WO2009092291A1

WO2009092291A1 - 一种给药系统及其制备方法和应用

Info

Publication number: WO2009092291A1
Application number: PCT/CN2009/000063
Authority: WO
Inventors: Yihui Deng; Xiaohui Dong; Li Shi; Yi Lu
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University; Hangzhou Yuhong Pharmaceutical Science & Technology Co., Ltd.
Priority date: 2008-01-16
Filing date: 2009-01-16
Publication date: 2009-07-30
Also published as: US20110064794A1; CN101485629B; JP2011509947A; CN101485629A; EP2243495A1

Description

一种给药系统及其制备方法和应用技术领域

本发明涉及药物制剂领域，更具体地说涉及一种给药系统及其制备方法。背景技术

近年来，伴随着药物治疗的快速发展， "用药最适化" 这一概念逐渐成为人们非常关注的问题，这主要是为了让药物治疗价值合理体现，保证治疗用药的安全性。

通过利用新的技术和方法调控药物在体内的动态变化，以获得最好治疗效果，这就是给药系统（drug delivery system, DDS)。利用给药系统的作用，可以改善药物的吸收、降低药物的毒副作用、提高药物在病变组织的分布量，实现增效减毒目的。

药剂学领域里，一般将纳米粒的尺寸度界定在 1 ~ lOOOnm, 该范围包括了大小在 lOOnm以上的亚微米粒子。药剂学中的纳米粒可分为两类：纳米载体和纳米药物。纳米载体系指溶解或分散有药物的各种纳米粒子，如纳米脂质体、聚合物纳米囊、纳米球、聚合物胶束等。纳米药物则是指直接将原料药加工成纳米粒，其实质是微粉化技术、超细粉技术的进一步发展。

将纳米技术和纳米材料应用于药学领域产生了纳米给药系统，包括纳米粒 ( Nanopar t i c 1 es , NP )，纳米球 ( Nanospheres , NS )，纳米囊 ( Nanocapsules , NC ), 纳米胶束（ Nanomicel le, NM), 纳米月旨质体（ Nano- 1 i posomes , NL ) 和纳米乳剂（ Nano-emulsion, NE ) 等。其中 NP—般是指由天然或合成的高分子材料制成的、粒度在纳米级的（ 1 ~ lOOOnm) 固态胶体微粒； NC是用高分子材料包成的纳米级的囊泡，有明显的囊壳相。 NP和 NC的制备方法主要有乳化聚合物法、交联聚合法和界面缩聚法等。近来用二亲性聚合物材料自动聚合（被称为自组装）形成 "核-壳" 结构的纳米固体胶束引人注目，胶束的亲水端向外而亲脂端向内，核内可装载各种药物、酶和基因等。

早在 20世纪 70年代，人类就将纳米粒作为药物载体， 30多年来在药剂学领域得到广泛推广。目前关于蛋白纳米制剂的研究比较多，蛋白质具有无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等优点，蛋白质类高分子均易于代谢，并能以相对非专一的形式包埋药物，因此，可用于生物降解纳米颗粒的制备。此外，蛋白分子中的大量功能团（氨基和羧基等）有利于将药物分子专属性地连接到纳米颗粒表面，并且适于制备缀合物。通过表面修饰连接适当配体以达到受体介导的主动靶向。蛋白纳米制剂可以实现靶向输送药物的目的，同时还可以降低药物的毒副作用，目前已经上巿的纳米制剂有诸如紫杉醇蛋白纳米粒。例如，中国发明申请 CN200380109606.9、 CN97199720.9 , CN20031023461. X, CN028110 17. X、 CN03108361. 7 , CN200610077006.4及发明专利 ZL 01119258.5

ZL03108361.7都是关于蛋白纳米制剂的。但是，这些发明申请或发明专利涉及的产品和技术仅仅是釆用人血清白蛋白（ HSA ), 而且存在所使用的有机溶剂（如氯仿、二氯甲烷等）毒性大、制备方法周期长及工艺繁瑣等缺点。在专利申请 CN20031023461. X中，实施例 3证明加入吐温 80 (1% ~ 10%)或其它表面活性剂 (F68\F127等）不能获得良好的分散体系，该分散体系中很-快析出药物晶体.； _实施例 4证明单独采用吐温 80对药物的氯仿溶液进行乳化，不能得到均匀分散体系，分散液很快析出沉淀；实施例 12证明单独釆用与水相溶溶剂不能得到理想的分散系统，粒度分布非常宽，粒径达到几个微米，从而强调特别排除与水相溶溶剂的单独使用。

脂质体（liposomes)是一种定向药物载体，属于第四代靶向给药系统 (targeting drug delivery system)的一种新剂型。脂质体最初是由英国学者 Banghatn和 Standi sh将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均为脂质的双分子层；囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为 4纳米。它具有类似于细胞膜的结构，构成双分子层的类脂亲水性的头部形成膜的内表面，而亲脂性的尾部则处于膜的中间。正由于脂质体的这种类膜结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两亲的物质，这些物质可被包入脂质体内部水相，插入类脂双分子层或吸附连接在脂质体的表面。 1971年英国 Rahman等人开始将脂质体作为药物载体包埋淀粉葡萄糖苷酶治疗糖原沉积病首次获得成功，人们在脂质体作为药物载体方面进行了大量的研究，在脂质体的制备、稳定性以及靶向性等方面取得了重大进展。

目前用以制备脂质体的材料有天然磷脂（蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂）、半合成磷脂（氢化磷脂）与合成磷脂（如二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱）等。脂质体的作用主要表现在以下几个方面： ①脂质体对机体无毒或毒副作用小，其双分子层与生物膜有较大的相似性以及组织相溶性，易于被组织吸收，从而提高了药物的吸收利用率； ②脂质体包裹药物为物理过程，不改变药物分子结构，不会破坏药物成分，而包裹的药物则可以避免被体内水解酶所破坏； ③药物被包裹后可以降低对机体特定部位的毒性、减小使用量，并具有缓释和控释作用； ④与病毒载体不同，脂质体在宿主体内可以生物降解，无免疫原性； ⑤在基因治疗上易于与基因复合，有较高的靶向性，可实现特定细胞的治疗： ⑥材料廉价，便于大量制备。

脂质体虽然有其突出的优点，但也存在一些尚未解决的问题：如（ 1 ) 脂质体药物的稳定性不高；（ 2 ) 脂质体包封率和载药量较低，针对一种特定的药物要制备一种较为理想的脂质体，通常都要做大量的筛选工作；（ 3 ) 适合于脂质体的药物也有限；（ 4 ) 在制备过程中一般要用大量的有毒溶剂；（ 5 ) 普通脂质体主要集中于网状内皮细胞丰富的器官，不能识别血管内皮上的小窝蛋白。

中国发明申请 CN200610037609.1、 CN02129204.3 CN02160028.7和发明专利 ZL94191101.2、 ZL96190332.5中揭示了几种蛋白质与磷脂的组合物，但这些申请与本发明所要解决的技术问题和提供的技术方案有本质上的不同和区别，它们主要是制备含有蛋白类药物的脂质体或者含磷脂的制剂，即蛋白质是有效活性成分，在制备过程中，要尽可能保证蛋白的活性，是治疗主体，并非是为了达到特殊目的（如靶向、增加吸收），以辅料成分出现而研发的系统。如：中国发明申请 CN200610037609.1釆用反相蒸发法除去有毒有机溶剂（氯仿）与层层吸附技术，磷脂浓度与蛋白浓度均为 0.1mg/ml ~ l_mg/ml，粒度大于 1000纳米 (实施例 1中的粒度为 10微米、实施例 2中的粒度为 20微米、实施例 3中的粒度为 40微米），工艺中也未釆用均质，蛋白仅是简单的吸附，蛋白浓度也很低，蛋白是治疗主体；中国专利 ZL96190332.5是利用磷脂保护蛋白药物，也与本发明的目的不同；而中国发明申请 CN02129204.3揭示的是利用振荡气泡压方法，曲面制备蛋白质与磷脂复合膜用于研究药物，但由于方法复杂，所制备的粒度大，不具有作为药物载体进行静脉注射、口服、肺部等途径给药的价值。此外，在 2007 4月 12日公开的美国发明专利申请 US2007082838A1中，公开了一种多西紫杉醇（doce xel ) 蛋白纳米制剂，其在实施例 6中否定了磷脂的价值。

另外，在给药过程中存在的副作用主要有静脉刺激、静脉炎、疼痛、骨髓抑制、神经毒性、过敏、炎症、皮肤刺激等，是在研究开发新的给药系统时必须要考虑解决的重要问题。发明内容

综上所述，为有效解决上述问题，本发明的目的旨在提供一种给药系统。此外，本发明还提供该给药系统的制备方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下所述的技术方案。

本发明第一方面是提供一种给药系统，其包括蛋白质-磷脂分散体，其中所述蛋白质-磷脂分散体中的蛋白质与磷脂的重量比为 1: 300-300： 1，所述蛋白质-磷脂分散体的粒径在 5nra~ lOOOnm之间。在蛋白质-磷脂分散体中，磷脂表面或磷脂表面与内部包被（包覆）蛋白质层或者脂质体双分子层内外层包被（包覆）蛋白质，或在脂质体内水相形成蛋白纳米粒。如上所述，蛋白质与磷脂的重量比为 1: 300-300： 1, 例如可以是 1: 200 - 200： 1, 也可以是 1: 100 - 100: 1，还可以是 1: 50 ~ 50: 1和 1: 10- 10： 1 等。蛋白质 -磷脂的粒径优选在 20_nm~ 500nm之间。磷脂在水中分散可以形成脂质体，也可以形成脂质纳米球，磷脂还可以与其它脂质成分组成脂质体 /脂质纳米球（包括乳剂）。本发明分散体的纳米粒子表面与 /或内部包被（包覆）蛋白质层，此蛋白层是在经过超声，更为重要的是在均质（如微射流）处理后形成二硫键，与脂质体 /脂质纳米球（包括乳剂）共同组成稳定的药物载体，从而提供一种新的给药系统。

本发明人通过大量实验研究发现，在现有技术的蛋白质纳米制剂基础上，将蛋白与磷脂（还可包括其它脂质成分）结合，令人欣喜地获得了一个新型的给药系统。基于磷脂的独特分散能力 /性质，使得应用已久的蛋白质纳米制剂技术变得更为可行、可靠，更为重要的是，磷脂（包括其它脂质成分）的加入，极大地扩大了蛋白纳米粒的载药范围。也因为磷脂表面或磷脂表面与内部包被 (包覆）了蛋白质层，大大增加了脂质纳米球（包括乳剂） /脂质体的稳定性。此处的磷脂至少有两种作用，一是分散，二是溶解（承载）药物。磷脂本身也属于表面活性剂，磷脂的加入，使得在整个系统中可以加入其它各种表面活性剂，并且因为其它表面活性剂的加入，又进一步大大增加磷脂的作用，协助磷脂载药，进一步降低粒度，也可以减少磷脂用量，降低成本，并能确保给药系统的制备工艺简单、适用。

与以往的蛋白纳米粒技术（需要加入或者釆用有毒有机溶剂）不同，本发明的给药系统可以不用有机溶剂来溶解、分散药物。可不采用有机溶剂的药物包括中药或动植物挥发油或油脂，如：川芎油、当归油、莪术油、鸦胆子油、生姜油、连翘油、大蒜油、柴胡油 ·、榄香烯、艾叶油、蓝桉油、桉叶油、桉叶素、. 安息香油、巴豆油、白兰花油、白兰净油、白兰叶油、白柠檬油、十倍白柠檬油、五倍白柠檬油、白樟油、百里香油、柏木油、薄荷素油、 . 薄荷油、薄荷脑、苍术油、茶树油、橙叶油、茶叶油、橙花油、沉香油、陈皮油、玳玳花油、玳玳叶油、当归油、丁香罗勒油、丁香油、丁香花蕾油、冬青油、冬柠檬油、杜鹃花油、杜香油、大蒜油、芳樟油、佛手油、甘松油、广藿香油、桂花净油、桂油、橄榄油、葛缕子油、黑胡椒油、红花籽油、黄蒿油、红紫苏油、黄柏果油、黄樟油、茴香油 .、茴香脑、胡萝卜籽油、花椒油、金合欢净油、坚果油、椒样薄荷油、荆芥油、姜黄油、苦杏仁油、卡南加油、赖百当净油、辣椒精油、生姜油、柠檬油、桔子油、红桔油、薏苡仁油、留兰香油、连翘油、灵芝孢子油、芦荟油、罗马甘菊油、甜罗勒油、龙蒿油、玫瑰油、野玫瑰净油、墨红净油、牡荆油、没药油、迷迭香油、马刺花净油、柠檬桉油、柠檬草油、柠檬油、牛至油、甜牛至油、楠叶油、葡萄籽油、芹菜籽油、青蒿油、肉豆蔻油、沙田柚花净油、沙田柚花油、山苍子脚油、山苍子油、山秋油、杉木油、蛇床子油、生姜油、鼠尾草油、树兰净油、松节油、松籽油、松针油、松果油、松球油、丝柏油、山茶油、檀香油、甜橙油、甜橙萜、甜橙醛、十倍甜橙油、五倍甜橙油、五味子油、甜杏仁油、香根油、香茅油、香柠檬薄荷油、香叶油、香紫苏油、小豆蔻油、香柏油、小茴香油、小花茉莉净油、辛夷油、血柏木油、薰衣草油、缬草油、香薷精油、雪松油、烟花净油、芫妥籽油、椰子油、野玫瑰油、野菊花净油、茵陈草油、柚皮油、鱼腥草油、鸢尾精油、月桂油、圆柚油、伊兰油、月见草油、杂樟油、杂薰衣草油、栀子花油、脂檀油、紫苏籽油、樟脑油或麝香油；或挥发油的精制品，如由莪术油纯化的榄香烯或其它挥发油纯化的榄香烯、川芎油纯化的藁本内酯或其它挥发油纯化的藁本内酯，芹菜籽油纯化的丁苯酞 (也可以合成而得）；或包括两者或两者以上的挥发油及其精制品按任意比例混合的混合物。优选为大蒜油、莪术油或榄香烯。不采用有机溶剂的药物尚包括天然或者生物工程技术提取、合成的蛋白 /肽类药物，如胰岛素、胸腺肽、白介素、干扰素、胸腺五肽或促红细胞生长素等；不采用有机溶剂的药物也包括与磷脂有良好溶解性能、相互作用的药物，如水飞蓟素（水飞蓟宾）等。

本发明的给药系统中所述的蛋白质 -磷脂分散体为纳米液体制剂或纳米固体制剂。

本发明的给药系统中所述的蛋白质选自天然蛋白、人工合成蛋白及其衍生物。优选的方案是所述蛋白质选自但并不限于下述的人血白蛋白、牛血清蛋白、卵清蛋白、玉米蛋白、血红蛋白及其衍生物或相关蛋白、白蛋白衍生物（如半乳糖化白蛋白）和修饰猪血白蛋白（如 P E G修饰猪血白蛋白）中的至少一种。

本发明的给药系统中所述的磷脂选自天然、半合成、全合成磷脂及其衍生物。优选的方案是所述磷脂选自但并不限于下述的大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、卵磷脂酰甘油（ EPG)、多烯磷脂酰胆碱、磷脂酸、心肌磷脂、鞘磷脂、磷脂酸丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、氢化大豆卵磷脂（ HSPC：)、氢化蛋黄卵磷脂（ HEPC )、全合成磷脂，如 C3至 C30的各种合成磷脂，如二硬脂酰磷脂酰胆碱（ DSPC ), 二棕榈酰磷脂酰胆碱（ DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱（ D0PC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（ DMPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱（ DLPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油（钠盐 DSPG ), 二棕榈酰磷脂酰甘油（钠盐 DPPG ), L- ex -二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（钠盐 DMPG ), 二月桂酰磷脂酰甘油（ DLPG)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE) , 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE) , 二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺（DLPE)、双二硬脂酰磷脂酰甘油（钠盐）、双二棕榈酰磷脂酰甘油（纳盐）、双二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（钠盐）、双二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰花生四烯酰磷脂酰胆碱、 1, 2-二己酰卵磷脂、 1, 2-二月桂酰卵磷脂、 1， 2-二月桂酰磷脂酰乙醇胺、 1, 2-十四酰基卵磷脂、 1, 2-十四酰基磷脂酰乙醇胺、 1，2-十四烷基卵磷脂、 1, 2-二十五酰基卵磷脂、 1, 2- 二棕榈酰基卵磷脂、 1-棕榈酰 -2-油酰-卵磷脂、 1, 2-棕榈酰磷脂酰乙醇胺、 1 -棕榈酰- 2-亚油酰 -卵磷脂、 1, 2-十六烷基卵磷脂、 1，2-十六烷基磷脂酰乙醇胺、 1, 2-十六烷基磷脂酰甲基乙醇胺、 1, 2-十六垸基磷脂酰二甲基乙醇胺、 1，2- 十七酰基卵磷脂、 1, 2-二硬脂酰基卵磷脂、 1, 2-二油酰基卵磷脂、 1, 2-二亚油酰基卵磷脂、 1, 2-二亚麻酰基卵磷脂、 1, 2-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、 1, 2- 十九酰基卵磷脂、 1, 2-花生酰基卵磷脂、 1, 2-花生四烯酰卵磷脂、溶血卵磷脂、溶血脑磷脂、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油酯、溶血磷脂酰丝胺酸、 1, 2 - 二十二烷基磷脂酸、 1-十四酰 -2-羟基卵磷脂、 1, 2-十四酰磷脂酸、 1-棕榈酰- 2-羟基卵磷脂、 1, 2-二棕榈酰磷脂酸、 1-棕榈酰 -2-油酰磷脂酸、 1, 2-二十六烷基磷脂酸（钠盐）、 1-硬脂酰 -2-羟基卵磷脂、 1-油酰 -2-羟基卵磷脂、 1-亚油酰 -2-羟基卵磷脂、 1, 2-二硬脂酰磷脂酸、 1, 2-二油酰磷脂酸、 1, 2 - 二十八烷基磷脂酸（钠盐）、 1, 2-十四酰磷脂酰甘油（钠盐）、 1， 2-二棕榈酰磷脂酰甘油（纳盐）、 1，2-二硬脂酰磷脂酰甘油（纳盐）、二椋榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二椋榈酰磷脂酰甘油、四肉豆蔻酰心磷脂、四月桂酰心磷脂、四棕榈酰心磷脂、和四油酰心磷脂中的至少一种。

