KR100593861B1 - 칼시토닌을 함유한 경구투여용 나노입자의 제조방법 - Google Patents

칼시토닌을 함유한 경구투여용 나노입자의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 칼시토닌을 함유하는 경구투여용 제제의 제조방법으로,
칼시토닌이 양전하를 띄게 되는 pH 범위내에서 칼시토닌과 상기 pH 범위내에서 음전하를 띄는 지방산을 이온결합시켜 소수성 복합체를 합성하는 단계와, 상기 단계에 의한 소수성 복합체와 생분해성 고분자를 유기용매에 용해한 것을 소정의 분산매에 분산시켜 칼시토닌이 봉입된 나노입자를 합성하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 칼시토닌을 함유한 경구투여용 나노입자의 제조방법을 개시한다
상기 과정에 의하면 칼시토닌을 지방산과 이온결합체를 형성시킴으로써 유기용매에 대한 용해도를 개선하며, 또한 이를 이용하여 나노입자를 제조시에 칼시토닌의 열적 안정성과 장막세포에 대한 투과율을 개선할 수 있다.

Description

칼시토닌을 함유한 경구투여용 나노입자의 제조방법{Method for Synthesis of Nanoparticles Containing Calcitonin with the Form of Oral Delivery}
도 1은 칼시토닌과 올레이트의 복합체 형성곡선.
도 2는 칼시토닌-올레이트 복합체의 생체조건에서의 결합안정성을 나타내는 결과도.
도 3은 트립신에 대한 칼시토닌-올레이트 복합체의 안정성을 나타내는 결과도(그림에서 sCT:연어 칼시토닌, sCT-oleate complex: 칼시토닌-올레이트 복합체).
도 4는 칼시토닌-올레이트 복합체의 열적안정성을 나타내는 결과도(그림에서 sCT:연어 칼시토닌, sCT-oleate complex: 칼시토닌-올레이트 복합체).
도 5는 칼시토닌 나노입자의 다중형크기분포도.
도 6은 칼시토닌 및 칼시토닌 나노입자의 유세포분석결과도(x축: FSC, y: FL-1)(D: 로딩량 1%. E: 로딩량 3%, F: 로딩량 5%).
도 7은 칼시토닌 엔도시토시스결과도(D: 로딩량 1%. E: 로딩량 3%, F: 로딩량 5%).
도 8은 칼시토닌 및 칼시토닌 나노입자에 대한 장막모델 투과실험결과도[x축: 처음 넣어준 칼시토닌의 양(ug), y축: 투과전달된 칼시토닌(ug/㎠)].
도 9는 실험용 쥐에 대한 칼시토닌 나노입자의 경구투여실험 결과도(sCT: 연 어 칼시토닌, sCT NP: 칼시토닌 나노입자, control: 대조군).
도 10은 칼시토닌 나노입자를 이용한 실험용 쥐의 혈중 칼슘 강하 효과 실험결과도(sCT NP: 칼시토닌 나노입자, control: 대조군)
본 발명은 칼시토닌을 함유하는 경구투여용 제제의 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 칼시토닌을 소정의 지방산과 이온결합시켜 소수성 이온 복합체를 형성하고 이를 생분해성 고분자와 함께 적당한 유기 용매에 용해시킨 것을 소정 분산매에 분산시켜 제조하는 경구투여용 나노 입자의 신규 제조 방법에 관한 것이다.
칼시토닌(calcitonin)은 골다공증(osteroporosis)의 치료 목적으로 사용되는 32개 아미노산의 서열을 가진 단백질이다. 골다공증은 나이가 듦에 따라 골밀도가 낮아져 뼈가 골절되기 쉬운 병이다. 현재까지 골다공증의 치료를 위해 사용되는 약물은 에스트로겐, 비스포스포네이트, 칼시토닌 등이 있으며 칼시토닌에 의한 골다공증의 치료는 다른 약물에 비해 많은 비용이 소요된다. 그러나 칼시토닌은 부작용이 적어 다른 골다공증 치료의 부작용으로 치료에 성공하지 못한 경우 사용할 수 있다.
