRNA. Os ácaros Varroa foram coletados, e extraiu-se RNA e expressão de DWV ou IAPV analisada usando análise QuantiGene®Plex 2.0. (plataforma de ensaio de RNA da Affymetrix).
Processo Experimental:
[00148] Em primeiro lugar, uma dieta artificial foi preparada como se segue na Tabela 3: Tabela 3: Componentes de dieta artificial
Figure img0004
[00149] A mistura de dsRNA desencadeador continha uma mistura das SEQ ID NOs: 2-6 e 8-10 (125 μg/ml de cada).
[00150] Após placas arrefecerem, 15 ácaros Varroa foram colocados em cada placa. Em seguida, as placas foram vedadas com papel de absorbância, parafilme e incubadas durante 72 h numa incubadora a 290C. Varroa vivos foram coletados para extração de RNA e níveis de vírus de abelha e replicação foram analisados com QuantiGene® Plex 2,0 (plataforma de ensaio de RNA de Affymetrix).
[00151] A Figura 5A mostra a diminuição dos níveis de DWV em Varroa 72h após o tratamento com a mistura desencadeadora de vírus de abelha em comparação tanto com o controle em branco e o dsRNA não específico. Da mesma forma, A Figura 5B mostra a diminuição dos níveis de IAPV em Varroa 72h após o tratamento com a mistura desencadeadora de vírus de abelha em comparação tanto com o controle em branco e o dsRNA não específico.
EXEMPLO 5
[00152] Para testar o efeito de dsRNA direcionado a vírus de abelha sobre a carga viral de DWV e replicação em abelhas em um ambiente de caixa de abelha (condições de laboratório), as abelhas foram trazidas de colmeias comerciais no campo e colocadas em caixas de abelhas alimentadas com 66% de xarope de açúcar suplementado com dsRNA desencadeadores individuais selecionados a partir de SEQ ID NOs: 5, 6, 8, e 9 direcionados para DMV (T1 = SEQ ID NO: 5, T2 = SEQ ID NO: 6, T3 = SEQ ID NO: 8, e T4 = SEQ ID NO: 9) ou uma mistura destes dsRNA desencadeadores. Um dsRNA não específico (SEQ ID NO: 22 ou 23) que não tem identidade de sequência acima de 19 bp de genes abelha foi utilizado como um controle não específico. O controle em branco não continha dsRNA.
[00153] Colmeias de abelhas com alta carga viral foram identificadas. Caixas de abelhas foram então montadas com 5 abelhas da carga viral alta identificada. Ao preencher as caixas, amostras de tempo zero de abelhas foram coletadas. As amostras foram congeladas (-70 ° C). As cargas virais nas abelhas foram determinadas no ponto de tempo inicial.
[00154] As caixas de abelhas foram alimentadas com uma solução de sacarose a 66%. Após 2 dias de aclimatização, as abelhas foram alimentadas com uma solução de açúcar contendo a mistura de dsRNAs, ou um único, direcionados a DMV (concentração de 1 μg/abelha a 10 μg/abelha), que contém o controle não específico de dsRNA, ou não contém dsRNA. Após mais 3 dias, as abelhas foram alimentadas de novo com as mesmas soluções de açúcar.
[00155] 24 abelhas de cada grupo de tratamento foram coletadas após 4 e 10 dias a partir do segundo tratamento. As abelhas recolhidas foram analisadas por QuantiGene® Plex 2.0 para determinar a carga viral e replicação viral.
[00156] A Figura 6A mostra que tanto a mistura de dsRNA desencadeadores e os desencadeadores individuais foram eficazes na supressão de carga de DWV em abelhas em comparação com os dois controles, com T1 e T4 mostrando o maior efeito. A Figura 6B mostra efeitos similares sobre a replicação de DWV em abelhas, também com T1 e T4 mostrando maior efeito.
EXEMPLO 6
[00157] Para testar o efeito de dsRNA direcionado a vírus de abelha sobre a carga viral de IAPV e replicação em abelhas em um ambiente de caixa de abelha (condições de laboratório), as abelhas foram trazidas de colmeias comerciais no campo e colocadas em caixas de abelhas alimentadas com 66% de xarope de açúcar suplementado com dsRNA desencadeadores individuais selecionados a partir de SEQ ID NOs: 2-4 e 10 direcionados a IAPV (T5=SEQ ID NO:2, T6=SEQ ID NO:3, T7=SEQ ID NO:4 e T8=SEQ ID NO:10) ou uma mistura destes dsRNA desencadeadores. Um dsRNA não específico (SEQ ID NO: 22 ou 23) que tem nenhuma identidade de sequência acima de 19 bp de genes abelha foi utilizado como um controle não específico. O controle em branco não continha dsRNA.
[00158] Colmeias de abelhas com alta carga viral foram identificadas. Caixas de abelhas foram então montadas com 5 abelhas da carga viral alta identificada. Ao preencher as caixas, amostras de tempo zero de abelhas foram coletadas. As amostras foram congeladas (-70 ° C). As cargas virais nas abelhas foram determinadas no ponto de tempo inicial.
[00159] As caixas de abelhas foram alimentadas com uma solução de sacarose a 66%. Após 2 dias de aclimatização, as abelhas foram alimentadas com uma solução de açúcar contendo a mistura de dsRNAs, ou um único, direcionados a DMV (concentração de 1 μg/abelha a 10 μg/abelha), que contém o controle não específico de dsRNA, ou não contém dsRNA. Após mais 3 dias, as abelhas foram alimentadas de novo com as mesmas soluções de açúcar.
