WO2015098099A1 - 抗ｔｒｏｐ２抗体－薬物コンジュゲート - Google Patents

抗ｔｒｏｐ２抗体－薬物コンジュゲート Download PDF

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    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to an antibody-drug conjugate useful as an antitumor drug, in which an anti-TROP2 antibody and an antitumor drug are bound via a linker structure moiety.
  • An antibody-drug conjugate in which a cytotoxic drug is bound to an antibody that binds to an antigen that is expressed on the surface of a cancer cell and can be internalized in the cell is selectively applied to a cancer cell. By being able to deliver a drug, it can be expected to accumulate the drug in cancer cells and kill the cancer cells (see Non-Patent Documents 1 to 3).
  • ADC for example, Mylotarg (registered trademark; gemtuzumab ozogamicin) in which calicheamicin is bound to an anti-CD33 antibody is approved as a therapeutic agent for acute myeloid leukemia.
  • Adcetris registered trademark; brentuximab bedotin
  • auristatin E is bound to an anti-CD30 antibody
  • Drugs contained in previously approved ADCs target DNA or tubulin.
  • a camptothecin derivative that is a compound that inhibits topoisomerase I and exhibits an antitumor action is known as an antitumor low molecular weight compound.
  • SN-38 which is a medicinal substance of irinotecan, and topoisomerase I inhibitory activity are stronger than topotecan also used in clinical practice, and it has stronger cytotoxic activity against various cancer cells in vitro. Yes. In particular, it was effective against cancer cells that were resistant to SN-38 and the like due to the expression of P-glycoprotein.
  • a mouse human tumor subcutaneous transplantation model shows a strong antitumor effect, and clinical trials have not been performed yet (see Non-Patent Documents 5 to 10). It was not clear whether exatecan effectively acts as an ADC.
  • DE-310 is a complex in which exatecan is bound to a biodegradable carboxymethyldextran polyalcohol polymer via a GGFG peptide spacer (Patent Document 3).
  • exatecan By making exatecan into a polymeric prodrug, it retains high blood retention and passively increases the directivity to the tumor site by using increased permeability of tumor neovascularization and tumor tissue retention It is a thing.
  • exatecan which is the active body, and exatecan in which glycine is bonded to the amino group are continuously released, and as a result, pharmacokinetics are improved.
  • DE-310 is more effective than the single agent administration, despite the fact that the total amount of exatecan contained therein is reduced compared to the administration of exatecan alone. It showed higher effectiveness.
  • clinical trials have been conducted and effective cases have been confirmed, and it has been confirmed that the active substance accumulates in the tumor rather than the normal tissue, while DE-310 and active substance in tumors in humans have been reported There is a report that the accumulation of is not much different from the accumulation in normal tissues, and passive targeting was not seen in humans (see Non-Patent Documents 11 to 14). As a result, DE-310 also did not enter the market, and it was not clear whether Exatecan effectively functions as a drug aimed at such targeting.
  • TROP2 tumor-associated calcium signal transducer 2, GA733-1, EGP-1, M1S1; hereinafter referred to as hTROP2
  • hTROP2 tumor-associated calcium signal transducer 2, GA733-1, EGP-1, M1S1; hereinafter referred to as hTROP2
  • TACSTD2 tumor-associated calcium signal transducer 2, GA733-1, EGP-1, M1S1; hereinafter referred to as hTROP2
  • hTROP2 tumor-associated calcium signal transducer 2
  • Non-patent Document 17 tumor antigen GA733-1
  • Non-patent Document 18 epithelial glycoprotein
  • RS7-3G11 mouse monoclonal antibody
  • the hTROP2 gene constitutes the TACSTD gene family together with human Trop-1 (EpCAM, EGP-2, TACSTD1) having about 50% homology (Non-patent Document 21).
  • the hTROP2 protein is composed of a signal sequence composed of N-terminal 26 amino acid residues, an extracellular domain composed of 248 amino acid residues, a transmembrane domain composed of 23 amino acid residues, and an intracellular domain composed of 26 amino acid residues. There are four N-linked glycosylation sites in the extracellular domain, and the apparent molecular weight is known to increase around 10 kilodaltons from the theoretically calculated value of 35 kilodaltons (Non-patent Document 19).
  • Non-patent Document 20 Protein kinase C phosphorylates intracellular serine 303 residue (Non-patent Document 18) and has a PIP 2 binding sequence in the intracellular domain, suggesting a signal transduction function in tumor cells. (Non-patent document 22).
  • hTROP2 is overexpressed in various epithelial cell carcinoma types, and in normal tissues, it is limited to expression in epithelial cells of some tissues, and its expression level Has also been shown to be low compared to tumor tissue (Non-Patent Documents 23 to 27). Moreover, hTrop2 expression is poor in prognosis in colorectal cancer (Non-patent document 23), stomach cancer (Non-patent document 24), pancreatic cancer (Non-patent document 25), oral cancer (Non-patent document 26), and glioma (Non-patent document 27). It has also been reported to correlate with Furthermore, from a model using colon cancer cells, it has been reported that the expression of hTROP2 is involved in anchorage-independent cell proliferation of tumor cells and tumor formation in immunodeficient mice (Non-patent Document 28).
  • an object of the present invention is to obtain and provide an antitumor drug having an excellent therapeutic effect and excellent antitumor effect and safety.
  • anti-TROP2 antibody is an antibody capable of targeting tumor cells, that is, a property capable of recognizing tumor cells, a property capable of binding to tumor cells, a property capable of being internalized in tumor cells, and the like. Since it is an antibody, cytotoxicity using the antibody can be obtained by converting exatecan, which is an antitumor compound, to an antibody-drug conjugate conjugated to the antibody via a linker structure moiety, Furthermore, the antitumor compound can be surely moved by the tumor cells, and the antitumor effect of the compound can be exhibited specifically in the tumor cells. Therefore, the dose of the antitumor compound can be increased while the antitumor effect is reliably exhibited.
  • the present inventors have created a linker having a specific structure and succeeded in obtaining an antibody-drug conjugate in which an anti-TROP2 antibody and exatecan are bound via this linker.
  • the present invention was completed by finding that the antitumor effect was exhibited.
  • the present invention relates to an antibody-drug conjugate characterized in that it is bound by a thioether bond formed in a disulfide bond part present in the hinge part of an anti-TROP2 antibody via a linker having a structure represented by
  • the anti-TROP2 antibody binds at the end of L 1 , and the antitumor compound has a — (CH 2 ) n 2 —C ( ⁇ O) — moiety with the nitrogen atom of the amino group at position 1 as the binding site. Binds to the carbonyl group.
  • n 1 represents an integer of 0 to 6
  • n 2 represents an integer of 0 to 5
  • n 3 represents an integer of 2 to 8
  • L 2 represents —NH— (CH 2 CH 2 —O) n 4 —CH 2 CH 2 —C ( ⁇ O) — or a single bond
  • n 4 represents an integer of 1 to 6
  • L P represents a peptide residue composed of 2 to 7 amino acids
  • L a represents -O- or a single bond
  • -(Succinimid-3-yl-N)- is the following formula: It binds to the anti-TROP2 antibody at the 3-position of this, and binds to the methylene group in the linker structure containing it on the nitrogen atom at the 1-position.
  • peptide residue between L P is, phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid, the antibody according to a peptide residue consisting of amino acid selected from aspartic acid [1] - drug conjugates.
  • [3] The antibody-drug conjugate according to [1] or [2], wherein L P is a peptide residue selected from the following group: -GGF-, -DGGF-, -(D-) D-GGF-, -EGGF-, -GGFG-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG-, -DDGGFG-, -KDGGFG-, and -GGFGGGF-;
  • “(D-) D” represents D-aspartic acid.
  • L P is a peptide residue composed of 4 amino acids.
  • [5] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [4], wherein L P is a tetrapeptide residue -GGFG-.
  • n 3 is an integer of 2 to 5
  • L 2 is a single bond.
  • n 3 is an integer of 2 to 5
  • L 2 is —NH— (CH 2 CH 2 —O) n 4 —CH 2 CH 2 —C ( ⁇ O) —
  • n 4 is 2
  • the antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [9], which is —NH—CH 2 CH 2 —O—CH 2 —C ( ⁇ O) —.
  • the antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [9].
  • a drug-linker structure portion in which a drug is bound to -L 1 -L 2 -L P -NH- (CH 2 ) n 1 -L a- (CH 2 ) n 2 -C ( O)-
  • a drug-linker structure portion in which a drug is bound to -L 1 -L 2 -L P -NH- (CH 2 ) n 1 -L a- (CH 2 ) n 2 -C ( O)-
  • An antibody-drug conjugate which is bonded via a thioether bond formed in a disulfide bond moiety present in the hinge part of an anti-TROP2 antibody via a linker having a structure represented by
  • the anti-TROP2 antibody binds at the end of L 1 and the antitumor compound binds to the carbonyl group of the — (CH 2 ) n 2 —C ( ⁇ O) — moiety.
  • n 1 represents an integer of 0 to 6
  • n 2 represents an integer of 0 to 5
  • n 3 represents an integer of 2 to 8
  • L 2 represents —NH— (CH 2 CH 2 —O) n 4 —CH 2 CH 2 —C ( ⁇ O) — or a single bond
  • n 4 represents an integer of 1 to 6
  • L P represents a tetrapeptide residue of -GGFG- L a represents -O- or a single bond
  • -(Succinimid-3-yl-N)- is the following formula: It binds to the anti-TROP2 antibody at the 3-position of this, and binds to the methylene group in the linker structure containing it on the nitrogen atom at the 1-position.
  • n 1 is 3, n 2 is 0, n 3 is 2, and L 2 is —NH— (CH 2 CH 2 —O) n 4 —CH 2 CH 2 —C ( ⁇ O )-, Where n 4 is 2 and La is a single bond, n 1 is 1, n 2 is is 1, n 3 is 5, L 2 is a single bond, or L a is -O-, and or n 1 is 2, n 2 is is 1, n 3 is 5, L 2 is a single bond, an antibody according to L a is -O- [14] - drug conjugates. [16] The antibody-drug conjugate according to [14] or [15], wherein n 3 is 2 or 5, and L 2 is a single bond.
  • n 3 is 2 or 5
  • L 2 is —NH— (CH 2 CH 2 —O) n 4 —CH 2 CH 2 —C ( ⁇ O) —
  • n 4 is 2 or 4
  • a drug-linker structure portion in which a drug is bound to -L 1 -L 2 -L P -NH- (CH 2 ) n 1 -L a- (CH 2 ) n 2 -C ( O)-
  • a drug-linker structure portion in which a drug is bonded to -L 1 -L 2 -L P -NH- (CH 2 ) n 1 -L a- (CH 2 ) n 2 -C ( O)-
  • a medicament comprising the antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [23], a salt thereof, or a hydrate thereof.
  • An antitumor drug and / or an anticancer drug comprising the antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [23], a salt thereof, or a hydrate thereof.
  • [27] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [23], a salt thereof, or a hydrate thereof as an active ingredient, and a pharmaceutically acceptable formulation component Pharmaceutical composition.
  • [28] Lung cancer, renal cancer, urothelial cancer, colon cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, stomach cancer, cervical cancer, head and neck cancer, Or the pharmaceutical composition as described in [27] for applying to esophageal cancer.
  • a method for treating a tumor and / or cancer comprising administering the antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [23], a salt thereof, or a hydrate thereof.
  • An antibody-drug wherein a drug-linker moiety is bound to the antibody by a method of reacting with an anti-TROP2 antibody or a reactive derivative thereof to form a thioether bond at a disulfide bond moiety present in the hinge part of the antibody A method for producing a conjugate.
  • n 3 represents an integer of 2 to 8
  • L 2 represents —NH— (CH 2 CH 2 —O) n 4 —CH 2 CH 2 —C ( ⁇ O) — or a single bond
  • n 4 represents an integer of 1 to 6
  • L P represents a peptide residue composed of 2 to 7 amino acids selected from phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid, aspartic acid
  • n 1 represents an integer of 0 to 6
  • n 2 represents an integer of 0 to 5
  • L a represents -O- or a single bond
  • (maleimid-N-yl)- is the following formula And a group having a nitrogen atom as a binding site.
  • -(NH-DX) is And a group in which the nitrogen atom of the amino group at the 1-position is a binding site.
  • an excellent antitumor effect and safety can be achieved by the anti-TROP2 antibody-drug conjugate in which the antitumor compound exatecan is bound via a linker having a specific structure.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 7) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) of the cTINA1 antibody heavy chain are shown.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 9) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) of the cTINA1 antibody light chain are shown.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 11) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) of the hTINA1-H1 heavy chain are shown.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 13) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) of the hTINA1-H2 heavy chain are shown.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 15) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 16) of the hTINA1-H3 heavy chain are shown.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 17) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) of the hTINA1-L1 light chain are shown.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 19) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 20) of the hTINA1-L2 light chain are shown.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 21) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 22) of the hTINA1-L3 light chain are shown.
  • CDRA1 amino acid sequence (SEQ ID NO: 23), CDRH2 amino acid sequence (SEQ ID NO: 24), CDRH3 amino acid sequence (SEQ ID NO: 25), CDRL1 amino acid sequence (SEQ ID NO: 26), CDRL2 amino acid sequence (SEQ ID NO: 23) 27) and the amino acid sequence of CDRL3 (SEQ ID NO: 28).
  • the antibody-drug conjugate (1), (6), or (12) shows the antitumor effect shown against the human colon cancer cell line COLO205 subcutaneously transplanted BALB / c-nu / nu mice.
  • the antibody-drug conjugate (1), (6), or (12) shows the antitumor effect shown against the human pancreatic adenocarcinoma cell line BxPC-3 subcutaneously transplanted BALB / c-nu / nu mice.
  • the antibody-drug conjugate (1), (6), or (12) shows the antitumor effect shown against the human pancreatic adenocarcinoma cell line Capan-1 subcutaneously transplanted BALB / c-nu / nu mice.
  • the antibody-drug conjugate (2), (5), (7), or (10) shows the antitumor effect shown against the human colon cancer cell line COLO205 subcutaneously transplanted BALB / c-nu / nu mice.
  • Antibody-drug conjugate (2), (5), (7), or (10) shows the antitumor effect shown against human pancreatic cancer cell line BxPC-3 subcutaneously transplanted BALB / c-nu / nu mice .
  • the antibody-drug conjugate (3), (4), (8), or (9) shows the antitumor effect exhibited against the human colon cancer cell line COLO205 subcutaneously transplanted BALB / c-nu / nu mice.
  • Antibody-drug conjugate (3), (4), (8), or (9) shows the antitumor effect shown against human pancreatic cancer cell line BxPC-3 subcutaneously transplanted BALB / c-nu / nu mice .
  • Antibody-drug conjugate (3), (4), (8), or (9) shows the antitumor effect shown against human gastric cancer cell line NCI-N87 subcutaneously transplanted BALB / c-nu / nu mice.
  • Antibody-drug conjugate (3), (4), (8), or (9) shows the anti-tumor effect shown against human lung cancer cell line NCI-H292 subcutaneously transplanted BALB / c-nu / nu mice.
  • Antibody-drug conjugate (3), (4), (8), or (9) shows the anti-tumor effect shown against human pharyngeal cancer cell line FaDu subcutaneously transplanted BALB / c-nu / nu mice.
  • the antibody-drug conjugate (3), (4), (8), or (9) exhibits an antitumor effect on human pancreatic adenocarcinoma cell line CFPAC-1 subcutaneously transplanted BALB / c-nu / nu mice Show.
  • Antibody-drug conjugate (8) or (13) shows the antitumor effect shown against human pancreatic adenocarcinoma cell line CFPAC-1 subcutaneously transplanted BALB / c-nu / nu mice.
  • the antibody-drug conjugate (8) or (13) shows the antitumor effect shown against human pancreatic adenocarcinoma cell line HPAC subcutaneously transplanted BALB / c-nu / nu mice.
  • the antibody-drug conjugate (8) or (13) shows the antitumor effect shown against NOD-scid mice transplanted subcutaneously into human esophageal cancer tissue.
  • the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention is an antitumor drug obtained by binding an antitumor compound to an anti-TROP2 antibody via a linker structure moiety, and will be described in detail below.
  • the anti-TROP2 antibody used in the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention may be derived from any species, but preferably humans, rats, mice, and rabbits can be exemplified. When derived from species other than human, it is preferable to chimerize or humanize using well-known techniques.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferred.
  • the anti-TROP2 antibody is an antibody that can target tumor cells, that is, has the property of recognizing tumor cells, the property of binding to tumor cells, the property of being taken up and internalized in tumor cells, and the like. Can be linked via a linker to form an antibody-drug conjugate.
  • the binding property of the antibody to tumor cells can be confirmed using flow cytometry.
  • Methods for confirming the uptake of antibodies into tumor cells include (1) an assay that uses a secondary antibody (fluorescent label) that binds to a therapeutic antibody to visualize the antibodies taken into the cells with a fluorescence microscope (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) Assays that measure the amount of fluorescence taken into cells using secondary antibodies (fluorescent labels) that bind to therapeutic antibodies (Molecular Biology of the Cell Vol. 15 , 5268-5282, December 2004), or (3) Mab-ZAP assay (Bio Techniques 28), which uses an immunotoxin that binds to a therapeutic antibody to release the toxin and inhibit cell proliferation when taken up into the cell.
  • the immunotoxin a recombinant complex protein of the catalytic region of diphtheria toxin and protein G can also be used. Since the antibody-drug conjugate is conjugated with a compound that exhibits an antitumor effect, it is preferable but not essential that the antibody itself has an antitumor effect. For the purpose of specifically and selectively exerting the cytotoxicity of the antitumor compound in tumor cells, it is important and preferable that the antibody has a property of internalizing and transferring into the tumor cells.
  • the anti-TROP2 antibody can be obtained by immunizing an animal with a polypeptide serving as an antigen, and collecting and purifying the antibody produced in the living body, using a method commonly practiced in this field.
  • the origin of the antigen is not limited to humans, and animals can be immunized with antigens derived from animals other than humans such as mice and rats.
  • an antibody applicable to a human disease can be selected by examining the cross-reactivity between an antibody that binds to the obtained heterologous antigen and a human antigen.
  • a hybridoma can be established by fusing an antibody-producing cell that produces an antibody against an antigen and a myeloma cell to obtain a monoclonal antibody.
  • the antigen can be obtained by causing a host cell to produce a gene encoding an antigen protein by genetic manipulation.
  • a vector capable of expressing an antigen gene may be prepared, introduced into a host cell to express the gene, and the expressed antigen may be purified.
  • An antibody can also be obtained by using a method for immunizing an animal with an antigen-expressing cell or a cell line expressing the antigen by genetic manipulation as described above.
  • Anti-TROP2 antibody can be obtained by known means.
  • the anti-TROP2 antibody that can be used in the present invention is not particularly limited, but, for example, those specified by the amino acid sequences shown in the sequence listing of the present application can be preferably used.
  • the TROP2 antibody used in the present invention preferably has the following characteristics. (1) an antibody having the following characteristics; (A) specifically binds to TROP2 (b) has the activity of internalizing in TROP2 expressing cells by binding to TROP2 (2) The antibody according to (1) above, wherein TROP2 is human TROP2.
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 20 to 140 in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 21 to 129 in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 12
  • variable region of the heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 20 to 140 in SEQ ID NO: 12 and the variable region of the light chain consisting of the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 21 to 129 in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 14 A variable region of a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 20 to 140 in FIG.
  • variable region 8 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 21 to 129 of SEQ ID NO: 18;
  • the variable region of the heavy chain consisting of the amino acid sequence described in the above, the variable region of the light chain consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 21 to 129 in SEQ ID NO: 20, and the amino acid sequence described in amino acid numbers 20 to 140 of SEQ ID NO: 16 In the variable region of the heavy chain consisting of Antibody according to (7) having a heavy chain variable region and a variable region of the light chain of light chain consisting of the amino acid sequence selected from the group consisting of the variable regions as set forth in amino acid number 21 to 129 Te.
  • a heavy chain consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 20 to 470 in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 22 is a light chain comprising the amino acid sequence of amino acid numbers 21 to 234,
  • SEQ ID NO: 14 is the heavy chain comprising the amino acid sequence of amino acid numbers 20 to 470, and
  • SEQ ID NO: 18 is the amino acid sequence of amino acid numbers 21 to 234.
  • a light chain consisting of: SEQ ID NO: 14 A heavy chain consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 20 to 470, a light chain consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 21 to 234 in SEQ ID NO: 20, and an amino acid sequence described in amino acid numbers 20 to 470 in SEQ ID NO: 14
  • a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 21 to 234 in SEQ ID NO: 22 a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 20 to 470 in SEQ ID NO: 16 and amino acid number 21 in SEQ ID NO: 18
  • the above heavy chain and light chain selected from the group consisting of the heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in acid numbers 20 to 470 and the light chain consisting of the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 21 to 234 in SEQ ID NO: 22 (6 Or the antibody according to (7).
  • a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20 A light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22, a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14, and the sequence described in SEQ ID NO: 18
  • a light chain consisting of an amino acid sequence, a heavy chain consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 and a light chain consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20 a heavy chain consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 and A light chain consisting of the described amino acid sequence, a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 and a
  • (11) A heavy chain consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 20 to 470 in SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 21 to 234 in SEQ ID NO: 18, and amino acid numbers 20 to 470 in SEQ ID NO: 14
  • the anti-TROP2 antibody used in the present invention will be described below.
  • cancer and “tumor” are used interchangeably.
  • the term “gene” includes not only DNA but also mRNA, cDNA, and cRNA thereof.
  • polynucleotide is used interchangeably with nucleic acid, and includes DNA, RNA, probes, oligonucleotides, and primers.
  • polypeptide and “protein” are used without distinction.
  • the “cell” includes a cell in an animal individual and a cultured cell.
  • TROP2 is used in the same meaning as TROP2 protein.
  • CDR in this specification means a complementarity determining region (CDR). It is known that there are three CDRs in each of the heavy and light chains of an antibody molecule. CDRs, also called hypervariable domains, are sites in the variable regions of antibody heavy and light chains that have particularly high primary structure variability, and are heavy and light chain polypeptide chains. In the primary structure of each, it is separated into three locations.
  • CDRH1, CDRH2, CDRH3 from the amino terminal side of the heavy chain amino acid sequence
  • CDRL1 from the amino terminal side of the light chain amino acid sequence.
  • hybridize under stringent conditions means to hybridize at 68 ° C. in a commercially available hybridization solution ExpressHyb Hybridization Solution (manufactured by Clontech) or using a filter on which DNA is fixed. After hybridization at 68 ° C. in the presence of 0.7-1.0 M NaCl, 0.1-2 fold SSC solution (1 fold SSC consists of 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) Used, hybridization under conditions that can be identified by washing at 68 ° C. or equivalent conditions.
  • TROP2 TROP2 is one of the TACSTD family expressed in human trophoblasts and is a single-transmembrane type 1 cell membrane protein involved in immune resistance common to human trophoblast cells and cancer cells.
  • the TROP2 protein used in the present invention can be directly purified from TROP2-expressing cells of humans and non-human mammals (rats, mice, etc.) or can be used by preparing a cell membrane fraction of the cells. Alternatively, it can be obtained by synthesizing TROP2 in vitro or producing it in a host cell by genetic manipulation.
  • TROP2 cDNA is incorporated into a vector that can be expressed and then synthesized in a solution containing enzymes, substrates, and energy substances necessary for transcription and translation, or other prokaryotic or true organisms.
  • the protein can be obtained by expressing TROP2 by transforming a nuclear host cell. It is also possible to use a TROP2 expressing cell or a cell line expressing TROP2 by the above-described genetic manipulation as a TROP2 protein.
  • the DNA sequence and amino acid sequence of TROP2 are published on public databases and can be referred to by accession numbers such as NM_002353, NP_002344 (NCBI), for example.
  • TROP2 protein having a biological activity equivalent to the protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, and / or added in the amino acid sequence of TROP2 is also included in TROP2.
  • Human TROP2 protein is composed of a signal sequence consisting of N-terminal 26 amino acid residues, an extracellular domain consisting of 248 amino acid residues, a transmembrane domain consisting of 23 amino acid residues, and an intracellular domain consisting of 26 amino acid residues .
  • the antibody against TROP2 of the present invention is produced in vivo by immunizing an animal with any polypeptide selected from TROP2 or the amino acid sequence of TROP2 using a method commonly practiced in this field. Can be obtained by collecting and purifying the antibody.
  • the biological species of TROP2 serving as an antigen is not limited to humans, and it is also possible to immunize animals with TROP2 derived from animals other than humans such as mice and rats.
  • antibodies applicable to human diseases can be selected by examining the cross-reactivity between the obtained antibody binding to heterologous TROP2 and human TROP2.
  • known methods for example, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; Kennet, R.
  • Hybridomas can be established by fusing antibody-producing cells that produce antibodies against TROP2 and myeloma cells to obtain monoclonal antibodies.
  • the TROP2 serving as an antigen can be obtained by expressing the TROP2 gene in a host cell by genetic manipulation. Specifically, a vector capable of expressing the TROP2 gene may be prepared, introduced into a host cell to express the gene, and the expressed TROP2 may be purified. It is also possible to use a TROP2 expressing cell by the above-described genetic manipulation or a cell line expressing TROP2 as a TROP2 protein.
  • a method for obtaining an antibody against TROP2 will be specifically described.
  • Anti-TROP2 antibody is prepared by using TROP2 or a polypeptide comprising at least six consecutive partial amino acid sequences, or a derivative in which any amino acid sequence or carrier is added thereto.
  • TROP2 can be used by directly purifying from human tumor tissue or tumor cells, and can be obtained by synthesizing TROP2 in vitro or producing it in a host cell by genetic engineering. Specifically, in genetic manipulation, TROP2 cDNA is incorporated into a vector capable of expression and then synthesized in a solution containing enzymes, substrates and energy substances necessary for transcription and translation, or other prokaryotic or true organisms. An antigen can be obtained by transforming a nuclear host cell to express TROP2.
  • TROP2 cDNA is, for example, a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR”) using a cDNA library expressing the TROP2 cDNA as a template and a primer that specifically amplifies the TROP2 cDNA (Saiki, R. K., et al., Science (1988) 239, pp. 487-489).
  • PCR polymerase chain reaction
  • examples of in vitro synthesis of polypeptides include, but are not limited to, a rapid translation system (RTS) manufactured by Roche Diagnostics.
  • prokaryotic host examples include Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • the host cell is transformed with a plasmid vector containing a replicon or origin of replication from a species compatible with the host and regulatory sequences.
  • the vector preferably has a sequence capable of imparting phenotypic (phenotypic) selectivity to transformed cells.
  • eukaryotic host cells include vertebrates, insects, yeast, and the like. Examples of vertebrate cells include COS cells (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650; ATCC: American Type Culture Collection, mouse fibroblast NIH3T3 (ATCC No.
  • CHO cells ATCC CCL-61
  • dihydrofolate reductase Deficient strains Urlauub, G. and Chasin, LA Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, p. 4126-4220
  • the transformant obtained as described above can be cultured according to a method commonly practiced in this field, and the desired polypeptide is produced intracellularly or extracellularly by the culture.
  • the medium used for the culture can be appropriately selected from those commonly used according to the host cell employed by those skilled in the art. In the case of Escherichia coli, for example, ampicillin can be added to the LB medium as necessary.
  • Antibiotics such as these and IPMG can be added and used.
  • the recombinant protein produced inside or outside the transformant by the above culture can be separated and purified by various known separation procedures utilizing the physical and chemical properties of the protein. it can.
  • Specific examples of the method include various liquid chromatography such as treatment with an ordinary protein precipitating agent, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. , Dialysis methods, combinations thereof and the like.
  • a histidine tag consisting of 6 residues to a recombinant protein to be expressed, it can be efficiently purified with a nickel affinity column.
  • the desired polypeptide can be easily produced in large quantities with high yield and high purity. It is also possible to use the transformant itself described above as an antigen. It is also possible to use a cell line expressing TROP2 as an antigen.
  • Such cell lines include humanized lung cancer lines NCI-H322, PC14, NCIH-H2122, or LCAM1, human prostate cancer line PC3, human pancreatic cancer line BxPC-3, Capan-1, or PK-1, human ovary
  • Examples include the cancer line SKOV3 and the human colon cancer line COLO205, but are not limited to these cell lines as long as TROP2 is expressed.
  • TROP2 Purification of antigen TROP2 prepared by the method as described above or a part thereof can be used as the antigen.
  • a membrane fraction prepared by a TROP2-expressing recombinant cell, or a TROP2-expressing recombinant cell itself, and a partial peptide of the protein of the present invention chemically synthesized using methods well known to those skilled in the art are used as antigens. You can also.
  • a TROP2-expressing cell line can also be used as an antigen.
  • step (B) Preparation of antibody-producing cells
  • the antigen obtained in step (a) is mixed with Freund's complete or incomplete adjuvant, or an auxiliary agent such as potassium alum, and an experimental animal is immunized as an immunogen.
  • an experimental animal there is a method of immunizing experimental animals using antigen-expressing cells as an immunogen.
  • an animal used in a known hybridoma production method can be used without any problem. Specifically, for example, mouse, rat, goat, sheep, cow, horse and the like can be used. However, from the viewpoint of easy availability of myeloma cells to be fused with the extracted antibody-producing cells, it is preferable to use mice or rats as immunized animals.
  • mice there are no particular limitations on the mouse and rat strains actually used.
  • rats for example, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN Fischer or the like can be used.
  • mice and rats can be obtained, for example, from laboratory animal breeding and sales companies such as Nippon Clare Co., Ltd. and Japan Charles River Co., Ltd.
  • the BALB / c strain is particularly preferable for mice and the Wistar and Low strains are particularly preferable for rats, considering fusion compatibility with myeloma cells described later.
  • mice with reduced biological mechanisms for removing autoantibodies that is, autoimmune disease mice.
  • the age at the time of immunization of these mice or rats is preferably 5 to 12 weeks old, more preferably 6 to 8 weeks old.
  • a preferable method in the present invention is specifically shown as follows. That is, first, a membrane protein fraction that is an antigen or a cell in which the antigen is expressed is administered intradermally or intraperitoneally in an animal. However, in order to increase the immune efficiency, the combination of both is preferable. When the first half is intradermally administered and the second half or the last is intraperitoneally administered, the immune efficiency can be particularly enhanced.
  • the antigen administration schedule varies depending on the type of animal to be immunized, individual differences, and the like, but in general, the number of antigen administrations is preferably 3 to 6 times, and the administration interval is 2 to 6 weeks. More preferably 4 weeks.
  • the dose of the antigen varies depending on the kind of animal, individual differences, etc., but is generally 0.05 to 5 mg, preferably about 0.1 to 0.5 mg.
  • the booster immunization is performed 1 to 6 weeks after the antigen administration as described above, preferably 1 to 4 weeks, and more preferably 1 to 3 weeks. When the immunogen is a cell, 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 7 cells are used.
  • the dose of antigen for booster immunization varies depending on the type and size of the animal, but generally 0.05 to 5 mg, preferably 0.1 to 0.5 mg, more preferably, for example, in the case of mice. Is about 0.1 to 0.2 mg.
  • the immunogen is a cell
  • 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 7 cells are used.
  • Spleen cells or lymphocytes containing antibody-producing cells are aseptically removed from the immunized animal 1 to 10 days after the boost, preferably 2 to 5 days, and more preferably 2 to 3 days later. In this case, if the antibody titer is measured and an animal having a sufficiently high antibody titer is used as a source of antibody-producing cells, the efficiency of subsequent operations can be increased.
  • Examples of the antibody titer measurement method used here include, but are not limited to, the RIA method and the ELISA method.
  • the antibody titer in the present invention can be measured according to the procedure described below, for example, according to the ELISA method.
  • a purified or partially purified antigen is adsorbed on a solid phase surface such as a 96-well plate for ELISA, and the solid phase surface on which no antigen is adsorbed is covered with a protein unrelated to the antigen, such as bovine serum albumin (BSA), After washing the surface, it is contacted with a serially diluted sample (eg, mouse serum) as the first antibody, and the antibody in the sample is bound to the antigen.
  • a serially diluted sample eg, mouse serum
  • an antibody against a mouse antibody labeled with an enzyme as a second antibody is added and bound to the mouse antibody.
  • the substrate of the enzyme is added, and the change in absorbance due to color development based on the decomposition of the substrate is measured. calculate.
  • Separation of antibody-producing cells from the spleen cells or lymphocytes of the immunized animal can be performed by known methods (for example, Kohler et al., Nature (1975) 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977) 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature, (1977) 266, p. 495).
  • spleen cells a general method of separating antibody-producing cells by chopping the spleen and filtering the cells through a stainless mesh and then suspending them in the Eagle's minimum essential medium (MEM) can be employed.
  • MEM Eagle's minimum essential medium
  • myeloma Preparation of myeloma cells (hereinafter referred to as “myeloma”)
  • Myeloma cells used for cell fusion are not particularly limited and can be appropriately selected from known cell lines.
  • HGPRT Hydropoxanthine-guanine phosphoryltransferase
  • 8-azaguanine medium RPMI-1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, and fetal bovine serum (hereinafter referred to as “FBS”).
  • FBS fetal bovine serum
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the antibody-producing cells are used in a polyethylene glycol solution having a molecular weight of 1500 to 6000, preferably 2000 to 4000, at a temperature of 30 to 40 ° C., preferably 35 to 38 ° C. Mix with myeloma cells for 1-10 minutes, preferably 5-8 minutes.
  • hybridoma group The selection method of the hybridoma obtained by the above-mentioned cell fusion is not particularly limited. 495; Milstein et al., Nature (1977) 266, p. 550). This method is effective when hybridomas are obtained using myeloma cells of HGPRT-deficient strains that cannot survive with aminopterin. That is, by culturing unfused cells and hybridomas in a HAT medium, only hybridomas having resistance to aminopterin can be selectively left and grown.
  • a method for cloning a hybridoma As a method for cloning a hybridoma, a known method such as a methyl cellulose method, a soft agarose method, a limiting dilution method, or the like can be used (for example, Barbara, B. M. and Stanley, MS: Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman and Company, San Francisco (1980)). Among these methods, a three-dimensional culture method such as a methyl cellulose method is particularly preferable.
  • a hybridoma group formed by cell fusion is suspended and cultured in a methylcellulose medium such as ClonCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies # 03804), and the formed hybridoma colonies are recovered to recover the monoclonal hybridoma. Acquisition is possible.
  • a methylcellulose medium such as ClonCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies # 03804)
  • the formed hybridoma colonies are recovered to recover the monoclonal hybridoma. Acquisition is possible.
  • Each of the collected hybridoma colonies is cultured, and those in which the antibody titer is stably recognized in the obtained hybridoma culture supernatant are selected as TROP2 monoclonal antibody-producing hybridoma strains.
  • TROP2 hybridoma TINA1 can be mentioned.
  • an antibody produced by TROP2 hybridoma TINA1 is referred to as “TINA1 antibody” or simply “TINA1”.
  • the heavy chain variable region of the TINA1 antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the light chain variable region of the TINA1 antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • (G) Preparation of monoclonal antibody by culturing hybridoma
  • the hybridoma selected in this manner can be efficiently obtained by culturing the hybridoma, but the target monoclonal antibody is produced prior to culturing. It is desirable to screen for hybridomas. For this screening, a method known per se can be employed.
  • the antibody titer in the present invention can be measured by, for example, the ELISA method described in the item (b) above.
  • the hybridoma obtained by the above method can be stored in a frozen state in liquid nitrogen or in a freezer at ⁇ 80 ° C. or lower.
  • the hybridoma that has been cloned is cultured by changing the medium from the HT medium to the normal medium.
  • Mass culture is performed by rotary culture using a large culture bottle or spinner culture.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to the protein of the present invention can be obtained by purifying the supernatant in this mass culture using a method well known to those skilled in the art, such as gel filtration.
  • a large amount of the monoclonal antibody of the present invention is contained by injecting a hybridoma into the abdominal cavity of a mouse of the same strain (for example, the above-mentioned BALB / c) or Nu / Nu mouse, and proliferating the hybridoma. Ascites can be obtained.
  • a monoclonal antibody having a concentration of about 100 times or more compared with that in the culture solution can be obtained.
  • Monoclonal antibodies obtained by the above method are described in, for example, Weir, D. et al. M.M. : Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978). The monoclonal antibody thus obtained has a high antigen specificity for TROP2.
  • the isotype and subclass of the monoclonal antibody thus obtained can be determined as follows.
  • the identification method include an octerlony method, an ELISA method, and an RIA method.
  • the octerulony method is simple, but concentration is necessary when the concentration of the monoclonal antibody is low.
  • the ELISA method or the RIA method is used, the culture supernatant is reacted with the antigen-adsorbing solid phase as it is, and further, antibodies corresponding to various immunoglobulin isotypes and subclasses are used as secondary antibodies. Isotypes and subclasses can be identified.
  • a commercially available identification kit for example, mouse typer kit; manufactured by Bio-Rad
  • an antibody having cytotoxic activity equivalent to that of the TINA1 antibody can be obtained.
  • An example of such an antibody is an antibody that binds to the same epitope as the TINA1 antibody.
  • the monoclonal antibody binds to the partial peptide or partial conformation to which the TINA1 antibody binds, it can be determined that the monoclonal antibody binds to the same epitope as the TINA1 antibody. Further, by confirming that the monoclonal antibody competes for binding of TINA1 antibody to TROP2 (that is, the monoclonal antibody prevents binding of TINA1 antibody to TROP2), the sequence or structure of a specific epitope is determined. Even if not, it can be determined that the monoclonal antibody binds to the same epitope as the anti-TROP2 antibody. When it is confirmed that the epitope is the same, it is strongly expected that the monoclonal antibody has the same antigen binding ability or biological activity as the TINA1 antibody.
  • the antibodies of the present invention include genetically engineered antibodies that have been artificially modified for the purpose of reducing the heterologous antigenicity against humans, such as chimera (Chimeric ) Antibodies, humanized antibodies, human antibodies and the like. These antibodies can be produced using known methods.
  • Examples of the chimeric antibody include antibodies in which the variable region and the constant region of the antibody are different from each other, for example, a chimeric antibody in which the variable region of a mouse or rat-derived antibody is joined to a human-derived constant region (Proc. Natl. Acad). Sci.U.S.A., 81, 6851-6855, (1984)).
  • humanized antibody an antibody in which only the complementarity determining region (CDR) is incorporated into a human-derived antibody (see Nature (1986) 321; p.522-525), in addition to the CDR sequence by CDR grafting, Examples of the amino acid residues of some frameworks include antibodies grafted to human antibodies (WO 90/07861).
  • the humanized antibody derived from the TINA1 antibody is not limited to a specific humanized antibody as long as it retains all six CDR sequences of the TINA1 antibody.
  • the heavy chain variable region of the TINA1 antibody is shown in CDRH1 (TAGMQ) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 in the sequence listing, CDRH2 (WINTHSGVPKYAEDFKG) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 25.
  • CDRH3 SGFGSSYWYFDV having the amino acid sequence described above is possessed.
  • the light chain variable region of the TINA1 antibody is represented by CDRL1 (KASQDVSTAVA) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 of the sequence listing, CDRL2 (SASYRYT) consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 27, and SEQ ID NO: 28.
  • CDRL1 KASQDVSTAVA
  • CDRL2 SASYRYT
  • Examples of the humanized antibody of mouse antibody TINA1 include (1) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of SEQ ID NO: 12, 14, or 16 in the sequence listing, and (2) the amino acid sequence of (1) above.
  • “several” means 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1
  • amino acid substitution is preferable as the amino acid substitution in this specification.
  • Such amino acid substitution is preferably performed within a range that does not deteriorate the properties of the substance having the original amino acid sequence.
  • the heavy chain having a variable region consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 20 to 140 in SEQ ID NO: 12 and the amino acid numbers 21 to 129 in SEQ ID NO: 18 An antibody consisting of a light chain having a variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, a heavy chain having a variable region consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 20 to 140 in SEQ ID NO: 12 and amino acid numbers 21 to 129 in SEQ ID NO: 20
  • An antibody consisting of a light chain having a variable region consisting of an amino acid sequence, a heavy chain having a variable region consisting of an amino acid sequence described in amino acid numbers 20 to 140 in SEQ ID NO: 12 and an amino acid described in amino acid numbers 21 to 129 in SEQ ID NO: 22 An antibody comprising a light chain having a variable region comprising a sequence
  • Amino acids in the chain and SEQ ID NO: 18 An antibody consisting of a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in acid numbers 21 to 234; a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 20 to 470 in SEQ ID NO: 14; and an amino acid sequence set forth in amino acid numbers 21 to 234 in SEQ ID NO: 20
  • Antibody consisting of light chain consisting of amino acid sequence antibody consisting of heavy chain consisting of amino acid sequence described in amino acid numbers 20 to 470 in SEQ ID NO: 14 and light chain consisting of amino acid sequence described in amino acid numbers 21 to 234 in SEQ ID NO: 22
  • a heavy chain having a variable region consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 20 to 140 in SEQ ID NO: 12 and a variable region consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 21 to 129 in SEQ ID NO: 18 are used.
