CN107753435B - 一种药物-磷脂/白蛋白复合纳米粒及制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种紫杉醇‑磷脂/白蛋白复合纳米粒及制备工艺，其步骤如下：（1）配置紫杉醇、磷脂、胆固醇及DSPE‑PEG₂₀₀₀储备液；（2）制备紫杉醇脂质体；（3）配制白蛋白（BSA）储备液；（4）制备紫杉醇‑磷脂/白蛋白复合纳米粒。本发明制备方法简单并且可以解决难溶性药物在水中溶解度差的问题，制剂中不含有Cremophor EL，避免了注射时这些增溶剂引起的毒副作用；本发明制备的药物‑磷脂/白蛋白复合纳米粒不同于普通的脂质体和白蛋白纳米粒，在处方中添加了DSPE‑PEG₂₀₀₀增加了纳米粒的稳定性，且包封率高，粒径小而均一，室温放置2周纳米粒粒径未发生明显变化。

Description

一种药物-磷脂/白蛋白复合纳米粒及制备工艺

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体是涉及一种药物-磷脂/白蛋白复合纳米粒及制备工艺。

背景技术

紫杉醇(paclitaxel，PTX)作为阿霉素之后最热点的新型抗癌药之一，在肿瘤相关治疗领域中具有重要的意义。紫杉醇是由太平洋紫杉等红豆杉属植物中提取的一种抗癌作用优良的二萜类化合物。紫杉醇的抗癌机制是在促进极为稳定的微管聚集的同时，阻断微管正常生理性的解聚(在细胞分裂周期中的G2和M两个期)，从而导致细胞死亡，达到阻碍肿瘤生长的目的。目前广泛应用于非小细胞性肿瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等。然而，紫杉醇在水中的溶解度极低(0.658μg/L左右)，因此不能直接作为临床药物应用于癌症的治疗。

在当前国产和进口的紫杉醇注射剂中都是以乙醇和聚氧乙烯蓖麻油作为助溶的载体，聚氧乙烯蓖麻油会导致极为严重的超敏反应。因此，能够研制出副作用相对小的紫杉醇制剂已迫在眉睫。目前在国内临床研究方面，我国所研发的紫杉醇脂质体(力扑素)已开始在临床上应用，并且显示出了良好的应用前景。白蛋白结合型紫杉醇纳米粒(Abraxane)是用人血白蛋白来稳定紫杉醇所形成的纳米粒，其不仅大大增加了紫杉醇在水溶液中的溶解度，而且减少了聚氧乙烯蓖麻油所带来的副作用。由于纳米粒的粒径极小所以具有被动的靶向性，在肿瘤细胞上存在着特殊的载体能够主动摄取白蛋白，显示了白蛋白纳米粒技术所具有的优越性。

通过调研发现现有技术存在如下不足：白蛋白结合型紫杉醇纳米粒(Abraxane)制备过程中涉及有机溶剂的使用，白蛋白与有机溶剂的直接接触，有可能导致蛋白结构与功能的改变。关于不涉及有机溶剂使用的纳米粒制备方法尚未见报道；同时，未见pH值对纳米粒载药量和粒径影响的研究。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种药物-磷脂/白蛋白复合纳米粒，其组成包括胆固醇、卵磷脂、白蛋白、疏水性抗癌药物。

