WO2011108371A1 - 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム - Google Patents

光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム Download PDF

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light detection
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山口光城
聖二 近藤
田邊哲也
堀邦夫
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オリンパス株式会社
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
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    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
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    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Definitions

  • the present invention analyzes or analyzes the state of particles in a solution by detecting light from atoms, molecules or aggregates thereof (hereinafter referred to as “particles”) dispersed or dissolved in the solution.
  • the present invention relates to an optical analysis apparatus, an optical analysis method, and a computer program therefor, and more particularly, using an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • the present invention relates to an optical analysis apparatus, an optical analysis method, and an optical analysis computer program capable of acquiring information useful for analyzing or analyzing states (interactions, binding / dissociation states, etc.).
  • the average residence time (translational diffusion time) of the fluorescent molecules and the like in the minute region determined from the value of the autocorrelation function of the measured fluorescence intensity, and the average number of staying molecules Based on this, acquisition of information such as the speed or size of movement of fluorescent molecules, concentration, concentration, molecular structure or size change, molecular binding / dissociation reaction, dispersion / aggregation, etc.
  • the detection of various phenomena is achieved.
  • Fluorescence-Intensity Distribution Analysis (FIDA, for example, Patent Document 3) and Photon Counting Histogram (PCH, for example, Patent Document 4) are measured in the same manner as FCS.
  • a histogram of the fluorescence intensity of the fluorescent molecules entering and exiting the volume is generated, and by fitting a statistical model formula to the distribution of the histogram, the average value of the intrinsic brightness of the fluorescent molecules and the confocal
  • An average value of the number of molecules staying in the volume is calculated, and based on such information, a change in the structure or size of the molecule, a bound / dissociated state, a dispersed / aggregated state, and the like are estimated.
  • Patent Documents 5 and 6 propose a method of detecting a fluorescent substance based on the time lapse of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 7 describes the presence of fluorescent fine particles in a flow or on a substrate by measuring weak light from fluorescent fine particles circulated in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate using a photon counting technique. A signal arithmetic processing technique for detecting the signal is proposed.
  • the sample required for measurement has an extremely low concentration compared with the conventional method. It can be very small (the amount used in one measurement is about several tens of ⁇ L), and the measurement time is greatly shortened (measurement of time on the order of seconds is repeated several times in one measurement). . Therefore, these technologies are particularly useful for analyzing rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development, for clinical diagnosis of diseases, screening for physiologically active substances, etc. When the number is large, it is expected to be a powerful tool capable of performing experiments or inspections at a lower cost or faster than conventional biochemical methods.
  • the magnitude of the temporal fluctuation of the measured fluorescence intensity is calculated by statistical processing, and the sample solution is based on the magnitude of the fluctuation.
  • Various characteristics such as fluorescent molecules entering and exiting the minute region are determined. Therefore, in order to obtain a significant result in the above optical analysis technique, the concentration or number density of the fluorescent molecules to be observed in the sample solution must be as long as one second in the equilibrium state. In order for the number of fluorescent molecules that can be statistically processed within the measurement time to enter and exit the micro area, it is preferable that there is always approximately one fluorescent molecule in the micro area.
  • the volume of the confocal volume is typically about 1 fL, so that the concentration of the fluorescent molecule or the like is preferably about 1 nM or more.
  • the concentration or number density of the particles to be observed in the sample solution is significantly lower than the level capable of statistical processing (for example, significantly lower than 1 nM)
  • the observation target is measured in a minute region. A state that rarely enters in time occurs, and in the measurement result of fluorescence intensity, a state where the observation object is not present in the minute region is included for a long period of time, and is significant. Therefore, the optical analysis technique based on the statistical fluctuation of the fluorescence intensity as described above cannot expect a significant or accurate analysis result.
  • Patent Documents 5 and 6 the statistical processing relating to the fluctuation of the fluorescence intensity as described above is not performed, and the measurement time over several seconds is used.
  • the presence or absence of fluorescent molecules to be observed in the sample can be specified by the presence or absence of generation of a fluorescent signal with a significant intensity.
  • the frequency of the fluorescent signal with a significant intensity and the number of fluorescent molecules or the like in the sample It is disclosed that a correlation can be obtained.
  • Patent Document 6 suggests that detection sensitivity is improved by generating a random flow that stirs the sample solution.
  • these methods are also limited to detecting the presence of fluorescent molecules or the like that enter the microregion stochastically by diffusion or random flow.
  • Patent Document 7 The behavior cannot be grasped, and for example, particle counting and particle concentration or number density are not quantitatively calculated.
  • the technique described in Patent Document 7 is to individually detect the presence of fluorescent fine particles in a flow in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate, and in a normal state in a sample solution. This is not a technique for detecting molecules or colloid particles dissolved or dispersed in the sample solution, that is, particles moving randomly in the sample solution. Quantitative calculation of concentration or number density has not been achieved.
  • the technique of Patent Document 7 includes a process such as measurement in a flow cytometer or immobilization of fluorescent particles on a substrate, the amount of sample required for inspection is optical analysis such as FCS, FIDA, PCH, etc. It is considered to require a complicated and sophisticated operation technique for the practitioner as well as the number of techniques.
  • one object of the present invention does not include statistical processing, such as that performed in optical analysis techniques such as FCS, FIDA, PCH, etc., and therefore the concentration or number density of the particles to be observed is their optical analysis. It is to provide a novel optical analysis technique capable of detecting the state or characteristics of particles to be observed in a sample solution lower than the level handled by the technique.
  • Another subject of the present invention is an optical analysis apparatus, method or computer program for realizing the above-described novel optical analysis technology, which is measured in the same manner as optical analysis technologies such as FCS, FIDA, and PCH.
  • the amount of sample required for the measurement may be a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L), and the measurement time is short and the optical analysis capable of quantitatively specifying the characteristics such as the concentration or number density of the particles to be observed
  • An apparatus, an optical analysis method, or a computer program for optical analysis is provided.
  • an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, is used to randomly disperse in a sample solution.
  • This is an optical analysis technique for detecting light from particles that emit moving light (hereinafter referred to as “luminescent particles”), while moving the position of a micro area, which is a light detection area, within a sample solution. That is, light from the micro area is detected while scanning the sample solution by the micro area, and thereby, the luminescent particles crossing the micro area are individually detected to count the luminescent particles and emit light in the sample solution.
  • a new type of optical analysis technique is proposed that enables the acquisition of information on the concentration or number density of particles.
  • an optical analyzer that detects light from luminescent particles that are dispersed in a sample solution and move randomly using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, A light detection region moving unit that moves the position of the light detection region of the optical system in the sample solution, a light detection unit that detects light from the light detection region, and a light detection region in the sample solution.
  • a signal processing unit for detecting and the signal processing unit calculates a light intensity characteristic value indicating the presence or absence of light from a single light emitting particle for each time interval of a predetermined width in time-series light intensity data. Using these characteristic values, the optical signal from each of the luminescent particles is individually There is provided an apparatus and detecting.
  • the luminous particles dispersed in the sample solution and moving randomly are particles that emit light, such as atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in the sample solution, Any particle may be used as long as it is not fixed to the substrate or the like and freely moves in the solution in Brownian motion.
  • luminescent particles are typically fluorescent particles, but may be particles that emit light by phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, or the like.
  • the “light detection area” of the optical system of a confocal microscope or multiphoton microscope is a minute area in which light is detected in those microscopes.
  • the illumination light is Corresponds to the focused region (in the confocal microscope, it is determined in particular by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the luminescent particles emit light without illumination light, for example, chemiluminescence or biological In the case of particles that emit light by light emission, illumination light is not required in the microscope.
  • optical signal means “signal representing light”.
  • the position of the light detection region is moved in the sample solution, that is, the sample solution is scanned by the light detection region.
  • light is detected sequentially.
  • the moving light detection region includes light emitting particles moving at random, light from the light emitting particles is detected by the light detection unit.
  • the presence can be detected.
  • the value of the output signal of the light detection unit changes in a pulse shape, and has a characteristic that is different from the time interval in which light from the luminescent particles in which only noise occurs does not arrive. Therefore, the signal processing unit of the apparatus sequentially generates time-series light intensity data from the signals detected by the light detection unit, and in the time-series light intensity data, each time-series light intensity data is A characteristic value of light intensity representing the presence / absence of light from one luminescent particle is calculated, and the optical signal from each of the luminescent particles is individually detected using the characteristic value.
  • the size in a time interval of a predetermined width where light from a single light emitting particle exists is a time interval of a predetermined width where light from a single light emitting particle does not exist Any value that is larger than the size in can be used.
  • the characteristic value of the light intensity is larger than a predetermined threshold, it is determined that the light signal from the luminescent particles exists in a time interval of a predetermined width.
  • Such characteristic values include, for example, an integrated value of light intensity, a median value of light intensity, an average value of light intensity, a standard deviation of light intensity, a dispersion of light intensity, and an entropy of light intensity.
  • the photodetection unit detects light from the photodetection region by photon counting. Therefore, in this case, time-series light intensity data becomes time-series photon count data. Therefore, the characteristic value of the light intensity includes the total number of photons in the time interval of the predetermined width, the median value of the photons, the average value of the photons, the standard deviation of the number of photons, the dispersion of the number of photons, and the entropy of the number of photons. Further, it may be a value selected from the group of particle numbers calculated from the autocorrelation function value of the photon number with the maximum value of the photon number and the correlation time being zero.
  • the time required for the predetermined width from the time when the single light emitting particle enters the light detection region to the time when it escapes If it is shorter than the width, the light of one luminescent particle will be detected over two or more time intervals, and if the predetermined width is long enough to include the arrival times of the light of a plurality of luminescent particles.
  • information on a plurality of luminescent particles is included, and in any case, a relationship in which one luminescent particle corresponds to one time interval is not established.
  • the signal processing for individually detecting the optical signal from each becomes complicated.
  • the predetermined width of the time interval for calculating the characteristic value is preferably set to be substantially longer than the time width required from the time when one luminescent particle enters the light detection region to the time when it escapes. In addition, it is set to be substantially shorter than the time width from the time when one light emitting particle enters the light detection region to the time when another light emitting particle enters the light detection region.
  • the predetermined width of the time interval is set such that the lower limit is substantially longer than the time width of the optical signal of one luminescent particle, and the upper limit is the number of luminescent particles included in each time interval. Is set to be substantially 1 or less.
  • ⁇ Set to be substantially longer than the time width of '' means that the predetermined width is set longer than the time width of the optical signal of most luminescent particles, that is, a time width longer than the predetermined width within an error range.
  • the presence of an optical signal of the luminescent particles having Also, “substantially set to be shorter than the time width from the time when one luminescent particle enters the light detection region to the time when another luminescent particle enters the light detection region” or “included in each time interval “Set so that the number of luminescent particles to be substantially reduced to 1 or less” means to set the number of luminescent particles found in most time intervals to be 1 or less, that is, within an error range. This means that a time interval including two or more luminescent particles is allowed. According to this configuration, when one time interval in which light from the luminescent particles exists is determined, in most cases, the optical signal included in the time interval is an optical signal from one luminescent particle. As a result, the presence of one luminescent particle is confirmed, which facilitates the process of individually detecting the luminescent particle, which is advantageous.
  • the signal processing unit counts the number of light signals from the individually detected luminescent particles and is detected while the position of the light detection region is moving.
  • the number of luminescent particles may be counted (counting of luminescent particles).
  • the number of time intervals of the predetermined width having the light signal from the light emitting particles is the light emission.
  • the number of time intervals having a predetermined width having the optical signal from the luminescent particles is counted, and the number of luminescent particles detected during the movement of the position of the light detection region is counted.
  • information on the number density or concentration of the luminescent particles in the sample solution can be obtained by combining the number of luminescent particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the total volume of the movement locus of the light detection region is specified by any method, for example, by moving the position of the light detection region at a predetermined speed, the number density or concentration of the luminescent particles is reduced. It can be calculated specifically.
  • the absolute number density value or concentration value is not directly determined, but the relative number density or concentration ratio with respect to a plurality of sample solutions or a standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated. It may be like this.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution can be appropriately changed based on the characteristics of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution. Good.