由于磷脂在水中或者油相中分散能力以及磷脂溶解药物能力有限，为更好地制备含磷脂相或增大药物的溶解量，本发明的给药系统还可以包括有机溶剂。与以往公开的技术方案不同，本发明人选用的有机溶剂毒性大大降低，这对药物毒性降低更为有利，也更利于环保、更便于做好生产中工人的劳动保护；所述有机溶剂还可以是与水相溶的溶剂。本发明优选的方案所釆用的有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙醇、丁醇（包括正丁醇、叔丁醇）、丙酮、甲基吡咯烷酮 ( N-甲基吡咯烷酮或 1-甲基 -2-吡咯垸酮）、乙酸乙酯和异丙醚中的至少一种；更优选的方案是所述有机溶剂为乙醇或叔丁醇。为了增加磷脂溶解药物的范围以及能够加快磷脂相的分散速度，本发明的给药系统也可以加入适宜的油（脂）类物质或者其它脂质类物质，其与磷脂的重量比为 1 : 0. 1 ~ 1： 1 0。本发明对不同油相对粒度的影响和不同量 MCT所制备纳米粒的冻融稳定性做了考察。优选的方案是所述的油类物质或其它脂质类物质选自中链甘油三酯（ MCT )、结构油（结构脂肪， structured-triglyceride )、生育酚、醋酸生育酚、油酸、油酸乙酯、大豆油、红花油、橄榄油、辛酸及其酯类、葵酸及其酯类、月桂酸及其酯类、棕榈酸及其酯类、亚油酸及其酯类、亚麻油酸及其酯类、二十二碳六烯酸及其酯类、深海鱼油及植物挥发油中的至少一种。更优选的方案是油类物质选自 MCT、油酸及其酯类或结构油（结构脂肪）。

为了提高制剂的稳定性，在制剂中还可以加入抗氧剂（包括水溶性与油溶性抗氧剂，还可进一步包括惰性气体）。优选方案中水溶性抗氧剂选自维生素 C 及其酯类、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、硫辛酸、胱氨酸、半胱氨酸、组氨酸和甘氨酸中的至少一种；优选方案中油溶性抗氧剂选自 BHA、 BHT、生育酚或硫辛酸等。

在本发明具体实施方式中的一个优选实施例中油类选用了 MCT，其与磷脂的重量比为 1 : 1 ; 另一个优选实施例中油类选用了结构油，其与磷脂重量比为 1： 1 · 7。

本发明的给药系统还可以包括胆固醇及其衍生物（如胆固醇半琥珀酸酯）和 /或谷甾醇等其它脂质。制备磷脂相时，加入胆固醇和 /或谷甾醇作为脂质体或乳剂的附加剂成分，这些脂质可以用来协助磷脂负载亲脂性物质。

在本发明具体实施方式的一个优选实施例中加入了胆固醇。

本发明的给药系统还可以包括配体和 /或抗体，其中所述配体选自半乳糖衍生物、转铁蛋白衍生物、叶酸及其衍生物、氨基葡萄糖衍生物或各种 RGD及其衍生物等；所述的抗体选自各种鼠源、人源、重组鼠源或重组人源的抗体。优选的配体选自半乳糖配体、转铁蛋白、叶酸或 RGD (三肽结构精 -甘-天冬氨酸）及其衍生物。因为本发明的给药系统中含有磷脂或其它脂质，从而可以利用这些脂质成分来负载一些含有亲脂性基团的配体、抗体及其衍生物，实现主动靶向递药的目的。

在本发明具体实施方式中的一个优选实施例中加入了发明人为本发明人的申请 CN2 006 1 01 2 1 7 94. 2 中所述的半乳糖胆固醇衍生物。

为了实现特殊靶向或者实现细胞融合、提高基因转染效率，本发明的给药系统还可以包括荷正电性物质（阳离子物质），如脂肪胺、多聚胺、 TC- Cho l (多聚胺阳离子脂质）、 DC- Cho 阳离子心磷脂、壳聚糖或十八胺（氢化牛脂基伯胺）等。

为了增加药物或者化合物的稳定性，保证制剂在合理的 PH 值范围内，本发明的给药系统还可以包括 pH调节剂。其中所述的 pH调节剂选自有机酸、有机碱或无机酸、无机碱。如柠檬酸、乳酸、富马酸、酒石酸、乙酸、葡萄糖酸、乳糖酸、山梨酸、琥珀酸、马来酸、抗坏血酸、草酸、甲酸、苯磺酸、苯甲酸、谷氨酸、天冬氨酸、盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氢氧化钠、精氨酸、赖氨酸等中的至少一种。在本发明具体实施方式中的一个优选实施例中加入了柠檬酸。

本发明第二方面是提供上述给药系统的制备方法，其包括以下几个步骤： ( 1 ) 含磷脂相的制备（磷脂相的获得包括以下几种情况：直接使用磷脂、磷脂与油等成分混合溶解、或磷脂与其它成分溶于有机溶剂中）；（ 2 ) 含蛋白质水相的制备；（ 3 )将含磷脂相与含蛋白质水相混合，于温度 0 ~ 60'C、压力 400 - 40000 psi ( pound/square inch, 磅 /平方英寸）条件下，进行任选的挤出步骤，然后进行均质化处理。当有必要进行挤出步骤时，可采用挤出仪进行挤出，以获得所需粒度的脂质体，并能降低循环次数，挤出步骤的采用尤其适用于热敏性和压力敏感性活性物质的载入。挤出步骤之后，再进行均质处理。

与现有技术不同，本发明的含磷脂相的制备中，可不加入有机溶剂，而釆取直接将药物与磷脂、油脂混合溶解的方法。

本发明制备方法中所述的含蛋白质水相选用 0. 005-50% ( w/v )的蛋白质水溶液；优选为 0. 05%~30%；再优选为 0. 1%~10%。本发明对含 1 ~ 5%HSA (人血清白蛋白）水相对粒径的影响及不同浓度 H-SA所制备纳米粒的冻融稳定性做了进一步的阐述。结果见附图 1和对应的实施例。本发明制备方法中所述的蛋白质选自天然蛋白质或人工合成蛋白质及其衍生物。优选的方案是所述的蛋白质选自人血白蛋白、牛血清蛋白、卵清蛋白、血红蛋白及其衍生物、白蛋白衍生物（如半乳糖化白蛋白）和修饰猪血白蛋白（如 PEG修饰猪血白蛋白）中至少一种。

本发明含磷脂相的制备中所述的磷脂选自天然、半合成、全合成磷脂及其衍生物。优选的方案是所述的磷脂选自但不限于下述的大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、卵磷脂酰甘油（ EPG)、磷脂酸、心肌磷脂、鞘磷脂、磷脂酸丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油及其纳盐、二棕榈酰磷脂酰甘油及其钠盐、 L-cc -二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其钠盐、二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、双二硬脂酰磷脂酰甘油及其钠盐、双二棕榈酰磷脂酰甘油及其钠盐、双二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其钠盐、双二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰花生四烯酰磷脂酰胆碱、 DSPE-PEG、 DPPE- PEG、 DMPE-PEG 和 DLPE-PEG 中至少一种，其中所述 DSPE-PEG, DPPE - PEG、 DMPE_PEG、 DLPE-PEG 中 PEG 的分子量为 100 - 10000。也可包括其它类别的 PEG 衍生物，如： PEG- THS、 PEG - CHS、 PEG-CHM, 其结构式如图 2所示。本发明所述的均质化处理，优选的方案是高压均质化或微射流均质化。其中高压均质化处理过程为：将粗制乳剂在 1, 000 - 40, 000 psi 的压力下高压均化并再循环 1-20个周期以形成理想的乳剂。优选的压力是 2， 000 ~

20, 000 psi , 更优选的压力为 8, 000 ~ 16， 000 psi。粗制乳剂优选再循环 1-15 个周期，更优选再循环 1 ~ 5个周期。

本发明人在实施例中指明了不采用探头超声法制备纳米粒制剂的原因，同时也验证了磷脂的重要性。这与美国发明申请 US2007082838A1 中否定了磷脂的作用是截然不同的。也证明磷脂中加入其它表面活性剂或者脂质类物质的合理性，这与中国专利申请 CN20031023461. X中否定了表面活性剂的作用也是截然不同的。

在本发明具体实施方式的优选实施例中采用了高压均质化处理或微射流均质化处理；也可以先进行挤出，控制任意所需粒度，然后进行均质处理。

本发明的制备方法还可以包括冷冻干燥或喷雾干燥，所得到的块状物或粉末可以进一步制备成其它所需的制剂类型。其中冷冻干燥或者喷雾干燥使用的赋形剂选自蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、右旋糖苷、海藻糖、木糖醇、麦芽糖、果糖、蛋白、壳聚糖、甘氨酸、枸橼酸和氯化钠中的至少一种。

在制剂的冷冻干燥过程中，冻干保护剂（冻干赋形剂）的选择较为重要。它不仅起到冻干制剂的骨架作用，而且能促进微粒制剂再分散。

冷冻干燥分为两个阶段：升华干燥（第一阶段干燥）和解析干燥（第二阶段干燥）。升华干燥的时间长短与产品的品种及分装的厚度有关。第一阶段干燥除去全部水分的 95 %左右。第一阶段干燥完成时可见到升华交界面逐步前进到容器底部并消失。第二阶段干燥主要是除去部分结晶水和吸附于固体物质晶格间隙或以氢键方式结合在一些极性基团上的结合水，这部分结合水吸附能高，必须提供足够的能量（足够的温度和真空度）才能将其解吸出来。

实验发现，如果第一阶段干燥时间太短，冰晶升华不完全，影响冻干产品的外观。升华干燥的时间达到 12 小时，然后继续解析干燥 2-3小时，即可得到外观平整、质地疏松的冻干制品，加水后能迅速分散均匀。

经过上述考察，最终确定的冻干工艺如下： - 74°C预冻 8小时 —— 35°C 抽真空 20分钟，最后真空度达到约 15 Pa ► 温度升高至- 20°C , 保持 12小时（此阶段除去样品中的大部分水分） _►温度升高至 10°C , 保持 2 ~ 3小时 (此阶段除去样品中残留的水分）。 + 本发明人在优选的实施例中对冻干保护剂的使用及联合使用均做了考察。具体结果见对应实施例的说明内容。

在本发明具体实施方式的一个优选实施例中包括冷冻干燥，冷冻干燥选用蔗糖、海藻糖、乳糖、木糖醇、麦芽糖等作为冻干赋形剂。

本发明的制备方法还可以包括过滤除菌。本发明所得到的纳米粒、乳剂，非常容易经过微孔滤膜过滤除菌。但是，美国发明专利申请 US2007082838A1, 在制备多西他赛白蛋白纳米粒时，由于制备的粒度不均匀（本发明人反复证明，此专利申请所述的方法存在此问题），需要釆用分别经过 Ι μ π 0. 8 μ πι、 0. 6 μ m , 0. 4 μ m , 0. 2 μ m微孔滤膜过滤，逐步除去大粒子，最终实现 0. 2 μ ηι除菌过滤目的。该美国专利申请工艺不仅存在操作复杂、费时，而且会造成药物含量的损失，不同生产批次之间的波动，不重现等一系列问题。

在本发明具体实施方式的优选实施例中包括 0. 2 μ m微孔滤膜过滤除菌。本发明提供的给药系统能用于降低药物至少一种副作用，所述的副作用包括静脉刺激、静脉炎、疼痛、骨髓抑制、神经毒性、过敏、炎症、皮肤刺激等。

本发明的给药系统可以实现注射（包括静脉、动脉、关节腔、皮下、皮内、肌肉注射等）、口服（包括舌下、口腔粘膜）、腔道（包括眼睛、鼻腔、耳道、气管、肺部、直肠、阴道、尿道等栓剂）、皮肤等途径给药。适于阴道给药的制剂可以为阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾剂制剂，其除了活性成分以外还含有诸如本领域已知的适当载体。

本发明给药系统中可以设计的药物（广义上的）包括药理活性物质及其药学上可接受的赋形剂。所述的药理活性物质包括药物（狭义上的）、诊断试剂及营养物质，其中药物选自抗癌药物、麻醉类药物、心血管类药物、抗高血压药、抗炎药、抗关节炎药、抗喘药、镇痛药、免疫抑制剂、抗真菌剂、抗心率失常药、抗生素、激素类药物等。

