WO2009055979A1 - Micro-arn dans le sérum/plasma sanguin et leurs utilisations - Google Patents

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Junfeng Zhang
Xi Chen
Yi Ba
Jiangning Chen
Jin Wang
Ke Zeng
Hongjie Zhang
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Jiangsu Mingma Biotech Co., Ltd
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Definitions

  • the invention relates to microRNA and application thereof, in particular to serum/plasma microribonucleic acid and its diagnosis and differential diagnosis in diseases, occurrence of disease complications and prediction of recurrence of malignant diseases, evaluation of therapeutic effect, screening of active ingredients of drugs, medicine Effectiveness evaluation and application of forensic identification and illicit drug testing. Background technique
  • Finding disease markers and accurately detecting them has become a variety of clinical diseases (including various tumors; various acute and chronic infectious diseases, such as viral diseases: viral influenza, viral hepatitis, AIDS, SARS, etc., bacterial Diseases: Tuberculosis, bacterial pneumonia, etc., and other acute and chronic infectious diseases caused by various pathogenic microorganisms; other acute and chronic diseases, such as respiratory diseases, immune system diseases, blood and hematopoietic diseases, such as cardiovascular and cerebrovascular diseases Diseases, endocrine system metabolic diseases, digestive diseases, nervous system diseases, urinary system diseases, reproductive system diseases and sports system diseases are important prerequisites for diagnosis and treatment.
  • various acute and chronic infectious diseases such as viral diseases: viral influenza, viral hepatitis, AIDS, SARS, etc., bacterial Diseases: Tuberculosis, bacterial pneumonia, etc.
  • other acute and chronic infectious diseases such as respiratory diseases, immune system diseases, blood and hematopoietic diseases, such as cardiovascular and cerebrovascular diseases Diseases, en
  • the tiny ribonucleic acid known in English as microR A, is a non-coding single-stranded small ribonucleic acid molecule of about 19 to 23 nucleotides in length. They are highly conservative in evolution and are many with animals Normal physiological activities, such as biological individual hair, tissue differentiation, cell apoptosis, and energy metabolism, are closely related, and are also closely related to the occurrence and development of many diseases. Recent studies have found that the expression levels of several tiny ribonucleic acids in chronic lymphocytic leukemia and Burkitt lymphoma are down-regulated to varying degrees. When comparing microRNA expression in human lung cancer and breast cancer tissues, several tissues were found. The expression level of specific microRNAs is changed relative to normal tissues.
  • microRNAs affect the development and progression of cardiovascular diseases such as cardiac hypertrophy, heart failure, and atherosclerosis, and are closely related to metabolic diseases such as type II diabetes. These experimental results suggest that there is a necessary link between microRNA expression and specific changes and disease occurrence and development.
  • microRNA plays an important role in the regulation of gene expression after transcription, it has the following correlation with disease: First, the change of small RNA may be the cause, because of the inhibitor of disease and Promoting factors may be the target sites of tiny ribonucleic acids.
  • Promoting factors may be the target sites of tiny ribonucleic acids.
  • microRNAs may also be the result of disease, because when diseases (such as When cancer occurs, it can lead to the loss of chromosome fragments, mutations in genes or violent amplification of chromosome fragments. If the tiny ribonucleic acid is located in this change segment, the expression level will change extremely significantly. Therefore, in theory, microRNA molecules can be used as a new class of disease markers, and their specific changes must be related to the development of disease. At the same time, microRNA can also serve as a potential drug target. By inhibiting the up-regulation of microRNA and over-regulation of microRNA, it is possible to greatly alleviate the occurrence and development of the disease.