  • the manner of light detected from the luminescent particles can vary depending on the properties of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the moving speed of the light detection region increases, the amount of light obtained from one light emitting particle decreases, so that the light from one light emitting particle can be measured with high accuracy or sensitivity. It is preferable that the moving speed can be appropriately changed.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably the diffusion moving speed of the luminescent particles to be detected (average moving speed of particles due to Brownian motion). Higher than.
  • the apparatus of the present invention detects the light emitted from the light emitting particles when the light detection region passes the position where the light emitting particles exist, and individually detects the light emitting particles.
  • the luminescent particles move randomly in the solution due to Brownian motion and enter and exit the photodetection region multiple times, an optical signal (representing the presence of the luminescent particles) from one luminescent particle multiple times Is detected, and it becomes difficult to make the detected optical signal correspond to the presence of one luminescent particle.
  • the moving speed of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the light emitting particles, and thereby one light emitting particle can correspond to one light signal (representing the presence of the light emitting particle). It becomes possible. Since the diffusion movement speed varies depending on the luminescent particles, as described above, according to the characteristics of the luminescent particles (particularly, the diffusion constant), the apparatus of the present invention can appropriately change the movement speed of the light detection region. It is preferable to be configured.
  • the movement of the position of the light detection area may be performed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path using a galvanometer mirror employed in a laser scanning optical microscope, or the light detection region may be fixed,
  • the position of the sample solution may be moved (for example, by moving a microscope stage) to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the light detection is performed while moving the position of the light detection region in the sample solution, and the light signal from each light emitting particle is individually detected.
  • the processing can also be realized by a general-purpose computer. Therefore, according to another aspect of the present invention, for optical analysis for detecting light from luminous particles dispersed and moving randomly in a sample solution using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • the number of light signals from the light-emitting particles detected individually or the number of time intervals having a predetermined width having the light signals from the light-emitting particles is counted to determine the position of the light detection region.
  • light from the light detection region is detected by photon counting, in which case the time-series light intensity is detected.
  • the data is time-series photon count data.
  • the position of the light detection region may be moved at a predetermined speed or at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent particles.
  • the moving speed of the position of the detection region may be set based on the characteristics of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the movement locus of the position of the light detection region may be selectable from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the characteristic value of the light intensity in the time interval of the predetermined width is obtained from the light emitted from a single light emitting particle when light from the single light emitting particle exists. It may be a value that is greater than when no light is present, and when the light intensity characteristic value is greater than a predetermined threshold, it may be determined that an optical signal from the luminescent particles is present in a time interval of a predetermined width.
  • such characteristic values include the integrated value of light intensity, the median value of light intensity, the average value of light intensity, the standard deviation of light intensity, the dispersion of light intensity, the light intensity, Any of the number of particles calculated from the entropy of the intensity, the maximum value of the light intensity, and the autocorrelation function value of the light intensity with the correlation time being 0 may be adopted.
  • the characteristic value of the light intensity includes the total number of photons, the median of the number of photons, and the average of the number of photons in a predetermined time interval.
  • the predetermined width of the time interval is preferably set to be substantially longer than a time width required from the time when one luminescent particle enters the light detection region to the time when it exits, and It is set to be substantially shorter than the time width from the time when one luminescent particle enters the light detection region to the time when another luminescent particle enters the light detection region.
  • the light detection is performed while moving the position of the light detection region in the sample solution, and the light signal from each light emitting particle is individually received.
  • a novel optical analysis method for detection is realized. Therefore, the optical analysis method for detecting light from the luminous particles dispersed and moving randomly in the sample solution using the optical system of the confocal microscope or multiphoton microscope of the present invention is the above-described optical analysis method in the sample solution.
  • the process of moving the position of the light detection area of the optical system, and the process of generating light in time series by detecting the light from the light detection area while moving the position of the light detection area in the sample solution In the time-series light intensity data, the process of calculating the characteristic value of the light intensity indicating the presence or absence of light from a single light emitting particle for each time interval of a predetermined width, and the light intensity of each time interval of a predetermined width And a step of individually detecting optical signals from the individual luminescent particles based on the characteristic values.
  • the number of light signals from individually detected luminescent particles is counted, or the number of time intervals having a predetermined width having light signals from luminescent particles is counted to determine the position of the light detection region.
  • a step of counting the number of luminescent particles detected during movement and / or a step of determining the number density or concentration of luminescent particles in the sample solution based on the number of detected luminescent particles may be included.
  • the light from the light detection region is detected by photon counting, in which case the time series light intensity is detected.
  • the data is time-series photon count data.
  • the position of the light detection region may be moved at a predetermined speed or at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent particles.
  • the moving speed of the position of the detection region may be set based on the characteristics of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the movement locus of the position of the light detection region may be selectable from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the characteristic value of the light intensity in the time interval of the predetermined width is that the light from a single luminescent particle is present when light from a single luminescent particle is present. It may be a value that is larger than the case where no light exists, and when the light intensity characteristic value is larger than a predetermined threshold value, it may be determined that the light signal from the luminescent particles is present in a time interval of a predetermined width.
  • such characteristic values include the integrated value of light intensity, the median value of light intensity, the average value of light intensity, the standard deviation of light intensity, the dispersion of light intensity, the light intensity, Any of the number of particles calculated from the entropy of the intensity, the maximum value of the light intensity, and the autocorrelation function value of the light intensity with the correlation time being 0 may be adopted.
  • the characteristic value of the light intensity includes the total number of photons, the median of the number of photons, and the average of the number of photons in a predetermined time interval.
  • the predetermined width of the time interval is preferably set to be substantially longer than a time width required from the time when one luminescent particle enters the light detection region to the time when it exits, and It is set to be substantially shorter than the time width from the time when one light emitting particle enters the light detection region to the time when another light emitting particle enters the light detection region.
  • optical analysis technique realized by the above-described apparatus, method or computer program according to the present invention is the same as in the case of optical analysis techniques such as FCS, FIDA, PCH, etc. Since it is configured to detect light from the light detection region of the microscope, the amount of the sample solution may be small as well. However, in the present invention, since statistical processing such as calculating fluctuations in fluorescence intensity is not performed, the photoanalysis technique of the present invention uses photoanalysis such as the number density or concentration of luminescent particles of FCS, FIDA, PCH, etc. Applicable to sample solutions significantly below the level required for the technology.
  • each of the luminous particles dispersed or dissolved in the solution is individually detected. Therefore, the information is used to quantitatively count the luminous particles or the luminous particles in the sample solution. It is possible to calculate the concentration or the number density of the above or to acquire information on the concentration or the number density. For example, in the techniques described in Patent Documents 5 and 6, the correlation between the total value of the frequency of fluorescent signals having an intensity equal to or higher than a predetermined threshold within a predetermined time and the number of particles such as fluorescent molecules in the sample solution is obtained. However, it is not possible to grasp the dynamic behavior of particles passing through the measurement region (whether the particles have passed straight through the measurement region or whether the particles have stayed in the measurement region).
  • the luminescent particles that pass through the light detection region and the arrival time of the optical signal to the light detection unit are associated with each other one by one, the luminescent particles are detected one by one. It is possible to count luminous particles that are dispersed and move in a random manner, and it is possible to determine the concentration or number density of particles in a sample solution with higher accuracy than before.
  • the optical analysis technique of the present invention typically involves the production of particulate biological objects such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, viruses, cells and the like. Used for analysis or analysis of conditions in solution, but may be used for analysis or analysis of conditions in solution of non-biological particles (eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.) It should be understood that such a case also belongs to the scope of the present invention.
  • particulate biological objects such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, viruses, cells and the like.
  • non-biological particles eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer according to the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region of a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic diagram of a mechanism for changing the direction of the mirror 7 to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • FIG. 1D is a schematic diagram of a mechanism for moving the position of the photodetection region in the sample solution by moving the horizontal position of the microplate.
  • FIGS. 2A and 2B are a schematic diagram for explaining the principle of light detection by the optical analysis technique according to the present invention and a schematic diagram of a temporal change in measured light intensity, respectively.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer according to the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region of a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic diagram of
  • FIG. 2C is a diagram for explaining the principle of individually detecting light from the luminescent particles from the light intensity data.
  • FIG. 2 (D) shows the predetermined width of the time interval and the probability that the light of two or more luminescent particles has entered at the same time (the ratio that a plurality of luminescent particles are included in the time interval of one predetermined width ⁇ ). Showing the relationship.
  • FIGS. 3A and 3B are a model diagram in the case where the luminescent particle crosses the light detection region while performing a Brownian motion, and a diagram showing an example of a temporal change in photon count (light intensity) in that case. is there.
  • FIG. 4A and 4B show models in which the luminescent particles cross the light detection region by moving the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent particles. It is a figure which shows the example of the time change of a figure and the photon count (light intensity) in that case.
  • FIG. 5A is a diagram showing the entire time-series photon count data measured by the optical analysis technique of the present invention
  • FIG. 5B is an enlarged view of a part of the time-series photon count data. It is a figure and shows the various characteristic values calculated about the section currently referred.
  • FIG. 5A is a diagram showing the entire time-series photon count data measured by the optical analysis technique of the present invention
  • FIG. 5B is an enlarged view of a part of the time-series photon count data. It is a figure and shows the various characteristic values calculated about the section currently referred.
  • FIG. 6 shows the number of luminescent particles individually detected in time-series photon count data using the characteristic values calculated according to the present invention for each solution having a luminescent particle concentration of 10 fM to 100 pM.
  • FIG. 7 is a diagram showing the relationship between the predetermined width of the time interval and the number of intervals in which the presence of luminescent particles is detected in the time-series photon count data obtained by the optical analysis technique according to the present invention.
  • FIG. 8 is an example of the time change of the photon count (light intensity) obtained in the conventional optical analysis technique for calculating the fluctuation of the fluorescence intensity.
  • FIG. 8A shows that the concentration of particles in the sample is sufficient. This is a case where measurement accuracy is given, and (B) is a case where the concentration of particles in the sample is significantly lower than in (A).
  • optical analysis apparatus 1 that realizes the optical analysis technique according to the present invention is capable of executing FCS, FIDA, and the like as schematically illustrated in FIG.
  • the apparatus may be a combination of an optical system of a confocal microscope and a photodetector.
  • optical analysis apparatus 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the optical analyzer 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope, in which the laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is a fiber.
  • the light is emitted as a divergent light at an angle determined by a specific NA at the outgoing end of the light, becomes parallel light by the collimator 4, is reflected by the dichroic mirror 5, the reflection mirrors 6, 7, and the objective lens 8. Is incident on.
  • a microplate 9 in which a sample container or well 10 into which a sample solution of 1 to several tens of ⁇ L is dispensed is typically arranged is emitted from the objective lens 8.
  • the laser light is focused in the sample solution in the sample container or well 10 to form a region with high light intensity (excitation region).
  • light-emitting particles that are the observation target typically particles to which fluorescent labels such as fluorescent particles or fluorescent dyes are added are dispersed or dissolved, and these light-emitting particles enter the excitation region.
  • the luminescent particles are excited and light is emitted.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, is collected by the condenser lens 12, passes through the pinhole 13, and passes through the barrier filter 14. (Here, only the light component of a specific wavelength band is selected.), Introduced into the multimode fiber 15, reaches the photodetector 16, is converted into a time-series electrical signal, and then to the computer 18.
  • Input and processing for optical analysis is performed in a manner described later.
  • the pinhole 13 is disposed at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8, and as a result, as shown in FIG. Only the light emitted from the focal region of the laser beam, that is, the excitation region as schematically shown, passes through the pinhole 13, and the light from other than the excitation region is blocked.
  • the focal region of the laser beam illustrated in FIG. 1B is usually a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL (typically, the light intensity is in the region).
  • the photodetector 16 is preferably an ultra-high light that can be used for photon counting.
  • a sensitive photodetector is used.
  • the light intensity is measured in a manner in which the number of photons arriving at the photodetector is sequentially measured for a predetermined unit time (BIN TIME) over a predetermined time. Executed. Therefore, in this case, the time-series light intensity data is time-series photon count data.