本发明给药系统中设计的药物选自并不限于下面所列举的物质：镇痛剂 / 解热剂（如：阿斯匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生钠、盐酸叔丁啡、盐酸丙氧酚、萘磺酸丙氧酚、盐酸哌替啶、盐酸二氢吗啡酮、硫酸吗啡、盐酸羟考酮、磷酸可待因、酒石酸二氢可待因、盐酸镇痛新、重酒石酸二氢可待因酮、酒石酸左啡诺、二氟尼酸、水杨酸三乙醇胺、盐酸纳布啡、甲芬那酸、环丁吗喃醇酒石酸盐、水杨酸胆碱、布他比妥、柠檬酸苄苯醇胺、柠檬酸苯海拉明、甲氧异丁嗪、盐酸桂麻黄碱、眠尔通等）；麻醉剂（如：环丙烷、恩氟烷、氟烷、异氟垸、甲氧氟烷、一氧化氮、普鲁泊福（丙酚）等）；平喘药（如：氮卓司汀、酮替芬、 Traxanox等）；抗生素（如：新霉素、链霉素、氯霉素、头孢菌素、氨比西林、青霉素、四环素等）；抗抑郁药（如：甲苯噁唑辛、奥昔哌汀、盐酸多虑平、阿莫沙平、盐酸曲唑酮、盐酸阿米替林、麦普替林盐酸盐、硫酸苯乙肼、盐酸去甲丙咪嗪、盐酸去甲替林、硫酸反苯环丙胺、盐酸氟西汀、盐酸多虑平、盐酸米帕明、双经水杨酸米帕明、去甲替林、盐酸阿米替林、异唑肼、盐酸去甲丙咪嗪、马来酸三甲丙咪嗪、盐酸普罗替林等）；抗糖尿病药 (如：双胍类、激素、硫酰脲衍生物类等）；抗真菌药（如：灰黄霉素、酮康唑、两性霉素 B、制霉菌素、杀念菌素等）；抗高血压药（如：普萘洛尔、普罗帕酮、烯丙氧心安、硝苯吡啶、利血平、樟脑磺酸咪噻芬、盐酸酚苄明、帕吉林盐酸盐、脱甲氧利血平、二氮嗪、硫酸胍乙啶、长压定、萝芙木碱、硝普钠、缓脉灵、蛇根混合碱、甲磺酸酚妥拉明、利血平等）；抗炎药（如： [非甾体类] 消炎痛、萘普生、布洛芬、 r am i f _{e n a z o n e}、炎痛喜康； [类固醇类]皮质酮、地塞米松、地塞米松棕榈酸酯、氟噁米松、氢化可的松、强的松龙、强的松等）; 抗肿瘤药（如：蒽环类抗生素，盐酸阿霉素、环磷酰胺、放线菌素、博来霉素、正定霉素、阿霉素、表阿霉素、丝裂霉素、甲氨喋呤、 5-氟尿嘧啶、铂类药物，如卡铂、草酸铂、依铂、乙酸铂、顺铂、卡氮芥（ BCNU)、甲基 -CCNU、鬼臼乙叉甙、依托泊苷、干扰素、喜树碱及各种其衍生物、苯芥胆甾醇、紫杉酚（ Taxo l ) 及其衍生物，多西他赛及其衍生物，长春碱、长春新碱、长春瑞宾及其衍生物、三苯氧胺、哌酰硫垸、四环三萜类化合物、等）；抗焦虑药（如：氯羟去甲安定、盐酸丁螺环酮、环丙二氮卓、盐酸利眠宁、去甲羟安定、安定羧酸钾盐、安定、双羟萘酸羟嗪、盐酸羟嗪、阿普唑仑、氟哌利多、哈拉西泮、芬那露、丹曲林等）；免疫抑制剂（如：环孢菌素、硫唑嘌呤、咪唑立宾、 FK5 06 ( t a c ro l i mu s ) 等），抗偏头痛药（如：酒石酸麦角胺、盐酸萘心安、半乳糖二酸异美汀、二氯醛安替比林等）；镇静剂 /催眠剂（如：巴比妥类 [如戊巴比妥、戊巴比妥纳、司可巴比妥纳 ] ; 苯二氮卓类 [如氟西泮盐酸盐、三唑仑、托马西泮 ( t oma zepa rm) , 咪达唑仑盐酸盐等] )；抗心绞痛药（如： β -肾上腺能拮抗剂；钙通道阻滞剂（如：硝苯吡啶、盐酸硫氮卓酮等）；硝酸盐类〔如：硝酸甘油、硝酸异山梨醇酯、硝酸戊四醇酯、丁四硝酯等〕）；抗精神病药（如：氟哌啶醇、琥珀酸洛沙平、盐酸洛沙平、硫利哒嗪、盐酸甲硫哒嗪、替沃噻吨、盐酸氟奋乃静、氟奋乃静癸酸酯、氟奋乃静庚酸酯、盐酸三氟拉嗪、盐酸氯丙嗪、奋乃静、柠檬酸锂、丙氯拉嗪等）；抗躁狂药（如：碳酸锂）；抗心律失常药（如：溴苄铵甲苯磺酸盐、艾司洛尔盐酸盐、盐酸维拉帕米、乙胺碘呋酮、恩卡胺盐酸盐、地高辛、洋地黄毒甙、盐酸美西律、吡二丙胺磷酸盐、盐酸普鲁卡因胺、硫酸奎尼丁、葡萄糖酸奎尼丁、奎尼丁聚半乳糖醛酸盐、醋酸氟卡胺、盐酸妥卡胺、盐酸利多卡因等）；抗关节炎药（如：保泰松、舒林酸、青霉胺、水杨酰水杨酸、炎痛喜康、硫唑嘌呤、消炎痛、甲氯灭酸钠、硫代苹果酸金钠、苯酮苯丙酸、金诺芬、硫代葡萄糖金、痛灭定等）；抗痛风药（如：秋水仙碱、别嘌醇等）；抗凝剂（如：肝素、肝素钠、华法令钠等）；血栓溶解剂（如：尿激酶、链激酶、重组纤溶酶原激活剂等）、阿加曲班；抗纤溶剂（如氨基己酸）；血液流变学药物（如己酮可可碱）；抗血小板药物（如：阿斯匹林、安匹林、 a s c r i p t i n等）；抗惊厥药（如：丙戊酸、二丙戊酸钠、苯妥英、苯妥英钠、氯硝安定、去氧苯比妥、苯巴比妥、苯巴比妥钠、卡马西平、异戊巴比妥钠、甲琥胺、甲基巴比妥、甲基苯巴比妥、美芬妥英、苯琥胺、对甲双酮、乙苯妥英、苯乙酰脲、司可巴比妥钠、氯氣卓二钾、三甲双酮等）；抗巴金森药物（如：乙酰胺等）；抗组胺药 /止痒剂（如：盐酸羟嗪、盐酸苯海拉明、扑尔敏、马来酸溴苯吡胺、盐酸赛庚啶、特非那丁、富马酸氯苯苄咯、盐酸吡咯胺、马来酸卡比沙明、盐酸二苯拉林、酒石酸苯茚胺、马来酸哌吡庚啶、苄吡二胺、马来酸右旋氯苯吡胺、盐酸甲地嗪、酒石酸异丁嗪等）；用于钙调节的药物（如：降血钙素、甲状旁腺素等）；抗菌素（如：硫酸丁胺卡那霉素、氨曲南、氯霉素、棕搁酸氯霉素、琥珀酸氯霉素钠、盐酸环丙沙星、盐酸克林霉素、棕搁酸克林霉素、磷酸克林霉素、甲硝唑、盐酸甲硝唑、硫酸庆大霉素、盐酸林可霉素、硫酸妥布拉霉素、盐酸万古霉素、硫酸多粘菌素 B、多粘菌素 E 甲磺酸钠、硫酸多粘菌素 E等）；抗病毒药物（如： Y干扰素、叠氮胸苷、盐酸金刚垸胺、利巴韦林、无环鸟苷、恩替卡韦等）；抗微生物药物（如：头孢菌素（如：头孢唑啉钠、头孢拉定、头孢克罗、头孢匹林钠、头孢唑肟钠、头孢哌酮钠、头孢替坦二钠、头饱呋肟酯、头孢噻肟钠、一水合头孢羟氨苄、头孢他啶、头孢氨苄、头孢噻吩钠、盐酸一水合头孢氨苄、头孢孟多钠、头孢西丁钠、头孢尼西钠、头孢雷特、头孢三嗪钠、头孢他啶、头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢呋新钠等）；青霉素类（如：氨苄西林、阿莫西林、苄星青霉素 G、邻氯青霉素、氨苄青霉素钠、青霉素 G钾、青霉素 V钾、氧哌嗪青霉素钠、苯唑青霉素钠、盐酸氨节青霉素碳酯、邻氯青霉素钠、替卡西林钠、阿洛西林钠、羧茚青霉素钠卡茚西林、青霉素 G钾、普鲁卡因青霉素 0、甲氧西林钠、新青霉素 III钠等），红霉素类（如：琥乙红霉素、红霉素、无味红霉素、乳糖醛酸红霉素、红霉素硬脂酸酯、琥乙红霉素等），四环素类（如：盐酸四环素、盐酸强力霉素、盐酸二甲胺四环素等），等）；抗感染剂（如： GM- CSF) ; 支气管扩张剂（如：拟交感神经类（如：盐酸肾上腺素、硫酸异丙喘宁、硫酸特布他林、乙基异丙肾上腺素、甲磺酸乙基异丙贤上腺素、盐酸乙基异丙肾上腺素、硫酸舒喘灵、舒喘灵、甲磺酸双甲苯苄醇、盐酸异丙肾上腺素、硫酸特布他林、酒石酸肾上腺素、硫酸异丙喘宁、肾上腺素、酒石酸肾上腺素）；抗胆碱能药（如：溴化异丙托品）；黄嘌呤类（如：氨茶碱、喘定、硫酸异丙喘宁、氨茶碱）；肥大细胞稳定剂（如：色甘酸钠），；吸入皮质激素类（如：氟尼缩松倍氯米松、一水合二丙酸倍氯米松），舒喘灵，二丙酸倍氯米松（ BDP)，溴化异丙托品，喘乐宁，酮替芬，沙米特罗， x i na f oa t e , 硫酸特布他林，去炎松，氨茶碱，萘多罗米钠，硫酸异丙喘宁，舒'喘灵，氟尼缩松等）；激素（如：雄性激素类（如：达那唑，环戊丙酸睾酮，氟甲睾酮，乙基睾酮，庚酸睾酮，甲基睾酮，氟甲睾酮，环戊丙酸睾酮），雌激素类（如：雌二醇，雌酮，结合雌激素），孕酮类（如：醋酸甲氧孕酮，醋炔诺酮），皮质类固醇类（如：去炎松，倍他米松，磷酸倍他米松钠，地塞米松，磷酸地塞米松纳，醋酸地塞米松，强的松，甲基强的松龙悬液，去炎松缩酮，甲基强的松龙，磷酸强的松龙钠，琥珀酸甲基强的松龙钠，琥珀酸氢化考的松钠，琥珀酸甲基强的松龙钠，六氯化曲安缩松，氢化可的松，环戊丙酸氢化可的松，强的松龙，醋酸氟化可的松，醋酸帕拉米松，强的松龙叔丁乙酯，强的松龙醋酸酯，强的松龙磷酸纳，琥珀酸氢化可的松钠等），甲状腺激素类（如：左旋甲状腺素钠等），等）；降糖药物（如：人胰岛素，纯化牛胰岛素，纯化猪胰岛素，优降糖，氯磺丙服，格列吡嗪，曱磺丁脲，甲磺氮卓脲等）；降脂药物（如：安妥明，右旋甲状腺素钠，丙丁酚，美降脂，烟酸等）；蛋白质（如：脱氧核糖核酸酶，藻酸酶，超氧化歧化酶，脂肪酶等）；核酸（如：编码任何治疗用蛋白质的正义或反义核酸，包括这里提到的任何蛋白质等）；用于刺激红细胞生成的药物（如：红细胞生成素）；抗溃疡 /抗返流药物（如：法莫替丁，甲氰咪呱，盐酸雷尼替丁等）；抗恶心 /止吐药物（如：盐酸美克洛嗪，大麻隆，丙氯拉嗪，承暈宁，盐酸异丙嗪，硫乙哌丙嗪，东莨菪碱等）；脂溶性维生素（如：维生素 A， D， E , K 等）；钙三醇；还有其它药物如：米托坦，亚硝脲盐，甲基羟基玫瑰树碱等。尚可以包括维替泊芬、蟾酥毒基、蟾毒灵（buf a l i n)、雷公藤内酯醇、西多福韦、双环醇及其衍生物、联苯双酯及其衍生物、甘草酸、苦参素、氨氯地平、左甲状腺素钠、甲磺酸二氢麦角碱、硝酸布康唑、美洛昔康、鲁比特康、培美曲塞、单唾液酸四己糖神经节苷脂 GM1、葛根素、吉西他滨、石杉碱甲、草乌甲素、力达霉素、海参提取物、哈士蟆等。

已有文献将 HSA 作为乳化剂，对氯仿等油相进行乳化，在高剪切力作用下，使得 HSA 的蛋白质通过二硫键交联而形成蛋白纳米粒，现有技术的问题是很难制备稳定且粒度较小的纳米粒。

在本发明具体实施方式的优选实施例中分别选用了葫芦素、多西他赛、 10- 羟基喜树碱、两性霉素 B、丙泊酚、恩替卡维和紫杉醇等药物。

另外，尚可以利用蛋白质-磷脂制剂中存在的脂质体结构而采用硫酸铵梯度、 pH梯度、离子梯度等手段装载药物，优选的药物可选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、拓扑替康、米托蒽醌、长春新碱或长春瑞宾等。

本发明的给药系统可以以任何适当的方式用于人体或用于动物。优选的方案是将包含本发明给药系统的药物组合物通过静脉内给药、动脉内给药、肌内给药、口服给药、吸入肺内给药、气管内给药、皮下给药、眼内给药、膀胱内给药或经皮给药。

由于釆用中国专利申请 CN20031023461. X 中报道的方法存在问题，我们以最大的努力，均不能制备出文献所指的蛋白纳米粒。此外，现有工艺中采用了大量的有机溶媒一一氯仿、二氯甲垸等，其毒性大，考虑到环境保护问题及工作人员的劳保问题，本发明人建立的技术平台，可以大大减少有毒溶剂的使用，甚至不采用有毒溶剂。另外，由于在发明中釆用了磷脂，从而使得蛋白纳米粒的载药范围大大扩大，并且粒度也降低了，可以采用微孔滤膜过滤除菌。也因为在处方中加入了磷脂或其它脂质，从而可以利用这些脂质成分来负载一些含有亲脂性基团的配体、抗体及其衍生物，实现主动靶向递药目的。我们通过长期的大量试验，发现将磷脂与蛋白结合，可以得到令人惊奇的结果，所制备的纳米制剂的稳定性大大提高，粒度可以随意调整，更为重要的是，可以通过各种方法将各种配体、抗体等主动识别头基插入纳米制剂中，得到更为有价值和意义的药物递送系统。

特别是对于肿瘤， HSA能够与血管内皮细胞膜上的白蛋白受体 Gp60结合，启动细胞窖（ caveolae ) 介导的白蛋白转运，携带药物透过血管内皮。在肿瘤组织中 SPRAC ( Secreted Protein Acidic and Rich in Cystein, 富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白）表达通常会增强。 SPRAC是一种非结构性的细胞骨架蛋白，在组织的塑造和胚胎发育以及癌细胞的入侵和转移过程中，与细胞基质的相互作用有关。 SPRAC与 Gp60具有同源序列，也能够与白蛋白结合，这样就使 HSA 纳米粒容易在肿瘤组织中蓄积，形成药物储库，提高了药物杀伤肿瘤细胞的靶向性。体外细胞培养试验也表明 HSA纳米粒提高了药物与肿瘤细胞的亲和力。

此外，本发明给药系统在磷脂的帮助下，可以单独使用与水相分散，可以不需要溶剂的加入，很容易实现纳米分散。

在本发明具体实施方式的优选实施例中分别选用了人血白蛋白（ HSA)、牛血清蛋白、猪血蛋白、鸡蛋清蛋白、玉米蛋白和 PEG猪血蛋白等。

在本发明具体实施方式中的一个优选实施例中选用了蛋黄卵磷脂（ EPC ); 在另一个优选实施例中选用了大豆卵磷脂（ SPC ); 在另一个优选实施例中选用了二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（ DMPC ) 和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（ DMPG ); 在另一个优选实施例中选用了 HSPC和 DSPG; 在另一个优选实施例中选用了卵磷脂和 D0PC ; 在另一个优选实施例中选用了卵磷脂；在另一个优选实施例中选用了二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（ DMPG ); 在另一个优选实施例中选用了 TPGS , PEG-CHS 等。

在本发明具体实施方式中的一个优选实施例中选用了乙醇；另一个优选实施例中选用了甲基吡咯烷酮或者甲基吡咯烷酮 /甲醇混合溶剂；另一个优选实施例中选用了甲醇；另一个优选实施例中选用了叔丁醇；另一个优选实施例中选用了异丙醚。

本发明与现有技术相比其优点主要体现在以下几个方面：

1、通过将磷脂与蛋白质联合应用，大大提高制剂生产的可行性，特别是不釆用有毒或者毒性大的有机溶剂，而采用低毒的有机溶剂，甚至可以不釆用有机溶剂； '

2、由于与脂质体技术结合，在脂质体表面或者脂质体表面与内部包被 /包覆了以二硫键交联的蛋白层，大大提高脂质体的稳定性；

3、利用脂质体的特点，大大扩大现有的蛋白纳米粒载药范围，如硫酸长春新碱、阿霉素、拓扑替康、胸腺五肽、胰岛素、 bFGF等（原有的专利中，如 CN 031 08 361. 7A、 US 2007 0828 38 A 1仅可以适用于水难溶性药物）；

4、现有技术制备含有蛋白的纳米粒时，分散循环数次多，最少在高压下循环 5次（如中国专利申请 CN2 0031 012 346 1. X ), 最多者达到 1 5次以上，如此会增加蛋白变性的机会，加大成本，本发明技术减少分散次数，最优处方工艺仅需要循环 1 ~ 5个周期；

5、降低分散压力：一般现有工艺需要大于 20000p s〖的压力，本发明的优选工艺中小于 2 0000ps i 的压力就可以获得同样甚至更小粒径的分散系统；

6、可以利用磷脂的良好分散能力制备液体型的含有磷脂-蛋白质的给药系统，而且稳定性能好，由现有工艺的数小时延长至数十小时，甚至数十天。

7、磷脂本身也属于表面活性剂，磷脂的加入，使得在整个系统中可以加入其它各种表面活性剂，并且因为其它表面活性剂的加入，又进一步大大降低了粒度，减少磷脂用量，降低成本，也确保给药系统的制备简单、适用。

8、由于合理利用磷脂的价值，可以随意地采用外插入法将各种配体及其衍生物、抗体及其衍生物插入纳米粒中，进一步提高靶向性。

9、由于合理利用磷脂的价值，可以先制备含油类的纳米粒，或者将挤出工艺技术结合起来，即先在高压下或者采用挤出工艺降低粒度，任意获得所需要的粒度大小，随后外加入蛋白，高压下分散循环 1 - 2 次即可，大大降低蛋白变性的可能，确保蛋白活性，也大大降低蛋白的用量。

1 0、由于合理利用磷脂的价值，可以将磷脂与蛋白、辅料、药物混合，分散，特别是采用挤出工艺，在温和的条件下降低至所需粒度，最后在低压下分散处理，制备所需蛋白纳米粒（蛋白纳米囊泡）（例如，采用含有蛋白质的水相水化磷脂，进行挤出，控制任意所需粒度，然后进行均质处理），非常适合对压力和 /或高热敏感的药物。附图说明

图 1是本发明釆用不同浓度 HSA 的 CuB (葫芦素 B )制剂粒度的冻融考察。图 2 示出 PEG-THS、 PEG - CHS和 PEG-CHM的结构式。