  • Another preferred combination includes an antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12.
  • An antibody comprising a chain and a light chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, a heavy chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 14
  • An antibody comprising a chain, a heavy chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 and an antibody comprising the light chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22 An antibody comprising a heavy chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 and a light chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, a heavy chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20. And an antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 and an antibody consisting of the light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22.
  • An excellent and preferred combination is an antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 20 to 470 in SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 21 to 234 in SEQ ID NO: 18; An antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 20 to 470 in No. 14 and a light chain consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 21 to 234 in SEQ ID No. 18, and an amino acid number of 20 to 470 in SEQ ID No.
  • an antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 20 to 469 in SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 21 to 234 in SEQ ID NO: 18,
  • an antibody having a biological activity equivalent to that of each of the above antibodies by combining a sequence having high homology with the above heavy chain amino acid sequence and light chain amino acid sequence. Such homology is generally 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, most preferably 99% or more. Homology.
  • An antibody having biological activity equivalent to that of each of the above antibodies can also be selected by combining an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are substituted, deleted, or added to the heavy chain or light chain amino acid sequence. Is possible.
  • Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zhangband, Zhangbhang. (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
  • Blast algorithm can also be used by accessing www.ncbi.nlm.nih.gov/blast on the Internet.
  • the amino acid sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues is a signal sequence, and from the 20th to 140th amino acid residues.
  • the amino acid sequence consisting of the amino acid sequence consisting of the 141st to 470th amino acid residues is the constant region.
  • the sequence of SEQ ID NO: 12 is described in FIG. 3, the sequence of SEQ ID NO: 14 is described in FIG. 4, and the sequence of SEQ ID NO: 16 is described in FIG.
  • the amino acid sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues is a signal sequence, and from the 21st to 129th amino acid residues.
  • the amino acid sequence consisting of the amino acid sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues is the constant region.
  • the sequence of SEQ ID NO: 18 is described in FIG. 6, the sequence of SEQ ID NO: 20 is described in FIG. 7, and the sequence of SEQ ID NO: 22 is described in FIG.
  • Examples of the antibody of the present invention further include a human antibody that binds to TROP2.
  • An anti-TROP2 human antibody means a human antibody having only the gene sequence of an antibody derived from a human chromosome.
  • the anti-TROP2 human antibody is a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosome fragment containing the heavy and light chain genes of a human antibody (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133. -143; Kuroiwa, Y. et.al., Nucl.Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448; Yoshida, H.
  • the endogenous immunoglobulin heavy chain and light chain loci are disrupted, and instead, the human immunoglobulin is transferred via a yeast artificial chromosome (YAC) vector or the like.
  • YAC yeast artificial chromosome
  • genetically modified animals into which heavy and light chain loci have been introduced they can be produced by creating knockout animals and transgenic animals and crossing these animals together.
  • eukaryotic cells are transformed with cDNA encoding each of the heavy chain and light chain of such a human antibody, preferably a vector containing the cDNA, to produce a gene recombinant human monoclonal antibody.
  • This antibody can also be obtained from the culture supernatant by culturing the transformed cells.
  • eukaryotic cells preferably CHO cells
  • mammalian cells such as lymphocytes and myeloma can be used as the host.
  • a method for obtaining a human antibody derived from phage display selected from a human antibody library (Wormstone, IM et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p. 2301-2308; Mé, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431 etc.) are also known.
  • a phage display method (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.
  • a variable region of a human antibody in which a variable region of a human antibody is expressed on a phage surface as a single chain antibody (scFv) and a phage that binds to an antigen is selected.
  • scFv single chain antibody
  • a phage that binds to an antigen ⁇ 1116
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv binding to the antigen is clarified, a human antibody can be obtained by preparing an expression vector having the sequence, introducing it into a suitable host and expressing it (WO 92/01047). No.
  • a newly produced human antibody binds to the partial peptide or partial conformation to which the TINA1 antibody binds, it can be determined that the human antibody binds to the same epitope as the TINA1 antibody.
  • the human antibody competes for binding of TINA1 antibody to TROP2 (that is, the human antibody prevents binding of TINA1 antibody to TROP2), the sequence or structure of a specific epitope can be determined.
  • the human antibody binds to the same epitope as the TINA1 antibody.
  • the epitope is the same, it is strongly expected that the human antibody has a biological activity equivalent to that of the TINA1 antibody.
  • the chimeric antibody, humanized antibody, or human antibody obtained by the above method can be evaluated for binding to an antigen by a known method or the like, and a suitable antibody can be selected.
  • An example of another index for comparing the properties of antibodies is antibody stability.
  • DSC Differential scanning calorimetry
  • Tm thermal denaturation midpoint
  • the difference in thermal stability can be compared by measuring the Tm value using DSC and comparing the values.
  • Tm thermal denaturation midpoint
  • a suitable antibody can be selected using stability as an index.
  • Other indicators for selecting antibodies include high yields in suitable host cells and low aggregation in aqueous solutions. For example, since the antibody with the highest yield does not necessarily exhibit the highest thermal stability, it is necessary to select the most suitable antibody for human administration based on a comprehensive judgment based on the above-mentioned indicators. .
  • the antibody of the present invention includes a modified antibody.
  • the modified product means a product obtained by chemically or biologically modifying the antibody of the present invention.
  • Chemical modifications include chemical modifications to the amino acid backbone, chemical modifications of N-linked or O-linked carbohydrate chains, and the like.
  • Biological modifications include post-translational modifications (eg, glycosylation to N- or O-links, N- or C-terminal processing, deamidation, aspartic acid isomerization, methionine oxidation) And those obtained by adding a methionine residue to the N-terminal by expression using a prokaryotic host cell.
  • modified products of the antibody of the present invention for example, an enzyme label, a fluorescent label, and an affinity label are also included in the meaning of such a modified product.
  • Such a modified product of the antibody of the present invention is useful for improvement of antibody stability and blood retention, reduction of antigenicity, detection or isolation of antibody or antigen, and the like.
  • the antibody of the present invention includes an antibody whose sugar chain modification is regulated.
  • an antibody gene is once isolated and then introduced into an appropriate host to produce an antibody, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • Specific examples of the antibody gene include a combination of a gene encoding the heavy chain sequence of the antibody described herein and a gene encoding the light chain sequence.
  • the heavy chain sequence gene and the light chain sequence gene can be inserted into the same expression vector, or can be inserted into separate expression vectors. is there.
  • eukaryotic cells animal cells, plant cells, and eukaryotic microorganisms can be used.
  • animal cells mammalian cells such as COS cells (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650) which are monkey cells, mouse fibroblasts NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) and Chinese hamster ovary cells (CHO cells, ATCC CCL-61) dihydrofolate reductase-deficient strain (Urlauub, G.
  • the antibody of the present invention includes a step of culturing the transformed host cell and a step of collecting the target antibody or a functional fragment of the antibody from the culture obtained in the step. An antibody obtained by the method for producing the antibody is also included.
  • the antibody according to the present invention also includes the antibody subjected to the modification and a functional fragment of the antibody, a deletion in which 1 or 2 amino acids are deleted at the heavy chain carboxyl terminus, and amidated Such deletion forms (for example, heavy chain in which the proline residue at the carboxyl terminal site is amidated) and the like are also included.
  • the carboxyl-terminal deletion of the heavy chain of the antibody according to the present invention is not limited to the above type.
  • the two heavy chains constituting the antibody according to the present invention may be either one of the heavy chains selected from the group consisting of the full length and the above-mentioned deletion, or a combination of any two of them. It may be a thing.
  • the amount ratio of each deletion can be influenced by the type and culture conditions of cultured mammalian cells producing the antibody according to the present invention, but the main component of the antibody according to the present invention is the carboxyl in both of the two heavy chains. A case where one terminal amino acid residue is deleted can be mentioned.
  • Examples of the isotype of the antibody of the present invention include IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) and the like, and preferably IgG1 or IgG2.
  • the biological activity of an antibody generally includes an antigen-binding activity, an activity that is internalized in a cell that expresses the antigen by binding to the antigen, an activity that neutralizes the activity of the antigen, an activity that enhances the activity of the antigen, Examples include antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) activity, complement-dependent cytotoxicity (CDC) activity, and antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP).
  • the function of the antibody according to the present invention is directed to TROP2. It is a binding activity, preferably an activity that is internalized in a TROP2-expressing cell by binding to TROP2.
  • the antibody of the present invention may have ADCC activity, CDC activity and / or ADCP activity in addition to cell internalization activity.
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity. Separation and purification of antibodies may be carried out using separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining column chromatography, filter filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, preparative polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. (Stratesies) for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R.Marshak et al.eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies:. A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)) Is limited to these Not.
  • Examples of the chromatography include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, adsorption chromatography and the like. These chromatography can be performed using liquid chromatography, such as HPLC and FPLC.
  • Examples of the column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column. For example, as a column using a protein A column, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) and the like. It is also possible to purify an antibody using a carrier on which an antigen is immobilized, utilizing the binding property to the antigen.
  • the antitumor compound bound to the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention is described.
  • the antitumor compound used in the present invention is not particularly limited as long as it is a compound having an antitumor effect and has a substituent and a partial structure that can be bonded to a linker structure.
  • a part or all of the linker is cleaved in the tumor cell, and the antitumor compound portion is released to exhibit an antitumor effect.
  • the linker is cleaved at the binding site with the drug, the antitumor compound is released in an unmodified structure, and its original antitumor effect is exhibited.
  • exetecan ((1S, 9S) -1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-, which is a camptothecin derivative, is used.
  • Exatecan may be preferably used. Although this exatecan has excellent antitumor activity, it has not been marketed as an antitumor drug.
  • the compound can be easily obtained by a known method, and the amino group at the 1-position can be suitably used as a binding site to the linker structure. Exatecan may be released in tumor cells in a state in which a part of the linker is bound, and even if it has such a structure, it is an excellent compound that exhibits an excellent antitumor effect.
  • Exatecan has a camptothecin structure, so in an acidic aqueous medium (for example, about pH 3), the equilibrium is biased to a structure in which a lactone ring is formed (ring-closed), whereas in a basic aqueous medium (for example, about pH 10), the lactone ring is It is known that the equilibrium is biased to the ring-opened structure (ring-opened body). Even a drug conjugate into which an exatecan residue corresponding to such a ring-closed structure and a ring-opened structure is introduced is expected to have an equivalent antitumor effect, and any state is included in the scope of the present invention. Needless to say.
  • antitumor compounds examples include doxorubicin, daunorubicin, mitomycin C, bleomycin, cyclocytidine, vincristine, vinblastine, methotrexate, platinum antitumor agents (cisplatin or derivatives thereof), taxol or derivatives thereof, other camptothecins or derivatives thereof (Anti-tumor agent described in JP-A-6-87746) and the like.
  • antibody-drug conjugates the number of drugs bound to one antibody molecule is an important factor affecting the effectiveness and safety of the antibody-drug conjugate.
  • Antibody-drug conjugates are manufactured by specifying reaction conditions such as the amount of raw materials and reagents to be reacted so that the number of drug bonds is constant. What is a chemical reaction of low molecular weight compounds? In contrast, antibody-drug conjugates are usually obtained as a mixture of different numbers of drugs attached. The number of drugs bound to one antibody molecule is specified and expressed as an average value, that is, the average number of drug bonds.
  • the number of drug bindings is shown unless an antibody-drug conjugate having a specific drug binding number contained in an antibody-drug conjugate mixture having a different drug binding number is indicated. Mean value.
  • the number of Exatecan binding to the antibody molecule is controllable, and about 1 to 10 Exatecan can be bound as the average number of drugs bound per antibody, preferably 2 to 8, more preferably Is from 3 to 8.
  • a person skilled in the art can design a reaction for binding the required number of drugs to the antibody from the description of the examples of the present application, and can obtain an antibody-drug conjugate in which the number of bindings of exatecan is controlled. .
  • Linker structure A linker structure for binding an antitumor compound to an anti-TROP2 antibody in the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention will be described.
  • n 1 represents an integer of 0 to 6, preferably an integer of 1 to 5, and more preferably 1 to 3.
  • the position 3 in this partial structure is a binding site to the anti-TROP2 antibody.
  • This binding to the antibody at the 3-position is characterized by binding by forming a thioether.
  • n 3 is an integer of 2 to 8, preferably 2 to 5.
  • N 4 is an integer of 1 to 6, preferably 2 to 4.
  • L 2 binds to L 1 at the terminal amino group and binds to L P at the opposite terminal carbonyl group.
  • L P L P is a peptide residue composed of 2 to 7 amino acids. That is, it is composed of oligopeptide residues in which 2 to 7 amino acids are peptide-bonded. L P binds to L 2 at the N-terminus and to the amino group of the linker —NH— (CH 2 ) n 1 -L a — (CH 2 ) n 2 —C ( ⁇ O) — moiety at the C-terminus To do.
  • the amino acid constituting L P is not particularly limited, and is, for example, an L- or D-amino acid, preferably an L-amino acid.
  • amino acids having structures such as ⁇ -alanine, ⁇ -aminocaproic acid, and ⁇ -aminobutyric acid may also be used. There may be.
  • the amino acid sequence of L P is not particularly limited, but as constituent amino acids, phenylalanine (Phe; F), tyrosine (Tyr; Y), leucine (Leu; L), glycine (Gly; G), alanine (Ala; A ), Valine (Val; V), lysine (Lys; K), citrulline (Cit), serine (Ser; S), glutamic acid (Glu; E), aspartic acid (Asp; D) and the like.
  • phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid, and aspartic acid can be preferably used.
  • the number of amino acids may be 2 to 7.
  • L P As a specific example of L P , -GGF-, -DGGF-, -(D-) D-GGF-, -EGGF-, -GGFG-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG-, -DDGGFG-, -KDGGFG-, -GGFGGGF- Can be mentioned.
  • (D-) D means D-aspartic acid.
  • Antibodies of the present invention - as particularly preferred L P drug conjugates may include the tetrapeptide residues -GGFG-.
  • n 2 is an integer of 0 to 5, preferably 0 to 3, and more preferably 0 or 1.
  • L a — (CH 2 ) n 2 —C ( ⁇ O) — includes the following structures.
  • the linker —NH— (CH 2 ) n 1 -L a — (CH 2 ) n 2 —C ( ⁇ O) — preferably has a chain length of 4 to 7 atoms, more preferably It has a chain length of 5 or 6 atoms.
  • Antitumor derivatives that are released from the antibody-drug conjugate of the present invention and exhibit an antitumor effect include -NH- (CH 2 ) n 1 -L a- (CH 2 ) n 2 of the above-mentioned linkers.
  • NH 2 -CH 2 CH 2 -C ( O)-(NH-DX)
  • NH 2 -CH 2 CH 2 CH 2 -C ( O)-(NH-DX)
  • the drug-linker structure moiety [-L 1 -L 2 -L P -NH- (CH 2 ) n 1 -L a- (CH 2 ) n 2 —C ( ⁇ O) — (NH—DX)] is preferably bound to an antibody.
  • These drug-linker structure moieties may be bound to 1 to 10 as an average number of bonds per antibody, but preferably 2 to 8, more preferably 3 to 8.
  • the linker structure that binds the anti-TROP2 antibody and the drug can be constructed by linking the preferred structures shown in the above-mentioned linker parts.
  • the following structure can be preferably used. The left end of the structure is the binding site with the antibody, and the right end is the binding site with the drug.
  • An antibody-drug conjugate represented by formula (1) in which an antibody and a drug-linker structure are bonded via a thioether can be produced, for example, by the following method.
  • AB represents an antibody having a sulfhydryl group, L 1 ', in the linker structure represented by L 1, the linker terminal maleimidyl group (following formula)
  • the compound of the formula (1) can be interpreted as a structure in which one structural portion from the drug to the linker end is bound to one antibody, but this is for convenience of explanation. In practice, there are many cases in which a plurality of the structural portions are actually bound to one antibody molecule. This situation is the same in the following description of the manufacturing method.
  • the antibody-drug conjugate (1) can be produced by reacting the compound (2), which can be obtained by the method described later, with the antibody (3a) having a sulfhydryl group.
  • the antibody (3a) having a sulfhydryl group can be obtained by a method well known to those skilled in the art (Hermanson, GT, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)).
  • Traut's reagent is allowed to act on the amino group of an antibody; N-succinimidyl S-acetylthioalkanoates are allowed to act on the antibody's amino group, and then hydroxylamine is allowed to act; N-succinimidyl 3- (pyridyldithio) ) Propionate is allowed to act and then a reducing agent is allowed to act; a reducing agent such as dithiothreitol, 2-mercaptoethanol, tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) is allowed to act on the antibody, and the hinge part in the antibody The disulfide bond is reduced to form a sulfhydryl group; however, it is not limited thereto.
  • TCEP as a reducing agent is used in an amount of 0.3 to 3 molar equivalents per one intra-antibody hinge disulfide, and reacted with the antibody in a buffer containing a chelating agent, whereby the intra-antibody hinge Antibodies in which partial disulfides are partially or completely reduced can be obtained.
  • the chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA). These may be used at a concentration of 1 mM to 20 mM.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • DTPA diethylenetriaminepentaacetic acid
  • the buffer solution sodium phosphate, sodium borate, sodium acetate solution and the like can be used.
  • the antibody (3a) having a partially or completely reduced sulfhydryl group can be obtained by reacting the antibody with TCEP at 4 ° C. to 37 ° C. for 1 to 4 hours.
  • the drug-linker moiety can be bound by a thioether bond.
  • an antibody-drug conjugate (1) in which 2 to 8 drugs are bound per antibody is obtained. Can be manufactured.
  • a solution in which the compound (2) is dissolved may be added to a buffer solution containing the antibody (3a) having a sulfhydryl group and reacted.
  • a buffer solution a sodium acetate solution, sodium phosphate, sodium borate, or the like may be used.
  • the pH during the reaction is 5 to 9, and more preferably, the reaction may be performed in the vicinity of pH 7.
  • an organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMA), N-methyl-2-pyridone (NMP) can be used.
  • the organic solvent solution in which the compound (2) is dissolved may be reacted by adding 1 to 20% v / v to a buffer solution containing the antibody (3a) having a sulfhydryl group.
  • the reaction temperature is 0 to 37 ° C., more preferably 10 to 25 ° C., and the reaction time is 0.5 to 2 hours.
  • the reaction can be terminated by deactivating the reactivity of the unreacted compound (2) with a thiol-containing reagent.
  • Thiol-containing reagents are, for example, cysteine or N-acetyl-L-cysteine (NAC).
  • reaction can be completed by adding 1 to 2 molar equivalents of NAC to the compound (2) used and incubating at room temperature for 10 to 30 minutes.
  • the produced antibody-drug conjugate (1) was concentrated, buffer exchanged, purified, antibody concentration and the average number of drugs per antibody molecule were measured by the following common operations. Identification can be performed.
  • Common operation A Concentration of antibody or antibody-drug conjugate aqueous solution Place the antibody or antibody-drug conjugate solution in a container of Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Corporation) and centrifuge (Allegra X-15R, Beckman Coulter). The antibody or antibody-drug conjugate solution was concentrated by centrifugation using 2000 G to 3800 G for 5 to 20 minutes.
  • Common operation B Measurement of antibody concentration Using a UV measuring device (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), antibody concentration was measured according to the method prescribed by the manufacturer.
  • This fractionated fraction is placed on the NAP-25 column again, and the gel filtration purification procedure for elution with a buffer solution is repeated 2 to 3 times in total, so that unbound drug linkers and low molecular compounds (Tris (2-carboxyethyl) Antibody-drug conjugates without phosphine hydrochloride (TCEP), N-acetyl-L-cysteine (NAC), dimethyl sulfoxide) were obtained.
  • Tris (2-carboxyethyl) Antibody-drug conjugates without phosphine hydrochloride (TCEP), N-acetyl-L-cysteine (NAC), dimethyl sulfoxide were obtained.
  • the bound drug concentration in the antibody-drug conjugate can be calculated by measuring the UV absorbance at two wavelengths of 280 nm and 370 nm of the antibody-drug conjugate aqueous solution and performing the following calculation. Since the total absorbance at a certain wavelength is equal to the sum of the absorbances of all the absorbing species present in the system (addition of absorbance), the molar extinction coefficient of the antibody and drug changes before and after conjugation of the antibody and drug. Assuming that there is no antibody, the antibody concentration and the drug concentration in the antibody-drug conjugate are expressed by the following relational expression.
  • a 280 represents the absorbance of the antibody-drug conjugate aqueous solution at 280 nm
  • a 370 represents the absorbance of the antibody-drug conjugate aqueous solution at 370 nm
  • a A, 280 represents the absorbance of the antibody at 280 nm
  • a A , 370 indicates the absorbance of the antibody at 370 nm
  • AD, 280 indicates the absorbance of the conjugate precursor at 280 nm
  • AD, 370 indicates the absorbance of the conjugate precursor at 370 nm
  • ⁇ A, 280 is at 280 nm.
  • ⁇ A, 370 shows the molar extinction coefficient of the antibody at 370 nm
  • ⁇ D, 280 shows the molar extinction coefficient of the conjugate precursor at 280 nm
  • ⁇ D, 370 shows the conjugate at 370 nm.
  • C a antibody - indicates antibody concentration in drug conjugates
  • C D antibodies It shows the drug concentration in the drug conjugate.
  • ⁇ A, 280 can be estimated from the amino acid sequence of an antibody by a known calculation method (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423).
  • ⁇ A, 370 is usually zero.
  • C A and C D can be obtained by measuring A 280 and A 370 of the antibody-drug conjugate aqueous solution and substituting these values into equations (I) and (II) to solve the simultaneous equations.
  • C D can be drug average binding per antibody determined by the dividing in C A.
  • Common operation F Measurement of the average number of drugs per antibody molecule in antibody-drug conjugate (2)
  • the average number of drugs per antibody molecule in the antibody-drug conjugate can be determined by high performance liquid chromatography (HPLC) analysis using the following method in addition to the common operation E described above.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • HPLC analysis HPLC analysis is performed under the following measurement conditions.
  • HPLC system Agilent 1290 HPLC system (Agilent Technologies)
  • Detector UV absorbance meter (measurement wavelength: 280 nm)
  • Column PLRP-S (2.1 ⁇ 50 mm, 8 ⁇ m, 1000 mm; Agilent Technologies, P / N PL 1912-1802)
  • Mobile phase A 0.04% trifluoroacetic acid (TFA) aqueous solution
  • Mobile phase B acetonitrile solution containing 0.04% TFA
  • Gradient program 29% -36% (0 min-12.5 min), 36% -42 % (12.5-15 minutes), 42% -29% (15 minutes-15.1 minutes), 29% -29% (15.1 minutes-25 minutes)
  • Sample injection volume 15 ⁇ L [F-3.
  • the detection peak can be assigned to any one of L 0 , L 1 , H 0 , H 1 , H 2 , and H 3 by comparing the holding times with L 0 and H 0 .
  • the peak area value is corrected according to the following formula using the molar extinction coefficient of the L chain, H chain, and drug linker according to the number of bonds of the drug linker. .
  • the molar extinction coefficient (280 nm) of the L chain and H chain in each antibody is determined by the known calculation method (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423). Values deduced from the sequence can be used. In the case of hTINA, 34690 was used as the L chain molar extinction coefficient and 95000 as the estimated value of the H chain molar extinction coefficient according to the amino acid sequence.
  • the molar extinction coefficient (280 nm) of the drug linker is the measured molar extinction coefficient (280 nm) of the compound obtained by reacting each drug linker with mercaptoethanol or N-acetylcysteine and converting the maleimide group to succinimide thioether. It was. [F-3-3]
  • the ratio (%) of each chain peak area to the total peak area correction value is calculated according to the following formula.
  • n 3 represents an integer from 2 to 8
  • L 2 represents —NH— (CH 2 CH 2 —O) n 4 —CH 2 CH 2 —C ( ⁇ O) — or a single bond
  • n 4 represents an integer of 1 to 6
  • L P represents a peptide residue composed of 2 to 7 amino acids selected from phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid, aspartic acid
  • n 1 represents an integer of 0 to 6
  • n 2 represents an integer of 0 to 5
  • L a represents -O- or a single bond
  • L 2 is a single bond or, when —NH— (CH 2 CH 2 —O) n 4 —CH 2 CH 2 —C ( ⁇ O) —, n 4 is an integer from 2 to 4.
  • the peptide residue of L P phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid, compound is a peptide residue consisting of the amino acid selected from aspartic acid is preferred as a production intermediate.
  • a compound in which L P is a peptide residue composed of 4 amino acids is preferred as a production intermediate. More specifically, the compound L P is a tetrapeptide residue of -GGFG- is preferred as a production intermediate.
  • -NH- (CH 2) n 1 -L a - (CH 2) n 2 - The, -NH-CH 2 CH 2 - , - NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, - NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, - NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, - NH-CH 2 -O-CH 2 -, or -NH-CH 2 CH 2 -O- CH 2 - with Certain compounds are preferred as production intermediates, and more preferably as —NH—CH 2 CH 2 CH 2 —, —NH—CH 2 —O—CH 2 —, or —NH—CH 2 CH 2 —O—CH 2 It is a certain compound.
  • n 3 is an integer of 2 to 5
  • L 2 is a single bond
  • —NH— (CH 2 ) n 1 -L a — (CH 2 ) n 2 - is, -NH-CH 2 CH 2 - , - NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, - NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, - NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, —NH—CH 2 —O—CH 2 —, or —NH—CH 2 CH 2 —O—CH 2 — is preferred as a production intermediate.
  • -NH- (CH 2) n 1 -L a - (CH 2) n 2 - is, -NH-CH 2 CH 2 - , - NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, - NH-CH 2 —O—CH 2 — or —NH—CH 2 CH 2 —O—CH 2 —.
  • the compound whose n ⁇ 3 > is the integer 2 or 5 is preferable.
  • n 3 is an integer of 2 to 5
  • L 2 is —NH— (CH 2 CH 2 —O) n 4 —CH 2 CH 2 —C ( ⁇ O).
  • n 4 is an integer from 2 to 4 and -NH- (CH 2 ) n 1 -L a- (CH 2 ) n 2 -is -NH-CH 2 CH 2- , -NH- CH 2 CH 2 CH 2- , -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2- , -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2- , -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2- , -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2- , -NH-CH 2 -O-CH 2- , or- A compound that is NH—CH 2 CH 2 —O—CH 2 — is preferred as a production intermediate.
  • n 4 is an integer of 2 or 4.
  • -NH- (CH 2 ) n 1 -L a- (CH 2 ) n 2 - is substituted with -NH-CH 2 CH 2 CH 2- , -NH-CH 2 -O-CH 2- , or -NH Compounds that are —CH 2 CH 2 —O—CH 2 — are preferred.
  • a drug-linker compound selected from the group of production intermediate compounds described above is reacted with an anti-TROP2 antibody or a reactive derivative thereof to form a thioether bond at a disulfide bond portion present in the hinge part of the anti-TROP2 antibody.
  • Inventive anti-TROP2 antibody-drug conjugates can be prepared.
  • a reactive derivative of the anti-TROP2 antibody is preferably used, and a reactive derivative obtained by reducing the anti-TROP2 antibody is particularly preferable.
  • conjugates for example, about ⁇ 1 having the same average number of drugs prepared under the same conditions into a new lot. it can. In that case, the average number of drugs falls within the average number of drugs before mixing.
  • L 1 ′ represents a terminal maleimidyl group
  • P 1 , P 2 and P 3 represent protecting groups.
  • the compound (6) is obtained by derivatizing the carboxylic acid (5) into an active ester, mixed acid anhydride, acid halide or the like and reacting with NH 2 -DX (4) or a pharmacologically acceptable salt thereof in the presence of a base.
  • NH 2 -DX (4) is exatecan (chemical name: (1S, 9S) -1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H, 12H- Benzo [de] pyrano [3 ′, 4 ′: 6,7] indolidino [1,2-b] quinoline-10,13 (9H, 15H) -dione).
  • reaction reagents and conditions usually used for peptide synthesis may be applied mutatis mutandis.
  • active esters There are various types of active esters.
  • phenols such as p-nitrophenol, N-hydroxybenzotriazole or N-hydroxysuccinimide, and carboxylic acid (5) are mixed with N, N′-dicyclohexylcarbodiimide or 1 It can be produced by reacting with a condensing agent such as -ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide / hydrochloride.
  • the active ester is a reaction of carboxylic acid (5) with pentafluorophenyl trifluoroacetate or the like; a reaction of carboxylic acid (5) with 1-benzotriazolyloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphite; Reaction of (5) with diethyl cyanophosphonate (salt insertion method); Reaction of carboxylic acid (5) with triphenylphosphine and 2,2′-dipyridyl disulfide (Mukayama method); Carboxylic acid (5) and 4- ( It can also be produced by a reaction with a triazine derivative such as 4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (DMTMM); The reaction can also be performed by an acid halide method or the like that can be produced by treating carboxylic acid (5) with an acid halide such as thionyl chloride or oxalyl chloride in
  • the base used in each of the above steps include alkali metals or alkalis such as sodium carbonate, potassium carbonate, sodium ethoxide, potassium butoxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydride, potassium hydride and the like.
  • inert solvent used in this reaction examples include halogenated hydrocarbon solvents such as dichloromethane, chloroform and carbon tetrachloride; ether solvents such as tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane and dioxane; aromatics such as benzene and toluene.
  • halogenated hydrocarbon solvents such as dichloromethane, chloroform and carbon tetrachloride
  • ether solvents such as tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane and dioxane
  • aromatics such as benzene and toluene.
  • Hydrocarbon solvents such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidin-2-one; and in addition to these, dimethyl sulfoxide, sulfolane It is also possible to use sulfoxide solvents such as; ketone solvents such as acetone and methyl ethyl ketone; alcohol solvents such as methanol and ethanol. Furthermore, these can also be mixed and used.
  • Examples of the protecting group P 1 for the terminal amino group of the compound (6) include tert-butyloxycarbonyl group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, and other amino groups usually used for peptide synthesis. Protecting groups can be used.
  • protecting groups for amino groups include alkanoyl groups such as acetyl groups; alkoxycarbonyl groups such as methoxycarbonyl groups and ethoxycarbonyl groups; aryls such as paramethoxybenzyloxycarbonyl groups and para (or ortho) nitrobenzyloxycarbonyl groups Methoxycarbonyl group; arylmethyl group such as benzyl group and triphenylmethyl group; aroyl group such as benzoyl group; arylsulfonyl group such as 2,4-dinitrobenzenesulfonyl group and orthonitrobenzenesulfonyl group;
  • the protecting group P 1 may be selected according to the properties of the compound protecting the amino group.
  • Compound (7) can be produced by deprotecting the protecting group P 1 of the terminal amino group of the obtained compound (6). For this deprotection, a reagent and conditions corresponding to the protecting group may be selected.
  • the compound (9) can be produced by inducing the peptide carboxylic acid (8) whose N-terminal is protected with P 2 to an active ester, mixed acid anhydride or the like and reacting with the resulting compound (7).
  • Reaction conditions, reagents, bases and inert solvents for forming peptide bonds between peptide carboxylic acid (8) and compound (7) may be appropriately selected from those described in the synthesis of compound (6). .
  • the protecting group P 2 may be appropriately selected from those described for the protecting group of the compound (6) and used depending on the properties of the compound protecting the amino group. Further, as is usually used in peptide synthesis, the amino acid or peptide constituting peptide carboxylic acid (8) can be sequentially subjected to reaction and deprotection and extended to produce compound (9).
  • Compound (10) can be produced by deprotecting amino-protecting group P 2 of the resulting compound (9). For this deprotection, a reagent and conditions corresponding to the protecting group may be selected.
  • Compound (2) or can be produced by derivatizing carboxylic acid (11) into an active ester, mixed acid anhydride, acid halide or the like and reacting with the resulting compound (10). The reaction conditions, reagents, base, and inert solvent for forming a peptide bond between the carboxylic acid (11) and the compound (10) may be appropriately selected from those described in the synthesis of the compound (6).
  • Compound (9) can also be produced, for example, by the following method.
  • Peptide carboxylic acid (8) whose N-terminal is protected with P 2 is derived into an active ester, mixed acid anhydride, etc., and is reacted with an amine compound (12) whose carboxy group is protected with P 3 in the presence of a base. (13) can be manufactured.
  • Reaction conditions, reagents, bases, and inert solvents for forming peptide bonds between peptide carboxylic acid (8) and compound (12) may be appropriately selected from those described in the synthesis of compound (6). .
  • the amino-protecting group P 2 of the compound (13) may be protected with a commonly used protecting group.
  • hydroxyl-protecting groups include alkoxymethyl groups such as methoxymethyl groups; arylmethyl groups such as benzyl groups, 4-methoxybenzyl groups and triphenylmethyl groups; alkanoyl groups such as acetyl groups; benzoyl groups and the like An aroyl group; a silyl group such as a tert-butyldiphenylsilyl group; and the like.
  • the carboxy group can be protected as an ester with an alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, or a tert-butyl group, an allyl group, or an arylmethyl group such as a benzyl group.
  • the amino group is an alkyloxycarbonyl group such as tert-butyloxycarbonyl group, methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group; allyloxycarbonyl group, or 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, paramethoxybenzyloxy Arylmethoxycarbonyl group such as carbonyl group, para (or ortho) nitrobenzyloxycarbonyl group; alkanoyl group such as acetyl group; arylmethyl group such as benzyl group and triphenylmethyl group; aroyl group such as benzoyl group; And arylsulfonyl groups such as 2,4-dinitrobenzenesulfonyl group and orthonitrobenzenesulfonyl group.
  • alkyloxycarbonyl group such as tert-butyloxycarbonyl group, methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group; ally
  • a protective group usually used as a protective group for the carboxy group in organic synthetic chemistry, particularly peptide synthesis may be used.
  • a methyl group, an ethyl group, or a tert-butyl group may be used.
  • alkyl esters, allyl esters, benzyl esters, etc. which may be selected from the above protecting groups.
  • the protecting group for the amino group and the protecting group for the carboxy group can be removed by different methods or conditions.
  • a typical combination includes a combination in which P 2 is a tert-butyloxycarbonyl group and P 3 is a benzyl group.
  • protecting groups may be selected from those described above according to the properties of the compounds protecting amino groups and carboxy groups, and when cleaving these protecting groups, reagents and conditions corresponding to the protecting groups may be selected. Good.
  • the compound (14) can be produced by deprotecting the protecting group P 3 of the carboxy group of the obtained compound (13). For this deprotection, a reagent and conditions corresponding to the protecting group may be selected.
  • the compound (9) can be produced by derivatizing the obtained compound (14) into an active ester, mixed acid anhydride, acid halide or the like and reacting with the compound (4) in the presence of a base.
  • reaction reagents and conditions usually used for peptide synthesis may be applied mutatis mutandis, and reaction conditions, reagents, bases, and inert solvents may be appropriately selected from those described in the synthesis of compound (6). .
  • Compound (2) can also be produced, for example, by the following method.
  • Compound (15) can be produced by deprotecting amino-protecting group P 2 of compound (13). For this deprotection, a reagent and conditions corresponding to the protecting group may be selected.
  • Compound (16) can be produced by derivatizing carboxylic acid derivative (11) into an active ester, mixed acid anhydride, acid halide or the like and reacting with the obtained compound (15) in the presence of a base. .
  • the reaction conditions, reagents, base, and inert solvent for forming an amide bond between peptide carboxylic acid (11) and compound (15) may be appropriately selected from those described in the synthesis of compound (6). .
  • the compound (17) can be produced by deprotecting the protecting group of the carboxy group of the obtained compound (16). This deprotection can be carried out in the same manner as the deprotection of the carboxy group in the production of compound (14).
  • Compound (2) can be produced by inducing compound (17) to an active ester, mixed acid anhydride, acid halide or the like and reacting with compound (4) in the presence of a base. For this reaction, reaction reagents and conditions usually used for peptide synthesis may be applied mutatis mutandis, and reaction conditions, reagents, bases, and inert solvents may be appropriately selected from those described in the synthesis of compound (6). .
  • L 1 ' is the L 1 terminal is converted into maleimidyl group structure
  • P 4 is a protecting group
  • Compound (19) can be produced by inducing compound (11) to an active ester, mixed acid anhydride, etc., and reacting with peptide carboxylic acid (18) whose C-terminal is protected with P 4 in the presence of a base.
  • Reaction conditions, reagents, bases and inert solvents for forming peptide bonds between peptide carboxylic acid (18) and compound (11) may be appropriately selected from those described in the synthesis of compound (6).
  • the protecting group P 4 for the carboxy group of the compound (18) may be appropriately selected from the protecting groups described above.
  • the compound (20) can be produced by deprotecting the protecting group of the carboxy group of the obtained compound (19).
  • This deprotection can be carried out in the same manner as the deprotection of the carboxy group in the production of compound (14).
  • the compound (2) can be produced by inducing the obtained compound (20) to an active ester or a mixed acid anhydride and reacting with the compound (7).
  • reaction reagents and conditions usually used for peptide synthesis may be applied mutatis mutandis, and reaction conditions, reagents, bases, and inert solvents may be appropriately selected from those described in the synthesis of compound (6). .
  • L P represents the same as described above, L represents an acyl group, an alkanoyl group such as an acetyl group or an aroyl group such as a benzoyl group, or a hydrogen atom, and X and Y are An oligopeptide consisting of 1 to 3 amino acids, P 5 and P 7 are amino-protecting groups, and P 6 is a carboxy-protecting group.
  • the compound represented by the formula (21) is a method described in JP-A No. 2002-60351, a method described in literature (J. Org. Chem., 51, 3196, 1986), or an application of the method. And it can manufacture by removing a protective group and functional group conversion as needed. In addition, it can be obtained by treating an amino acid having a protected terminal amino group or an acid amide of an oligopeptide having a protected amino group with an aldehyde or a ketone.
  • Compound (23) can be produced by reacting compound (21) with compound (22) having a hydroxyl group in an inert solvent in the presence of an acid or a base under cooling and at room temperature.
  • acids examples include inorganic acids such as hydrofluoric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, and boric acid; organic acids such as acetic acid, citric acid, paratoluenesulfonic acid, and methanesulfonic acid; tetrafluoro And Lewis acids such as borate, zinc chloride, tin chloride, aluminum chloride, and iron chloride.
  • inorganic acids such as hydrofluoric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, and boric acid
  • organic acids such as acetic acid, citric acid, paratoluenesulfonic acid, and methanesulfonic acid
  • tetrafluoro And Lewis acids such as borate, zinc chloride, tin chloride, aluminum chloride, and iron chloride.
  • sulfonic acids particularly paratoluenesulfonic acid, are preferred.
  • the base may be appropriately selected from the above-mentioned bases, particularly alkali metal alkoxides such as potassium tert-butoxide; alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide; hydrogenation Preferred are alkali metal hydrides such as sodium and potassium hydride; organometallic bases typified by dialkylaminolithium such as lithium diisopropylamide; organometallic bases of bissilylamines such as lithium bis (trimethylsilyl) amide; As the solvent used in the reaction, ether solvents such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane; aromatic hydrocarbon solvents such as benzene and toluene; The above solvent may be a mixture with water.
  • alkali metal alkoxides such as potassium tert-butoxide
  • alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide
  • the amino protecting group exemplified in P 5 is not particularly limited as long as it is a group usually used for protecting an amino group.
  • the amino-protecting groups described in Production Method 2 can be mentioned, but the amino-protecting groups exemplified in P 5 may be cleaved during this reaction. In that case, the protecting group may be introduced again by reacting with an appropriate amino group protecting reagent as needed.
  • Compound (24) can be produced by removing protecting group P 6 of compound (23).
  • protecting group for the carboxy group exemplified as P 6 those representative in Production Method 2 are described, and can be appropriately selected therefrom.
  • protecting group P 6 of the protecting group P 5 and the carboxy group of the amino group is a protecting group which can be removed in different ways, or condition.
  • a representative combination is a combination in which P 5 is a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group and P 6 is a benzyl group.
  • Those protecting groups may be selected according to the properties of the compound protecting the amino group and carboxy group, and reagents and conditions corresponding to the protecting groups may be selected when removing these protecting groups.
  • the compound (25) is produced by derivatizing the carboxylic acid (24) into an active ester, mixed acid anhydride, acid halide or the like and reacting with the compound (4) or a pharmacologically acceptable salt thereof in the presence of a base. Then, the compound (26) can be produced by removing the protecting group P 5 of the obtained compound (25). In the reaction between the compound (4) and the carboxylic acid (24) and the reaction for removing the protecting group P 6 , the same reagents and reaction conditions as described in Production Method 2 may be used.