칼시토닌은 주로 혈액중의 칼슘을 뼈를 형성하는 세포로 옮겨주는 작용을 한다. 경구 투여용 제제에는 현재 나노 입자를 이용한 것, 마이크로 에멀젼을 이용한 것 등이 이용되고 있다. 나노입자를 이용한 제제는 약물을 고분자 중합체로 감싸서 소화 효소 및 외부의 환경 변화로 인한 칼시토닌 단백질의 변성 및 활성도 감소를 막아주게 되며, 소장에서 특별히 약물의 흡수가 촉진되는 부위인 Peyer's patch에서의 흡수가 증가되는 효과가 있다.
그러나 칼시토닌과 같은 단백질 약물은 나노 입자에 봉입되기 어려운데, 그 이유는 나노 입자의 제제화를 위해서는 단백질 약물이 나노 입자를 구성하는 고분자와 함께 유기 용매에 용해되어져야 하나, 칼시토닌을 포함한 수용성 단백질은 물에 비해 유기 용매에 대한 용해도가 낮아 많은 양이 용해될 수 없다. 또, 유기 용매에 용해된 단백질 약물도 나도 입자를 만드는 과정 중 유기 용매를 수용액 상으로 분산시킬 때 상대적으로 용해도가 좋은 수용액으로 퍼져나가 고분자 나노 입자로 봉입되는 약물의 양이 적어지는 문제가 있다.
현재 많은 연구진들에 의해 단백질 약물을 유기 용매에 가용화하기 위한 연구들이 진행 중에 있다. 지금까지 가장 많은 연구가 진행된 분야로는 단백질에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 접합시키는 것이다. 이는 단백질의 아민기(-NH2)와 PEG를 화학적으로 접합시켜 PEG 사슬의 영향으로 인해 단백질이 유기 용매에 녹을 수 있게 하는 것이다.
그러나 이 경우, 단백질에 화학적으로 이물질을 접합시키기 때문에 단백질 약물이 가진 자체의 활성도가 변화할 가능성이 높으며, 또한 단백질 약물이 FDA의 승인을 받은 것이라고 해도 일단 화학적인 변형이 적용되면 새로운 약물로 간주되기 때문에, FDA의 승인을 다시 받아야 하는 경우가 생긴다. 따라서 기존의 약물에 화학적인 변형을 하지 않으면서 유기 용매에 가용화시킬 수 있는 방안이 강구되어져야 한다.
이에, 본 발명자들은 종래 단백질 약물의 전달시 문제가 되었던 단백질 약물의 불안정성과 저흡수율을 극복하고자 생분해성 나노입자에 칼시토닌을 봉입하는 방법을 연구한 결과, 소정의 지방산을 이용해 소수성 복합체를 형성하면 본래 유기용매에 낮은 용해율을 보이는 칼시토닌의 단점을 극복하여, 유기용매에 대한 용해율을 높임으로써 안정적으로 생분해성 나노입자를 만들 수 있음을 확인하고서 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 칼시토닌과 지방산을 이온 결합시키고 이것을 나노입자 형태로 제제화하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명은 칼시토닌을 함유하는 경구투여용 나노입자의 제조방법에 있어서,
칼시토닌이 양전하를 띄게 되는 pH 범위내에서 칼시토닌과 상기 pH 범위내에서 음전하를 띄는 지방산을 이온결합시켜 소수성 복합체를 합성하는 단계와, 상기 단계에 의한 소수성 복합체와 생분해성 고분자를 유기용매에 용해한 것을 소정의 분산매에 분산시켜 칼시토닌이 봉입된 나노입자를 합성하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 칼시토닌을 함유한 경구투여용 나노입자의 제조방법을 포함한다.