图 3是本发明 "实施例 12" 的纳米制剂粒径分布图。

图 4是本发明 "实施例 12" 的纳米制剂放置 30天后粒径分布图。

图 5是本发明 "实施例 25" 的纳米粒径照片图。

图 6是本发明 "实施例 32" 的脂质体照片图。

图 7是本发明葫芦素 B溶液对 Hep- 2 细胞（人喉癌上皮细胞）增殖抑制作用影响的示意图。

图 8是本发明 CuB HSA纳米粒、 CuB /HSA溶液在不同剂量下对 Hep2 (人喉癌上皮细胞）细胞增殖抑制作用影响的示意图。

图 9是本发明 CuB HSA纳米粒、 CuB /HSA溶液在不同剂量下对 A549 (人肺腺癌细胞）增殖抑制作用的影响示意图。

图 10 是本发明 CuB HSA纳米粒、 CuB /HSA溶液在不同剂量下对 HepG2 (人肝癌细胞）增殖抑制作用影响的示意图。

图 11 是本发明葫芦素 B HSA 纳米粒与乳剂、脂质体对不同肿瘤细胞生长抑制作用的比较示意图。具体实鉋方式

下面结合实施例更具体地说明本发明。应当理解，下面的实施例用于说明本发明内容而非限定本发明内容，任何形式上的变动和 /或变通只要符合本发明精神都将落入本发明的保护范围之内。实施例 1 探头超声法制备葫芦素 HSA 纳米粒的问题

葫芦素 B 0. Olg

HSA 4g

水适量

将葫芦素 B (纯度大于 98%)用 1ml 乙醇溶解，备用；处方量的 HSA用水溶解制备成 4% ( g/ml ) 的溶液。将 HSA溶液加入到葫芦素 B 乙醇溶液中，分散后，置于超声仪中。先经 200W超声处理，随后釆用 600W超声分散 5min，得乳状液。旋转蒸发除去有机溶剂。所得纳米粒的平均粒径为 282.2nm, 分布很宽，不能通过 0.45 μ m 的微孔滤膜，放置 20分钟即有沉淀产生，系统不稳定。冻干后再分散性差，难以恢复到冻干前的状态，复溶后的粒度大于 400 nm„

实施例 2 加入磷脂解决探头超声法制备葫芦素 HSA 纳米粒存在的问题

葫芦素 B 0. Olg

HSA 4g

S100 1.5g

水适量将葫芦素 B (纯度大于 98%)与 S100 (大豆卵磷脂， SPC，德国 LIPOID公司）用 1ml 乙醇溶解，备用；处方量的 HSA用水溶解制备成， 4%的溶液。将 HSA溶液加入到葫芦素 B/磷脂的乙醇溶液中，分散后，置于超声仪中。先经 200W超声处理，随后采用 600W超声分散 5min, 得乳状液。旋转蒸发除去有机溶剂。所得纳米粒的平均粒径为 156nm, 分布窄，能通过 0.45 μ πι、 0. 3 μ ι 的微孔滤膜，放置 60 分钟未产生沉淀，系统稳定性大大提高。冻干后再分散性好，可以恢复到冻干前的状态，复溶后的粒度为 166 nm。

实施例 3 用叔丁醇溶解磷脂制备葫芦素 HSA 纳米粒

葫芦素 B O. Olg

HSA 4g

S100 1. 5g

水适量

将葫芦素 B (纯度大于 98%)与 S100(大豆卵磷脂， SPC 德国 LIPOID )用 5ml 叔丁醇溶解，备用；处方量的 HSA用水溶解制备成 4%的溶液。将 HSA溶液加入到葫芦素 B/磷脂叔丁醇溶液中，分散后，置于超声仪中。先经 200W超声处理，随后釆用 600W超声分散 5min，得乳状液。所得纳米粒的平均粒径为 139nm，分布窄，能通过 0.45 μ ηι、 0. 3 μ ιη 的微孔滤膜，放置 60分钟未产生沉淀，系统稳定性大大提高。冻干后再分散性好，可以恢复到冻干前的状态，复溶后的粒度为 157nm。

由于采用了叔丁醇，不需要减压除溶剂，直接进行冷冻干燥即可，工艺更为简单。

实施例 4 微射流法制备 CuB HSA 纳米粒时压力对粒度的影响

葫芦素 B O. Olg

HSA 4g

S100 1.5g

水适量

将葫芦素 B (纯度大于 98%)与 S100(大豆卵磷脂， SPC 德国 LIPOID )用 1ml 乙醇溶解，备用；处方量的 HSA用水溶解制备成 4%的溶液。将 HSA溶液加入到葫芦素 B/磷脂乙醇溶液中，分散后，置于微射流仪中进行均质化，考察压力与循环次数对粒度的影响。结果见表 1。

表 1分散压力与循环次数对粒度的影响

由此可见，分散压力从 800 psi提高到 8000 psi后，纳米粒的粒径显著减小，循环 2次即可获得小于 100 nm的纳米粒，但 8000 ps i 的循环次数增多并未使粒径产生显著性的降低，甚至在循环次数过多时略有增长。实施例 5 不同油相的考察

基本处方：

葫芦素 B 0. 05g

HSA 4g

S75 2g

油 2g

水适量

含有磷脂，磷脂与油的比例为 1: 1。

将葫芦素 B (纯度大于 98%)、油与 S75 (大豆卵磷脂， SPC 德国 LIPOID公司）加热溶解后，以 30ml水分散，均质机处理，获得平均粒度小于 200nm，备用；处方量的 HSA用水溶解制备成 5%的溶液。将 HSA溶液加入到葫芦素 B乳液中，混匀后，置于微射流仪（ 10000 psi循环 1次）中进一步均质分散。结果见下表 2。

表 2 不同油类物质对粒度的影响

可以获得平均粒径小于 200 nm的纳米粒。 MCT、油酸与结构油所制备的纳米粒的平均粒度最小。

实施例 6 不同量 MCT制备 CuB HSA纳米粒的冻融稳定性

按照 "实施例 5" 的处方与方法制备 MCT不同含量的 CuB HSA 纳米粒，并考察经过一次冻融（ - 30°C冷冻一夜，室温复融）处理后，测定其粒径变化。结果见表 3。

表 3 冻融稳定性试验结果

可以看出，随 MCT 用量的增加，所制备的 CuB HSA 纳米粒冻融后粒径增长幅度增大。特别是 MCT在处方中的量达到 3%时，纳米粒冻融后粒径增长更为显著。（ °/。的单位为 g/ml。 )

实施例 7 水相不同浓度 HSA对纳米制剂粒径的影响

基本处方：

葫芦素 B 0. Olg

HSA 适量

DLPC 2g

水适量

按照 "实施例 4" 的基本工艺，压力选择 12000psi, 循环 3次。

• ( 1 ) 水相中 1%HSA浓度：平均体积经 84.4nm， 0.22 μ m过滤后 87 · 9 nm; 冻融后粒度长至 246 nm。

( 2 ) 水相中 2%HSA浓度：平均体积经 91.5nm, 0.22 μ m过滤后 88.8 nm; 冻融后粒度变化成为 116 nm。

( 3 ) 水相中 3%HSA浓度：平均体积经 90.3nm， 0.22 μ m过滤后 90.6 nm; 冻融后粒度变化成为 121 nm。

( 4 ) 水相中 4%HSA浓度：平均体积经 91.8nm, 0.22 μ m过滤后 92.2nm。

( 5 ) 水相中 5%HSA浓度：平均体积经 93.6nm， 0.22 μ m过滤后 93.8nm。说明本发明中， HSA浓度对制剂的最终粒度没有显著性影响，但冻融后有影响。 1%、 Vk、 3%HSA的结果见图 1。

实施例 8 单一冻干保护剂的筛选

基本处方

葫芦素 B 0. Olg

按照 "实施例 4" 的基本工艺，压力选择 12000psi，循环 3次。所得纳米粒液体按照下列工艺进行冻干。

冻干工艺如下： - 70°C预冻 6小时，抽真空，至真空度达到 15Pa 以下（优选 5Pa 以下）， - 35 抽真空 6小时，随后在真空状态下，由- 35 °C至 1 (TC线性升温，持续时间 10小时， 10°C保存 2小时，即得。

分别选用海藻糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖作为葫芦素 HSA纳米粒的冻午保护剂。试验结果见下表，其中：

1 ) 冻干制剂的外观：表面平整，白色饼状，饱满，无结晶记为（ - ）；表面平整，白色饼状，饱满，有细小的鳞状结晶记为（ + )；饱满但有较长的针晶记为（ + + ); 冻干产品脱离瓶壁，整体呈针晶状记为（ + + + )。

2 ) 冻干制剂水化后的透光性：与冻干前（半透明，有明显的乳光）相同记为（ - ) , 比冻干前澄明度略有下降，但仍有明显的乳光记为（ + )，几乎不透明，略带乳光记为（ + + )。结果见表 4。

表 4. 单一冻干保护剂的筛选结果

很显然，加入保护剂的纳米粒冻融稳定性优于不加保护剂，加入保护剂的产品在水化后所获得的纳米粒均可以在 24 小时内稳定，其中加入甘露醇的制剂外观最好，水化时间：海藻糖、乳糖、葡萄糖优于甘露醇、蔗糖。（％的单位为 g/ml。）实施例 9 冻干保护剂联合使用的考察

纳米制剂制备方法同实施例 8，结果见下表 5。

可以看出，冻干保护剂的联合应用对纳米粒冻融稳定性有进一步改善， 10 小时之内均可稳定。其中 "6%甘露醇 + 3% 乳糖" 与 "7%甘露醇 + 3% 海藻糖" 作保护剂的冻干产品水化后，粒度在 48小时内没有发生变化。

实施例 10 多西他赛脂质体

分别称取多西他赛与磷脂（ EPCS, 德国 LIPOID公司；)，选择药脂重量比为 1: 15、 1: 20、 1: 25、 1: 30 和 1: 35 ( w/w), 按照经典薄膜法制备多西他赛脂质体。结果表明，当药脂比为 1: 15 与 1: 20 时， 6 ± 2°C冰箱内放置过夜即有药物晶体析出；药脂比为 1: 25和 1: 30时， 6 ± 2°C冰箱内放置 5天略有脂质体聚集现象，产生沉淀，而药脂比为 1: 35 时，脂质体稳定性良好，放置 15天未见有沉淀。

研究表明多西他赛与磷脂用量直接关系到脂质体的稳定性，药脂比过大，会超出脂质体双分子层的承载能力，导致药物析出，甚至无法形成性质稳定的脂质体。即使采用冷冻干燥技术进行冻干处理，所得冻干制剂也难以回复至冻干前状态。

实施例 11 说明采用氯仿溶剂制备蛋白纳米粒存在的问题

处方：

多西他赛 60 mg

氯仿 lml

600mg

制备：称取处方量的多西他赛，用 1ml氯仿溶解，所得溶液备用。取巿售 HSA注射液（人血白蛋白注射液），以水稀释配制成 2%的浓度，即 30ml 的 2%HSA 溶液。用 2%HSA 溶液对多西他赛氯仿溶液进行乳化，并于 20000psi 下进行分散。所得纳米分散液于减压下回收氯仿，余下分散液体难以通过 0.8 μ ιη微孔滤膜。放置约 3小时，产生沉淀。

实施例 12 说明磷脂的重要性

处方：

多西他赛 60 mg

无水乙醇 1.5ml

大豆卵磷脂（ SPC ) 1500 mg

HSA 600mg 制备：称取处方量的多西他赛、磷脂，用 1.5ml 无水乙醇溶解，所得溶液备用。取 HSA, 以水配制成 2%的浓度, 即 30ml 的 2%HSA溶液。将 2%HSA溶液加入药物 /磷脂乙醇溶液中，搅拌，并于 20000psi 下进行分散，得到半透明分散体。此分散体轻松通过 0.22 μ m微孔滤膜，实现除菌过滤目的。测定结果表明其粒度为 31.8nm (见图 3)。将其室温放置约 30小时无沉淀产生， 6 ± 2 °C冰箱放置 30天也无沉淀，粒度测定结果表明未发生变化（见图 4 ), 平均粒径为 31.2 nm。

实施例 13 含有磷脂-蛋白的多西他赛纳米粒

一、处方： 100ml

人血清白蛋白（ HSA ) 2g

蛋黄卵磷脂（ EPC ) 4g

无水乙醇 3ml

多西他赛（ Doc ) 0.2g

柠檬酸适量

蒸馏水加至 100 ml

二、按如下步骤的方法制备：

1、脂质相的制备

精密称取处方量的 EPC、 Doc, 置于烧杯中，加入乙醇（未特指的情况下，其浓度为 95%, 下同） 4mi，在氮气环境中溶解上述物质，混匀，得澄清溶液，即脂质相。

2、水相的制备

巿售人血清白蛋白（ 20%, W/V(g/ml) )用灭菌注射用水稀释成为 4%的溶液，以柠檬酸调节 PH至 4，即得。

3、分散

将水相加入至脂质相中，搅拌分散，即得乳状分散液体。

4、均质化

将上述液体转移至微射流仪中，于 400 ~ 12000psi进一步均质 5遍，即得。

5、测定其 pH为 5 ~ 6。通过 0.22 μ m微孔滤膜进行过滤除菌，分装，压盖，即得。测定粒度，其平均体积粒径为 160nm。

制剂稳定性良好，制备后的液体于冰箱（ 2-8°C ) 放置一个月未见分层、沉降，外观仍呈澄清透明。

此外，根据需要，可在处方中加入 10%蔗糖，按照 -8(TC预冻 4小时，抽真空 10小时， 3(TC保持 5小时即可得到冻干制剂。

将上述所得冻干制剂加水水化后，可以回复到冻干前的状态，平均体积粒径为 166nm。

实施例 13-1

处方配比同实施例 13, 具体操作也与实施例 13相同，不同之处在于采用 Lipoid E80(德国 LIPOID公司）代替蛋黄卵磷脂，试验结果类似于实施例 13。实施例 13-2

处方配比同实施例 13，具体操作也与实施例 13相同，不同之处在于采用 Lipoid S100 (德国 LIPOID公司）代替蛋黄卵磷脂，试验结果类似于实施例 13。实施例 13-3

处方配比同实施例 13, 具体操作也与实施例 13相同，不同之处在于釆用 Lipoid EPG (德国 LIPOID公司）代替蛋黄卵磷脂，试验结果类似于实施例 13。实施例 13-4

处方配比同实施例 13，具体操作也与实施例 13相同，不同之处在于釆用 Lipoid E DPPG (德国 LIPOID公司）代替蛋黄卵磷脂，试验结果类似于实施例 13。实施例 13-5

处方配比同实施例 13, 具体操作也与实施例 13相同，不同之处在于采用 Lipoid E DMPG (德国 LIPOID公司）代替蛋黄卵磷脂，试验结果类似于实施例 13。实施例 13-6

处方配比同实施例 13, 具体操作也与实施例 13相同，不同之处在于采用 Lipoid E DPPC (德国 LIPOID公司）代替蛋黄卵磷脂，试验结果类似于实施例 13。实施例 13-7

处方配比同实施例 13, 具体操作也与实施例 13相同，不同之处在于采用 Lipoid E DMPC (德国 LIPOID公司）代替蛋黄卵磷脂，试验结果类似于实施例 13。实施例 13-8

在实施例 13处方中加入 0. Olg吐温 80, 具体操作与实施例 13相同，试验结果类似于实施例 13。

实施例 13-9

在实施例 13处方中加入 0. lg吐温 80, 具体操作与实施例 13相同，试验结果类似于实施例 13。

实施例 13-10

在实施例 13处方中加入 0. OlgTPGS, 具体操作与实施例 13相同，试验结果类似于实施例 13。

实施例 14

处方：

10 -羟基喜树碱 10mg

DMPC lOOmg

DMPG 200mg

无水乙醇适量

HSA 3000mg

称取处方量的 10-羟基喜树碱、 DMPC、 DMPG置于梨形瓶中，加入适量乙醇，加热溶解。将所得溶液进行减压回收，药物与磷脂在瓶底形成一膜状结构。然后加入 50 ml 人血清白蛋白溶液（ 6% w/v ), 混合、水化。所得水化物于 9000-40, 000 psi 下进行乳化，循环 5个周期。所得制剂的平均粒度 116nm。

' 该分散体可以进一步冻干，得到饼块冻干制剂。通过加入无菌水或葡萄糖注射液或木糖醇注射液，重构为原有分散体。

应当认识到用于本实施例的药物、溶剂、蛋白质的量、类型和比率不受任何方式的限制。实施例 14-1

针对喜树碱类药物，如羟基喜树碱、喜树碱、 9-硝基喜树碱、 7-乙基 -10 羟基喜树碱等，尚可加入碱性物质（任何碱性物质，如氢氧化纳、碳酸钠、赖氨酸等）进行简单的 pH调节，使 pH值至大于 7.4 的方式来溶解药物，配成药物水溶液，然后与磷脂混合，釆用均质机或者超声分散，降低粒径至任意所需的粒径（如小于 lOOnm, 或者小于 50 _nin)。在获得含有药物的磷脂分散体后，重新加入酸性物质（任何酸性物质，如柠檬酸、乳酸、富马酸、酒石酸、乙酸、葡萄糖酸、乳糖酸、山梨酸、抗坏血酸、草酸、甲酸、苯磺酸、谷氨酸、天冬氨酸等）调节 pH值至小于 7.4, 再与 HSA混合，高压或者高强度超声分散一次即可，确保蛋白在脂质纳米粒表面或内部形成二硫键，稳定分布在纳米粒上。所得制剂可以注射、口服、外用。