  • Compound (9b) is produced by reacting compound (26) with an amino acid with a terminal amino group protected or an oligopeptide (27) with an amino group protected, and protecting group P 7 of compound (9b) obtained is reacted.
  • Compound (10b) can be produced by removing.
  • the amino protecting group shown as P 7 is not particularly limited as long as it is usually a group used for protecting an amino group, and representative examples include the amino protecting group described in Production Method 2.
  • a reagent and conditions corresponding to the protecting group may be selected.
  • reaction reagents and conditions usually used for peptide synthesis may be applied mutatis mutandis.
  • the compound (10b) produced by the above method can be led to the compound (1) of the present invention according to the above production method.
  • the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention may be left in the atmosphere or purified by recrystallization or the like to absorb water, adsorbed water, or become a hydrate. Yes, such water-containing compounds and salts are also encompassed by the present invention.
  • the present invention also includes compounds labeled with various radioactive or non-radioactive isotopes.
  • One or more of the atoms making up the antibody-drug conjugate of the present invention may also contain unnatural proportions of atomic isotopes. Examples of atomic isotopes include deuterium ( 2 H), tritium ( 3 H), iodine-125 ( 125 I), carbon-14 ( 14 C), and the like.
  • the compound of the present invention can be radiolabeled with a radioisotope such as tritium ( 3 H), iodine-125 ( 125 I) or carbon-14 ( 14 C).
  • Radiolabeled compounds are useful as therapeutic or prophylactic agents, research reagents such as assay reagents, and diagnostic agents such as in vivo diagnostic imaging agents. All isotope variants of the antibody-drug conjugates of the present invention, whether radioactive or not, are encompassed within the scope of the present invention.
  • the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention exhibits cytotoxic activity against cancer cells, it can be used as a pharmaceutical, particularly as a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer. That is, the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can be selected and used as a drug for chemotherapy, which is a main therapeutic method for cancer treatment, and as a result, cancer cell growth is delayed and Can be suppressed, and cancer cells can be destroyed.
  • chemotherapy which is a main therapeutic method for cancer treatment
  • cancer cell growth is delayed and Can be suppressed, and cancer cells can be destroyed.
  • the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can be used not only as a drug alone but also as a drug combined with other therapies in adjuvant therapy, and can be combined with surgery, radiation therapy, hormone therapy and the like. Furthermore, it can also be used as a drug for pharmacotherapy in neoadjuvant therapy. In addition to the therapeutic use as described above, it can be expected that the antibody binds to a finely metastasized cancer cell by binding to an antigen, suppresses the growth of the cancer cell, and further destroys it.
  • suppression of cancer metastasis and prevention can be expected by administering the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention.
  • an effect of suppressing and destroying cancer cells in a body fluid during a metastasis process and an effect of suppressing and destroying fine cancer cells immediately after implantation in any tissue can be expected.
  • suppression of cancer metastasis, especially after surgical removal of cancer can be expected, and these can be expected to suppress cancer metastasis.
  • the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can be administered to a patient systemically as a systemic therapy or locally to a cancer tissue to expect a therapeutic effect.
  • the types of cancer to which the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention is applied include lung cancer, renal cancer, urothelial cancer, colon cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, Examples include melanoma, liver cancer, bladder cancer, gastric cancer, cervical cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, etc., but a protein capable of recognizing the antibody in the antibody-drug conjugate is expressed in cancer cells to be treated. It is not limited to these as long as they are cancer cells.
  • the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can be suitably administered to a mammal, but is more preferably a human.
  • the substance used in the pharmaceutical composition containing the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention is appropriately selected and applied from the formulation additives and the like commonly used in this field at the dosage and concentration. Can do.
  • the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can be administered as a pharmaceutical composition comprising one or more pharmaceutically compatible ingredients.
  • the pharmaceutical composition typically includes one or more pharmaceutical carriers (eg, sterile liquids).
  • Liquids here include, for example, water and oils (oils of petroleum, animal origin, plant origin or synthetic origin).
  • the oil may be, for example, peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like.
  • Water is a more typical carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously.
  • Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients are known in the art.
  • composition can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents, if desired.
  • suitable pharmaceutical carriers are E. W. It is described in “Remington's Pharmaceutical Sciences” by Martin. The formulation corresponds to the mode of administration.
  • Introduction methods can include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, and subcutaneous routes. Administration can be, for example, by infusion or bolus injection. In certain preferred embodiments, administration of the ligand drug conjugate is by infusion. Parenteral administration is the preferred route of administration.
  • the pharmaceutical composition is formulated according to routine procedures as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to humans.
  • compositions for intravenous administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer.
  • the medicament may also include a solubilizing agent and a local anesthetic (eg, lignocaine) to relieve pain at the site of injection.
  • a local anesthetic eg, lignocaine
  • the ingredients are either separately or together in a unit dosage form, for example, as a dry lyophilized powder or anhydrous concentrate in a hermetically sealed container such as an ampoule or sachet indicating the amount of active agent Mixed and supplied either.
  • the medicament is in a form to be administered by infusion, it can be dispensed, for example, with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline.
  • an ampule of sterile water for injection or saline can be provided, for example, so that the ingredients can be mixed prior to administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be a pharmaceutical composition containing only the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present application, or a pharmaceutical containing the anti-TROP2 antibody-drug conjugate and at least one other cancer therapeutic agent. It may be a composition.
  • the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can also be administered together with other cancer therapeutic agents, thereby enhancing the anticancer effect.
  • Other anticancer agents used for such a purpose may be administered to an individual simultaneously or separately with the antibody-drug conjugate, or may be administered at different intervals. .
  • cancer therapeutic agents abraxane, paclitaxel, cisplatin, gemcitabine, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinblastin, or an analog described in International Publication No. 2003/038043 H Prorelin, goserelin, etc.), estramustine phosphate, estrogen antagonists (tamoxifen, raloxifene, etc.), aromatase inhibitors (anastrozole, letrozole, exemestane, etc.), etc. There is no limitation as long as the drug has.
  • Such a pharmaceutical composition may be formulated as a freeze-dried preparation or a liquid preparation as a preparation having the selected composition and the required purity.
  • a pharmaceutical composition When formulated as a lyophilized formulation, it may be a formulation containing appropriate formulation additives used in this field.
  • liquid preparations can be formulated as liquid preparations containing various preparation additives used in this field.
  • the anti-TROP2 antibody-drug conjugate contained in the pharmaceutical composition of the present invention has the affinity of the antibody-drug conjugate for the antigen, that is, dissociation for the antigen.
  • Kd value the higher the affinity (the lower the Kd value), the more effective the drug can be exerted even with a small dose. Therefore, in determining the dose of the antibody-drug conjugate, the dose can be set based on the affinity state between the antibody-drug conjugate and the antigen.
  • the antibody-drug conjugate of the present invention is administered to humans, for example, about 0.001 to 100 mg / kg may be administered once or several times at intervals of 1 to 180 days. .
  • Example 1 Immunization of mice and acquisition of hybridoma
  • 5 ⁇ 10 6 NCI-H322 cells human non-small cell lung cancer cell line, ATCC CRL-5806; ATCC: American Type Culture Collection
  • RPMI-1640 Roswell Park Memorial
  • PBS phosphate buffered saline
  • PBS phosphate buffered saline
  • mice BALB / c mice (6 weeks old) were immunized intraperitoneally with NCI-H322 cells (1 ⁇ 10 7 cells) for the first immunization.
  • the second to fifth rounds were immunized intraperitoneally with 1 ⁇ 10 6 NCI-H322 cells at weekly intervals.
  • NCI-H322 cells were immunized with 1 ⁇ 10 6 cells / 200 ⁇ l PBS into the tail vein and the abdominal cavity, respectively. Spleen cells were removed 3 days after the final immunization.
  • RPMI 1640FBS (+) medium (10 ml) was added to the cell suspension, passed through a cell strainer, and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes at room temperature. The supernatant was discarded and the spleen cells were resuspended in RPMI 1640 FBS ( ⁇ ) medium (10 ml).
  • P3U1 cells mouse myeloma cell line
  • EDTA (0.02%) solution 10 ml
  • the P3U1 cell suspension was centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes at room temperature.
  • the supernatant was discarded and resuspended in RPMI 1640 FBS ( ⁇ ) medium (10 ml).
  • NCI-H322 cells treated with ⁇ -Gal reporter gene assay using Galacto-Light Plus Reporter Gene Assay System were washed with 200 ⁇ l / well of PBS, and Lysis Solution was added at 50 ⁇ l / well. Allowed to stand for 10 minutes.
  • This cell lysate (10 ⁇ L) was diluted 100-fold with Galacton-Plus Galacto Reaction Buffer Diluent, added to White microwell SH 96 well plate (Nunc), and reacted at room temperature for 1 hour.
  • Accelerator II was added at 150 ⁇ l / well, chemiluminescence was measured for 5 seconds using a multi-label counter Wallac 1420ARVOsx (Perkin Elmer), and the average value per second was determined as RLU (luminescence) to NCI-H322 cells. The amount of virus infection was expressed.
  • RLU measured value
  • clones having a measured value (RLU) of 5000 RLU or more were selected from the entire group (minimum value 1383 RLU, average value 10914 RLU, maximum value 78746 RLU).
  • 81 positive wells were selected from 960 well hybridoma wells obtained by one cell fusion.
  • the assay was performed in duplicate by the same method as in the primary screening, and both wells with measured values of 5000 RLU or more were made positive, and 81 to 52 wells obtained in the primary screening. Positive wells were selected. The selected clones were subcloned 2 to 4 times to establish 44 monoclonal hybridoma cell lines.
  • Example 2 Purification of antibody from hybridoma
  • pristane Pristane; 2,6,10,14-tetramethylpentadecane; 0.5 ml
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas were injected intraperitoneally.
  • ascites was collected after 10 to 21 days after the hybridoma was changed to ascites tumor.
  • the resulting ascites was centrifuged to remove solids, salted out with 40-50% ammonium sulfate, purified by caprylic acid precipitation method, DEAE-Sepharose column, protein G-column, and IgG or IgM fraction was obtained. Collected and used as a purified monoclonal antibody.
  • Example 3 Identification of antigen bound by antibody produced by hybridoma
  • TINA1 is one of the antibodies produced by the hybridoma prepared in Example 2.
  • the washed cells were resuspended in lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40 + Protease inhibitor, Complete EDTA free (Roche) 1 tablet / 50 ml; 2 ml) at 4 ° C. For 30 minutes.
  • Protein G Sepharose / Protein G Sepharose / lysis buffer (50% slurry; 30 ⁇ l) obtained by substituting the buffer of Protein G Sepharose (Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare)) with the lysis buffer was added to the cell lysis solution at 4 ° C. And then centrifuged at 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was collected.
  • TINA1 antibody (3 ⁇ g) was added to the supernatant, and the mixture was rotated at 4 ° C. for 1 hour, and then Protein G Sepharose / lysis buffer (50% slurry; 60 ⁇ l) was added and rotated at 4 ° C. for 2 hours.
  • Protein G Sepharose 6 was was was rotated at 4 ° C. for 1 hour, and then Protein G Sepharose / lysis buffer (50% slurry; 60 ⁇ l) was added and rotated at 4 ° C. for 2 hours.
  • lysis buffer 1 ml
  • 1 ⁇ SDS sample buffer / 5% 2-ME (2-mercaptoethanol) buffer (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 25 ° C.), 2 % (W / v) SDS, 10% glycerol and 0.01% (w / v) phenol red).
  • SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • the membrane was washed 4 times for 10 minutes with PBS-T, and then the target band was detected using ECL Western blotting detection reagents (Amersham) and Hyperfilm ECL (Amersham).
  • ECL Western blotting detection reagents Amersham
  • Hyperfilm ECL Hyperfilm ECL
  • An immunoprecipitate obtained by immunoprecipitation of NCI-H322 cells labeled with biotin according to the procedure of Example 3-1) with KCI7A3 antibody and TINA1 antibody whose antigen was already determined to be TROP2 by mass spectrometry was obtained. Analysis was performed by SDS-PAGE and Western blotting with or without DTT added, respectively.
  • TINA1 antibody Since it was predicted from the band pattern that the antigen of TINA1 antibody was TROP2, forced expression analysis by gene introduction of cDNA was performed without mass spectrometry. As a result of FACS analysis, TINA1 antibody showed a strong positive reaction in human TROP2-expressing CHOK1 cells, indicating that the antigen of TINA1 antibody is TROP2.
  • lung cancer cell line PC14 lung cancer cell line NCI-H322, lung cancer cell line NCI-H2122, lung cancer cell line LCAM1, lung cancer cell line LC2 / ad, pancreatic cancer cell line MIAPaCa2, pancreatic cancer cell line PK-1, prostate cancer cell line PC3
  • colon cancer cell line HCT116 melanoma cell line A375
  • FACS analysis was performed. All the lung cancer cell lines examined were TROP2-positive, and PC3, PK1, and SKOV3 were positive in cell lines other than lung cancer. On the other hand, all normal blood cells were negative.
  • Antibody internalization activity evaluation system DT3C a recombinant complex protein, was prepared for the purpose of antibody internalization and measurement of immunotoxin activity.
  • This DT3C is a protein having three catalytic domains of diphtheria toxin (DT) and three antibody binding domains of protein G.
  • DT3C specifically binds to the Fc part of the antibody and is stable, and when it is taken into cells, it induces cell death by inhibiting protein synthesis.
  • antibody internalization and cytocidal effect by immunotoxin can be observed simultaneously (Yamaguchi, M., Hamada, H., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 454 (2014) 600- 603).
  • NCI-H322 cells 50 ⁇ L of 2 ⁇ 10 4 cells / mL (RPMI1640 medium supplemented with 20% Low IgG FBS) were seeded, incubated at room temperature for 30 minutes, and then cultured in a 37 ° C. CO 2 incubator for 3 days. The supernatant after culturing, 10% WST-10% FBS -RPMI1640 the (100 [mu] L) was added, 37 ° C. CO 2 1 hour incubation in an incubator, the number of viable cells microplate reader (OD 450 ⁇ OD 640, infinite200 , Tecan Japan Co., Ltd.). In the culture supernatant of the evaluated hybridoma cells, strong internalization and immunotoxin activity were observed with antibodies against CD59, CD71, EGFR, EpCAM, and TROP2 (FIG. 10).
  • Example 4 Difference in internalization and immunotoxin activity of anti-TROP2 antibody in each clone Example 1 or TINA1 (immunogen: lung cancer strain NCI-H322), KCL7A3, and KCL2D6 (immunogen: Pancreatic cancer strain KCL-MOH1), Pr1E11 and Pr8H10 (immunogen: prostate cancer strain Pc-1), NY16 and NY17 (immunogen: pancreatic cancer strain PK-1) and commercially available 77220 (R & D System) anti-TROP2 antibodies was evaluated in the same manner as in Example 4-3). As a result, the TINA1 antibody had the strongest activity among the eight anti-TROP2 antibodies (FIG. 12).
  • Example 5 Determination of nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of TINA1 antibody gene and production of chimeric TINA1 (hereinafter, cTINA1) antibody] 5-1) Determination of nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of TINA1 antibody gene 5-1-1) Preparation of mRNA from TINA1 antibody-producing hybridoma Production of TINA1 antibody to amplify cDNA containing variable region of TINA1 antibody MRNA was prepared from the hybridoma using mRNA Isolation kit (Roche applied science).
  • a cDNA containing a heavy chain variable region amplified by 5'-RACE PCR was purified using MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN), cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen), and cloned Sequence analysis of the nucleotide sequence of the cDNA containing the variable region of the strand was performed.
  • sequence primer the above-mentioned primer mG2aVR2 designed from the sequence of the constant region of the mouse heavy chain in the database and NUP (Nested Universal Primer A: attached to SMARTer RACE cDNA Amplification Kit) were used.
  • sequence analysis was performed using a gene sequence analyzer (“ABI PRISM 3700 DNA Analyzer” or “Applied Biosystems 3730xl Analyzer”, Applied Biosystems), and the sequence reaction was performed using Gene Amp 9ed (Apli, Inc.).
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the determined heavy chain of TINA1 antibody is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Amplification of cDNA containing the light chain variable region of TINA1 antibody by 5'-RACE PCR using this primer combination and the cDNA synthesized in Example 5-1-2) (5'-RACE-Ready cDNA) as a template did.
  • PCR was performed using a touchdown PCR program according to the manual of SMARTER RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH) using KOD-plus- (TOYOBO) as Polymerase.
  • a cDNA containing a light chain variable region amplified by 5′-RACE PCR was purified using MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN), cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen), and cloned.
  • Sequence analysis of the nucleotide sequence of the cDNA containing the variable region of the strand was performed.
  • the primers mKVR2 and NUP designed from the sequence of the constant region of the mouse light chain in the database were used as sequence primers.
  • the above-mentioned apparatus was used for sequence analysis and sequence reaction.
  • the determined nucleotide sequence of cDNA encoding the light chain variable region of the TINA1 antibody is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • PCR was carried out with the following primer set, and the obtained 3.8 kb fragment was phosphorylated and self-ligated to downstream of the CMV promoter to establish a signal sequence, cloning site, and human kappa chain.
  • Chimeric and humanized antibody light chain expression vectors pCMA-LK with normal regions were constructed.
  • Primer set 5'-tataccgtcgacccttagtagtaggctttggc-3 '(SEQ ID NO: 35: primer 3.3-F1) 5′-gctatggcaggggcctgccgcccccgacgtgt-3 ′ (SEQ ID NO: 36: primer 3.3-R1)
  • chimeric and humanized antibody IgG1-type heavy chain expression vector pCMA-G1 A DNA fragment obtained by digesting pCMA-LK with XbaI and PmeI to remove the ⁇ chain secretion signal and the human ⁇ chain constant region; A DNA fragment comprising a DNA sequence encoding the amino acid sequence of the human heavy chain signal sequence shown in SEQ ID NO: 6 and the human IgG1 constant region was ligated using an In-Fusion Advantage PCR cloning kit (CLONTECH), downstream of the CMV promoter. A chimeric and humanized antibody IgG1-type heavy chain expression vector pCMA-G1 having a signal sequence, a cloning site, a human IgG1 heavy chain constant region was constructed.
  • cTINA1 antibody heavy chain expression vector Using cDNA containing the variable region of the heavy chain of TINA1 antibody obtained in Example 5-1-3) as a template, KOD-Plus- (TOYOBO) and In-Fusion HD PCR cloning at the site where the DNA fragment containing cDNA encoding the variable region of the heavy chain was amplified with the following primer set and the chimeric and humanized IgG1-type heavy chain expression vector pCMA-G1 was cleaved with the restriction enzyme BlpI
  • a cTINA1 antibody heavy chain expression vector was constructed by insertion using a kit (CLONTECH). The obtained expression vector was designated as “pCMA-G1 / cTINA1”.
  • the nucleotide sequence of the cTINA1 antibody heavy chain is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 are also shown in FIG.
  • cTINA1 antibody heavy chain primer set 5′-CCAGATGGGTGCTGAGCCAGATCCAGTGGGTGCAGTCTGGACCTGAG-3 ′
  • SEQ ID NO: 37 primer TINA1H-F
  • SEQ ID NO: 38: primer TINA1H-R primer TINA1H-R
  • the light chain nucleotide sequence of the cTINA1 antibody is shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 are also shown in FIG.
  • cTINA1 antibody light chain primer set 5′-ATCTCCGGGCCGTACGGCGGACATGTGATGACCCAGTCTCCAAAATC-3 ′
  • SEQ ID NO: 39: primer TINA1L-F 5′-GGAGGGGGCGGCCCACAGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGC-3 ′
  • SEQ ID NO: 40 primer TINA1L-R
  • FreeStyle 293F cells Small-scale production of cTINA1 antibody FreeStyle 293F cells (Invitrogen) were subcultured and cultured according to the manual. 1 ⁇ 10 7 FreeStyle 293F cells (Invitrogen) in logarithmic growth phase were diluted to 9.6 mL with FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen), then seeded at 30 mL Square Storage Bottle, 37 ° C., Nalgen 8 The culture was shaken at 90 rpm for 1 hour in a% CO 2 incubator.
  • Polyethyleneimine (Polyscience # 24765; 30 ⁇ g) was dissolved in Opti-Pro SFM (Invitrogen; 200 ⁇ L), and then a light chain expression vector (6 ⁇ g) and a light chain expression vector prepared using PureLink HiPure Plasmid kit (Invitrogen) (4 ⁇ g) was added to Opti-Pro SFM (Invitrogen; 200 ⁇ L).
  • the expression vector / Opti-Pro SFM mixed solution (200 ⁇ L) was added to the Polyethyleneimine / Opti-Pro SFM mixed solution (200 ⁇ L), stirred gently, allowed to stand for another 5 minutes, and then added to FreeStyle 293F cells.
  • a culture supernatant obtained by shaking culture at 90 rpm in a 37 ° C., 8% CO 2 incubator for 7 days was filtered through a Minisart-Plus filter (Sartorius) to obtain a sample for evaluation.
  • the human chimeric TINA1 antibody obtained by the combination of pCMA-G1 / cTINA1 and pCMA-LK / cTINA1 was named “cTINA1 antibody”.
  • Example 6 Design of humanized antibody of mouse anti-TROP2 monoclonal antibody] 6-1) Design of humanized version of TINA1 6-1-1) Molecular modeling of variable region of TINA1 Molecular modeling of the variable region of TINA1 is a method known as homology modeling (Methods in Enzymology, 203, 121-153). (1991)). Primary sequence of variable region of human immunoglobulin registered in Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) (three-dimensional structure derived from X-ray crystal structure is available) Comparison was made with the previously determined variable region of TINA1.
  • 1ZEA was selected as having the highest sequence homology among antibodies that are similarly defective in the framework to the variable region of the heavy chain of TINA1.
  • 3IU4 was also selected as having the highest sequence homology to the variable region of the light chain of TINA1.
  • the three-dimensional structure of the framework region was created by combining the coordinates of 1ZEA and 3IU4 corresponding to the heavy and light chains of TINA1 to obtain a “framework model”. A representative conformation for each CDR was then incorporated into the framework model.
  • an energy calculation was performed to eliminate adverse interatomic contacts. The above procedure was performed using a commercially available protein tertiary structure analysis program Discovery Studio (Accelrys, Inc.).
  • the amino acid residues in the framework region for HuPR1A3 were aligned with the amino acid residues for TINA1, and the positions where different amino acids were used were identified. The positions of these residues are analyzed using the three-dimensional model of TINA1 constructed above, and the donor residues to be graphed on the acceptor are described in Queen et. al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1000029-10033 (1989)).
  • the humanized TINA1 sequence was constructed as described in the examples below by transferring several selected donor residues into the acceptor antibody.
  • TINA1 heavy chain 6-2-1) hTINA1-H1 type heavy chain The amino acid number 21 (isoleucine) of the TINA1 heavy chain shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing is valine, amino acid number 28 (proline) is alanine, amino acid number 30 (leucine) is valine, and amino acid number 35 (glutamic acid).
  • amino acid number 36 to serine
  • amino acid number 38 arginine to lysine
  • amino acid number 39 isoleucine
  • amino acid number 57 (glutamine) to arginine
  • amino acid number 58 lysine
  • Glutamine amino acid number 59 (methionine) to alanine
  • amino acid number 62 to glutamine
  • amino acid number 65 (lysine) to glutamic acid
  • amino acid number 67 isoleucine
  • amino acid number 87 phenylalanine
  • amino acid number 89 (phenylalanine) to isoleucine, amino acid number 91 (leucine) to alanine, amino acid number 92 (glutamic acid) to aspartic acid, amino acid number 95 (alanine) to threonine, Amino acid number 102 (isoleucine) to leucine, amino acid number 104 (asparagine) to serine, amino acid number 107 (asparagine) to serine, amino acid number 111 (threonine) to alanine, amino acid number 112 (threonine) to valine,
  • the humanized TINA1 heavy chain designed with the replacement of amino acid number 114 (phenylalanine) with tyrosine, amino acid number 132 (alanine) with glutamine, and amino acid number 135 (alanine) with leucine is designated as “hTINA1”.
  • H1 was designated as type heavy chain ".
  • the amino acid sequence of the hTINA1-H1 type heavy chain is set forth in SEQ ID NO: 12 in the Sequence Listing.
  • the sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, the sequence consisting of amino acid residues 20 to 140, and the sequence consisting of amino acid residues 141 to 470 are a signal sequence and a heavy chain, respectively. It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 is described in SEQ ID NO: 11 of the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 57th nucleotides, the sequence consisting of the 58th to 420th nucleotides, and the sequence consisting of the 421th to 1410th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, respectively, are a signal sequence, a heavy chain variable region sequence, and a heavy chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 are also shown in FIG.
  • hTINA1-H2 type heavy chain The amino acid number 21 (isoleucine) of the TINA1 heavy chain shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing is valine, amino acid number 28 (proline) is alanine, amino acid number 30 (leucine) is valine, and amino acid number 35 (glutamic acid).
  • amino acid number 36 to serine
  • amino acid number 38 arginine to lysine
  • amino acid number 39 isoleucine
  • amino acid number 57 (glutamine) to arginine
  • amino acid number 58 lysine
  • Glutamine amino acid number 59 (methionine) to alanine
  • amino acid number 62 to glutamine
  • amino acid number 65 (lysine) to glutamic acid
  • amino acid number 67 isoleucine
  • amino acid number 87 phenylalanine
  • the amino acid sequence of the hTINA1-H2 type heavy chain is set forth in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, the sequence consisting of amino acid residues 20 to 140, and the sequence consisting of amino acid residues 141 to 470 are a signal sequence and a heavy chain, respectively. It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 is described in SEQ ID NO: 13 of the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 57th nucleotides, the sequence consisting of the 58th to 420th nucleotides, and the sequence consisting of the 421th to 1410th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 are a signal sequence, a heavy chain variable region sequence, and a heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 are also shown in FIG.
  • hTINA1-H3 type heavy chain Amino acid number 28 (proline) of TINA1 heavy chain shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing is alanine, amino acid number 30 (leucine) is valine, amino acid number 36 (threonine) is serine, and amino acid number 38 (arginine) is In lysine, amino acid number 39 (isoleucine) is valine, amino acid number 58 (lysine) is glutamine, amino acid number 65 (lysine) is glutamic acid, amino acid number 67 (isoleucine) is methionine, and amino acid number 87 (phenylalanine).
  • the amino acid sequence of the hTINA1-H3 type heavy chain is set forth in SEQ ID NO: 16 in the Sequence Listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues, and the sequence consisting of the 141st to 470th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 is described in SEQ ID NO: 15 of the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 57th nucleotides, the sequence consisting of the 58th to 420th nucleotides, and the sequence consisting of the 421th to 1410th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 are a signal sequence, a heavy chain variable region sequence, and a heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 are also shown in FIG.
  • TINA1 light chain 6-3-1) Humanization of TINA1 light chain 6-3-1) hTINA1-L1 type light chain: The amino acid number 23 (valine) of the TINA1 light chain shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is glutamine, amino acid number 28 (histidine) is proline, amino acid number 29 (lysine) is serine, and amino acid number 30 (phenylalanine).
  • amino acid number 31 (methionine) to leucine, amino acid number 33 (threonine) to alanine, amino acid number 40 (serine) to threonine, amino acid number 62 (glutamine) to lysine, amino acid number 63 (serine) Alanine, amino acid number 80 (aspartic acid) to serine, amino acid number 83 (threonine) to serine, amino acid number 90 (alanine) to aspartic acid, amino acid number 93 (phenylalanine) to leucine, amino acid number 98 (valine) ) To leucine, amino acid number Replacing 100 (alanine) with proline, amino acid number 103 (leucine) with phenylalanine, amino acid number 120 (alanine) with glutamine, amino acid number 126 (leucine) with isoleucine, and amino acid number 129 (alanine) with threonine.
  • the humanized TINA1 light chain designed with was named “hTINA1-L1 type light chain”.
  • the amino acid sequence of the hTINA1-L1 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing.
  • a sequence consisting of amino acid residues 1 to 20 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, a sequence consisting of amino acid residues 21 to 129, and a sequence consisting of amino acid residues 130 to 234 are a signal sequence and a light chain, respectively. It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 is described in SEQ ID NO: 17 of the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 60th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17, the sequence consisting of the 61st to 387th nucleotides, the sequence consisting of the 388th to 702th nucleotides are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 are also shown in FIG.
  • hTINA1-L2 type light chain The amino acid number 28 (histidine) of the TINA1 light chain shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is proline, amino acid number 29 (lysine) is serine, amino acid number 30 (phenylalanine) is serine, and amino acid number 31 (methionine) is Leucine, amino acid number 33 (threonine) to alanine, amino acid number 40 (serine) to threonine, amino acid number 62 (glutamine) to lysine, amino acid number 63 (serine) to alanine, amino acid number 80 (aspartic acid) Amino acid number 83 (threonine) as serine, amino acid number 90 (alanine) as aspartic acid, amino acid number 93 (phenylalanine) as leucine, amino acid number 98 (valine) as leucine, amino acid number 100 (alanine) ) To proline, amino acid No.
  • hTINA1-L2 type light chain The amino acid sequence of the hTINA1-L2 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 20 in the sequence listing.
  • a sequence consisting of amino acid residues 1 to 20 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, a sequence consisting of amino acid residues 21 to 129, and a sequence consisting of amino acid residues 130 to 234 are a signal sequence and a light chain, respectively.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 is described in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 60th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19, the sequence consisting of the 61st to 387th nucleotides, the sequence consisting of the 388th to 702th nucleotides are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 are also shown in FIG.
  • hTINA1-L3 type light chain The amino acid number 28 (histidine) of the TINA1 light chain shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is proline, amino acid number 29 (lysine) is serine, amino acid number 30 (phenylalanine) is serine, and amino acid number 31 (methionine) is Leucine, amino acid number 33 (threonine) to alanine, amino acid number 40 (serine) to threonine, amino acid number 62 (glutamine) to lysine, amino acid number 63 (serine) to glutamine, amino acid number 80 (aspartic acid) Amino acid number 83 (threonine) as serine, amino acid number 90 (alanine) as aspartic acid, amino acid number 93 (phenylalanine) as leucine, amino acid number 98 (valine) as leucine, amino acid number 100 (alanine) ) To proline, amino Humanized TINA1 light designed to replace number
  • the chain was named “hTINA1-L3 type light chain”.
  • the amino acid sequence of the hTINA1-L3 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of amino acid residues 1 to 20 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, the sequence consisting of amino acid residues 21 to 129, and the sequence consisting of amino acid residues 130 to 234 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 is described in SEQ ID NO: 21 of the Sequence Listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 60th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21, the sequence consisting of the 61st to 387th nucleotides, the sequence consisting of the 388th to 702th nucleotides are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 are also shown in FIG.
  • Example 7 Construction of hTINA1 antibody expression vector and production of antibody
  • 7-1) Construction of hTINA1 heavy chain expression vector 7-1-1)
  • a DNA fragment containing a DNA sequence encoding the variable region of H1 was synthesized (Geneart Artificial Gene Synthesis Service).
  • hTINA1-H1 expression vector was constructed by inserting the expression vector pCMA-G1 into the site cleaved with the restriction enzyme BlpI using an In-Fusion HD PCR cloning kit (CLONTECH). The obtained expression vector was designated as “pCMA-G1 / hTINA1-H1”.
  • hTINA1-H2 Expression Vector DNA comprising a DNA sequence encoding the variable region of hTINA1-H2 shown in nucleotide numbers 36 to 437 of the nucleotide sequence of hTINA1-H2 shown in SEQ ID NO: 13 of the Sequence Listing Fragments were synthesized (GENEART Artificial Gene Synthesis Service), and an hTINA1-H2 expression vector was constructed in the same manner as in Example 7-1-1). The resulting expression vector was named “pCMA-G1 / hTINA1-H2”.
  • hTINA1-L1 expression vector was constructed by inserting pCMA-LK into a site cut with the restriction enzyme BsiWI using an In-Fusion HD PCR cloning kit (CLONTECH). The obtained expression vector was designated as “pCMA-LK / hTINA1-L1”.
  • hTINA1-L2 expression vector DNA comprising a DNA sequence encoding the variable region of hTINA1-L2 shown in nucleotide numbers 38 to 402 of the nucleotide sequence of hTINA1-L2 shown in SEQ ID NO: 19 of the Sequence Listing Fragments were synthesized (GENEART Artificial Gene Synthesis Service), and an hTINA1-L2 expression vector was constructed in the same manner as in Example 7-2-1). The obtained expression vector was designated as “pCMA-LK / hTINA1-L2”.
  • hTINA1 antibody 7-3-1) Production and purification of hTINA1 antibody 7-3-1) Small-scale production of hTINA1 antibody Production was carried out in the same manner as in Example 5-2-5).
  • the hTINA1 antibody obtained by the combination of pCMA-G1 / hTINA1-H1 and pCMA-LK / hTINA1-L1 is represented by “hTINA1-H1L1”, the combination of pCMA-G1 / hTINA1-H2 and pCMA-LK / hTINA1-L1.
  • the obtained hTINA1 antibody was designated as “hTINA1-H2L1,” and pCMA-G1 / hTINA1-H2 and the combination of pCMA-LK / hTINA1-L2 were designated as hTINA1 antibody as “hTINA1-H2L2,” and pCMA-G1 / hTINA1-
  • the hTINA1 antibody obtained by the combination of H3 and pCMA-LK / hTINA1-L3 was named “hTINA1-H3L3”.
  • hTINA1 antibody hTINA1-H1L1, hTINA1-H2L1, hTINA1-H2L2, and hTINA1-H3L3 were produced by the following method.
  • FreeStyle 293F cells (Invitrogen) were subcultured and cultured according to the manual. 1.2 ⁇ 10 9 cells of FreeStyle 293F cells in the logarithmic growth phase (Invitrogen) were seeded in 3L Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING Inc.), FreeStyle293 expression medium was diluted with (Invitrogen, Inc.) 1.0 ⁇ 10 6 cells / Ml, and cultured with shaking at 90 rpm in an 8% CO 2 incubator at 37 ° C.
  • hRS7 antibody light chain expression vector The DNA sequence encoding the variable region of the hRS7 antibody light chain shown in nucleotide numbers 38 to 402 of the nucleotide sequence of the hRS7 antibody light chain shown in SEQ ID NO: 31 in the sequence listing is included. A DNA fragment was synthesized (GENEART, an artificial gene synthesis service), and an hRS7 antibody light chain expression vector was constructed in the same manner as in Example 7-2-1). The obtained expression vector was named “pCMA-LK / hRS7”. The amino acid sequence of the hRS7 antibody heavy chain is shown in SEQ ID NO: 32 in the Sequence Listing.
  • hRS7 antibody 1-3-1 Production and purification of hRS7 antibody 1-3-1) Production of hRS7 antibody
  • the hRS7 antibody is obtained by combining pCMA-G1 / hRS7 and pCMA-LK / hRS7 in the same manner as in Example 7-3-2). Produced in.
  • Example 8 Measurement of antigen-binding ability of hTINA1 antibody and hRS7 antibody
  • 8-1) Measurement of antigen binding ability using small-scale production antibody (culture supernatant) Dissociation constant measurement of antibody and antigen (Recombinant Human TROP-2 Fc chimera) was performed using Biacore 3000 (GE Healthcare Bioscience ( The antibody was captured (captured) with an immobilized anti-human IgG (Fab) antibody as a ligand, and the antigen was measured as an analyte.
  • Biacore 3000 GE Healthcare Bioscience
  • An anti-human IgG (Fab) antibody (Human Fab capture kit, GE Healthcare Biosciences) was covalently bound to a sensor chip CM5 (BIAcore, Inc.) by an amine coupling method at about 2000 RU.
  • the reference cell was similarly fixed.
  • HBS-EP + (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Surfactant P20) was used as a running buffer. After adding the culture supernatant containing the antibody for about 80 seconds on the chip on which the anti-human IgG (Fab) antibody is immobilized, a dilution series solution of the antigen (1-1000 nM) is added for 300 seconds at a flow rate of 30 ⁇ l / min.
  • the dissociation phase for 600 seconds was monitored.
  • 10 mM Gly-HCl pH 1.5 containing 20% DMSO was added at a flow rate of 10 ⁇ l / min for 60 seconds.
  • HBS-EP + (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Surfactant P20) was used as a running buffer.
  • a dilution series solution (1-1000 nM) of the antigen is added at a flow rate of 30 ⁇ l / min for 300 seconds, and then dissociated for 600 seconds. The phase was monitored.
  • 25 mM NaOH diluted with a running buffer was added twice for 3 seconds at a flow rate of 100 ⁇ l / min. Data analysis was performed by the above method.
  • Step 1 tert-butyl (4- ⁇ [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15 -Hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6,7] indolidino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino ⁇ -4-oxobutyl) carbamate 4- (tert- Butoxycarbonylamino) butanoic acid (0.237 g, 1.13 mmol) was dissolved in dichloromethane (10 mL), N-hydroxysuccinimide (0.130 g, 1.13 mmol), and 1-ethyl-3- (3-dimethylamino).
  • Step 2 4-amino-N-[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- Hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ′, 4 ′: 6,7] indolidino [1,2-b] quinolin-1-yl] butanamide trifluoroacetate
  • Compound obtained in Step 1 above 0.388 g, 0.61 mmol
  • dichloromethane 9 mL
  • Trifluoroacetic acid 9 mL
  • Step 3 N- (tert-Butoxycarbonyl) glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (4- ⁇ [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-Dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ′, 4 ′: 6,7] indolidino [1,2-b] quinoline-1- Yl] amino ⁇ -4-oxobutyl) glycinamide N- (tert-butoxycarbonyl) glycylglycyl-L-phenylalanylglycine (0.081 g, 0.19 mmol) was dissolved in dichloromethane (3 mL) to give N-hydroxysuccinimide ( 0.021 g, 0.19 mol) and 1-ethyl-3- (3-dimethylamino
  • Step 4 Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (4- ⁇ [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3 9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ′, 4 ′: 6,7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino ⁇ -4-oxobutyl ) Glycinamide trifluoroacetate
  • the compound obtained in Step 3 above (1.97 g, 2.10 mmol) was dissolved in dichloromethane (7 mL).
  • Trifluoroacetic acid (7 mL) was added and stirred for 1 hour.
  • the title compound (1.97 g, 99%) was obtained.
  • Step 5 N- ⁇ 3- [2- (2- ⁇ [3- (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) propanoyl] amino ⁇ ethoxy) ethoxy] propanoyl ⁇ glycylglycyl -L-phenylalanyl-N- (4- ⁇ [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ′, 4 ′: 6,7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino ⁇ -4-oxobutyl) glycinamide To a solution of the compound obtained in Step 4 (100 mg, 0.119 mmol) in N, N-dimethylformamide (1.20 mL), diisopropylethyl
  • Step 6 Antibody-drug conjugate (1)
  • Antibody reduction 10 mg of hTINA1-H1L1 prepared in Example 7 in PBS 6.0 / EDTA using common procedure B (using 1.54 as the 280 nm extinction coefficient) and C described in Production Method 1 / ML.
  • This solution (10.0 mL) was collected in a 50 mL tube, and a 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) aqueous solution (0.317 mL; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M dipotassium hydrogen phosphate aqueous solution (Nacalai) Tesque, Inc .; 0.500 mL) was added.
  • TCEP Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • Step 1 Antibody-drug conjugate (2)
  • Antibody reduction 10 mg of hTINA1-H1L1 prepared in Example 7 in PBS 6.0 / EDTA using common procedure B (using 1.54 as the 280 nm extinction coefficient) and C described in Production Method 1 / ML.
  • This solution (2.00 mL) was collected in a 4 mL tube, and a 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) aqueous solution (0.0690 mL; 5.0 equivalents for one antibody molecule) and a 1 M dipotassium hydrogen phosphate aqueous solution (Nacalai) Tesque, Inc .; 0.100 mL) was added.
  • TCEP Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • Step 1 Antibody-drug conjugate (3)
  • Antibody reduction 10 mg of hTINA1-H1L1 prepared in Example 7 in PBS 6.0 / EDTA using common procedure B (using 1.54 as the 280 nm extinction coefficient) and C described in Production Method 1 / ML.
  • This solution 5.0 mL was collected in a 15 mL container, and a 1 M aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0813 mL) was added with stirring, followed by stirring at 37 ° C. for 10 minutes.
  • Step 1 Antibody-drug conjugate (4) Antibody reduction:
  • the hTINA1-H1L1 prepared in Example 7 was treated with PBS 6.0 / EDTA using the common procedure B described in Production Method 1 (using 1.54 as the 280 nm extinction coefficient) and C.