  • a mechanism for scanning the sample solution with the light detection region that is, for moving the position of the focal region, that is, the light detection region in the sample solution.
  • a mechanism for moving the position of the light detection region for example, a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG. A method of moving the absolute position of the light detection area).
  • Such a mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope.
  • FIG. 1D the horizontal position of the container 10 (microplate 9) into which the sample solution is injected is moved to detect light in the sample solution.
  • a stage position changing device 17a that moves the relative position of the region may be employed (a method of moving the absolute position of the sample solution).
  • the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a cooperates with the light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18 in order to achieve a desired movement pattern of the position of the light detection region.
  • the movement locus of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (so that various movement patterns can be selected in the program in the computer 18). It may be.)
  • the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 or the stage up and down.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed. Further, when the luminescent particles to be observed emit light regardless of excitation light due to chemiluminescence or bioluminescence phenomenon, the optical systems 2 to 5 for generating excitation light may be omitted. When the luminescent particles emit light by phosphorescence or scattering, the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • a plurality of excitation light sources 2 may be provided, and the wavelength of the excitation light may be appropriately selected according to the excitation wavelength of the luminescent particles.
  • a plurality of photodetectors 16 may be provided, and when a plurality of types of light emitting particles having different wavelengths are included in the sample, light can be separately detected based on the wavelengths. It's okay.
  • the spectroscopic analysis technology such as FCS, FIDA and the like is superior to the conventional biochemical analysis technology in that the required amount of sample is extremely small and inspection can be performed quickly. ing.
  • the concentration and characteristics of the observation target particles are calculated based on the fluctuation of the fluorescence intensity. Therefore, in order to obtain an accurate measurement result, the sample solution
  • the concentration or number density of the observation target particles therein is always about one observation target particle in the light detection region CV during the measurement of the fluorescence intensity. As shown on the right side of the figure, it is required that a significant light intensity (photon count) is always detected during the measurement time.
  • the concentration or number density of the observation target particles is lower than that, for example, as shown in FIG. 8B, the observation target particles are at a level that only occasionally enters the light detection region CV. As illustrated on the right side of the figure, a significant light intensity (photon count) appears only in a part of the measurement time, making it difficult to accurately calculate the fluctuation of the light intensity.
  • the concentration of the observation target particle is much lower than the level at which about one observation target particle is always present in the light detection area during measurement, the influence of the background is considered in the calculation of the light intensity fluctuation.
  • the measurement time is long in order to obtain significant light intensity data sufficient for calculation.
  • the concentration of the observation target particles is lower than the level required by the spectral analysis technology such as FCS or FIDA as described above, the characteristics such as the number density or the concentration of the observation target particles.
  • a mechanism for moving the position of the light detection region is driven, As schematically illustrated in FIG. 2, light detection is performed while moving the position of the light detection region CV in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region CV. Is done. Then, for example, as shown in FIG. 2A, while the light detection region CV moves (time to to t2 in the figure), it passes through a region where one luminescent particle (fluorescent dye in the figure) exists. At this time (t1), as shown in FIG. 2B, a significant light intensity (Em) is detected as a pulse signal.
  • Em significant light intensity
  • the movement of the position of the light detection region CV and the light detection are executed, and the significant light intensity, that is, the pulse-like signal appearing in the meantime as illustrated in FIG. 2B is detected one by one.
  • the luminescent particles are individually detected, and by counting the number thereof, information on the number of luminescent particles existing in the measured region, or the concentration or number density can be acquired.
  • statistical calculation processing such as calculation of fluctuations in fluorescence intensity is not performed, and luminescent particles are detected one by one, and FCS, FIDA, etc. are sufficient. It should be understood that information on the concentration or number density of luminescent particles can be obtained even in a sample solution having a low concentration of luminescent particles (observation target particles) that cannot be analyzed with high accuracy.
  • the integrated value of the light intensity and the median value of the light intensity in a predetermined time interval Average value of light intensity, standard deviation value of light intensity (SD value), dispersion value of light intensity, entropy of light intensity (EP value), maximum value of light intensity and autocorrelation of light intensity with correlation time being zero It may be the number of particles calculated from the function value.
  • the characteristic values are a total value of the number of photons in a time interval of a predetermined width, a median value of the number of photons, an average value of the number of photons, Select from the group of particle numbers calculated from the standard deviation value of the photon number, the dispersion value of the photon number, the entropy value of the photon number, the maximum value of the photon number, and the autocorrelation function value of the photon number with zero correlation time
  • the value may be
  • the predetermined width of the time interval for calculating the characteristic value is preferably substantially longer than the time width required from the time when one luminescent particle enters the light detection region to the time when it exits, And it is set substantially shorter than the time width from the time of the approach of one luminescent particle to the photodetection region until the time of the entrance of another luminescent particle to the photodetection region.
  • the predetermined width is set in this way, one time interval in which the light signal of the luminescent particles exists corresponds to the presence of one luminescent particle, that is, the time interval and the presence of the luminescent particles have a one-to-one relationship. This is advantageous because the processing in the counting of the light emitting particles is simplified.
  • the predetermined width of the time interval is shorter than the time width required from the time when one light emitting particle enters the light detection region to the time when it exits, the light signal of one light emitting particle is spread over a plurality of time intervals. Therefore, a process for associating a plurality of time intervals with one luminescent particle is necessary, and if the predetermined width of the time interval is different from the time when one luminescent particle enters the light detection region, If it is longer than the time width until the light emitting particle enters the light detection region, the light signal of the plurality of light emitting particles exists in one time interval, and it is difficult to detect the light emitting particles one by one. Will be.
  • the lower limit ⁇ low of the predetermined width is assumed when the luminescent particles pass linearly through the center of the light detection region (see (1) Measurement of the light intensity of the sample solution and FIG. 4 below), for example, the light detection region.
  • the diameter 2 Wo and the moving speed u ⁇ low 2Wo / u (1) May be set.
  • the predetermined width ⁇ high may be set to the predetermined width ⁇ that gives an allowable error in the above equation (2d) using the expected concentration c of the luminescent particles.
  • the particles to be observed in the optical analysis technique of the present invention are particles such as dissolved molecules that are dispersed in the sample solution and move randomly in the solution.
  • a biomolecule such as a protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, virus, cell, metal colloid, or other non-biological molecule may be used. And so on.
  • a luminescent label fluorescent molecule, phosphorescent molecule, chemical / bioluminescent molecule
  • the sample solution is typically an aqueous solution, but is not limited thereto, and may be an organic solvent or any other liquid.
  • the light intensity in the optical analysis of the present invention is measured by driving the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a during the measurement to move the position of the light detection region in the sample solution (scanning in the sample solution). ) May be performed in the same manner as the light intensity measurement process in FCS or FIDA.
  • the operation process typically, after injecting the sample solution into the well 10 of the microplate 9 and placing it on the stage of the microscope, the user inputs an instruction to start measurement to the computer 18. Then, the computer 18 stores a program stored in a storage device (not shown) (procedure for moving the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region).
  • the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a drives the mirror 7 (galvanomirror) or the microplate 9 on the stage of the microscope, and the wells. 10, the position of the light detection region is moved, and at the same time, the light detector 16 sequentially converts the detected light into an electric signal and transmits it to the computer 18. In this manner, time-series light intensity data is generated from the transmitted optical signal and stored.
  • the photodetector 16 is an ultra-sensitive photodetector that can detect the arrival of one photon, and therefore when the light detection is based on photon counting, the time-series light intensity data is a time-series data. It may be photon count data.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity may be a predetermined speed that is arbitrarily set, for example, experimentally or so as to suit the purpose of analysis.
  • the size or volume of the region through which the light detection region has passed is required, so that the movement distance can be grasped.
  • the movement of the position of the light detection region is executed at.
  • the movement speed is basically a constant speed.
  • the present invention is not limited to this.
  • the moving speed of the position of the light detection region in order to quantitatively and accurately execute individual detection of luminescent particles from the measured time-series light intensity data, or counting of the number of luminescent particles.
  • the moving speed is preferably set to a value faster than the random movement of the luminescent particles, that is, the moving speed due to the Brownian movement. Since the observation target particle of the optical analysis technique of the present invention is a particle that is dispersed or dissolved in a solution and moves freely and randomly, the position moves with time by Brownian motion. Therefore, when the moving speed of the position of the light detection region is slower than the movement due to the Brownian motion of the particle, the particle moves randomly within the region as schematically illustrated in FIG.
  • the particle crosses the light detection region in a substantially straight line, so that the time-series light intensity data is illustrated in FIG. 4 (B).
  • the light intensity change profile corresponding to each light emitting particle becomes substantially uniform (if the light emitting particle passes through the light detection region substantially linearly, the light intensity change profile is the excitation light intensity distribution).
  • the movement speed of the position of the light detection region is the average movement speed (diffusion movement speed) due to the Brownian motion of the particles so that the correspondence between the individual luminescent particles and the light intensity can be easily identified. Set faster than.
  • the moving speed of the position of the photodetection region may be set to 15 mm / s, which is 10 times or more.
  • the profile of the change in the light intensity by setting the moving speed of the position of the light detection region in various ways is expected (typically, the excitation light intensity distribution).
  • a preliminary experiment for finding a condition that is substantially the same as that described above may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 stores the program stored in the storage device (the predetermined width in the time-series light intensity data).
  • the procedure for calculating the characteristic value of the light intensity representing the presence or absence of light from a single light emitting particle for each time interval of, and the light signal from each light emitting particle based on the light intensity characteristic value for each time interval of a predetermined width The light intensity analysis as described below may be executed by the processing according to the procedure for individually detecting the light intensity.
  • the locus when one luminescent particle passes through the light detection region is substantially linear as shown in FIG.
  • the change in the light intensity corresponding to the luminescent particle is a profile that reflects the light intensity distribution in the light detection region (determined by the optical system), as schematically depicted in FIG.
  • the light intensity characteristic value is calculated for each time interval having a predetermined width on the time-series light intensity data.
  • the characteristic value of the light intensity when the time-series light intensity data is time-series photon count data, as described above, the total value of the number of photons in the time interval of the predetermined width, the median value of the number of photons Particles calculated from the average value of photons, the standard deviation value of the number of photons, the dispersion value of the number of photons, the entropy value of the number of photons, the maximum value of the number of photons, and the autocorrelation function value of the number of photons. It may be a value selected from a group of numbers.
  • the total number of photons is the total number of photons in a predetermined time interval. Since the total value of the time interval in which the light signal of the luminescent particles exists is increased by the number of photons from the luminescent particles than the total value of the other time intervals, the total value of a certain time interval is larger than a predetermined threshold value. Is larger, it is determined that the light signal of the luminescent particles is present in the time interval.
  • the median value and maximum value of the number of photons are the median value and maximum value of the number of photons found in the time interval of the predetermined width, respectively. Since the number of photons is larger during the period when the light of the luminescent particles arrives at the photodetector than when only normal noise occurs, the median and maximum value of the time interval in which the light signal of the luminescent particles is present also increases. To do. Therefore, when the median value or the maximum value of a certain time interval is larger than a predetermined threshold, it is determined that the light signal of the luminescent particles exists in that time interval.
  • the average value of the number of photons is the time average value of the number of photons in a predetermined time interval.
  • the total value of the time interval in which the light signal of the luminescent particles is present is increased by the number of photons from the luminescent particles than the total value of the other time intervals, and thus the number of photons in the time interval of a predetermined width.
  • the time average also increases. Therefore, when the average value in a certain time interval is larger than the predetermined threshold, it is determined that the light signal of the luminescent particles exists in that time interval.
  • the standard deviation value, dispersion value, and entropy value of the number of photons are the standard deviation value, dispersion value, and entropy value of the information amount in the time average of the number of photons in the time interval of the predetermined width, respectively.
  • This is a characteristic value representing the degree of variation in the time change of the number of photons found in the time interval.
  • the standard deviation value, dispersion value, and entropy value of the number of photons in the time interval in which the light signal of the luminescent particles is present increase compared to the values in the other time intervals.
  • the entropy value of the number of photons is the number of times when the number of photons is x in a certain time interval when the probability that the number of photons at a certain time (BIN TIME) is x is px.