优选的，脂质体和疏水性药物的摩尔比为25:1-35:1，白蛋白和疏水性药物的摩尔比 1:1-1:15。

优选的，还包括缓冲液为pH＝2.0-10.0的缓冲液。

优选的，其粒径为100-200nm。

优选的，所述的白蛋白是牛血清白蛋白。

优选的，所述的疏水性药物是紫杉醇。

优选的，所述的磷脂是卵磷脂和DSPE-PEG₂₀₀₀。

一种药物-磷脂/白蛋白复合纳米粒，其制备工艺包括以下步骤：

a.将白蛋白溶于缓冲液中，充分溶解；

b.将疏水性药物、胆固醇、卵磷脂、DSPE-PEG₂₀₀₀溶于有机溶剂中；

c.将步骤b的有机溶液加到55℃的空白缓冲液中，搅拌20-40min(优选30min)；

d.将步骤c的溶液减压蒸馏除去有机溶剂；

e.将步骤d的溶液加到步骤a的缓冲液中，搅拌3-5h(优选4h)，得到白色乳液；

f.将步骤e的白色乳液高压均质，粒径控制在100-200nm。

优选的，疏水性药物的浓度可达到100μg/mL(0.117mmol/L)。

优选的，步骤d所获得的混合溶液进行除有机溶剂的步骤，避免了后续加入的白蛋白与有机溶剂的直接接触。

利用响应面法设计筛选出药物-磷脂/白蛋白复合纳米粒的最佳处方，选择以药物-磷脂比例(摩尔比)、药物-白蛋白比例(摩尔比)、介质pH 3个因素为试验受试因子，以平均粒径、 Zeta电位、载药量损失率及载药量作为响应值，运用

8.0.6软件进行Box- Behnken设计，得到3因素3水平共17组实验。通过响应面设计优化药物-磷脂比例(摩尔比)、药物-白蛋白比例(摩尔比)、介质pH的最佳组合，得到了最佳处方。

本发明取得的优异效果是：

1.本发明制备方法简单并且可以解决难溶性药物在水中溶解度差的问题，制剂中不含有 Cremophor EL，避免了注射时这些增溶剂引起的毒副作用；

2.本发明提供了将脂质体与白蛋白相结合的一种复合纳米粒的制备方法。避免了白蛋白与有机溶剂的直接接触；

3.本发明通过响应面设计考察了药物-磷脂比例(摩尔比)、药物-白蛋白比例(摩尔比)、介质pH对平均粒径、Zeta电位、载药量损失率及载药量的影响；

4.本发明提供的药物-磷脂/白蛋白复合纳米粒的处方中添加了DSPE-PEG₂₀₀₀增加了纳米粒的稳定性，且包封率高达99％，粒径小而均一，4℃条件下放置2周，纳米粒粒径未发生明显变化。

附图说明

图1药物-磷脂/白蛋白复合纳米粒(PTX/EPC-BSA NPs)在水中的DLS曲线；

图2 PTX/EPC-BSA NPs的TEM图片；

图3 PTX(a)、PTX/EPC-BSA NPs(b)的DSC曲线；

图4 PTX(a)、PTX/EPC-BSA NPs(b)的XRD图谱；

图5 PTX(a)、PTX/EPC-BSA NPs(b)的红外图谱；

图6 PTX/EPC-BSA NPs在4℃下的放置稳定性；

图7 PTX/EPC-BSA NPs的稀释稳定性。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步说明，以帮助更好的理解本发明的内容，但这些具体实施方式不以任何方式限制本发明的保护范围。

实施例1本发明提供的一种紫杉醇-磷脂/白蛋白复合纳米粒的制备工艺，其步骤如下：(1)配置紫杉醇、卵磷脂、胆固醇及DSPE-PEG₂₀₀₀储备液；(2)制备紫杉醇脂质体； (3)配制BSA储备液；(4)制备紫杉醇-磷脂/白蛋白复合纳米粒；具体如下：

分别用0.01mol/L不同pH的缓冲液配制20.4mg/mL(0.0003mol/L)的白蛋白储备液。配制加乙醇溶解的10mg/mL(0.0117mol/L)的紫杉醇、15.5mg/mL(0.04mol/L)的胆固醇、29.2mg/mL(0.04mol/L)的卵磷脂、5.6mg/mL(0.002mol/L)的DSPE-PEG₂₀₀₀储备液；

将紫杉醇、胆固醇、卵磷脂、DSPE-PEG₂₀₀₀储备液按照一定比例加入不断搅拌的55℃的空白缓冲液中，加完后搅拌30min，旋蒸除去乙醇；将紫杉醇-脂质体加入白蛋白储备液中，不断搅拌4h，高压均质数次，得到紫杉醇-磷脂/白蛋白复合纳米粒。