  • This solution (5.00 mL) was collected in a 15 mL container, and 1 M aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0813 mL) was added with stirring, followed by stirring at 37 ° C. for 10 minutes.
  • Step 1 Antibody-drug conjugate (5)
  • TCEP Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • Step 1 ( ⁇ N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] glycyl ⁇ amino) methyl acetate N-9-fluorenylmethoxycarbonylglycylglycine (4.33 g, 12.2 mmol), tetrahydrofuran (120 ml ) And toluene (40.0 ml) were added pyridine (1.16 ml, 14.7 mmol and lead tetraacetate (6.84 g, 14.7 mmol), and the mixture was heated to reflux for 5 hours.
  • Step 2 Benzyl [( ⁇ N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] glycyl ⁇ amino) methoxy] acetate
  • the compound obtained in Step 1 above (3.68 g, 10.0 mmol) and benzyl glycolate (4
  • potassium tert-butoxide (2.24 g, 20.0 mmol) was added to the reaction solution at 0 ° C., and the mixture was extracted with ethyl acetate and chloroform.
  • Step 3 [( ⁇ N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] glycyl ⁇ amino) methoxy] acetic acid
  • the compound obtained in Step 2 above (1.88 g, 3.96 mmol) was ethanol (40.0 mL). , Dissolved in ethyl acetate (20.0 ml). Palladium carbon catalyst (376 mg) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours under a hydrogen atmosphere. Insoluble materials were removed by Celite filtration, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain the title compound (1.52 g, quantitative) as a colorless solid.
  • Step 4 9H-fluoren-9-ylmethyl (2- ⁇ [(2- ⁇ [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2, 3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ′, 4 ′: 6,7] indolidino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino ⁇ -2 -Oxoethoxy) methyl] amino ⁇ -2-oxoethyl) carbamate Under ice-cooling, exatecan mesylate (0.283 g, 0.533 mmol), N-hydroxysuccinimide (61.4 mg, 0.533 mmol), and the above steps To a solution of the compound obtained in 3 (0.205 g, 0.533 mmol) in N, N-dimethylformamide (10.0 mL), N, N-diisopropylethylamine (92
  • Step 5 N-[(2- ⁇ [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15 -Hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6,7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino ⁇ -2-oxoethoxy) methyl] glycinamide Piperidine (1.1 mL) was added to a solution of the compound obtained in step 4 (0.881 g, 1.10 mmol) in N, N-dimethylformamide (11.0 mL), and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a mixture containing the title compound. This mixture was used in the next reaction without further purification.
  • Step 6 N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2- ⁇ [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy -4-Methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ′, 4 ′: 6,7] indolidino [1,2 -B] quinolin-1-yl] amino ⁇ -2-oxoethoxy) methyl] glycinamide Under ice-cooling, the mixture obtained in Step 5 above (0.439 mmol), N-hydroxysuccinimide (0.101 g, 0.878 mmol) ), And N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] glycylglycyl
  • Step 7 Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2- ⁇ [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3 , 9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ′, 4 ′: 6,7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino ⁇ -2- Oxoethoxy) methyl] glycinamide Piperidine (0.251 mL, 2.53 mmol) was added to a solution of the compound obtained in Step 6 (0.269 g, 0.253 mmol) in N, N-dimethylformamide (4.00 mL). And stirred at room temperature for 2 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a mixture containing the title compound. This mixture was used in the next reaction without further purification.
  • Step 8 N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl] glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2- ⁇ [(1S, 9S) -9-Ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6,7] Indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino ⁇ -2-oxoethoxy) methyl] glycinamide N of the compound obtained in Step 7 above (0.253 mmol) To a solution of N-dimethylformamide (10.0 mL) was added N-succinimidyl 6-maleimidohexanoate (0.156 g, 0.506 mmol), and the
  • Step 9 Antibody-drug conjugate (6)
  • Antibody reduction 10 mg of hTINA1-H1L1 prepared in Example 7 in PBS 6.0 / EDTA using common procedure B (using 1.54 as the 280 nm extinction coefficient) and C described in Production Method 1 / ML.
  • This solution (10.0 mL) was collected in a 50 mL tube, and a 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) aqueous solution (0.317 mL; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M dipotassium hydrogen phosphate aqueous solution (Nacalai) Tesque, Inc .; 0.500 mL) was added.
  • TCEP Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • Step 1 Antibody-drug conjugate (7)
  • Antibody reduction 10 mg of hTINA1-H1L1 prepared in Example 7 in PBS 6.0 / EDTA using common procedure B (using 1.54 as the 280 nm extinction coefficient) and C described in Production Method 1 / ML.
  • This solution (2.0 mL) was collected in a 4 mL tube, and a 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) aqueous solution (0.0690 mL; 5.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M dipotassium hydrogen phosphate aqueous solution (Nacalai) Tesque, Inc .; 0.0299 mL) was added.
  • TCEP Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • Step 1 Antibody-drug conjugate (8)
  • Antibody reduction 10 mg of hTINA1-H1L1 prepared in Example 7 in PBS 6.0 / EDTA using common procedure B (using 1.54 as the 280 nm extinction coefficient) and C described in Production Method 1 / ML.
  • This solution (30.0 mL) was collected in a 100 mL container, and 1 M aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc .; 0.4875 mL) was added with stirring, followed by stirring at 37 ° C. for 10 minutes.
  • Step 1 Antibody-drug conjugate (9)
  • Antibody reduction 10 mg of hTINA1-H1L1 prepared in Example 7 in PBS 6.0 / EDTA using common procedure B (using 1.54 as the 280 nm extinction coefficient) and C described in Production Method 1 / ML.
  • This solution 5.0 mL was collected in a 15 mL container, and a 1 M aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0813 mL) was added with stirring, followed by stirring at 37 ° C. for 10 minutes.
  • Step 1 Antibody-drug conjugate (10)
  • Antibody reduction hRS7 prepared in Reference Example 1 was prepared at 10 mg / mL in PBS 6.0 / EDTA using the common procedure B (using 1.56 as the 280 nm extinction coefficient) and C described in Production Method 1.
  • This solution (2.0 mL) was collected in a 4 mL tube, and a 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) aqueous solution (0.0690 mL; 5.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M dipotassium hydrogen phosphate aqueous solution (Nacalai) Tesque, Inc .; 0.0299 mL) was added.
  • TCEP Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • Step 1 tert-butyl [2- (2- ⁇ [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ′, 4 ′: 6,7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino ⁇ -2-oxoethoxy) ethyl] Carbamate Exatecan Mesylate (3.10 g, 5.47 mol) was replaced with 4- (tert-butoxycarbonylamino) butanoic acid instead of ⁇ 2-[(tert-butoxycarbonyl) amino] ethoxy ⁇ acetic acid (J.
  • Step 2 2- (2-Aminoethoxy) -N-[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10 , 13,15-Hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ′, 4 ′: 6,7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] acetamide trifluoroacetate salt
  • the obtained compound (1.50 g, 2.36 mol) was reacted in the same manner as in Step 2 of Example 1 to obtain the title compound (1.50 g, quantitative) as a pale yellow solid.
  • Step 3 N- (tert-Butoxycarbonyl) glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- [2- (2- ⁇ [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl -10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6,7] indolidino [1,2-b] quinoline -1-yl] amino ⁇ -2-oxoethoxy) ethyl] glycinamide
  • the compound obtained in Step 2 above (554 mg, 0.85 mmol) was reacted in the same manner as in Step 3 of Example 1 to give the title compound (775 mg, 95%).
  • Step 4 Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- [2- (2- ⁇ [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2 , 3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ′, 4 ′: 6,7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino ⁇ - 2-Oxoethoxy) ethyl] glycinamide trifluoroacetate
  • the compound obtained in Step 3 (630 mg, 0.659 mmol) was reacted in the same manner as in Step 4 of Example 1 to give the title compound (588 mg, 92%).
  • Step 5 N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl] glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- [2- (2- ⁇ [( 1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ′, 4 ′: 6,7] Indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino ⁇ -2-oxoethoxy) ethyl] glycinamide Compound obtained in Step 4 above (240 mg, 0.247 mmol ), Triethylamine (31.4 ⁇ L, 0.22 mmol) instead of diisopropylethylamine, 3- (2- (2- (3-maleimidopropanamid
  • Step 6 Antibody-drug conjugate (11)
  • Antibody reduction 10 mg of hTINA1-H1L1 prepared in Example 7 in PBS 6.0 / EDTA using common procedure B (using 1.54 as the 280 nm extinction coefficient) and C described in Production Method 1 / ML.
  • This solution (3.0 mL) was collected in a 15 mL container, and 1 M aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0488 mL) was added with stirring, followed by stirring at 37 ° C. for 10 minutes.
  • Antibody concentration 1.93 mg / mL, antibody yield: 27.0 mg (90%), drug average binding number per antibody molecule (n) measured in common operation E: 7.1; in common operation F The average number of drugs bound per molecule of antibody measured (n): 7.0.
  • Step 1 Antibody-drug conjugate (12)
  • This solution (10.0 mL) was collected in a 50 mL tube, and a 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) aqueous solution (0.317 mL; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M dipotassium hydrogen phosphate aqueous solution (Nacalai) Tesque, Inc .; 0.500 mL) was added.
  • TCEP Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • Step 1 Antibody-drug conjugate (13)
  • Antibody reduction Using hTINA1-H1L1 prepared in Example 7 with the common procedure B (using 1.54 as the 280 nm extinction coefficient) and C described in Production Method 1, the medium was changed to PBS 6.0 / EDTA. Substitution was made to an antibody concentration of 10 mg / mL. This solution (100 mL) was put into a polycarbonate 250 mL Erlenmeyer flask container, and 1 M aqueous solution of dipotassium hydrogenphosphate (1.4 mL) was added at room temperature with stirring with a magnetic stirrer, and then 10 mM TCEP aqueous solution (1.62 mL; 2.5 equivalents to molecule).
  • an ultrafiltration membrane Merck, Pellicon XL Cassette, Ultracell 30 KDa
  • a tube pump US Coal Palmer Master Flex Pump model 77521-40, a pump head model 7518-00
  • a tube US
  • Ultrafiltration was performed using an ultrafiltration apparatus composed of Cole Palmer Master Flex Tube L / S16). That is, by performing ultrafiltration purification while adding ABS (a total of 1600 mL) as a purification buffer to the reaction solution, unbound drug linkers and other low molecular weight reagents are removed and the buffer solution is replaced with ABS. And further concentrated.
  • All antibody-drug conjugates were diluted with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory) and administered at a volume of 10 mL / kg into the tail vein.
  • 2 ⁇ 10 6 cells in which human colon cancer cell line COLO205 purchased from ATCC is suspended in physiological saline are subcutaneously implanted into the right flank of female BALB / c-nu / nu mice (Day 0), and randomly grouped on Day 7 Divided.
  • Antibody-drug conjugates (1), (6), and (12) were administered into Day 7, 14, and 21 via the tail vein at a dose of 10 mg / kg.
  • hTINA1-H1L1 antibody and hRS7 antibody to which no drug was bound were similarly administered at a dose of 25 mg / kg.
  • ADC antitumor effect (2) Human pancreatic adenocarcinoma cell line Bx-PC3 purchased from ATCC was transplanted into female BALB / c-nu / nu mice, and solid passage tumor pieces were subcutaneously transplanted into the right flank of female BALB / c-nu / nu mice. (Day 0), Day 16 was randomly grouped. Antibody-drug conjugates (1), (6), and (12) were all administered to Day 16, 23, 30 at a dose of 10 mg / kg via the tail vein. As negative controls, hTINA1-H1L1 antibody and hRS7 antibody to which no drug was bound were similarly administered at a dose of 25 mg / kg. The administration of the antibody-drug conjugates (1) and (6) significantly reduced the tumor volume compared to the administration of the antibody-drug conjugate (12), and both exhibited a tumor growth inhibitory effect (FIG. 14).
  • Example 21-d ADC antitumor effect (4)
  • COLO205 was subcutaneously transplanted into female BALB / c-nu / nu mice (Day 0), and random grouping was performed on Day 11.
  • antibody-drug conjugates (2) and (5) were all administered at 10 mg / kg
  • antibody-drug conjugates (7) and (10) were all administered at 3 mg / kg via the tail vein. All of the administrations of antibody-drug conjugates (2), (5), (7), and (10) exhibited a tumor growth inhibitory effect (FIG. 16).
  • Example 21-e Antitumor effect of ADC (5)
  • Bx-PC3 was subcutaneously transplanted into female BALB / c-nu / nu mice (Day 0), and randomized grouping was performed on Day 25.
  • Antibody-drug conjugates (2), (5), (7), and (10) were all administered to Day 25 and 32 via the tail vein at a dose of 3 mg / kg. All of the administrations of antibody-drug conjugates (2), (5), (7), and (10) exhibited a tumor growth inhibitory effect (FIG. 17).
  • Example 21-g ADC antitumor effect (7)
  • Bx-PC3 was subcutaneously transplanted into female BALB / c-nu / nu mice (Day 0), and Day 21 was randomly grouped.
  • antibody-drug conjugates (3), (4), (8), (9) were all administered into the tail vein at a dose of 3 mg / kg. All of the antibody-drug conjugates (3), (4), (8), and (9) exhibited a tumor growth inhibitory effect (FIG. 19).
  • ADC antitumor effect 9
  • Human gastric cancer cell line NCI-N87 1 ⁇ 10 7 cells purchased from ATCC was suspended in physiological saline, subcutaneously implanted into female BALB / c-nu / nu mice (Day 0), and randomly grouped on Day 6 did.
  • Antibody-drug conjugates (3), (4), (8), and (9) were all administered to Day 6 via the tail vein at a dose of 3 mg / kg. All of the administrations of antibody-drug conjugates (3), (4), (8), and (9) exhibited a tumor growth inhibitory effect (FIG. 21).
  • ADC antitumor effect (11) Human pharyngeal carcinoma cell line FaDu 3 ⁇ 10 6 cells purchased from ATCC was suspended in physiological saline, subcutaneously implanted into female BALB / c-nu / nu mice (Day 0), and randomized to Day 11 .
  • Antibody-drug conjugates (3), (4), (8), and (9) were all administered to Day 11 via the tail vein at a dose of 3 mg / kg. All of the antibody-drug conjugates (3), (4), (8), and (9) exhibited a tumor growth inhibitory effect (FIG. 23).
  • Example 21-m Antitumor effect of ADC (13)
  • CFPAC-1 was subcutaneously transplanted into female BALB / c-nu / nu mice (Day 0), and grouping was performed randomly on Day 14.
  • antibody-drug conjugates (8) and (13) were all administered into the tail vein at a dose of 1 mg / kg. Both administrations of antibody-drug conjugates (8) and (13) exhibited a tumor growth inhibitory effect (FIG. 25).
  • BxPC3 and NCI-H292 are RPMI 1640 Medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum (Moregate), NIH: OVCAR-3 is RPMI 1640 Medium containing 20% fetal bovine serum and 0.01 mg / mL Insulin (Invitrogen), CFPAC-1 is Iscove's Modified Dulbecco's Medium (Gibco) containing 10% fetal calf serum, and FaDu, Calu-3 and Calu-6 are Eagle's Minimum Essential Medium (ATCC) containing 10% fetal bovine serum.
  • Gibco fetal bovine serum
  • Ad Eagle's Minimum Essential Medium
  • CaOV3 and A375 are Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum, each 2.2 ⁇ 1 It was prepared in 6 cells / mL, and seeded each 90 ⁇ L microplate for 96-well cell culture. Add 10 ⁇ L each of RPMI1640 Medium to antibody-drug conjugate (4), (8) diluted for 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0.8 nM, 0.16 nM, 0.032 nM, 0.0064 nM with RPMI1640 Medium or for comparison. Then, the cells were cultured for 6 days at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Cell growth inhibition rate (%) a ⁇ b ⁇ 100 a: Average value of sample-added wells after 6 days of culture-Average value of wells without sample added at the start of culture b: Average value of wells added with medium after 6 days of culture-Average value of wells without sample added at the start of culture
  • the GI 50 value was calculated by the following formula.
  • GI 50 (nM) antilog ((50 ⁇ f) ⁇ (LOG 10 (d) ⁇ LOG 10 (c)) ⁇ (fe) + LOG 10 (d)) c: specimen concentration c d: specimen concentration d e: Cell growth inhibition rate at sample concentration c f: Cell growth inhibition rate c at sample concentration d, d is c> d at two points sandwiching 50% cell growth inhibition rate.
  • Antibody-drug conjugates (4) and (8) have a GI 50 against TROP2 antigen positive cell lines BxPC3, NCI-H292, NIH: OVCAR-3, CFPAC-1, FaDu, Calu-3, CaOV3. An anti-cell effect of ⁇ 1 (nM) was shown. On the other hand, no anti-cell effect was shown against Calu-6, A375, which is a TROP2 antigen negative cell line (> 100 (nM)).
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of heavy chain of TINA1 antibody
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of variable region of heavy chain of TINA1 antibody
  • SEQ ID NO: 3 cDNA encoding variable region of light chain of TINA1 antibody
  • Nucleotide sequence SEQ ID NO: 4 amino acid sequence of the light chain variable region of TINA1 antibody
  • SEQ ID NO: 5 nucleotide sequence encoding human ⁇ chain secretion signal and human ⁇ chain constant region
  • SEQ ID NO: 6 human heavy chain secretion signal and human IgG1
  • SEQ ID NO: 9 cTINA1 antibody light chain nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 10 cTINA1 antibody light chain amino acid
  • SEQ ID NO: 11 hTINA

Abstract

抗腫瘍効果と安全性面に優れる、優れた治療効果を有する抗腫瘍薬の提供。　次式で示される抗腫瘍性化合物と抗ＴＲＯＰ２抗体とを、次式： -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- で示される構造のリンカーを介して結合させたことを特徴とする抗体－薬物コンジュゲート（抗ＴＲＯＰ２抗体はL1の末端において結合し、抗腫瘍性化合物は、１位のアミノ基の窒素原子を結合部位として、-(CH2)n2-C(=O)-部分のカルボニル基に結合する）を提供する。

Description

抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲート
　本発明は、抗ＴＲＯＰ２抗体と抗腫瘍性薬物とをリンカー構造部分を介して結合させた、抗腫瘍薬として有用な抗体－薬物コンジュゲートに関する。
　癌細胞表面に発現し、かつ細胞に内在化できる抗原に結合する抗体に、細胞毒性を有する薬物を結合させた抗体－薬物コンジュゲート（Antibody-Drug Conjugate；ADC）は、癌細胞に選択的に薬物を送達できることによって、癌細胞内に薬物を蓄積させ、癌細胞を死滅させることが期待できる（非特許文献１～３参照）。ADCとして例えば、抗CD33抗体にカリチアマイシンを結合させたMylotarg（登録商標；ゲムツズマブオゾガマイシン）が急性骨髄性白血病の治療薬として認可されている。また、抗CD30抗体にオーリスタチンＥを結合させたAdcetris（登録商標；ブレンツキシマブベドティン）がホジキンリンパ腫と未分化大細胞リンパ腫の治療薬として最近認可された（非特許文献４参照）。これまでに認可されたADCに含有される薬物は、DNA又はチューブリンを標的としている。
　抗腫瘍性の低分子化合物としてトポイソメラーゼＩを阻害して抗腫瘍作用を発現する化合物であるカンプトテシン誘導体が知られている。その中で下式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
で示される抗腫瘍性化合物（エキサテカン、化学名：(1S,9S)-1-アミノ-9-エチル-5-フルオロ-2,3-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-10,13(9H,15H)-ジオン）は、水溶性のカンプトテシン誘導体である（特許文献１、２）。この化合物は、現在臨床で用いられているイリノテカンとは異なり、抗腫瘍効果の発現には酵素による活性化を必要としない。また、イリノテカンの薬効本体であるSN-38や、同じく臨床で用いられているトポテカンよりもトポイソメラーゼＩ阻害活性が強く、in vitroで種々の癌細胞に対して、より強い殺細胞活性を有している。特にP-glycoproteinの発現によってSN-38等に耐性を示す癌細胞に対しても効果を示した。また、マウスのヒト腫瘍皮下移植モデルでも強い抗腫瘍効果を示し、臨床試験が行われたものの上市には至っていない（非特許文献５～１０参照）。エキサテカンがADCとして有効に作用するかについては明らかではなかった。
　DE-310は、生分解性のカルボキシメチルデキストランポリアルコールポリマーにエキサテカンを、GGFGペプチドスペーサーを介して結合させた複合体である（特許文献３）。エキサテカンを高分子プロドラッグ化することによって、高い血中滞留性を保持させ、さらに腫瘍新生血管の透過性の亢進と腫瘍組織滞留性を利用して、受動的に腫瘍部位への指向性を高めたものである。DE-310は、酵素によるペプチドスペーサーの切断によって、活性本体であるエキサテカン、及びグリシンがアミノ基に結合しているエキサテカンが持続的に遊離され、その結果薬物動態が改善される。非臨床試験における種々の腫瘍の評価モデルにおいて、DE-310は、ここに含まれるエキサテカンの総量がエキサテカン単剤の投与時よりも減少しているのにも拘らず、単剤の投与時よりもより高い有効性を示した。DE-310に関しては臨床試験が実施されて有効例も確認され、活性本体が正常組織よりも腫瘍に集積することが確認されたとの報告がある一方、ヒトにおける腫瘍へのDE-310及び活性本体の集積は正常組織への集積と大差なく、ヒトでは受動的なターゲティングは見られなかったとの報告もある（非特許文献１１～１４参照）。結果としてDE-310も上市には至らず、エキサテカンがこの様なターゲティングを指向した薬物として有効に機能するかについては明らかではなかった。
　DE-310の関連化合物として、-NH-(CH2)4-C(=O)-で示される構造部分を-GGFG-スペーサーとエキサテカンの間に挿入し、-GGFG-NH-(CH2)4-C(=O)-をスペーサー構造とする複合体も知られているが（特許文献４）、同複合体の抗腫瘍効果については全く知られていない。
　ヒトＴＲＯＰ２（ＴＡＣＳＴＤ２：ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ　２，ＧＡ７３３－１，ＥＧＰ－１，Ｍ１Ｓ１；以下、ｈＴＲＯＰ２と表記する）は、３２３アミノ酸残基からなる１回膜貫通型の１型細胞膜蛋白質である。以前より、ヒト栄養膜細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓ）と癌細胞に共通する、免疫抵抗性に関与する細胞膜蛋白質の存在（非特許文献１５）が示唆されていたが、ヒト絨毛癌細胞株の細胞膜蛋白質に対するモノクローナル抗体（１６２－２５．３，１６２－４６．２）により認識される抗原分子が特定され、ヒト栄養膜細胞に発現する分子の一つとしてＴＲＯＰ２と命名された（非特許文献１６）。後に同じ分子が他の研究者によって発見され、胃癌細胞株を免疫して得られたマウスモノクローナル抗体ＧＡ７３３によって認識される腫瘍抗原ＧＡ７３３－１（非特許文献１７）、非小細胞肺癌細胞免疫によって得られたマウスモノクローナル抗体ＲＳ７－３Ｇ１１により認識される上皮糖蛋白質（ＥＧＰ－１；非特許文献１８）とも呼ばれたが、１９９５年にＴＲＯＰ２遺伝子がクローニングされ、これらが同一の分子であることが確認された（非特許文献１９）。ｈＴＲＯＰ２のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は公的データベース上に公開されており、例えばＮＭ＿００２３５３，ＮＰ＿００２３４４（ＮＣＢＩ）等のアクセッション番号により参照可能である。
　ｈＴＲＯＰ２遺伝子は約５０％の相同性を持つヒトＴｒｏｐ－１（ＥｐＣＡＭ，ＥＧＰ－２，ＴＡＣＳＴＤ１）と共にＴＡＣＳＴＤ遺伝子ファミリーを構成している（非特許文献２１）。ｈＴＲＯＰ２蛋白質は、Ｎ末端２６アミノ酸残基から成るシグナル配列、２４８アミノ酸残基から成る細胞外ドメイン、２３アミノ酸残基から成る細胞膜貫通ドメイン、２６アミノ酸残基から成る細胞内ドメインで構成されている。細胞外ドメインには４つのＮ結合型糖鎖付加部位があり、見かけ上の分子量は理論計算値３５キロダルトンより１０キロダルトン前後増加することが知られている（非特許文献１９）。
　これまでｈＴＲＯＰ２の生理学的リガンドは同定されておらず、分子機能は明らかにされていないが、腫瘍細胞においてカルシウムシグナルを伝達することが示され（非特許文献２０）、またＣａ2+依存性キナーゼであるプロテインキナーゼＣにより細胞内セリン３０３残基がリン酸化されること（非特許文献１８）や、細胞内ドメインにＰＩＰ2結合配列を有することから、腫瘍細胞におけるシグナル伝達機能が示唆されている（非特許文献２２）。
　臨床検体を用いた免疫組織化学解析により、ｈＴＲＯＰ２は種々の上皮細胞癌種において過剰発現していること、かつ、正常組織においてはいくつかの組織の上皮細胞での発現に限られ、その発現量も腫瘍組織と比較して低いことが示されている（非特許文献２３～２７）。またｈＴｒｏｐ２の発現は大腸癌（非特許文献２３）、胃癌（非特許文献２４）、膵臓癌（非特許文献２５）、口腔癌（非特許文献２６）、グリオーマ（非特許文献２７）において予後不良と相関することも報告されている。
　さらに大腸癌細胞を用いたモデルから、ｈＴＲＯＰ２の発現が腫瘍細胞の足場非依存的細胞増殖及び免疫不全マウスでの腫瘍形成に関与していることが報告されている（非特許文献２８）。
　この様な癌との関連性を示唆する情報から、これまでに複数の抗ｈＴＲＯＰ２抗体が樹立され、その抗腫瘍効果が検討されている。この中にはコンジュゲート化されていない抗体単独でヌードマウス異種移植モデルにおける抗腫瘍活性を示すもの（特許文献５～８）の他、抗体と抗細胞薬剤とのADCとして抗腫瘍活性を示すもの（特許文献９～１２）等が開示されている。しかしながら、それらの活性の強さや適用範囲はまだ十分ではなく、ｈＴＲＯＰ２を治療標的とする未充足医療ニーズが存在している。
特開平５－５９０６１号公報 特開平８－３３７５８４号公報 国際公開第１９９７/４６２６０号 国際公開第２０００/２５８２５号 国際公開第２００８/１４４８９１号 国際公開第２０１１/１４５７４４号 国際公開第２０１１/１５５５７９号 国際公開第２０１３/０７７４５８号 国際公開第２００３/０７４５６６号 国際公開第２０１１/０６８８４５号 国際公開第２０１３/０６８９４６号 米国特許第７９９９０８３号明細書
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　抗体による腫瘍の治療においては、抗体が抗原を認識して腫瘍細胞に結合しても抗腫瘍効果が十分でない場合が観察されることもあり、より効果の高い抗腫瘍抗体が必要とされる場合がある。また、抗腫瘍性の低分子化合物においては、抗腫瘍効果に優れていても副作用や毒性面等、安全性上の問題を有するものが多く、安全性をより高めてより優れた治療効果を獲得することが課題となっている。すなわち、本発明は、抗腫瘍効果と安全性面に優れる、優れた治療効果を有する抗腫瘍薬を獲得して提供することが課題である。
　本発明者らは、抗ＴＲＯＰ２抗体が腫瘍細胞を標的にできる抗体であること、すなわち、腫瘍細胞を認識できる特性、腫瘍細胞に結合できる特性、或は腫瘍細胞に内在化できる特性等を備えた抗体であることから、抗腫瘍性化合物であるエキサテカンを、リンカー構造部分を介して同抗体に結合させた抗体－薬物コンジュゲートに変換することによって、同抗体を利用した細胞障害性が獲得できること、さらに抗腫瘍性化合物を腫瘍細胞により確実に移動させて当該化合物の抗腫瘍効果を腫瘍細胞で特異的に発揮させることができ、したがって抗腫瘍効果の確実な発揮とともに抗腫瘍性化合物の投与量を当該化合物の単体投与時よりも減少させることができること、さらにはこれらによって通常細胞への抗腫瘍性化合物の影響を緩和させることができること、すなわちこれらによってより高い安全性を達成できること、が可能と考えた。
　このために本発明者らは特定の構造のリンカーを創出し、このリンカーを介して抗ＴＲＯＰ２抗体とエキサテカンとを結合させた抗体－薬物コンジュゲートを獲得することに成功し、同コンジュゲートが優れた抗腫瘍効果を発揮することを見出して本発明を完成させたのである。
　すなわち本願発明は、
［１］次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 で示される抗腫瘍性化合物と抗ＴＲＯＰ２抗体とを次式：
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
で示される構造のリンカーを介して、抗ＴＲＯＰ２抗体のヒンジ部に存在するジスルフィド結合部分において形成させたチオエーテル結合によって結合させたことを特徴とする抗体－薬物コンジュゲートに関するものである。
　ここで、抗ＴＲＯＰ２抗体はL1の末端において結合し、抗腫瘍性化合物は、１位のアミノ基の窒素原子を結合部位として、-(CH2)n2-C(=O)-部分のカルボニル基に結合する。
　式中、n1は、０から６の整数を示し、
n2は、０から５の整数を示し、
L1は、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-を示し、
　ここで、n3は、２から８の整数を示し、
L2は、-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-又は単結合を示し、
　ここで、n4は、１から６の整数を示し、
LPは、２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基を示し、
Laは、-O-又は単結合を示し、
-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 で示される構造であり、このものの３位で抗ＴＲＯＰ２抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。
　さらに本願発明は以下の各々に関するものでもある。
［２］LPのペプチド残基が、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選ばれるアミノ酸からなるペプチド残基である［１］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［３］LPが、以下の群から選ばれるペプチド残基である［１］又は［２］に記載の抗体－薬物コンジュゲート：
-GGF-、
-DGGF-、
-(D-)D-GGF-、
-EGGF-、
-GGFG-、
-SGGF-、
-KGGF-、
-DGGFG-、
-GGFGG-、
-DDGGFG-、
-KDGGFG-、及び
-GGFGGGF-；
　ここで『(D-)D』はD-アスパラギン酸を示す。
［４］LPが、４個のアミノ酸で構成されるペプチド残基である［１］又は［２］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［５］LPが、テトラペプチド残基の-GGFG-である［１］から［４］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［６］n3が２から５の整数であって、L2が単結合である［１］から［５］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［７］n3が２から５の整数であって、L2が-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-であり、n4が２又は４である［１］から［５］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［８］-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、４から７原子の鎖長を有する部分構造である［１］から［７］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［９］-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、５又は６原子の鎖長を有する部分構造である［１］から［７］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［１０］-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、
-NH-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、又は
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-である［１］から［９］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［１１］-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、又は
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
である［１］から［９］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［１２］-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-に薬物を結合させた薬物－リンカー構造部分が、次の群から選ばれる１種の薬物－リンカー構造である［１］から[９]のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート：
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
　ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で示される構造であり、このものの３位で抗ＴＲＯＰ２抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。
-(NH-DX)は次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基を示す。
-GGFG-は、-Gly-Gly-Phe-Gly-のテトラペプチド残基を示す。
［１３］-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-に薬物を結合させた薬物－リンカー構造部分が、次の群から選ばれる１種の薬物－リンカー構造である［１］から［９］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート：
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
　ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-、-(NH-DX)、及び-GGFG-は、上記の通りである。
［１４］次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 で示される抗腫瘍性化合物と抗ＴＲＯＰ２抗体とを次式：
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
で示される構造のリンカーを介して、抗ＴＲＯＰ２抗体のヒンジ部に存在するジスルフィド結合部分において形成させたチオエーテル結合を介して結合させたことを特徴とする抗体－薬物コンジュゲート。
　ここで、抗ＴＲＯＰ２抗体はL1の末端において結合し、抗腫瘍性化合物は-(CH2)n2-C(=O)-部分のカルボニル基に結合する。
　式中、n1は、０から６の整数を示し、
n2は、０から５の整数を示し、
L1は、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-を示し、
　ここで、n3は、２から８の整数を示し、
L2は、-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-又は単結合を示し、
　ここで、n4は、１から６の整数を示し、
LPは、-GGFG-のテトラペプチド残基を示し、
Laは、-O-又は単結合を示し、
-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 で示される構造であり、このものの３位で抗ＴＲＯＰ２抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。
［１５］n1が３であり、n2が０であり、n3が２であり、L2が-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-であって、n4が２であり、Laが単結合であるか、
n1が１であり、n2が１であり、n3が５であり、L2が単結合であり、Laが-O-であるか、又は
n1が２であり、n2が１であり、n3が５であり、L2が単結合であり、Laが-O-である［１４］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［１６］n3が２又は５であって、L2が単結合である［１４］又は［１５］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［１７］n3が２又は５であって、L2が-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-であり、n4が２又は４である［１４］又は［１５］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［１８］-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、又は
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
である［１４］から［１７］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［１９］-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-に薬物を結合させた薬物－リンカー構造部分が、次の群から選ばれる１種の薬物－リンカー構造である［１４］から[１８]のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート：
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)；
　ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 で示される構造であり、このものの３位で抗ＴＲＯＰ２抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。
-(NH-DX)は次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基を示す。
-GGFG-は、-Gly-Gly-Phe-Gly-のテトラペプチド残基を示す。
［２０］-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-に薬物を結合させた薬物－リンカー構造部分が、次の群から選ばれる１種の薬物－リンカー構造である［１４］から［１８］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート：
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
　ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-、-(NH-DX)及び-GGFG-は、上記の通りである。
［２１］選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が１から１０個の範囲である［１］から［２０］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［２２］選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個の範囲である［１］から［２０］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［２３］選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個の範囲である［１］から［２０］のいずれか一に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［２４］［１］から［２３］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を含有する医薬。
［２５］［１］から［２３］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を含有する抗腫瘍薬及び/又は抗癌薬。
［２６］肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸部癌、又は食道癌に適用するための［２５］に記載の抗腫瘍薬及び/又は抗癌薬。
［２７］［１］から［２３］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を活性成分とし、薬学的に許容される製剤成分とを含有する医薬組成物。
［２８］肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸部癌、又は食道癌に適用するための［２７］に記載の医薬組成物。
［２９］［１］から［２３］のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を投与することを特徴とする腫瘍及び/又は癌の治療方法。
［３０］次式で示される化合物：
(maleimid-N-yl)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)
を抗ＴＲＯＰ２抗体又はその反応性誘導体と反応させ、該抗体のヒンジ部に存在するジスルフィド結合部分においてチオエーテル結合を形成させる方法によって薬物－リンカー部分を該抗体に結合させることを特徴とする抗体－薬物コンジュゲートの製造方法。
　式中、n3は、整数の２から８を示し、
L2は、-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-又は単結合を示し、
　ここで、n4は、１から６の整数を示し、
LPは、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選ばれる２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基を示し、
n1は、０から６の整数を示し、
n2は、０から５の整数を示し、
Laは、-O-又は単結合を示し、
(maleimid-N-yl)-は、次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 で示される、窒素原子が結合部位となっている基である。
-(NH-DX)は、次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
［３１］薬物－リンカー部分を抗ＴＲＯＰ２抗体に結合させる方法が、該抗体を還元処理して反応性誘導体に変換する方法である［３０］に記載の製造方法。
［３２］選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が１から１０個の範囲である［３０］又は［３１］に記載の製造方法。
［３３］選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個の範囲である［３０］又は［３１］に記載の製造方法。
［３４］選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個の範囲である［３０］又は［３１］に記載の製造方法。
［３５］［３０］から［３４］のいずれかの製造方法によって得られる抗体－薬物コンジュゲート。
［３６］抗ＴＲＯＰ２抗体を還元条件で処理した後に以下の群から選ばれる化合物を反応させることを特徴とする、該抗体のヒンジ部のスルフィド結合部分においてチオエーテル結合を形成させて得られる抗体－薬物コンジュゲート：
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、及び
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)。
　ここで、(maleimid-N-yl)-は、次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 で示される、窒素原子が結合部位となっている基である。
-(NH-DX)は、次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
-GGFG-は、-Gly-Gly-Phe-Gly-のテトラペプチド残基を示す。
［３７］抗ＴＲＯＰ２抗体を還元条件で処理した後に以下の群から選ばれる化合物を反応させることを特徴とする、該抗体のヒンジ部のスルフィド結合部分においてチオエーテル結合を形成させて得られる抗体－薬物コンジュゲート：
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、及び
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)。
　ここで、(maleimid-N-yl)-、-(NH-DX)、及び-GGFG-は、上記の通りである。
［３８］選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が１から１０個の範囲である［３６］又は［３７］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［３９］選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個の範囲である［３６］又は［３７］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［４０］選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個の範囲である［３６］又は［３７］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　特定の構造のリンカーを介して抗腫瘍性化合物エキサテカンを結合させた抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートによって、優れた抗腫瘍効果及び安全性を達成することができる。
ｃＴＩＮＡ１抗体重鎖のヌクレオチド配列（配列番号７）及びアミノ酸配列（配列番号８）を示す。 ｃＴＩＮＡ１抗体軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号９）及びアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。 ｈＴＩＮＡ１－Ｈ１重鎖のヌクレオチド配列（配列番号１１）及びアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。 ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２重鎖のヌクレオチド配列（配列番号１３）及びアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。 ｈＴＩＮＡ１－Ｈ３重鎖のヌクレオチド配列（配列番号１５）及びアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。 ｈＴＩＮＡ１－Ｌ１軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号１７）及びアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。 ｈＴＩＮＡ１－Ｌ２軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号１９）及びアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。 ｈＴＩＮＡ１－Ｌ３軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号２１）及びアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。 ＴＩＮＡ１抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号２３）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号２４）、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号２５）、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号２６）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号２７）、及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号２８）を示す。 抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ４６抗体、抗ＣＤ５５抗体、抗ＣＤ５９抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ１４７抗体、抗ＣＤ２７６抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、及び抗ＴＲＯＰ２抗体（ＴＩＮＡ１抗体）の細胞内在化能を示す。 抗ＣＤ５９抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体、及び抗ＴＲＯＰ２抗体（ＴＩＮＡ１抗体）の細胞内在化能を示す。 各種抗ＴＲＯＰ２抗体の細胞内在化能を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（１）、（６）、又は（１２）が、ヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（１）、（６）、又は（１２）が、ヒト膵臓腺癌細胞株ＢｘＰＣ－３皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（１）、（６）、又は（１２）が、ヒト膵臓腺癌細胞株Ｃａｐａｎ－１皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（２）、（５）、（７）、又は（１０）が、ヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（２）、（５）、（７）、又は（１０）が、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ－３皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、又は（９）が、ヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、又は（９）が、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ－３皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、又は（９）が、ヒト卵巣癌細胞株ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、又は（９）が、ヒト胃癌細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、又は（９）が、ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ２９２皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、又は（９）が、ヒト咽頭癌細胞株ＦａＤｕ皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、又は（９）が、ヒト膵臓腺癌細胞株ＣＦＰＡＣ－１皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（８）又は（１３）が、ヒト膵臓腺癌細胞株ＣＦＰＡＣ－１皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（８）又は（１３）が、ヒト膵臓腺癌細胞株ＨＰＡＣ皮下移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。 抗体－薬物コンジュゲート（８）又は（１３）が、ヒト食道癌組織皮下移植ＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスに対して示す抗腫瘍効果を示す。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートは、抗ＴＲＯＰ２抗体に、リンカー構造部分を介して抗腫瘍性化合物を結合させた抗腫瘍性薬物であり、以下に詳細に説明する。
［抗体］
　本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートに使用される抗ＴＲＯＰ２抗体は、いずれの種に由来してもよいが、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、及びウサギを例示できる。ヒト以外の種に由来する場合は、周知の技術を用いて、キメラ化又はヒト化することが好ましい。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