  • ix -Log 2 (p0 i0 ⁇ p1 i1 ⁇ px ix ⁇ pn in ) (7) Is the value given by Usually, the probability px that the number of photons is x is p0>p1>p2>...> Px.
  • the entropy value in the interval where only noise exists is about -log 2 (p0 i0 ⁇ p1 i1 ⁇ p2 i2 ), but in the interval where the light signal of the luminescent particles exists, -log 2 (p0 i0 ⁇ p1) i1 , p2 i2 , p3 i3 , p4 i4 ), etc., and the value increases.
  • the number of particles calculated from the autocorrelation function value of the number of photons with zero correlation time in a time interval of a predetermined width is an amount corresponding to the number of particles in that time interval.
  • the autocorrelation function C ( ⁇ ) of light intensity is (Where ⁇ D is the translational diffusion time, AR is the structure parameter, and N is the number of particles).
  • C (0) when the correlation time ⁇ 0, the number N of particles is given by 1 / (C (0) ⁇ 1). Since this number of particles is considered to be the number of particles found for each time interval, and similar to the above characteristic value, when the light signal of the luminescent particles is present in that time interval when it is larger than a predetermined threshold value. Determined.
  • the predetermined width of the time interval is substantially larger than the time width required from the time when one luminescent particle enters the light detection region to the time when it escapes.
  • control solution a plurality of solutions having different concentrations of luminescent particles are prepared, measurement is performed for each, and the calculated average value of Vt is adopted as the total volume Vt of the region through which the light detection region has passed. It may be like this.
  • the volume of the light detection region and the total volume of the region through which the light detection region has passed are given by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method. It's okay.
  • the relationship between the concentration C of various standard luminescent particles and the number N of luminescent particles (formula (9)) regarding the assumed movement pattern of the light detection region. ) May be stored in advance in the storage device of the computer 18 so that the user can use the information stored as appropriate when the user of the device performs optical analysis.
  • the position of the micro area which is the photo detection area in the sample solution is moved, that is, the sample solution is scanned while traversing the photo detection area. It does not include statistical processing such as calculation of fluctuations in fluorescence intensity performed in FCS, FIDA, etc. by the method of detecting luminescent particles individually or counting such luminescent particles. It is possible to detect the state or characteristics of the observation target particles in the sample solution whose particle concentration or number density is lower than the level handled by FCS, FIDA, or the like.
  • the optical analysis technique of the present invention basically uses the same optical system as FCS, FIDA, etc., it may be executed in combination with FCS, FIDA, etc.
  • FCS optical analysis technique
  • the optical analysis technique of the present invention in the case of detecting an interaction between a plurality of types of substances in a solution containing a plurality of types of substances, and when the concentration difference between the substances is large, for example, the concentration of one of the substances is on the order of nM.
  • the other substance is on the order of pM
  • the high concentration substance is measured and analyzed by FCS or FIDA, and the low concentration substance is measured using the optical analysis technique of the present invention.
  • an analysis aspect such as performing an analysis will be performed. In such a case, it is advantageous to prepare a plurality of photodetectors as illustrated in FIG.
  • Fluorescent dye ATTO633 (Signa-Aldrich Cat. No. 18620) was used as the luminescent particles, and the measurable range of the concentration of the luminescent particles in the sample solution according to the present invention was verified.
  • a sample solution a phosphate buffer solution (containing 0.05% Tween 20) was prepared for ATTO 633 so that the concentrations thereof were 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, and 100 pM.
  • a single molecule fluorescence measurement device MF20 (Olympus Corporation) equipped with a confocal fluorescence microscope optical system and a photon counting system is used as the optical analysis device.
  • time-series light intensity data was obtained for each sample solution.
  • the photodetector 16 uses an ultrasensitive photodetector that can detect the arrival of one photon, and light detection is performed sequentially for a predetermined unit time (BIN TIME) over a predetermined time.
  • the photon counting is performed in such a manner that the number of photons arriving at the photodetector is measured. Therefore, the time-series light intensity data is time-series photon count data.
  • the excitation light was 633 nm laser light
  • the detection light wavelength was 660-710 nm using a bandpass filter.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution was 15 mm / second
  • the BIN TIME was 10 ⁇ sec
  • the measurement for 2 seconds was performed three times.
  • FIG. 5A shows an example of the entire time-series photon count data obtained by measurement for 2 seconds
  • FIG. 5B shows one of the time-series photon count data obtained by measurement for 2 seconds. The part is shown enlarged.
  • the detection of the light signal of the luminescent particles in the time series photon count data acquired for each sample solution is performed as shown in FIG. 5B.
  • the entire area of the data is divided into time intervals having a width of 200 ⁇ s, and in each time interval, the total value of the number of photons and the number of photons are obtained as characteristic values of light intensity indicating the presence or absence of light from a single light emitting particle.
  • Photon number, photon number standard deviation value (SD value), photon number dispersion value, photon number entropy value, photon number maximum value, and photon number autocorrelation with zero correlation time The number of particles calculated from the function value was calculated.
  • SD value photon number standard deviation value
  • photon number dispersion value photon number dispersion value
  • photon number entropy value photon number maximum value
  • photon number autocorrelation with zero correlation time The number of particles calculated from the function value was calculated.
  • the example characteristic values are The value was larger than the characteristic value of the section (Window # 31) in which it can be determined that the light signal of the luminescent particles does not exist.
  • each of the above characteristic values exceeds the corresponding predetermined threshold value for one luminescent particle.
  • the number of time intervals exceeding a predetermined threshold was counted for each characteristic value.
  • FIG. 6 shows the number of time intervals in which each characteristic value exceeds a predetermined threshold value for each solution.
  • the threshold value of each characteristic value was as follows.
  • the time-series photon count data includes the number of consecutive time regions in which the number of photons exceeds 2. (The number of binarized areas).
  • FIG. 7 shows the number of detected luminescent particles (characteristic value) when the width of the time interval for calculating the characteristic value (total number of photons) is changed in the time-series photon count data of the sample solution having a luminescent particle concentration of 10 pM. Indicates the number of time intervals exceeding a predetermined threshold).
  • the time interval width is 100 to 200 ⁇ s
  • the number of detected luminescent particles is stable.
  • the time interval width was less than 100 ⁇ sec, the number of detected particles increased apparently.
  • the time required for a single luminescent particle to linearly pass through the light detection region is calculated to be about 74 ⁇ sec. It is considered that the number of times that one luminescent particle is detected over two or more time intervals is reduced by making it longer than the time required for linearly passing through the detection region. In the above results, when the time interval width exceeded 200 ⁇ sec, the number of detected particles was apparently reduced. This is considered to be because when the time interval width is increased, the number of time intervals in which optical signals of a plurality of luminescent particles are present increases.
  • the upper limit ⁇ high of the predetermined width of the time interval calculated with the allowable error of about 5% using the equation (2d) was about 200 ⁇ sec (light detection region)
  • the radius Wo was set to 1 ⁇ m.
  • the optical analysis technique of the present invention it is possible to determine the number density or concentration of the luminescent particles up to a concentration range lower than the number density or concentration limit that can be measured by the method using the conventional fluorescence intensity. It was shown that.
  • the lower limit of the particle concentration that can be measured by optical analysis techniques such as FCS, FIDA, and PCH including statistical processing such as calculation of fluctuations in fluorescence intensity was about 1 nM, whereas the measurement of this example.
  • the lower limit of the possible particle concentration is ⁇ 10 fM. Therefore, according to the present invention, it is shown that it is possible to measure particles in a concentration range that is significantly lower than in the case of optical analysis techniques such as FCS, FIDA, and PCH. It was done.

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Abstract

　観測対象粒子の濃度又は数密度が低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な光分析技術が提供される。本発明の光分析技術は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、微小領域の試料溶液内に於ける位置を移動しながら（微小領域により試料溶液内を走査しながら）、観測対象粒子である発光粒子からの光を検出して時系列の光強度データを生成し、光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、特性値を用いて発光粒子の各々からの光信号を個別に検出し、発光粒子のカウンティングや発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。

Description

光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
　本発明は、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）からの光を検出して、溶液中の粒子の状態を分析又は解析するための光分析装置、光分析方法並びにそのためのコンピュータプログラムに係り、より詳細には、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、種々の粒子、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子の状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラムに係る。
　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、非特許文献１－３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域－コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が達成される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity　Distribution　Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon　Counting　Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献４）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。更に、特許文献５、６に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献７は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。
