ITMI980234A1 - Composizioni farmaceutiche in forma di nanoparticelle comprendenti sostanze lipidiche e sostanze antifiliche e relativo processo di - Google Patents

Composizioni farmaceutiche in forma di nanoparticelle comprendenti sostanze lipidiche e sostanze antifiliche e relativo processo di

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ITMI980234A1
ITMI980234A1 IT98MI000234A ITMI980234A ITMI980234A1 IT MI980234 A1 ITMI980234 A1 IT MI980234A1 IT 98MI000234 A IT98MI000234 A IT 98MI000234A IT MI980234 A ITMI980234 A IT MI980234A IT MI980234 A1 ITMI980234 A1 IT MI980234A1
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IT98MI000234A
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Pierandrea Esposito
Italo Colombo
Nicoletta Coceani
Curto Maria Dorly Del
Fabio Carli
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Description

Domanda di breveto per invenzione industriale dal titolo:
Composizioni farmaceutiche in forma di nanoparticelie comprendenti sostanze lipidiche e sostanze anfifiliche e relativo processo di preparazione.
TECNICA ANTERIORE
Nel campo della ricerca di nuovi veicoli adatti alla somministrazione di principi attivi, un ampio interesse e' stato rivolto ai sistemi polimerici aventi dimensioni nell’ ambito dei micrometri ed ai sistemi polimerici aventi dimensioni nell’ ambito dei nanometri.
Tra i polimeri maggiormente utilizzati sono da ricordare i polialchilcianoacrilati e i derivati dell’ acido poli-lattico (PLA) e dell’ acido poli-laticoglicolico (PLA-PLGA). Tali sistemi presentano pero’ alcuni svantaggi.
I poli-alchilcianoacrilati per esempio sono metabolizzati dall’organismo nell’ arco di 24 ore e liberano formaldeide, un derivato potenzialmente tossico; i polimeri del PLA e del PLA-PLGA non producono metaboliti tossici ma hanno tempi di degradazione lunghi che vanno da alcune settimane ad alcuni mesi, e quindi possono presentare fenomeni di accumulo pericolosi.
Inoltre, i metodi di preparazione dì questi sistemi richiedono l'impiego di solventi organici potenzialmente tossici che possono rimanere in tracce nella forma finale.
Infine, la dimensione della maggior parte di detti sistemi esclude il loro impiego per via endovenosa poiché corpi estranei aventi dimensioni superiori ai 5 μm iniettati in vena possono provocare embolie.
Questi aspetti negativi hanno fatto si che ci fosse maggiore attenzione per sistemi di somministrazione maggiormente biocompatibili e meno tossici: tra questi primi fra tutti i sistemi colloidali lipidici quali emulsioni olio/acqua, liposomi, micro-e nanoparticelle lipidiche.
Emulsioni olio/acqua, costituite da goccioline lipidiche con dimensioni di nanometri, disperse in una fase esterna acquosa, sono state utilizzate come veicolo per la nutrizione parenterale (Brevetto JP No. 55,476, 1979, Okamota, Tsuda e Yokoama).
Emulsioni olio/acqua contenenti principi attivi sono state descritte nel brevetto WO 91/02517, 1991, Davis e Washington. Tali sistemi possiedono un' elevata capacità di incorporare principi attivi nella fase interna lipidica, ma i principi attivi diffondono facilmente da tale fase verso la fase esterna originando problemi di stabilita' e limitazioni per l’eventuale sviluppo di una forma a rilascio protratto.
I liposomi sono strutture colloidali aventi una fase interna acquosa circondata da uno o piu strati di fosfolipidi. L'utilizzo dei liposomi come veicoli per la somministrazione di farmaci e’ descritto ad esempio nel brevetto U.S. No 3,993,754 (1976, Rahman e Cerny).
Tipicamente, tali sistemi presentano pero’ problemi di stabilita’ durante lo stoccaggio, un metodo di preparazione scarsamente riproducibile ed una bassa potenzialità di incorporare e trattenere principi attivi.
Fountain e altri inventarono microparticelle lipidiche di forma globulare con dimensioni tra 0.5 μιτι e 100 μm come veicoli per la somministrazione di principi attivi. Tale invenzione e<* >descritta nel brevetto U.S. No 4,610,868 (1986).
Domb e altri (Brevetto US 435, 546 ) inventarono le Liposfere™, particelle insolubili con dimensioni di circa 40 μm, sospese in mezzo acquoso, costituite da una fase interna lipofila circondata da strati esterni di fosfolipidi, aggiunti alla composizione ed adsorbiti sulla superficie delle particelle stesse. Questi sistemi furono sviluppati per il rilascio controllato di farmaci anestetici (Domb e al..Brevetto US 5227165) e principi attivi con attività insetticida e pesticida (Domb e al., Brevetto US 5227535). La tecnica di preparazione di tali sistemi richiede tuttavia l’ausilio di solventi che restano in tracce nella forma finale.
La somministrazione per via orale risulta essere difficoltosa per principi attivi che sono poco solubili, poco assorbiti nel tratto gastro-enterico o che sono sensibili al pH o all’azione degli enzimi proteolitici (proteine e peptidi). L'incorporazione di tali sostanze in nanoparticelle lipidiche permette di superare tali difficoltà perchè questi sistemi nanoparticellari possono essere assorbiti lungo il tratto gastro-intestinale. Le loro ridotte dimensioni permettono di sfruttare i meccanismi di assorbimento transmucosale passivo, oppure di passare attraverso le giunzioni intercellulari o i canali ionici o di utilizzare il meccanismo di endocitosi oppure di accedere al flusso linfatico.
Sistemi lipidici solidi costituiti da nanopellets furono sviluppati da Speiser e al. (Brevetto US 4,880,634, 1989), e destinati alia somministrazione orale di farmaci scarsamente assorbiti. I pellets lipidici vengono preparati emulsificando sostanze lipidiche in un mezzo acquoso con un miscelatore ad alta energia, raffreddando poi l’emulsione a temperatura ambiente e ottenendo i pellets tramite sonicazione.
Gasco (EP 0526666A1, 05/08/1991) ha inventato una tecnica per la preparazione di nanoparticelle lipidiche. Viene preparata una microemulsione aggiungendo a una fase acquosa un lipide fuso in presenza di tensioattivi e cotensioattivi, la quale viene poi dispersa in un mezzo acquoso mantenuto a temperatura intorno a 10°C. Le nanoparticelle solide sono ottenute in sospensione acquosa, ma possono essere successivamente private dei tensioattivi residui tramite ultrafiltrazione e recuperate tramite filtrazione o liofilizzazione.
Tale tecnica risulta essere vantaggiosa dai punto di vista del risparmio energetico rispetto alla omogeneizzazione ad alta energia , permette di ottenere nanoparticelle piu’ piccole, con diametri medi dai 90 nm a 900 nm.<'>con una distribuzione dimensionale piu' uniforme ed un indice di polidispersione basso. La preparazione di una microemulsione tuttavia richiede la fusione del materiale lipidico che si aggira per la maggior parte delle sostanze lipidiche utilizzate intorno ai 70 °C, il che limita l’utilizzo di tale tecnica per sostanze termolabili.
SOMMARIO
L'invenzione riguarda composizioni farmaceutiche in forma di nanoparticelle, aventi diametro inferiore a 1000 nm e preferibilmente compreso fra 50 e 500 nm, comprendenti un materiale composito, costituito da almeno una sostanza lipidica e da almeno una sostanza anfifilica, ed un principio farmaceuticamente attivo.
Noi abbiamo inaspettatamente trovato che, operando secondo la presente invenzione, detto materiale composito e le relative particelle hanno caratteristiche non ottenibili mediante usuale miscelazione di una sostanza lipidica con una sostanza anfifilica o mediante adsorbimento di una sostanza anfifilica su particelle lipidiche.
La sostanza anfifilica può essere preferenzialmente distribuita sulla superficie delle nanoparticelle oppure può essere preferenzialmente distribuita all’interno delle nanoparticelle oppure può essere omogeneamente distribuita in superficie e all’interno delle nanoparticelle. La formazione del materiale composito consente di ottenere nanoparticelle:
1. con carateristiche di superficie che favoriscono l'assorbimento da somministrazione orale ed il tempo di emivita nel sistema circolatorio; 2. con carateristiche di massa, come la bassa temperatura di fusione, che consente di incorporare farmaci termolabili;
3. adate, grazie alla presenza di zone lipofile e di zone parzialmente idrofile nel materiale composito, alla veicolazione sia di farmaci idrosolubili che di farmaci liposolubili;
4. capaci di incorporare in maniera omogenea i farmaci idrofili (p.es. peptidi) all’ interno di una matrice essenzialmente lipofila.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL' INVENZIONE
L’invenzione riguarda la preparazione di composizioni ad uso farmaceutico in forma di particelle di dimensióni inferiori ad un micrometro (nanoparticelle), comprendenti un materiale composito costituito da sostanze lipidiche e anfifiliche, queste ultime essendo di tipo lipidico o polimerico.
In generale, le nanoparticelle secondo l’invenzione vengono preparate a partire da un materiale composito ottenuto per cofusione o cosolubilizzazione del materiale lipidico e delle sostanze anfifiliche. La miscela cofusa, al successivo raffreddamento, porta ad un materiale composito che possiede caratteristiche nuove rispetto ai due materiali di partenza, presentando zone più idrofile e zone più lipofile grazie alla reciproca disposizione dei componenti o alla segregazione del materiale anfifilico verso la superficie o verso l'interno della massa delle nanoparticelle. Queste caratteristiche sono sostanzialmente differenti dall’adsorbimento superficiale di una sostanza anfifilica su una superficie lipofila. Tali proprietà verranno descritte in dettaglio negli esempi di caratterizzazione di seguito riportati.
Il farmaco può essere disciolto o sospeso in detta miscela cofusa durante il processo di preparazione e, grazie alle nuove proprietà del materiale composito, può ripartirsi, a seconda delle sue caratteristiche, preferenzialmente ali’ interno delle aree più idrofile oppure delle aree più lipofile. Inoltre, i farmaci idrofili (p.es. peptidi) caricati sulle nanoparticelle risultano inaspettatamente distribuiti in modo omogeneo all' interno delle nanoparticelle stesse mentre la frazione di peptide adsorbita sulla superficie risulta molto bassa, ed inferiore agli esempi di prior art (particelle costituite da core lipidico e sostanza anfifilica adsorbita).
Le nanoparticelle otenute a partire dalia miscela cofusa mantengono le stesse carateristiche del materiale composito di partenza.
Le nanoparticelle possono essere ottenute con tecniche di preparazione differenti:
- 1. una tecnica che prevede la dispersione di una microemulsione olio in acqua (costituita, come fase olio, dai materiali lipidici ed anfifilici mantenuti a temperatura superiore al punto di fusione della miscela composita e da uno o piu tensioattivi e cotensioativi) in un mezzo acquoso, sfrutando il gradiente di temperatura.
- 2. una tecnica che prevede la omogeneizzazione ad alta pressione di una emulsione fine, a temperatura superiore alla temperatura di fusione dei materiali costituenti il composito, o di una sospensione fine di materiale composito, al di soto della temperatura di fusione del materiale composito, in presenza di agenti tensioattivi.