其他操作同实施例 14。

实施例 15

处方：

两性霉素 B 50 mg

HSPC 213 mg

DSPG 84 rag

胆固醇（ CH ) 52 mg

甲基吡咯烷酮 /甲醇适量

生育酚 0.64 mg

HSA 400 mg

制备工艺：

将处方量的两性霉素 B、 HSPC, DSPG, CH、生育酚溶于甲基吡咯烷酮 /甲醇混合溶剂中，并减压除去有机溶剂，备用。将 400 mg HSA 溶于注射用水中，制备 1% ( w/v ) 的 HSA溶液。以 HSA溶液分散两性霉素 B混合物，所得分散液体在 8000- 20, 000 psi 下进行乳化循环至少 3 个周期，获得半透明分散体，平均直径为 110nm。可以采用常规方法进行冷冻干燥。

测定 H 5.0-6. 0。

实施例 16

处方：

骨化三醇 0. OOlg

DPPC 0.1 g

胆固醇 0. 01g

HSA 1 g

取处方量的骨化三醇、 DPPC、胆固醇，加入 0.5ml 甲醇溶解，备用；取处方量的 HSA,以注射用水溶解，配制成 1%溶液。将 HSA溶液加至骨化三醇与 DPPC、胆固醇的甲醇溶液中，搅拌，分散，显微镜观察为脂质体。将此脂质体在 60 °C温度下以挤出仪进行整粒，分别通过 0.4、 0.3、 0.22、 0.1、 0.05、 0.01 μ m 微孔滤膜三遍，将分散体系中粒径降至 30nm以下。过均质机进行进一步分散，使得脂质体表面与内水相中的 HSA在均质机的分散处理下形成二硫键，交联的蛋白对脂质体具有保护作用，进一步确保脂质体的长期储存稳定性。此系统中骨化三醇的浓度为 lmg/100ml,即 10 μ g/ lml。可以进一步加入注射用水至 1000 ml，药物浓度为 1 μ g/lml。如果需要冻干可以在处方中加入 5%甘氨酸（ W/V)，即 1000 ml 药物液体中加入 50g甘氨酸，按照常规方法进行冻干即可。

实施例 17

处方：

骨化三醇 0. OOlg

癸酸 1 g

DLPC 1 g

HSA 10 g

取处方量的骨化三醇、癸酸、 DLPC, 在氮气环境下，加热溶解，备用；取处方量的 HSA, 以注射用水溶解，配制成 3%溶液。将 HSA溶液水化含骨化三醇的脂质相，搅拌，分散，显微镜观察为乳剂。过均质机进行进一步分散，使得乳剂表面的 HSA在均质机的分散处理下形成二硫键，交联的蛋白对乳剂具有保护作用，进一步确保乳剂的长期储存稳定性。可以进一步加入注射用水至 1000 ml, 药物浓度为 1 μ g/lmK 如果需要冻干，可以在处方中加入 10%蔗糖（ g/ml ), 即 1000 ml 药物液体中加入 100g蔗糖，按照常规方法进行冻干即可。

实施例 18

处方：

两性霉素 B 50mg

二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC) 34 mg

二辛酰磷脂酰甘油 60 mg

柠檬酸 5 mg

人血清白蛋白 300 mg

制备：取处方量的两性霉素 B、 DMPC、二辛酰磷脂酰甘油，用适量甲醇溶解，减压回收甲醇。人血清白蛋白用蒸馏水配制而成为 4%的溶液，加入柠檬酸溶解，所得溶液加入至两性霉素 B 磷脂复合物中，水化，在 4(TC温度下依次通过 0.8、 0.6、 0.4、 0.2、 0.1、 0.05 μ m微孔滤膜，所得分散液体置于超声仪中进行超声处理（釆用 600W超声分散 lmin) ，促使蛋白生成二硫键。

处方中的柠檬酸可以用其它任何酸，如乳酸、富马酸、酒石酸、乙酸、葡萄糖酸、乳糖酸、山梨酸、抗坏血酸、草酸、甲酸、苯磺酸、谷氨酸、天冬氨酸等所代替，亦得到相同的结果。

实施例 19

处方：

丙泊酚 lOOmg

卵磷脂 lOOmg

DOPC 300mg

EDTA-2Na 5mg

人血清白蛋白 300rag

制备方法：称取处方量的丙泊酚卵磷脂 D0PC, 氮气环境下，加热溶解，备用；人血清白蛋白用蒸馏水配制而成为 4%的溶液，加入 EDTA-2Na, 溶解，所得溶液加入至丙泊酚磷脂中，水化，在 40°C温度下依次通过 0.8、 0.6、 0.4、 0.2、 0.1、 0.05 μ ίη微孔滤膜，所得分散液体置于超声仪中进行超声处理，先经 200W超声处理，随后釆用 600W超声分散 5min, 得乳状液。平均粒径 69_nm。

此外，加入 0.2% ~ 20% ( W/V ) 的 DSPE- PEG, 釆用外插入方法，可制备 PEG 包衣的蛋白纳米粒。

实施例 20 丙泊酚纳米制剂（ 100ml )

处方：

丙泊酚 lg

MCT 3g

SPC lg

EDTA-2Na 0.005g

人血清白蛋白（ HSA ) 3g

制备方法：称取处方量的丙泊酚、 SPC、 MCT, 氮气环境下，加热溶解，备用；将处方量的人血清清蛋白（ HSA)、 EDTA- 2Na 以注射用水配制 ' 5°/。HSA溶液，通过滤器（ 0.2 μ m滤器）过滤除菌，得水相。将水相加入至油相中，并在 10, 000 RPM分散 2 分钟，得到粗乳。将粗乳剂在 28, 000 psi 下高压均化并在 4 'C再循环 2个周期，得到最终乳剂。补加注射用水至 100ml, 混匀，过滤（ 0.2 μ ιη 滤器）、分装，充氮气，封口。粒径小于 200nm。

实施例 21

处方：

丙泊酚 lg

结构油 3g

DMPG 5g

人血清白蛋白 10g

制备方法同 "实施例 20"。

此外，加入 0.2% ~ 20% ( W/V ) 的 DPPE- PEG, 采用外插入方法，可制备 PEG 包衣的蛋白纳米粒。

实施例 22

处方：

丙泊酚 lg

结构油 lg

TPGS 5g

人血清白蛋白 3g

制备方法同 "实施例 20"。

此外，加入 0.2%~ 2% ( W/V ) 的 DSPE- PEG, 采用外插入方法，可制备 PEG 包衣的蛋白纳米粒。处方：

恩替卡韦 0.5g

D0PG 5g

HSA 5g

蔗糖 10g

水加至 100ml

制备：将处方量的恩替卡韦、 D0PG用少量甲醇溶解，所得溶液备用。配制 10% HSA、 20%蔗糖溶液，加入上述药物磷脂溶液中，分散， 4000 ~ 40000psi 均质处理，得到粒度小于 lOOnm的液体、加水至 lOO ral, 混匀，即得。可采用冷冻工作或者喷雾干燥制备固体。

制剂稳定性良好，制备后的液体于冰箱（ 2-8°C ) 放置一个月未见分层、沉降，外观仍呈半透明。

实施例 24 葫芦素 E (纯度大于 95% )

处方组成（ 100ml, 葫芦素 E的浓度为 0. lmg/ml )

葫芦素 E 0.01g

油 ( MCT ) ig

0. lg

HSA 5g

甘露醇 6g

葡萄糖 1 g

水适量

制备：将处方量的葫芦素 E、 MCT、 S75 ( Lipoid S 75, 上海东尚实业有限公司）加热溶解，备用；取处方量的甘露醇、葡萄糖，加入注射用水 50ml 溶解，加入少量活性炭除热原，冷却后，加入 25ml 巿售的 20%HSA, 混匀，所得溶液过滤除菌。将所得的含有 HSA 的水溶液加入油相，分散，继续在 1000 ~ 20, 000 psi 下高压均化循环 5个周期，得到最终乳剂。过滤（ 0.2 μ ra滤器）、分装，冻干，充氮气，封口。平均粒径小于 300nm。

冻干工艺：预冻： - 74°C , 4h; 抽真空进行干燥。第一阶段干燥： -3(TC , 60min; 第二阶段干燥： _20°C , 12h; 保温： 15 °C , 5h。

实施例 24-1

其他操作同实施例 24。不同的是在处方中加入常规量的抗氧化剂，如生育酚、维生素 C或者 EDTA-2Na。

实施例 24-2

其他操作同实施例 24-1。不同的是将处方中的葫芦素 E换成当量相当的葫芦素提取物（包括巿售葫芦素 BE原料）、葫芦素 A、葫芦素 B、异葫芦素 8、双氢葫芦素 8、葫芦素（：、葫芦素 D、异葫芦素 D、双氢葫芦素 D、异葫芦素 6、双氢葫芦素 E、葫芦素 F、葫芦素 I、四氢葫芦素 I或葫芦素（}。

实施例 25 葫芦素 I (纯度大于 95% )

处方组成（ 100ml, 葫芦素 I的浓度为 0. lmg/ml )

葫芦素 I o. oig 结构油 lg

磷脂（ S75 ) ig

生育酚 0. Olg

HSA 5g

海藻糖 10g

水适量

制备：将处方量的葫芦素 I、结构油、 S75 ( Lipoid S 75, 上海东尚实业有限公司）、生育酚加热溶解，备用；取处方量的海藻糖，加入注射用水 50ml 溶解，加入少量活性炭除热原，冷却后，加入 25ml 巿售的 20%HSA, 混匀，所得溶液过滤除菌。将所得的含有 HSA的水溶液加入油相，分散，继续在 1000 - 20, 000 psi 下高压均化循环 3个周期，得到最终乳剂。过滤（ 0.2 μ m滤器）、分装，冻干，充氮气，封口。平均粒径小于 200nm。见图 5。

冻干工艺：预冻： - 74°C , 4h; 抽真空进行干燥。第一阶段干燥： - 30°C， 30rain; 第二阶段干燥： - 20°C , 12h; 保温： 15°C , 5h。

其他操作同实施例 24- 1。不同的是将处方中的葫芦素 E换成葫芦素提取物 (包括巿售葫芦素 BE原料）、葫芦素 A、葫芦素 B、异葫芦素 8、双氢葫芦素 B、葫芦素 C、葫芦素 D、异葫芦素 D、双氢葫芦素 D、异葫芦素 £、双氢葫芦素 E、葫芦素 F、葫芦素 E、四氢葫芦素 I或葫芦素 0。

实施例 25 - 1

其他操作同实施例 25。不同的是在处方中加入常规量的抗氧化剂，如生育酚、维生素 C或者 EDTA_2Na。

实施例 25-2

其他操作同实施例 25-1。不同的是将处方中的葫芦素 I 换成葫芦素提取物、葫芦素 A、葫芦素 B、异葫芦素 8、双氫葫芦素 B、葫芦素（：、葫芦素 D、异葫芦素 D、双氢葫芦素 D、异葫芦素 6、双氢葫芦素 E、葫芦素 F、葫芦素 E、四氢葫芦素 I或葫芦素 Q。

实施例 26 葫芦素 Q (纯度大于 95% )

处方组成（ 100ml , 葫芦素 Q的浓度为 0. lmg/ml )

葫芦素 E 0. Olg

结构油 0. lg

MCT 0.4g

磷脂（ S75 ) 5g

HSA lg

海藻糖 10g

木糖醇 2g

水适量

制备：将处方量的葫芦素 Q、结构油、 MCT 、 S75 ( Lipoid S 75, 上海东尚实业有限公司）加热溶解，备用；取处方量的海藻糖、木糖醇，加入注射用水 50ml 溶解，加入少量活性炭除热原，冷却后，加入 5ml 巿售的 20%HSA, 混匀，所得溶液过滤除菌。将所得的含有 HSA的水溶液加入油相，分散，继续在 1000 - 20, 000 psi 下高压均化循环 2 个周期，得到最终乳剂。过滤（ 0. 2 μ m 滤器）、分装，冻干，充氮气，封口。平均粒径小于 200nm。

冻干工艺：预冻： - 74°C， 4h; 抽真空进行干燥。第一阶段干燥： - 30'C , 90min; 第二阶段干燥： -20°C， 12h; 保温： 20°C， 5h。

实施例 26-1

其他操作同实施例 26。不同的是在处方中加入常规量的抗氧化剂，如生育酚、维生素 C或者 EDTA-2Na。

实施例 26-2

其他操作同实施例 26-1。不同的是将处方中的葫芦素 Q 换成葫芦素提取物、葫芦素 A、葫芦素 B、异葫芦素 ^ 双氢葫芦素 B、葫芦素（：、葫芦素 D、异葫芦素 D、双氢葫芦素 D、异葫芦素 6、双氢葫芦素 E、葫芦素 F、葫芦素 I、四氢葫芦素 I、葫芦素 S或葫芦素 E。

实施例 27 醋酸去氨加压素（去氨加压素的等电点 10.9)

处方组成：

醋酸去氨加压素 400ug

二棕榈酰磷脂酰甘油 lg

四月桂酰心磷脂 0. lg

HSA 5g

海藻糖 10g

水适量

制备：将处方量的二棕榈酰磷脂酰甘油与四月桂酰心磷脂用少量叔丁醇溶解，加入醋酸去氨加压素水溶液，分散、混合（显微镜观察为脂质体），用 Tris 调节 pH至 7.4，加入海藻糖溶液，采用挤出法，依次挤压通过双层 800nm、 300 nm、 200nm、 100 nm、 50 nm孔径的薄膜 (Nucleopore) , 备用。取巿售 20%HSA 25ml 溶液，加入上述磷脂分散系统中，混匀，采用 28000psi压力进行分散，循环 1 次，制备所需粒度大小的纳米粒。平均粒径小于 100nm。蛋白层包覆在脂质体的外层。

可以釆用冻干技术获得固体。

冻干工艺：预冻： - 4(TC， 4h; 抽真空进行干燥。第一阶段干燥： - 3(TC， 60min; 第二阶段干燥： - 20°C , 18h; 保温： 25°C， 6h。

实施例 28

处方：

奥曲肽 lOOOug

四棕榈酰心磷脂 lg

四油酰心磷脂 0. lg

HSA 5g

海藻糖 lOg

水适量

制备：将处方量的四棕榈酰心磷脂与四油酰心磷脂用少量叔丁醇溶解，加入醋酸去氨加压素水溶液，分散、混合，用 Tris调节 pH至 7.4, 其他操作同实施磷例处莪 29

术脂方

：油

lg

2g

lg

制备：将莪术油与磷脂混合，加入注射用水 50ml 进行分散，微射流仪或者均质机进一步降低粒度至小于 ΙΟΟηιη, 过滤除菌；蛋白用灭菌注射用水制备成 2%浓度，与上步制备的乳剂混合，再次采用微射流仪或者均质机分散， 4000psi 分散一个循环即可。注射用水补加至 100ml, 过滤，分装，封口，即得。蛋白层包覆在外层。平均粒径小于 150nm。

实施例 30

处方：

阿霉素 0. lg

胆固醇半琥珀酸酯 0. lg

150mM硫酸铵 100ml

蔗糖 15 g

人血清白蛋白 0.02g

制备：称取处方量的四油酰心磷脂、 DMPC、胆固醇半琥珀酸酯，加入 10ml 乙醇溶解，备用。取 150mM硫酸铵 100ml, 加入 15 g蔗糖溶解后，加入 0.1ml 巿售 20%人血清白蛋白，混匀，将此混合液加至磷脂乙醇溶液中，进行水化，所得脂质体，于 50° C用挤压器（Lipex Biomembranes, Inc. , Vancouver, BC, Canada)依次挤压通过双层 800nm、 300 nm、 200nm、 100 nm、 50 nm 孔径的薄膜（Nucleopore) , 最后采用 18000ps i 压力进行分散，循环 2 次，制备所需粒度大小的纳米粒。采用微柱离心法，以 Sephadex G-50除去脂质体外水相的硫酸铵，得到含有蛋白的脂质体。阿霉素以 0.9%氯化钠注射液溶解，配制 10mg/ml。将阿霉素溶液与空白脂质体混合，于 50° C水浴保温 15 分钟，并不断搅拌，即得载有阿霉素的含有蛋白的脂质体。包封率测定结果表明，该方法制备的脂质体包封率大于 90%。 0.22um的滤膜过滤除菌，分装，封口即得， 2 ~ 8° C保存。

可以采用冻干技术获得固体。

冻干工艺：预冻： - 80°C , 4h; -60°C , 抽真空进行干燥。冻干曲线： - 60 °C至 - 50°C， 2h; -50°C - -30°C , 10h; - 30°C ~ 0°C， 6h; 0 °C ~ 20 °C , 4h; 保温： 20。C , 2h。