　抗ＴＲＯＰ２抗体は腫瘍細胞を標的にできる抗体であり、すなわち腫瘍細胞を認識できる特性、腫瘍細胞に結合できる特性、そして腫瘍細胞内に取り込まれて内在化する特性等を備えており、抗腫瘍活性を有する化合物を、リンカーを介して結合させて抗体－薬物コンジュゲートとすることができる。
　抗体の腫瘍細胞への結合性は、フローサイトメトリーを用いて確認することができる。腫瘍細胞内への抗体の取り込みの確認方法としては、（１）治療抗体に結合する二次抗体（蛍光標識）を用いて細胞内に取り込まれた抗体を蛍光顕微鏡で可視化するアッセイ（Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761）、（２）治療抗体に結合する二次抗体（蛍光標識）を用いて細胞内に取り込まれた蛍光量を測定するアッセイ（Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, December 2004）、又は（３）治療抗体に結合するイムノトキシンを用いて、細胞内に取り込まれると毒素が放出されて細胞増殖が抑制されるというMab-ZAPアッセイ（Bio Techniques 28:162-165, January 2000)等を挙げることができる。なお、イムノトキシンとしては、ジフテテリア毒素の触媒領域とプロテインＧとのリコンビナント複合蛋白質も使用可能である。
　抗体－薬物コンジュゲートは抗腫瘍効果を発揮する化合物を結合させてあるので、抗体自体が抗腫瘍効果を有することは、好ましいが、必須ではない。抗腫瘍性化合物の細胞障害性を腫瘍細胞において特異的・選択的に発揮させる目的からは、抗体が内在化して腫瘍細胞内に移行する性質のあることが重要であり、好ましい。
　抗ＴＲＯＰ２抗体は、この分野で通常実施される方法を用いて、抗原となるポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原の由来はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来する抗原を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種抗原に結合する抗体とヒト抗原との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
　また、公知の方法（例えば、Kohler and Milstein, Nature(1975)256, p.495-497；Kennet, R.ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y.(1980)）に従って、抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによってハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
　なお、抗原は抗原蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、抗原遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現した抗原を精製すればよい。上記の遺伝子操作による抗原発現細胞、或は抗原を発現している細胞株、を動物に免疫する方法を用いることによっても抗体を取得できる。
　抗ＴＲＯＰ２抗体は、公知の手段によって取得することができる。
　本発明で使用できる抗ＴＲＯＰ２抗体は、特に制限はないが、例えば、本願の配列表で示されたアミノ酸配列で特定されるものを好適に使用することができる。本発明において使用されるＴＲＯＰ２抗体としては、以下の特性を有するものが望ましい。
（１）以下の特性を有することを特徴とする抗体；
　（ａ）ＴＲＯＰ２に特異的に結合する
　（ｂ）ＴＲＯＰ２と結合することによってＴＲＯＰ２発現細胞に内在化する活性を有する
（２）ＴＲＯＰ２がヒトＴＲＯＰ２である上記（１）に記載の抗体。
（３）重鎖における相補性決定領域として配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、並びに軽鎖における相補性決定領域として配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する上記（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）定常領域がヒト由来定常領域である上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の抗体。
（５）ヒト化されている上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）（ａ）配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列、（ｄ）（ａ）乃至（ｃ）の配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（ｅ）（ａ）乃至（ｃ）の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、並びに（ｆ）配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列、（ｇ）配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列、（ｈ）配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列、（ｉ）（ｆ）乃至（ｈ）の配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（ｊ）（ｆ）乃至（ｈ）の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、を有する上記（５）に記載の抗体。
（７）配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、並びに配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域からなる群から選択される重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を有する上記（６）に記載の抗体。
（８）配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、並びに配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域からなる群から選択される重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を有する上記（７）に記載の抗体。
（９）配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、並びに配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる群から選択される重鎖及び軽鎖からなる上記（６）又は（７）に記載の抗体。
（１０）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、並びに配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる群から選択される重鎖及び軽鎖からなる上記（６）又は（７）に記載の抗体。
（１１）配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、並びに配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる群から選択される重鎖及び軽鎖からなる上記（８）に記載の抗体。
（１２）重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している上記（１）乃至（１１）のいずれかに記載の抗体。
（１３）上記（１）乃至（１２）のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する工程及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含む当該抗体の製造方法によって得られる抗体。
　以下に、本発明において使用される抗ＴＲＯＰ２抗体について説明する。
　本明細書において、「癌」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。
　本明細書において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びそのｃＲＮＡも含まれる。
　本明細書において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれる。
　本明細においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
　本明細書において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
　本明細書において、「ＴＲＯＰ２」は、ＴＲＯＰ２蛋白質と同じ意味で用いている。
　本明細書における「ＣＤＲ」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｒｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）を意味する。抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所のＣＤＲがあることが知られている。ＣＤＲは、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ３ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体のＣＤＲについて、重鎖のＣＤＲを重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖のＣＤＲを軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
　本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、又はＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７－１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１－２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することによって同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
１．ＴＲＯＰ２
　ＴＲＯＰ２は、ヒト栄養膜細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓ）に発現するＴＡＣＳＴＤファミリーのひとつであり、ヒト栄養膜細胞と癌細胞に共通する免疫抵抗性に関与する、１回膜貫通型の１型細胞膜蛋白質である。
　本発明で用いるＴＲＯＰ２蛋白質は、ヒト、非ヒト哺乳動物（ラット、マウス等）のＴＲＯＰ２発現細胞から直接精製して使用するか、或は当該細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、ＴＲＯＰ２をin vitroにて合成する、或は遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、ＴＲＯＰ２　ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、或は他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＴＲＯＰ２を発現させることによって、該蛋白質を得ることが出来る。また、前記の遺伝子操作によるＴＲＯＰ２発現細胞、或はＴＲＯＰ２を発現している細胞株をＴＲＯＰ２蛋白質として使用することも可能である。
　ＴＲＯＰ２のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は公的データベース上に公開されており、例えばＮＭ＿００２３５３，ＮＰ＿００２３４４（ＮＣＢＩ）等のアクセッション番号により参照可能である。
　また、上記ＴＲＯＰ２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、当該蛋白質と同等の生物活性を有する蛋白質もＴＲＯＰ２に含まれる。
　ヒトＴＲＯＰ２蛋白質は、Ｎ末端２６アミノ酸残基から成るシグナル配列、２４８アミノ酸残基から成る細胞外ドメイン、２３アミノ酸残基から成る細胞膜貫通ドメイン、２６アミノ酸残基から成る細胞内ドメインで構成されている。
２．抗ＴＲＯＰ２抗体の製造
　本発明のＴＲＯＰ２に対する抗体は、この分野で通常実施される方法を用いて、ＴＲＯＰ２又はＴＲＯＰ２のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原となるＴＲＯＰ２の生物種はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するＴＲＯＰ２を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種ＴＲＯＰ２に結合する抗体とヒトＴＲＯＰ２との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
　また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５－４９７；Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５－３６７，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、ＴＲＯＰ２に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによってハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
　なお、抗原となるＴＲＯＰ２はＴＲＯＰ２遺伝子を遺伝子操作によって宿主細胞に発現させることによって得ることができる。
　具体的には、ＴＲＯＰ２遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したＴＲＯＰ２を精製すればよい。
　また、上記の遺伝子操作によるＴＲＯＰ２発現細胞、或はＴＲＯＰ２を発現している細胞株をＴＲＯＰ２蛋白質として使用することも可能である。以下、具体的にＴＲＯＰ２に対する抗体の取得方法を説明する。
（１）　抗原の調製
　抗ＴＲＯＰ２抗体を作製するための抗原としては、ＴＲＯＰ２又はその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、或はこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
　ＴＲＯＰ２は、ヒトの腫瘍組織或は腫瘍細胞から直接精製して使用することができ、また、ＴＲＯＰ２をin vitroにて合成する、或は遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。
　遺伝子操作では、具体的には、ＴＲＯＰ２のｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、或は他の原核生物又は真核生物の宿主細胞を形質転換してＴＲＯＰ２を発現させることによって、抗原を得ることができる。
　また、膜蛋白質であるＴＲＯＰ２の細胞外領域と抗体の定常領域とを連結した融合蛋白質を適切な宿主・ベクター系において発現させることによって、分泌蛋白質として抗原を得ることも可能である。
　ＴＲＯＰ２のｃＤＮＡは例えば、ＴＲＯＰ２のｃＤＮＡを発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＴＲＯＰ２　ｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という；Ｓａｉｋｉ，Ｒ．　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐ．４８７－４８９　参照）を行う、いわゆるＰＣＲ法によって取得することができる。
　ポリペプチドのin vitro合成としては、例えばロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）を挙げることができるが、これに限定されることはない。
　原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を挙げることができる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
　真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５－１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１６５０；ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，ｐ．４１２６－４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
　上記の様にして得られる形質転換体は、この分野で通常実施される方法に従って培養することができ、該培養によって細胞内又は細胞外に目的のポリペプチドが産生される。
　該培養に用いられる培地は、当業者であれば採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択することができ、大腸菌であれば、例えば、ＬＢ培地に必要に応じて、アンピシリン等の抗生物質やＩＰＭＧを添加して用いることができる。
　上記培養によって、形質転換体の細胞内又は細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法によって分離・精製することができる。
　該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等を例示できる。
　また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンタグを繋げることによって、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。或は、発現させる組換え蛋白質にＩｇＧのＦｃ領域を繋げることによって、プロテインＡカラムで効率的に精製することができる。
　上記方法を組合せることによって容易に高収率、高純度で目的とするポリペプチドを大量に製造できる。
　上記に述べた形質転換体自体を抗原として使用することも可能である。また、ＴＲＯＰ２を発現する細胞株を抗原として使用することも可能である。この様な細胞株としては、ヒト化肺癌株ＮＣＩ－Ｈ３２２、ＰＣ１４、ＮＣＩＨ－Ｈ２１２２、又はＬＣＡＭ１、ヒト前立腺癌株ＰＣ３、ヒト膵臓癌株ＢｘＰＣ－３、Ｃａｐａｎ－１、又はＰＫ－１、ヒト卵巣癌株ＳＫＯＶ３並びにヒト大腸癌株ＣＯＬＯ２０５を挙げることができるが、ＴＲＯＰ２を発現する限り、これらの細胞株に限定されることはない。
（２）　抗ＴＲＯＰ２モノクローナル抗体の製造
　ＴＲＯＰ２と特異的に結合する抗体の例として、ＴＲＯＰ２と特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
　モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記の様な作業工程が必要である。
　すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、又は抗原発現細胞の調製、
（ｂ）抗原を動物に注射することによって免疫した後に血液を採取し、その抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）この様にして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその結合特異性の検討、或は標識試薬としての特性の検定
等である。
　以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。
　（ａ）抗原の精製
　抗原としては、前記した様な方法で調製したＴＲＯＰ２又はその一部を使用することができる。
　また、ＴＲＯＰ２発現組換え体細胞によって調製した膜画分、又はＴＲＯＰ２発現組換え体細胞自身、さらに、当業者に周知の方法を用いて化学合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを抗原として使用することもできる。
　さらに、ＴＲＯＰ２発現細胞株を抗原として使用することもできる。
　（ｂ）抗体産生細胞の調製
　工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、或はカリミョウバンの様な助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。この他に、抗原発現細胞を免疫原として実験動物に免疫する方法もある。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法で用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、例えばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
　また、実際に使用するマウス及びラットの系統には特に制限はなく、マウスの場合には、例えば各系統Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ/ｃ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、Ｒ　ＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、またラットの場合には、例えば、Ｗｉｓｔａｒ、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｇｕｅ、Ｄａｗｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ等を用いることができる。
　これらのマウス及びラットは例えば日本クレア株式会社、日本チャ－ルス・リバー株式会社等の実験動物飼育販売業者より入手することができる。
　被免疫動物としては、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではＷｉｓｔａｒ及びＬｏｗ系統が特に好ましい。
　また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。
　なお、これらのマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは５～１２週齢、さらに好ましくは６～８週齢である。
　ＴＲＯＰ２又はこの組換え体によって動物を免疫するには、例えば、Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ　Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｃ　Ｔｈｏｍａｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ　Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等に詳しく記載されている公知の方法を用いることができる。
　これらの免疫法のうち、本発明において好適な方法を具体的に示せば、例えば以下の通りである。
　すなわち、まず、抗原である膜蛋白質画分、又は抗原を発現させた細胞を動物の皮内又は腹腔内に投与する。ただし、免疫効率を高めるためには両者の併用が好ましく、前半は皮内投与を行い、後半又は最終回のみ腹腔内投与を行うと、特に免疫効率を高めることができる。
　抗原の投与スケジュールは、被免疫動物の種類、個体差等によって異なるが、一般には、抗原投与回数３～６回、投与間隔２～６週間が好ましく、投与回数３～４回、投与間隔２～４週間がさらに好ましい。
　また、抗原の投与量は、動物の種類、個体差等によって異なるが、一般には０．０５～５ｍｇ、好ましくは０．１～０．５ｍｇ程度とする。
　追加免疫は、以上の通りの抗原投与の１～６週間後、好ましくは１～４週間後、さらに好ましくは１～３週間後に行う。免疫原が細胞の場合には、１×１０6乃至１×１０7個の細胞を使用する。
　なお、追加免疫を行う際の抗原投与量は、動物の種類、大きさ等によって異なるが、一般に、例えばマウスの場合には０．０５～５ｍｇ、好ましくは０．１～０．５ｍｇ、さらに好ましくは０．１～０．２ｍｇ程度とする。免疫原が細胞の場合には、１×１０6乃至１×１０7個の細胞を使用する。
　上記追加免疫から１～１０日後、好ましくは２～５日後、さらに好ましくは２～３日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞又はリンパ球を無菌的に取り出す。その際に抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効率を高めることができる。
　ここで用いられる抗体価の測定法としては、例えば、ＲＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法を挙げることができるがこれらの方法に制限されない。本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載する様な手順によって行うことができる。
　まず、精製又は部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗体を結合させる。
　さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することによって、抗体価を算出する。
　被免疫動物の脾臓細胞又はリンパ球からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５；Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７７）６，ｐ．５１１；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７），２６６，ｐ．５５０；Ｗａｌｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９７７）２６６，ｐ．４９５）に従って行うことができる。例えば、脾臓細胞の場合には、脾臓を細切して細胞をステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。
　（ｃ）骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」という）の調製
　細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ｇｕａｎｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。
　すなわち、マウス由来のＸ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１－ＡＮＳ／１（ＮＳ１）、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｘ６３－Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１－４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ、ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ－００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ－Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９－６、ＬＩＣＲ－ＬＯＷ－ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４－１（ＮＰ４１）等である。これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例えば、ＡＴＣＣ等から入手することができる。
　これらの細胞株は、適当な培地、例えば８－アザグアニン培地（ＲＰＭＩ－１６４０培地にグルタミン、２－メルカプトエタノール、ゲンタマイシン及びウシ胎児血清（以下「ＦＢＳ」という）を加えた培地に８－アザグアニンを加えた培地）、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地（例えば、１０％　ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素株式会社製））で継代培養し、融合当日に２×１０7以上の細胞数を確保しておく。
　（ｄ）細胞融合
　抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ　Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｃ　Ｔｈｏｍａｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ　Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。
　その様な方法として、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。このうち、上記化学的方法の具体例を示せば以下の通りである。
　すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量１５００～６０００、好ましくは２０００～４０００のポリエチレングリコール溶液中で、３０～４０℃、好ましくは３５～３８℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１～１０分間、好ましくは５～８分間混合する。
　（ｅ）ハイブリドーマ群の選択
　上記細胞融合によって得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法（Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６，ｐ．５５０）が用いられる。
　この方法は、アミノプテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することによって、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
　（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）
　ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる（例えばＢａｒｂａｒａ，　Ｂ．Ｍ．ａｎｄ　Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．Ｓ．：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０）参照）。これらの方法のうち、特にメチルセルロース法等の三次元培養法が好適である。例えば、細胞融合によって形成されたハイブリドーマ群をＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製　＃０３８０４）等のメチルセルロース培地に懸濁して培養し、形成されたハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマの取得が可能である。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清中に安定して抗体価の認められたものをＴＲＯＰ２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
　この様にして樹立されたハイブリドーマ株の例としては、ＴＲＯＰ２ハイブリドーマＴＩＮＡ１を挙げることができる。なお、本明細書中においては、ＴＲＯＰ２ハイブリドーマＴＩＮＡ１が産生する抗体を、「ＴＩＮＡ１抗体」又は単に「ＴＩＮＡ１」と記載する。
　ＴＩＮＡ１抗体の重鎖可変領域は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。また、ＴＩＮＡ１抗体の軽鎖可変領域は、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。
　（ｇ）ハイブリドーマの培養によるモノクローナル抗体の調製
　この様にして選択されたハイブリドーマは、これを培養することによって、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。
　このスクリーニングにはそれ自体既知の方法が採用できる。
　本発明における抗体価の測定は、例えば上記（ｂ）の項目で説明したＥＬＩＳＡ法によって行うことができる。
　以上の方法によって得たハイブリドーマは、液体窒素中又は－８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。
　クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養される。
　大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、或はスピナー培養で行われる。この大量培養における上清から、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することによって、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。
　また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、或はＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド－マを増殖させることによって、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。
　腹腔内に投与する場合には、事前（３～７日前）に２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（２，６，１０，１４－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ；プリスタン）等の鉱物油を投与すると、より多量の腹水が得られる。
　例えば、ハイブリドーマと同系統のマウスの腹腔内に予め免疫抑制剤を注射し、Ｔ細胞を不活性化した後、２０日後に１０6～１０7個のハイブリドーマ・クローン細胞を、血清を含まない培地中に浮遊（０．５ｍｌ）させて腹腔内に投与し、通常腹部が膨満し、腹水がたまったところでマウスより腹水を採取する。この方法によって、培養液中に比べて約１００倍以上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。
　上記方法によって得たモノクローナル抗体は、例えばＷｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．：Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９７８）に記載されている方法で精製することができる。
　かくして得られるモノクローナル抗体は、ＴＲＯＰ２に対して高い抗原特異性を有する。
　（ｈ）モノクローナル抗体の検定
　かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下の様に行うことができる。
　まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、又はＲＩＡ法を挙げることができる。
　オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。
　一方、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることによって、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。
　また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
　さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法及び２８０ｎｍにおける吸光度（１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ）より算出する方法によって行うことができる。
　さらに、（２）の（ａ）乃至（ｈ）の工程を再度実施して別途に独立してモノクローナル抗体を取得した場合においても、ＴＩＮＡ１抗体と同等の細胞傷害活性を有する抗体を取得することが可能である。この様な抗体の一例として、ＴＩＮＡ１抗体と同一のエピトープに結合する抗体を挙げることができる。新たに作製されたモノクローナル抗体が、ＴＩＮＡ１抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、該モノクローナル抗体がＴＩＮＡ１抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、ＴＩＮＡ１抗体のＴＲＯＰ２に対する結合に対して該モノクローナル抗体が競合する（即ち、該モノクローナル抗体がＴＩＮＡ１抗体とＴＲＯＰ２の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、該モノクローナル抗体が抗ＴＲＯＰ２抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピトープが同一であることが確認された場合、該モノクローナル抗体がＴＩＮＡ１抗体と同等の抗原結合能又は生物活性を有していることが強く期待される。
（３）　その他の抗体
　本発明の抗体には、上記ＴＲＯＰ２に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体等も含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
　キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１－６８５５，（１９８４）参照）。
　ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５参照）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加えて一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開第９０／０７８６１号）を挙げることができる。
　但し、ＴＩＮＡ１抗体由来のヒト化抗体としては、ＴＩＮＡ１抗体の６種全てのＣＤＲ配列を保持する限り、特定のヒト化抗体に限定されることはない。なお、ＴＩＮＡ１抗体の重鎖可変領域は、配列表の配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＴＡＧＭＱ）、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＷＩＮＴＨＳＧＶＰＫＹＡＥＤＦＫＧ）、及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＳＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ）を保有している。また、ＴＩＮＡ１抗体の軽鎖可変領域は、配列表の配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ）、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＳＡＳＹＲＹＴ）、及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ）を保有している。
　マウス抗体ＴＩＮＡ１のヒト化抗体の実例としては、（１）配列表の配列番号１２、１４、又は１６の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（２）上記（１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（３）上記（１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列のいずれか一つからなる重鎖可変領域を含む重鎖、並びに（４）配列番号１８、２０、又は２２の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（５）上記（４）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（６）上記（４）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列のいずれか一つからなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の任意の組合せを挙げることができる。
　なお、本明細書における「数個」とは、１乃至１０個、１乃至９個、１乃至８個、１乃至７個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、又は１若しくは２個を意味する。
　また、本明細書におけるアミノ酸の置換としては保存的アミノ酸置換が好ましい。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。好適なアミノ酸グループは、以下の通りである：酸性グループ＝アスパラギン酸、グルタミン酸；塩基性グループ＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；非極性グループ＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；非帯電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。他の好適なアミノ酸グループは次の通りである：脂肪族ヒドロキシグループ＝セリン及びスレオニン；アミド含有グループ＝アスパラギン及びグルタミン；脂肪族グループ＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；並びに芳香族グループ＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。かかるアミノ酸置換は元のアミノ酸配列を有する物質の特性を低下させない範囲で行うのが好ましい。
　上記の重鎖及び軽鎖の好適な組合せの抗体としては、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、並びに配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　さらに好適な組合せの抗体としては、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番１４においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３４番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、並びに配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　優れた好適な組み合わせとしては、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、並びに配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　また、別の好適な組合せとしては、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番１２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番１４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、並びに配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　優れた好適な組み合わせとしては、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、並びに配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　さらに優れた好適な組合せとしては、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４６９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至４６９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１４においてアミノ酸番号２０乃至４６９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、並びに配列番号１６においてアミノ酸番号２０乃至４６９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　上記の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列と高い相同性を示す配列を組み合わせることによって、上記の各抗体と同等の生物活性を有する抗体を選択することが可能である。この様な相同性は、一般的には８０％以上の相同性であり、好ましくは９０％以上の相同性であり、より好ましくは９５％以上の相同性であり、最も好ましくは９９％以上の相同性である。また、重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の各抗体と同等の生物活性を有する抗体を選択することが可能である。
　二種類のアミノ酸配列間の相同性は、Ｂｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ　Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，　Ｊｉｎｇｈｕｉ　Ｚｈａｎｇ，　Ｚｈｅｎｇ　Ｚｈａｎｇ，　Ｗｅｂｂ　Ｍｉｌｌｅｒ，　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴ　ａｎｄ　ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Ｂｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍは、インターネットでwww.ncbi.nlm.nih.gov/blastにアクセスすることによっても使用することができる。
　なお、配列表の配列番号１２、１４、又は１６に示される重鎖アミノ酸配列中で、１乃至１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列番号１２の配列は図３に、配列番号１４の配列は図４に、配列番号１６の配列は図５に各々記載されている。
　また、配列表の配列番号１８、２０、又は２２に示される軽鎖アミノ酸配列中で、１乃至２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列番号１８の配列は図６に、配列番号２０の配列は図７に、配列番号２２の配列は図８に各々記載されている。
　本発明の抗体としては、さらに、ＴＲＯＰ２に結合する、ヒト抗体を挙げることができる。抗ＴＲＯＰ２ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗ＴＲＯＰ２ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３－１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７－３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｖｏｌ．１０，ｐ．６９－７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ　Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２－７２７等を参照。）によって取得することができる。
　この様なヒト抗体産生マウスは、具体的には、内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクター等を介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物として、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製及びこれらの動物同士を掛け合わせることによって作り出すことができる。
　また、遺伝子組換え技術によって、その様なヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターによって真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することによって、この抗体を培養上清中から得ることもできる。
　ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。
　また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ　＆　Ｖｉｓｕａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７），ｐ．２３０１－２３０８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ　ｉｎ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２），１（２），ｐ．１８９－２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７－４３１等参照。）も知られている。
　例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５－１１１６）を用いることができる。
　抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。
　抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによってヒト抗体を取得することができる（国際公開第９２／０１０４７号、同９２／２０７９１号、同９３／０６２１３号、同９３／１１２３６号、同９３／１９１７２号、同９５／０１４３８号、同９５／１５３８８号；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３－４５５；Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５－１１１６）。
　新たに作製されたヒト抗体が、ＴＩＮＡ１抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、該ヒト抗体がＴＩＮＡ１抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、ＴＩＮＡ１抗体のＴＲＯＰ２に対する結合に対して該ヒト抗体が競合する（すなわち、該ヒト抗体が、ＴＩＮＡ１抗体とＴＲＯＰ２の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、該ヒト抗体がＴＩＮＡ１抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピトープが同一であることが確認された場合、該ヒト抗体がＴＩＮＡ１抗体と同等の生物活性を有していることが強く期待される。
　以上の方法によって得られたキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体は、公知の方法等によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。
　抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性のよい指標となる熱変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる装置である。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Ｌｏｒｉ　Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）１２，ｐ．２６５－２７３）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。
　本発明の抗体には抗体の修飾体も含まれる。当該修飾体とは、本発明の抗体に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ－結合又はＯ－結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ－結合又はＯ－結合への糖鎖付加、Ｎ末又はＣ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによってＮ末にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。この様な本発明の抗体の修飾物は、抗体の安定性及び血中滞留性の改善、抗原性の低減、抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
　また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコース化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、国際公開第１９９９／５４３４２号、同２０００／６１７３９号、同２００２／３１１４０号等が知られているが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体には当該糖鎖修飾を調節された抗体も含まれる。
　抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、及び軽鎖配列をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。
　真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞や、真核微生物を用いることができる。特に動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５－１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６－４２２０）を挙げることができる。
　原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。
　これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換によって導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによって抗体が得られる。当該培養においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。よって、本発明の抗体には、上記形質転換された宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体又は当該抗体の機能性断片を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体の製造方法によって得られる抗体も含まれる。
　なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ，７０５：１２９－１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リシンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用等）には影響を及ぼさない。したがって、本発明に係る抗体には、当該修飾を受けた抗体及び当該抗体の機能性断片も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２のアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）等も包含される。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であってもよいし、いずれか二種を組み合わせたものであってもよい。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端のひとつのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
　本発明の抗体のアイソタイプとしては、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２を挙げることができる。
　抗体の生物活性としては、一般的には抗原結合活性、抗原と結合することによって該抗原を発現する細胞に内在化する活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性及び抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）を挙げることができるが、本発明に係る抗体が有する機能は、ＴＲＯＰ２に対する結合活性であり、好ましくはＴＲＯＰ２と結合することによってＴＲＯＰ２発現細胞に内在化する活性である。さらに、本発明の抗体は、細胞内在化活性に加えて、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性及び/又はＡＤＣＰ活性を併せ持っていてもよい。
　得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ　Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。
　クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。
　これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
　アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ　Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆ．Ｆ．（ファルマシア）等を挙げることができる。
　また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
［抗腫瘍性化合物］
　本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートに結合される抗腫瘍性化合物について述べる。本発明で使用される抗腫瘍性化合物としては、抗腫瘍効果を有する化合物であって、リンカー構造に結合できる置換基、部分構造を有するものであれば特に制限はない。抗腫瘍性化合物は、リンカーの一部又は全部が腫瘍細胞内で切断されて抗腫瘍性化合物部分が遊離して抗腫瘍効果が発現される。リンカーが薬物との結合部分で切断されれば抗腫瘍性化合物が未修飾の構造で遊離され、その本来の抗腫瘍効果が発揮される。
　本発明で使用される抗腫瘍性化合物として、カンプトテシン誘導体であるエキサテカン（(1S,9S)-1-アミノ-9-エチル-5-フルオロ-2,3-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-10,13(9H,15H)-ジオン；次式：）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
を好適に使用することができる。このエキサテカンは、優れた抗腫瘍活性を有しているものの、抗腫瘍薬として市販されるには至っていない。同化合物は、公知の方法で容易に取得でき、１位のアミノ基をリンカー構造への結合部位として好適に使用することができる。また、エキサテカンはリンカーの一部が結合した状態で腫瘍細胞内で遊離される場合もあるが、この様な構造であっても優れた抗腫瘍効果が発揮される優れた化合物である。
　エキサテカンはカンプトテシン構造を有するので、酸性水性媒体中（例えばpH3程度）ではラクトン環が形成された構造（閉環体）に平衡が偏り、一方、塩基性水性媒体中（例えばpH10程度）ではラクトン環が開環した構造（開環体）に平衡が偏ることが知られている。この様な閉環構造及び開環構造に対応するエキサテカン残基を導入した薬物コンジュゲートであっても同等の抗腫瘍効果が期待され、いずれの状態のものも本発明の範囲に包含されることはいうまでもない。
　他の抗腫瘍性化合物として例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、シクロシチジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、白金系抗腫瘍剤（シスプラチン又はその誘導体）、タキソール又はその誘導体、その他のカンプトテシン又はその誘導体（特開平6-87746号公報に記載された抗腫瘍剤）等を挙げることができる。
　抗体－薬物コンジュゲートにおいて、抗体１分子への薬物の結合数は、その有効性、安全性に影響する重要因子である。抗体－薬物コンジュゲートの製造は、薬物の結合数が一定の数となるよう、反応させる原料・試薬の使用量等の反応条件を規定して実施されるが、低分子化合物の化学反応とは異なり、抗体－薬物コンジュゲートは異なる数の薬物が結合した混合物として得られるのが通常である。抗体１分子への薬物の結合数は平均値、すなわち、平均薬物結合数として特定され、表記される。本発明でも原則として断りのない限り、すなわち、異なる薬物結合数をもつ抗体－薬物コンジュゲート混合物に含まれる特定の薬物結合数をもつ抗体－薬物コンジュゲートを示す場合を除き、薬物の結合数は平均値を意味する。抗体分子へのエキサテカンの結合数はコントロール可能であり、１抗体あたりの薬物平均結合数として、１から１０個程度のエキサテカンを結合させることができるが、好ましくは２から８個であり、より好ましくは３から８個である。なお、当業者であれば本願の実施例の記載から抗体に必要な数の薬物を結合させる反応を設計することができ、エキサテカンの結合数をコントロールした抗体－薬物コンジュゲートを取得することができる。
［リンカー構造］
　本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートにおいて抗腫瘍性化合物を抗ＴＲＯＰ２抗体に結合させるリンカー構造について述べる。当該リンカーは、次式：
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
の構造を有しており、抗体はL1の末端（L2が結合するのとは反対側の末端）で結合し、抗腫瘍性化合物は-La-(CH2)n2-C(=O)-部分のカルボニル基で結合する。
　n1は、０から６の整数を示すが、好ましくは１から５の整数であり、より好ましくは１から３である。
１．L1
　L1は、
-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-
の構造で示される。
　ここで、n3は、２から８の整数であり、『-(Succinimid-3-yl-N)-』は、次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
で示される構造を有する。この部分構造における３位が抗ＴＲＯＰ２抗体への結合部位である。この３位での該抗体との結合は、チオエーテルを形成して結合することが特徴である。この構造部分の１位の窒素原子は、この構造が含まれるリンカー内に存在するメチレンの炭素原子と結合する。すなわち、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-L2-は次式で示される構造である（ここで、「抗体－Ｓ－」は抗体由来である。）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　式中、n3は、２から８の整数であるが、好ましくは２から５である。
　L1の具体例としては、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
等を挙げることができる。
２．L2
　L2は、
-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-
で示される構造であるが、L2は存在しなくともよく、この場合L2は単結合となる。また、n4は、１から６の整数であり、好ましくは２から４である。L2は末端のアミノ基でL1に結合し、反対の末端のカルボニル基でLPと結合する。
　L2の具体例としては、
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-
等を挙げることができる。
３．LP
　LPは、２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基である。すなわち、２から７個のアミノ酸がペプチド結合したオリゴペプチドの残基によって構成される。LPは、Ｎ末端においてL2に結合し、Ｃ末端においてリンカーの-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-部分のアミノ基に結合する。
　LPを構成するアミノ酸は特に限定されることはないが、例えば、L-又はD-アミノ酸であり、好ましくはL-アミノ酸である。また、α－アミノ酸の他、β－アラニン、ε－アミノカプロン酸、γ－アミノ酪酸等の構造のアミノ酸であってもよく，さらには例えばＮ－メチル化されたアミノ酸等の非天然型のアミノ酸であってもよい。
　LPのアミノ酸配列は、特に限定されないが、構成するアミノ酸として、フェニルアラニン（Phe；F）、チロシン（Tyr；Y）、ロイシン（Leu；L）、グリシン（Gly；G）、アラニン（Ala；A）、バリン（Val；V）、リシン（Lys；K）、シトルリン（Cit）、セリン（Ser；S）、グルタミン酸（Glu；E）、アスパラギン酸（Asp；D）等を挙げることができる。
　これらのうちで好ましくは、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸を挙げることができる。アミノ酸の種類によって、薬物遊離のパターンをコントロールすることができる。アミノ酸の数は、２から７個でよい。
　LPの具体例として、
-GGF-、
-DGGF-、
-(D-)D-GGF-、
-EGGF-、
-GGFG-、
-SGGF-、
-KGGF-、
-DGGFG-、
-GGFGG-、
-DDGGFG-、
-KDGGFG-、
-GGFGGGF-
を挙げることができる。上記の『(D-)D』はD-アスパラギン酸を意味する。本発明の抗体－薬物コンジュゲートの特に好ましいLPとして、-GGFG-のテトラペプチド残基を挙げることができる。
４．La-(CH2)n2-C(=O)-
　La-(CH2)n2-C(=O)-におけるLaは、-O-の構造であるか、又は単結合である。n2は、０から５の整数であるが、好ましくは０から３であり、より好ましくは０または１である。
　La-(CH2)n2-C(=O)-としては以下の構造のものを挙げることができる。
-O-CH2-C(=O)-、
-O-CH2CH2-C(=O)-、
-O-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-O-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-O-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-CH2-C(=O)-、
-CH2CH2-C(=O)-、
-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-。
　これらのうちでは、
-O-CH2-C(=O)-、
-O-CH2CH2-C(=O)-
である場合か、Laが単結合でn2が０である場合が好ましい。
　リンカーの-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-で示される構造の具体例として、
-NH-CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
等を挙げることができる。
　より好ましくは、
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2-O-C(=O)-
である。
　リンカーの-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-は、鎖長として４から７原子の鎖長であるものが好ましいが、さらに好ましくは５又は６原子の鎖長を有するものである。
　本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートは、腫瘍細胞内に移動した後にはリンカー部分が切断され、NH2-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)で示される構造の薬物誘導体が遊離して抗腫瘍作用を発現すると考えられる。本発明の抗体－薬物コンジュゲートから遊離されて抗腫瘍効果を発現する抗腫瘍性誘導体としては、先に挙げたリンカーの-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-で示される構造の末端がアミノ基となった構造部分を有する抗腫瘍性誘導体を挙げることができるが、特に好ましいものは次のものである。
NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
NH2-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)。
　なお、NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)の場合は同分子内にあるアミナール構造が不安定であるため、さらに自己分解して
HO-CH2-C(=O)-(NH-DX)
が遊離されることが確認された。これらの化合物は本発明の抗体－薬物コンジュゲートの製造中間体としても好適に用いることができる。
　薬物をエキサテカンとする本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおいては、下記の構造の薬物－リンカー構造部分［-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)］を抗体に結合させたものが好ましい。これらの薬物－リンカー構造部分は、１抗体あたりの平均結合数として、１から１０を結合させればよいが、好ましくは２から８であり、より好ましくは３から８である。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
　これらのうちでより好ましくは、次のものである。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
　さらに、好ましくは、次のものである。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおいて、抗ＴＲＯＰ２抗体と薬物とを結合するリンカー構造は、これまで述べたリンカー各部において示した好ましい構造のものを結合することで好ましいリンカーを構築することができる。この様なリンカ－構造として以下の構造のものを好適に使用することができる。なお構造の左端が抗体との結合部位であり、右端が薬物との結合部位である。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
　これらのうちでより好ましくは、次のものである。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
　さらに、好ましくは、次のものを挙げることができる。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
［製造方法］
　次に、本発明の抗体－薬物コンジュゲート或はその製造中間体の代表的な製造方法について説明する。なお、以下において、化合物を示すために、各反応式中に示される化合物の番号を用いる。すなわち、『式（１）の化合物』、『化合物（１）』等と称する。またこれ以外の番号の化合物についても同様に記載する。
１．製造方法１
　式（１）で示される、チオエーテルを介して抗体と薬物－リンカー構造が結合している抗体－薬物コンジュゲートは、例えば下記の方法によって製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
［式中、ABは、スルフヒドリル基を有する抗体を示し、L1’は、L1で示されるリンカー構造において、リンカー末端がマレイミジル基（次式）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
となった構造（ここで、窒素原子が結合部位となっている）を示すが、具体的には、L1のうちの-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-において-(Succinimid-3-yl-N)-部分がマレイミジル基となった基を示す。また、-(NH-DX)は次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
で示される構造であり、エキサテカンの１位のアミノ基の水素原子１個が除かれて生成する基を示す。］
　なお、上記の反応式において、式（１）の化合物では、薬物からリンカー末端までの構造部分１個が１個の抗体に対して結合した構造として解釈され得るが、これは説明のための便宜的な記載であって、実際には当該構造部分が抗体分子１個に対して複数個が結合している場合が多い。この状況は以下の製造方法の説明においても同様である。
　後述する方法によって入手しうる化合物（２）と、スルフヒドリル基を有する抗体（３a）を反応させることによって、抗体－薬物コンジュゲート（１）を製造することができる。
　スルフヒドリル基を有する抗体（３a）は、当業者周知の方法で得ることができる（Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp.56-136, pp.456-493, Academic Press(1996)）。例えば、Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬を抗体のアミノ基に作用させる；Ｎ－サクシンイミジル　Ｓ－アセチルチオアルカノエート類を抗体のアミノ基に作用させた後、ヒドロキシルアミンを作用させる；Ｎ－サクシンイミジル　３－（ピリジルジチオ）プロピオネートを作用させた後、還元剤を作用させる；ジチオトレイトール、２－メルカプトエタノール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ)等の還元剤を抗体に作用させて抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元してスルフヒドリル基を生成させる；等の方法を挙げることができるがこれらに限定されることはない。
　具体的には、還元剤としてＴＣＥＰを、抗体内ヒンジ部ジスルフィド１個当たりに対して０．３乃至３モル当量用い、キレート剤を含む緩衝液中で、抗体と反応させることで、抗体内ヒンジ部ジスルフィドが部分的又は完全に還元された抗体を得ることができる。キレート剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）等を挙げることができる。これらを１ｍＭ乃至２０ｍＭの濃度で用いればよい。緩衝液としては、リン酸ナトリウムやホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム溶液等を用いることができる。具体的には、抗体は４℃乃至３７℃で１乃至４時間ＴＣＥＰと反応させることで部分的又は完全に還元されたスルフヒドリル基を有する抗体（３a）を得ることが出来る。
　ここでスルフヒドリル基を薬物－リンカー部分に付加させる反応を実施することでチオエーテル結合によって薬物－リンカー部分を結合させることができる。