La preparazione dell’invenzione secondo il processo di microemulsionedispersione (tecnica 1), prevede la iniziale cofusione o cosolubilizzazione di due o più componenti lipidici ed anfifilici, portati alla temperatura di fusione dei componenti stessi od almeno alla fusione di uno dei due componenti, quando Γ altro è solubile nel primo; a tale materiale composito fuso si aggiunge un appropriato volume di una soluzione acquosa contenente uno o piu tensioativi e cotensioattivi, riscaldata alla stessa temperatura del materiale composito fuso, sotto blanda agitazione.
É anche possibile formare la microemulsione portando simultaneamente a temperatura di fusione i componenti lipidici ed anfifilici in presenza dell'acqua e dei tensioattivi e cotensioattivi necessari alla formazione della microemulsione stessa.
Il principio attivo farmaceutico può essere disciolto o disperso nel materiale composito fuso di partenza od aggiunto direttamente alla microemulsione durante la prepararazione della stessa, a seconda delle proprietà del principio attivo stesso. La distribuzione del principio attivo avviene nel materiale composito, permettendo una diminuzione inaspettata della quantità di farmaco adsorbito sulla superficie e soggetto all’azione degradante degli enzimi e dell'ambiente esterno. La microemulsione olio/acqua cosi formata viene successivamente dispersa in acqua o in ambiente acquoso, in condizioni di volume ed agitazione controllate, a temperatura generalmente compresa fra Γ e 10°C, ma che può essere compresa anche fra -15 e -30X utilizzando solventi non acquosi miscibili con l’acqua, originando in questo modo le nanoparticelle composite in forma solida in sospensione acquosa. Dette nanoparticelle hanno diametro inferiore a 1000 nm. Le nanoparticelle risultano differenti rispetto ai sistemi ottenuti con tecniche di adsorbimento di sostanze anfifliche sulla superficie di particelle lipidiche (Domb) o mediante l’uso di sostanze anfifiliche come tensioattivi per la formazione di nanoparticelle lipidiche (Gasco).
Successivamente, le sospensioni di nanoparticelle possono essere lavate con acqua o soluzioni acquose attraverso un sistema di ultrafiltrazione (o dialisi) che permette di eliminare l'eccesso di tensioattivi, cotensioattivi e di farmaco libero. Tale procedimento permette quindi di eliminare i possibili effetti indesiderati dovuti alla presenza di' tensioattivi nella forma farmaceutica. Inoltre, con tale procedimento é possibile determinare quantitativamente la percentuale di principio attivo non incorporata o adsorbita sulle nanoparticelle.
La composizione sopra descritta può essere somministrata come sospensione acquosa oppure recuperata come solido mediante tecniche di liofilizzazione, filtrazione, evaporazione del solvente acquoso o spraydrying.
Le nanoparticelle secondo la presente invenzione hanno la seguente composizione quantitativa in peso:
- sostanze lipidiche da 0.5 a 99.5.%, e preferibilmente fra 10% e 90% - sostanze anfifìliche da 0.5 a 99.5 % e preferibilmente fra 10% e 90% - principio farmacologicamente attivo da 0.001 a 99 %, e preferibilmente fra 0.01% e 50% rispetto alla somma delle istanze lipidiche e delle sostanze anfifìliche.
Nel processo di preparazione delle nanoparticelle secondo la tecnica (1), le sostanze componenti vengono impiegate nelle seguenti proporzioni in peso:
Nella microemulsione:
- componenti lipidici, fra 0.1% e 50% in peso e preferibilmente fra 10 e 25%;
- componenti anfifìlici, fra 0.1% e 50% in peso e preferibilmente fra 0.5% e 25%;
- tensioattivi, fra 5% e 30% e preferibilmente fra 10% e 20%;
- cotensioattivi, da 0% a 15% e preferibilmente da 3% a 7%;
- acqua, o soluzioni acquose, da 40% a 75% in peso e preferibilmente da 50% a 70%;
- principi attivi farmaceutici, incorporati direttamente nel materiale composito o disciolti nella microemulsione, in concentrazioni variabili in base all’efficacia di incorporazione ed ai dosaggi desiderati e comprese fra 0.001% e 99 % e preferibilmente fra 0.001% e 50% in peso rispetto alla somma dei componenti lipidici e dei componenti anfìfilici.
Nella dispersione:
- la microemulsione preparata come sopra viene dispersa in ambiente acquoso (acqua o soluzioni acquose) con diluizioni volumetriche da 1:2 a 1:200, preferibilmente da 1:5 a 1:50.
Alla dispersione possono essere aggiunti
- coadiuvanti della dispersione, fra lo 0.05% ed il 5% in peso;
- agenti viscosizzantì, di tipo polimerico, fra 0.05% e 5% in peso.
La preparazione secondo la tecnica di omogeneizzazione ad alta pressione (tecnica 2) prevede la dispersione del materiale composito, addizionato di una o più sostanze tensioattive, in un mezzo acquoso. Il materiale composito viene omogeneizzato fino a formare nanoparticelle mantenendo il sistema alla temperatura di fusione del materiale stesso oppure appena al di sotto di tale temperatura (‘‘rammollimento") oppure a temperature che mantengono il materiale composito allo stato solido. Il materiale composito può essere inizialmente preparato per cofusione o cosolubilizzazione, analogamente a quanto riportato per la tecnica 1, procedendo alla cofusione di due o più componenti lipidici ed anfìfilici portati alla temperatura di fusione dei componenti stessi od almeno alla fusione di uno dei due componenti quando l’altro è solubile nel primo.
Il materiale composito può essere preliminarmente disperso in una soluzione acquosa contenente sostanze tensioattive, sostanze stabilizzanti e/o viscosizzanti mediante tecniche di dispersione o di omogeneizzazione a bassa energia (p.es. utilizzando equipaggiamento tipo Silverson L2R o Ultra-Turrax). Dopo tale trattamento, che può non essere necessario se il materiale composito presenta caratteristiche di superfìcie tali da favorirne la dispersione in acqua, il sistema viene sottoposto in omogeneizzatore ad alta pressione (p. es. del tipo APV Gaulin, APV Rannie Mini-Lab, Microfluidizer) a cicli ripetuti di omogeneizzazione che danno origine a dispersioni di nanoparticelle. Il trattamento di omogeneizzazione ad alta pressione può avvenire alla temperatura di fusione del materiale composito, a temperatura di '‘rammollimento" o a temperature alle quali il materiale é presente allo stato solido in forma micronizzata.
Il principio attivo può essere cofuso, disciolto o disperso nel materiale composito o in ciascuno dei suoi costituenti durante la cofusione del sistema, o aggiunto durante le fasi successive del processo, tal quale o in presenza di tensioattivi che ne favoriscono l’incorporazione nelle nanoparticelle o l’adsorbimento sulla loro superficie.
Successivamente, le sospensioni di nanoparticelle possono essere lavate con acqua o soluzioni acquose, analogamente a quanto descritto per la tecnica (1), attraverso un sistema di ultrafiltrazione.
Analogamente, la composizione può essere somministrata come sospensione acquosa oppure recuperata come solido mediante tecniche di liofilizzazione, filtrazione od evaporazione del solvente acquoso o di spray-drying.
Nel processo di preparazione delle nanosferé secondo la tecnica (2), le sostanze componenti l invenzione vengono impiegate alle seguenti proporzioni in peso:
- i componenti lipidici, fra 0.1% e 50% in peso, preferibilmente fra 0.5% e 15%;
- i componenti anflfilici, fra 0.1% e 50%, preferibilmente fra 0.5% e 15%; - tensioattivi, fra 0.05% e 10%, preferibilmente fra 0.5 % e 5%;
- acqua, o soluzioni acquose di componenti idrosolubili, da 45% a 99.5%, preferibilmente da 50% a 80%;
- coadiuvanti della dispersione da 0.05% a 5%;
- agenti viscosizzanti, di tipo polimerico da 0.05% a 1%;
- principi attivi farmaceutici, incorporati direttamente nel materiale composito o disciolti nella microemulsione, in concentrazioni variabili in base all’efficacia di incorporazione ed ai dosaggi desiderati, e comprese fra 0.001% e 99.9% e preferibilmente fra 0.001% e 50% in peso rispetto alla somma dei componenti lipidici e dei componenti anfifilici.
Fra i materiali lipidici utilizzabili secondo l’invenzione si possono menzionare sia i prodotti naturali sia i prodotti di natura sintetica o semisintetica definibili come “grassi” in quanto non miscibili o solo parzialmente miscibili con l’acqua:
1) grassi naturali sia saturi che insaturi ed olii vegetali parzialmente o totalmente idrogenati, per esempio olio di cotone idrogenato (Lubritab™), olio di palma idrogenato (Dynasan™ P60) ed olio di soia idrogenato (Sterotex™ HM);
2) mono-, di- e tri-gliceridi semisintetici e di sintesi contenenti acidi grassi saturi e/o insaturi (con lunghezza delle catene alifatiche variabile fra C10 e C22) e loro derivati poliidrossietilati, per esempio tristearina, trigliceridi caprico-caprilici (Mygliol™, Captex™, Labrafac™ Lipo), trigliceridi behenici (Compritol™) monogliceridi quali glyceril monostearato (Myvaplex™ 600) o glyceril palmitostearato (Precirol™) e trigliceridi poliidrossilati saturi o insaturi (serie dei Labrafil™, Labrafac™ Hydro, Gelucire™);
3) "cere liquide”, per esempio isopropil miristato, isopropil-caprinato, -caprylato, -laurato, -palmitato, -stearato ed esteri di acidi grassi, quali etil oleato ed oleil oleato;
4) "cere solide”, per esempio cera carnauba e cera d’api;
alcooli alitatici, per esempio alcool cetilico, alcool stearilico, alcool laurico, alcol cetilstearilico e loro derivati poliidrossietilati;
6) acidi carbossilici alifatici preferibilmente a catena media e lunga (C10-C22), saturi (acido decanoico, acido laurico, palmitico, stearico, behenico ecc.), insaturi (oleico, linoleico, ecc.) e loro derivati poliidrossietilati.
Fra i materiali anfifilici di tipo lipidico si possono utilizzare lipidi che posseggono nella loro struttura delle componenti idrofile, quali ad esempio:
1 ) fosfolipidi appartenenti alle serie: fosfatidilglicerolo, fosfatidilcolina ed acido fosfatidico (p.es. dimiristoil fosfatidii glicerolo);
2) mono- e di-gliceridi quali glyceril monostearato (Myvaplex™ 600) o glyceril palmitostearato (Precirol™);
3) trigliceridi e trigliceridi poliidrossilati saturi o insaturi (p.es. serie dei Labrafil™, Labrafac™ Hydro, Gelucire™);
4) esteri di acidi grassi, quali decilestere dell'acido oleico: Cetiol™ V e isopropilmiristato;
5) acidi grassi a catena media (quali acido caprico, caproico e laurico. Fra i materiali anfifilici di tipo polimerico, possono essere utilizzati polimeri quali:
1) Polietilenglicoli (PEG), sia liquidi (PEG 200 a PEG 1000) che solidi (PEG 1500 a 20.000);
2) Copolimeri poli-(propilenossido) poli -(etilenossido), Poloxamer (Lutrol™ 188, Lutrol™407);
3) Poli-vinil alcool;
4) Poliacrilati ( Carbopol™, Pemulen™, Noveon™);
5) Copolimeri poli-(metil vinil etere) - anidride maleica (Gantrez™);
6) Polisaccaridi di origine naturale quali chitosano e derivati, acido ialuronico e derivati, xantano, scleroglucano, gellano, gomma guar, gomma locust bean, alginato e dextrano;
7) Poliesteri quali ad esempio poli -ε- caprolattone.