삭제
상기 칼시토닌과 이온결합에 관여하는 지방산은 바람직하기로는 이온결합이 수행되는 용매환경에서 양극성 지방산인 것이 바람직하다. 통상적으로 이온결합은 물, 완충용액 또는 이들의 혼합액을 용매로 하여 pH 5 내지 10의 범위내에서 당업자에 의해 적의 선택되어 수행될 수 있으며, 이때 상기 범위하에서는 칼시토닌은 양전하를 띠게 되므로 상기 지방산은 바람직하기로는 음전하를 띠는 것 중에서 선택함이 바람직하다. 상기 요건을 충족하는 지방산의 예를 들면 올레산, 디옥시콜레산, DHA, 리놀레산, 라우레산, DMPG 등이 있으며 이들 중 적어도 1종이 여기에 포함될 수 있다.
소수성 복합체를 합성시에 칼시토닌과 지방산과의 결합비율은 특별한 한정을 요하지는 아니하나 칼시토닌과 지방산의 표면 전하를 고려할 때, 중량비로 1:1∼1:100으로 하여둠이 바람직하다. 상기와 같이 합성된 소수성 복합체는 나노입자의 제조시 통상적으로 동결건조된 형태로서 제공되어 질 수 있다.
생분해성 고분자는 소정의 분산매의 존재하에 소수성 복합체와 나노입자를 합성하기에 충분한 것인 한 특별히 한정되지 아니한다. 이들 고분자의 예로는 폴리에스테르계와 폴리메타아크릴산 계열의 고분자를 들 수 있다. 바람직하기로 상기 폴리에스테르계의 예로는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(D,L-락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시 부틸레이트), 폴리(하이드록시 발러레이트) 등이 있으며 이들 중에서 적어도 1종을 포함할 수 있다. 또한 바람직하기로 폴리메타아크릴산 계의 예로는 폴리메타아크릴산, 폴리메틸메타아크릴산, 폴리(메타아크릴산-메틸메타아크릴산) 등이 있으며 이들 중에서 적어도 1종을 포함할 수 있다. 상기 고분자들 중에서도 보다 바람직하기로는 폴리(D,L-락트산-코-글리콜산)과 폴리(메타아크릴산-메틸메타아크릴산)이 사용되어진다.
나노입자의 제조를 위해서는 적당한 유기용매를 선택하여 소수성 복합체와 생분해성 고분자를 용해하는 과정이 수반된다. 이 경우 유기용매는 사용되는 용질(소수성 복합체와 생분해성 고분자)의 종류에 따라 당업자에 의해 적절한 선택이 가능하다. 이러한 유기용매의 구체적인 예로는 디메틸술폭사이드(DMSO), 디메틸포름알데히드(DMF) 등이 있으며 이에 한정되지는 아니한다.
소수성 복합체와 생분해성 고분자가 용해된 유기용매는 이후 소정의 분산매에 분산되어 칼시토닌이 봉입된 나노입자(이하 칼시토닌 나노입자라 칭한다)를 형성시킨다. 이때 사용가능한 분산매의 예를 들면 물, 완충용액, 에탄올, 메탄올 등을 포함하는 친수성 알콜 등이 이에 포함되며 이들 중에서 적어도 1종을 포함할 수 있다. 상기 소수성 복합체와 생분해성 고분자를 함유하는 용해액과 상기 분산매와의 비는 특별한 한정을 요하는 것은 아니지만 나노 입자의 안정적인 생성이라는 면에서 중량비로 1:10∼1:100으로 하는 것이 바람직하다.
상기 방법에 의해 제조된 칼시토닌 나노입자 중 지방산으로서 올레산을 이용하고 생분해성 고분자로서 PLGA를 사용하여 제조한 나노 입자의 성능 실험 결과 장내벽 배양 세포에 대해 기존의 칼시토닌에 비해 우수한 투과성을 보임을 확인할 수 있었다.
따라서 상기 본 발명에 의한 칼시토닌 나노입자는 경구투여용 골다공증 치료제의 유효성분으로 적용함이 가능하다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 구체적으로 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위를 한정하는 것은 아니다.