刺激性及毒性试验结果表明，本发明的给药系统可以减少活性药物对静脉的刺激、静脉炎、静脉血栓形成、外渗和其它与给药相关的副作用。

实施例 30-1

具体操作同实施例 30。不同的是药物选用柔红霉素、表阿霉素、硫酸长春新碱、米托蒽醌、盐酸拓扑替康、重酒石酸长春瑞宾或博来霉素。制备的含有蛋白的脂质体包封率均大于 85%。

实施例 31

处方：

阿霉素 0.2g

胆固醇 0.2 g

四油酰心磷脂 lg

DMPC 5 g

DSPE - PEG2000 0.5 g

150mM硫酸铵 100ml

蔗糖 10 g

人血清白蛋白 0.02g

制备：参照 "实施例 30" 制备载有阿霉素的含有蛋白的脂质体，随后以外插入法将 0.5 g DSPE-PEG2000插入所制备的脂质体中，得到 PEG包衣的阿霉素含有蛋白的脂质体。包封率测定结果表明，该方法制备的脂质体包封率大于 90%。

0.22um的滤膜过滤除菌，分装，封口即得， 2~8° C保存。

可以采用冻干技术获得固体。

冻干工艺：预冻： - 80°C , 4h; -60°C , 抽真空进行干燥。冻干曲线： -60 °C至- 50°C , lh; -50°C - - 3(TC， 8h; -30 °C - 0°C , 6h; 0 °C ~ 20 °C , 2h; 保温： 20°C , 2h。

研究表明，本发明的给药系统可以减少活性药物对静脉的刺激、静脉炎、静脉血栓形成、外渗和其它与给药相关的副作用。

实施例 31-1

具体操作同实施例 31。不同的是药物选用柔红霉素、表阿霉素、硫酸长春新碱、米托蒽醌、盐酸拓扑替康、长春瑞宾或博来霉素。制备的含有蛋白的脂质体包封率均大于 85%。

实施例 32

处方：

阿霉素

四棕榈酰心磷月

DMPC

300raM柠檬酸

蔗糖

人血清白蛋白

制备：称取处方量的四棕榈酰心磷脂、 DMPC, 加入 lml 乙醇溶解，备用。取 300mM柠檬酸（ ρΗ4· 0 ) 10ml, 加入 1 g蔗糖溶解后，加入 0. lml 巿售 20%人血清白蛋白，混匀，加入至磷脂乙醇溶液中，进行水化，探头超声处理，制备半透明的脂质体液体。

阿霉素以 0.9%氯化钠注射液溶解，配制 10mg/ml。将阿霉素溶液与空白脂质体混合，并用 10mM的氢氧化納调节 pH至 ⁷.⁵, 于 50° C水浴保温 I⁵分钟，并不断搅拌，即得载有阿霉素的含有蛋白的脂质体。包封率测定结果表明，该方法制备的脂质体包封率大于 90%。 0.22um的滤膜过滤除菌，分装，封口即得， 2 ~ 8° C保存。

可以采用冻干技术获得固体。

冻干工艺：预冻： - 80°C , 4h; -60°C , 抽真空进行干燥。冻干曲线： - 60 °C至— 50°C , 8h; -50°C - — 30。C， 12h; -30°C - 0°C , 16h; 0 °C ~ 15 °C , 4h; 保温： 15°C , 4h。

研究表明，本发明的给药系统可以减少药物对静脉的刺激、静脉炎、静脉血栓形成、外渗和其它与给药相关的副作用。

脂质体照片见图 6。

小鼠体内药动研究结果表明，阿霉素普通脂质体的 AUC_n。_h 为 106mg/L * h, 蛋白包衣阿霉素脂质体的

为 330mg/L · h。与未用蛋白被覆的普通脂质体相比，采用蛋白被覆的脂质体，其能增加药时曲线下的面积，延长药物作用时间。

实施例 32-1

具体操作同实施例 32。不同的是药物选用柔红霉素、表阿霉素、硫酸长春新碱、米托蒽醌、盐酸拓扑替康、长春瑞宾、吉西他滨、石杉碱甲、草乌甲素或博来霉素。制备的含有蛋白的脂质体包封率均大于 85%。

实施例 32-2

具体操作同实施例 32, 不同的是可以采用外插入法将不同 PEG 分子量的 PEG脂质衍生物插入脂质体中，制备含有蛋白的 PEG包衣脂质体。

实施例 33

处方：

榄香烯 lg

磷脂 2g

TPGS 0.5g

HSA lg

制备：将榄香烯与磷脂、 TPGS混合，加入注射用水 50ml进行分散，微射流仪或者均质机进一步降低粒度至小于 lOOnra, 0.22um的滤膜过滤除菌；蛋白用灭菌注射用水制备成 2%浓度，与上步制备的乳剂混合，再次采用微射流仪或者均质机分散， 2000psi分散一个循环即可。表面活性剂 TPGS 的加入，降低了分散所需压力，减少成本。

研究表明，本发明的给药系统可以减少药物对静脉的刺激、注射时的烧灼感和疼痛、静脉炎、静脉血栓形成、外渗和其它与给药相关的副作用。

实施例 34

处方：

尼莫地平 0. lg

SPC 10g

生育酚半琥珀酸酯 0. lg 叔丁醇 20ml

HSA 10g

蔗糖 15g

制备：取处方量的尼莫地平、 SPC 、生育酚半琥珀酸酯、叔丁醇，搅拌溶解，加入 50%蔗糖溶液 30 ml, 混匀，加入 20%HSA溶液 20ml, 混匀。 20000psi 高压均质处理 2个循环，补加余下的 30 ml20%HSA溶液与注射用水至 250 ml, 混匀， 0.22um的滤膜过滤除菌，可以制备粒度小于 50纳米的脂质纳米粒。实施例 35 在纳米粒中插入含有亲脂性基团的配体

釆用 "实施例 25" 的纳米粒，将本发明人专利申请 CN200610121794.2 的半乳糖胆固醇衍生物按照占磷脂摩尔比 5%的量插入，即可。也可插入转铁蛋白衍生物、叶酸及其衍生物、氨基葡萄糖衍生物、各种 RGD及其衍生物、选自各种鼠源、人源化、重组鼠源、人源的抗体，实现主动靶向递药的目的。

实施例 36 前列地尔纳米粒（ 5 μ g/ml )

处方：

前前列列地地尔尔 500 g

人血白蛋白 0.03g

磷脂 3g

海藻糖 10g

水适量（加至 100ml )

制备：称取处方量的前列地尔与磷脂，加入 3ml 乙醇溶解，备用。取处方量的海藻糖，加入注射用水 70ml 溶解，加入少量活性炭除热原，冷却后加入药物磷脂液中，水化，分散，依次通过 0.8、 0.6、 0.4、 0.2、 0.1、 0.05 μ m 微孔滤膜，得到透明分散液。加入 0.15ml 巿售的 20%HSA，混匀，继续在 1000 - 10, 000 psi 较低压力下均化循环 1 个周期，注射用水加至 100ml, 混匀，得到最终纳米粒。过滤（ 0.2 μ ηι滤器）除菌、分装，充氮气，封口。平均粒径小于 100nm。该纳米粒可以以液体方式保存。如果需要以固体方式保存，则可以进一步进行冻干，充氮气，封口，即得。冻干产品加水复溶后，其平均粒径小于 100nm。

实施例 36-1 前列地尔纳米粒（ 50 μ g/ml )

处方：

前列地尔 5000 μ g

人血白蛋白 0.3g

辛酸乙酯 lg

磷脂 3g

海海澡藻穉糖 10g

水适量（加至 100ml )

制备：称取处方量的前列地尔、辛酸乙酯与磷脂 ,加入 3ml 无水乙醇溶解，备用。取处方量的海藻糖，加入注射用水 70ml溶解，加入少量活性炭除热原，冷却后加入药物磷脂液中，水化， 10， 000 - 40, 000 si分散，得到粒径小于 lOOnm的分散液。加入 1.5ml巿售的 20%HSA, 混匀，继续在 1000 ~ 10， 000 psi 较低压力下均化循环 1个周期，注射用水加至 100ml, 混匀，得到最终纳米粒。过滤（ 0.2 μ m滤器）除菌、分装，充氮气，封口。平均粒径小于 100nm。该纳米粒可以以液体方式保存。如果需要以固体方式保存，则可以进一步进行冻干，充氮气，封口，即得。冻干产品加水复溶后，其平均粒径小于 100nm。

实施例 37

恩替卡韦（ entecavir ) 胶囊 100个剂量单位（ 0.5mg/胶囊）

处方：

鸡蛋清蛋白 5g

SPC 0. lg

恩替卡韦 ( entecavir ) 0.05g

乳糖 20g

制备：取处方量的恩替卡韦、 SPC , 用适量乙醇溶解，备用。取处方量的鸡蛋清蛋白，加入水制备 20%的溶液，加入至恩替卡韦 /SPC溶液中，分散，过均质机（ 400 ~ 4000 psi )，控制粒度在 500nm~ lOOOnm, 加入乳糖，进行喷雾干燥，得到含有恩替卡韦的蛋白纳米粒颗粒，加入 0.1%微粉硅胶，混匀后装胶囊（ 0.5mg/胶囊）。也可以采用粉末直接压片技术进行压片。

实施例 37-1

具体操作同实施例 37。不同的是药物恩替卡韦被以下药物替代：苯丙醇（鸡蛋清蛋白的浓度为 10¾；鸡蛋清蛋白：磷脂 =300: 1 )、非布丙醇（鸡蛋清蛋白的浓度为 30%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 = 300: 1 )、维生素 K1 (鸡蛋清蛋白的浓度为 50%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =300: 1 )、辅酶 Q10(鸡蛋清蛋白的浓度为 50%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 = 300: 1 )、黄杨宁（鸡蛋清蛋白的浓度为 50%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =300: 1 )、益心酮（鸡蛋清蛋白的浓度为 40%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 = 300： 1 )、灯盏花素（鸡蛋清蛋白的浓度为 40%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =200: 1 )、醋柳黄酮（鸡蛋清蛋白的浓度为 40%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =200: 1 )、尼莫地平（鸡蛋清蛋白的浓度为 30%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =200: 1 )、维生素 D (鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =200: 1 )、丹参酮 Π Α (鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =100: 1 )、丁苯酞（鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =100: 1 )、藁本内酯（鸡蛋清蛋白的浓度为 5%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =100: 1 )、胆维他（茴三硫）（鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =100: 1 )、马洛替酯（鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =100: 1 )、去甲斑蝥酸（鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =100: 1 )、斑蝥素（鸡蛋清蛋白的浓度为 0.1%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =50: 1 )、冬凌草甲素（鸡蛋清蛋白的浓度为 0.5%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =100: 1 )、石杉碱甲（鸡蛋清蛋白的浓度为 0.05%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =1: 1 )、草乌甲素（鸡蛋清蛋白的浓度为 1%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =50: 1 )、他汀类降脂药（鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =100: 1 )，如 "洛伐他订"， "辛伐他汀"、阿德福韦酯（鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =50: 1 )、 VE 烟酸酯（鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =50: 1 )、齐多夫定棕榈酸酯（鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =50: 1 )、齐多夫定肉豆蔻酸酯（鸡蛋清蛋白胡维甘的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 = 150: 1 )、齐多夫定棕胆固醇酯（鸡蛋清蛋萝生油白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =150: 1 )、齐多夫定胆固醇酯（鸡蛋清蛋素卜白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =150: 1 )、细辛醚（脑）（鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =150: 1 )、非诺贝特（鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =150: 1 )、熊果酸（鸡蛋清蛋白的浓度为 5%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =150: 1 )、 23-羟基白桦酸（鸡蛋清蛋白的浓度为 1%；鸡蛋清蛋白：磷脂 = 150: 1 )、 2oc, 23-二羟基乌苏酸（鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =150: 1 )、伊曲康唑（鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =150: 1 )、骨化三醇（鸡蛋清蛋白的浓度为 0.005%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =1: 1 )或坎地沙坦（鸡蛋清蛋白的浓度为 10%; 鸡蛋清蛋白：磷脂 =150: 1 )。

实施例 37 - 2

具体操作同实施例 37。不同的是将 "鸡蛋清蛋白" 置换为 "玉米蛋白"，药物与 SPC、玉米蛋白用适量乙醇溶解，随后以乳糖溶液进行水化，分散。药物选用恩替卡韦、苯丙醇、非布丙醇、维生素 Π、辅酶 Q10、黄杨宁、益心酮、灯盏花素、醋柳黄酮、尼莫地平、维生素 D、丹参酮 Π Α、丁苯酞、藁本内酯、胆维他（茴三硫）、马洛替酯、去甲斑蝥酸、斑蝥素、冬凌草甲素、石杉碱甲、草乌甲素、海参提取物、他汀类降脂药，如 "洛伐他订"， "辛伐他汀"、阿德福韦酯、 VE 烟酸酯、齐多夫定椋榈酸酯、齐多夫定肉豆蔻酸酯、齐多夫定棕胆固醇酯、齐多夫定胆固醇酯、细辛醚（脑）、非诺贝特、熊果酸、 23-羟基白桦酸、 la, 23 -二羟基乌苏酸、伊曲康唑或坎地沙坦。

实施例 37-3

鸡蛋清蛋白 lg

10g

0.05g

0.5g

3 g

制备：取处方量的维生素 E、胡萝卜素、 EPC ，用适量无水乙醇溶解，备用。取处方量的鸡蛋清蛋白、甘油，加入水制备 2%的溶液，加入至维生素 E/ 胡萝卜素 /EPC 溶液中，分散，过均质机（ 4000 - 40000 psi ), 控制粒度小于 500nm，加入蒸馏水至 100ml ,得到含有维生素 E与胡萝卜素的蛋白纳米分散液，外用具有保湿、细嫩皮肤作用；加入哈士蟆分散后，可得到外用面膜。根据需要尚可加入人参等植物提取物、维生素 C棕榈酸酯、辅酶 Q、熊果苷、氢醌、曲酸、各种蛋白水解物、各种氨基酸等。

实施例 37-4

鸡蛋清蛋白 10g

EPC lg

维生素 C椋榈酸酯 0. lg

生育酚 O. lg 甘油 5 g

制备：取处方量的生育酚、维生素 C棕榈酸酯、 EPC , 用适量无水乙醇溶解，备用。取处方量的鸡蛋清蛋白、甘油，加入水制备 50%的溶液，加入至生育酚 /维生素 C棕榈酸酯 /EPC溶液中，分散，过均质机（ 4000 - 40000 psi ), 控制粒度小于 lOOOnm, 加入蒸馏水至 50ml, 得到含有生育酚与维生素 C棕榈酸酯的蛋白纳米分散液，外用具有保湿、细嫩皮肤作用；加入哈士蟆分散后，可得到外用面膜。根据需要尚可加入人参等植物提取物、胡萝卜素、辅酶 Q、熊果苷、氢醌、曲酸、各种蛋白水解物、各种氨基酸等。

实施例 38 碱性成纤维细胞因子（bFGF) (等电点 9.6 )

处方：

bFGF 500 μ g

人血白蛋白 10g

DMPG 0.07g

1,2-十四酰磷脂酸 0.03 g

海藻糖 10g

水适量（加至 100ml )

制备：称取处方量的 bFGF加水 2ml 溶解，将所得溶液与 DMPG、 1，2-十四酰磷脂酸混合，分散，备用。取处方量的海藻糖，加入注射用水 30ml 溶解，加入少量活性炭除热原，冷却后加入 lOgHSA搅拌溶解，与 bFGF的磷脂液体混合，依次通过 0.8、 0.6、 0.4、 0.2、 0.1、 0.05 μ m微孔滤膜，得到透明分散液。加入 50ml 巿售的 20%人血白蛋白注射液，混匀，在 1000 ~ 10, 000 psi 较低压力下均化循环 1个周期，注射用水加至 100ml, 混匀，得到最终分散液。过滤（ 0.2 μ ιη滤器）、分装，充氮气，封口。平均粒径小于 100nm。也可以采用常规方法进行冻干。

实施例 39

处方：

胸腺五肽 10mg

四肉豆蔻酰心磷脂 500mg

HSA lOOOmg

SPC lOOmg

乳糖 20g

制备：取处方量的胸腺五肽、四肉豆蔻酰心磷脂、 SPC , 加入适量水中，搅拌、分散，过均质机（ 4000 - 24000 psi ), 备用。取处方量的 HSA, 加入水制备 20%的溶液，加入至胸腺五肽分散液体中， 20000 psi分散循环 2次，控制粒度在 100nm~ 200nm, 加入乳糖，进行喷雾干燥，得到含有胸腺五肽的蛋白纳米粒颗粒。此纳米粒可以进一步加工成为胶囊、压片、颗粒剂；也可以直接制备成粉雾剂，肺部给药。