Come sopra riportato i materiali compositi secondo l'invenzione possono essere preparati per miscelazione, cofusione o cosolubilizzazione dei componenti scelti fra i materiali lipidici e fra i materiali anfifilici di tipo lipidico o polimerico. Ad esempio, materiali compositi secondo l<’>invenzione, possono essere formati da miscele di acidi grassi (acido stearico-acido decanoico), di acidi grassi e fosfolipidi (acido stearicodimiristoil fosfatidii glicerolo o dimiristoil fosfatidii colina), acidi grassi e trigliceridi o trigliceridi poliidrossilati (acido stearico e Labrafil ™ 2130), mono- o di-gliceridi con acidi grassi (gliceril palmitostearato con acido stearico), acidi grassi con polietiienglicole (acido stearico-PEG), mono e digliceridi con copolimeri di polietilen ossido-polipropilen ossido (glicerilpalmitostearato con poloxamer).
Come fasi acquose secondo l’invenzione (fase acquosa della microemulsione secondo la tecnica 1 e/o fase disperdente secondo le tecniche 1 e 2) possono essere menzionate:
1 ) acqua come tale o tamponata a diversi pH e forza ionica;
2) soluzioni acquose di polimeri idrofili, idrosolubili o idrodisperdibili quali polietiienglicole, polivinilpirrolidone, acidi poliacrilici e derivati (p. es. Carbopol® , Pemulen® , ecc. ), acidi polimetacrilici e derivati (p. es. Eudragit®), copolimeri di poliossietilene-poliossipropilene (p. es. Poloxamer, Lutrol®), polisaccaridi di varia natura come ad esempio destrano, xanthano, scleroglucano, gomma arabica, gomma guar, chitosano, derivati della cellulosa e dell' amido;
3) soluzioni acquose di saccaridi (p.es. sorbitolo, mannitolo, xilitolo); 3) alcooli alifatici mono o poliossidrilici, preferibilmente a catena corta (C2-C4);
4) polietilenglicoli ( p. es. PEG 200, PEG 400, PEG 600, PEG 1000); 5) gliceridi poliglicolici ( p. es. Labrasol™);
6) poliglicoli, come ad esempio propilenglicole, tetraglicole, etossidiglicole (Transcutol™).
Fra i tensioattivi , da utilizzare nelle tecniche 1 e 2, si possono menzionare a titolo non esaustivo tutti i tensioattivi non ionici con un valore di HLB in genere ma non necessariamente superiore a 7, come ad esempio: sorbitan-esteri di acidi grassi (p. es. Span®, Arlacel®, Brij®) , poliossietilen sorbitan esteri di acidi grassi (p. es. Tween®, Capirmi®, Liposorb®), copolimeri di polipropilenossido-polietilenossido (Poloxamer), esteri di polietilenglicole (PEG)-glicerolo (Labrasol®, Labrafil® con HLB 6-7), esteri di PEG ed acidi o alcooli alitatici a catena lunga (p. es. Cremophor®), esteri poligliceridi (Pluroi®), esteri di saccaridi ed acidi grassi (sucro-esteri). Possono essere utilizzati, quando necessario, anche tensioattivi anionici (p.es. sodio laurilsolfato, sodio stearato, sodio oleato), sali biliari (p.es. sodio glicocolato, taurodesossicolato, taurocolato, ursodesossicolato) o cationici (p. es. tricetol), come pure tensioattivi a basso HLB, lecitine tal quali (Lipoid S75) e idrogenate (p.es. Lipoid S75, S75-3) , fosfolipidi e loro derivati semisintetici o sintetici.
Fra i cotensioattivi necessari alla formazione della microemulsione si ricordano alcooli a catena corta quali ad esempio etanolo, 2-propanolo, n-butanolo, isopropanolo; acidi alifatici (p. es. acido butirrico, valerianico e capronico) a catena corta e media, alcooli aromatici (p. es. alcool benzilico); alcooli ed acidi alifatici a catena media (C8-C12) quali acido decanoico, acido laurico, caprinil alcool e lauril alcool. Inoltre, possono essere utilizzati come cotensioattivi anche esteri o eteri di acidi od alcooli alifatici a catena medio-lunga con alcooli mono- o poliossidrilati. Alcuni dei componenti menzionati fra i cotensioattivi possono essere allo stesso tempo costituenti la fase olio della microemulsione.
I principi attivi farmaceutici utilizzabili nell’invenzione possono essere sia idrosolubili (p.es. peptidi o proteine) che liposolubili (p. es. ormoni steroidei), come pure scarsamente solubili in entrambi i veicoli (p.es. acyclovir). Le proprietà di superficie e di massa delle nanoparticelle secondo l’invenzione consentono importanti vantaggi come ad esempio: 1) la possibilità di somministrare per la via orale o transmucosale molecole solitamente non assorbibili per tale via (p.es polipeptidi e proteine);
2) la possibilità di somministrare per via orale e/o parenterale molecole lipofiie altamente insolubili e poco assorbibili;
3) un miglioramento delle proprietà biofarmaceutiche dei principi attivi (p.es. rilascio controllato o prolungato ed incremento del tempo di emivita piasmatica );
4) la possibilità di somministrare per via topica molecole attive a livello mucosale o dermale (p.es. farmaci antivirali, antimicotici, antipsoriasici); 5) la possibilità di incapsulare principi attivi dal sapore sgradevole, somministrabili in formulazioni a rilascio immediato.
I gruppi di principi attivi che possono trarre particolare vantaggio dall’invenzione comprendono: antinfiammatori non steroidei (NSAID) e steroidei (SAID), ormoni estrogeni o progestinici, cardiovascolari, antivirali, antimicotici, antineoplasici, ipolipemizzanti, peptidi e proteine a diversa azione.
Fra detti principi attivi si possono menzionare, ad esempio comunque non esaustivo:
Alcaloidi dell' ergot e derivati: diidroergotamina, diidroergotossina e bromocriptina.
Analgesici ed antiinfiammatori non steroidei e loro sali: diclofenac sodio, diclofenac idrossietil pirrolidina, diclofenac dietilammina, ibuprofene, flurbiprofene, ketoprofene, indometacina, acido mefenamico, naproxene, nimesulide e piroxicam.
Antiaritmici: amiodarone, diisopiramide, propranololo e verapamil.
Antibatterici : amoxicillina, fludoxacillina, gentamicina, rifampicina, eritromicina e cefalosporine.
Antifungini e antipsoriasici: amfotericina, butoconazolo nitrato, ketoconazolo, econazolo, etretinato, fluconazolo, flucitosina, griseofulvina, itraconazolo, miconazolo, nystatin, sulconazolo e tioconazolo.
Antivirali: Acyclovir, gancyclovir, A2T e inibitori delle proteasi.
Antiipertensivi: amlodipina, clonidina, diltiazem, felodipina, guanabenz acetato, isradipina, minoxidil, nicardipina cloridrato, nimodipina, nifedipina, prazosin cloridrato e papaverina.
Antidepressivi: carbamazepina.
Antiistamininici: difenidramina, clorfeniramina, pirilamina, clorciclizina, prometazina, acrivastina, cinnarizina.loratadina e terfenadina.
Antineoplasici e immunosoppressori: cyclosporina, dacarbazina, etretinato, etoposide, lomustina, melphalan, mitomicina, mitozantrone, paclitaxel, procarbazina, tamoxifene, taxolo e derivati e taxotere.
Ansiolitici, sedativi, ipnotici: alprazolam, bromazepam, diazepam, lorazepam, ossazepam, temazepam, sulpiride e triazolam.
β-Bloccanti: alprenololo, atenololo.oxprenololo, pindololo e propranololo. β-Agonisti: salbutamolo, salmeterolo.
Inotropici cardiaci e cardiovascolari: amrinone, digitossina, digossina, lanatoside C, medigoxina ed ubidecarenone.
Corticosteroidi: beclometasone, betametasone, budesonide, cortisone acetato, desossimetasone, dexametasone, fludrocortidone acetato, flunisolide, idrocortisone, metilprednisolone, prednisone e triamcinolone. Gastrointestinali e anti H2-istaminici: cimetidina, cisapride, domperidone, famotidina,loperamide, mesalazina, omeprazolo, ondansetrone cloridrato e ranitidina.
Ipolipemizzanti: bezafibrato, clofibrato,gemfibrozil, probucol e lovastatina.
Anti-Angina: amil nitrato, giicerii trinitrato, isosorbide dinitrato e mononitrato e pentaeritritolo tetranitrato.
Farmaci ad Azione Centrale: p. es. Nicotina.
Agenti vitaminici e nutrizionali: betacarotene, Vitamina A, Vitamina B2, Vitamina D e derivati, vitamina E e derivati e vitamina K.
Analgesici Oppioidi: Codeina, destropropossifene, didrocodeina, morfina, pentazocina e metadone.
Ormoni sessuali: danazol, etinilestradiolo, medrossiprogesterone acetato, metiltestosterone, testosterone, noretistrone, norgestrel, estradiolo, estriolo, progesterone, stilbestrolo e dietilstilbestrolo.
Molecole peptidiche, proteiche o polisaccaridiche a diversa attività: leuprolide e LH-RH analoghi, calcitonina, glutatione, somatotropina (GH), somatostatina, desmopressina (DDAVP), interferone, molgramostim, fattore di crescita epidermica (EGF), fattore di crescita nervosa (NGF), insulina, glucagone, tossine o tossoidi (p.es. tossina tetanica), fattori antigenici di tipo proteico o polisaccaridico, eparina, eparina a basso peso molecolare ed eparinoidi.
Molecole ad attività topica specifica: p. es. protettori solari (Assorbenti UV); nutrienti della pelle, ceramidi ed acido glicolico.
La caratteristiche delle composizioni secondo l'invenzione possono essere valutate con diversi metodi chimico fisici, quali ad esempio:
- analisi termica (DSC, TGA e microscopia “hot stage”) per verificare la modifica delle proprietà di massa,
- analisi di superficie (metodo dell'angolo di contatto) per determinare la variazione delle proprietà di superficie,
- tecniche di diffusione di luce laser (LLS) per la determinazione della distribuzione dimensionale delle nanoparticelle,
- tecniche di misurazione di potenziale Zeta per la determinazione delle proprietà di carica di superfìcie delle nanoparticelle,
- tecniche di determinazione dell’efficienza di incorporazione di principi attivi (tecniche di marcatura con molecole fluorescenti, tecniche di separazione e di analisi),
- tecniche di osservazione morfologica (microscopia a trasmissione elettronica: TEM).