<실시예 1> 칼시토닌-올레이트 복합체의 제조
복합체의 제조
원료인 연어 칼시토닌(sCT)(0.5 mg)은 3차 증류수(이하 DDW라 약칭함)(10ml)에 녹여 준비하고, 올레이트는 소듐올레이트(시그마)(10mg)를 PBS(phosphate buffered saline)(1 ml)에 완전히 용해시켜 준비하였다. 상기 칼시토닌 수용액에 소듐올레이트 용액을 서서히 떨어뜨리면서 교반해 주었다. 복합체가 형성된 것을 육안으로 확인한 후, 7000 rpm으로 30 분 동안 원심분리하여 칼시토닌-올레이트 복합체를 침전시켰다. 상등액을 제거하여 얻어진 펠릿을 1일 동안 감압 조건하에서 완전히 건조시켰다.
도 1은 600nm에서 Shimadzu UV/VIS 스펙트로포토미터로 측정한 결합 곡선으로 이에 의하면, 칼시토닌과 올레이트의 결합은 약 1:4(칼시토닌:올레이트)의 몰비율에서 포화되는 것으로 나타났다.
결합안정성
생체 조건에서 어느 정도 분리되는지 알아보기 위해 PBS의 부피를 변화시켜가면서 실험을 실시했다(도 2). 1㎖ PBS와 10㎖ PBS의 경우 24시간 동안의 배양동안 약 10% 정도의 칼시토닌이 분리되었으나 그 양이 크지 않아 생체조건에서 단시간 동안에는 비교적 안정한 복합체를 유지하고 있음이 관찰되었다.
효소에 대한 안정성
트립신에 대한 안정성을 알아보기 위해, 제조된 복합체를 500㎕의 PBS에 분산시킨 후, 트립신을 20㎕ 가하여 37℃에서 1시간부터 6시간까지 방치하였다. 대조군으로는 1mg/㎖의 칼시토닌이 용해된 PBS(pH 7.4)를 사용하였다. 이것을 다시 NaCl 1M PBS 500㎕를 첨가한 후 10분 동안 보텍스하였다. 원심분리하여 상층액을 C18 역상 크로마토그래피(spherisorb S5 ODS2, Waters)를 사용하여 분석하였다(도 3: 이동상은 아세토니트릴을 0.01% TFA DDW와 혼합한 것을 이용하여 분석하였으며, 신호수집은 여기 282nm, 방출 320nm의 형광검출기가 사용되었다. 6시간 동안의 배양동안 대조군인 칼시토닌은 거의 분해되어 칼시토닌이 남아있지 않았지만 칼시토닌-올레이트 복합체의 경우는 비교적 낮은 분해속도를 보여 주었다.
열에 대한 안정성
제조된 복합체의 열적 안정성을 알아보기 위해, 칼시토닌-올레이트 복합체 및 순수 칼시토닌을 PBS(pH 7.4)에 용해시킨 후 80℃ 로 가열하여 1시간부터 24시간까지 각각 방치한 후 상기한 바와 동일한 방법으로 칼시토닌을 분리하여 분석하였다.
칼시토닌의 경우에는 24시간 뒤에 원래의 상태를 유지하고 있는 칼시토닌이 5% 이하였지만 칼시토닌-올레이트 복합체의 경우에는 약 60% 정도가 원래의 구조로 남아 있었다(도 4).
<실시예 2> 칼시토닌 나노입자의 제조
일정한 양(1mg, 3mg, 5mg)의 칼시토닌-올레이트 복합체와 PLGA (99mg, 97mg, 95mg)를 섞어 이것을 DMSO 5㎖에 완전히 용해시킨 다음, 호미게나이저로 100㎕의 DDW를 섞어주면서 위의 혼합액을 천천히 첨가하여 칼시토닌 나노입자를 제조하였다.
제조된 칼시토닌 나노입자 용액을 투석막(MWCO 10,000)을 사용하여 3회 반복하여 투석을 실시하여 DMSO를 완전히 제거하였다. 브루크해븐 인스트루먼트 (Brookhaeven Instrument)사의 제타플러스(ZetaPlus)를 사용하여 동적광산란(DLS)법에 의해 상기 제조된 나노입자의 크기를 측정하였다. 로딩량을 측정하기 위해, 10㎖의 나노입자 용액을 고속원심분리기를 이용하여 나노입자만을 침전시킨 후, 이를 동결건조하였다. 완전히 건조된 칼시토닌 나노입자를 DMSO에 녹인 후 280nm에서 흡광도를 측정해 칼시토닌의 로딩량을 결정하였다.