试验例1

1.1仪器及试剂

高效液相色谱仪(waters 2489)，纳米粒度电位仪(Zetasizer Nano ZSP，Malvarn)，pH计(METTLER TOLEDO FE20)。差示扫描量热仪(TA Discovery)，低速离心机(cence TDZ5- WS，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。紫杉醇(纯度＞99％)由大连美仑生物技术有限公司提供，牛血清白蛋白(BSA)由百灵威提供，胆固醇、卵磷脂、DSPE-PEG₂₀₀₀均来自于德国Lipoid公司。乙腈(HPLC级)购于Fisher Scientific，乙醇购于国药集团化学试剂有限公司，其他试剂均为分析纯。实验用水为超纯水(Millipore)。

1.2 Box-Benhnken(BBD)实验设计-响应面优化

1.2.1色谱条件：Agilent Eclipse XDB-Phenyl色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相为乙腈：水(65:35)，流速1.0mL/min，检测波长为227nm，柱温25℃。

1.2.2标准曲线的制备：精密称取紫杉醇适量，加乙醇溶解，配制成浓度为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、 20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、140 μg/mL、160μg/mL、180μg/mL、200μg/mL紫杉醇溶液，经0.22μm滤膜过滤后进液相，对0.01μg/mL-1μg/mL和1μg/mL-200μg/mL质量浓度和峰面积进行回归，得到两条标准曲线A＝20936C+903.11，R²＝1和A＝19788C+21382，R²＝0.9997。

1.2.3响应面法设计筛选处方：利用响应面法设计筛选药物-磷脂/白蛋白复合纳米粒的最佳处方，选择以药物-磷脂比例(摩尔比)、药物-白蛋白比例(摩尔比)、介质pH 3个因素为试验受试因子，以平均粒径、Zeta电位、载药量损失率及载药量作为响应值，运用

8.0.6软件进行Box-Behnken设计，得到3因素3水平共17组实验。将所有样品进行编号，编号结果见表1。

表1 Box-Benhnken(BBD)实验设计

1.2.4样品制备的准备：精密称取紫杉醇、胆固醇、卵磷脂、DSPE-PEG₂₀₀₀适量，将紫杉醇、胆固醇、卵磷脂、DSPE-PEG₂₀₀₀用乙醇溶解，分别配制成10mg/mL(0.0117mol/L)、15.5mg/mL(0.04mol/L)、29.2mg/mL(0.04mol/L)、5.6mg/mL(0.002mol/L)的储备液。分别用0.01mol/L不同pH的缓冲液配制20.4mg/mL(0.0003mol/L)的BSA储备液。

1.2.5样品的制备：将紫杉醇、胆固醇、卵磷脂、DSPE-PEG₂₀₀₀储备液按照一定比例加入不断搅拌的55℃的空白缓冲液中，加完后搅拌30min，旋蒸除去乙醇。再将上述紫杉醇-脂质体加入BSA储备液中，不断搅拌4h，高压均质数次，得到紫杉醇-磷脂/白蛋白复合纳米粒。

1.2.6粒度及Zeta电位测定实验：分别取1.2.4项下制备的样品1mL进行粒度和Zeta 电位检测，检测温度25℃，每个样品平行测定三次。

1.2.7样品载药量的测定：将制好的纳米粒取适量于冻干机中冻干。冻干后称量样品的质量。冻干的样品加1mL甲醇，涡旋1min左右，离心后取上层清液进液相，得到药物浓度，按以下公式计算载药量DL(％)。

DL(％)＝W₁/W₂*100％(其中W₁为冻干纳米粒中的药物质量，W₂为冻干纳米粒的总质量)

1.2.8处方确定：本实验以粒径、Zeta电位、载药量为主要评价标准，运用

8.0.6软件优化所制备紫杉醇复合纳米粒的最佳处方。

1.3体外表征

1.3.1透射电镜(Transmission electron microscopy，TEM)观察

取紫杉醇-磷脂/白蛋白复合纳米粒6μL，滴到300目的铜网上，在空气中自然晾干1min，后用3％磷酸钨染色2min，在JEM-2100TEM下观察粒子的状态。

1.3.2粒径、粒径分布及Zeta电位的测定

采用动态光散射(Dynamic light scattering，DLS)原理，选择马尔文粒度仪测定其粒径、粒径分布及电位。参数：4mW He-Ne激光器，波长633nm，散射角为173º 。