　特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
特開２００５－０９８８７６ 特開２００８－２９２３７１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８－０８０４１７ 特開２００７－２０５６５ 特開２００８－１１６４４０ 特開平４－３３７４４６号公報
金城政孝、蛋白質　核酸　酵素　Vol.４４、No.９、１４３１－１４３８頁　１９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４－２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１－２７７頁
　上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術に於いて有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい（典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であることが好ましい。）。換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るときには（例えば、１ｎＭを大幅に下回るときには）、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入してこない状態が発生し、蛍光強度の計測結果に於いて、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれると共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなるので、上記の如き蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を望むことができなくなる。
　特許文献５、６に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の如き蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、数秒間に亘る計測時間に於ける有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中に於ける観測対象となる蛍光分子等の有無が特定でき、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られることが開示されている。特に、特許文献６では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法に於いても、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することに留まっており、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することができず、例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７に記載された技術は、フローサイトメータに於けるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出するものであり、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではないので、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７の技術は、フローサイトメータに於ける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含むため、検査に必要な試料量は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなるとともに、実施者に於いて複雑で高度な操作技術が要求されると考えられる。
　かくして、本発明の一つの課題は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術にて実行されている如き、統計的処理を含まず、従って、観測対象粒子の濃度又は数密度がそれらの光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な新規な光分析技術を提供することである。
　また、本発明のもう一つの課題は、上記の如き新規な光分析技術を実現する光分析装置、方法又はそのためのコンピュータプログラムであって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術と同様に測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、観測対象粒子の濃度又は数密度等の特性を定量的に特定することが可能な光分析装置、光分析方法又は光分析用コンピュータプログラムを提供することである。
　概して述べれば、本発明に於いては、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）からの光を検出する光分析技術であって、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域の位置を移動させながら、即ち、微小領域により試料溶液内を走査しながら、微小領域からの光を検出し、これにより、微小領域内を横切る発光粒子を個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする新規な方式の光分析技術が提案される。
　本発明によれば、一つの態様として、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、試料溶液内に於ける前記の光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光信号を個別に検出する信号処理部とを含み、信号処理部が、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、かかる特性値を用いて発光粒子の各々からの光信号を個別に検出することを特徴とする装置が提供される。かかる構成に於いて、「試料溶液中に分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の物であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。なお、本明細書に於いて、「光信号」という場合には、「光を表す信号」を意味している。
　上記から理解される如く、本発明の装置の基本的な構成に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が光検出部にて検出されるので、その光を捉えることにより、一つの発光粒子の存在が検出できることとなる。この点に関し、より詳細には、光検出部から時系列に出力される信号、即ち、光強度データに於いて、単一の発光粒子からの光が光検出部に到来している時間区間に於いて、光検出部の出力信号の値は、パルス状にて変化し、ノイズのみが生ずる発光粒子からの光が到来していない時間区間とは異なる特徴を有する。そこで、装置の信号処理部は、逐次的に光検出部により検出される信号から時系列の光強度データを生成し、かかる時系列の光強度データに於いて、所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、その特性値を用いて発光粒子の各々からの光信号を個別に検出するよう構成される。
　かかる特性値としては、単一の発光粒子からの光が存在している所定幅の時間区間に於けるその大きさが、単一の発光粒子からの光が存在していない所定幅の時間区間に於ける大きさよりも大きくなる任意の値が採用可能である。その場合、光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに所定幅の時間区間に発光粒子からの光信号が存在すると判定される。そのような特性値は、例えば、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び光強度の自己相関関数の相関時間を０としたときの値から算定される粒子数のうちのいずれかであってよい。なお、典型的には、光検出部は、フォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、従って、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。従って、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。
　また、上記の如く所定幅の時間区間毎の特性値を用いて発光粒子の信号を検出する手法の場合、所定幅が一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも短い場合には、一つの発光粒子の光が二つの以上の時間区間に亘って検出されることとなり、所定幅が複数の発光粒子の光の到来時間を包含するほど長い場合には、一つの時間区間に於いて、複数の発光粒子の情報が含まれることとなり、いずれも場合も、一つの時間区間に対して一つの発光粒子が対応する関係が成立しなくなるため、発光粒子の各々からの光信号を個別に検出するための信号処理が煩雑となる。そこで、上記の特性値を算出する時間区間の所定幅は、好適には、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定され、且つ、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定される。換言すれば、時間区間の所定幅は、その下限が、一つの発光粒子の光信号の時間幅よりも実質的に長くなるように設定され、その上限が各時間区間に包含される発光粒子数が実質的に１個以下となるように設定される。なお、上記の表現に於いて、「実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定」或いは「一つの発光粒子の光信号の時間幅よりも実質的に長くなるよう設定」とは、所定幅が、殆どの発光粒子の光信号の時間幅よりも長く設定すること、即ち、誤差の範囲で所定幅よりも長い時間幅を有する発光粒子の光信号の存在が許されることを意味している。また、「実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定」或いは「各時間区間に包含される発光粒子数が実質的に１個以下となるように設定」とは、殆どの時間区間に於いて見出される発光粒子数が１個以下となるよう設定すること、即ち、誤差の範囲で２個以上の発光粒子を包含する時間区間の存在が許されることを意味している。かかる構成によれば、発光粒子からの光が存在している一つの時間区間が決定された際、殆どの場合、その時間区間に含まれる光信号は、一つの発光粒子からの光信号であると判断でき、これにより、一つの発光粒子の存在が確認されることとなるので、発光粒子を個別に検出する処理が簡単となり、有利である。
　上記の如く、試料溶液中にてランダムに運動している発光粒子が個別に検出可能となると、発光粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。具体的には、例えば、上記の本発明の装置に於いて、信号処理部が、個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（発光粒子のカウンティング）。その場合、上記の如く、所定幅の時間区間毎の光強度の特性値を用いて発光粒子を個別に検出する場合には、発光粒子からの光信号を有する所定幅の時間区間の数が発光粒子の数に対応するので、発光粒子からの光信号を有する所定幅の時間区間の数を計数して、光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数が計数される。かかる構成によれば、発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量とを組み合わせることにより、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。
　また、上記の本発明の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。当業者に於いて理解される如く、発光粒子から検出される光の態様は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、一つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、一つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。
　更に、本発明の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、光検出領域が発光粒子の存在位置を通過したときにその発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（発光粒子の存在を表す）光信号が検出されてしまい、検出された光信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を一つの（発光粒子の存在を表す）光信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。
　光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、光検出領域を固定して、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける位置を移動するようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　上記の本発明の装置に於いて試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、個々の発光粒子からの光信号を個別に検出するという特徴的な光分析技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於ける前記の光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出する手順と、所定幅の時間区間毎の光強度の特性値に基づいて個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順とをコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。
　かかるコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して又は発光粒子からの光信号を有する所定幅の時間区間の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順に於いて、光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、その場合、時系列の光強度データは時系列のフォトンカウントデータとなる。また、光検出領域の位置を移動する手順に於いて、光検出領域の位置が所定の速度にて或いは発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるようになっていてよく、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、所定幅の時間区間に於ける光強度の特性値は、単一の発光粒子からの光が存在している場合には、単一の発光粒子からの光が存在していない場合よりも大きくなる値であってよく、光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに所定幅の時間区間に発光粒子からの光信号が存在すると判定されてよい。そのような特性値は、具体的には、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び相関時間を０とした光強度の自己相関関数値から算定される粒子数のうちのいずれかが採用されてよい。特に、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであるときには、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。更に、上記の時間区間の所定幅は、好適には、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定され、且つ、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定される。
　更に、上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、上記の如く、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行って個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する新規な光分析方法が実現される。従って、本発明の共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法は、試料溶液内に於ける前記の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出する過程と、所定幅の時間区間毎の光強度の特性値に基づいて個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する過程とを含むことを特徴とする。
　かかる方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して又は発光粒子からの光信号を有する所定幅の時間区間の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程に於いて、光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、その場合、時系列の光強度データは時系列のフォトンカウントデータとなる。また、光検出領域の位置を移動する過程に於いて、光検出領域の位置が所定の速度にて或いは発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるようになっていてよく、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　更に、上記の方法に於いても、所定幅の時間区間に於ける光強度の特性値は、単一の発光粒子からの光が存在している場合には、単一の発光粒子からの光が存在していない場合よりも大きくなる値であってよく、光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに所定幅の時間区間に発光粒子からの光信号が存在すると判定されてよい。そのような特性値は、具体的には、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び相関時間を０とした光強度の自己相関関数値から算定される粒子数のうちのいずれかが採用されてよい。特に、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであるときには、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。更に、上記の時間区間の所定幅は、好適には、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定され、且つ、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から別の発光粒子の前記光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定される。
　上記の本発明による装置、方法又はコンピュータプログラムにより実現される光分析技術は、その光検出機構自体については、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、本発明に於いては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、本発明の光分析技術は、発光粒子の数密度又は濃度がＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。
　また、本発明では、溶液中に分散又は溶解した発光粒子の各々を個別に検出するようになっているので、その情報を用いて、定量的に、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度若しくは数密度の算定又は濃度若しくは数密度に関する情報の取得が可能となる。例えば、特許文献５，６に記載の技術では、所定時間内に於ける所定の閾値以上の強度を有する蛍光信号の頻度の集計値と試料溶液中の蛍光分子等の粒子数との相関を得ることが可能であるが、計測領域を通過する粒子の動的な振る舞い（粒子が計測領域を真直ぐ通過したのか、粒子が計測領域内に滞留していたのか）を把握することはできず、従って、所定の閾値以上の強度を有する蛍光信号と計測領域を通過する粒子との対応が不明確であったため、発光粒子のカウンティングは原理的に不可能であり、試料溶液中の粒子の濃度を精度よく決定することが困難であった。しかしながら、本発明によれば、光検出領域を通過する発光粒子と、その光信号の光検出部への到来の時間とを１対１に対応させて発光粒子を一つずつ検出するので、溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子のカウンティングが可能となり、従前に比して、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。
　本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
　本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
図１（Ａ）は、本発明による光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明による光分析技術による光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、光強度データから発光粒子からの光を個別に検出する原理を説明する図である。図２（Ｄ）は、時間区間の所定幅と二つ以上の発光粒子の光が同時に進入している確率（複数の発光粒子が一つの所定幅ωの時間区間に包含される割合）との関係を示している。 図３（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図と、その場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図と、その場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 図５（Ａ）は、本発明の光分析技術により計測された時系列フォトンカウントデータの全体を表す図であり、図５（Ｂ）は、時系列フォトンカウントデータの一部の区間を拡大した図であり、参照している区間について算出された種々の特性値を示している。 図６は、発光粒子濃度が１０ｆＭ～１００ｐＭのそれぞれの溶液について、本発明に従って算出された特性値を用いて、時系列フォトンカウントデータに於いて個別に検出された発光粒子数を示している。 図７は、本発明に従った光分析技術による時系列フォトンカウントデータに於ける時間区間の所定幅と発光粒子の存在が検出された区間の数との関係を表す図である。 図８は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
　以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
光分析装置の構成
　本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。
　更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するステージ位置変更装置１７ａが採用されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。