实施例 39-1

具体搡作同实施例 39。不同的是釆用后插入法将 DSPE-PEG( PEG分子量 100 - 10000 )、 (PEG分子量 100 ~ 10000 )、 DMPE- PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 - 10000 )加入上述制剂中。

异海蒸马实施例 40

处馆丙藻蔺方：

糖水醚子

人血清白蛋白（ HSA) 5g

心肌磷脂 5g

甲醇 3ml

冬凌草甲素 0.2g

麦芽糖 10g

蒸馏水加至 100

具体操作参照 "实施例 13" 进行。不同的是将 10%蔗糖换成 10%麦芽糖。制备得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径为 110nm。

实施例 40-1

具体操作同实施例 40。不同的是采用后插入法将 DSPE-PEG ( PEG 分子量 100 ~ 10000 )、 DMPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )加入上述制剂中。

实施例 41

处方：

人血清白蛋白（ HSA) 5g

心肌磷脂 5g

DPPE-PEG ₁₀„o lg

3ml

0.2g

10g

加至

具体操作参照 "实施例 13" 进行。不同的是将 10%蔗糖换成 10%海藻糖。制备得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径为 130 n m。

实施例 41-1

具体操作同实施例 41。不同的是采用后插入法将 DSPE-PEG ( PEG 分子量 100 ~ 10000 )、 DMPE-PEG ( PEG分子量 100~ 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )力口入上述制剂中。

实施例 42

处方：

人血清白蛋白（ HSA) 5g

心肌磷脂 5_g

DLPG 5g

DPPE-PEG ,οοοο 0. lg

无水乙醇 3ml

高三尖酯碱 0.2_g

海藻糖 lg

乳糖 10g 蒸馏水加至 100 ml

具体操作参照 "实施例 13" 进行。不同的是将 10%蔗糖换成 10%乳糖、 1% 海藻糖。制备得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径为 106nm。

实施例 42-1

具体搡作同实施例 42。不同的是采用后插入法将 DSPE-PEG ( PEG 分子量 100 - 10000 )、 DMPE-PEG ( PEG分子量 100 - 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )加入上述制剂中。

实施例 43

处方：

人血清白蛋白（ HSA ) 3g

SPC 5g

1,2-二棕榈酰磷脂酸 lg

MCT lg

地塞米松棕榈酸酯 0.02g

海藻糖 10g

蒸馏水加至 100 ml

具体操作参照 "实施例 13" 进行。不同的是将 10%蔗糖换成 10%海藻糖。制备得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径为 90nm。

实施例 43-1

具体操作同实施例 43。不同的是釆用后插入法将 DSPE-PEG ( PEG 分子量

100 ~ 10000 ) , DMPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 - 10000 )加入上述制剂中。

实施例 44

处方：

人血清白蛋白（ HSA ) 3g

SPC 5g

1， 2-十六烷基磷脂酰乙醇胺 lg

MCT lg

氯霉素棕榈酸酯 0.02g

蒸馏水力口至 100 ml

具体操作参照 "实施例 13" 进行。制备得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径为 150nm。

实施例 44-1

具体操作同实施例 44。不同的是采用后插入法将 0.01% ~ 10% ( w/v ) DSPE- PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )、 DMPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )力口入上述制剂中。

实施例 45

处方：

人血清白蛋白（ HSA) 3g

二棕榈酰磷脂酰甘油 5g 1,2-十六烷基磷脂酰乙醇胺 lg

海蒸麦 DMPE-PEG ig

乙餾醇芽藻 lg

藤黄酸 0.2g

5g

10g

加至 100

具体操作参照 "实施例 13" 进行。不同的是将 10%蔗糖换成 10%海藻糖、 5°/。麦芽糖。制备得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径为 170nm。

实施例 45-1

具体操作同实施例 45。不同的是采用后插入法将 0.01% ~ 10% ( w/v ) DSPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )、 DMPE-PEG ( PEG分子量 100 - 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 - 10000 )加入上述制剂中。

实施例 46

处方：

人血清白蛋白（ HSA ) 10g

1,2-二油酰基卵磷脂 3_g

1， 2-二亚油酰基卵磷 lg

DMPE-PEG lg

乙醇 lg

二氢青蒿素 0.2g

麦芽糖 10g

蒸馏水加至 100 ml

具体操作参照 "实施例 13" 进行。不同的是将 10%蔗糖换成 10%麦芽糖。制备得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径为 120nm。

实施例 46-1

具体操作同实施例 46。不同的是采用后插入法将 0.01% ~ 10% ( w/v ) DSPE-PEG ( PEG分子量 100 - 10000 )、 DMPE-PEG ( PEG分子量 100 - 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )加入上述制剂中。

实施例 47

处方：

人血清白蛋白（HSA) 10g

溶血磷脂酰肌醇 3g

1,2-二亚麻酰基卵磷脂 lg

乙醇 lg

二氢青蒿素 0.2g

海藻糖 10g

蒸馏水加至 100 ml

具体操作参照 "实施例 1ϊ" 进行。不同的是将 10%蔗糖换成 10%海藻糖。制备得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径为 130nm。实施例 47-1

具体搡作同实施例 47。不同的是采用后插入法将 0.01% ~ 10% ( w/v ) DSPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )、 DMPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )力口入上述制剂中。

实施例 48

处方：

蟾蜍脂溶性提取物 0. lg

溶血磷脂酰甘油酯 0.02g

溶血磷脂酰丝胺酸 0.2g

1,2-二十二烷基磷脂酸 3g

猪血蛋白 PEG衍生物 lg

海藻糖 lOg

蒸馏水加至 100 ml

具体操作参照 "实施例 13" 进行。制备得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径小于 30nm。

实施例 48-1

具体操作同实施例 48。不同的是采用后插入法将 0.01% ~ 10% ( w/v ) DSPE-PEG ( PEG分子量 100 - 10000 )、 DMPE-PEG ( PEG分子量 100 - 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )加入上述制剂中。

实施例 49

处方：

辅酶 Q10 0. lg

四肉豆蔻酰心磷脂 10g

牛血清白蛋白 0. lg

海藻糖 20g

蒸馏水加至 100 ml

具体操作参照 "实施例 13" 进行。不同的是将人血清白蛋白换成牛血清白蛋白， 10%蔗糖换成 20%海藻糖。制备得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径小于 100nm。

实施例 49-1

具体搡作同实施例 49。不同的是釆用后插入法将 0.01% ~ 10% ( w/v ) DSPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )、 DMPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )力口入上述制剂中。

实施例 50

处方：

维生素 L 0. lg

1-椋榈酰 -2-油酰磷脂酸 2g

牛血清白蛋白 lg

海藻糖 10g

木糖醇 5g 蒸馏水加至 100 ml

具体操作参照 "实施例 13" 进行。不同的是将人血清白蛋白换成牛血清白蛋白， 10%蔗糖换成 10%海藻糖与 5%木糖醇。制备得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径小于 100nm。

实施例 50-1

具体操作同实施例 50。不同的是采用后插入法将 0.01% ~ 10% ( w/v ) DSPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )、 DMPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )力口入上述制剂中。

实施例 51

处方：

20 (S)-原人参二醇 0. lg

1,2 -二十六烷基磷脂酸 ig

1- 十四酰 -2-羟基卵磷脂 lg

1- 亚油酰 -2-羟基卵磷脂 ig

1， 2-二油酰磷脂酸 lg

牛血清白蛋白 ig

海藻糖 lOg

蔗糖 5g

蒸馏水力口至 100 ml

具体操作参照 "实施例 13" 进行。不同的是将 10%蔗糖换成 10%海藻糖与

5%蔗糖。制备得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径小于 100nm。

实施例 51-1

具体操作同实施例 51。不同的是采用后插入法将 DSPE-PEG ( PEG 分子量 100 - 10000 )、 DMPE-PEG ( PEG分子量 100 - 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 - 10000 ) , 或者 PEG-THS、 PEG - CHS, PEG-CHM加入上述制剂中。

实施例 52

处方：

20(1)-人参皂甙{^3

1-硬脂酰 -2-羟基卵磷脂

SPC HSA

具体操作参照 "实施例 13" 进行。不同的是将 10%蔗糖换成 10%海藻糖。制备―得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径小于 100 n m。

实施例 52-1

具体操作同实施例 52。不同的是采用后插入法将 DSPE- PEG ( PEG 分子量

100 - 10000 )、 DMPE-PEG ( PEG 分子量 100~ 10000 ) 、 DPPE-PEG ( PEG 分子量 100 ~ 10000 )或 DLPE- PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )加入上述制剂中。实施例 53

处方：

人参皂甙 Rg₂ 0. lg 1-油酰- 2-羟基卵磷脂 0. Olg

EPG 1 g

EPC 10 g

1,2-二硬脂酰磷脂酸 0.1 g

1,2-十四酰磷脂酰甘油 0.1 g

1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油 0.1 g

二棕榈酰磷脂酰胆碱 0.1 g

HSA 0.1 g

具体操作参照 "实施例 13" 进行。不同的是将 10%蔗糖换成 10%海藻糖。制备得到的蛋白纳米制剂其平均体积粒径小于 100nm。

实施例 53-1

具体操作同实施例 53。不同的是采用后插入法将 DSPE-PEG ( PEG 分子量 100 ~ 10000 )、 PEG-THS, PEG _ CHS、 PEG-CH 、 DMPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 ) 、 DPPE-PEG ( PEG分子量 100 - 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )加入上述制剂中。

实施例 54

处方：

七叶皂苷钠 500mg

2 -二十八烷基磷脂酸 lg

1, 2-二棕榈酰磷脂酰甘油 2g

猪血蛋白 10g

水适量

制备方法：将处方中的七叶皂苷纳、 2-二十八垸基磷脂酸、 1， 2-二棕榈酰磷脂酰甘油、猪血蛋白用水分散，搅拌，均质机 800psi处理，水加至 50ml, 混匀，即得。外用可以消肿。实施例 54-1

• 具体操作同实施例 54。不同的是釆用后插入法将 DSPE-PEG ( PEG 分子量 100 - 10000 ) 、 DPPE-PEG ( PEG 分子量 100 - 10000 )、 DMPE-PEG ( PEG 分子量 100 - 10000 )或 DLPE-PEG ( PEG分子量 100 ~ 10000 )力口入上述制剂中。实施例 55 阿奇霉素滴眼液（ 100ml )

处方：

阿奇霉素 lg

DLPG 2g

EDTA- 2Na 0.002g

洁尔灭 0.003g

HSA lg

水适量

制备方法：阿奇霉素、 DLPG用乙醇溶解，得溶液； EDTA- 2Na 、 HSA溶解于水中，配成 2%溶液，加入上步制备的溶液中，搅拌。柠檬酸调 pH6~8，微射流分散， 12000 psi处理 2 个循环，加入洁尔灭与水，调整体积至 100ml, 混匀，得阿奇霉素滴眼液。

实施例 56 处方：

硝酸咪糠唑 lg

二癸酰磷脂酰胆碱 10g

HSA lg

壳聚糖 lg

水适量

制备方法：硝酸咪糠唑、二癸酰磷脂酰胆碱用适量乙醇溶解，备用；壳聚糖用适量醋酸溶解，加入巿售 20%HSA5ml与水 50ml ,混匀，加入至硝酸咪糠唑磷脂溶液中，分散， 16000 ps i处理 3个循环，调 pH4 ~ 5 , 并调整体积至 100ml , 混匀，得硝酸咪糠唑纳米粒制剂。此制剂可以外用于阴道给药。

可以将 "壳聚糖"换成 "十八胺"、 "脂肪胺"、 "多聚胺胆固醇阳离子脂质"、 "胆固醇阳离子脂质衍生物"，确保纳米粒荷正电荷，实现阴道粘附给药目的。实施例 57

处方：

辛伐他汀 lg

磷脂 2_g

鸡蛋清蛋白 2 g

乳糖 10g

水适量

制备方法：取处方量的辛伐他汀、磷脂，用适量乙醇溶解，备用。取处方量的鸡蛋清蛋白、乳糖，加入水制备 5%的溶液，加入至辛伐他汀 /磷脂溶液中，分散，过均质机（ 1 000 ~ 1 0000 ps i ), 控制粒度在 300nm ~ 500nm，进行冷冻干燥或者喷雾干燥，得到含有辛伐他汀的蛋白纳米粒颗粒，装胶囊或者直接压片，或者制备成颗粒剂。

实施例 57-1

具体操作同实施例 5 7。不同的是用于 "他汀类药物"、 "水蛭素"、 "蜂毒肽"、 "胰岛素" 口服给药或者关节腔注射给药或者皮下注射给药的药剂制备。

实施例 58

处方：

降钙素 lg

磷脂 2g

蛋白 lg

海藻糖 2g

制备方法：同 "实施例 57" 。药剂注射给药或者鼻腔给药

实施例 59

处方：

蚓激酶 lg

磷脂 2g

蛋白 2g

甘露醇 10g 水适量

制备：同 "实施例 57"。制剂口服给药。

实施例 60 纳米银

处方：

硝酸银 lg

水合肼 lg

磷脂 5g

PEG猪血蛋白 lg

水加至 100ml

制备方法：取硝酸银，用水配制成 0. lMol/L，加入磷脂， 20000psi分散循环 3次，备用。取 PEG猪血蛋白，以水配制成 5%溶液，加入上述的脂质体分散液中， 10000 psi分散循环 1次，超滤除去未包封的硝酸银，余下脂质体液体中加入水合肼，搅拌，反应 6小时，超滤除去多余的水合肼，水加至 50ml，酸类物质调 pH至 6~7, 即得纳米银胶体。平均粒径小于 100nm。外用（包括阴道、直肠等腔道给药）、口服或者注射。

实施例 60-1

具体操作同实施例 60。不同的是用于制备 "纳米金"、 "纳米铁" 等胶体分散系。外用 (包括阴道、直肠等腔道给药）、口服或者注射或者磁靶向。

实施例 61 葫芦素 I (纯度大于 98%)

处方组成（ 100ml, 葫芦素 I的浓度为 0. lmg/ml )

葫芦素 I 0. Olg

DMPC 5g

DSPE-PEG2000 0.2 g

HSA 0. lg

海藻糖 10g

水适量

制备方法：将处方量的葫芦素 I、 DMPC用少量乙醇溶解，备用。取处方量的海藻糖，加入注射用水 70ml 溶解，加入少量活性炭除热原，过滤，滤液冷却后，加入葫芦素 I 的磷脂溶液中，分散，并依次通过 0.8、 0.6、 0.4、 0.2、 0.1、 0.05 μ m微孔滤膜，得到透明分散液，备用；加入 25ml 巿售的 20%HSA , 混匀，所得溶液过滤除菌。将所得的含有 HSA的水溶液加入上述分散体系中，在 1000 ~ 20, 000 psi 下高压均化循环 2个周期，得分散体系。采用外插入法将 0.2 g 的 DSPE- PEG₂。。。插入上述分散纳米粒中，过滤（ 0.2 μ m滤器）除菌、分装，封口即得。

可以采用冷冻干燥技术。

冻干工艺：预冻： - 74 ， 4h; 抽真空进行干燥。第一阶段干燥： - 30°C ,

30min; 第二阶段干燥： - 20°C， 12h; 保温： 15°C , 5h。

实施例 61-1

具体操作同实施例 61。不同的是在处方中加入常规量的抗氧化剂，如生育酚、维生素 C或者 EDTA- 2Na。

实施例 61-2 具体操作同实施例 61。不同的是将处方中的葫芦素 I 换成葫芦素提取物 (包括巿售的葫芦素 BE)、葫芦素 A、葫芦素 B、异葫芦素 B、双氢葫芦素 B、葫芦素 C、葫芦素 D、异葫芦素 D、双氢葫芦素 D、异葫芦素 E、双氢葫芦素 E、葫芦素 F、葫芦素 E、四氢葫芦素 I、葫芦素 Q。

实施例 61-3

具体操作同实施例 61。不同的是釆用外插入法将不同 PEG 分子量的 DPPE-PEG, DMPE-PEG. DLPE- PEG插入纳米粒中。

实施例 62

处方：

葫芦素 Q 0. i_g

多烯磷脂酰胆碱 10g

叔丁醇 20ml

蛋白 lg

蔗糖 20g

制备方法：取处方量的葫芦素 Q、多烯磷脂酰胆碱、叔丁醇，搅拌溶解，加入 50%蔗糖溶液 40 ml, 混匀，加入 20 SA溶液 5ml，混匀。 20000psi 高压均质处理 1个循环，补加注射用水至 100 ml, 混匀， 0.22 的滤膜过滤除菌，平均粒度小于 50纳米。分装，每支 1 ml, 按照常规方法进行冷冻干燥，可以制备 1000 y g/ml/支的高浓度冻干产品。由于葫芦素 Q的药理活性高，一曰总用量小于 1000 μ ₈, 所以采用本发明的技术可以获得高浓度制剂，这样就可减少生产、运输、储存、使用的成本。