1.4固态表征

1.4.1差示扫描量热法(Differential scanning calorimetry，DSC)

Discover型差示扫描量热仪，以(Al₂O₃)为参比，升温速率：10℃/min；氮气保护下在 20～240℃的范围内分别测定紫杉醇原药以及纳米粒冻干粉的DSC曲线图。

1.4.2 X-射线粉末衍射(X-ray)分析

室温条件下，紫杉醇原药、纳米粒冻干粉用X射线粉末衍射仪进行晶型评价。样品测量参数：XD-3型X-射线粉末衍射仪(铜靶，石墨弯晶单色器，工作电压36kV，电流20mA，扫描范围2θ＝5°～50°，扫描速度4°/min)。

1.4.3傅里叶变换红外光谱仪测定

紫杉醇原药、纳米粒的冻干粉用傅里叶变换红外光谱仪进行官能团测定。样品测量参数： 6700型傅里叶变换红外光谱仪(KBr压片，在400～2000cm^-1波数范围内进行收集)。

1.5稳定性研究

通过使用DLS测量粒径确定PTX/EPC-BSA NPs的稳定性。为了分析时间依赖的稳定性，在 4℃条件下存储14天，分别于第0、2、3、4、7、14天DLS测定样品粒径。同时通过在700 μg/mL PTX/EPC-BSA NPs溶液不断稀释后用DLS测量粒径来分析制剂的稀释稳定性。

2结果与讨论

2.1 Box-Benhnken(BBD)响应面分析

基于单因素考察实验，选定卵磷脂-白蛋白(EPC-BSA)为紫杉醇复合纳米粒载体，采用乙醇注入法制备紫杉醇脂质体后再与BSA结合获得紫杉醇复合纳米粒。在此基础上，选择以药物-EPC比例(摩尔比)、药物-BSA比例(摩尔比)、介质pH 3个因素为试验受试因子，以平均粒径、Zeta电位、载药量损失率及载药量作为响应值，运用

8.0.6软件进行BBD设计-响应面设计3因素3水平共17组实验。测试结果见表2。

表2试验设计与结果

试验结果运用软件

8.0.6进行线性拟合及回归分析，通过复相关系(R²)选择最佳数学模型。得到各响应值的二次多项回归预测模型如下：

(1)Size＝384.87–6.77×A–5.72×B–42.92×C–0.09×AB+0.68×AC +0.31×BC+0.06×A²+0.37×B²+1.29×C²(P<0.05)；

(2)Zeta Potential＝-16.28+1.65×A–0.84×B+3.22×C+0.02×AB-0.10× AC–0.03×BC-0.02×A²+0.01×B²-4.67*E^-3×C²(P<0.05)；

(3)DL Loss＝2.42-0.13×A+0.48×B-0.12×C-5.14*E^-3×AB–6.25*E^-4×AC–3.39*E^-3×BC+2.05*E^-3×A²–0.01×B²+0.01×C²(P<0.0001)。

(4)DL＝-0.14+0.02×A+0.07×B+0.11×C–5.00*E^-4×AB+5.00*E^-4×AC+3.48*E^-3×BC–4.80*E^-4×A²–2.85*E^-3×B²-9.50*E^-3×C²(P< 0.0001)。

所得方程的方差分析结果显示，预测模型具有显著性(P<0.05)，失拟项影响不显著 (P>0.05)，说明所采用的回归预测模型能够描述响应值的变化，与实际试验的拟合程度良好。因此，可以使用该回归预测模型对制剂处方进行优化。

在本实验所考察处方范围内，介质pH对制剂粒径及制剂电位绝对值具有最显著影响，药物-EPC比例与pH的交互作用影响作用次之，两因素与药物-BSA比例之间交互作用的影响不显著。药物-BSA比例对制剂载药量损失影响较大，其与药物-BSA比例及介质pH两两之间的交互作用影响次之；介质pH及其与药物-BSA比例之间的交互作用对制剂载药量影响较大。