[00160] 24 abelhas de cada grupo de tratamento foram coletadas após 4 e 10 dias a partir do segundo tratamento. As abelhas recolhidas foram analisadas por QuantiGene® Plex 2.0 para determinar a carga viral e replicação viral.
[00161] A Figura 7A mostra que T5 e T6 foram eficazes na supressão de carga de IAPV em comparação com os controles. A Figura 7B mostra que, com a exceção da mistura e T8, a replicação viral foi suprimida em todas as abelhas alimentadas com dsRNA direcionado a sequências de IAPV em comparação com as abelhas alimentadas com uma dieta suplementada com dsRNA não específico.
EXEMPLO 7
[00162] Para testar o efeito de dsRNA direcionado a vírus de abelha sobre a carga viral de LSV e replicação em abelhas em um ambiente de caixa de abelha (condições de laboratório), as abelhas foram trazidas de colméias comerciais no campo e colocadas em caixas de abelhas alimentadas com 66% de xarope de açúcar suplementado com uma mistura de cinco dsRNA desencadeadores selecionados a partir de SEQ ID NOs: 11-20. Duas misturas de dsRNA desencadeadores foram testadas. Mistura A continha SEQ ID NOs: 11, 13, 14, 17, e 18 e mistura B continha SEQ ID NOs: 12, 15, 16, 19, e 20, possuindo as seguintes sequências de dsRNA: Tabela 4: sequências de dsRNA desencadeadores direcionadas a LSV
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[00163] Um dsRNA não específico (SEQ ID NO: 22 ou 23) que tem nenhuma identidade de sequência acima de 19 bp de genes abelha foi utilizado como um controle. O controle em branco não continha dsRNA.
[00164] Colmeias de abelhas com alta carga viral foram identificadas. Caixas de abelhas foram então montadas com 5 abelhas da carga viral alta identificada. Ao preencher as caixas, amostras de tempo zero de abelhas foram coletadas. As amostras foram congeladas (-70 ° C). As cargas virais nas abelhas foram determinadas no ponto de tempo inicial.
[00165] As caixas de abelhas foram alimentadas com uma solução de sacarose a 66%. Após 2 dias de aclimatização, as abelhas foram alimentadas com uma solução de açúcar contendo a mistura de dsRNAs, ou um único, direcionados a DMV (concentração de 1 μg/abelha a 10 μg/abelha), que contém o controle não específico de dsRNA, ou não contém dsRNA. Após mais 3 dias, as abelhas foram alimentadas de novo com as mesmas soluções de açúcar.
[00166] 24 abelhas de cada grupo de tratamento foram coletadas após 4 e 10 dias a partir do segundo tratamento. As abelhas recolhidas foram analisadas por QuantiGene® Plex 2.0 para determinar a carga viral.
[00167] A Figura 8 mostra que tanto a mistura A e Mistura B foram eficazes na supressão de carga de LSV em comparação com os controles, com uma mistura B mostrando maior efeito. Carga de LSV foi diminuída em colmeias de abelhas alimentadas com uma dieta suplementada com dsRNA direcionado a sequências de LSV em comparação com colmeias alimentadas com uma dieta suplementada com dsRNA não específico.

Claims (9)

1. Uso de pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que regula negativamente a expressão de um gene de vírus de abelha em um ácaro Varroa destructor, caracterizado pelo fato de que é para preparar de uma composição para redução de carga viral ou supressão replicação viral no ácaro Varroa destructor; e em que pelo menos um polinucleotídeo compreende uma sequência de ácido nucleico que é idêntica a ou um complemento completo de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-21.
2. Uso de pelo menos um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que é idêntica ou completamente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-21, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma composição para reduzir a susceptibilidade de uma abelha a uma doença causada por um vírus de abelha, em que a composição é fornecida à abelha.
3. Uso de pelo menos um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que é idêntica ou completamente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-21, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma composição para reduzir a carga viral ou a supressão da replicação viral em uma colônia de abelhas, em que a composição é fornecida a um parasita da colônia de abelhas.
4. Uso de pelo menos um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que é idêntica ou um completamente complementar a uma sequência de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-21, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma composição para aumentar a tolerância de uma abelha ou uma colônia de abelhas a uma doença causada por um vírus de abelha, em que a composição é fornecida a um ácaro Varroa.
5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo compreende uma mistura de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 polinucleotídeos de diferentes.
6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os diferentes polinucleotídeos são direcionados contra diferentes vírus, ou são direcionados a diferentes genes do mesmo vírus, ou são direcionados a diferentes fragmentos de um gene viral.
7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo ser DNA de fita simples (ssDNA), RNA de fita simples (ssrNA), RNA de fita dupla (dsRNA), DNA de fita dupla (dsDNA ), ou híbridos de DNA-RNA de fita dupla.
8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o vírus é selecionado a partir do grupo que consiste em Vírus da Paralisia Aguda em Abelhas (ABPV), Vírus da Asa Deformada (DWV), Vírus Caxemira (KBV), Vírus da Realeira Negra (BQCV), Vírus da Cria Ensacada (SBV), Vírus da Paralisia Crônica da Abelha (CPV), Vírus Clowdy Wing (CWV), Vírus Israelense da Paralisia Aguda (IAPV), Vírus Iridescente de Invertebrado Tipo 6 (ITV-6), Vírus Varroa destructor-1 (VDV-1), Vírus Kakugo (KV) e Vírus Lake Sinai (LSV).
9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o fornecimento é efetuado por pulverização do ácaro Varroa ou do parasita com a composição compreendendo o polinucleotídeo ou pela alimentação direta do ácaro Varroa ou do parasita com a composição compreendendo os polinucleotídeos.
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