Tali tecniche permettono di dimostrare che i materiali compositi costituenti le nanoparticelle secondo l'invenzione e le stesse nanoparticelle presentano proprietà innovative e vantaggiose. Utilizzando le appropriate combinazioni di materiale lipidico ed anfifilico, é possibile preparare dei materiali e delle nanoparticelle composite che possono:
- incrementare l’efficienza di incorporazione di farmaci idrofili (p.es.
peptidi) in una matrice lipidica, favorendo la dissoluzione/dispersione del principio attivo nelle zone più idrofile delle nanoparticelle stesse,
- modificare in maniera inaspettata la localizzazione delle molecole incorporate nelle nanoparticelle: per esempio, permettendo una distribuzione omogenea, all’interno delle nanoparticelle lipoftle, di molecole peptidiche solitamente adsorbite sulla superficie,
- presentare energia di superficie piu bassa rispetto ai componenti di partenza, risultando così più biocompatibili,
- presentare superfici più lipofile rispetto ai singoli componenti, e risultare così più assorbibili per la via orale,
- quando utile all’applicazione, presentare superfici più idrofile rispetto ai singoli componenti e incrementare i tempi di emivita piasmatica delle particelle iniettate per via parenterale,
- a certe proporzioni di sostanza anfifilica e lipidica, risultare in due fasi , con caratteristiche peculiari, in cui il composto anfifilico:
1) può essere disposto preferenzialmente sulla superficie delle nanoparticelle (“segregato in superficie”);
2) può essere disposto preferenzialmente all’ interno delle nanoparticelle (“segregato al'interno");
3) può disporsi omogeneamente sulla superficie e all'interno delle nanosfere stesse,
- a certe proporzioni le nanoparticelle, essendo costituite da materiali compositi con caratteristiche peculiari e differenti rispetto ai singoli materiali originali, possono fondere a temperature fisiologiche rilasciando il principio attivo in maniera rapida (p.es. per trattamenti topici/percutanei e mascheramento del gusto),
- ad altre proporzioni, le nanoparticelle possono mantenersi come tali a temperature fisiologiche assicurando il rilascio del principio attivo per diffusione e/o degradazione delle nanoparticelle stesse,
- a certe proporzioni di materiale lipidico ed anfifilico, nella tecnica di preparazione (1), basata sulla microemulsione olio-acqua della miscela composita, é possibile estendere l’intervallo termico di esistenza della microemulsione stessa verso valori di temperatura piu bassi, permettendo l'incorporazione di molecole termolabili.
Caratteristica fondamentale ed innovativa dell’ invenzione, indipendentemente dal processo dì preparazione delle nanoparticelle, é dunque l’inaspettata formazione di un materiale composito con nuove e differenti caratteristiche di superficie e di massa rispetto ai singoli componenti. In base alle caratteristiche qualitative dei materiali di partenza scelti (p.es. struttura chimica, punto di fusione, idrofobicità e bagnabilità), ed alle percentuali relative dei materiali in una determinata miscela, é possibile ottenere un numero di materiali compositi molto elevato, e quindi di nanoparticelle dotate di caratteristiche differenti.
Vantaggio dell'invenzione é la possibilità di incrementare l'incorporazione di principio attivo idrofilo all'interno di una nanoparticella lipofilica, e di poterne modificare la distribuzione.
Un importante vantaggio dell’invenzione risiede quindi nella possibilità di avere a disposizione sistemi vettori (nanoparticelle composite) formati da materiali nuovi originati da modifiche esclusivamente fisiche delle sostanze componenti e che quindi non richiedono il lungo iter di prove sperimentali tossicologiche.
ESEMPI
A scopo illustrativo vengono riportati esempi di preparazione di composizioni secondo l’invenzione, con la tecnica 1 (esempi 1-36), e con la tecnica 2 (esempi 37-45), ed esempi di confronto con preparazioni secondo la tecnica anteriore (A-E). La caratterizzazione dei prodotti ottenuti e il vantaggioso comportamento in vivo rispetto ai prodotti della tecnica anteriore sono riportate negli esempi (F-Z 1 ).
Esempio 1
Si miscelano 4 grammi di acido stearico e 19.9 mg di di-miristoilfosfatidilglicerolo (percentuale di DMPG nella miscela: 0.5%), e si riscaldano a circa 72°C con formazione della miscela composita fusa alla quale vengono aggiunti 4 mi di n-butanolo. In 20 mi di acqua acidificata a pH 3, si sciolgono 2 g di sodio taurodeossicolato e 3.85 mg di calcitonina di salmone e la soluzione riscaldata a 72°C viene aggiunta alla miscela composita fusa. All’emulsione così formata, mantenuta sotto agitazione, si aggiungono 3 mi di Tween 20, a formare una microemulsione trasparente ed anisotropa. La microemulsione, a circa 60°C, viene dispersa in 5 volumi di acqua a pH 3 raffreddata a 3-5°C, sotto agitazione costante (250 rpm), a formare nanoparticelle lipidiche composite solide costituite da acido stearico - dimiristoilfosfatidilglicerolo contenenti calcitonina. La sospensione viene lavata mediante ultrafiltrazione per eliminare l’eccesso di tensioattivi. L’efficacia di incorporazione della calcitonina nelle nanoparticelle, determinata mediante tecniche fluorimetriche e cromatografiche (v. esempi di caratterizzazione), e’ circa 10.5%. Il diametro medio delle nanoparticelle é 226 nm e l’indice di polidispersione 0.200.
Esempio 2
Si ripete la preparazione dell'esempio 1 , utilizzando una percentuale di DMPG nella miscela composita dell' 1,0%. L'efficacia di incorporazione della calcitonina é 10.2 %, il diametro medio delle nanoparticelle 220 nm e la polidispersione 0.268 .
Esempio 3
Si ripete la preparazione dell’esempio 1 , utilizzando una percentuale di DMPG nella miscela composita del 4.5% . L'efficacia di incorporazione della calcitonina e’ 13.2%, il diametro medio delle nanoparticelle 199 nm e la polidispersione 0.212.
Esempio 4
Si ripete la preparazione dell’esempio 1, utilizzando una percentuale di DMPG nella miscela composita del 5.2% . L’efficacia di incorporazione della calcitonina e' 13.4%, il diametro medio delle nanoparticelle 195 nm e la polidispersione 0.200.
Esempio 5
Si ripete la preparazione dell’esempio 1 , utilizzando una percentuale di DMPG nella miscela composita del 9.5% . L'efficacia di incorporazione della calcitonina e’ 9.19 %, il diametro medio delle nanoparticelle 231 nm e la polidispersione 0.186.
Esempio 6
Si ripete la preparazione dell'esempio 1 , utilizzando una percentuale di DMPG nella miscela composita del 25% . L’efficacia di incorporazione della calcitonina e’ 9.51%, il diametro medio delle nanoparticelle 205 nm e la polidispersione 0.275.
Esempio 7
Si ripete la preparazione dell’esempio 1, utilizzando come materiale anfifilico il fosfolipide acido distearoil fosfatidico (DSPA), in percentuale nella miscela composita del 1.2% . L'efficacia di incorporazione della calcitonina e' 9.9%, il diametro medio delle nanoparticelle é di 245 nm e la polidispersione 0.261.
Esempio 8
Sì ripete la preparazione dell’esempio 7, utilizzando una percentuale di DSPA nella miscela composita del 5.2% . L’efficacia di incorporazione della calcitonina e’ 14.4%, il diametro medio delle nanoparticelle 324 nm e la polidispersione 0.341.
Esempio 9
Si ripete la preparazione dell’esempio 1 , utilizzando come principio attivo eparina a basso peso molecolare (peso molecolare medio 4000 Da) e, come materiale anfifilico il fosfolipide dimiristoil fosfatidii colina (DMPC), in percentuale nella miscela composita del 4.0% . L'efficacia di incorporazione della eparina é circa 1,0%, il diametro medio delle nanoparticelle é di 213 nm e la polidispersione 0.186.
Esempio 10
Si ripete la preparazione dell'esempio 9, utilizzando il fosfolipide dimiristoil fosfatidii colina (DMPC), in percentuale nella miscela composita dell'8.0% . Il diametro medio delle nanoparticelle é di 179 nm e la polidispersione 0.249.
Esempio 11
Si ripete la preparazione dell’esempio 9, utilizzando il fosfolipide dimiristoil fosfatidii colina (DM PC), in percentuale nella miscela composita del 10% . Il diametro medio delle nanoparticelle é di 290 nm e la polidispersione 0.270.
Esempio 12
Si ripete la preparazione dell’esempio 9, utilizzando il fosfolipide dimiristoil fosfatidii colina (DMPC), in percentuale nella miscela composita del 14% . Il diametro medio delle nanoparticelle é di 369 nm e la polidispersione 0.360.
Esempio 13
Si ripete la preparazione dell’esempio 1, utilizzando come materiale anfifilico il trigliceride poliossidrilato Labrafac Hydro™, in percentuale di 1,0% nella miscela composita. Il diametro medio delle nanoparticelle è di 307 nm e la polidispersione 0.234.
Esempio 14
Si ripete la preparazione dell'esempio 13, utilizzando il trigliceride polióssidrilato Labrafac Hydro™, in percentuale di 2,5% nella miscela composita, li diametro medio delle nanoparticelle é di 307 nm e la polidispersione 0.234.
Esempio 15
Si ripete la preparazione dell’esempio 13, utilizzando il trigliceride poliossidrilato Labrafac Hydro™, in percentuale del 50% nella miscela composita. Il diametro medio delle nanoparticelle lipidiche é di 310 nm e la polidispersione 0.332.
Esempio 16
Si ripete la preparazione dell’esempio 13, utilizzando il trigliceride poliossidrilato Labrafac Hydro™, in percentuale del 10,0% nella miscela composita. Il diametro medio delle nanoparticelle é di 326 nm e la polidispersione 0.325.
Esempio 17
Si ripete la preparazione dell’esempio 13, utilizzando il trigliceride poliossidrilato Labrafac Hydro™, in percentuale del 10,0% nella miscela composita e incorporando nella miscela composita 3.87 mg di calcitonina in 3.8g di miscela stessa. Il diametro medio delle nanoparticelle é di 326 nm e la polidispersione 0.325.
Esempio 18
Si miscelano 2.18 g di acido stearico e 67 mg di trigliceride poliossidrilato Labrafìl™ M 2130CS (percentuale di Labrafil nella miscela composita: 3.1%), e si riscaldano a circa 75°C con formazione della miscela composita fusa. La miscela viene solidificata per raffreddamento. In 10 mi di acqua, acidificata a pH 3, si sciolgono 1.34g di sodio taurodeossicolato e 3.85 mg di calcitonina di salmone, la soluzione viene riscaldata a 72°C e viene aggiunta alla miscela composita fusa a circa 72°C, a cui era stato aggiunto 1 mi di n-butanolo. All’emulsione cosi formata mantenuta sotto agitazione, si aggiungono 4 mi di Tween 20, a formare una microemulsione trasparente ed anisotropa. La microemulsione, riscaldata a circa 50°C viene dispersa in 50 volumi di acqua a pH 3 raffreddata a circa 3-5°C, sotto agitazione costante (250 rpm), a formare le nanoparticelle solide contenenti calcitonina. La sospensione viene lavata mediante ultrafiltrazione per eliminare l'eccesso di tensioattivi. L’efficacia di incorporazione della calcitonina nelle nanoparticelle e' circa 11.5%. Il diametro medio delle nanoparticelle é 185 nm e l’indice di polidispersione 0.300.
Esempio 19
Si ripete la preparazione dell'esempio 18 senza l’incorporazione di calcitonina. Il diametro medio delle nanoparticelle composite é 182 nm e l’indice di polidispersione 0.295.