　観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
本発明の光分析技術の原理
　ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、図８（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図８（Ｂ）に描かれているように、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
　そこで、本発明に於いては、観測対象粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく光分析技術が提案される。
　本発明の光分析技術に於いて、実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａ）を駆動して、図２にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図２（Ａ）の如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ～ｔ２）に於いて一つの発光粒子（図中、蛍光色素）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２（Ｂ）に描かれている如く、パルス状の信号として、有意な光強度（Ｅｍ）が検出されることとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如き有意な光強度、即ち、パルス状の信号を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる本発明の光分析技術の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、発光粒子（観測対象粒子）の濃度が低い試料溶液でも、発光粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能であることは理解されるべきである。
　なお、実際の光強度データ（フォトンカウントデータ）に於いては、図２（Ｃ）にて例示されている如く、発光粒子からの光の他に、ノイズ（光検出器の熱ノイズ、背景光）が存在するので、発光粒子からの光信号とノイズとを区別して、発光粒子からの光信号の存在を検出する必要がある。そこで、そのような発光粒子からの光信号の存在を抽出する手法の一つとして、本実施形態に於いては、時系列光強度データ上に於いて、所定幅の時間区間毎に、逐次的に、時間区間内の光強度値（光子数）を用いて単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値が算出される。かかる光強度の特性値の大きさを参照すると、所定幅の時間区間毎に、単一の発光粒子からの光信号が存在しているか否かが検出できるので、これにより、発光粒子が一つずつ検出される。単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値は、典型的には、単一の発光粒子からの光の信号が存在すると、単一の発光粒子からの光の信号が存在していない場合（ノイズのみしか存在していない場合）に比して、増大する任意の値であってよく、例えば、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差値（ＳＤ値）、光強度の分散値、光強度のエントロピー（ＥＰ値）、光強度の最大値及び相関時間を０とした光強度の自己相関関数値から算定される粒子数などであってよい。特に、本実施形態では、光強度データは、フォトンカウンティングによるフォトンカウントデータなので、特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差値、光子数の分散値、光子数のエントロピー値、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。
　また、上記の特性値の算出のための時間区間の所定幅は、好適には、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長く、且つ、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも短く設定される。このように所定幅を設定すると、発光粒子の光信号の存在する一つの時間区間が、一つの発光粒子の存在に対応する、即ち、時間区間と発光粒子の存在が一対一の関係となるので、発光粒子のカウンティングに於ける処理が簡単となり有利である。（もし時間区間の所定幅が一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも短い場合には、一つの発光粒子の光信号が複数の時間区間に亘って存在することになり、複数の時間区間を一つの発光粒子に対応させるための処理が必要となる。また、もし時間区間の所定幅が一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも長い場合には、一つの時間区間に複数の発光粒子の光信号が存在することとなり、発光粒子を一つずつ検出することが困難となる。）
　上記の所定幅の下限ωlowは、発光粒子が光検出領域の中心を直線的に通過すると仮定した場合（下記の（１）試料溶液の光強度の測定及び図４参照）、例えば、光検出領域の直径２Ｗｏと移動速度ｕとを用いて、
　　ωlow＝２Ｗｏ／ｕ　　　…（１）
設定されてよい。
　所定幅の上限ωhighは、各時間区間に於いて包含される発光粒子数が実質的に１以下となる所定幅である。所定幅の上限ωhighは、下記のいずれかの手法により決定可能である。
（１）発光粒子が試料溶液内に均等に分散していると仮定した場合
　所定幅ωの時間区間に於ける光検出領域の移動の間に検出される発光粒子数ｎは、
　　ｎ＝ｃＮＡＳｕω　　　…（２ａ）
により与えられる。ここで、ｃは、発光粒子のモル濃度であり、ＮＡは、アボガドロ数であり、Ｓは、光検出領域の断面積である。Ｓ～πＷｏ２と近似して、所定幅ωの時間区間に於いて一つの発光粒子が存在する（ｎ＝１）と仮定すると、所定幅ωは、
　　ω＝１／（ｃＮＡπＷｏ２ｕ）　　　…（２ｂ）
により与えられる。従って、所定幅ωhighは、予想される発光粒子の濃度ｃを用いて、式（２ｂ）にて算出される値ωか、発光粒子の存在位置のばらつきを考慮して、それよりも小さい値に設定されてよい。
（２）所定幅の時間区間に発光粒子がポアソン分布にて進入すると仮定した場合
　所定幅ωの時間区間に於ける光検出領域の移動の間に検出される平均の発光粒子数ｎは、上記の式（２ａ）にて与えられる。一方、所定幅ωの時間区間に出現する発光粒子数がｋである確率ｐｋは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 となるので、所定幅ωの時間区間に出現する発光粒子数が２以上である確率ｐ＞１、即ち、複数の発光粒子が一つの所定幅ωの時間区間に包含される割合は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 となる。図２（Ｄ）は、所定幅ωに対する式（２ｄ）の変化の例を表した図である（ｃ＝１０ｐＭ、ｕ＝１５ｍｍ／ｓ、Ｗｏ＝１μｍとして算出した。）。同図を参照して、図示の例では、所定幅ω＝２００μ秒とすると、５％の時間区間が複数の発光粒子を包含する可能性があることが理解される。かくして、所定幅ωhighは、予想される発光粒子の濃度ｃを用いて、上記の式（２ｄ）に於いて、許容誤差を与える所定幅ωに設定されてよい。
本発明の光分析装置の作動と処理操作過程
　図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明による光分析に於いては、具体的には、（１）発光粒子（観測対象粒子）を含む試料溶液の光強度の測定処理過程と、（２）測定された光強度の分析処理過程とが実行される。
（１）試料溶液の光強度の測定
　本発明の光分析技術の観測対象物となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。
　本発明の光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図３（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度が図３（Ｂ）の如くランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ａ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図４（Ｂ）に例示の如く、個々の発光粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（発光粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
　　（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ　　　…（４）
から、
　　Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ　　　…（５）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
　　Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　　…（６）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
（２）光強度の分析
　上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラム（時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出する手順、所定幅の時間区間毎の光強度の特性値に基づいて個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順）に従った処理により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。
（ｉ）一つの発光粒子の検出
　時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ａ）に示されている如く略直線状である場合、その発光粒子に対応する光強度の変化は、図４（Ｂ）に模式的に描かれている如く、（光学系により決定される）光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル（通常、略釣鐘状）を有し、発光粒子が通過していない期間のデータ（ノイズがランダムに発生する状態）とは顕著に異なる。そこで、既に触れた如く、本実施形態に於いては、時系列の光強度データ上に於ける所定幅の時間区間毎に光強度の特性値が算出される。光強度の特性値としては、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータである場合には、上記の如く、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差値、光子数の分散値、光子数のエントロピー値、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。
　各特性値について、より詳細には、光子数の合計値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値である。発光粒子の光信号が存在する時間区間の合計値は、その他の時間区間の合計値よりも発光粒子からの光子数だけ増大するので、或る時間区間の合計値の大きさが所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の光信号が存在すると判定される。
　光子数の中央値、最大値は、それぞれ、所定幅の時間区間に見出される光子数の中央値、最大値である。発光粒子の光が光検出器に到来している期間は、通常のノイズのみが発生する場合より光子数が大きくなるので、発光粒子の光信号が存在する時間区間の中央値、最大値も増大する。従って、或る時間区間の中央値又は最大値の大きさが所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の光信号が存在すると判定される。
　光子数の平均値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の時間平均値である。上記の如く、発光粒子の光信号が存在する時間区間の合計値は、その他の時間区間の合計値よりも発光粒子からの光子数だけ増大するので、所定幅の時間区間に於ける光子数の時間平均値も増大する。従って、或る時間区間の平均値の大きさが所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の光信号が存在すると判定される。
　光子数の標準偏差値、分散値及びエントロピー値は、それぞれ、所定幅の時間区間に於ける光子数の時間平均に於ける標準偏差値、分散値及び情報量のエントロピー値であり、所定幅の時間区間内に見出される光子数の時間変化のばらつきの程度を表す特性値である。或る時間区間に発光粒子の光信号が存在する場合、その他の時間区間に比して、光子数の時間変化が激しくなる。従って、発光粒子の光信号が存在する時間区間の光子数の標準偏差値、分散値、エントロピー値は、その他の時間区間の各値に比して増大するので、或る時間区間の各値が、所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の光信号が存在すると判定される。なお、光子数のエントロピー値は、或る時点（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）に於ける光子数がｘ個である確率がpｘであったとき、或る時間区間に於いて光子数がｘ個の時点の数ixを用いて、
　　－ｌｏｇ２（p0i0・p1i1・…・pxix・…・pnin）　　　…（７）
により与えられる値である。通常、光子数がｘ個である確率pｘは、p0＞p1＞p2＞…＞px…＞pnである。ノイズのみしか存在していない区間のエントロピー値は、－ｌｏｇ２（p0i0・p1i1・p2i2）程度であるが、発光粒子の光信号が存在する区間では、－ｌｏｇ２（p0i0・p1i1・p2i2・p3i3・p4i4）などとなり、値が増大する。
　所定幅の時間区間に於ける相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数とは、その時間区間に於ける粒子数に相当する量である。ＦＣＳの理論によれば、光強度の自己相関関数Ｃ（τ）は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 により与えられる（ここで、τＤは、並進拡散時間であり、ＡＲは、ストラクチャ・パラメータであり、Ｎは、粒子数である。）。上記の式に於いて、相関時間τ＝０のときのＣ（０）から、粒子数Ｎは、１／（Ｃ（０）－１）により与えられる。この粒子数は、時間区間毎に見出される粒子数であると考えられるので、上記の特性値と同様に、所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の光信号が存在すると判定される。
（ii）発光粒子のカウンティング
　上記の発光粒子の検出処理に於いて、時間区間の所定幅が、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長く、且つ、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも短く設定されている場合、一つの発光粒子は、発光粒子の光信号が存在すると判定された一つの時間区間に対応するので、かかる時間区間の数を計数することにより、発光粒子の数が決定される。
（iii）発光粒子の数密度又は濃度の決定
　発光粒子のカウンティングが為されると、光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、発光粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは困難である。そこで、本実施形態に於いては、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された発光粒子の数と対照溶液の発光粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、発光粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。対照溶液の発光粒子としては、好ましくは、観測対象粒子と同様の波長特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
　　　Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　　…（９）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の数密度ｃは、
　　　ｃ＝ｎ／Ｖｔ　　　…（１０）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（９））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
　かくして、上記の本発明の光分析技術によれば、試料溶液内に於いて光検出領域である微小領域の位置を移動させながら、即ち、試料溶液内を走査しながら、光検出領域内を横切る発光粒子を個別に検出し、或いは、かかる発光粒子のカウンティングを行うという手法によって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等に於いて実行される蛍光強度のゆらぎの演算等の統計的処理を含まず、従って、観測対象粒子の濃度又は数密度がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能となる。
　なお、本発明の光分析技術は、基本的には、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様の光学系を使用するので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と組み合わせて実行されてもよい。例えば、複数種の物質を含む溶液中に於いて複数種の物質の間の相互作用等検出する場合などであって、物質の濃度差が大きいとき、例えば、一方の物質の濃度がｎＭオーダーであり、他方の物質がｐＭオーダーであるときなどに於いて、濃度の高い物質については、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにより測定及び分析を行い、濃度の低い物質については、本発明の光分析技術を用いて測定及び分析を行うといった分析態様が実行されるであろう。そのような場合、図１（Ａ）に例示されている如く、複数個の光検出器を準備しておくと有利である。
　上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
　発光粒子として、蛍光色素であるＡＴＴＯ６３３（シグマ－アルドリッチ社(Signma-Aldrich)　Cat.No.　１８６２０）を用い、本発明による試料溶液中の発光粒子の濃度の測定可能範囲を検証した。試料溶液としては、ＡＴＴＯ６３３を、その濃度が１０ｆＭ、１００ｆＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭとなるようにリン酸緩衝液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む）をそれぞれ調製した。
　本発明の光分析技術による計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（１）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の各試料溶液について、時系列の光強度データを取得した。対物レンズには、水浸対物レンズ（４０倍、ＮＡ＝１．１５、ＷＤ＝０．２６）を用いた。なお、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器を用い、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングとした。従って、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用い、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて６６０－７１０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを１０μ秒とし、２秒間の測定を３回行った。
　図５（Ａ）は、２秒間の測定により得られた時系列フォトンカウントデータの全体の例を示しており、図５（Ｂ）は、２秒間の測定による時系列フォトンカウントデータのうちの一部を拡大して示している。上記の光強度の測定後、各試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータに於ける発光粒子の光信号の検出は、図５（Ｂ）に例示されている如く、時系列のフォトンカウントデータの全域を２００μ秒の幅を有する時間区間に区分し、各時間区間に於いて、単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値として、光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差値（ＳＤ値）、光子数の分散値、光子数のエントロピー値、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数を算定した。その結果、例えば、図５（Ｂ）にて示されている如く、目視にて発光粒子の光信号が存在すると判断できる区間（Ｗｉｎｄｏｗ＃３０、Ｗｉｎｄｏｗ＃３２）に於いて、例示の特性値は、発光粒子の光信号が存在していないと判断できる区間（Ｗｉｎｄｏｗ＃３１）の特性値よりも大きな値であった。
　かくして、時系列のフォトンカウントデータの全域に於ける時間区間毎に光強度の特性値を算出した後、上記の各特性値が、対応する所定の閾値を超えた時間区間に一つの発光粒子の光信号が存在するとの仮定の下、特性値の各々について、所定の閾値を超えた時間区間の数を計数した。図６は、上記の各溶液について、各特性値の所定の閾値を超えた時間区間の数を表している。それぞれの特性値の閾値は、以下の通りとした。
　　光子数合計値　　　　　　　　　　　１００個
　　光子数中央値　　　　　　　　　　　４．５個
　　光子数標準偏差値　　　　　　　　　３．５個
　　光子数分散値　　　　　　　　　　１２．５個
　　光子数エントロピー　　　　　　　　　１０５
　　光子数最大値　　　　　　　　　　　　１３個
　　粒子数（自己相関関数値から算定）　０．４個
なお、比較のため、時系列フォトンカウントデータに於いて、光子数が２を超える連続した時間領域の数が併記されている（二値化領域数）。
　図６を参照して、例示の特性値は、いずれも、試料溶液中の発光粒子濃度の増大と共に増大した。ただし、相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数については、発光粒子濃度が１ｐＭ未満では、顕著な変化は見られなかった。一方、二値化領域数については、測定に使用した試料溶液では、顕著な濃度依存性は得られなかった。かくして、上記の結果は、本発明に従って、光の計測を行って得られた時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、かかる特性値を参照することによって、発光粒子からの光が個別に検出され、その濃度が決定できることを示唆している。
　更に、上記の時系列フォトンカウントデータに於いて、特性値を算出する時間区間の幅による発光粒子の検出数の影響を検証した。図７は、発光粒子濃度が１０ｐＭの試料溶液の時系列フォトンカウントデータに於いて、特性値（光子数合計値）を算出する時間区間の幅を変更した場合の発光粒子の検出数（特性値が所定の閾値を超えた時間区間の数）を示している。同図を参照して、時間区間幅が１００～２００μ秒であるときに、発光粒子の検出数は、安定した。一方、時間区間幅が１００μ秒を下回ると、粒子の検出数は、みかけ上増大した。本実験例の測定の条件では、単一の発光粒子が光検出領域を直線的に通過する際の所要時間は、約７４μ秒と算定されるので、時間区間幅を単一の発光粒子が光検出領域を直線的に通過する際の所要時間よりも長くすることにより、一つの発光粒子が二つ以上の時間区間に亘って検出される回数が低減されたと考えられる。また、上記の結果に於いて、時間区間幅が２００μ秒を上回ると、粒子の検出数は、みかけ上低減した。これは、時間区間幅を長くすると、複数の発光粒子の光信号が存在する時間区間の数が増えるためであると考えられる。実際、上記の溶液条件及び装置条件に於いて、式（２ｄ）を用いて許容誤差を約５％として算定される時間区間の所定幅の上限ωhighは、約２００μ秒であった（光検出領域の半径Ｗｏ～１μｍに設定した。）。これらの結果は、時間区間の幅を、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長く、且つ、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも短く設定することにより、一つの時間区間に一つの発光粒子を対応させることができることを示唆している。