  • the present inventors have carried out research in the related field of microribonucleic acid as a disease marker, for example, selecting colon cancer which is the fourth highest incidence of malignant tumors as a research object, and found that during the development of benign polyps of the colon into malignant tumors Some microRNA molecules have specific changes, and a more sensitive and accurate method for early diagnosis of colon cancer has been established by measuring the specific changes of microRNAs. However, due to the lack of access to tissue specimens, the widespread use of this method in clinical practice has been limited. Summary of the invention
  • the present inventors will study the blood that can be easily obtained, even in a conventional physical examination. Because blood circulates to all tissues in the body, and delivers nutrients to the cells and removes waste, This blood is enough to reflect the physiopathological condition of the whole body. "The results of the test have guiding significance for the human body. There are many proteins in the serum/plasma, such as total protein, albumin, globulin, etc. Lipids, such as HDL cholesterol, triglycerides, etc., various saccharides, pigments, electrolytes and inorganic salts, various enzymes such as amylase, alkaline phosphatase, acid phosphatase, bilirubinase, aldolase, etc.
  • Glycosyl unit composition with structural specificity and relative stability, they are most likely to be present in serum/plasma, due to micro Ribonucleic acid molecules are a new class of disease markers, so it is hoped that through the study of the presence of serum/plasma microRNAs, whether they can be detected and their correlation with disease, a small amount of stable use in serum/plasma is established.
  • Ribonucleic acid and its specific changes for early diagnosis of various diseases, disease identification and disease monitoring, malignant disease recurrence and prognosis, prediction of complications, drug efficacy, medication guidelines, individualized treatment, screening of effective components of traditional Chinese medicine, New technologies for population classification and other research.
  • the present invention provides a combination of microribonucleotides for assessing a physiological and/or pathological state of a subject comprising all microRNAs that are stably present and detectable in the serum/plasma of the subject.
  • the invention also provides a method for assessing a physiological and/or pathological state of a subject, the method comprising determining all microRNAs that are stably present and detectable in serum/plasma of the subject.
  • all microRNAs stably present in the serum/plasma of the subject and detectable may be all mature microRNAs in human serum/plasma, specifically including let-7a, let-7b, Let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g, let-7i, miR-l, miR-100, miR-101, miR-103, miR-105, miR-106a, miR- 106b, miR-107, miR-10a, miR-10b, miR-122a, miR-124a, miR-125a, miR-125b, miR-126, miR-126*, miR-127, miR-128a, miR-128b , miR-129, miR-130a, miR-130b, miR-132, miR-133a, miR-133b, miR-134, miR-135a, miR-135b, miR-136, miR-137, miR-138, miR -139, miR
  • the above method for determining the stable and detectable total microRNA in the serum/plasma of the subject is selected from the group consisting of: RT-PCR method, Real-time PCR method, Northern blotting method, RNase protection assay, Solexa sequencing technology, and biochip method. One or several of them.
  • the RT-PCR method includes the following steps:
  • the Real-time PGR method includes the following steps:
  • the invention also provides a kit for assessing a physiological and/or pathological state of a subject, the kit comprising means for determining the total presence and detectability of all microRNAs in the serum/plasma of the subject.
  • the kit may comprise primers for all mature microRNAs in human serum/plasma, specifically including let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g.
  • let-7i miR- miR-100, miR-101, miR-103, miR-105, miR-106a, miR-106b, miR-107, miR-10a, miR-10b, miR-122a, miR-124a , miR-125a, miR-125b, miR-126, miR-126*.
  • the present invention also provides a biochip for evaluating a physiological or pathological state of a subject, the biochip comprising an element for determining all microRNAs stably present and detectable in serum/plasma of a subject.
  • the biochip may comprise a probe of all mature microRNAs in human serum/plasma, the probes specifically comprising the probes shown in Table 1:
  • the above diseases include various tumors; various acute and chronic infectious diseases, such as viral influenza, viruses 3 ⁇ 4 hepatitis, AIDS, SARS viral diseases such as tuberculosis, bacterial pneumonia, and other acute and chronic diseases caused by various pathogenic microorganisms; other acute and chronic diseases, such as respiratory diseases, immune system diseases , blood and hematopoietic diseases, such as circulatory diseases of cardiovascular and cerebrovascular diseases, endocrine system metabolic diseases, digestive diseases, nervous system diseases, urinary system diseases, reproductive system diseases and sports system diseases.