Esempio 20
Si ripete la preparazione dell’esempio 18, utilizzando il trigliceride poliossidrilato Labrafil 2130CS al 8.9% nella miscela composita. La miscela composita viene fusa a circa 70°C. Il diametro medio delle nanoparticelle è 173 nm e l'indice di polidispersione 0.268.
Esempio 21
Si ripete la preparazione dell’esempio 18, utilizzando il trigliceride poliossidrilato Labrafil 2130CS al 10% nella miscela composita. La miscela composita viene fusa a 66°C. Il diametro medio delle nanoparticelle é 216nm e l'indice di polidispersione 0.287.
Esempio 22
Si ripete la preparazione dell’esempio 18, utilizzando il trigliceride poliossidrilato Labrafil 2130CS al 15% nella miscela composita. Il diametro medio delle nanoparticelle é 188 nm e l’indice di polidispersione 0.247.
Esempio 23
Si ripete la preparazione dell'esempio 18, utilizzando il trigliceride poliossidrìlato Labrafil 2130CS al 50% nella miscela composita e la miscela composita viene fusa a 60°C II diametro medio delle nanoparticelle é 312 nm e l'indice di polidispersione 0.424.
Esempio 24
Si ripete la preparazione dell'esempio 18, utilizzando il trigliceride poliossidrìlato Labrafil 2130CS al 75% nella miscela composita e la miscela composita viene fusa a 54°C II diametro medio delle nanoparticelle é 162 nm e l’indice di polidispersione 0.315.
Esempio 25
Si ripete la preparazione dell'esempio 18, utilizzando il trigliceride poliossidrìlato Labrafil 2130CS al 95% nella miscela composita e la miscela composita viene fusa a 35°C. Il diametro medio delle nanoparticelle é 205 nm e l’indice di polidispersione 0.281.
Esempio 26
Vengono miscelati 1.5 g di acido stearico e 0.5 g di acido decanoico (percentuale di acido decanoico nella miscela: 25%), e si riscalda la miscela a circa 75°C con formazione della miscela composita. La miscela viene solidificata per raffreddamento. In 10 mi di acqua acidificata a pH 3 si sciolgono 1.30 g di sodio taurodeossicolato e la soluzione riscaldata a 55°C viene aggiunta alla miscela composita fusa a circa 55°C, a cui era stato aggiunto 1 mi di n-butanolo. All'emulsione cosi formata, mantenuta sotto agitazione, si aggiungono 2.6 mi di Tween 20 a formare una microemulsione trasparente ed anisotropa. La microemulsione mantenuta a circa 45°C viene dispersa in 50 volumi di acqua a pH 3 raffreddata a circa 3-5°C, sotto agitazione costante (250 rpm), a formare nanoparticelle solide bassofondenti. La sospensione viene lavata mediante ultrafiltrazione per eliminare l'eccesso di tensioattivi. Il diametro medio delle nanoparticelle é 280 nm.
Esempio 27
Si ripete la preparazione dell’esempio 26, utilizzando acido decanoico al 50% nella miscela composita. La miscela composita viene fusa a 50°C. Il diametro medio delle nanoparticelle é 310 nm e l'indice di polidispersione 0.280.
Esempio 28
Si ripete la preparazione dell’esempio 26, utilizzando acido decanoico al 75% nella miscela composita. La miscela composita viene fusa a 35°C. Il diametro medio delle nanoparticelle é 300 nm e l’indice di polidispersione 0.250.
Esempio 29
Si miscelano 1.8 g di acido stearico e 0.2 g di polietilenglicole PEG 4000 (percentuale di PEG 4000 nella miscela: 10,0%), e si riscaldano a circa 75°C con formazione della miscela composita. In 10 mi di acqua, acidificata a pH 3 si sciolgono 1.30 g di sodio taurodeossicolato e la soluzione riscaldata a 50°C viene aggiunta alla miscela composita fusa a circa 50°C, a cui erano stati aggiunti 0.5 mi di n-butanolo. All’emulsione cosi formata, mantenuta sotto agitazione, si aggiungono 2.4 mi di Tween 20 a formare una microemulsione trasparente ed anisotropa. La microemulsione mantenuta a circa 45°C viene dispersa in 50 volumi di acqua a pH 3, a circa 3-5°C, sotto agitazione costante (250 rpm), a formare le nanoparticelle lipidiche composite solide. La sospensione viene lavata mediante ultrafiltrazióne per eliminare l’eccesso dì tensioattivi. Il diametro medio delle nanoparticelle é 184 nm e la polidispersione 0.302 .
Esempio 30
Si ripete la preparazione dell’esempio 29 utilizzando polietilenglicole PEG 4000 al 20% nella miscela composita. La miscela composita viene fusa a 50°C. Il diametro medio delle nanoparticelle é 263 nm e l’indice di polidispersione 0.334.
Esempio 31
Si ripete la preparazione dell'esempio 29, utilizzando come materiale anfifilico il copolimero poli-(propilenossido) poli - (etilenossido), Lutrol™ 188 al 10% nella miscela composita. La miscela composita viene fusa a 50°C. Il diametro medio delle nanoparticelle è 353 nm e l’indice di polidispersione 0.314.
Esempio 32
Si ripete la preparazione dell'esempio 29, utilizzando Lutrol™ 188 al 20% nella miscela composita. La miscela composita viene fusa a 50°C. Il diametro medio delle nanoparticelle é 375 nm e l'indice di polidispersione 0.300.
Esempio 33
Si miscelano 1.4 g di acido stearico e 607 mg di trigliceride poliossidrilato Labrafil™ M 2130CS (percentuale di Labrafil nella miscela: 30.1%), e si riscaldano a circa 70°C con formazione della miscela composita. A tale miscela si aggiunge 1.06 g di lecitina di soia parzialmente idrogenata (Lipoid S75-35). 10 mi di soluzione acquosa a pH 3 vengono aggiunti alla miscela composita fusa a circa 70°C, a cui è stato aggiunto 1,0 ml di n-butanolo. All'emulsione cosi formata, mantenuta sotto agitazione, si aggiungono 6 mi di Tween 20 a formare una microemulsione trasparente ed anisotropa. Nella microemulsione si aggiungono circa 200 mg di ciclosporina. La microemulsione, riscaldata a circa 50°C viene dispersa in 50 volumi di acqua a pH 3, raffreddata a circa 3-5°C, sotto agitazione costante (250 rpm), a formare le nanoparticelle solide contenenti ciclosporina. La sospensione viene lavata mediante ultrafiltrazione per eliminare l’eccesso di tensioattivi. Il diametro medio delle nanoparticelle contenenti la ciclosporina é 304 nm e l'indice di polidispersione 0.365.
Esempio 34
Si ripete la preparazione dell'esempio 33, incorporando nella microemulsione 100 mg di etoposide. La miscela composita viene fusa a 50°C. Il diametro medio delle nanoparticelle composite é 288 nm e la polidispersione 0.211.
Esempio 35
Si ripete la preparazione dell’esempio 29, utilizzando Lutrol™ 188 al 20% nella miscela composita. La miscela composita viene fusa a 50°C ed addizionata con acyclovir in quantità di 100 mg per grammo di miscela composita. Il diametro medio delle nanoparticelle contenenti aciclovir é 360 nm e l'indice di polidispersione 0.302.
Esempio 36
Si miscelano 980 mg di acido stearico e 510 mg di trigliceride poliossidrilato Labrafil™ M 2130CS (percentuale di Labrafil nella miscela: 30 %), e si riscaldano a circa 70°C con formazione della miscela composita. A tale miscela si aggiungono 300 mg di Coenzima Q10 (Ubidecarenone) e 1.06 g di lecitina di soia parzialmente idrogenata (Lipoid S75-35). 10 mi di soluzione acquosa a pH 3 vengono aggiunti alla miscela composita fusa a circa 70°C, a cui è stato aggiunto 1 mi di n-butanolo. All’emulsione cosi formata, mantenuta sotto agitazione, si aggiungono 6 mi di Tween 20 a formare una microemulsione trasparente ed anisotropa. La microemulsione, riscaldata a circa 50°C viene dispersa in 50 volumi di acqua a pH 3, a circa 3-5°C, sotto agitazione costante (250 rpm), a formare le nanoparticelle solide contenenti ubidecarenone. La sospensione viene lavata mediante ultrafilitrazione per eliminare l'eccesso di tensioattivi. La percentuale dì incorporazione di ubidecarenone nelle nanoparticelle é 99%, il diametro medio delle nanoparticelle é 195 nm e l’indice di polidispersione 0.214.
Esempio 37
Si miscelano 6g di acido stearico e 0.9g di trigliceride poliossidriiato Labrafil™ M 2130CS (15% della miscela), che vengono fusi ad una temperatura di 75 °C. Alla miscela composita fusa si aggiungono 1.5g di lecitina di soia (Lipoid S75-35), e 300 mi di soluzione acquosa a pH 5.5 contenente 3g di Tween 20. L'emulsione cosi formata viene passata in omogeneizzatore ad alta pressione Rannie-MiniLab 8.30, a temperatura di 70°C e pressione di 750 bar per tempi variabili fra 0 e 15 min. Le dispersioni vengono recuperate e raffreddate istantaneamente a 4°C, mediante agitazione costante a 250 rpm in bagno termostatato, dando origine a nanoparticelle solide. I diametri medi sono:
Tempo di Diametro (nm) Polidispersione processo
(min)
5 257 0.36
10 264 0.392
15 282 0.400
Esempio 38
Si ripete la preparazione dell’esempio 37, mantenendo la temperatura del sistema, una volta preparato il materiale composito per cofusione, al di sotto della temperatura di fusione del composito stesso (T< 50°C). La dispersione ottenuta viene pre-omogenata per 5 minuti in un omogeneizzatore - miscelatore a bassa energia (Silverson mod. L2R), e successivamente omogeneizzata ad alta pressione (750 bar) a T° costante (45°C).
Esempio 39
Si miscelano 0.39 g di acido stearico e 5.5g di trigliceride poliossidrilato Labrafil™ M 2130CS (95% della miscela), che vengono fusi ad una temperatura di 75 °C. Alla miscela composita fusa si aggiungono 3g di lecitina di soia (Lipoid S75-35) e 300 mi di soluzione acquosa a pH 5.5 contenente 12g di Tween 20. L'emulsione cosi formata viene passata in omogeneizzatore ad alta pressione Rannie-MiniLab 8.30 a temperatura di 70°C e pressione di 750 bar per tempi variabili fra 0 e 15 min. Le dispersioni vengono raffreddate istantaneamente a 4°C mediante agitazione costante a 250 rpm in bagno termostatato, dando origine a nanoparticelle lipidiche solide composite. I diametri medi sono:
Tempo di Diametro (nm) Pòlidispersione processo
(min)
3 106 0.205
5 72 0.161
10 91 0.176
Esempio 40
Si ripete la preparazione dell’esempio 39, mantenendo la temperatura de) sistema una volta preparato il materiale composito per cofusione, al di sotto della temperatura di fusione del composito stesso (T< 35°C). La dispersione ottenuta viene pre-omogenata in omogeneizzatore -miscelatore a bassa energia (Silverson mod. L2R),e successivamente omogeneizzata ad alta pressione (750 bar) a T costante (30°C).