　かくして、本発明の光分析技術によれば、従前の蛍光強度を利用した方法に於いて計測可能であった数密度又は濃度限界よりも低い濃度範囲まで、発光粒子の数密度又は濃度を決定可能であることが示された。更に、蛍光強度のゆらぎの算出などの統計的処理を含むＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術に於いて計測可能な粒子濃度の下限が１ｎＭ程度であったのに対し、本実施例の計測可能な粒子濃度の下限は、～１０ｆＭであり、従って、本発明によれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術の場合よりも大幅に低い濃度域の粒子について計測可能であることが示された。

Claims (24)

  1. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
    　前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
    　前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、前記特性値を用いて前記発光粒子の各々からの光信号を個別に検出することを特徴とする装置。
  2. 　請求項１の装置であって、前記信号処理部が、前記発光粒子からの光信号を有する前記所定幅の時間区間の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数することを特徴とする装置。
  3. 　請求項１又は２の装置であって、前記光検出部がフォトンカウンティングにより前記光検出領域からの光を検出し、前記時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであることを特徴とする装置。
  4. 　請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
  5. 　請求項１乃至４のいずれかの装置であって、前記単一の発光粒子からの光が存在している前記所定幅の時間区間に於ける前記光強度の特性値が前記単一の発光粒子からの光が存在していない前記所定幅の時間区間に於ける前記光強度の特性値よりも大きく、前記光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに前記所定幅の時間区間に前記発光粒子からの光信号が存在すると判定されることを特徴とする装置。
  6. 　請求項３の装置であって、前記光強度の特性値が、前記所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であることを特徴とする装置。
  7. 　請求項１乃至６のいずれかの装置であって、前記所定幅が、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定され、且つ、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から別の発光粒子の前記光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定されることを特徴とする装置。
  8. 　請求項１乃至７のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
  9. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
    　前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、
    　前記時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出する過程と、
    　前記所定幅の時間区間毎の光強度の特性値に基づいて個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する過程と
    を含むことを特徴とする方法。
  10. 　請求項９の方法であって、更に、前記発光粒子からの光信号を有する前記所定幅の時間区間の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
  11. 　請求項９又は１０の方法であって、前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程に於いて、前記光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、前記時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであることを特徴とする方法。
  12. 　請求項９乃至１１のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
  13. 　請求項９乃至１２のいずれかの方法であって、前記単一の発光粒子からの光が存在している前記所定幅の時間区間に於ける前記光強度の特性値が前記単一の発光粒子からの光が存在していない前記所定幅の時間区間に於ける前記光強度の特性値よりも大きく、前記光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに前記所定幅の時間区間に前記発光粒子からの光信号が存在すると判定されることを特徴とする方法。
  14. 　請求項１１の方法であって、前記光強度の特性値が、前記所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であることを特徴とする方法。
  15. 　請求項９乃至１４のいずれかの方法であって、前記所定幅が、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定され、且つ、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から別の発光粒子の前記光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定されることを特徴とする方法。
  16. 　請求項９乃至１５のいずれかの方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
  17. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
    　前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置の移動中に前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
    　前記時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出する手順と、
    　前記所定幅の時間区間毎の光強度の特性値に基づいて個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順と
    をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
  18. 　請求項１７のコンピュータプログラムであって、更に、前記発光粒子からの光信号を有する前記所定幅の時間区間の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
  19. 　請求項１７又は１８のコンピュータプログラムであって、前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順に於いて、前記光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、前記時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであることを特徴とするコンピュータプログラム。
  20. 　請求項１７乃至１９のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  21. 　請求項１７乃至２０のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記単一の発光粒子からの光が存在している前記所定幅の時間区間に於ける前記光強度の特性値が前記単一の発光粒子からの光が存在していない前記所定幅の時間区間に於ける前記光強度の特性値よりも大きく、前記光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに前記所定幅の時間区間に前記発光粒子からの光信号が存在すると判定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  22. 　請求項１９のコンピュータプログラムであって、前記光強度の特性値が、前記所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であることを特徴とするコンピュータプログラム。
  23. 　請求項１７乃至２２のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記所定幅が、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定され、且つ、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から別の発光粒子の前記光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定されることを特徴とする方法。
  24. 　請求項１７乃至２３のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
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Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012032955A1 (ja) * 2010-09-10 2012-03-15 オリンパス株式会社 複数の波長帯域の光計測を用いた光分析方法
WO2012039352A1 (ja) * 2010-09-21 2012-03-29 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析方法
WO2012053355A1 (ja) * 2010-10-19 2012-04-26 オリンパス株式会社 単一発光粒子の偏光特性を観測する光分析装置、光分析方法及びそのための光分析用コンピュータプログラム
WO2012070414A1 (ja) * 2010-11-25 2012-05-31 オリンパス株式会社 単一発光粒子の光の波長特性を用いた光分析装置及び光分析方法
WO2013069504A1 (ja) 2011-11-10 2013-05-16 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
WO2013121905A1 (ja) 2012-02-17 2013-08-22 オリンパス株式会社 単一粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
WO2013125124A1 (ja) 2012-02-22 2013-08-29 オリンパス株式会社 標的粒子の検出方法
WO2013140890A1 (ja) 2012-03-21 2013-09-26 オリンパス株式会社 標的核酸分子の検出方法
WO2013157319A1 (ja) 2012-04-18 2013-10-24 オリンパス株式会社 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム
WO2013157283A1 (ja) 2012-04-18 2013-10-24 オリンパス株式会社 標的粒子の検出方法
WO2014020967A1 (ja) 2012-08-02 2014-02-06 オリンパス株式会社 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
WO2014064971A1 (ja) 2012-10-25 2014-05-01 オリンパス株式会社 標的粒子の検出方法
US8785886B2 (en) 2010-09-10 2014-07-22 Olympus Corporation Optical analysis method using the light intensity of a single light-emitting particle
US8900812B2 (en) 2011-01-26 2014-12-02 Olympus Corporation Method for identifying polymorphism of nucleic acid molecules
US8911944B2 (en) 2011-01-26 2014-12-16 Olympus Corporation Method for identifying polymorphism of nucleic acid molecules
WO2015015951A1 (ja) 2013-07-31 2015-02-05 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出技術を用いた光学顕微鏡装置、顕微鏡観察法及び顕微鏡観察のためのコンピュータプログラム
WO2015052965A1 (ja) 2013-10-07 2015-04-16 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
US9068944B2 (en) 2011-04-13 2015-06-30 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection
US9354176B2 (en) 2011-08-11 2016-05-31 Olympus Corporation Method for detecting a target particle
US9435727B2 (en) 2011-03-29 2016-09-06 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection
US9488578B2 (en) 2011-08-26 2016-11-08 Olympus Corporation Single particle detection device, single particle detection method, and computer program for single particle detection, using optical analysis
JP2016197111A (ja) * 2016-06-14 2016-11-24 ソニー株式会社 微小粒子測定装置
US9528923B2 (en) 2011-08-30 2016-12-27 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection
US9841418B2 (en) 2011-08-30 2017-12-12 Olympus Corporation Method for detecting target particle
US10371631B2 (en) 2011-08-26 2019-08-06 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection
US11016026B2 (en) 2015-12-09 2021-05-25 Olympus Corporation Optical analysis method and optical analysis device using single light-emitting particle detection

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8218836B2 (en) * 2005-09-12 2012-07-10 Rutgers, The State University Of New Jersey System and methods for generating three-dimensional images from two-dimensional bioluminescence images and visualizing tumor shapes and locations
US8798338B2 (en) * 2006-01-09 2014-08-05 University Of Wyoming Method and system for counting particles in a laminar flow with an imaging device
WO2011108371A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 オリンパス株式会社 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
WO2012014778A1 (ja) * 2010-07-26 2012-02-02 オリンパス株式会社 発光プローブを用いて溶液中の希薄粒子を検出する方法
CN103154708B (zh) 2010-10-13 2015-01-14 奥林巴斯株式会社 利用单个发光粒子检测的粒子的扩散特性值的测量方法
EP2667183A4 (en) 2011-01-20 2017-05-10 Olympus Corporation Photoanalysis method and photoanalysis device using detection of light from single light-emitting particle
WO2012144528A1 (ja) 2011-04-18 2012-10-26 オリンパス株式会社 標的粒子の定量方法、光分析装置及び光分析用コンピュータプログラム
CN103608663B (zh) * 2011-04-20 2016-01-13 奥林巴斯株式会社 生物样品中的核酸分子的检测方法
EP2725347B1 (en) * 2011-06-27 2018-09-26 Olympus Corporation Method for detecting target particles
JP6010029B2 (ja) * 2011-08-12 2016-10-19 オリンパス株式会社 蛍光粒子の検出方法
JP6013337B2 (ja) * 2011-08-15 2016-10-25 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
JP2015083922A (ja) * 2012-02-07 2015-04-30 オリンパス株式会社 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム
JP2013238479A (ja) * 2012-05-15 2013-11-28 Seiko Epson Corp 検出装置
JP6363991B2 (ja) 2013-03-13 2018-07-25 オリンパス株式会社 光分析装置の評価方法
KR102126032B1 (ko) * 2013-07-31 2020-07-08 삼성전자주식회사 다채널 형광 검출 모듈 및 이를 포함하는 핵산 분석 시스템
DE102013015016A1 (de) * 2013-09-07 2014-09-18 Testo Ag Verfahren zur Partikeldetektion in einem partikelhaltigen Fluid und korrespondierende Partikeldetektionsvorrichtung
JP6593668B2 (ja) * 2014-07-11 2019-10-23 株式会社リコー 微粒子分散性評価装置
JPWO2016017591A1 (ja) * 2014-08-01 2017-06-01 シャープ株式会社 検査器具、検査装置、検査キット、および測定方法
WO2016125278A1 (ja) * 2015-02-05 2016-08-11 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置
WO2017110838A1 (ja) * 2015-12-25 2017-06-29 株式会社キーエンス 共焦点変位計
CN115308145A (zh) * 2016-01-21 2022-11-08 蛋白质动态解决方案有限公司 用于光谱数据分析的方法和系统
JP6793352B2 (ja) * 2016-03-31 2020-12-02 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 光源と、光検出器と、制御回路とを備える撮像装置
CN109069008B (zh) * 2016-05-16 2022-06-28 索尼公司 光学设备和信息处理方法
WO2018105462A1 (ja) * 2016-12-08 2018-06-14 東京エレクトロン株式会社 信号処理方法及びプログラム
WO2018149889A1 (en) * 2017-02-16 2018-08-23 Koninklijke Philips N.V. Particle characterization apparatus and method
EP4235146A3 (en) * 2017-03-14 2023-09-20 Toppan Printing Co., Ltd. Analysis kit and analysis system
WO2018179078A1 (ja) * 2017-03-28 2018-10-04 オリンパス株式会社 光分析装置、光分析方法、およびプログラム
DE102017128773A1 (de) * 2017-12-04 2019-06-06 Leica Microsystems Cms Gmbh Detektoranordnung für die Mikroskopie
WO2019144443A1 (zh) * 2018-01-26 2019-08-01 中国科学院大气物理研究所 一种双线二极管阵列器件及粒子速度测量方法和测量装置
CN112041660A (zh) * 2018-02-16 2020-12-04 加利福尼亚大学董事会 用于移动粒子三维成像的系统、装置与方法
EP3910315A4 (en) * 2019-01-09 2022-12-07 Hitachi High-Tech Science Corporation SIZE DISTRIBUTION MEASURING DEVICE, SIZE DISTRIBUTION MEASURING METHOD, AND SAMPLE CONTAINER
US12059520B2 (en) * 2019-04-08 2024-08-13 Baxter International Inc. Priming sensor for a medical fluid delivery system
IT202000006031A1 (it) * 2020-03-20 2021-09-20 Celldynamics I S R L Dispositivo fluidico per analisi di corpuscoli e relativo metodo
DE102022121505A1 (de) 2022-08-25 2024-03-07 Carl Zeiss Meditec Ag Verfahren, Computerprogramm und Datenverarbeitungseinheit zur Vorbereitung der Beobachtung einer Fluoreszenzintensität, Verfahren zum Beobachten einer Fluoreszenzintensität und optisches Beobachtungssystem

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0423523B2 (ja) 1986-12-11 1992-04-22 Matsushita Electric Ind Co Ltd
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