  • infectious diseases such as viral influenza, viruses 3 ⁇ 4 hepatitis, AIDS, SARS viral diseases such as tuberculosis, bacterial pneumonia, and other acute and chronic diseases caused by various pathogenic microorganisms
  • other acute and chronic diseases such as respiratory diseases, immune system diseases , blood and hematopoietic diseases, such as circulatory diseases of cardiovascular and cerebrovascular diseases, endocrine system metabolic diseases, digestive diseases, nervous system diseases, urinary system diseases, reproductive system diseases
  • the above serum/plasma is derived from the living body, tissues, organs and/or corpses of the subject.
  • the problems to be solved by the present invention include: (1) analyzing and identifying serum/plasma small RNA molecules and their stability in various animals such as mice and rats; (2) studying various clinical diseases (including various tumors) Various acute and chronic infectious diseases, such as viral diseases: viral influenza, viral hepatitis, AIDS, SARS, etc., bacterial diseases: tuberculosis, bacterial pneumonia, etc., and other acute and chronic infectious diseases caused by various pathogenic microorganisms; Other acute and chronic diseases, such as respiratory diseases, immune system diseases, blood and hematopoietic diseases, such as cardiovascular diseases, endocrine and metabolic diseases, digestive diseases, nervous system diseases, urinary diseases, reproductive diseases Specific changes in serum/plasma microribonucleic acid during the onset of disease and motor system disorders; (3) determination of serum/plasma microRNAs in different diseases by biochip and sequencing techniques of serum/plasma microribonucleic acid; ) will be screened under disease and normal physiological conditions A class of serum/plasma microribonucleic acid molecules with high
  • the present invention analyzes and identifies tiny serum/plasma in various animals such as human, mouse, and rat by RT-PCR, Real-time PCR, Northern blotting, Rase protection assay > Solexa sequencing technology, and biochip.
  • the presence of a ribonucleic acid molecule The stability of serum/plasma microribonucleic acid was studied by comparing changes in microribonucleotide after deoxyribonuclease and ribonuclease action in serum/plasma. The presence and sequence correctness of serum/plasma microribonucleotide molecules was further verified by sequencing and aligning the PCR products of serum/plasma microribonucleic acids.
  • RT-PCR method Collecting serum/plasma samples; preparing a cDNA sample by reverse transcription reaction of serum/plasma or extracting serum/plasma total RNA using Trizol reagent and performing reverse transcription reaction to prepare a cDNA sample; performing PCR reaction by designing primers for mature microRNA; performing PCR
  • the product was subjected to agarose gel electrophoresis; after EB staining, the results were observed under UV light and photographed.
  • Real-time PCR method Collect serum/plasma samples; perform reverse transcription reaction on serum/plasma to prepare cDNA samples or extract serum/plasma total RNA using Trizol reagent for reverse transcription
  • the fluorescent probe EVA GREEN was subjected to PCR reaction; the data was analyzed and the results were compared.
  • RNase protection assay First, synthesis of antisense RNA probes, isotope labeling and purification; collecting serum/plasma samples and extracting RNA; dissolving the extracted RNA in hybridization buffer and adding antisense RNA probe for hybridization; adding RNase digestion The liquid was reacted; electrophoresis and autoradiography were carried out; the results were analyzed.
  • Solexa sequencing technology ⁇ 1History serum/plasma samples; serum/plasma total RNA was extracted by Trizol reagent; 17-27 nt RNA molecules were recovered by PAGE; adaptor prime was ligated to the 3' and 5' ends of small RNA molecules; RT-PCR was performed. After the reaction and sequencing; data analysis and processing.
  • Biochip method Place more than 500 mature microRNA libraries and prepare biochips; collect serum/plasma samples; extract serum/plasma total RNA; separate microRNAs by column separation; use microRNAs with T4 RNA ligase Fluorescent labeling; hybridization with biochips; data detection and analysis.