Esempio 41
Si miscelano 3.75g di acido stearico e 3.75g di polietilenglicole 20000 (PEG 20000) (50% nella miscela) che vengono fusi ad una temperatura di 75 eC. Alla miscela composita fusa si aggiungono 3g di lecitina di soia (Lipoid S75-35) e 300 mi di soluzione acquosa a pH 5.5 contenente 6g di Tween 20. L’emulsione cosi formata viene passata in omogeneizzatore ad alta pressione Rannie-MiniLab 8.30, a temperatura di 70°C e pressione di 750 bar per tempi variabili fra 1 e 10 min. Le dispersioni vengono raffreddate istantaneamente a 4°C mediante agitazione costante a 250 rpm in bagno termostatato, dando origine a nanoparticelle solide. I diametri medi sono:
Tempo di Diametro (nm) Polidipersione processo
(min)
5 156 0.274
10 188 0.308
Esempio 42
Si ripete la preparazione dell’esempio 41 mantenendo la temperatura del sistema, una volta preparato il materiale composito per cofusione, al di sotto della temperatura di fusione del composito stesso (T< 45°C). La dispersione ottenuta viene pre-omogenata in omogeneizzatore -miscelatore a bassa energia (Silverson mod. L2R), e successivamente omogeneizzata ad alta pressione (750 bar) a T costante (45°C).
Esempio 43
Si ripete la preparazione dell’esempio 41 con una percentuale di PEG del 15% nella miscela composita e incorporando nella miscela composita stessa 300 mg di calcitonina di salmone. L’efficienza di incorporazione della calcitonina nella miscela PEG-acido stearico é del 35%.
Esempio 44
Si ripete la preparazione dell'esempio 42 mantenendo la temperatura del sistema, una volta preparato il materiale composito per cofusione al di sotto della temperatura di fusione del composito stesso (T< 45°C). La dispersione ottenuta viene pre-omogenata in Silverson e successivamente omogeneizzata ad alta pressione (750 bar) a T costante (45°C).
Esempio 45
Si prepara per cofusione e raffreddamento una miscela composita contenente acido stearico 5% e trigliceride poliossidrilato Labrafìl™ M 2130CS 95%. Alla miscela composita fusa (75°C) si aggiungono 1g di ibuprofene ed 240 mg di lecitina di soia (Lipoid S75-35) per grammo di miscela e una soluzione acquosa contenente 1.2% di Tween 20 in quantità di 40 mi di soluzione acquosa a pH 5.5 per grammo di miscela composita+farmaco. L'emulsione cosi formata viene trattata in omogeneizzatore ad alta pressione Rannie-MiniLab 8.30, a temperatura di 70°C e pressione di 750 bar, per tempi variabili fra 0 e 10 min. Le dispersioni vengono raffreddate istantaneamente a 4°C mediante agitazione costante a 250 rpm in bagno termostatato, dando origine a nanoparticelle solide. I diametri medi sono:
Tempo di Diametro (nm) Polidipersione processo
(min)
2 224 0.304
5 264 0.364
10 253 0.352
Esempio A ( secondo tecnica anteriore EP 0526666 A1)
4.2 grammi di acido stearico vengono riscaldati a fusione a circa 72°C. In 20 mi di acqua acidificata a pH 3, si sciolgono 2.6 g di sodio taurodeossicolato e la soluzione, riscaldata a 72°C viene aggiunta al’acido stearico fuso, a cui si sono aggiunti 2 mi di n-butanolo. All’emulsione cosi formata, mantenuta sotto agitazione in miscelatore, si aggiungono 5 mi di Tween 20 ottenendo Una microemulsione trasparente ed anisotropa. La microemulsione, portata a circa 60°C, viene dispersa in 5 volumi di acqua a pH 3, a circa 3-5°C, sotto agitazione costante (250 rpm), a formare le nanoparticelle secondo la tecnica utilizzata in EP 0526666A1. La sospensione viene lavata mediante ultrafiltrazione per eliminare l’eccesso di tensioattivi. Il diametro medio delle nanoparticelle é 209 nm e l’indice di polidispersione 0.155.
Esempio B
Si ripete la procedura dell’esempio A, aggiungendo 3.85 mg di calcitonina di salmone. L’efficacia di incorporazione della calcitonina nelle nanoparticelle é 1.82%. Il diametro medio delle nanoparticelle é 193 nm e l’indice di polidispersione 0.235.
Esempio C
Si ripete la procedura dell'esempio B. Alle nanoparticelle cosi preparate viene aggiunta, sotto agitazione in miscelatore, una quantità di materiale anfifilico (dimiristoil fosfatidii glicerolo, DMPG), in rapporto 1:10 rispetto alla massa lipidica di acido stearico, che viene adsorbita sulla superficie delle nanoparticelle stesse. L’efficacia di incorporazione di calcitonina sulle nanoparticelle é del 1.75%. Tale composizione secondo la prior art é direttamente confrontabile con I' esempio 5 dell’invenzione, differendone solamente per avere il componente anfifilico adsorbito sulla superficie e non componente del materiale composito costituente le nanoparticelle. La sospensione viene lavata mediante ultrafiltrazione per eliminare l eccesso di tensioattivi. Il diametro medio delle nanoparticelle é 215 nm e l indice di po!idispersione 0.175.
Esempio D
Si miscelano 1.7 g di acido stearico e 300 mg di ubidecarenone e si riscaldano a fusione a circa 70°C. Si aggiungono al cofuso 0.5 mL dì nbutanolo, 1.30 g di sodio taurodesossicolato in 10 mi di soluzione acquosa a pH 3, riscaldata a 70°C. All’emulsione cosi formata, mantenuta sotto agitazione, si aggiungono 3.25 g di Tween 20 a formare una microemulsione. La microemulsione riscaldata a circa 70°C viene dispersa in 50 volumi di acqua a pH 3 a circa 3-5°C sotto agitazione costante (250 rpm), a formare le nanoparticelle lipidiche secondo la tecnica EP 0526666A1. La sospensione viene lavata mediante ultrafiltrazione per eliminare l’eccesso di tensioattivi. La percentuale di incorporazione di ubidecarenone nelle nanoparticelle é circa 80%, il diametro medio delle nanoparticelle é 205 nm e l’indice di polidispersione 0,244.
Esempio E (secondo tecnica anteriore WO 93/05768)
7.5 g di acido stearico vengono fusi ad una temperatura di 75 °C. Si aggiungono 3g di lecitina di soia (Lipoid S75-35) e 300 mi di soluzione acquosa a pH 5.5 contenente 6g di Tween 20. L'emulsione cosi otenuta viene trattata in omogeneizzatore ad alta pressione Rannie-MiniLab 8.30 a temperatura di 70°C e pressione di 750 bar, per tempi variabili fra 0 e 10 min. Le dispersioni vengono raffreddate istantaneamente a 4°C dando origine a nanoparticelle solide secondo la tecnica descritta in WO 93/05768).
I diametri medi sono:
Tempo di Diametro (nm) Polìdipersione processo
(min)
5 190 0.254
10 178 0.308
Esempi di caratterizzazione
- Miglioramento delle caratteristiche di incorporazione di farmaci idrofili (peptidi)
Una delie caratteristiche innovative dell'invenzione é la possibilità di incrementare l’efficacia di incorporazione di farmaci idrofili (peptidi) e di migliorarne la distribuzione all’interno delle nanoparticelle composite. Tale aspetto é stato dimostrato mediante tecniche di fluorescenza.
Il peptide calcitonina é stato marcato con un fluoroforo (7- nitrobenz-2oxa-1,3 diazolo, NBD), secondo una tecnica nota (Biochem. J., 272, 713-719, [1990]), e successivamente incorporato nelle nanoparticelle come descritto negli esempi dell’invenzione 1-8 e negli esempi di confronto B-C. I campioni sono stati lavati secondo le procedure di ultrafiltrazione descritte negli esempi. Si sono calcolate, mediante misura dei valori di emissione in fluorescenza rispetto a una curva standard, e rispetto al 100% di fluorescenza emessa prima dell’ultrafiltrazione:
• la percentuale di peptide incorporato nelle nanoparticelle
• la percentuale di peptide adsorbito in superficie, rispetto al totale incorporato, misurando la fluorescenza prima e dopo il trattamento delle sospensioni con l'enzima proteolitico tripsina, capace di dissolvere e degradare solamente la frazione di peptide adsorbita sulla superficie delle particelle stesse.
I risultati, riportati in Esempio F, Tabella 1, dimostrano come le nanoparticelle composite incrementano l'efficienza di incorporazione del peptide, diminuendone la frazione localizzata in superfìcie (adsorbita ed attaccabile dagli enzimi proteolitici),e mantenendone la maggior parte all' interno della matrice composita.
ESEMPIO F
Tabella 1. Efficienza di incorporazione di calcitonina in nanoparticelle lipidiche composite, e percentuale di peptide adsorbito sulla superficie delle particelle stesse.
Modifica delie caratteristiche di massa
Un'altra delle caratteristiche innovative del prodotto dell’invenzione é la modifica delle proprietà di massa dei materiali compositi costituenti le nanoparticelle. Le modifiche delle proprietà di massa sono valutate in modo quantitativo mediante tecniche di analisi termica con un calorimetro a scansione differenziale, DSC, Perklri Elmer mod. DSC 7. Le nanoparticelle secondo l'invenzione possono essere formate o da un materiale composito omogeneo, oppure da un materiale composito che presenta fasi separate con proprietà differenti. Nel primo caso é per esempio possibile osservare che il materiale composito omogeneo presenta la modifica di un evento termico (temperatura di fusione) in funzione della composizione (Esempio G) (tabella 2). Nel secondo caso sono distinguibili più eventi termici, relativi alle transizioni termiche o alla fusione di fasi separate, che avvengono a temperature e con entalpie di transizione specifiche per ciascuna composizione percentuale (Esempi H,i) (tabelle 3 e 4). In entrambi i casi, le caratteristiche del materiale composito sono inaspettate ed imprevedibili sulla base dei singoli materiali.
La modifica del comportamento termodinamico delle nanoparticelle composite in funzione della percentuale dei componenti é osservabile anche sulle nanoparticelle in sospensione, ad esempio mediante tecniche di diffusione della luce laser (“laser tight scattering”) . Le transizioni di fase delle nanoparticelle composite sono evidenziabili dalla variazione dell'intensità di scattering in funzione della temperatura, misurata con un Particle Sizer Brookhaven mod. BI-90. Con questa tecnica, é possibile evidenziare come le nanoparticelle composite presentino transizioni di fase e fusione a temperature differenti a seconda della composizione del materiale costituente; vedi: Esempio L, Figura 1.
Esempio G
Tabella 2. Punto di fusione (C°) di miscele binarie composite di acido stearico e acidi grassi a catena media (anfifilici) corrispondenti in parte agli esempi 26-28
Esempio H
Tabella 3. Transizioni di fase ed entalpie del materiale composito acido stearico - dimiristoil-fosfatidilglicerolo (DMPG), ad alcune composizioni significative, corrispondenti in parte agli esempi 1-6.
Esempio I
Tabella 4. Transizioni di fase ed entalpie del materiale composito acido stearico-trigliceride poliossidrilato Labrafil 2130 CS, corrispondente agli esempi 18-25.