　スルフヒドリル基を有する抗体（３a）１個あたり、２乃至２０モル当量の化合物（２）を使用して、抗体１個当たり２個乃至８個の薬物が結合した抗体―薬物コンジュゲート（１）を製造することができる。具体的には、スルフヒドリル基を有する抗体（３a）を含む緩衝液に、化合物（２）を溶解させた溶液を加えて反応させればよい。ここで、緩衝液としては、酢酸ナトリウム溶液、リン酸ナトリウムやホウ酸ナトリウム等を用いればよい。反応時のｐＨは５乃至９であり、より好適にはｐＨ７付近で反応させればよい。化合物（２）を溶解させる溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ－メチル－２－ピリドン（ＮＭＰ）等の有機溶媒を用いることができる。
　化合物（２）を溶解させた有機溶媒溶液を、スルフヒドリル基を有する抗体（３a）を含む緩衝液に１乃至２０％ｖ／ｖを加えて反応させればよい。反応温度は、０乃至３７℃、より好適には１０乃至２５℃であり、反応時間は、０．５乃至２時間である。反応は、未反応の化合物（２）の反応性をチオール含有試薬によって失活させることによって終了できる。チオール含有試薬は例えば、システインまたはＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）である。より具体的には、ＮＡＣを、用いた化合物（２）に対して、１乃至２モル当量加え、室温で１０乃至３０分インキュベートすることにより反応を終了できる。
　製造した抗体－薬物コンジュゲート（１）は、以下の共通操作によって濃縮、バッファー交換、精製、抗体濃度及び抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定を行い、抗体－薬物コンジュゲート（１）の同定を行うことができる。
共通操作Ａ：抗体又は抗体－薬物コンジュゲート水溶液の濃縮
　Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ（５０，０００　ＭＷＣＯ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の容器内に抗体又は抗体－薬物コンジュゲート溶液を入れ、遠心機（Ａｌｌｅｇｒａ　Ｘ－１５Ｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いた遠心操作（２０００Ｇ乃至３８００Ｇで５乃至２０分間遠心）にて、抗体又は抗体－薬物コンジュゲート溶液を濃縮した。
共通操作Ｂ：抗体の濃度測定
　ＵＶ測定器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ　１０００，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）を用いて、メーカー規定の方法に従い、抗体濃度の測定を行った。その際に、抗体ごとに異なる２８０ｎｍ吸光係数（１．３ｍＬｍｇ-1ｃｍ-1乃至１．８ｍＬｍｇ-1ｃｍ-1）を用いた。
共通操作Ｃ－１：抗体のバッファー交換
　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５担体を使用したＮＡＰ－２５カラム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７－０８５２－０２，ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｊａｐａｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、メーカー規定の方法に従い、塩化ナトリウム（１３７ｍＭ）及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ，５ｍＭ）を含むリン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ６．０；本明細書でＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡと称する）にて平衡化させた。このＮＡＰ－２５カラム一本につき、抗体水溶液２．５ｍＬをのせた後、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡ３．５ｍＬで溶出させた画分（３．５ｍＬ）を分取した。この画分を共通操作Ａによって濃縮し、共通操作Ｂを用いて抗体濃度の測定を行った後に、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡを用いて１０ｍｇ／ｍＬに抗体濃度を調整した。
共通操作Ｃ－２：抗体のバッファー交換
　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５担体を使用したＮＡＰ－２５カラム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７－０８５２－０２，ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｊａｐａｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、メーカー規定の方法に従い、塩化ナトリウム（５０ｍＭ）及びＥＤＴＡ（２ｍＭ）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６．５；本明細書でＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡと称する）にて平衡化させた。このＮＡＰ－２５カラム一本につき、抗体水溶液２．５ｍＬをのせた後、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡ３．５ｍＬで溶出させた画分（３．５ｍＬ）を分取した。この画分を共通操作Ａによって濃縮し、共通操作Ｂを用いて抗体濃度の測定を行った後に、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡを用いて２０ｍｇ／ｍＬに抗体濃度を調整した。
共通操作Ｄ：抗体－薬物コンジュゲートの精製
　市販のリン酸緩衝液（ＰＢＳ７．４，Ｃａｔ．Ｎｏ．１００１０－０２３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、塩化ナトリウム（１３７ｍＭ）を含むリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ６．０；本明細書でＰＢＳ６．０と称する）又はＳｏｒｂｉｔｏｌ（５％）を含む酢酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ５．５；本明細書でＡＢＳと称する）のいずれかの緩衝液でＮＡＰ－２５カラムを平衡化させた。このＮＡＰ－２５カラムに、抗体－薬物コンジュゲート反応水溶液（約１．５ｍＬ）をのせ、メーカー規定の量の緩衝液で溶出させることで、抗体画分を分取した。この分取画分を再びＮＡＰ－２５カラムにのせ、緩衝液で溶出させるゲルろ過精製操作を計２乃至３回繰り返すことで、未結合の薬物リンカーや低分子化合物（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）、ジメチルスルホキシド）を除いた抗体－薬物コンジュゲートを得た。
共通操作Ｅ：抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定（１）
　抗体－薬物コンジュゲートにおける結合薬物濃度は、抗体－薬物コンジュゲート水溶液の２８０ｎｍ及び３７０ｎｍの二波長におけるＵＶ吸光度を測定した後に下記の計算を行うことで、算出することができる。
　ある波長における全吸光度は系内に存在する全ての吸収化学種の吸光度の和に等しい（吸光度の加成性）ことから、抗体と薬物のコンジュゲーション前後において、抗体及び薬物のモル吸光係数に変化がないと仮定すると、抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体濃度及び薬物濃度は、下記の関係式で示される。

Ａ280＝ＡD,280＋ＡA,280＝εD,280ＣD＋εA,280ＣA 式（Ｉ）
Ａ370＝ＡD,370＋ＡA,370＝εD,370ＣD＋εA,370ＣA 式（ＩＩ）

　ここで、Ａ280は２８０ｎｍにおける抗体－薬物コンジュゲート水溶液の吸光度を示し、Ａ370は３７０ｎｍにおける抗体－薬物コンジュゲート水溶液の吸光度を示し、ＡA,280は２８０ｎｍにおける抗体の吸光度を示し、ＡA,370は３７０ｎｍにおける抗体の吸光度を示し、ＡD,280は２８０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体の吸光度を示し、ＡD,370は３７０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体の吸光度を示し、εA,280は２８０ｎｍにおける抗体のモル吸光係数を示し、εA,370は３７０ｎｍにおける抗体のモル吸光係数を示し、εD,280は２８０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体のモル吸光係数を示し、εD,370は３７０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体のモル吸光係数を示し、ＣAは抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体濃度を示し、ＣDは抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物濃度を示す。
　ここで、εA,280、εA,370、εD,280、εD,370は、事前に用意した値（計算推定値又は化合物のＵＶ測定から得られた実測値）が用いられる。例えば、εA,280は、抗体のアミノ酸配列から、既知の計算方法（Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423）によって推定することが出来る。εA,370は、通常、ゼロである。εD,280及びεD,370は、用いるコンジュゲート前駆体をあるモル濃度に溶解させた溶液の吸光度を測定することで、ランベルト・ベールの法則（吸光度＝モル濃度×モル吸光係数×セル光路長）によって、得ることができる。抗体－薬物コンジュゲート水溶液のＡ280及びＡ370を測定し、これらの値を式（Ｉ）及び（ＩＩ）に代入して連立方程式を解くことによって、ＣA及びＣDを求めることができる。さらにＣDをＣAで除することで１抗体あたりの薬物平均結合数が求めることができる。
共通操作Ｆ：抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定（２）
　抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数は、前述の共通操作Ｅに加え、以下の方法を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によっても求めることができる。
［Ｆ－１．ＨＰＬＣ分析用サンプルの調製（抗体－薬物コンジュゲートの還元）］
　抗体－薬物コンジュゲート溶液（約１ｍｇ／ｍＬ、６０μＬ）をジチオトレイトール（ＤＴＴ）水溶液（１００ｍＭ、１５μＬ）と混合する。混合物を３７℃で３０分インキュベートすることで、抗体－薬物コンジュゲートのＬ鎖及びＨ鎖間のジスルフィド結合を切断したサンプルを、ＨＰＬＣ分析に用いる。
［Ｆ－２．ＨＰＬＣ分析］
　ＨＰＬＣ分析を、下記の測定条件にて行う。
　ＨＰＬＣシステム：Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
　検出器：紫外吸光度計（測定波長：２８０ｎｍ）
　カラム：ＰＬＲＰ－Ｓ（２．１×５０ｍｍ、８μｍ、１０００Å；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐ／Ｎ ＰＬ１９１２－１８０２）
　カラム温度：８０℃
　移動相Ａ：０．０４％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液
　移動相Ｂ：０．０４％ＴＦＡを含むアセトニトリル溶液
　グラジエントプログラム：２９％－３６％（０分－１２．５分）、３６％－４２％（１２．５－１５分）、４２％－２９％（１５分－１５．１分）、２９％－２９％（１５．１分－２５分）
　サンプル注入量：１５μＬ
［Ｆ－３．データ解析］
〔Ｆ－３－１〕　薬物の結合していない抗体のＬ鎖（Ｌ０）及びＨ鎖（Ｈ０）に対して、薬物の結合したＬ鎖（薬物が一つ結合したＬ鎖：Ｌ１）及びＨ鎖（薬物が一つ結合したＨ鎖：Ｈ１、薬物が二つ結合したＨ鎖：Ｈ２、薬物が三つ結合したＨ鎖：Ｈ３）は、結合した薬物の数に比例して疎水性が増して保持時間が大きくなることから、Ｌ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３の順に溶出される。Ｌ０及びＨ０との保持時間比較により検出ピークをＬ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３のいずれかに割り当てることができる。
〔Ｆ－３－２〕　薬物リンカーにＵＶ吸収があるため、薬物リンカーの結合数に応じて、Ｌ鎖、Ｈ鎖及び薬物リンカーのモル吸光係数を用いて下式に従ってピーク面積値の補正を行う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　ここで、各抗体におけるＬ鎖及びＨ鎖のモル吸光係数（２８０ｎｍ）は、既知の計算方法（Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423）によって、各抗体のＬ鎖及びＨ鎖のアミノ酸配列から推定される値を用いることができる。ｈＴＩＮＡの場合、そのアミノ酸配列に従って、Ｌ鎖のモル吸光係数として３４６９０を、Ｈ鎖のモル吸光係数として９５０００を推定値として用いた。また、薬物リンカーのモル吸光係数（２８０ｎｍ）は、各薬物リンカーをメルカプトエタノール又はＮ－アセチルシステインで反応させ、マレイミド基をサクシニイミドチオエーテルに変換した化合物の実測のモル吸光係数（２８０ｎｍ）を用いた。
〔Ｆ－３－３〕　ピーク面積補正値合計に対する各鎖ピーク面積比（％）を下式に従って計算する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
〔Ｆ－３－４〕　抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数を、下式に従って計算する。
　薬物平均結合数＝（Ｌ０ピーク面積比×０＋Ｌ０ピーク面積比×１＋Ｈ０ピーク面積比×０＋Ｈ１ピーク面積比×１＋Ｈ２ピーク面積比×２＋Ｈ３ピーク面積比×３）／１００×２
　製造方法１における式（２）で示される化合物は次式：
(maleimid-N-yl)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)
で示される化合物である。
　式中、
n3は、整数の２から８を示し、
L2は、-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-又は単結合を示し、
　ここで、n4は、１から６の整数を示し、
LPは、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選ばれる２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基を示し、
n1は、０から６の整数を示し、
n2は、０から５の整数を示し、
Laは、-O-又は単結合を示し、
(maleimid-N-yl)-は、次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
で示される、マレイミジル基（2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl基）であって、窒素原子が結合部位となっている基であり、
-(NH-DX)は、次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
　L2は、単結合であるか、-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-である場合にはn4が整数の２から４であることが製造中間体として好ましい。
　LPのペプチド残基としては、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選ばれるアミノ酸からなるペプチド残基である化合物が製造中間体として好ましい。この様なペプチド残基のうち、LPが４個のアミノ酸で構成されるペプチド残基である化合物が製造中間体として好ましい。より具体的には、LPが-GGFG-のテトラペプチド残基である化合物が製造中間体として好ましい。
　また、-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-としては、-NH-CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物が製造中間体として好ましく、より好ましくは、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2である化合物である。
　さらに、式（２）で示される化合物は、n3が整数の２から５であり、L2が単結合であり、-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-が、-NH-CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物が製造中間体として好ましい。より好ましくは、-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-が、-NH-CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物である。さらに、n3が、整数の２又は５である化合物が好ましい。
　また、式（２）で示される化合物は、n3が整数の２から５であり、L2が-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-であって、n4が整数の２から４であり、-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-が、-NH-CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物が製造中間体として好ましい。より好ましくは、n4が整数の２又は４の化合物である。さらに、-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-が、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物が好ましい。
　この様な本発明化合物の製造に有用な中間体として好ましいものとしては以下のものを例示することができる。
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
　上記の製造中間体化合物の群から選ばれる薬物－リンカー化合物を、抗ＴＲＯＰ２抗体又はその反応性誘導体と反応させることによって抗ＴＲＯＰ２抗体のヒンジ部に存在するジスルフィド結合部分においてチオエーテル結合を形成させて本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートを製造することができる。この場合、抗ＴＲＯＰ２抗体の反応性誘導体を使用することが好ましく、特に抗ＴＲＯＰ２抗体を還元処理して得られる反応性誘導体が好ましい。
　以下のものが製造中間体としてより好ましい化合物である。
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
　また、上記の中間体化合物群の中では次式：
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、又は
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
で示される化合物がさらに好ましい化合物である。
　なお、コンジュゲートの量を確保するために、同様な条件で作製して得られた平均薬物数が同程度の複数のコンジュゲート（例えば±１程度）を混合して新たなロットにすることができる。その場合、平均薬物数は混合前の平均薬物数の間に収まる。
２．製造方法２
　先の製造方法で使用した中間体である式（２）で示される化合物及びそれらの薬理上許容される塩は例えば下記の方法によって製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
［式中、L1’は末端マレイミジル基を示し、P1、P2及びP3は保護基を示す。］
　カルボン酸（５）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩基存在下、NH2-DX（４）またはその薬理上許容される塩と反応させることによって化合物（６）を製造することができる。NH2-DX（４）は、エキサテカン（化学名：(1S,9S)-1-アミノ-9-エチル-5-フルオロ-2,3-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-10,13(9H,15H)-ジオン）を示す。
　この反応は、ペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよい。活性エステルには各種のものがあるが、例えばｐ－ニトロフェノール等のフェノール類、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール或はＮ－ヒドロキシスクシンイミド等とカルボン酸（５）をＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド或は１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩等の縮合剤を用いて反応させれば製造できる。また、活性エステルは、カルボン酸（５）とペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート等との反応；カルボン酸（５）と１－ベンゾトリアゾリルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファイトとの反応；カルボン酸（５）とシアノホスホン酸ジエチルとの反応（塩入法）；カルボン酸（５）とトリフェニルホスフィン及び２，２’－ジピリジルジスルフィドとの反応（向山法）；カルボン酸（５）と４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロライド（ＤＭＴＭＭ）等のトリアジン誘導体との反応；等によっても製造することができる。また、カルボン酸（５）を塩基存在下に塩化チオニル、オキザリルクロリド等の酸ハロゲン化物で処理することによって製造できる酸ハライド法等によって反応を行うこともできる。
　上記の様に得たカルボン酸（５）の活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物を化合物（４）と適当な塩基存在下に不活性な溶媒中で－７８℃～１５０℃の反応温度で反応させることによって化合物（６）を製造することができる。なお、「不活性な溶媒」とはその溶媒が採用された反応において実施される目的とされた反応を阻害することのない溶媒を意味する。
　上記の各工程に用いる具体的な塩基としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムエトキシド、カリウムブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム等の、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の炭酸塩、アルコキシド、水酸化物、又は水素化物；ｎ－ブチルリチウム等のアルキルリチウム、又はリチウムジイソプロピルアミドの様なジアルキルアミノリチウムに代表される有機金属塩基；リチウムビス（トリメチルシリル）アミド等のビスシリルアミンの有機金属塩基；さらにはピリジン、２，６－ルチジン、コリジン、４－ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、ジイソプロピルエチルアミン、ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク－７－エン（ＤＢＵ）等の三級アミン或は含窒素複素環化合物等の有機塩基等を挙げることができる。
　本反応に用いる不活性な溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素系溶媒；テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、ジオキサン等のエーテル系溶媒；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリジン－２－オン等のアミド系溶媒；を挙げることができ、これらに加えて場合によってはジメチルスルホキシド、スルホラン等のスルホキシド系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒；メタノール、エタノール等のアルコール系の溶媒等を使用することも可能である。さらにはこれ等を混合して使用することもできる。
　化合物（６）の末端アミノ基の保護基P1としては、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基や９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等、ペプチド合成に通常用いられているアミノ基の保護基を用いることができる。他のアミノ基の保護基としては、アセチル基等のアルカノイル基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基；パラメトキシベンジルオキシカルボニル基、パラ（又はオルト）ニトロベンジルオキシカルボニル基等のアリールメトキシカルボニル基；ベンジル基、トリフェニルメチル基等のアリールメチル基；ベンゾイル基等のアロイル基；２，４－ジニトロベンゼンスルホニル基、オルトニトロベンゼンスルホニル基等のアリールスルホニル基；を挙げることができる。保護基P1は、アミノ基を保護する化合物の性質等に応じて選択すればよい。
　得られた化合物（６）の末端アミノ基の保護基P1を脱保護させることによって化合物（７）を製造することができる。この脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
　Ｎ末端をP2で保護したペプチドカルボン酸（８）を活性エステル、混合酸無水物等に誘導し、得られた化合物（７）に反応させることによって、化合物（９）を製造することができる。ペプチドカルボン酸（８）と化合物（７）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩基、及び不活性な溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。保護基P2は、化合物（６）の保護基で述べたものから適宜選択して使用すればよく、アミノ基を保護する化合物の性質等に応じて選択すればよい。また、ペプチド合成に通常用いられている様に、ペプチドカルボン酸（８）を構成するアミノ酸又はペプチドを順次反応と脱保護を繰り返し、伸長させて化合物（９）を製造することもできる。
　得られた化合物（９）のアミノ基の保護基P2を脱保護させることによって化合物（１０）を製造することができる。この脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
　カルボン酸（１１）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、得られた化合物（１０）に反応させることによって、化合物（２）又はを製造することができる。カルボン酸（１１）と化合物（１０）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩基、及び不活性溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
　化合物（９）は例えば下記の方法でも製造することができる。
　Ｎ末端をP2で保護したペプチドカルボン酸（８）を活性エステル、混合酸無水物等に誘導し、塩基存在下、カルボキシ基をP3で保護したアミン化合物（１２）と反応させることによって化合物（１３）を製造することができる。ペプチドカルボン酸（８）と化合物（１２）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩基、及び不活性な溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
　化合物（１３）のアミノ基の保護基P2は、通常用いられる保護基で保護されていてよい。
　具体的には水酸基の保護基としては、メトキシメチル基等のアルコキシメチル基；ベンジル基、４－メトキシベンジル基、トリフェニルメチル基等のアリールメチル基；アセチル基等のアルカノイル基；ベンゾイル基等のアロイル基；ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基等のシリル基；等を挙げることができる。カルボキシ基は、メチル基、エチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等のアルキル基、アリル基、又はベンジル基等のアリールメチル基とのエステル等として保護することができる。アミノ基は、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等のアルキルオキシカルボニル基；アリルオキシカルボニル基、又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、パラメトキシベンジルオキシカルボニル基、パラ（又はオルト）ニトロベンジルオキシカルボニル基等のアリールメトキシカルボニル基；のほか、アセチル基等のアルカノイル基；ベンジル基、トリフェニルメチル基等のアリールメチル基；ベンゾイル基等のアロイル基；２，４－ジニトロベンゼンスルホニル基、オルトニトロベンゼンスルホニル基等のアリールスルホニル基；等を挙げることができる。
　カルボキシ基の保護基P3としては、有機合成化学、中でもペプチド合成においてカルボキシ基の保護基として通常用いられている保護基を使用すればよく、具体的にはメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ－ブチル等のアルキルエステル、アリルエステル、ベンジルエステル等であり上記の保護基から適宜選択して使用すればよい。この場合に、アミノ基の保護基とカルボキシ基の保護基が異なる方法又は条件で除去できることが好ましい。例えばP2がｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基であり、P3がベンジル基である組み合わせ等を代表的なものとして挙げることができる。それらの保護基はアミノ基とカルボキシ基を保護する化合物の性質等に応じて上述したものから選択すればよく、それらの保護基の切断に際してもその保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
　得られた化合物（１３）のカルボキシ基の保護基P3を脱保護させることによって化合物（１４）を製造することができる。この脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
　得られた化合物（１４）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩基存在下、化合物（４）と反応させることによって化合物（９）を製造することができる。この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条件や試薬、塩基、及び不活性な溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
　化合物（２）は、例えば下記の方法でも製造することができる。
　化合物（１３）のアミノ基の保護基P2を脱保護させることによって化合物（１５）を製造することができる。この脱保護は、その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
　カルボン酸誘導体（１１）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩基存在下、得られた化合物（１５）と反応させることによって化合物（１６）を製造することができる。ペプチドカルボン酸（１１）と化合物（１５）のアミド結合を形成する反応条件や試薬、塩基、及び不活性な溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
　得られた化合物（１６）のカルボキシ基の保護基を脱保護させることによって化合物（１７）を製造することができる。この脱保護は、化合物（１４）の製造におけるカルボキシ基の脱保護と同様に行うことができる。
　化合物（１７）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩基存在下、化合物（４）と反応させることによって化合物（２）を製造することができる。この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条件や試薬、塩基、及び不活性な溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
３．製造方法３
　中間体の式（２）で示される化合物は下記の方法によっても製造することもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
［式中、L1’は末端がマレイミジル基に変換された構造のL1であり、P4は保護基を示す。］
　化合物（１１）を活性エステル、混合酸無水物等に誘導し、塩基存在下、Ｃ末端をP4で保護したペプチドカルボン酸（１８）と反応させることによって化合物（１９）を製造することができる。ペプチドカルボン酸（１８）と化合物（１１）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、塩基、及び不活性な溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。化合物（１８）のカルボキシ基の保護基P4は先に述べた保護基から適宜選択して使用すればよい。
　得られた化合物（１９）のカルボキシ基の保護基を脱保護させることによって化合物（２０）を製造することができる。この脱保護は、化合物（１４）の製造におけるカルボキシ基の脱保護と同様に行うことができる。
　得られた化合物（２０）を活性エステル、又は混合酸無水物等に誘導し、化合物（７）に反応させることによって、化合物（２）を製造することができる。この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条件や試薬、塩基、及び不活性な溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
４．製造方法４
　以下に、製造方法２に記載の製造中間体（１０）のうち、n1=1、Ｌa=Oの化合物（１０ｂ）の製造方法について詳述する。式（１０ｂ）で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物は、例えば下記の方法で製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
［式中、LPは前記と同じものを示し、Lはアシル基であって、アセチル基等のアルカノイル基若しくはベンゾイル基等のアロイル基であるか、又は水素原子等を示し、Ｘ及びＹは１から３個のアミノ酸からなるオリゴペプチドを、P5及びP7はアミノ基の保護基を、P6はカルボキシ基の保護基を示す。］
　式（２１）で示される化合物は、特開２００２－６０３５１号公報に記載される手法や文献（J. Org. Chem., 51巻，3196頁，1986年）記載の方法、又はその方法を応用し、必要に応じて保護基の除去や官能基変換を行うことによって、製造することができる。この他、末端アミノ基が保護されたアミノ酸又はアミノ基が保護されたオリゴペプチドの酸アミドをアルデヒド又はケトンと処理することによって得ることができる。
　化合物（２１）を、不活性な溶媒中、酸または塩基存在下で冷却下から室温の温度条件で水酸基を有する化合物（２２）と反応させることによって、化合物（２３）を製造することができる。
　ここで使用できる酸としては例えば、フッ化水素酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等の無機酸；酢酸、クエン酸、パラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸等の有機酸；テトラフルオロボレート、塩化亜鉛、塩化スズ、塩化アルミニウム、塩化鉄等のルイス酸；等を挙げることができる。これらのうちではスルホン酸類、特にパラトルエンスルホン酸が好ましい。さらに塩基としては、既に述べられた塩基の中から適宜選択して使用すればよく、特にカリウム　ｔｅｒｔ－ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド；水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物；水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物；リチウム　ジイソプロピルアミド等のジアルキルアミノリチウムに代表される有機金属塩基；リチウム　ビス（トリメチルシリル）アミド等のビスシリルアミンの有機金属塩基；等が好ましい。反応に用いる溶媒としては、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン等のエーテル系溶媒；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒；等が用いられる。上記の溶媒は水との混合物としてもよい。また、P5に例示されるアミノ基の保護基としては、通常、アミノ基の保護に用いられる基であれば特に制限はない。代表的なものとして製造方法２で記載したアミノ基の保護基を挙げることができるが、本反応中においてP5に例示されるアミノ基の保護基が切断される場合がある。その場合には、必要に応じて適当なアミノ基の保護試薬と適宜反応させて再度保護基を導入すればよい。
　化合物（２４）は、化合物（２３）の保護基P6を除去することによって製造することができる。ここで、P6として例示されるカルボキシ基の保護基としては、製造方法２に代表的なものが記載されており、ここから適宜選択することができる。化合物（２３）においては、アミノ基の保護基P5とカルボキシ基の保護基P6が異なる方法又は条件で除去できる保護基であることが望ましい。例えば、P5が９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基であり、P6がベンジル基である組み合わせ等を代表的なものとして挙げることができる。それらの保護基は、アミノ基及びカルボキシ基を保護する化合物の性質等に応じて選択すればよく、それらの保護基の除去に際してもその保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
　カルボン酸（２４）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩基存在下、化合物（４）又はその薬理上許容される塩と反応させることによって化合物（２５）を製造し、得られた化合物（２５）の保護基P5を除去することによって化合物（２６）を製造することができる。化合物（４）とカルボン酸（２４）との反応及び保護基P6を除去する反応では、製造方法２で述べた試薬や反応条件と同様のものを用いればよい。
　化合物（２６）と末端アミノ基が保護されたアミノ酸又はアミノ基が保護されたオリゴペプチド（２７）を反応させることによって化合物（９ｂ）を製造し、得られた化合物（９ｂ）の保護基P7を除去することによって化合物（１０ｂ）を製造することができる。P7として示されるアミノ基の保護基としては、通常、アミノ基の保護に用いられる基であれば特に制限はなく、代表的なものとして製造方法２で記載したアミノ基の保護基を挙げることができ、その除去に際しても保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。化合物（２６）と化合物（２７）との反応では、ペプチド合成に通常使用される反応試薬や条件を準用すればよい。上記の方法で製造した化合物（１０ｂ）は、上述の製造方法に従って本発明化合物（１）に導くことができる。
　本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートは、大気中に放置したり、又は再結晶する等して精製することにより、水分を吸収し、吸着水が付着したり、水和物になる場合が有り、その様な水を含む化合物及び塩も本発明に包含される。
　また、本発明には、種々の放射性または非放射性同位体でラベルされた化合物も包含される。本発明の抗体－薬物コンジュゲートを構成する原子の１以上に、原子同位体の非天然割合も含有し得る。原子同位体としては、例えば、重水素（2H）、トリチウム（3H）、ヨウ素－125（125I）または炭素－14（14C）等を挙げることができる。また、本発明化合物は、例えば、トリチウム（3H）、ヨウ素－125（125I）または炭素－14（14C）等の放射性同位体で放射性標識され得る。放射性標識された化合物は、治療または予防剤、研究試薬、例えば、アッセイ試薬、及び診断剤、例えば、インビボ画像診断剤として有用である。本発明の抗体－薬物コンジュゲートの全ての同位体変異種は、放射性であると否とを問わず、本発明の範囲に包含される。
［医薬］
　本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートは、癌細胞に対して細胞傷害活性を示すことから、医薬として、特に癌に対する治療剤及び/又は予防剤として使用することができる。
　すなわち本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートは、癌治療の主要な治療法である化学療法のための薬剤として選択して使用することができ、その結果として、癌細胞の成長を遅らせ、増殖を抑え、さらには癌細胞を破壊することができる。これ等によって、癌患者において、癌による症状からの解放や、ＱＯＬの改善を達成でき、癌患者の生命を保って治療効果が達成される。癌細胞の破壊には至らない場合であっても、癌細胞の増殖の抑制やコントロールによって癌患者においてより高いＱＯＬを達成しつつより長期の生存を達成させることができる。
　本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートは、薬物単独での使用の他、アジュバント療法において他の療法と組み合わせる薬剤としても使用でき、外科手術や、放射線療法、ホルモン療法等と組み合わせることができる。さらにはネオアジュバント療法における薬物療法の薬剤として使用することもできる。
　以上のような治療的使用の他、抗体の抗原への結合性によって微細な転移癌細胞に結合して癌細胞の増殖を押さえ、さらには破壊する効果も期待することができる。すなわち、特に原発性の癌細胞においてＴＲＯＰ２の発現が確認されたときに本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートを投与することよって癌転移の抑制や、予防効果を期待することができる。例えば、転移過程で体液中にある癌細胞を抑制、破壊する効果や、いずれかの組織に着床した直後の微細な癌細胞に対する抑制、破壊等の効果が期待できる。また、特に外科的な癌の除去後においての癌転移の抑制、予防効果が期待でき、これらによって癌の転移抑制効果が期待できる。
　本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートは、患者に対しては全身療法として全身的に投与する他、癌組織に局所的に投与して治療効果を期待することができる。
　本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートが適用される癌の種類としては、肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌等を挙げることができるが、治療対象となる癌細胞において抗体－薬物コンジュゲート中の抗体が認識できるタンパクを発現している癌細胞であればこれらには限定されることはない。
　本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートは、哺乳動物に対して好適に投与することができるが、より好ましくはヒトである。
　本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートが含まれる医薬組成物において使用される物質としては、投与量や投与濃度において、この分野において通常使用される製剤添加物その他から適宜選択して適用することができる。
　本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートは、１種以上の薬学的に適合性の成分を含む薬学的組成物として投与され得る。例えば、上記薬学的組成物は、代表的には、１種以上の薬学的キャリア（例えば、滅菌した液体）を含む。ここで液体には、例えば、水及び油（石油、動物起源、植物起源又は合成起源の油）が含まれる。油は、例えば、ラッカセイ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等であってよい。水は、上記薬学的組成物が静脈内投与される場合に、より代表的なキャリアである。食塩水溶液、ならびにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液もまた、液体キャリアとして、特に、注射用溶液のために使用され得る。適切な薬学的賦形剤は、当該分野で公知である。上記組成物はまた、所望であれば、微量の湿潤剤又は乳化剤、或はｐＨ緩衝化剤を含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。その処方は、投与の態様に対応する。
　種々の送達システムが公知であり、本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートを投与するために使用され得る。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下の経路を挙げることができるが、これらに限定されることはない。投与は、例えば、注入またはボーラス注射によるものであり得る。特定の好ましい実施形態において、上記リガンド薬物結合体の投与は、注入によるものである。非経口的投与は、好ましい投与経路である。
　代表的実施形態において、上記薬学的組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した薬学的組成物として、常習的手順に従って処方される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌の等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要である場合、上記医薬はまた、可溶化剤及び注射部位での疼痛を和らげるための局所麻酔剤（例えば、リグノカイン）を含み得る。一般に、上記成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェ等に密封してシールされた容器中の乾燥凍結乾燥粉末または無水の濃縮物として、別個に、または単位剤形中で一緒に混合して、のいずれかで供給される。上記医薬が注入によって投与される形態である場合、それは、例えば、滅菌の製薬グレードの水または食塩水を含む注入ボトルで投薬され得る。上記医薬が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または食塩水のアンプルは、例えば、上記成分が投与前に混合され得るように、提供され得る。
　本発明の医薬組成物は、本願の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートのみを含む医薬組成物であってもよいし、抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲート及び少なくとも一つのこれ以外の癌治療剤を含む医薬組成物であってもよい。本発明の抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートは、他の癌治療剤と共に投与することもでき、これによって抗癌効果を増強させることができる。この様な目的で使用される他の抗癌剤は、抗体－薬物コンジュゲートと同時に、別々に、或は連続して個体に投与されてもよいし、それぞれの投与間隔を変えて投与してもよい。この様な癌治療剤として、ａｂｒａｘａｎｅ、ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（ＣＰＴ－１１）、ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ、ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ又は国際公開第２００３／０３８０４３号に記載の薬剤、更にＬＨ－ＲＨアナログ（リュープロレリン、ゴセレリン等）、エストラムスチン・フォスフェイト、エストロジェン拮抗薬（タモキシフェン、ラロキシフェン等）、アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン等）等を挙げることができるが、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば限定されることはない。
　この様な医薬組成物は、選択された組成と必要な純度を持つ製剤として、凍結乾燥製剤或は液状製剤として製剤化すればよい。凍結乾燥製剤として製剤化する際には、この分野において使用される適当な製剤添加物が含まれる製剤であってもよい。また液剤においても同様にして、この分野において使用される各種の製剤添加物を含む液状製剤として製剤化することができる。
　医薬組成物の組成及び濃度は投与方法によっても変化するが、本発明の医薬組成物に含まれる抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲートの抗原に対する親和性、すなわち、抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）の点において、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、少量の投与量であっても薬効を発揮させことができる。したがって、抗体－薬物コンジュゲートの投与量の決定に当たっては、抗体－薬物コンジュゲートと抗原との親和性の状況に基づいて投与量を設定することもできる。本発明の抗体－薬物コンジュゲートをヒトに対して投与する際には、例えば、約０．００１～１００ｍｇ／ｋｇを１回或は１～１８０日間に１回の間隔で複数回投与すればよい。
　以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、これらはいかなる意味においても限定的に解釈されるものではない。また、本明細書において、特に記載のない試薬、溶媒及び出発材料は、市販の供給源から容易に入手可能である。
［実施例１：マウスの免疫とハイブリドーマの取得］
１－１）マウス免疫に用いる細胞の準備
　５×１０6個のＮＣＩ－Ｈ３２２細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞株、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－５８０６；ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）をＲＰＭＩ－１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ－１６４０）培地（１０ｍｌ）で５日間培養後に回収し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄し、ＰＢＳ（５００μｌ）中に再懸濁した。
１－２）マウスへの免疫
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）に対し、１回目の免疫はＮＣＩ－Ｈ３２２細胞（１×１０7個）を腹腔内へ免疫した。２～５回目は１週間間隔で１×１０6個のＮＣＩ－Ｈ３２２細胞を腹腔内へ免疫した。６回目の最終免疫では、ＮＣＩ－Ｈ３２２細胞を１×１０6細胞／２００μｌ　ＰＢＳで尾静脈ならびに腹腔内へそれぞれ免疫した。脾臓細胞は最終免疫から３日後に摘出した。
１－３）免疫したマウスの脾臓細胞の準備
　免疫済みマウスの脾臓を摘出し、すりつぶしてＲＰＭＩ　１６４０　１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）（＋）培地に懸濁した。細胞懸濁液をセルストレイナー（１００μｍ、ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社）に通した後、１５００ｒｐｍで５分間、室温にて遠心して上清を廃棄した。Ｔｒｉｓ－ＮＨ4Ｃｌ溶液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５、０．８３％ＮＨ4Ｃｌ；１０ｍＬ）を加え、室温で５分間処理した。細胞懸濁液にＲＰＭＩ　１６４０ＦＢＳ（＋）培地（１０ｍｌ）を加え、セルストレイナーに通した後、１５００ｒｐｍで５分間、室温にて遠心した。上清を廃棄し、脾臓細胞をＲＰＭＩ　１６４０　ＦＢＳ（－）培地（１０ｍｌ）で再懸濁した。
１－４）ミエローマ細胞の準備
　Ｐ３Ｕ１細胞（マウスミエローマ細胞株）を回収し、１５００ｒｐｍで５分間、室温にて遠心した。Ｐ３Ｕ１細胞にＥＤＴＡ（０．０２％）溶液（１０ｍｌ）を加え、３７℃で５分間処理した。Ｐ３Ｕ１細胞懸濁液を１５００ｒｐｍで５分間、室温にて遠心した。上清を廃棄し、ＲＰＭＩ　１６４０　ＦＢＳ（－）培地（１０ｍｌ）で再懸濁した。
１－５）細胞融合
　脾臓細胞とミエローマ細胞を５：１になるように混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した。得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、ポリエチレングリコール－４０００（ＰＥＧ－４０００；１ｍＬ）を約１分かけて徐々に加えた。その後該細胞液に１分毎にＲＰＭＩ培地（１ｍＬ）を数回加えた後、ＲＰＭＩ培地を加えて全量を５０ｍＬとした。該細胞懸濁液を遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）し、得られた沈殿画分の細胞をゆるやかにほぐした後、ＨＡＴ培地（１０％ウシ胎児血清及びＨＡＴ　Ｍｅｄｉａ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを加えた　ＭＩ１６４０培地；１００ｍＬ）中にゆるやかに懸濁した。該懸濁液を９６ウェル培養用プレートに２００μＬ／ウェルずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター中で、５０％コンフルエントとなるまで培養した。
１－６）変異型アデノウイルスウイルスＦＺ３３でのハイブリドーマのスクリーニング
　ＮＣＩ－Ｈ３２２細胞を、９６ウェルプレートに５×１０3細胞／ウェルで播種し、３７℃で４８時間培養した。細胞を１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、各ウェルに対して、各ハイブリドーマ培養上清（５０μｌ）を加え４℃で１時間反応させた。１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、アデノウイルスＡｘ３ＣＡＺ３－ＦＺ３３（抗体に結合するようにＺ３３ファイバーが改変されたβ－ガラクトシダーゼ発現アデノウイルス（米国特許出願公開第２０１２／０２３７５１８号明細書を参照））を３×１０6ｖｐ／１００μｌ（１×１０3ｖｐ／細胞）の濃度になるようにＲＰＭＩ１６４０（－）培地で希釈し、この希釈溶液を１００μｌ／ウェルで加えた。４℃で１時間反応後、１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。ＲＰＭＩ１６４０　ＦＢＳ（＋）培地を１００μｌ／ウェルで加えて３７℃で２４時間培養した。Ｇａｌａｃｔｏ－Ｌｉｇｈｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用したβ－Ｇａｌレポーター遺伝子アッセイで処理したＮＣI－Ｈ３２２細胞を２００μｌ／ウェルのＰＢＳで洗浄し、Ｌｙｓｉｓ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを５０μｌ／ウェルで加えて室温で１０分間静置した。この細胞溶解液（１０μＬ）をＧａｌａｃｔｏｎ－Ｐｌｕｓ　Ｇａｌａｃｔｏ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｄｉｌｕｅｎｔで１００倍に希釈し、Ｗｈｉｔｅ　ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　ＳＨ　９６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）に加えて室温で１時間反応させた。Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ　ＩＩを１５０μｌ／ウェルで加え、マルチラベルカウンターＷａｌｌａｃ　１４２０ＡＲＶＯｓｘ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社）を用いて化学発光を５秒間測定し、１秒あたりの平均値をＲＬＵ（発光量）として、ＮＣI－Ｈ３２２細胞へのウイルス感染量を表した。この様に行ったハイブリドーマ群のスクリーニングにおいて、測定値（ＲＬＵ）が群全体（最小値１３８３ＲＬＵ、平均値１０９１４ＲＬＵ、最大値７８７４６ＲＬＵ）の中で、５０００ＲＬＵ以上のクローンを選抜した。まず、１次スクリーニングとして、一回の細胞融合で得られた９６０ウェルのハイブリドーマウェルのうち８１ウェルの陽性ウェルを選抜した。さらに、確認スクリーニングとして、１次スクリーニングと同様の手法により、デュプリケート（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）でアッセイを行って、両方の測定値が５０００ＲＬＵ以上のウェルを陽性とし、１次スクリーニングで得られた８１ウェルから５２ウェルの陽性ウェルを選抜した。選抜したクローンは２～４回サブクローニングを行い、モノクローナルなハイブリドーマ細胞株４４株を樹立した。
［実施例２：ハイブリドーマからの抗体の精製］
　プリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ；２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン；０．５ｍｌ）を腹腔内投与して予め２週間飼育した８～１０週齢のマウス又はヌードマウスに、実施例１で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射した。さらに１０～２１日してハイブリドーマを腹水癌化させた後に腹水を採取した。得られた腹水を遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＧ－カラムによる精製を行い、ＩｇＧ又はＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とした。
［実施例３：ハイブリドーマの産生する抗体の結合する抗原の同定］
　実施例２において調製されたハイブリドーマの産生する抗体の一つであるＴＩＮＡ１について抗原の同定を行った。
３－１）ビオチンラベルした細胞表面蛋白質のＴＩＮＡ１抗体を用いた免疫沈降
　５×１０6個のＮＣＩ－Ｈ３２２細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＥＺ－Ｌｉｎｋ　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社）を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに懸濁した。ＮＣＩ－Ｈ３２２細胞をＢｉｏｔｉｎ／ＰＢＳ溶液中、室温で３０分間ローテートした後に１００ｍＭグリシン／ＰＢＳ溶液（２５ｍｌ）で２回洗浄し、その後、ＰＢＳ（２５ｍｌ）で３回洗浄した。洗浄後の細胞を溶解バッファー（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．６、１％ＮＰ－４０　＋　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＥＤＴＡ　ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ社）１粒／５０ｍｌ；２ｍｌ）中に再懸濁し、４℃で３０分間処理した。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社））のバッファーを溶解バッファーに置換して得られたＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ／溶解バッファー（５０％スラリー；３０μｌ）を細胞溶解液に加え、４℃で１時間ローテートした後に４℃で５分間遠心し、上清を回収した。この上清にＴＩＮＡ１抗体（３μｇ）を加え、４℃で１時間ローテートした後にＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ／溶解バッファー（５０％スラリー；６０μｌ）を加え、４℃で２時間ローテートした。溶解バッファー（１ｍｌ）でＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを６回洗浄した後に１×ＳＤＳサンプルバッファー／５％　２－ＭＥ（２－メルカプトエタノール）ｂｕｆｆｅｒ（６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃でｐＨ６．８）、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ及び０．０１％（ｗ／ｖ）ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅｄ）に再懸濁した。１００℃で５分間懸濁液を処理した後、溶液を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）のためのサンプルとした。
３－２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング
　３－１）で調製したＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルをＲｅａｄｙ　Ｇｅｌｓ　Ｊ　５－２０％（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて２０ｍＡで泳動した後、ゲルよりメンブレンへ０．１ｍＡ／ｃｍ2でブロッティングした。メンブレンをＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ（－）－０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間洗浄した後、１時間ブロッキングを行った。メンブレンをＰＢＳ－Ｔで５分間３回洗浄した後にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社；ＰＢＳ－Ｔで２０００倍に希釈して使用）と１時間反応させた。メンブレンをＰＢＳ－Ｔで１０分間４回洗浄した後に、ＥＣＬ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）及びＨｙｐｅｒｆｉｌｍ　ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて目的のバンドを検出した。実施例３－１）の手順によりビオチンラベルしたＮＣＩ－Ｈ３２２細胞を、既に質量分析によって抗原がＴＲＯＰ２であることが確定しているＫＣＩ７Ａ３抗体及びＴＩＮＡ１抗体で免疫沈降して得られた免疫沈降物を、それぞれＤＴＴ非添加或はＤＴＴ添加でＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより解析した。ＫＣＩ７Ａ３抗体とＴＩＮＡ１抗体を用いたいずれの場合においても、ＤＴＴ非添加では分子量４６ｋＤａのバンドが、ＤＴＴを添加したサンプルでは分子量３７ｋＤａのバンドが検出された。
３－３）ＦＡＣＳ解析
　バンドパターンからＴＩＮＡ１抗体の抗原がＴＲＯＰ２であることが予測できたため、質量分析を行わずにｃＤＮＡの遺伝子導入による強制発現解析を行った。ＦＡＣＳ解析の結果、ヒトＴＲＯＰ２発現ＣＨＯＫ１細胞ではＴＩＮＡ１抗体は強陽性反応を示したため、ＴＩＮＡ１抗体の抗原はＴＲＯＰ２であることが示された。また、肺癌細胞株ＰＣ１４、肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ３２２、肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ２１２２、肺癌細胞株ＬＣＡＭ１、肺癌細胞株ＬＣ２／ａｄ、膵癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ２、膵癌細胞株ＰＫ－１、前立腺癌細胞株ＰＣ３、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、メラノーマ細胞株Ａ３７５、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、造血系腫瘍細胞株ＲＰＭＩ８２２６、造血系腫瘍細胞株Ｋ５６２、ＰＢＭＣ（ヒト末梢血単核細胞）及びヒト血小板を使用して同様なＦＡＣＳ解析を行った。調査した肺癌細胞株はいずれもＴＲＯＰ２陽性であり、肺癌以外の細胞株ではＰＣ３、ＰＫ１、ＳＫＯＶ３が陽性であった。一方、正常血液細胞はいずれも陰性であった。
［実施例４：抗体内在化活性の測定］
４－１）抗体内在化活性評価系
　抗体の内在化及びイムノトキシン活性の測定を目的にリコンビナント複合蛋白質であるＤＴ３Ｃを作製した。このＤＴ３Ｃは、ジフテリア毒素（ＤＴ）の触媒領域とプロテインＧの抗体結合領域を３個兼ね備えた蛋白質である。ＤＴ３Ｃは抗体のＦｃ部分に特異的に結合し安定で、細胞内へ取り込まれると蛋白質合成阻害により細胞死を誘導する。この系を用いることで抗体の内在化とイムノトキシンによる殺細胞効果を同時に観察することができる（Yamaguchi, M., Hamada, H., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 454 (2014) 600-603）。
４－２）ＤＴ３Ｃによる内在化ならびにイムノトキシン活性の評価
　９６ｗｌｌ　Ｐｌａｔｅに４μｇ／ｍＬのＤＴ３Ｃ（２５μＬ）を加え、さらに実施例１又はこれに準じた方法で取得された１１種のハイブリドーマの培養上清（２５μＬ）を加え、室温で３０分インキュベーションした。なお、ＴＩＮＡ１抗体産生ハイブリドーマ以外のハイブリドーマが産生する抗体の認識する抗原は、ＣＤ９、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ１４７、ＣＤ２７６、ＥｐＣＡＭ、又はＥＧＦＲであることを予め確認した。２×１０4個／ｍＬ（２０％　Ｌｏｗ　ＩｇＧ　ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地）のＮＣＩ－Ｈ３２２細胞（５０μＬ）を播種し、室温で３０分インキュベーションした後、３７℃　ＣＯ2インキュベータで３日間培養した。培養後に上清を除き、１０％ＷＳＴ－１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ１６４０（１００μＬ）を加え、３７℃　ＣＯ2インキュベータ内で１時間インキュベーションし、生細胞数をマイクロプレートリーダー（ＯＤ450～ＯＤ640、ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００、テカンジャパン株式会社）で測定した。評価したハイブリドーマ細胞の培養上清の中で、ＣＤ５９、ＣＤ７１、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、及びＴＲＯＰ２に対する抗体で強い内在化ならびにイムノトキシン活性が認められた（図１０）。
４－３）ＣＤ５９、ＣＤ７１、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、及びＴＲＯＰ２に対する抗体での内在化ならびにイムノトキシン活性の相違
　９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔにＤＴ３Ｃ（０、０．００４、０．０４、０．４、４、４０μｇ／ｍＬ）希釈溶液（２５μＬ）を加え、各抗体（４０μｇ／ｍＬ；２５μＬ）を加え、室温で３０分インキュベーションした。さらに、２×１０4個／ｍＬ（２０％ＬｏｗＩｇＧＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地）のＮＣＩ－Ｈ３２２細胞（５０μＬ）を播種し、室温で３０分インキュベーションした後、３７℃　ＣＯ2インキュベータで３日間培養した。培養後に上清を除き、１０％ＷＳＴ－１加１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ１６４０（１００μＬ）を加え、３７℃　ＣＯ2インキュベータ内で１時間インキュベーションし、生細胞数をプレートリーダー（ＯＤ450～ＯＤ640）で測定した。評価した抗体の中で、ＴＲＯＰ２に対する抗体であるＴＩＮＡ１の内在化ならびにイムノトキシン活性が最も強かった（図１１）。
４－４）抗ＴＲＯＰ２抗体の各クローンにおける内在化ならびにイムノトキシン活性の相違
　実施例１又はこれに準じて取得されたＴＩＮＡ１（免疫原：肺癌株ＮＣＩ－Ｈ３２２）、ＫＣＬ７Ａ３、及びＫＣＬ２Ｄ６（免疫原：膵臓癌株ＫＣＬ－ＭＯＨ１）、Ｐｒ１Ｅ１１及びＰｒ８Ｈ１０（免疫原：前立腺癌株Ｐｃ－１）、ＮＹ１６及びＮＹ１７（免疫原：膵臓癌株ＰＫ－１）並びに市販の７７２２０（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍ）の各抗ＴＲＯＰ２抗体の内在化ならびにイムノトキシン活性について実施例４－３）と同様に評価した。その結果、８種の抗ＴＲＯＰ２抗体の中でＴＩＮＡ１抗体が最も強い活性を有していた（図１２）。
［実施例５：ＴＩＮＡ１抗体遺伝子の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定とキメラＴＩＮＡ１（以下ｃＴＩＮＡ１）抗体の作製］
５－１）ＴＩＮＡ１抗体遺伝子の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
５－１－１）ＴＩＮＡ１抗体産生ハイブリドーマからのｍＲＮＡの調製
　ＴＩＮＡ１抗体の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅するため、ＴＩＮＡ１抗体産生ハイブリドーマよりｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてｍＲＮＡを調製した。
５－１－２）ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成
　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成は実施例５－１－１）で調製したｍＲＮＡ（１００ｎｇ）とＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて実施した。
５－１－３）５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるＴＩＮＡ１抗体の重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
　重鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ　Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに付属）、及び５’－ＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧ－３’（配列番号３３：プライマー　ｍＧ２ａＶＲ２）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に付属のものを使用し、ｍＧ２ａＶＲ２はデータベースのマウス重鎖（ＩｇＧ２ａ）の定常領域の配列から設計した。
　このプライマーの組み合わせと、実施例５－１－２）で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによりＴＩＮＡ１抗体の重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ－ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲで増幅した重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。シークエンスプライマーとして、データベースのマウス重鎖の定常領域の配列から設計した上記プライマー　ｍＧ２ａＶＲ２、及びＮＵＰ（Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに付属）を用いた。
　シークエンス解析は遺伝子配列解析装置（「ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ」或は「Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３７３０ｘｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ」、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて実施し、シークエンス反応は、Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。
　決定されたＴＩＮＡ１抗体の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号１に示し、アミノ酸配列を配列番号２に示した。
５－１－４）５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるＴＩＮＡ１抗体の軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
　ＴＩＮＡ１抗体の軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ　Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに付属）及び５’－ＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＧＧＡＣＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＣＧ－３’（配列番号３４：プライマー　ｍＫＶＲ２）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に付属のものを使用し、ｍＫＶＲ２はデータベースのマウス軽鎖の定常領域の配列から設計した。
　このプライマーの組み合わせと、実施例５－１－２）で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによりＴＩＮＡ１抗体の軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲで増幅した軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
　シークエンスプライマーとして、データベースのマウス軽鎖の定常領域の配列から設計した上記プライマーｍＫＶＲ２及びＮＵＰを用いた。
　シークエンス解析及びシークエンス反応には、上述の装置を用いた。
　決定されたＴＩＮＡ１抗体の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号３に示し、アミノ酸配列を配列番号４に示した。
５－２）ｃＴＩＮＡ１抗体の作製
５－２－１）キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫの構築
　プラスミドｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列番号５に示すヒトκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。
　ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを鋳型として、下記プライマーセットでＰＣＲを行い、得られた約３．８ｋｂのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、及びヒトκ鎖定常領域を持つ、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを構築した。
プライマーセット
５’－ｔａｔａｃｃｇｔｃｇａｃｃｔｃｔａｇｃｔａｇａｇｃｔｔｇｇｃ－３’（配列番号３５：プライマー　３．３－Ｆ１）
５’－ｇｃｔａｔｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｃｃｇｃｃｃｃｇａｃｇｔｔｇ－３’（配列番号３６：プライマー　３．３－Ｒ１）
５－２－２）キメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１の構築
　ｐＣＭＡ－ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化してκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片と、配列番号６に示すヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合して、ＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をもつキメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を構築した。
５－２－３）ｃＴIＮＡ１抗体重鎖発現ベクターの構築
　実施例５－１－３）で得られたＴＩＮＡ１抗体の重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットで重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて挿入することにより、ｃＴＩＮＡ１抗体重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｃＴＩＮＡ１」と命名した。ｃＴＩＮＡ１抗体重鎖のヌクレオチド配列を配列番号７に示し、アミノ酸配列を配列番号８に示した。配列番号７のヌクレオチド配列及び配列番号８のアミノ酸配列は、図１にも記載されている。
ｃＴIＮＡ１抗体重鎖用プライマーセット
５’－ＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧ－３’（配列番号３７：プライマー　ＴＩＮＡ１Ｈ－Ｆ）
５’－ＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＣＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＣＡＧＡＣ－３’（配列番号３８：プライマー　ＴＩＮＡ１Ｈ－Ｒ）
５－２－４）ｃＴIＮＡ１抗体軽鎖発現ベクターの構築
　実施例５－１－４）で得られたＴＩＮＡ１抗体の軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットで軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＡＮ断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて挿入することにより、ｃＴＩＮＡ１抗体の軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－ＬＫ／ｃＴＩＮＡ１」と命名した。ｃＴＩＮＡ１抗体の軽鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号９に示し、アミノ酸配列を配列番号１０に示した。配列番号９のヌクレオチド配列及び配列番号１０のアミノ酸配列は、図２にも記載されている。
ｃＴＩＮＡ１抗体軽鎖用プライマーセット
５’－ＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＣＡＡＡＴＴＣ－３’（配列番号３９：プライマー　ＴＩＮＡ１Ｌ－Ｆ）
５’－ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣ－３’（配列番号４０：プライマー　ＴＩＮＡ１Ｌ－Ｒ）
５－２－５）ｃＴＩＮＡ１抗体の小スケール生産
　ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。
　対数増殖期の１×１０7個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で９．６ｍＬに希釈した後に、３０ｍＬ　Ｓｑｕａｒｅ　Ｓｔｏｒａｇｅ　Ｂｏｔｔｌｅ（Ｎａｌｇｅｎｅ社）に播種し、３７℃、８％ＣＯ2インキュベーター内で９０ｒｐｍで一時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ　＃２４７６５；３０μｇ）をＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；２００μＬ）に溶解し、次にＰｕｒｅＬｉｎｋ　ＨｉＰｕｒｅ　Ｐｌａｓｍｉｄキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて調製した軽鎖発現ベクター（６μｇ）及び重鎖発現ベクター（４μｇ）をＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；２００μＬ）に添加した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ混合液（２００μＬ）に、発現ベクター／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ混合液（２００μＬ）を加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ2インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ　ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過して評価用のサンプルとした。
　ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｃＴＩＮＡ１とｐＣＭＡ－ＬＫ／ｃＴＩＮＡ１との組合せによって取得されたヒトキメラＴＩＮＡ１抗体を「ｃＴＩＮＡ１抗体」と命名した。
［実施例６：マウス抗ＴＲＯＰ２モノクローナル抗体のヒト化抗体の設計］
６－１）ＴＩＮＡ１のヒト化バージョンの設計
６－１－１）ＴＩＮＡ１の可変領域の分子モデリング
　ＴＩＮＡ１の可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１－１５３（１９９１））によって実行された。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１－Ｄ３０３（２００７））に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能）を、先に決定されたＴＩＮＡ１の可変領域と比較した。結果として、１ＺＥＡが、ＴＩＮＡ１の重鎖の可変領域に対して同様にフレームワーク中に欠損がある抗体の中で、最も高い配列相同性を有するとして選択された。また、３ＩＵ４が、ＴＩＮＡ１の軽鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、ＴＩＮＡ１の重鎖及び軽鎖に対応する１ＺＥＡ及び３ＩＵ４の座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
　最後に、エネルギーの点でＴＩＮＡ１の可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販の蛋白質立体構造解析プログラムＤｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。
６－１－２）ヒト化ＴＩＮＡ１に対するアミノ酸配列の設計
　ヒト化ＴＩＮＡ１抗体の構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９））として公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択された。ＴＩＮＡ１のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔデータベース（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２９，２０５－２０６（２００１））の全てのヒトフレームワークと比較し、結果として、ＨｕＰＲ１Ａ３抗体がフレームワーク領域についての７４％の配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。ＨｕＰＲ１Ａ３についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、ＴＩＮＡ１についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築されたＴＩＮＡ１の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ　ｅｔ． ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択されたいくつかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化ＴＩＮＡ１配列を以下の実施例に記載される様に構築した。
６－２）ＴＩＮＡ１重鎖のヒト化
６－２－１）ｈＴＩＮＡ１－Ｈ１タイプ重鎖：
　配列表の配列番号８に示されるＴＩＮＡ１重鎖のアミノ酸番号２１（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号２８（プロリン）をアラニンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３５（グルタミン酸）をアラニンに、アミノ酸番号３６（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号３８（アルギニン）をリシンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号５７（グルタミン）をアルギニンに、アミノ酸番号５８（リシン）をグルタミンに、アミノ酸番号５９（メチオニン）をアラニンに、アミノ酸番号６２（リシン）をグルタミンに、アミノ酸番号６５（リシン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号６７（イソロイシン）をメチオニンに、アミノ酸番号８７（フェニルアラニン）をバリンに、アミノ酸番号８８（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号８９（フェニルアラニン）をイソロイシンに、アミノ酸番号９１（ロイシン）をアラニンに、アミノ酸番号９２（グルタミン酸）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９５（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号１０２（イソロイシン）をロイシンに、アミノ酸番号１０４（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号１０７（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号１１１（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号１１２（スレオニン）をバリンに、アミノ酸番号１１４（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号１３２（アラニン）をグルタミンに、アミノ酸番号１３５（アラニン）をロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ＴＩＮＡ１重鎖を「ｈＴＩＮＡ１－Ｈ１タイプ重鎖」と命名した。
　ｈＴＩＮＡ１－Ｈ１タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２に記載されている。配列番号１２のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１に記載されている。配列番号１１のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１１のヌクレオチド配列及び配列番号１２のアミノ酸配列は、図３にも記載されている。
６－２－２）ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２タイプ重鎖：
　配列表の配列番号８に示されるＴＩＮＡ１重鎖のアミノ酸番号２１（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号２８（プロリン）をアラニンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３５（グルタミン酸）をアラニンに、アミノ酸番号３６（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号３８（アルギニン）をリシンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号５７（グルタミン）をアルギニンに、アミノ酸番号５８（リシン）をグルタミンに、アミノ酸番号５９（メチオニン）をアラニンに、アミノ酸番号６２（リシン）をグルタミンに、アミノ酸番号６５（リシン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号６７（イソロイシン）をメチオニンに、アミノ酸番号８７（フェニルアラニン）をバリンに、アミノ酸番号８８（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号８９（フェニルアラニン）をイソロイシンに、アミノ酸番号９２（グルタミン酸）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９５（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号１０２（イソロイシン）をロイシンに、アミノ酸番号１０４（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号１０７（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号１１１（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号１１２（スレオニン）をバリンに、アミノ酸番号１１４（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号１３２（アラニン）をグルタミンに、アミノ酸番号１３５（アラニン）をロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ＴＩＮＡ１重鎖を「ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２タイプ重鎖」と命名した。
　ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４に記載されている。配列番号１４のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１３に記載されている。配列番号１３のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１３のヌクレオチド配列及び配列番号１４のアミノ酸配列は、図４にも記載されている。
６－２－３）ｈＴＩＮＡ１－Ｈ３タイプ重鎖：
　配列表の配列番号８に示されるＴＩＮＡ１重鎖のアミノ酸番号２８（プロリン）をアラニンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３６（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号３８（アルギニン）をリシンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号５８（リシン）をグルタミンに、アミノ酸番号６５（リシン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号６７（イソロイシン）をメチオニンに、アミノ酸番号８７（フェニルアラニン）をバリンに、アミノ酸番号８８（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９２（グルタミン酸）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９５（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号１０２（イソロイシン）をロイシンに、アミノ酸番号１０４（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号１０７（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号１１１（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号１１２（スレオニン）をバリンに、アミノ酸番号１１４（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号１３２（アラニン）をグルタミンに、アミノ酸番号１３５（アラニン）をロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ＴＩＮＡ１重鎖を「ｈＴＩＮＡ１－Ｈ３タイプ重鎖」と命名した。
　ｈＴＩＮＡ１－Ｈ３タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６に記載されている。配列番号１６のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５に記載されている。配列番号１５のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１５のヌクレオチド配列及び配列番号１６のアミノ酸配列は、図５にも記載されている。
６－３）ＴＩＮＡ１軽鎖のヒト化
６－３－１）ｈＴＩＮＡ１－Ｌ１タイプ軽鎖：
　配列表の配列番号１０に示されるＴＩＮＡ１軽鎖のアミノ酸番号２３（バリン）をグルタミンに、アミノ酸番号２８（ヒスチジン）をプロリンに、アミノ酸番号２９（リシン）をセリンに、アミノ酸番号３０（フェニルアラニン）をセリンに、アミノ酸番号３１（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号３３（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号４０（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号６２（グルタミン）をリシンに、アミノ酸番号６３（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号８０（アスパラギン酸）をセリンに、アミノ酸番号８３（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号９０（アラニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９３（フェニルアラニン）をロイシンに、アミノ酸番号９８（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号１００（アラニン）をプロリンに、アミノ酸番号１０３（ロイシン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号１２０（アラニン）をグルタミンに、アミノ酸番号１２６（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号１２９（アラニン）をスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ＴＩＮＡ１軽鎖を「ｈＴＩＮＡ１－Ｌ１タイプ軽鎖」と命名した。
　ｈＴＩＮＡ１－Ｌ１タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８に記載されている。配列番号１８のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号１８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７に記載されている。配列番号１７のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１７のヌクレオチド配列及び配列番号１８のアミノ酸配列は、図６にも記載されている。
６－３－２）ｈＴＩＮＡ１－Ｌ２タイプ軽鎖：
　配列表の配列番号１０に示されるＴＩＮＡ１軽鎖のアミノ酸番号２８（ヒスチジン）をプロリンに、アミノ酸番号２９（リシン）をセリンに、アミノ酸番号３０（フェニルアラニン）をセリンに、アミノ酸番号３１（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号３３（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号４０（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号６２（グルタミン）をリシンに、アミノ酸番号６３（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号８０（アスパラギン酸）をセリンに、アミノ酸番号８３（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号９０（アラニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９３（フェニルアラニン）をロイシンに、アミノ酸番号９８（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号１００（アラニン）をプロリンに、アミノ酸番号１０３（ロイシン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号１２０（アラニン）をグルタミンに、アミノ酸番号１２６（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号１２９（アラニン）をスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ＴＩＮＡ１軽鎖を「ｈＴＩＮＡ１－Ｌ２タイプ軽鎖」と命名した。
　ｈＴＩＮＡ１－Ｌ２タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０に記載されている。配列番号２０のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９に記載されている。配列番号１９のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１９のヌクレオチド配列及び配列番号２０のアミノ酸配列は、図７にも記載されている。
６－３－３）ｈＴＩＮＡ１－Ｌ３タイプ軽鎖：
　配列表の配列番号１０に示されるＴＩＮＡ１軽鎖のアミノ酸番号２８（ヒスチジン）をプロリンに、アミノ酸番号２９（リシン）をセリンに、アミノ酸番号３０（フェニルアラニン）をセリンに、アミノ酸番号３１（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号３３（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号４０（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号６２（グルタミン）をリシンに、アミノ酸番号６３（セリン）をグルタミンに、アミノ酸番号８０（アスパラギン酸）をセリンに、アミノ酸番号８３（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号９０（アラニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９３（フェニルアラニン）をロイシンに、アミノ酸番号９８（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号１００（アラニン）をプロリンに、アミノ酸番号１０３（ロイシン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号１２０（アラニン）をグルタミンに、アミノ酸番号１２６（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号１２９（アラニン）をスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ＴＩＮＡ１軽鎖を「ｈＴＩＮＡ１－Ｌ３タイプ軽鎖」と命名した。
　ｈＴＩＮＡ１－Ｌ３タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２に記載されている。配列番号２２のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号２２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２１に記載されている。配列番号２１のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号２１のヌクレオチド配列及び配列番号２２のアミノ酸配列は、図８にも記載されている。
［実施例７：ｈＴＩＮＡ１抗体発現ベクターの構築と抗体の生産］
７－１）ｈＴＩＮＡ１の重鎖発現ベクターの構築
７－１－１）ｈＴＩＮＡ１－Ｈ１発現ベクターの構築
　配列表の配列番号１１に示すｈＴＩＮＡ１－Ｈ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７に示されるｈＴＩＮＡ１－Ｈ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットでｈＴＩＮＡ１－Ｈ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて挿入することによりｈＴＩＮＡ１－Ｈ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＴＩＮＡ１－Ｈ１」と命名した。
プライマーセット
５’－ａｇｃｔｃｃｃａｇａｔｇｇｇｔｇｃｔｇａｇｃ－３’（配列番号４１：プライマー　ＥＧ－Ｉｎｆ－Ｆ）
５’－ｇｇｇｃｃｃｔｔｇｇｔｇｇａｇｇｃｔｇａｇｃ－３’（配列番号４２：プライマー　ＥＧ１－Ｉｎｆ－Ｒ）
７－１－２）ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２発現ベクターの構築
　配列表の配列番号１３に示すｈＴＩＮＡ１－Ｈ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７に示されるｈＴＩＮＡ１－Ｈ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成し（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）、実施例７－１－１）と同様の方法でｈＴＩＮＡ１－Ｈ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２」と命名した。
７－１－３）ｈＴＩＮＡ１－Ｈ３発現ベクターの構築
　配列表の配列番号１５に示すｈＴＩＮＡ１－Ｈ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７に示されるｈＴＩＮＡ１－Ｈ３の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成し（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）、実施例７－１－１）と同様の方法でｈＴＩＮＡ１－Ｈ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＴＩＮＡ１－Ｈ３」と命名した。
７－２）ｈＴＩＮＡ１の軽鎖発現ベクターの構築
７－２－１）ｈＴＩＮＡ１－Ｌ１発現ベクターの構築
　配列表の配列番号１７に示すｈＴＩＮＡ１－Ｌ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３８乃至４０２に示されるｈＴＩＮＡ１－Ｌ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットでｈＴＩＮＡ１－Ｌ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて挿入することによりｈＴＩＮＡ１－Ｌ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－ＬＫ／ｈＴＩＮＡ１－Ｌ１」と命名した。
プライマーセット
５’－ｃｔｇｔｇｇａｔｃｔｃｃｇｇｃｇｃｇｔａｃｇｇｃ－３’（配列番号４３：プライマー　ＣＭ－ＬＫＦ）
５’－ｇｇａｇｇｇｇｇｃｇｇｃｃａｃｃｇｔａｃｇ－３’（配列番号４４：プライマー
　ＫＣＬ－Ｉｎｆ－Ｒ）
７－２－２）ｈＴＩＮＡ１－Ｌ２発現ベクターの構築
　配列表の配列番号１９に示すｈＴＩＮＡ１－Ｌ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３８乃至４０２に示されるｈＴＩＮＡ１－Ｌ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成し（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）、実施例７－２－１）と同様の方法でｈＴＩＮＡ１－Ｌ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－ＬＫ／ｈＴＩＮＡ１－Ｌ２」と命名した。
７－２－３）ｈＴＩＮＡ１－Ｌ３発現ベクターの構築
　配列表の配列番号２１に示すｈＴＩＮＡ１－Ｌ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３８乃至４０２に示されるｈＴＩＮＡ１－Ｌ３の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成し（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）、実施例７－２－１）と同様の方法でｈＴＩＮＡ１－Ｌ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－ＬＫ／ｈＴＩＮＡ１－Ｌ３」と命名した。
７－３）ｈＴＩＮＡ１抗体の生産と精製
７－３－１）ｈＴＩＮＡ１抗体の小スケール生産
　実施例５－２－５）と同様の方法で生産した。
　ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＴＩＮＡ１－Ｈ１とｐＣＭＡ－ＬＫ／ｈＴＩＮＡ１－Ｌ１との組合せによって取得されたｈＴＩＮＡ１抗体を「ｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１」、ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２とｐＣＭＡ－ＬＫ／ｈＴＩＮＡ１－Ｌ１との組合せによって取得されたｈＴＩＮＡ１抗体を「ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２Ｌ１」、ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２とｐＣＭＡ－ＬＫ／ｈＴＩＮＡ１－Ｌ２との組合せによって取得されたｈＴＩＮＡ１抗体を「ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２Ｌ２」、及びｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＴＩＮＡ１－Ｈ３とｐＣＭＡ－ＬＫ／ｈＴＩＮＡ１－Ｌ３との組合せによって取得されたｈＴＩＮＡ１抗体を「ｈＴＩＮＡ１－Ｈ３Ｌ３」と命名した。
７－３－２）ｈＴＩＮＡ１抗体の生産
　ｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１、ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２Ｌ１、ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２Ｌ２、及びｈＴＩＮＡ１－Ｈ３Ｌ３を以下の方法で生産した。
　ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の１．２×１０9個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ　Ｆｅｒｎｂａｃｈ　Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ　Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して１．０×１０6細胞／ｍｌに調製した後に、３７℃、８％ＣＯ2インキュベーター内で９０ｒｐｍで一時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ　＃２４７６５；３．６ｍｇ）をＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；２０ｍｌ）に溶解し、次にＰｕｒｅＬｉｎｋ　ＨｉＰｕｒｅ　Ｐｌａｓｍｉｄキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて調製した軽鎖発現ベクター（０．８ｍｇ）及び重鎖発現ベクター（０．４ｍｇ）をＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；２０ｍｌ）に添加した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ混合液（２０ｍｌ）に、発現ベクター／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ混合液（２０ｍｌ）を加えて穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ2インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ　Ｃａｐｓｕｌｅ　Ｆｉｌｔｅｒ　（ＡＤＶＡＮＴＥＣ　＃ＣＣＳ－０４５－Ｅ１Ｈ）でろ過した。
７－３－３）ｈＴＩＮＡ１抗体の精製
　上記７－３－２）で得られた培養上清から抗体を、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー（４－６℃）とセラミックハイドロキシアパタイト（室温）の２段階工程で精製した。ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックハイドロキシアパタイト精製後のバッファー置換工程は４－６℃で実施した。最初に、培養上清を、ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＨｉＴｒａｐカラム）にアプライした。培養上清がカラムに全て入った後、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳに置換した後、５ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭ　ＭＥＳ／ｐＨ７．０のバッファーで５倍希釈した抗体溶液を、５ｍＭ　ＮａＰｉ／５０ｍＭ　ＭＥＳ／３０ｍＭ　ＮａＣｌ／ｐＨ７．０のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシアパタイトカラム（日本バイオラッド、Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ　ＣＨＴＴｙｐｅ‐Ｉ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ　Ｃｏｌｕｍｎ）にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）への液置換を行った。最後にＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ＵＦ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，４℃）にて濃縮し、ＩｇＧ濃度を２０ｍｇ／ｍｌ以上に調製し精製サンプルとした。
［参考例１：ｈＲＳ７抗体発現ベクターの作製と抗体の生産］
　ｈＲＳ７抗体は、国際公開第２００３／０７４５６６号に記載されている軽鎖、及び重鎖のアミノ酸配列をもとに作製した。
１－１）ｈＲＳ７抗体重鎖発現ベクターの構築
　配列表の配列番号２９に示すｈＲＳ７抗体重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７に示されるｈＲＳ７抗体重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成し（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）、実施例７－１－１）と同様の方法でｈＲＳ７抗体重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＲＳ７」と命名した。ｈＲＳ７抗体重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号３０に示した。
１－２）ｈＲＳ７抗体軽鎖発現ベクターの構築
　配列表の配列番号３１に示すｈＲＳ７抗体軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３８乃至４０２に示されるｈＲＳ７抗体軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成し（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）、実施例７－２－１）と同様の方法でｈＲＳ７抗体軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－ＬＫ／ｈＲＳ７」と命名した。ｈＲＳ７抗体重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号３２に示した。
１－３）ｈＲＳ７抗体の生産と精製
１－３－１）ｈＲＳ７抗体の生産
　ｈＲＳ７抗体はｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＲＳ７とｐＣＭＡ－ＬＫ／ｈＲＳ７との組合せにより実施例７－３－２）と同様の方法で生産した。
１－３－２）ｈＲＳ７抗体の精製
　上記１－３－１）で得られた培養上清から実施例７－３－３）と同様の方法で精製した。
［実施例８：ｈＴＩＮＡ１抗体及びｈＲＳ７抗体の抗原結合能の測定］
８－１）小スケール生産の抗体（培養上清）を用いた抗原結合能の測定
　抗体と抗原（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＴＲＯＰ－２　Ｆｃ　ｃｈｉｍｅｒａ）との解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ　３０００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を使用し、固定化した抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）抗体に抗体をリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）抗体（Ｈｕｍａｎ　Ｆａｂ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｋｉｔ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））は、センサーチップＣＭ５（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）へアミンカップリング法にて約２０００ＲＵ共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐ２０）を用いた。抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）抗体を固定化したチップ上に、抗体を含む培養上清を約８０秒間添加した後、抗原の希釈系列溶液（１－１０００ｎＭ）を流速３０μｌ／分で３００秒間添加し、引き続き６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、２０％ＤＭＳＯを含む１０ｍＭ　Ｇｌｙ－ＨＣｌ　ｐＨ１．５を流速１０μｌ／分で６０秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェア（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ，　ｖｅｒｓｉｏｎ　４．１）のＢｉｖａｌｅｎｔ結合モデルを用いて、結合速度定数ｋｏｎ、解離速度定数ｋｏｆｆ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
８－２）精製抗体を用いた抗原結合能の測定
　抗体と抗原（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＴＲＯＰ－２　Ｆｃ　ｃｈｉｍｅｒａ）との解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ　３０００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を使用し、固定化した抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）抗体に抗体をリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）抗体（Ｈｕｍａｎ　Ｆａｂ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｋｉｔ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））は、センサーチップＣＭ５（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）へアミンカップリング法にて約２０００ＲＵ共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐ２０）を用いた。抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）抗体を固定化したチップ上に、抗体を約１分間添加した後、抗原の希釈系列溶液（１－１０００ｎＭ）を流速３０μｌ／分で３００秒間添加し、引き続き６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、ランニングバッファーにて希釈した２５ｍＭ　ＮａＯＨを流速１００μｌ／分で３秒間、２回添加した。データの解析は、上記方法により行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例９：hTINA1-H1L1 ADCの作製（１）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
工程１：ｔｅｒｔ－ブチル　（４－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－４－オキソブチル）カーバメート
　４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ブタン酸（０．２３７ｇ、１．１３ｍｍｏＬ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（０．１３０ｇ、１．１３ｍｍｏＬ）、及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．２１６ｇ、１．１３ｍｍｏＬ）を加えて１時間撹拌した。エキサテカンのメシル酸塩（０．５００ｇ、０．９４ｍｍｏＬ）、及びトリエチルアミン（０．１５７ｍＬ、１．１３ｍｍｏＬ）を加えたＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１０ｍＬ）に滴下し、室温にて一日間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム～クロロホルム：メタノ－ル＝８：２（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（０．５９５ｇ、定量的）を得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．３１（９Ｈ，ｓ），１．５８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．６６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．８９－１．８２（２Ｈ，ｍ），２．１２－２．２１（３Ｈ，ｍ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．９２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．１７（２Ｈ，ｓ），５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５９－５．５５（１Ｈ，ｍ），６．５３（１Ｈ，ｓ），６．７８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｓ），７．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：６２１（Ｍ＋Ｈ）+．
工程２：４－アミノ－Ｎ－［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］ブタンアミドトリフルオロ酢酸塩
　上記工程１で得た化合物（０．３８８ｇ、０．６１ｍｍｏＬ）をジクロロメタン（９ｍＬ）に溶解した。トリフルオロ酢酸（９ｍＬ）を加えて４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム～クロロホルム：メタノール：水＝７：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）の分配有機層］にて精製し、標記化合物（０．３４３ｇ、定量的）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．７９－１．９２（４Ｈ，ｍ），２．１０－２．１７（２Ｈ，ｍ），２．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．８０－２．８６（２Ｈ，ｍ），３．１５－３．２０（２Ｈ，ｍ），５．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５４－５．６１（１Ｈ，ｍ），６．５５（１Ｈ，ｓ），７．３２（１Ｈ，ｓ），７．７２（３Ｈ，ｂｒｓ），７．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：５２１（Ｍ＋Ｈ）+．
工程３：Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－（４－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－４－オキソブチル）グリシンアミド
　Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニルグリシン（０．０８１ｇ、０．１９ｍｍｏＬ）をジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（０．０２１ｇ、０．１９ｍｏＬ）及び、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．０３６ｇ、０．１９ｍｍｏＬ）を加えて３．５時間撹拌した。その反応溶液を上記工程２で得た化合物（０．０８０ｇ、０．１５ｍｍｏＬ）を加えたＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１．５ｍＬ）に滴下し、室温にて４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム～クロロホルム：メタノ－ル＝８：２（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（０．１０６ｇ、７３％）を得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．３６（９Ｈ，ｓ），１．７１（２Ｈ，ｍ），１．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），２．１５－２．１９（４Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．７７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．７，８．８Ｈｚ），３．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．１，４．７Ｈｚ），３．０８－３．１１（２Ｈ，ｍ），３．１６－３．１９（２Ｈ，ｍ），３．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），３．５７－３．７７（４Ｈ，ｍ），４．４６－４．４８（１Ｈ，ｍ），５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５５－５．６０（１Ｈ，ｍ），６．５３（１Ｈ，ｓ），７．００（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．１７－７．２６（５Ｈ，ｍ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．７１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），７．９２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：９３９（Ｍ＋Ｈ）+．
工程４：グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－（４－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－４－オキソブチル）グリシンアミドトリフルオロ酢酸塩
　上記工程３で得た化合物（１．９７ｇ、２．１０ｍｍｏＬ）をジクロロメタン（７ｍＬ）に溶解した。トリフルオロ酢酸（７ｍＬ）を加えて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、トルエンを加えて共沸し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム～クロロホルム：メタノール：水＝７：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）の分配有機層］にて精製し、標記化合物（１．９７ｇ、９９％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．７１－１．７３（２Ｈ，ｍ），１．８２－１．９０（２Ｈ，ｍ），２．１２－２．２０（４Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７，９．４Ｈｚ），３．０３－３．０９（３Ｈ，ｍ），３．１８－３．１９（２Ｈ，ｍ），３．５８－３．６０（２Ｈ，ｍ），３．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），３．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），３．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），３．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．８，５．９Ｈｚ），４．５０－４．５６（１Ｈ，ｍ），５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５５－５．６０（１Ｈ，ｍ），７．１７－７．２７（５Ｈ，ｍ），７．３２（１Ｈ，ｓ），７．７８－７．８１（２Ｈ，ｍ），７．９５－７．９７（３Ｈ，ｍ），８．３３－８．３５（２Ｈ，ｍ），８．４８－８．５１（２Ｈ，ｍ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：８３９（Ｍ＋Ｈ）+．
工程５：Ｎ－｛３－［２－（２－｛［３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）プロパノイル］アミノ｝エトキシ）エトキシ］プロパノイル｝グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－（４－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－４－オキソブチル）グリシンアミド
　上記工程４で得た化合物（１００ｍｇ，０．１１９ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．２０ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（２０．８μＬ，０．１１９ｍｍｏＬ）、３－（２－（２－（３－マレインイミドプロパンアミド）エトキシ）エトキシ）プロパン酸Ｎ－スクシンイミジル（５０．７ｍｇ，０．１１９ｍｍｏＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム～クロロホルム：メタノール＝５：１（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（６６．５ｍｇ，４８％）を淡黄色固体として得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δ：０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．６５－１．７４（２Ｈ，ｍ），１．７７－１．９０（２Ｈ，ｍ），２．０７－２．１９（４Ｈ，ｍ），２．３０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．３３－２．３６（２Ｈ，ｍ），２．３８（３Ｈ，ｓ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７，９．８Ｈｚ），２．９６－３．１８（９Ｈ，ｍ），３．４２－３．４４（４Ｈ，ｍ），３．５３－３．７６（１０Ｈ，ｍ），４．４３（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝８．６，４．７Ｈｚ），５．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），５．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），５．５２－５．５８（１Ｈ，ｍ），６．５２（１Ｈ，ｓ），６．９８（２Ｈ，ｓ），７．１２－７．１７（１Ｈ，ｍ），７．１８－７．２５（４Ｈ，ｍ），７．２９（１Ｈ，ｓ），７．６９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ），７．９８－８．０３（２Ｈ，ｍ），８．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．１６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：１１４９（Ｍ＋Ｈ）+．
工程６：抗体－薬物コンジュゲート（１）
　抗体の還元：実施例７にて作製したｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５４を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１０．０ｍＬ）を５０ｍＬチューブに採取し、１０ｍＭ　ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．３１７ｍＬ；抗体一分子に対して４．６当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．５００ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を常温水浴で１０分間インキュベートした後にジメチルスルホキシド（０．５６７ｍＬ）を添加した。次いで上記工程５で得た化合物の１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．６３５ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、チューブローテーター（ＭＴＲ－１０３、アズワン株式会社）を用いて室温で４０分間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ　ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．１２７ｍＬ；抗体一分子に対して１８．４当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
　精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲートを含有する溶液を３５．０ｍＬ得た。
　特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＤ，２８０＝４９６４（実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：２．７０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：９４．５ｍｇ（９５％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．６。
［実施例１０：hTINA1-H1L1 ADCの作製（２）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（２）
　抗体の還元：実施例７にて作製したｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５４を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（２．００ｍＬ）を４ｍＬチューブに採取し、１０ｍＭ　ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０６９０ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．１００ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃水浴で１０分間インキュベートした後に実施例９工程５で得た化合物の１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．１２７ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、１５℃水浴にて１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ　ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１９０ｍＬ；抗体一分子に対して１３．８当量）を加え、チューブローテーターを用いて室温で２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
　精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲートを含有する溶液を９．００ｍＬ得た。
　特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＤ，２８０＝４９６４（実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：２．０８ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１８．７ｍｇ（９４％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．１。
［実施例１１：hTINA1-H1L1 ADCの作製（３）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（３）
　抗体の還元：実施例７にて作製したｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５４を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（５．０ｍＬ）を１５ｍＬ容器に採取し、撹拌下１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０８１３ｍＬ）を加えた後、３７℃で１０分間撹拌した。撹拌下１０ｍＭ　ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０７４５ｍＬ；抗体一分子に対して２．３当量）を加えた後、本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認し、３７℃で１時間撹拌することによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃水浴で１０分間撹拌した後に実施例９工程５で得た化合物の１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．１６２ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）をゆっくり滴下しながら加え、１５℃水浴にて１時間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ　ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０４１８ｍＬ；抗体一分子に対して１２．９当量）を加え、室温で２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
　精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲートを含有する溶液を２１．０ｍＬ得た。
　特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ及びＦ（εＤ，２８０＝４９６４（実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：２．１９ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：４６．０ｍｇ（９２％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：３．６；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：３．６。
［実施例１２：hTINA1-H1L1 ADCの作製（４）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（４）
　抗体の還元：実施例７にて作製したｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５４を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０．０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（５．００ｍＬ）を１５ｍＬ容器に採取し、撹拌下１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０８１３ｍＬ）を加えた後、３７℃で１０分間撹拌した。撹拌下１０ｍＭ　ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．１６２ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）を加えた後、本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認し、３７℃で１時間撹拌することによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃水浴で１０分間撹拌した後に実施例９工程５で得た化合物の１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．３８９ｍＬ；抗体一分子に対して１２．０当量）をゆっくり滴下しながら加え、１５℃水浴にて１時間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ　ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０４１８ｍＬ；抗体一分子に対して１２．９当量）を加え、室温で２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
　精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲートを含有する溶液を２１．０ｍＬ得た。
　特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ及びＦ（εＤ，２８０＝４９６４（実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：２．１９ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：４６．０ｍｇ（９２％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．０；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．０。
［参考例１３：hRS7 ADCの作製（５）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（５）
　抗体の還元：参考例１にて作製したｈＲＳ７を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５６を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（２．０ｍＬ）を４ｍＬチューブに採取し、１０ｍＭ　ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０６９０ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．１００ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃水浴で１０分間インキュベートした後に実施例９工程５で得た化合物の１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．１２７ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、１５℃水浴にて１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ　ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１９０ｍＬ；抗体一分子に対して１３．８当量）を加え、チューブローテーターを用いて室温で２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
　精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲートを含有する溶液を９．００ｍＬ得た。
　特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＤ，２８０＝４９６４（実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：２．０４ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１８．４ｍｇ（９２％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．２。
［実施例１４：hTINA1-H1L1 ADCの作製（６）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
工程１：（｛Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］グリシル｝アミノ）メチルアセテート
　Ｎ－９－フルオレニルメトキシカルボニルグリシルグリシン（４．３３ｇ，１２．２ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１２０ｍｌ）、及びトルエン（４０．０ｍｌ）からなる混合物に、ピリジン（１．１６ｍｌ，１４．７ｍｍｏｌ及び四酢酸鉛（６．８４ｇ，１４．７ｍｍｏｌ）を加え、５時間加熱還流した。反応液を室温まで冷却した後、不溶物をセライト濾過によって除き、減圧下濃縮した。得られた残留物を酢酸エチルに溶解し、水及び飽和食塩水で洗浄後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で留去した後、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝９：１（ｖ／ｖ）～酢酸エチル］にて精製し、標記化合物（３．００ｇ，６７％）を無色固体として得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：２．０７（３Ｈ，ｓ），３．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），４．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．４６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），５．２６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），５．３２（１Ｈ，ｂｒｓ），６．９６（１Ｈ，ｂｒｓ），７．３２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）．
工程２：ベンジル　［（｛Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］グリシル｝アミノ）メトキシ］アセテート
　上記工程１で得た化合物（３．６８ｇ，１０．０ｍｍｏＬ）及びベンジルグリコレート（４．９９ｇ，３０．０ｍｍｏＬ）のテトラヒドロフラン（４０．０ｍＬ）溶液に、カリウム　ｔｅｒｔ－ブトキシド（２．２４ｇ，２０．０ｍｍｏＬ）を０℃で加え、室温にて１５分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチル、水を０℃で加え、酢酸エチル、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をジオキサン（４０．０ｍＬ）、水（１０．０ｍＬ）に溶解し、炭酸水素ナトリウム（１．０１ｇ，１２．０ｍｍｏＬ）、クロロギ酸９－フルオレニルメチル（２．５９ｇ，１０．０ｍｍｏＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応溶液に水を加え、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０（ｖ／ｖ）～０：１００］にて精製し、無色油状の標記化合物（１．８８ｇ、４０％）を得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：３．８４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），４．２４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．４９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），４．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），５．１５－５．２７（１Ｈ，ｍ），５．１９（２Ｈ，ｓ），６．７４（１Ｈ，ｂｒｓ），７．３１－７．３９（７Ｈ，ｍ），７．４３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．６１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）．
工程３：［（｛Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］グリシル｝アミノ）メトキシ］酢酸
　上記工程２で得た化合物（１．８８ｇ、３．９６ｍｍｏＬ）をエタノール（４０．０ｍＬ）、酢酸エチル（２０．０ｍｌ）に溶解した。パラジウム炭素触媒（３７６ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温にて２時間撹拌した。不溶物をセライト濾過によって除き、溶媒を減圧留去し、標記化合物（１．５２ｇ、定量的）を無色固体として得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δ：３．６２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．９７（２Ｈ，ｓ），４．１８－４．３２（３Ｈ，ｍ），４．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），７．２９－７．４６（４Ｈ，ｍ），７．５８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），７．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），８．７１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）．
工程４：９Ｈ－フルオレン－９－イルメチル（２－｛［（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］アミノ｝－２－オキソエチル）カーバメート