  • miR-490 miR-491, miR-492, miR-493, miR-493-3p, miR-494, miR-495, miR-496, miR-497, miR-498, miR-499, miR-500, miR-501, miR-502, miR-503, miR-504, miR-505, miR-506, miR-507, miR-508, miR-509, miR-510, miR-511 miR-512-3p, miR-512-5p, miR-513, miR-514, miR-515-3p, miR-515-5p, miR-516-3p miR-516-5p, miR-517*, miR- 517a, miR-517b, miR-517c, miR-518a, miR-518a-2*, miR-518b, miR-518c, miR-518c*, miR-518d, miR-518e, miR-518f, , miR-519a, miR-519b, miR-519
  • RNA detection techniques Development of disease-related serum/plasma microRNA detection techniques. Specifically, the disease-related specific changes of microRNAs are screened, and their primers are collected into a PCR kit (RT-PCR or Real-time PCR) to prepare a disease diagnosis kit, or reverse complementarily The sequence is used as a probe point on the chip, and a biochip for detecting serum/plasma microribonucleic acid specific for a certain disease is prepared.
  • RT-PCR or Real-time PCR Real-time PCR
  • the sequence is used as a probe point on the chip, and a biochip for detecting serum/plasma microribonucleic acid specific for a certain disease is prepared.
  • the traditional physicochemical and molecular biology 3 ⁇ 4 lines of the disease are still more cumbersome and rough.
  • New technologies that have been developed in recent years and are likely to be used for disease diagnosis include gene chip and protein (antibody) chip technology. Changes in mRNA levels measured by the microarray do not fully reflect changes in true
  • Protein chip technology cannot detect marker molecules in body fluids and blood.
  • Protein (antibody) chip technology and proteomics technology also have their limitations.
  • the human body, especially serum/plasma contains tens of thousands of protein and polypeptide fragments, which are widely distributed in concentration, with few proteins reported and less quantified. Finding proteins that are closely related to a particular disease in this large proteome and understanding its role in tissue pathology remains a daunting task, and the lack of sophisticated antibody resources will constrain antibody chip technology. A bottleneck in development.
  • Serum/plasma microribonucleic acid detection technology serum/plasma microRNA-based biochips and diagnostic kits subtly combine the unique properties of serum/plasma microRNAs with conventional molecular biology detection techniques, which can be quickly High-throughput analysis of the composition of microRNAs in serum/plasma of various patients is highly clinically applicable. Since changes in the physiological state of organ tissues can cause changes in serum/plasma microribonucleic acid composition, serum/plasma microribonucleic acid can be used as a "disease fingerprint," to achieve early diagnosis of disease.
  • Serum/plasma microribonucleic acid as a novel disease marker, has the advantages of wide detection spectrum, high sensitivity, low detection cost, convenient material selection, easy storage of samples (serum/plasma storage at -20 °C), etc. This method can be widely used in related work such as disease screening, and is an effective means for early diagnosis of diseases.
  • Serum/plasma microribonucleic acid as a new disease marker will improve the low specificity and low sensitivity brought about by individual differences that are difficult to overcome with a single marker, significantly improve the clinical detection rate of the disease and achieve disease. Early diagnosis and treatment.
  • serum/plasma microribonucleic acid detection technology detects a series of disease-related markers, thus being able to overcome the differences between individual patients (ie age, sex, race, diet and environment, etc.) It is a major problem that cannot be overcome by a single disease marker.
  • serum/plasma ribonucleic acid detection technology can be used to diagnose early pathological changes.
  • This new serum/plasma disease marker not only provides a material basis for understanding the mechanism of tissue lesions at the molecular level, but also accelerates clinical disease. Advances in diagnostics and therapeutics. Of course, the vast majority of molecular diagnostic techniques for early detection of disease are still in the preliminary experimental stage, and their effectiveness needs further verification and improvement.
  • each disease has its own characteristics and needs ——— With your own unique detection method, it is impossible to detect all diseases by one or a few types of detection methods.
  • Figure 1 shows the RT-PCR results of a portion of microRNAs directly detected in normal human serum.
  • Figure 2 shows the results of RT-PCR for extracting RNA from normal human serum and detecting microRNAs.
  • U6 is a snOORNA with a molecular weight of lOObp, which is used as an internal reference molecule for the microRNA experiment.
  • the remaining 12 codes represent the blood cell-specific microRNAs miR-181a ( 181a ) and miR-181b ( 181b ) , miR-223 ( 223 ) , miR-142-3p ( 142-3p ) , miR-142-5p ( 142-5p ) , miR-150 ( 150 ) , microRNA from the myocardium and bone muscles miR -1 (1), miR-133a (133a), miR-206 (206), microRNAs miR-9 (9) from brain tissue, miR-124a (124a), and luciferic miR from the liver -122a ( 122a ).