Esempio L
Figura 1. Transizioni di fase delle nanoparticelle composite (acido stearico-DMPG), determinate mediante tecniche di scattering, corrispondenti ai prodotti descritti negli esempi 3-5 e l'esempio di confronto A. La transizione di fase ( fusione ) é evidenziata dalla diminuzione dell’intensità di diffusione della luce laser (“scattering”), in funzione della temperatura. L’ inizio di tale variazione (discostamento dal plateau delle curve) corrisponde all' inizio della transizione. É evidente come, nelle composizioni secondo l’invenzione, tale transizione può essere modificata e controllata variando la composizione del materiale costituente le nanoparticelle. La temperatura di fusione delle particelle (63°C nell’esempio A), diminuisce infatti a 55°, 53° e 49°C rispettivamente negli esempi 3, 4, 5.
- Modifica delle caratteristiche di preparazione (tecnica 1 ) : intervallo di esistenza della microemulsione
Le proprietà dei materiali compositi secondo l’invenzione permettono sia di ottenere composizioni a basso punto di fusione sia di estendere l'intervallo termico di esistenza della microemulsione, utilizzata come intermedio nella preparazione delle nano particeli e composite secondo la tecnica 1 (Esempio M) (figura 2), a temperature di molto inferiori alla temperatura di fusione dei singoli materiali componenti. Tale intervallo é stato determinato mediante misurazione della frequenza di scattering, che é minima (< 10 KHz) in presenza di una microemulsione. Evidente e principale vantaggio dell’ invenzione é di poter formulare principi attivi termolabili nelle nanoparticelle composite; ulteriore vantaggio é di poter utilizzare, per la preparazione delle nanoparticelle, certi materiali a temperature inferiori rispetto alla loro temperatura di fusione.
Esempio M
Figura 2. Intervallo termico di esistenza della microemulsione costituita, in fase olio, da acido stearico ed acido decanoico (tecnica preparativa 1. Vedi esempi 26-28 ed esempio A).
- Modifica delle caratteristiche di superficie
Una delle caratteristiche innovative del prodotto dell’invenzione é la possibilità di controllare le proprietà di superficie dei materiali compositi costituenti le nanoparticelle e, di conseguenza, delle stesse nanoparticelle. Le caratteristiche di superficie delle nanoparticelle ottenute secondo le tecniche ed i materiali dell'invenzione differiscono in maniera sostanziale rispetto all’adsorbimento superficiale di componenti anfìfìlici descrìtte nello stato dell'arte, in quanto dipendenti dalla formazione del materiale composito. Un vantaggio dell'invenzione é quindi la possibilità di ottenere nanoparticelle composite con favorevoli caratteristiche di biocompatibilità , di idrofobicità, idrofilicità e polarità a seconda dell'obiettivo terapeutico da conseguire.
Le proprietà di superficie dei materiali compositi costituenti le nanoparticelle possono essere misurate con il metodo dell'angolo di contatto, utilizzando un apparato Lorentzen & Wettre. Tale metodo permette di calcolare l'energia di superficie dei materiali, correiabile alla bagnabilità, attraverso l'equazione (1),
dove gli indici sv, si, Iv, si riferiscono rispettivamente all'energia di superficie (y) delle superfici solido-vapore, solido-liquido e liquidovapore, e Θ é l’angolo di contatto del liquido con la superfìcie solida. Poiché l'energia libera di superficie di ogni materiale può essere divisa in una componente polare e una di dispersione, secondo (2):
è possibile calcolare, da misure sperimentali elaborate attraverso una serie di equazioni, i valori di tali componenti e dell’energia libera totale, come pure la polarità delle superfici, espressa in percentuale come:
Dalle misure di energia di superficie dei materiali compositi secondo l’invenzione é stato possibile determinare che il componente anfifilico può:
1 ) essere disposto preferenzialmente sulla superficie delle nanoparticelle costituite dal materiale composito (“segregato in supèrflue");
2) essere disposto preferenzialmente all' interno delle nanoparticelle costituite dal materiale composito (“segregato all'interno”);
3) può disporsi omogeneamente sulla superficie e all’interno delle nanosfere stesse.
Si riportano, a titolo di esempio nelle figure 3, 4 e 5 i diagrammi delle energie di superficie delle miscele composite: acido stearico-DMPG (Esempio N), costituenti le nanoparticelle descritte negli esempi 1-6, acido stearico-trigliceride poliossidrilato Labrafac Hydro™ (esempio O), costituenti le nanoparticelle descritte negli esempi 13-17, acido stearicotrigiiceride caprilico-caprico Labrafac Lipo (Esempio P).
Nelle figure 3, 4 e 5 le curve A, B e C si riferiscono rispettivamente all’energia libera di superficie totale, alla componente di dispersione ed alla componente polare.
Esempio N
Figura 3. Andamento dell’energia di superficie della composizione acido-stearico-DMPG, riferibile agli esempi 1-6. L'andamento, caratterizzato da un decremento dell’energia totale, indica una “segregazione preferenziale in superficie" del componente anfifilico DMPG nella miscela composita.
Esempio O
Figura 4. Andamento dell’energia di superficie della composizione acido-stearico-Labrafac Hydro, riferibile agli esempi 13-17. L’andamento indica una “segregazione preferenziale all’ interno” del componente anfifilico Labrafac Hydro nella miscela composita (e del componente acido stearico all’esterno).
Esempio P
Figura 5. Andamento dell'energia di superficie della composizione acido-stearico-Labrafac Lipo. L’andamento invariante indica una distribuzione omogenea del componente anfifilico Labrafac Lipo nella miscela composita.
La variazione delle proprietà di superficie delle nanoparticelle composite in funzione della composizione dei materiali compositi utilizzati, é quantificabile anche attraverso misure di potenziale Zeta effettuate con un analizzatore elettroforetico a diffusione di luce laser, ZetaMaster (Malvern, UK), sulle sospensioni acquose di nanoparticelle composite. Il potenziale Zeta (potenziale al piano di shear) é una misura della carica di superficie delle nanoparticelle in sospensione. É evidente dagli esempi Q-T che il potenziale zeta delle nanoparticelle, e di conseguenza le proprietà di superficie, variano in funzione della percentuale di materiale anfifilico nel composito, con un andamento proprio a ciascuna composizione.
La possibilità di modificare le proprietà di superficie ed il potenziale Zeta delle nanoparticelle dell’ invenzione ha inoltre Γ importante vantaggio di diminuire od eliminare la tendenza delle sospensioni alla sedimentazione o all’ aggregazione, aumentandone quindi la stabilità. Tale vantaggio può essere ottenuto quindi modificando la composizione del materiale costituente le nanoparticelle stesse.
Tabella 5. (Esempi Q-T)
Esempio Q
Potenziale Zeta (mV) misurato sulle nanoparticelle acido stearico-DMPG, preparate analogamente agli esempi 2-5 ed A.
Esempio R
Potenziale Zeta (mV) misurato sulle nanoparticelle acido stearico-DMPC, preparate analogamente agli esempi 9-11 ed A.
Esempio S
Potenziale Zeta (mV) misurato sulle nanoparticelle acido stearicotrigliceride poliossìdrilato Labrafac Hydro, preparate analogamente agii esempi 13-16 ed A.
Esempio T
Potenziale Zeta (mV) misurato sulle nanoparticelle acido stearicotrigliceride poliossìdrilato Labrafil 2130 CS, preparate analogamente agli esempi 19-24 ed A.
- Morfologia delle nanoparticelle composite secondo l’invenzione e secondo la tecnica anteriore.
A conferma delle sostanziali differenze fra le nanoparticelle secondo Γ invenzione e la tecnica anteriore, si é osservata la morfologia di alcuni campioni significativi (corrispondenti all’ Esempio 6 ed Esempio A), mediante la tecnica di microscopia elettronica a trasmissione (TEM), utilizzando la procedura di "colorazione negativa" (citrato di uranile) per la preparazione dei campioni di nanoparticelle.
In Figura 6 é evidente la differente morfologia delle nanoparticelle composite (Esempio 1 , Fig. 6a), rispetto a quelle preparate secondo la tecnica anteriore (Esempio A Fig. 6b): si notano infatti sulle particelle in 6a aree morfologicamente differenti, chiare e scure, corrispondenti alle fasi del materiale composito ("segregazione preferenziale”), mentre il sistema 6b appare omogeneo.
Ingrandimenti ulteriori del campione corrispondente all’ esempio 1 (Figura 7a e 7b) suggeriscono che il materiale presente in superficie é differente da un monostrato di materiale anfìfitìco adsorbito sulla superfìcie della particella, ma é parte integrante della particella stessa. - Miglioramento dell’ assorbimento orale di peptidi (farmacocinetica ed efficacia terapeutica)
Per dimostrare un importante vantaggio dell'invenzione, sono state somministrate “in vivo” nanoparticelle lipidiche composite contenenti calcitonina di salmone come principio attivo (Esempi 2,4,5), e nanoparticelle contenenti calcitonina preparate secondo la tecnica anteriore (Esempi A,B,C).
Protocollo di Dosaggio ed Analisi dei Campioni
Sospensioni di nanoparticelle composite secondo l’invenzione (20 mi) contenenti calcitonina (attività specifica: 4000 Ul/mg; dose nominale: 600 Ul/Kg, dose effettiva incorporata nelle nanoparticelle: 60-80 Ul/Kg), furono somministrate a 4 macachi Rhesus per via orale. Campioni di sangue (1.5 mi) furono prelevati a tempi determinati ed analizzati immediatamente dopo il prelievo.
Farmacocinetica ; la concentrazione di peptide nel plasma fu determinata mediante un saggio radioimmunologico specifico (RIA), espressa come milliunità/ml (mUl/ml).
Efficacia terapeutica: i livelli di Calcio totale nel plasma furono determinati mediante un Kit colorimetrico (Cobas Mira, Roche, CH). I livelli di Calcio ionizzato furono determinati mediante iniezione in uno strumento equipaggiato con membrane ione-seléttive (IG Radiometer, Copenhagen, DK). I risultati furono espressi come variazione percentuale dei livelli di Calcio rispetto alla linea di base.
I risultati vengono riportati nelle figure 8-11 relative agli esempi U-Z 1 di seguito riportati.
Esempio U
Figura 8. Cinetica di assorbimento di calcitonina formulata in composizioni secondo l’invenzione (Esempi 2,4,5) e in composizioni secondo la tecnica anteriore (Esempi A,B,C), dopo somministrazione orale.
Esempio V
Figura 9.Cinetica di variazione del calcio totale nel sangue dopo somministrazione per via orale di calcitonina formulata in composizioni secondo l’invenzione (Esempi 2,4,5) e in composizioni secondo la tecnica anteriore (Esempi A,B,C).
Esempio Z
Figura 10. Cinetica di variazione del calcio ionizzato nel sangue dopo somministrazione per via orale di calcitonina formulata in composizioni secondo l'invenzione (Esempi 2,4,5) e in composizioni secondo la tecnica anteriore (Esempi A,B).
Esempio Z 1
Figura 11. Biodisponibilità , espressa come AUC (0-8 ore) (area sottesa alla curva di cinetica piasmatica) relativa alla somministrazione orale di calcitonina formulata in composizioni secondo l’invenzione (Esempi 2,4,5, 7) e in composizioni secondo la tecnica anteriore (Esempi A,B e C).