实施例 63 加速实验考察多西紫杉醇纳米粒的化学稳定性

以 "实施例 13" 的处方为例（冻干制剂），进行室温加速试验考察。

测试条件：

色谱柱： Diamond 0DS 柱（ 4.6 mm χ 200 mm, 5 μιη ); 流动相：乙腈-水（ 50 ： 50, V： V); 柱温：室温；检测波长： 230 nm, 理论塔板数不低于 5000；药物浓度：约为 20p _g/ml; 进样量： 20 μΐ; 外标法。

测定结果见下表 6。表 6 含量测定结果

粒径未发生明显变化。

实施例 64 不同多西紫杉醇制剂的急性毒性试验

药品： "实施例 13" 制剂与按照目前巿售多西他赛（多西紫杉醇）制剂的处方工艺所制备的多西紫杉醇吐温 80溶液剂。

动物：选择雄性小鼠，小鼠体重在 18g- 20g。给药剂量：均为 100mg/kg。

给药途径：静脉注射。

观察时间： 7天。

试验重复三次。

小鼠存活情况见下表 7。

不同处方小鼠存活情况

三批数据结果表明，本发明的制剂（ "实施例 13" )毒性远低于巿售多西他赛（多西紫杉醇）制剂的处方工艺所制备的多西紫杉醇吐温 80溶液剂。

实施例 65 紫杉醇纳米粒

按照 "实施例 13" 的方法进行制备，不同的是将药物 "多西紫杉醇" 换成 "紫杉醇" 即可。

制备得到的分散体很容易地通过 0.22 μ ιη微孔滤膜，实现除菌过滤目的。放置约 30小时无沉淀产生。

实施例 65 的对照例说明釆用氯仿溶剂制备蛋白纳米粒的问题

紫杉醇 60 mg

氯仿 1ml

HSA 600mg

制备方法：称取处方量的紫杉醇，用 1ml氯仿溶解，所得溶液备用。取巿售 HSA注射液，以水稀释配制成 2%的浓度，即 30ml 的 2%HSA溶液。用 2%HSA 溶液对紫杉醇氯仿溶液进行乳化，并于 20000psi 下进行分散。所得纳米分散液于减压下回收氯仿，余下液体难以通过 0.8 μ ηι微孔滤膜。放置约 1 小时即产生沉淀。

实施例 66 紫杉醇纳米粒毒性试验

药品： "实施例 65" 制备的制剂与按照目前市售紫杉醇（采用 Creraophor RH40聚乙二醇蓖麻油）制剂的处方工艺所制备的紫杉醇溶液剂。

动物：选择雄性小鼠，小鼠体重在 18g- 20g。

给药剂量：均为 50mg/kg。

给药途径：静脉注射。

观察时间： 7天。

试验重复三次。

小鼠存活情况见下表 8。不同处方小鼠存活情况

三批数据结果表明，本发明的制剂（ "实施例 65" )毒性远低于巿售紫杉醇制剂的处方工艺所制备的紫杉醇溶液剂。

实施例 67 葫芦素 B磷脂蛋白纳米制剂药效试验

酶标仪（瑞士 Sunrise)、溴化 3 - ( 4， 5 - 二甲基噻唑 - 2 ) - 2， 5 - 二苯基四氮唑（MTT ) (美国 Fluka)、 DMSO (Sigma )、 RPMI 1640培养液（GIBCO)、胎牛血清（FBS) (天津 TBD生物技术中心）。

分别以人喉癌上皮细胞（ Hep-2 )、人肝癌细胞（ He_PG-2 )、人肺腺癌细胞 ( A549 ) 考察了葫芦素 B HSA纳米粒对体外肿瘤细胞生长的抑制作用，并在这些细胞中比较相同剂量的葫芦素 B乳剂和脂质体的抑制作用。

1、试验方法

将细胞用含 10 %胎牛血清的 RPMI 1640 培养液培养，置 37 °C、 5 %C02 培养箱中，每 3 - 4 天传代 1 次。选对数生长期的细胞用于实验。贴壁细胞用 0。

25%胰酶（含 EDTAlmM )消化后悬浮于培养液中，调细胞浓度为 2.5 χ 10⁴/ ml , 按每孔 100 μ L接种于 96 孔板上，每孔设 3 个复孔。空白对照孔（ b 1 ank ) 加培养液。培养 18-24h 待细胞贴壁后，分组加入不同浓度药物（ 0.5 μ 1 )，余一组为对照组（加细胞不加药）。继续培养一定时间（如 24或 48小时）后，每孔加入 5 mg/ ml MTT试剂 10 μ L ，继续培养 4 h , 每孔加入 10%SDS (含 1 OmM 盐酸） ΙΟΟ μ 1，培养箱内过夜。用酶标仪（570nm 波长）测每孔的 0D (optical density) 值。根据 0D 值求出细胞抑制率，计算公式为抑制率（inhibi t ion rate , IR) =[ (对照组 0D值均数 - b 1 ank组 OD值均数）- （实验组 0D 值均数 - blank组 0D值均数）] / (对照组 0D 值均数 -blank组 0D值均数）。

即：抑制率（％) = 1- ( 0D实验- 0D空白） / ( 0D对照 - 0D空白）

(一 ) 葫芦素 B溶液对 Hep-2细胞的生长抑制作用

在 Hep-2细胞的培养液中分别加入浓度为 0. 1、 1、 10、 ΙΟΟ μ Μ的葫芦素 B (用 DMS0溶解），考察培养不同时间后葫芦素 Β对 Hep-2细胞的生长抑制作用。可见葫芦素 B对 Hep-2细胞增殖的抑制作用随时间延长和剂量提高而增强。特别是在作用时间长、剂量高时这种趋势更为明显。结果见图 7。

(二）不同葫芦素 B/ HSA (人血清白蛋白）比例制备的纳米粒对不同肿瘤细胞生长的抑制作用

按照 "实施例 4" 制备了含 HSA 2%或 3%的葫芦素 B HSA纳米粒（ CuB药物浓度相同，即均为 0. lmg/ml )。在 2%HSA 的处方中葫芦素 B 与 HSA 的比例为 1 /200 ( w/w ) ，在 3%HSA 的处方中 CuB与 HSA的比例为 1 /300 ( w/w )。为了阐明制备纳米粒的重要性，我们将 CuB用含 10%乙醇的注射液水溶解，制备 CuB 溶液，并按照 CuB/HSA为 1/300 ( w/w) 的比例加入 HSA, 使得 CuB/HAS溶液中 HSA 的浓度为 3%。分别考察 CuB HSA 纳米粒、 CuB /HSA 溶液在不同剂量下对 Hep- 2、 A549、 HepG- 2 肿瘤细胞生长的抑制作用。结果分别见图 8、图 9、图 10₀

从图中可以看出葫芦素 B纳米粒对 Hep-2、 A549、 HepG- 2细胞的生长抑制作用均随剂量的升高而增强。葫芦素 B 的 HSA 溶液仅在 Hep- 2 细胞中随剂量升高表现出逐渐增强的抑制作用；但在 HepG- 2细胞中剂量超过 ΙΟηΜ后抑制作用没有明显增强；在 A549细胞中剂量超过 ΙΟΟηΜ后抑制作用反而呈下降趋势。葫芦素 B HSA 纳米粒在各细胞中剂量达到 Ι μ Μ后抑制作用明显强于溶液，其中 3%HSA的纳米粒抑制作用要明显强于 2%HSA的纳米粒。可以发现， CuB的 HSA 溶液对几种肿瘤细胞的抑制作用随剂量升高变化不如纳米粒明显，在 A549 细胞中剂量超过 ΙΟΟηΜ后抑制作用反而呈下降趋势，很有可能是因为这种细胞的摄取机制被大量不携带药物的 HSA所饱和，反而阻碍了药物进入细胞。对于普通的脂质体和乳剂，只能通过非特异性的融合或胞吞等途径通过细胞膜，细胞对其亲和力和摄取的选择性较 HSA纳米粒低。当纳米粒中的 HSA达到 3%时，这一优势表现得更为明显。

实施例 68 葫芦素 B HSA纳米粒与乳剂、脂质体对不同肿瘤细胞生长抑制作用的比较比较同等剂量的 CuB不同制剂（葫芦素 B/HSA溶液、 CuB HSA纳米粒、 CuB 脂质体、 CuB乳剂）对 Hep-2、 A549、 HepG-2肿瘤细胞生长的抑制作用。结果见图 11。

由图 11 可见 3%HSA的 CuB纳米粒对 Hep-2、 A549、 HepG-2 细胞均表现出最强的抑制作用； 2%HSA的 CuB纳米粒对 Hep-2细胞的抑制作用强于脂质体和乳剂；在 A549细胞中抑制作用低于脂质体；在 HepG-2细胞中作用与乳剂和脂质体相近。 CuB HSA溶液在各组中抑制作用都较弱，但在 Hep-2细胞中强于脂质体。

综合上述试验结果， CuB HSA纳米粒对体外的肿瘤细胞生长表现出较强的抑制作用。 HSA 能结合肿瘤细胞膜上的白蛋白结合蛋白（ albumin binding protein, ABP ), 使其携带的药物容易被肿瘤细胞所摄取。在 CuB HSA 纳米粒中，药物大部分被包裹在蛋白形成的颗粒内部，通过颗粒表面的 HSA与细胞表面受体结合，将药物转运至细胞内部；对于 CuB HSA溶液，其中只有一部分 CuB与 HSA形成分子结合体，还有大量药物和 HSA均以游离的分子状态存在于溶液中。

实施例 69 葫芦素 B HSA纳米粒的体内抗肿瘤和升高白细胞作用

按照抗肿瘤药物实验方法进行，建立裸鼠体内肝癌 H22移植模型。随机分组，每组 10只，分别为 "空白对照组"、 "环磷酰胺阳性对照组（ CTX 20mg kg"¹ )'\ "给药治疗组（高、中、低剂量组， 0, 20mg.kg-' 、 0. lOmg kg"¹, 0. 05 mg kg"') '\ "溶液组" （非纳米粒制剂）。模型对照组给予生理盐水注射液。造模后第四天待肿瘤有一定体积时开始给药。给药时间：第 5、 7、 9、 11、 13天给药。第 14 天时，断颈法处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，电子天平称瘤重。根据下面公式计算抑瘤率。

抑瘤率（ °/。） = (1 -给药组平均瘤重照组平均瘤重） X 100%,

所有数据均釆用均值用标准差表示土 SD),

小鼠尾静脉采血，进行常规血白细胞计数。

结果见下表 9。表 9 葫芦素 B纳米粒抗 H22实验结果小鼠数体重（g)

量瘤重 (g) 抑瘤组给药剂量起始结束

(起始 ( 土 SD) 率（％) /终止)

对照组 - 10/8 19. 36 25. 86 2.82土 0. 71 -

CTX 20mg/kg 10/9 19. 77 21. 08 1.26 ± 0. 63 * * 55. 3 高剂量 0.2mg/kg 10/10 20. 06 24. 16 1. 18 ± 0. 58 * * 58. 2 中剂量 0. lmg/kg 10/10 19.62 25. 38 1.43 ± 0. 67 * * 49. 3 低剂量 0. 05mg/kg 10/10 19.88 25.66 1. 77 ± 0. 55 * 37. 2 药物溶液 0. lmg/kg 10/8 19.62 24. 71 1. 91 ± 0. 83 * 32. 3

* P<0. 01 * P<0. 05

葫芦素 B溶液组有两只小鼠死亡，而纳米粒组无小鼠死亡，毒性小于溶液组； HSA 纳米粒制剂的抑瘤率大于溶液组。 HSA 纳米粒在剂量为溶液组的一半时，抑瘤率仍高于溶液；在剂量高于溶液一倍时，毒性仍然低于溶液组，显示出提高疗效，降低毒性的作用。

"空白对照组"、 "环磷酰胺阳性对照组（ CTX， 20mg.kg )"、"给药治疗组（高、中、低剂量组， 0.20mg kg"¹ 、 0. lOmg kg"¹, 0. 05 rag-kg"¹) "溶液组" 的白细胞数分别为： 6.89、 3. 11、 8. 63. 8. 11、 8.21、 8.26 ( χ 10' - L"¹) , 环磷酰胺阳性对照组的白细胞数大大下降，葫芦素各组的白细胞数均高于环磷酰胺阳性对照组，高于空白对照组。

Claims

杈利要求

1、一种给药系统，其特征在于，所述给药系统包括蛋白质-磷脂分散体，在蛋白质-磷脂分散体中，蛋白质与磷脂的重量比为 1 : 300 - 300 : 1 , 蛋白质- 磷脂粒径在 5nm ~ 1 O O Onm之间。

2、如权利要求 1所述的给药系统，其特征在于，在所述蛋白质 -磷脂分散体中，磷脂表面或磷脂表面与内部包被蛋白质层，或者脂质体双分子层内外层包被蛋白质，或在脂质体内水相形成蛋白纳米粒。

3、如权利要求 1 或 2 所述的给药系统，其特征在于，所述蛋白质选自人血白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、玉米蛋白、血红蛋白及其衍生物、半乳糖化白蛋白和修饰猪血白蛋白中的至少一种。

4、如权利要求 1 ~ 3任一项所述的给药系统，其特征在于，所述磷脂选自下列中的至少一种：大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、 EPG、磷脂酸、心肌磷脂、鞘磷脂、磷脂酸丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二辛酰磷脂酰胆碱、二己酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油及其钠盐，二棕榈酰磷脂酰甘油及其钠盐， L- α -二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其钠盐，二月桂酰磷脂酰甘油、二癸酰磷脂酰甘油、二辛酰磷脂酰甘油、二己酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、双二硬脂酰磷脂酰甘油及其钠盐、双二棕榈酰磷脂酰甘油及其钠盐、双二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其钠盐、双二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰花生四烯酰磷脂酰胆碱、 DSPE-PEG、 DPPE-PEG、 DMPE-PEG 和 DLPE-PEG , 其中所述 DSPE-PEG、 DPPE-PEG. DMPE-PEG . DLPE-PEG中 PEG 的分子量为 100 - 10000。

5、如权利要求 1 ~ 4任一项所述的给药系统，其特征在于，还包括选自乙醇、甲醇、丙醇、丙二醇、甲基吡咯烷酮、正丁醇、叔丁醇、丙酮、乙酸乙酯和异丙醚中至少一种的有机溶剂。

6、如权利要求 1 ~ 5任一项所述的给药系统，其特征在于，还包括与磷脂重量比为 1: 0.1 - 1: 10的油类物质，所述油类物质选自 MCT、结构油、生育酚、醋酸生育酚、油酸、油酸乙酯、大豆油、红花油、橄榄油、椰子油、辛酸、葵酸、月桂酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻油酸、二十二碳六烯酸、深海鱼油及植物挥发油中的至少一种。

7、如权利要求 1 ~ 6任一项所述的给药系统，其特征在于，还包括配体、抗体，所述配体选自半乳糖衍生物、转铁蛋白衍生物、叶酸及其衍生物、氨基葡萄糖衍生物或 RGD及其衍生物；所述的抗体选自鼠源、人源、重组鼠源或重组人源的抗体。

8、如权利要求 1 ~ 7任一项所述的给药系统，其特征在于，还包括胆固醇和 /或谷醇。

9、如权利要求 1 - 8任一项所述的给药系统，其特征在于，还包括选自壳聚糖、十八胺、脂肪胺、多聚胺胆固醇阳离子脂质或胆固醇阳离子脂质衍生物的荷正电物质。

10、如杈利要求 1 ~ 9任一项所述的给药系统，其特征在于，还包括 pH调节剂。

11、如权利要求 10所述的给药系统，其特征在于，所述的 PH调节剂为有机酸碱或无机酸碱，其选自柠檬酸、乳酸、富马酸、酒石酸、乙酸、葡萄糖酸、乳糖酸、山梨酸、琥珀酸、马来酸、抗坏血酸、草酸、甲酸、苯磺酸、苯甲酸、谷氨酸、天冬氨酸、盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氢氧化钠、精氨酸和赖氨酸中的至少一种。

12、权利要求 1-11 中任何一项所述的给药系统的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

( 1 ) 含磷脂相的制备；

( 2 ) 含蛋白质水相的制备；和

( 3 )将含磷脂相与含蛋白质水相混合，于温度 0 ~ 6(TC、压力 400 - 40000 psi条件下，进行任选的挤出步骤，然后进行均质化处理。

13、如权利要求 12 所述的制备方法，其特征在于，所述含蛋白质水相为 0.005 - 50% ( g/ml ) 的蛋白质水溶液。

14、如权利要求 12或 13所述的制备方法，其特征在于，所述均质化处理为高压均质化或微射流均质化。

15、如权利要求 12- 14 中任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括冷冻干燥或喷雾干燥。

16、如权利要求 15 所述的制备方法，其特征在于，冷冻干燥或喷雾干燥中使用的添加剂为蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、右旋糖苷、海藻糖、木糖醇、麦芽糖、果糖、蛋白、壳聚糖、甘氨酸、枸櫞酸和氯化钠中的至少一种。

17、如权利要求 12-16 中任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括过滤除菌。

18、蛋白质 -磷脂分散体在药物给药系统中的应用。