JP2002507762A (ja) * 1998-03-16 2002-03-12 プリーラックス・インコーポレイテッド 共焦点顕微鏡イメージングシステム
JP2004506192A (ja) * 2000-08-08 2004-02-26 カール　ツァイス　イエナ　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツング 検出器の分光学的および空間分解能を増大させるための方法
JP2005098876A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Institute Of Physical & Chemical Research ２成分相互作用分析方法
JP2007020565A (ja) 2005-06-13 2007-02-01 Kansai Bunri Sogo Gakuen 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
WO2008007580A1 (fr) * 2006-07-13 2008-01-17 Olympus Corporation Procédé d'analyse de particules fines
JP2008116440A (ja) 2006-10-13 2008-05-22 Shiga Pref Gov 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム
WO2008080417A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Flult Biosystems Gmbh A method of determining characteristic properties of a sample containing particles
JP2008536093A (ja) * 2005-01-31 2008-09-04 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ イリノイ 透明媒質及び懸濁媒質内の粒子を特性評価する方法及びデバイス
JP2008292371A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法
JP2009145242A (ja) * 2007-12-14 2009-07-02 Olympus Corp 光測定装置
JP2009288161A (ja) * 2008-05-30 2009-12-10 Olympus Corp 光測定装置及び光測定方法
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4251733A (en) * 1978-06-29 1981-02-17 Hirleman Jr Edwin D Technique for simultaneous particle size and velocity measurement
US4979824A (en) * 1989-05-26 1990-12-25 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High sensitivity fluorescent single particle and single molecule detection apparatus and method
EP0836090A1 (en) 1996-10-12 1998-04-15 Evotec BioSystems GmbH Method of analysis of samples by determination of the distribution of specific brightnesses of particles
US20030036855A1 (en) 1998-03-16 2003-02-20 Praelux Incorporated, A Corporation Of New Jersey Method and apparatus for screening chemical compounds
US6388788B1 (en) 1998-03-16 2002-05-14 Praelux, Inc. Method and apparatus for screening chemical compounds
EP1175602B1 (en) * 1999-04-29 2003-03-19 Evotec OAI AG A method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions
US6376843B1 (en) 1999-06-23 2002-04-23 Evotec Oai Ag Method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions
US8264680B2 (en) 1999-05-28 2012-09-11 Yokogawa Electric Corporation Biochip reader and electrophoresis system
US6965113B2 (en) 2000-02-10 2005-11-15 Evotec Ag Fluorescence intensity multiple distributions analysis: concurrent determination of diffusion times and molecular brightness
US20010035954A1 (en) * 2000-03-10 2001-11-01 Rahn John Richard Method and apparatus for measuring particle size distributions using light scattering
US6947133B2 (en) 2000-08-08 2005-09-20 Carl Zeiss Jena Gmbh Method for increasing the spectral and spatial resolution of detectors
AU2002211913A1 (en) * 2000-10-12 2002-04-22 Amnis Corporation Multipass cavity for illumination and excitation of moving objects
US7668697B2 (en) * 2006-02-06 2010-02-23 Andrei Volkov Method for analyzing dynamic detectable events at the single molecule level
US6750963B2 (en) 2002-05-21 2004-06-15 Agilent Technologies, Inc. Imaging systems for signals on a surface
US20080052009A1 (en) * 2006-08-23 2008-02-28 Washington, University Of Method for deconvolving single-molecule intensity distributions for quantitative biological measurements
GB0618057D0 (en) * 2006-09-14 2006-10-25 Perkinelmer Ltd Improvements in and relating to scanning confocal microscopy
EP2124085A4 (en) 2007-02-14 2010-04-28 Nikon Corp CONFOCAL SLOTTED SCANNING MICROSCOPE
EP2232271B1 (en) * 2007-12-19 2019-09-11 Singulex, Inc. Scanning analyzer for single molecule detection and methods of use
US20100177190A1 (en) 2008-12-16 2010-07-15 Ann-Shyn Chiang Microscopy system with revolvable stage
WO2011108371A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 オリンパス株式会社 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0423523B2 (ja) 1986-12-11 1992-04-22 Matsushita Electric Ind Co Ltd
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
JP2002507762A (ja) * 1998-03-16 2002-03-12 プリーラックス・インコーポレイテッド 共焦点顕微鏡イメージングシステム
JP2004506192A (ja) * 2000-08-08 2004-02-26 カール　ツァイス　イエナ　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツング 検出器の分光学的および空間分解能を増大させるための方法
JP2005098876A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Institute Of Physical & Chemical Research ２成分相互作用分析方法
JP2008536093A (ja) * 2005-01-31 2008-09-04 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ イリノイ 透明媒質及び懸濁媒質内の粒子を特性評価する方法及びデバイス
JP2007020565A (ja) 2005-06-13 2007-02-01 Kansai Bunri Sogo Gakuen 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
WO2008007580A1 (fr) * 2006-07-13 2008-01-17 Olympus Corporation Procédé d'analyse de particules fines
JP2008116440A (ja) 2006-10-13 2008-05-22 Shiga Pref Gov 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム
WO2008080417A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Flult Biosystems Gmbh A method of determining characteristic properties of a sample containing particles
JP2008292371A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法
JP2009145242A (ja) * 2007-12-14 2009-07-02 Olympus Corp 光測定装置
JP2009288161A (ja) * 2008-05-30 2009-12-10 Olympus Corp 光測定装置及び光測定方法
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F.J.MEYER-ALMS: "Fluorescence Correlation Spectroscopy", 2000, SPRINGER, pages: 204 - 224
MASATAKA KANESHIRO, PROTEIN, NUCLEIC ACID, ENZYME, vol. 44, no. 9, 1999, pages 1431 - 1438
NORIKO KATO ET AL., GENE MEDICINE, vol. 6, no. 2, pages 271 - 277

Cited By (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5893564B2 (ja) * 2010-09-10 2016-03-23 オリンパス株式会社 複数の波長帯域の光計測を用いた光分析方法
US8785886B2 (en) 2010-09-10 2014-07-22 Olympus Corporation Optical analysis method using the light intensity of a single light-emitting particle
US8958066B2 (en) 2010-09-10 2015-02-17 Olympus Corporation Optical analysis method using measurement of light of two or more wavelength bands
WO2012032955A1 (ja) * 2010-09-10 2012-03-15 オリンパス株式会社 複数の波長帯域の光計測を用いた光分析方法
WO2012039352A1 (ja) * 2010-09-21 2012-03-29 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析方法
US8680485B2 (en) 2010-09-21 2014-03-25 Olympus Corporation Optical analysis method using the detection of a single light-emitting particle
JP5914341B2 (ja) * 2010-09-21 2016-05-11 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析方法
JP5907882B2 (ja) * 2010-10-19 2016-04-26 オリンパス株式会社 単一発光粒子の偏光特性を観測する光分析装置、光分析方法及びそのための光分析用コンピュータプログラム
WO2012053355A1 (ja) * 2010-10-19 2012-04-26 オリンパス株式会社 単一発光粒子の偏光特性を観測する光分析装置、光分析方法及びそのための光分析用コンピュータプログラム
US8803106B2 (en) 2010-10-19 2014-08-12 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis for observing polarization characteristics of a single light-emitting particle
US9103718B2 (en) 2010-11-25 2015-08-11 Olympus Corporation Optical analysis device and optical analysis method using a wavelength characteristic of light of a single light-emitting particle
WO2012070414A1 (ja) * 2010-11-25 2012-05-31 オリンパス株式会社 単一発光粒子の光の波長特性を用いた光分析装置及び光分析方法
US8900812B2 (en) 2011-01-26 2014-12-02 Olympus Corporation Method for identifying polymorphism of nucleic acid molecules
US8911944B2 (en) 2011-01-26 2014-12-16 Olympus Corporation Method for identifying polymorphism of nucleic acid molecules
US9435727B2 (en) 2011-03-29 2016-09-06 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection
US9068944B2 (en) 2011-04-13 2015-06-30 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection
US9354176B2 (en) 2011-08-11 2016-05-31 Olympus Corporation Method for detecting a target particle
US9488578B2 (en) 2011-08-26 2016-11-08 Olympus Corporation Single particle detection device, single particle detection method, and computer program for single particle detection, using optical analysis
US10371631B2 (en) 2011-08-26 2019-08-06 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection
US9528923B2 (en) 2011-08-30 2016-12-27 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection
US9841418B2 (en) 2011-08-30 2017-12-12 Olympus Corporation Method for detecting target particle
US9329117B2 (en) 2011-11-10 2016-05-03 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection
WO2013069504A1 (ja) 2011-11-10 2013-05-16 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
EP2778658A4 (en) * 2011-11-10 2015-12-02 Olympus Corp SPECTROSCOPY DEVICE, SPECTROSCOPY PROCESS AND SPECTROSCOPY COMPUTER PROGRAM DETECTING SINGLE LIGHT-EMITTING PARTICLES
JPWO2013121905A1 (ja) * 2012-02-17 2015-05-11 オリンパス株式会社 単一粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
US9494779B2 (en) 2012-02-17 2016-11-15 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single particle detection
EP2816344A4 (en) * 2012-02-17 2015-09-23 Olympus Corp OPTICAL ANALYSIS DEVICE USING SINGLE PARTICLE DETECTION TECHNIQUE, OPTICAL ANALYSIS METHOD, AND COMPUTER PROGRAM FOR OPTICAL ANALYSIS
WO2013121905A1 (ja) 2012-02-17 2013-08-22 オリンパス株式会社 単一粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
US9428796B2 (en) 2012-02-22 2016-08-30 Olympus Corporation Method for detecting a target particle
WO2013125124A1 (ja) 2012-02-22 2013-08-29 オリンパス株式会社 標的粒子の検出方法
JPWO2013140890A1 (ja) * 2012-03-21 2015-08-03 オリンパス株式会社 標的核酸分子の検出方法
WO2013140890A1 (ja) 2012-03-21 2013-09-26 オリンパス株式会社 標的核酸分子の検出方法
US9771612B2 (en) 2012-03-21 2017-09-26 Olympus Corporation Method for detecting a target nucleic acid molecule
US9188535B2 (en) 2012-04-18 2015-11-17 Olympus Corporation Single particle detection device, single particle detection method, and computer program for single particle detection, using optical analysis
WO2013157319A1 (ja) 2012-04-18 2013-10-24 オリンパス株式会社 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム
WO2013157283A1 (ja) 2012-04-18 2013-10-24 オリンパス株式会社 標的粒子の検出方法
US9575060B2 (en) 2012-04-18 2017-02-21 Olympus Corporation Method for detecting a target particle
WO2014020967A1 (ja) 2012-08-02 2014-02-06 オリンパス株式会社 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
WO2014064971A1 (ja) 2012-10-25 2014-05-01 オリンパス株式会社 標的粒子の検出方法
CN104736999A (zh) * 2012-10-25 2015-06-24 奥林巴斯株式会社 目标粒子的检测方法
WO2015015951A1 (ja) 2013-07-31 2015-02-05 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出技術を用いた光学顕微鏡装置、顕微鏡観察法及び顕微鏡観察のためのコンピュータプログラム
US10310245B2 (en) 2013-07-31 2019-06-04 Olympus Corporation Optical microscope device, microscopic observation method and computer program for microscopic observation using single light-emitting particle detection technique
US9739698B2 (en) 2013-10-07 2017-08-22 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection
WO2015052965A1 (ja) 2013-10-07 2015-04-16 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
US11016026B2 (en) 2015-12-09 2021-05-25 Olympus Corporation Optical analysis method and optical analysis device using single light-emitting particle detection
JP2016197111A (ja) * 2016-06-14 2016-11-24 ソニー株式会社 微小粒子測定装置

Also Published As

Publication number Publication date
US8471220B2 (en) 2013-06-25
EP2543990A4 (en) 2017-11-01
JP5250152B2 (ja) 2013-07-31
CN102869982A (zh) 2013-01-09
CN102782479B (zh) 2014-04-30
US8541759B2 (en) 2013-09-24
EP2543989A4 (en) 2017-11-01
US20130048875A1 (en) 2013-02-28
WO2011108370A1 (ja) 2011-09-09
EP2543989A1 (en) 2013-01-09
JP2013137332A (ja) 2013-07-11
CN102869982B (zh) 2014-04-30
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