나노입자의 로딩량, 로딩 효율, 유효직경 등이 하기 표 1에 요약되어 있다.
<표 1> 나노입자의 물리적 특성
유효직경(nm) 로딩량(w/w,%) 로딩효율(w/w,%)
A(1%) 353.41 0.96±0.12 96.00±0.12
B(3%) 335.14 1.83±0.23 53.53±7.67
C(5%) 387.76 2.70±0.31 54.31±6.20
로딩 효율은 로딩량이 증가할수록 감소하여 50%정도에서 포화되는 현상을 보이며, 유효직경은 로딩량에 따라 크게 달라지지 않는 현상을 나타냈다. 칼시토닌 나노입자의 다중형크기분포(multimodal size distribution)를 관찰해 보면 300nm근처에 대부분의 군집이 존재함을 알 수 있다(도 5, 유효직경: 320.33nm).
<시험예 1> Caco-2 세포를 이용한 나노입자의 세포내 이행
실시예 2에 의해 제조된 칼시토닌 나노입자가 순수 칼시토닌에 비해, 장내막 세포인 caco-2 세포내로 얼마나 많이 이행되어지는지 알아보기 위해 caco-2 세포에 대한 엔도시토시스 실험을 실시하였다. 도 6은 유세포분석기(Flow cytometry)로 세포안에 들어간 로다민-sCT(Rhodamine-sCT)의 양을 측정한 것이다. 칼시토닌(sCT)의 경우보다 D, E, F (각각 로딩량이 1%, 3%, 5%)의 칼시토닌 나노입자의 경우에서 caco-2가 가장 많은 형광을 나타내고 있었다. 이것을 사분면의 좌측, 위쪽만 gating하여 gated event를 조사해보면 이 차이가 더욱 확연하게 관찰된다(도 7). sCT의 경우는 7%정도의 event를 기록하고 있지만 D, E, F의 경우에는 30%가 넘는 event를 기록하고 있어 칼시토닌을 나노입자로 제제화함으로써 caco-2 세포 안에 더욱 많은 양의 칼시토닌을 전달시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다. 이것은 소장에 서 칼시토닌 나노입자의 트랜스시토시스가 더 많이 이루어져 결국 많은 양의 칼시토닌이 전달될 수 있을 것이라는 가능성을 제공해 준다.
<시험예 2> Caco-2 cell을 이용한 인공 장세포막 투과실험
칼시토닌과 칼시토닌 나노 입자가 사람의 소장에서 어느 정도 흡수되는지 비교하기 위해 인공적인 장세포막을 만들어 각각에 대한 흡수율을 알아보았다. 장세포로는 caco-2 세포를 사용하였으며 트랜스웰(Transwell, Costar사 제품)을 이용하여 세포배양을 하였다. 도 8은 칼시토닌과 칼시토닌 나노입자에 대한 장막모델투과실험결과 약물 투여후 18시간이 경과한 뒤 칼시토닌의 량을 정량한 결과를 보여준다. 이에 의하면 칼시토닌 나노입자가 칼시토닌에 비해 100배 이상의 세포막 투과율을 나타냈으며 이것으로 칼시토닌 나노 입자가 칼시토닌에 비해 장막 흡수율이 더욱 빠를 것이라는 것을 알 수 있다.