本实验以粒径、Zeta电位、载药量为主要评价标准，运用

8.0.6软件优化所得制备紫杉醇复合纳米粒最佳处方为：药物-EPC摩尔比25.00，药物-BSA摩尔比3.36，介质pH＝8.64。

2.2紫杉醇复合纳米粒的表征

2.2.1粒径及形态

采用DLS测紫杉醇复合纳米粒粒径及电位显示载药纳米粒的平均粒径为117.9nm，粒径分布为单峰(见图1)。纳米大小的粒径有助于纳米粒进入血液后不被RES系统吞噬，并能通过 EPR效应被动靶向肿瘤部位起到抑制肿瘤的作用。

通过TEM观察紫杉醇复合纳米粒的形态，结果见图2。紫杉醇复合纳米粒TEM观察呈规则的球形，平均粒径约为150nm。与DLS测量结果差别不大。

2.2.2固态表征

为了探究PTX在纳米粒中的存在状态，分别绘制了PTX、NPs的DSC图谱(见图3)和XRD图谱(见图4)。PTX熔点峰出现在原药的DSC图谱中，却在NPs的DSC曲线中消失。说明PTX是以无定型的形式存在于载药纳米粒中的。XRD图谱中，PTX原药显示明显的药物衍射峰，说明原药是以晶态形式存在。药物衍射峰在NPs的图谱中消失，说明PTX是以分子分散形式存在于载药纳米粒中。

DSC和XRD结果均证实了PTX是以无定型形式存在于载药纳米粒中。

FT-IR光谱法用于评价药物与蛋白质/脂质体官能团之间的化学相互作用。游离PTX 和NPs的光谱如图5所示。PTX固体在2930cm^-1(＝C-H)，1720cm^-1(C＝O基团)，1380 cm^-1(C-H₃弯曲)，1250cm^-1(C-N伸缩)，1090cm^-1(C-O伸缩)。由于这些峰在NPs制剂的光谱中也存在并且基本不变，所以PTX和BSA或脂质体之间很可能没有化学作用。

2.2.3稳定性研究

取制备的紫杉醇-磷脂/白蛋白复合纳米粒在4℃条件下存储14天。分别于第0、4、7、14天 DLS测定样品粒径图如图6所示。PTX/EPC-BSA NPs不断稀释后测得的粒径如图7所示。结果显示14天后纳米粒的粒径与第0天的粒径差别不大，不断稀释后的粒径差别也不大。说明纳米粒的时间依赖性稳定性和稀释依赖性胶体稳定性良好。

3结论：本申请通过采用乙醇注入法制备紫杉醇脂质体后再与BSA结合获得紫杉醇复合纳米粒。粒径约为116.2nm，粒径分布为单峰，Zeta电位值为-17.133mV，电镜观察为规则的球形，药物以无定型状态存在于载药纳米粒中。并且在4℃下储存14天后，粒径变化不大。稀释后粒径几乎不变，说明稳定性良好。

以上各实施例只是对本发明做进一步说明，并非用以限制本发明专利，凡为本发明的等效实施，均应包含于本发明专利的权利要求范围之内。

Claims (2)

1.一种药物-磷脂/白蛋白复合纳米粒，其特征在于，其组成包括胆固醇、磷脂、白蛋白、疏水性抗癌药物；所述的磷脂是卵磷脂和DSPE-PEG₂₀₀₀，所述的疏水性抗癌药物是紫杉醇；所述疏水性抗癌药物与卵磷脂的摩尔比为25:1，疏水性抗癌药物与白蛋白的摩尔比是3.36:1，还包括分散介质为pH＝2.0-10.0的缓冲液；制备方法包括以下步骤：

a.将白蛋白溶于缓冲液中，充分溶解；

b.将疏水性药物、胆固醇、卵磷脂、DSPE-PEG₂₀₀₀溶于有机溶剂中；

c.将步骤b的有机溶剂加到55℃的空白缓冲液中，搅拌20-40min；

d.将步骤c的溶液减压蒸馏除去有机溶剂；

e.将步骤d的溶液加到步骤a的缓冲液中，搅拌3-5h，得到白色乳液；

f.将白色乳液高压均质，使粒径控制在100-200nm。

2.如权利要求1所述的药物-磷脂/白蛋白复合纳米粒，其特征在于，所述的白蛋白是牛血清白蛋白。

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