Risulta evidente dalle prove di farmacocinetica riportate che la biodisponibilità della calcitonina formulata in nanoparticelle composite secondo l'invenzione e somministrata per via orale, è significativamente incrementata (fino a 13.5 volte) rispetto alle formulazioni della tecnica anteriore. Inoltre, é evidente che le nanoparticelle secondo l'invenzione permettono, oltre ad un incremento dell’assorbimento, anche un controllo deH’assorbimento del peptide il quale è presente in forma attiva nel plasma fino ad 8 ore dalla somministrazione. Le prove di efficacia terapeutica, inoltre, evidenziano come l’effetto sul calcio ematico è maggiore per le formulazioni dell’invenzione (Esempi 2,4,5) rispetto alle formulazioni secondo la tecnica anteriore (Esempi A, B, C), e non dipende dalla semplice miscela dei componenti (Esempio C), ma dalla presenza di materiale composito.

Claims (20)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composizioni farmaceutiche in forma di nanoparticelle solide, caratterizzate dal fatto di comprendere un materiale composito, costituito da almeno una sostanza lipidica e da almeno una sostanza anfifilica, ed un principio farmacologicamente attivo idrosolubile, liposolubile o scarsamente solubile.
  2. 2. Composizioni secondo la rivendicazione 1, caratterizzate dal fatto che detta sostanza lipidica è presente in quantità da 0,5 a 99,5% e che detta sostanza anfifilica è presente in quantità da 0.5 a 99.5% e detto principio attivo è presente in quantità da 0.001 e 99% in peso rispetto alla somma di detta sostanza lipidica e di detta sostanza anfifilica.
  3. 3. Composizioni secondo la rivendicazione 1 , caratterizzate dal fatto che dette nanoparticelle hanno diametro inferiore a 1000 nm, e preferibilmente comprese fra 50 e 500 nm.
  4. 4. Composizioni secondo la rivendicazione 1, contenenti: 1) una miscela di due o più materiali di cui almeno uno lipidico ed uno anfifilico che formano un materiale composito; 2) uno o più agenti di superficie, tensioattivi e cotensioattivi; 3) una fase disperdente/sospendente acquosa o non acquosa; 4) una o più sostanze farmacologicamente attive.
  5. 5. Composizioni secondo la rivendicazione 4 in forma di microemulsioni aventi intervallo di esistenza a temperature inferiori alla temperatura di fusione dei singoli componenti.
  6. 6. Composizioni secondo la rivendicazione 1 , caratterizzate dal fatto che detta sostanza lipidica è scelta fra grassi naturali, olii vegetali parzialmente o totalmente idrogenati, mono-, di- e tri-gliceridi semisintetici e di sintesi contenenti acidi grassi saturi e/o insaturi con lunghezza delle catene alifatiche variabile fra C10 e C22 e loro derivati poliidrossietilati, cere liquide scelte fra isopropil miristato, isopropilcaprinato, -caprylato, -laurato, -palmitato, -stearato; esteri di acidi grassi scelti fra etil oleato, oleil oleato, cere solide scelte fra cera carnauba e cera d’api, alcooli alifatici scelti fra alcool cetilico, alcool stearilico, alcool laurico, alcool cetilstearilico e loro derivati poliidrossietilati; acidi carbossilici alifatici (C10-C22), scelti fra acido decanoico, laurico, paimitico, stearico, behenico, oleico, linoleico e loro derivati poliidrossietilati.
  7. 7. Composizioni secondo la rivendicazione 1 , caratterizzate dal fatto che detta sostanza anfifilica è scelta fra fosfatidilglicerolo, fosfatidilcolina, acido fosfatidico, glyceril monostearato, glyceril monooleato, glyceril palmitostearato, trigliceridi e trigliceridi poliidrossilati, esteri di acidi grassi ed acidi grassi a catena media (C6-C12), polietilenglicole, copolimeri poli-(propilenossido) poli -(etilenossido), poloxamer, poli-vinil alcool, poliacrilati, copolimeri poli-(metil vinil etere) - anidride maleica, chitosano, acido ialuronico, cellulosa, amido, xantano, scleroglucano, gellano, gomma guar, gomma locust bean, alginato, dextrano, poli -εcaprolattone, poli-idrossi-butirrato, acido polilattico, acido poliglicolico e copolimeri.
  8. 8. Composizioni secondo la rivendicazione 4, caratterizzate dal fatto che detta fase disperdente comprende acqua, come tale o tamponata a diversi pH e forza ionica, soluzioni acquose di polimeri idrofili, idrosolubili o idrodisperdibili scelti fra polietilenglicole, polivinilpirrolidone, acidi poliacrilici, acidi polimetacrilici, copolimeri di poliossietilenepoliossipropilene, destrano, xanthano, scleroglucano, gomma arabica, gomma guar, chitosano, derivati della cellulosa e dell’ amido, sorbitolo, mannitolo, xilitolo, alcooli alitatici, mono o poliossidrilici, a catena corta, polietilenglicoli liquidi, gliceridi poliglicolici, propilenglicole, tetraglicole, ed etossidiglicole.
  9. 9. Composizioni secondo la rivendicazione 4, caratterizzate dal fatto che detti tensioattivi sono scelti fra sorbitan-esteri di acidi grassi, poliossietilen sorbitan esteri di acidi grassi, copolimeri di polipropilenossido-polietilenossido, esteri di polietilengiicoie-glicerolo, esteri di polietilenglicole ed acidi o alcooli alitatici a catena lunga, esteri poligliceridi , esteri di saccaridi ed acidi grassi, sodio laurilsolfato, sodio stearato, sodio oleato, sodio glicocolato, taurodesossicolato, taurocolato, ursodesossicolato, lecitine tal quali, parzialmente idrogenate ed idrogenate, fosfolipidi e loro derivati semisintetici o sintetici e sorbitanesteri di acidi grassi.
  10. 10. Composizioni secondo la rivendicazione 4, caratterizzate dal fatto che detti cotensioattivi sono scelti fra etanolo, 2-propanolo, n-butanolo, isopropanolo, acido butirrico, valerianico, capronico, alcool benzilico, acido decanoico, acido laurico, caprini) alcool, lauri) alcool, esteri o eteri di acidi od alcooli alitatici a catena medio-lunga con alcooli mono- o poliossidrilati.
  11. 11. Composizioni secondo la rivendicazione 1, caratterizzate dal fatto che detti principi attivi idrosolubili comprendono calcitonina, somatostatina, somatotropina (GH), LH-RH analoghi, desmopressina (DDAVP), interferone, molgramostim, fattore di crescita epidermica (EGF), fattore di crescita nervosa (NGF), insulina, glucagone, tossine o tossoidi, fattori antigenici di tipo proteico o polisaccaridico, eparina, eparina a basso peso molecolare ed eparinoidi.
  12. 12. Composizioni secondo la rivendicazione 1, caratterizzate dal fatto che detti principi attivi liposolubili comprendono ciclosporina, leuprolide, taxolo e derivati ed etoposide.
  13. 13. Composizioni secondo la rivendicazione 1, caratterizzate dal fatto che detti principi attivi scarsamente solubili comprendono acyclovir e ganciclovir.
  14. 14. Processo per la preparazione di composizioni farmaceutiche come definite nella rivendicazione 1 o nella rivendicazione 4, caratterizzato da: a) iniziale cofusione o cosolubilizzazione di almeno una sostanza lipidica con almeno una sostanza anfìfìlica alla temperatura di fusione delle sostanze stesse od almeno alla temperatura di fusione di una delle due sostanze quando l’altra è solubile o disperdibile nella prima, ottenendo un materiale composito; b) aggiunta a detto materiale composito fuso di una soluzione acquosa contenente uno o più tensioattivi e cotensioattivi, riscaldata alla stessa temperatura del materiale composito fuso, a formare una microemulsione, oppure formazione della microemulsione portando a temperatura di fusione i componenti lipidici ed anfifilici in presenza dell’acqua e dei tensioattivi e cotensioattivi necessari alla formazione della microemulsione stessa; c) discioglimento o dispersione del principio attivo nel materiale cofuso di partenza, oppure aggiunta del principio attivo alla microemulsione; d) dispersione della microemulsione in acqua o in ambiente acquoso a temperatura compresa fra 1 e 10°C, oppure in solventi non acquosi miscibili con l’acqua a temperatura compresa fra -15 e -30°C, con l'ottenimento di una sospensione di nanoparticelle; e) opzionalmente le nanoparticelle sono lavate con acqua o soluzioni acquose attraverso un sistema di ultrafiltrazione o dialisi per eliminare i tensioattivi, i cotensioattivi e il farmaco libero presente nella sospensione, e ottenute sotto forma di polvere secca mediante liofilizzazione o filtrazione o spray drying o evaporazione del solvente.
  15. 15. Processo per la preparazione di composizioni farmaceutiche come definite nella rivendicazione 1 o nella rivendicazione 4, caratterizzato da: a) cofusione o cosolubilizzazione di almeno una sostanza lipidica con almeno una sostanza anfifilica alla temperatura di fusione delle sostanze stesse od almeno alla temperatura di fusione di una delle sostanze, quando l’altra è solubile o disperdibile nella prima, ottenendo un materiale composito; b) dispersione del materiale composito in una soluzione acquosa contenente sostanze tensioattive, sostanze stabilizzanti e/o viscosizzanti, mediante tecniche di omogeneizzazione ad alta pressione, mantenendo la miscela alla temperatura di fusione del materiale composito o alla sua temperatura “rammollimento", o a temperature che mantengono il materiale composito allo stato solido; c) raffreddamento della miscela mediante passaggio in un circuito refrigerante a temperature comprese fra 10°C e -30°C ottenendo le nanoparticelle; d) opzionalmente le nanoparticelle sono lavate con acqua o soluzioni acquose attraverso un sistema di ultrafiltrazione o dialisi, che permette di eliminare i tensioattivi, cotensioattivi e il farmaco libero presente nella sospensione e le nanoparticelle composite vengono recuperate come solido mediante tecniche di liofilizzazione oppure mediante tecniche di filtrazione oppure mediante tecniche di spray-drying oppure mediante tecniche di evaporazione del solvente, il principio attivo essendo aggiunto durante lo stadio di cofusione o cosolubilizzazione oppure negli stadi successivi del processo, tale quale oppure in miscela con sostanze ad azione di superficie che favoriscono l’incorporazione nelle nanoparticelle o l’adsorbimento sulla loro superficie.
  16. 16. Composizioni secondo la rivendicazione 1, caratterizzate dal fatto che dette nanoparticelle sono disperse in sospensione acquosa a concentrazione compresa fra 0,1 e 50% p/v.
  17. 17. Composizioni secondo la rivendicazione 1, caratterizzate dal fatto che dette nanoparticelle sono formulate come sospensione acquosa all’interno di capsule o di ovuli per uso farmaceutico.
  18. 18. Composizioni secondo la rivendicazione 1, caratterizzate dal fatto che dette nanoparticelle sono formulate in forma di sciroppo.
  19. 19. Composizioni secondo la rivendicazione 1, caratterizzate dal fatto che dette nanoparticelle sono formulate come polvere solida, all’interno di capsule per uso farmaceutico
  20. 20. Composizioni secondo la rivendicazione 1 , caratterizzate dal fatto che dette nanoparticelle sono formulate come polvere solida, all'interno di compresse, pellets o granuli per uso farmaceutico.
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