　氷冷下、エキサテカンのメシル酸塩（０．２８３ｇ，０．５３３ｍｍｏＬ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（６１．４ｍｇ，０．５３３ｍｍｏＬ）、及び上記工程３で得た化合物（０．２０５ｇ，０．５３３ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１０．０ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（９２．９μＬ，０．５３３ｍｍｏＬ）及びＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１４３ｇ，０．６９３ｍｍｏＬ）を加え、室温にて３日間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム～クロロホルム：メタノール：水＝７：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）の分配有機層］にて精製し、標記化合物（０．３５２ｇ，８２％）を淡茶色固体として得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δ：０．８１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．７３－１．８７（２Ｈ，ｍ），２．０６－２．２０（２Ｈ，ｍ），２．３４（３Ｈ，ｓ），３．０１－３．２３（２Ｈ，ｍ），３．５８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），３．９８（２Ｈ，ｓ），４．１３－４．２５（３Ｈ，ｍ），４．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），５．０９－５．２２（２Ｈ，ｍ），５．３２－５．４２（２Ｈ，ｍ），５．５０－５．５９（１Ｈ，ｍ），６．４９（１Ｈ，ｓ），７．２４－７．３０（３Ｈ，ｍ），７．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．５３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．６６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），７．８４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），８．７７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：８０２（Ｍ＋Ｈ）+．
工程５：Ｎ－［（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］グリシンアミド
　上記工程４で得た化合物（０．８８１ｇ，１．１０ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１１．０ｍＬ）溶液に、ピペリジン（１．１ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、標記化合物を含む混合物を得た。本混合物は、これ以上の精製は行わずに次の反応に用いた。
工程６：Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］グリシンアミド
　氷冷下、上記工程５で得た混合物（０．４３９ｍｍｏＬ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（０．１０１ｇ，０．８７８ｍｍｏＬ）、及びＮ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニン（特開２００２－６０３５１号公報；０．４４０ｇ，０．８７８ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５０．０ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１８１ｇ，０．８７８ｍｍｏＬ）を加え、室温にて４日間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム～クロロホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（０．２６９ｇ，５８％）を淡橙色固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０６３（Ｍ＋Ｈ）+．
工程７：グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］グリシンアミド
　上記工程６で得た化合物（０．２６９ｇ，０．２５３ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（４．００ｍＬ）溶液に、ピペリジン（０．２５１ｍＬ，２．５３ｍｍｏＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、標記化合物を含む混合物を得た。本混合物は、これ以上の精製は行わずに次の反応に用いた。
工程８：Ｎ－［６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］グリシンアミド
　上記工程７で得た化合物（０．２５３ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１０．０ｍＬ）溶液に、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－スクシンイミジル（０．１５６ｇ，０．５０６ｍｍｏＬ）を加え、室温で３日間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム～クロロホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（０．１００ｇ，３８％）を淡黄色固体として得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δ：０．８３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．０９－１．２１（２Ｈ，ｍ），１．３３－１．４７（４Ｈ，ｍ），１．７５－１．９０（２Ｈ，ｍ），２．００－２．２３（４Ｈ，ｍ），２．３６（３Ｈ，ｓ），２．６９－２．８１（１Ｈ，ｍ），２．９４－３．０３（１Ｈ，ｍ），３．０６－３．２２（２Ｈ，ｍ），３．２３－３．７４（６Ｈ，ｍ），３．９８（２Ｈ，ｓ），４．３９－４．５０（１Ｈ，ｍ），４．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），５．１７（２Ｈ，ｓ），５．３９（２Ｈ，ｓ），５．５３－５．６１（１Ｈ，ｍ），６．５０（１Ｈ，ｓ），６．９６（２Ｈ，ｓ），７．１１－７．２４（５Ｈ，ｍ），７．２８（１Ｈ，ｓ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），７．９７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．０３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），８．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．６０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０３４（Ｍ＋Ｈ）+．
工程９：抗体－薬物コンジュゲート（６）
　抗体の還元：実施例７にて作製したｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５４を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１０．０ｍＬ）を５０ｍＬチューブに採取し、１０ｍＭ　ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．３１７ｍＬ；抗体一分子に対して４．６当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．５００ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を常温水浴で１０分間インキュベートした後にジメチルスルホキシド（０．５６７ｍＬ）を添加した。次いで上記工程８で得た化合物の１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．６３５ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、チューブローテーターを用いて室温で４０分間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ　ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．１２７ｍＬ；抗体一分子に対して１８．４当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
　精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲートを含有する溶液を３５．０ｍＬ得た。
　特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＤ，２８０＝５１７８（実測値）、εＤ，３７０＝２０２１７（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：２．７０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：９４．５ｍｇ（９５％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．４。
［実施例１５：hTINA1-H1L1 ADCの作製（７）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（７）
　抗体の還元：実施例７にて作製したｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５４を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（２．０ｍＬ）を４ｍＬチューブに採取し、１０ｍＭ　ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０６９０ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０２９９ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃水浴で１０分間インキュベートした後に実施例１４工程８で得た化合物の１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．１２７ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、１５℃水浴にて１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ　ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１９０ｍＬ；抗体一分子に対して１３．８当量）を加え、チューブローテーターを用いて室温で２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
　精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲートを含有する溶液を９．００ｍＬ得た。
　特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＤ，２８０＝５１７８（実測値）、εＤ，３７０＝２０２１７（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：２．０４ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１８．４ｍｇ（９２％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．７。
［実施例１６：hTINA1-H1L1 ADCの作製（８）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（８）
　抗体の還元：実施例７にて作製したｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５４を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（３０．０ｍＬ）を１００ｍＬ容器に採取し、撹拌下１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．４８７５ｍＬ）を加えた後、３７℃で１０分間撹拌した。撹拌下１０ｍＭ　ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．９７２１ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）を加えた後、本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認し、３７℃で１時間撹拌することによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃水浴で１０分間撹拌した後に実施例１４工程８で得た化合物の１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（２．３３ｍＬ；抗体一分子に対して１２．０当量）をゆっくり滴下しながら加え、１５℃水浴にて１時間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ　ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．２５１ｍＬ；抗体一分子に対して１２．９当量）を加え、室温で２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
　精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲートを含有する溶液を９８．０ｍＬ得た。その後、製造方法１に記載した共通操作Ａによる濃縮操作を行い、標記抗体－薬物コンジュゲートを含有する溶液を１７．５ｍＬ得た。
　特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ及びＦ（εＤ，２８０＝５１７８（実測値）、εＤ，３７０＝２０２１７（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：１４．６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２５６ｍｇ（８５％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．７；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．０。
［実施例１７：hTINA1-H1L1 ADCの作製（９）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（９）
　抗体の還元：実施例７にて作製したｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５４を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（５．０ｍＬ）を１５ｍＬ容器に採取し、撹拌下１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０８１３ｍＬ）を加えた後、３７℃で１０分間撹拌した。撹拌下１０ｍＭ　ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０７７８ｍＬ；抗体一分子に対して２．４当量）を加えた後、本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認し、３７℃で１時間撹拌することによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃水浴で１０分間撹拌した後に実施例１４工程８で得た化合物の１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．１６２ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）をゆっくり滴下しながら加え、１５℃水浴にて１時間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ　ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０４１８ｍＬ；抗体一分子に対して１２．９当量）を加え、室温で２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
　精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲートを含有する溶液を２１．０ｍＬ得た。
　特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ及びＦ（εＤ，２８０＝５１７８（実測値）、εＤ，３７０＝２０２１７（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：２．２６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：４７．５ｍｇ（９５％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：３．５；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：３．６。
［参考例１８：hRS7 ADCの作製（１０）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（１０）
　抗体の還元：参考例１にて作製したｈＲＳ７を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５６を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（２．０ｍＬ）を４ｍＬチューブに採取し、１０ｍＭ　ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０６９０ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０２９９ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃水浴で１０分間インキュベートした後に実施例１４工程８で得た化合物の１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．１２６９ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、１５℃水浴にて１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ　ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１９０ｍＬ；抗体一分子に対して１３．８当量）を加え、チューブローテーターを用いて室温で２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
　精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲートを含有する溶液を９．００ｍＬ得た。
　特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＤ，２８０＝５１７８（実測値）、εＤ，３７０＝２０２１７（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：２．０７ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１８．６ｍｇ（９３％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．６。
［実施例１９：hTINA1-H1L1 ADCの作製（１１）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
工程１：ｔｅｒｔ－ブチル　［２－（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）エチル］カーバメート
　エキサテカンのメシル酸塩（３．１０ｇ、５．４７ｍｏＬ）を、４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ブタン酸の代わりに｛２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］エトキシ｝酢酸（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９２年，３５巻，２９２８頁；１．５５ｇ，６．０１ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の工程１と同様に反応させ、標記化合物（２．５６ｇ，７３％）を淡黄色固体として得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．２６（９Ｈ，ｓ），１．８１－１．９１（２Ｈ，ｍ），２．１３－２．２２（２Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），３．０８－３．２６（４Ｈ，ｍ），３．４３－３．５３（２Ｈ，ｍ），４．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ），４．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ），５．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ），５．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ），５．５９－５．６６（１Ｈ，ｍ），６．５３（１Ｈ，ｓ），６．８６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：６３７（Ｍ＋Ｈ）+．
工程２：２－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アセトアミドトリフルオロ酢酸塩
　上記工程１で得た化合物（１．５０ｇ，２．３６ｍｏｌ）を、実施例１の工程２と同様に反応させ、標記化合物（１．５０ｇ，定量的）を淡黄色固体として得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．８１－１．９２（２Ｈ，ｍ），２．１５－２．２３（２Ｈ，ｍ），２．４１（３Ｈ，ｓ），３．０５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），３．１５－３．２３（２Ｈ，ｍ），３．７１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），４．１０（２Ｈ，ｓ），５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．４３（２Ｈ，ｓ），５．５８－５．６６（１Ｈ，ｍ），６．５５（１Ｈ，ｓ），７．３３（１Ｈ，ｓ），７．７３－７．８４（４Ｈ，ｍ），８．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：５３７（Ｍ＋Ｈ）+．
工程３：Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［２－（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）エチル］グリシンアミド
　上記工程２で得た化合物（５５４ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ）を、実施例１の工程３と同様に反応させ、標記化合物（７７５ｍｇ，９５％）を得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δ：０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．３６（９Ｈ，ｓ），１．７８－１．８９（２Ｈ，ｍ），２．１３－２．２２（２Ｈ，ｍ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．４，９．８Ｈｚ），２．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．４，４．３Ｈｚ），３．０９－３．２３（１Ｈ，ｍ），３．２３－３．３２（２Ｈ，ｍ），３．４０－３．６２（８Ｈ，ｍ），３．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．５，５．５Ｈｚ），４．０３（２Ｈ，ｓ），４．３９－４．４７（１Ｈ，ｍ），５．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．９Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．９Ｈｚ），５．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ），５．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ），５．５７－５．６４（１Ｈ，ｍ），６．５４（１Ｈ，ｓ），６．９９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），７．１３－７．２６（５Ｈ，ｍ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．７６－７．８２（２Ｈ，ｍ），７．９０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），８．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），８．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：９５５（Ｍ＋Ｈ）+．
工程４：グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［２－（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）エチル］グリシンアミドトリフルオロ酢酸塩
　上記工程３で得た化合物（６３０ｍｇ，０．６５９ｍｍｏｌ）を、実施例１の工程４と同様に反応させ、標記化合物（５８８ｍｇ，９２％）を得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δ：０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．７９－１．９０（２Ｈ，ｍ），２．１３－２．２２（２Ｈ，ｍ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．４，１０．１Ｈｚ），２．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．４，４．３Ｈｚ），３．０９－３．２３（１Ｈ，ｍ），３．２４－３．３２（３Ｈ，ｍ），３．４１－３．７１（７Ｈ，ｍ），３．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．８，５．８Ｈｚ），４．０４（２Ｈ，ｓ），４．５２（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝９．０，４．１Ｈｚ），５．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．９Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．９Ｈｚ），５．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ），５．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ），５．５６－５．６５（１Ｈ，ｍ），６．５５（１Ｈ，ｓ），７．１３－７．２６（５Ｈ，ｍ），７．３２（１Ｈ，ｓ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），７．８７－８．０１（４Ｈ，ｍ），８．２９－８．３６（２Ｈ，ｍ），８．４６－８．５５（２Ｈ，ｍ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：８５５（Ｍ＋Ｈ）+．
工程５：Ｎ－［６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［２－（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）エチル］グリシンアミド
　上記工程４で得た化合物（２４０ｍｇ，０．２４７ｍｍｏｌ）を、ジイソプロピルエチルアミンの代わりにトリエチルアミン（３１．４μＬ，０．２２ｍｍｏＬ）を、３－（２－（２－（３－マレインイミドプロパンアミド）エトキシ）エトキシ）プロパン酸Ｎ－スクシンイミジルの代わりに６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－スクシンイミジル（９５．３ｍｇ，０．３１ｍｍｏＬ）を用いて、実施例１の工程５と同様に反応させ、標記化合物（１６２ｍｇ，６２％）を得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δ：０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．１３－１．２２（２Ｈ，ｍ），１．４０－１．５１（４Ｈ，ｍ），１．７８－１．９０（２Ｈ，ｍ），２．０９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．１４－２．２１（２Ｈ，ｍ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．６，９．７Ｈｚ），２．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．６，４．５Ｈｚ），３．０８－３．２４（１Ｈ，ｍ），３．２４－３．３０（１Ｈ，ｍ），３．３３－３．４０（４Ｈ，ｍ），３．４７－３．６８（７Ｈ，ｍ），３．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．６，５．７Ｈｚ），４．０３（２Ｈ，ｓ），４．４２（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝８．６，４．２Ｈｚ），５．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），５．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），５．５７－５．６４（１Ｈ，ｍ），６．５２（１Ｈ，ｓ），６．９９（２Ｈ，ｓ），７．１３－７．２５（５Ｈ，ｍ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．７４－７．８１（２Ｈ，ｍ），７．９９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．０３－８．１１（２Ｈ，ｍ），８．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：１０４８（Ｍ＋Ｈ）+．
工程６：抗体－薬物コンジュゲート（１１）
　抗体の還元：実施例７にて作製したｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５４を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（３．０ｍＬ）を１５ｍＬ容器に採取し、撹拌下１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０４８８ｍＬ）を加えた後、３７℃で１０分間撹拌した。撹拌下１０ｍＭ　ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０９７２ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）を加えた後、本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認し、３７℃で１時間撹拌することによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃水浴で１０分間撹拌した後に実施例１１a工程８で得た化合物の１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．２３３３ｍＬ；抗体一分子に対して１２．０当量）をゆっくり滴下しながら加え、１５℃水浴にて１時間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ　ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０２５１ｍＬ；抗体一分子に対して１２．９当量）を加え、室温で２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
　精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲートを含有する溶液を１４ｍＬ得た。
　特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ及びＦ（εＤ，２８０＝５１９３（実測値）、εＤ，３７０＝２０３４７（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：１．９３ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２７．０ｍｇ（９０％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．１；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．０。
［参考例２：hRS7-CL2A-SN38の作製（１２）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（１２）
　抗体の還元：参考例１にて作製したｈＲＳ７を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５４を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１０．０ｍＬ）を５０ｍＬチューブに採取し、１０ｍＭ　ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．３１７ｍＬ；抗体一分子に対して４．６当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．５００ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を常温水浴で１０分間インキュベートした後にジメチルスルホキシド（０．５６７ｍＬ）を添加した。次いで、米国特許公開第２０１１/０２９３５１３号明細書に従って合成したＣＬ２Ａ－ＳＮ３８の１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．６３５ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、チューブローテーターを用いて室温で４０分間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ　ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．１２７ｍＬ；抗体一分子に対して１８．４当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
　精製：上記反応溶液について、製造方法１－共通操作Ｄに記載したゲルろ過精製操作を２回繰り返し、次いでポリソルベート８０（０．０１％）を含有する２５ｍＭトレハロース溶液にて同様にＮＡＰ－２５カラムによるゲルろ過精製操作を１回行った後に得られる溶出液（３５ｍＬ）を凍結乾燥操した。
　特性評価：凍結乾燥前の溶出液について製造方法１に記載した共通操作Ｅを使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：２．７８ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：９７．３ｍｇ（９７％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．６
［実施例２０：hTINA1-H1L1 ADCの作製（１３）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（１３）
　抗体の還元：実施例７にて作製したｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５４を使用）及びＣを用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製した。本溶液（１００ｍＬ）をポリカーボネート製の２５０ｍL三角フラスコ容器に入れ、マグネティックスターラー撹拌下、室温で１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（１．４ｍＬ）を加えた後、１０ｍＭ　ＴＣＥＰ水溶液（１．６２ｍＬ；抗体一分子に対して２．５当量）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、撹拌を停止し、３７℃で２時間インキュベートすることにより、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃に冷却後、撹拌下、ＤＭＳＯ（３．２４ｍＬ）をゆっくり滴下して加えた。次いで、実施例１４工程８の化合物を１０ｍＭ含むＤＭＳＯ溶液（１．７６ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）をゆっくり滴下して加えた。この溶液を１５℃にて、１時間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、撹拌下、１００ｍＭ　ＮＡＣ水溶液（０．３２４ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）を加え、さらに室温で２０分間インキュベートし、未反応の薬物リンカーの反応性を停止させた。
　精製：撹拌下、上記溶液に２０％酢酸水（約０．５２ｍＬ）とＡＢＳ（１００ｍＬ）をゆっくり加え、本溶液のｐＨを５．５±０．１にした。この溶液を精密ろ過（０．４５μｍ、ＰＶＤＦ膜）することにより白濁物を除いて、ろ液を約２００ｍＬ得た。このろ液に対して、限外ろ過膜（メルク株式会社、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ　ＸＬ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ、Ｕｌｔｒａｃｅｌｌ　３０ＫＤａ）、チューブポンプ（米国コールパーマー社マスターフレックスポンプ　ｍｏｄｅｌ　７７５２１－４０、ポンプヘッド　ｍｏｄｅｌ　７５１８－００）及びチューブ（米国コールパーマー社マスターフレックスチューブ　Ｌ／Ｓ１６）で構成された限外ろ過装置を用い、限外ろ過精製を行った。すなわち、反応液に精製緩衝液としてＡＢＳ（計１６００ｍＬ）を滴下しながら、限外ろ過精製を行うことで、未結合の薬物リンカー及び他の低分子量試薬を除去するとともに緩衝液をＡＢＳへ置換し、さらに濃縮まで行った。得られた精製溶液に対して、精密ろ過（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ膜）を行い、標記抗体－薬物コンジュゲートを含有する溶液を８８ｍL得た。
　特性評価：共通操作Ｅと共通操作Ｆ（εＤ，２８０＝５１７８、εＤ，３７０＝２０２１７を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：９．９６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：８７６ｍｇ（８８％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：３．８；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：３．８。
［実施例２１：ＡＤＣの抗腫瘍効果の評価］
２１－ａ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（１）
　マウス：５－６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウス（日本チャールス・リバー株式会社）を実験使用前にＳＰＦ条件下で４－７日間馴化した。マウスには滅菌した固形飼料（ＦＲ－２，Ｆｕｎａｂａｓｈｉ　Ｆａｒｍｓ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を給餌し、滅菌した水道水（５－１５ｐｐｍ次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加して調製）を与えた。
　測定、計算式：全ての研究において、腫瘍の長径及び短径を電子式デジタルキャリパー（ＣＤ－１５Ｃ，Ｍｉｔｕｔｏｙｏ　Ｃｏｒｐ．）で１週間に２回測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を計算した。計算式は以下に示す通り。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
　抗体－薬物コンジュゲートは全て生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）で希釈し、１０ｍＬ／ｋｇの液量を尾静脈内投与した。ＡＴＣＣから購入したヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５を生理食塩水に懸濁した２×１０6ｃｅｌｌｓを雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスの右側腹部に皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ７に無作為に群分けを実施した。抗体－薬物コンジュゲート（１）、（６）、（１２）をＤａｙ７、１４、２１に全て１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。陰性対照として薬物を結合していないｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１抗体及びｈＲＳ７抗体を２５ｍｇ／ｋｇの用量で同様に投与した。抗体－薬物コンジュゲート（１）、（６）の投与によって腫瘍体積が抗体－薬物コンジュゲート（１２）の投与に比べて著しく減少し、いずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図１３）。なお、図中、横軸は日数、縦軸は腫瘍体積を示す。
２１－ｂ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（２）
　ＡＴＣＣから購入したヒト膵臓腺癌細胞株Ｂｘ－ＰＣ３を雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに移植し、更に固形継代した腫瘍片を雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウス右側腹部に皮下移植して（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ１６に無作為に群分けを実施した。抗体－薬物コンジュゲート（１）、（６）、（１２）をＤａｙ１６、２３、３０に全て１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。陰性対照として薬物を結合していないｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１抗体及びｈＲＳ７抗体を２５ｍｇ／ｋｇの用量で同様に投与した。抗体－薬物コンジュゲート（１）、（６）の投与によって腫瘍体積が抗体－薬物コンジュゲート（１２）の投与に比べて著しく減少し、いずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図１４）。
２１－ｃ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（３）
　ＡＴＣＣから購入したヒト膵臓腺癌細胞株Ｃａｐａｎ－１を雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに移植し、更に固形継代した腫瘍片を雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウス右側腹部に皮下移植して（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ１８に無作為に群分けを実施した。抗体－薬物コンジュゲート（１）、（６）、（１２）をＤａｙ１８、２５、３２に全て１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。陰性対照として薬物を結合していないｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１抗体及びｈＲＳ７抗体を２５ｍｇ／ｋｇの用量で同様に投与した。抗体－薬物コンジュゲート（１）、（６）の投与によって腫瘍体積が抗体－薬物コンジュゲート（１２）の投与に比べて著しく減少し、いずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図１５）。
２１－ｄ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（４）
　実施例２１－ａ）と同様にＣＯＬＯ２０５を雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ１１に無作為に群分けを実施した。Ｄａｙ１１、１８、２５に抗体－薬物コンジュゲート（２）、（５）を全て１０ｍｇ／ｋｇ、抗体－薬物コンジュゲート（７）、（１０）を全て３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（２）、（５）、（７）、（１０）の投与によっていずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図１６）。
２１－ｅ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（５）
　実施例２１－ｂ）と同様にＢｘ－ＰＣ３を雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ２５に無作為に群分けを実施した。抗体－薬物コンジュゲート（２）、（５）、（７）、（１０）をＤａｙ２５、３２に全て３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（２）、（５）、（７）、（１０）の投与によっていずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図１７）。
２１－ｆ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（６）
　実施例２１－ａ）と同様にＣＯＬＯ２０５を雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ９に無作為に群分けを実施した。Ｄａｙ９、１６に抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）を全て１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）の投与によっていずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図１８）。
２１－ｇ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（７）
　実施例２１－ｂ）と同様にＢｘ－ＰＣ３を雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ２１に無作為に群分けを実施した。Ｄａｙ２１、２８に抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）を全て３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）の投与によっていずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図１９）。
２１－ｈ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（８）
　ＡＴＣＣから購入したヒト卵巣癌細胞株ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３　８×１０6ｃｅｌｌｓをＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）に懸濁し、雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ２５に無作為に群分けを実施した。Ｄａｙ２５に抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）を全て３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）の投与によっていずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図２０）。
２１－ｉ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（９）
　ＡＴＣＣから購入したヒト胃癌細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７　１×１０７ｃｅｌｌｓを生理食塩水に懸濁し、雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ６に無作為に群分けを実施した。Ｄａｙ６に抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）を全て３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）の投与によっていずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図２１）。
２１－ｊ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（１０）
　ＡＴＣＣから購入したヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ２９２　５×１０6ｃｅｌｌｓを生理食塩水に懸濁し、雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ９に無作為に群分けを実施した。Ｄａｙ９に抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）を全て３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）の投与によっていずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図２２）。
２１－ｋ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（１１）
　ＡＴＣＣから購入したヒト咽頭癌細胞株ＦａＤｕ　３×１０6ｃｅｌｌｓを生理食塩水に懸濁し、雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ１１に無作為に群分けを実施した。Ｄａｙ１１に抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）を全て３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）の投与によっていずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図２３）。
２１－ｌ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（１２）
　ＡＴＣＣから購入したヒト膵臓腺癌細胞株ＣＦＰＡＣ－１　４×１０6ｃｅｌｌｓを生理食塩水に懸濁し、雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ１４に無作為に群分けを実施した。Ｄａｙ１４に抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）を全て３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（３）、（４）、（８）、（９）の投与によっていずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図２４）。
２１－ｍ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（１３）
　実施例２１－ｌと同様に、ＣＦＰＡＣ－１を雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ１４に無作為に群分けを実施した。Ｄａｙ１４に抗体－薬物コンジュゲート（８）、（１３）を全て１ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（８）、（１３）の投与によっていずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図２５）。
２１－ｎ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（１４）
　ＡＴＣＣから購入したヒト膵臓腺癌細胞株ＨＰＡＣ　３×１０6ｃｅｌｌｓを生理食塩水に懸濁して雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ１２に無作為に群分けを実施した。Ｄａｙ１２に抗体－薬物コンジュゲート（８）、（１３）を全て３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（８）、（１３）の投与によっていずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図２６）。
２１－ｏ）ＡＤＣの抗腫瘍効果（１５）
　公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団から入手したヒト食道癌組織をＮＯＧマウス（公益財団法人　実験動物中央研究所）の皮下に移植し増殖させて得た腫瘍片を、さらに雌ＮＯＤ－ｓｃｉｄマウス（日本チャールス・リバー株式会社）に皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ２７に無作為に群分けを実施した。Ｄａｙ２７に抗体－薬物コンジュゲート（８）、（１３）を全て３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（８）、（１３）の投与によっていずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図２７）。
［実施例２２：ＡＤＣの抗細胞効果の評価］
　ＴＲＯＰ２抗原陽性細胞株であるＢｘＰＣ３、ＮＣＩ－Ｈ２９２、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３、ＣＦＰＡＣ－１、ＦａＤｕ、ヒト肺腺癌細胞株Ｃａｌｕ－３（ＡＴＣＣ）、ヒト卵巣癌細胞株ＣａＯＶ３（ＡＴＣＣ）、及びＴＲＯＰ２抗原陰性細胞株であるヒト肺癌細胞株Ｃａｌｕ－６（ＡＴＣＣ）、ヒト皮膚黒色腫細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ）を各ＡＤＣの抗細胞効果の評価に使用した。ＢｘＰＣ３及びＮＣＩ－Ｈ２９２は１０％ウシ胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ）を含むＲＰＭＩ１６４０　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）で、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３は２０％ウシ胎児血清及び０．０１ｍｇ／ｍＬ　Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０　Ｍｅｄｉｕｍで、ＣＦＰＡＣ－１は１０％ウシ胎児血清を含むＩｓｃｏｖｅ‘ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）で、ＦａＤｕ、Ｃａｌｕ－３及びＣａｌｕ－６は１０％ウシ胎児血清を含むＥａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ）で、ＣａＯＶ３及びＡ３７５は１０％ウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）で、それぞれ２．２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６穴細胞培養用マイクロプレートに９０μＬずつ播種した。更にＲＰＭＩ１６４０　Ｍｅｄｉｕｍで１００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．０３２ｎＭ、０．００６４ｎＭに希釈した抗体－薬物コンジュゲート（４）、（８）もしくは比較のためＲＰＭＩ１６４０　Ｍｅｄｉｕｍを１０μＬずつ添加して、３７℃、５％ＣＯ２下で６日間培養した。培養後、マイクロプレートをインキュベーターから取り出し、室温で３０分間静置した。培養液と等量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、プレートミキサーで１０分間攪拌して細胞を溶解後にプレートリーダーで発光量を計測した。
6日間培養後の細胞増殖阻害率は次式で算出した。
細胞増殖阻害率（％）＝ａ÷ｂ×１００
ａ：６日間培養後の検体添加ウェルの平均値－培養開始時の検体未添加ウェルの平均値
ｂ：６日間培養後の培地添加ウェルの平均値－培養開始時の検体未添加ウェルの平均値
またＧＩ５０値は次式で算出した。
ＧＩ５０（ｎＭ）＝ａｎｔｉｌｏｇ（（５０－ｆ）×（ＬＯＧ１０（ｄ）－ＬＯＧ１０（ｃ））÷（ｆ－ｅ）＋ＬＯＧ１０（ｄ））
ｃ：検体濃度ｃ
ｄ：検体濃度ｄ
ｅ：検体濃度ｃにおける細胞増殖阻害率
ｆ：検体濃度ｄにおける細胞増殖阻害率
ｃ、ｄは細胞増殖阻害率５０％を挟む２点でｃ＞ｄ。
　抗体－薬物コンジュゲート（４）及び（８）は、ＴＲＯＰ２抗原陽性細胞株であるＢｘＰＣ３、ＮＣＩ－Ｈ２９２、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３、ＣＦＰＡＣ－１、ＦａＤｕ、Ｃａｌｕ－３、ＣａＯＶ３に対して、ＧＩ５０＜１（ｎＭ）の抗細胞効果を示した。一方、ＴＲＯＰ２抗原陰性細胞株であるＣａｌｕ－６，Ａ３７５に対しては抗細胞効果を示さなかった（＞１００（ｎＭ））。
配列番号１：ＴＩＮＡ１抗体の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２：ＴＩＮＡ１抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号３：ＴＩＮＡ１抗体の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号４：ＴＩＮＡ１抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号５：ヒトκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号６：ヒト重鎖分泌シグナル及びヒトＩｇＧ１定常領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号７：ｃＴＩＮＡ１抗体重鎖のヌクレオチド配列
配列番号８：ｃＴＩＮＡ１抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号９：ｃＴＩＮＡ１抗体軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号１０：ｃＴＩＮＡ１抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１１：ｈＴＩＮＡ１－Ｈ１のヌクレオチド配列
配列番号１２：ｈＴＩＮＡ１－Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号１３：ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２のヌクレオチド配列
配列番号１４：ｈＴＩＮＡ１－Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号１５：ｈＴＩＮＡ１－Ｈ３のヌクレオチド配列
配列番号１６：ｈＴＩＮＡ１－Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号１７：ｈＴＩＮＡ１－Ｌ１のヌクレオチド配列
配列番号１８：ｈＴＩＮＡ１－Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号１９：ｈＴＩＮＡ１－Ｌ２のヌクレオチド配列
配列番号２０：ｈＴＩＮＡ１－Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号２１：ｈＴＩＮＡ１－Ｌ３のヌクレオチド配列
配列番号２２：ｈＴＩＮＡ１－Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号２３：ＴＩＮＡ１抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号２４：ＴＩＮＡ１抗体のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号２５：ＴＩＮＡ１抗体のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号２６：ＴＩＮＡ１抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号２７：ＴＩＮＡ１抗体のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号２８：ＴＩＮＡ１抗体のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号２９：ｈＲＳ７抗体重鎖のヌクレオチド配列
配列番号３０：ｈＲＳ７抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号３１：ｈＲＳ７抗体軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号３２：ｈＲＳ７抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３３：プライマー　ｍＧ２ａＶＲ２
配列番号３４：プライマー　ｍＫＶＲ２
配列番号３５：プライマー　３．３－Ｆ１
配列番号３６：プライマー　３．３－Ｒ１
配列番号３７：プライマー　ＴＩＮＡ１Ｈ－Ｆ
配列番号３８：プライマー　ＴＩＮＡ１Ｈ－Ｒ
配列番号３９：プライマー　ＴＩＮＡ１Ｌ－Ｆ
配列番号４０：プライマー　ＴＩＮＡ１Ｌ－Ｒ
配列番号４１：プライマー　ＥＧ－Ｉｎｆ－Ｆ
配列番号４２：プライマー　ＥＧ１－Ｉｎｆ－Ｒ
配列番号４３：プライマー　ＣＭ－ＬＫＦ
配列番号４４：プライマー　ＫＣＬ－Ｉｎｆ－Ｒ

Claims (27)

  1. 　次式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
     で示される抗腫瘍性化合物と抗ＴＲＯＰ２抗体とを次式：
    -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
    で示される構造のリンカーを介して、抗ＴＲＯＰ２抗体のヒンジ部に存在するジスルフィド結合部分において形成させたチオエーテル結合によって結合させたことを特徴とする抗体－薬物コンジュゲート。
    （ここで、抗ＴＲＯＰ２抗体は、L1の末端において結合する。抗腫瘍性化合物は、１位のアミノ基の窒素原子を結合部位として、-(CH2)n2-C(=O)-部分のカルボニル基に結合する。
    　式中、n1は、０から６の整数を示し、
    n2は、０から５の整数を示し、
    L1は、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-を示し、
    　ここで、n3は、２から８の整数を示し、
    L2は、-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-又は単結合を示し、
    　ここで、n4は、１から６の整数を示し
    LPは、２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基を示し、
    Laは、-O-又は単結合を示し、
    -(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
     で示される構造であり、このものの３位で抗ＴＲＯＰ２抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。）
  2. 　LPのペプチド残基が、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選ばれるアミノ酸からなるペプチド残基である請求項１記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  3. 　LPが、以下の群から選ばれるペプチド残基である請求項１又は２に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
    -GGF-、
    -DGGF-、
    -(D-)D-GGF-、
    -EGGF-、
    -GGFG-、
    -SGGF-、
    -KGGF-、
    -DGGFG-、
    -GGFGG-、
    -DDGGFG-、
    -KDGGFG-、
    -GGFGGGF-；
    （ここで『(D-)D』はD-アスパラギン酸を示す。）
  4. 　LPが、４個のアミノ酸で構成されるペプチド残基である請求項１又は２に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  5. 　LPが、テトラペプチド残基の-GGFG-である請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  6. 　n3が２から５の整数であって、L2が単結合である請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  7. 　n3が２から５の整数であって、L2が-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-であり、n4が２又は４である請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  8. 　-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、４から７原子の鎖長を有する部分構造である請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  9. 　-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、５又は６原子の鎖長を有する部分構造である請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  10. 　-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、以下のいずれかである請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
    -NH-CH2CH2-C(=O)-、
    -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
    -NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
    -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、
    -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
    -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-。
  11. 　-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、以下のいずれかである請求項１０に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
    -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
    -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
    -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-。
  12. 　-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-に薬物を結合させた薬物－リンカー構造部分が、次の群から選ばれる１種の薬物－リンカー構造である請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)；
    （ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
     で示される構造であり、このものの３位で抗ＴＲＯＰ２抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。
    -(NH-DX)は次式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
     で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基を示す。
    -GGFG-は、-Gly-Gly-Phe-Gly-のテトラペプチド残基を示す。）
  13. 　前記薬物－リンカー構造部分が、次の群から選ばれる１種の薬物－リンカー構造である請求項１２に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
    -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
  14. 　次式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
     で示される抗腫瘍性化合物と抗ＴＲＯＰ２抗体とを次式：
    -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
    で示される構造のリンカーを介して、抗ＴＲＯＰ２抗体のヒンジ部に存在するジスルフィド結合部分において形成させたチオエーテル結合を介して結合させたことを特徴とする抗体－薬物コンジュゲート。
    （ここで、抗ＴＲＯＰ２抗体はL1の末端において結合する。抗腫瘍性化合物は-(CH2)n2-C(=O)-部分のカルボニル基に結合する。
    　式中、n1は、０から６の整数を示し、
    n2は、０から５の整数を示し、
    L1は、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-を示し、
    　ここで、n3は、２から８の整数を示し、
    L2は、-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-又は単結合を示し、
    　ここで、n4は、１から６の整数を示し、
    LPは、-GGFG-のテトラペプチド残基を示し、
    Laは、-O-又は単結合を示し、
    -(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
     で示される構造であり、このものの３位で抗ＴＲＯＰ２抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。）
  15. 　n1が３であり、n2が０であり、n3が２であり、L2が-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-であって、n4が２であり、Laが単結合であるか、
    n1が１であり、n2が１であり、n3が５であり、L2が単結合であり、Laが-O-であるか、又は
    n1が２であり、n2が１であり、n3が５であり、L2が単結合であり、Laが-O-である、請求項１４に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  16. 　n3が２又は５であって、L2が単結合である請求項１４又は１５に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  17. 　n3が２又は５であって、L2が-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-であり、n4が２又は４である請求項１４又は１５に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  18. 　-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-が、以下のいずれかである請求項１４～１７のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
    -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、
    -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、
    -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-。
  19. 　選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が１から１０個の範囲である請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  20. 　選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個の範囲である請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  21. 　選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個の範囲である請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  22. 　請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を含有する医薬。
  23. 　請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を含有する抗腫瘍薬及び/又は抗癌薬。
  24. 　肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸部癌、又は食道癌に適用するための請求項２３記載の抗腫瘍薬及び/又は抗癌薬。
  25. 　請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を活性成分とし、薬学的に許容される製剤成分とを含有する医薬組成物。
  26. 　肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸部癌、又は食道癌に適用するための請求項２５記載の医薬組成物。
  27. 　請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を投与することを特徴とする腫瘍及び/又は癌の治療方法。

     
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