<시험예 3> 실험용 쥐를 이용한 전임상 실험
칼시토닌 나노입자를 실험용 쥐(6주령 랫트)에게 경구투여하여, 임상적인 칼시토닌 투여를 모사한 실험을 실시하였다. 실험용 쥐를 12시간 이상 먹이를 주지 않고 물만 주면서 위를 공복상태로 유지하였다. 3% 중탄산소다 수용액 1㎖을 투여하여, 위산을 중화시킨 다음 100㎍/kg(유효 연어 칼시토닌의 양 기준)의 칼시토닌 수용액 및 동 수용액과 유효 농도가 같은 칼시토닌 나노입자 분산액을 각각 경구투여하였다. 투여 후 일정 시간(1, 3, 6, 12, 24 시간)이 지난 후, 쥐의 꼬리 정맥에 서 혈액을 채취하여, 혈장을 분리한 후 혈중 칼시토닌의 양과 칼슘의 양을 정량화하였다. 도 9는 시간에 따른 혈중 칼시토닌의 양을 나타낸 그래프이며, 도 10은 시간에 따른 혈중 칼슘의 양을 나타낸 그래프이다. 도면에서와 같이, 칼시토닌 나노입자는 칼시토닌에 비해 혈중 수치가 상당히 높았으며, 3시간 이후에 혈중에서 최고치를 기록했다. 또한 칼시토닌 나노 입자가 들어있지 않은 생리적 식염수로 구성된 대조군과 비교해 볼 때 칼시토닌 나노입자는 혈중 칼슘의 강하 효과가 큼을 확인할 수 있다.
본 발명에 의하면 칼시토닌을 지방산과 이온결합체를 형성시킴으로써 유기용매에 대한 용해도를 개선하며, 또한 이를 이용하여 나노입자를 제조시에 칼시토닌의 열적 안정성과 장막세포에 대한 투과율을 개선할 수 있다.

Claims (13)

  1. 칼시토닌을 함유하는 경구투여용 제제의 제조방법에 있어서,
    칼시토닌이 양전하를 띄게 되는 pH 5.0∼10의 범위에서 칼시토닌과 상기 pH 범위내에서 음전하를 띄는 지방산을 이온결합시켜 소수성 복합체를 합성하는 단계와,
    상기 단계에 의한 소수성 복합체와 생분해성 고분자를 물, 완충용액, 친수성 알콜에서 선택된 1종의 분산매에 분산시켜 칼시토닌이 봉입된 나노입자를 합성하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 칼시토닌을 함유한 경구투여용 나노입자의 제조방법
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 지방산은 올레산, 디옥시콜레산, DHA, 리놀레산, 라우레산, DMPG의 군에서 선택된 1종임을 특징으로 하는 경구투여용 나노입자의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    생분해성 고분자는 폴리에스테르 계, 폴리메타아크릴산 계에서 선택된 1종의 고분자임을 특징으로 하는 경구투여용 나노입자의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    폴리에스테르계 고분자는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(D,L-락트산-코-글리콜산), 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시 부틸레이트), 폴리(하이드록시 발러레이트)에서 선택된 1종을 포함함을 특징으로 하는 경구투여용 나노입자의 제조방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    폴리메타아크릴산계 고분자는 폴리메타아크릴산, 폴리메틸메타아크릴산, 폴리(메타아크릴산-메틸메타아크릴산)에서 선택된 1종을 포함함을 특징으로 하는 경구투여용 나노입자의 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    칼시토닌-지방산 복합체내의 칼시토닌과 지방산의 조성비는 중량비로 1:1∼1:100임을 특징으로 하는 경구투여용 나노입자의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 제 1항에 있어서,
    나노입자의 합성시 칼시토닌-지방산 복합체와 생분해성 고분자의 혼합비는 중량비로 칼시토닌:고분자 = 1:10∼1:100 임을 특징으로 하는 경구투여용 나노입자의 제조방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    칼시토닌-지방산 복합체는 디메틸술폭사이드 또는 디메틸포름알데히드에 용해된 형태의 것임을 특징으로 하는 경구투여용 나노입자의 제조방법.
  11. 삭제
  12. 제 1항에 있어서,
    칼시토닌-지방산 복합체와 생분해성 고분자를 함유하는 상기 용해액과 분산매와의 비는 중량비로 1:10∼1:100임을 특징으로 하는 경구투여용 나노입자의 제조방법.
  13. 제 1항의 방법으로 제조된 나노입자를 유효성분으로 함유하는 경구투여용 골다공증 치료제.
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