  • Figure 3 shows the results of partial mini-ribonucleic acid RT-PCR directly detected in serum of mice, rats, fetal calves, calves and horses.
  • Figure 4 shows the amount of change in the microRNA in the serum of a patient suffering from the indicated disease relative to the microRNA in normal human serum.
  • Figure 5 shows the ratio of macromolecular ribonucleic acid and microRNA in blood cells to serum.
  • Figure 6 shows the enzymatic cleavage effect of macromolecular ribonucleic acid and microRNA. The best way to implement the invention
  • the cDNA was diluted 1/50, and the diluted cDNA was taken, and 0.3 l Taq enzyme (Takara), 0.2 ⁇ l ⁇ forward primer, 0.2 ⁇ l ⁇ universal reverse primer, 1.2 ⁇ l 25 mM MgCl 2 , 1 ⁇ 6 ⁇ l 2.5 mM each dNTP mixture ( Takara), 2 ⁇ l lOx PCR buffer, 13.5 ⁇ 1 ⁇ 2 0, 20 ⁇ l system for PCR.
  • the reaction conditions of the PCR were: one cycle at 95 ° C for 5 minutes ⁇ 95 ° C, 15 seconds, 60 ° C, 1 minute for 40 cycles.
  • the PCR product was subjected to 3% agarose gel electrophoresis, and stained with sputum and observed under an ultraviolet lamp.
  • Fig. 1 shows the results of direct RT-PCR of serum by using normal human serum as a research object. PCR was performed using all of the more than 500 mature human microRNAs.
  • Figure 1 shows 12 of them: small RNA, which are blood cell-specific microRNAs miR-181a, miR-181b, miR-223, respectively. , miR-142-3p, miR-142-5p, miR-150, microRNAs miR-1, miR-133a, miR-206 from myocardium and skeletal muscle, microRNAs miR-9, miR from brain tissue -124a, and the tiny ribonucleic acid miR-122a from the liver. It can be seen from the results that the microRNAs of the above four tissue sources can be detected in the blood, and not all of the more than 500 mature microRNAs have high abundance expression in serum/plasma, and some microRNAs are Very small, not even detectable.
  • RA was extracted from normal human serum, and then more than 500 mature human microRNAs were used for PCR experiments. The results are shown in Fig. 2. The results in Figure 2 are in good agreement with the results in Figure 1.
  • the single PCR product indicates that both methods can detect the expression and abundance of human serum/plasma ribonucleic acid, demonstrating a stable presence in human serum/plasma. Tissues are derived from microRNAs.
  • microRNAs in mouse, rat, fetal bovine, calf and horse serum were detected by the same method, and microRNAs of different tissue origins were also found in mice, large Stable expression in the serum of rats, fetal calves, calves and horses (see Figure 3).
  • Example 2 Real-time PCR experiment of microRNA in serum/plasma
  • chronic infectious diseases such as viral diseases: viral influenza, viral hepatitis, AIDS, SARS, etc.
  • bacterial diseases tuberculosis, bacterial pneumonia, etc.
  • various other pathogens Acute and chronic infectious diseases caused by microorganisms
  • other acute and chronic diseases such as respiratory diseases, immune system diseases, blood and hematopoietic diseases, such as circulatory diseases of cardiovascular and cerebrovascular diseases, endocrine system metabolic diseases, digestive diseases, nervous systems
  • Quantitative PCR experiments of serum/plasma microRNAs were performed for specific changes in serum/plasma microRNAs during disease, urinary system diseases, reproductive system diseases and motor system diseases.
  • the principle and experimental procedure of quantitative PCR are the same as RT-PCR. The only difference is that the fluorescent dye EVA GREEN is added during PCR.
  • the instrument was an ABI Prism 7300 real-time PCR instrument with a reaction condition of 95 ° C, 5 minutes for 1 cycle ⁇ 95 ° C, 15 seconds, 60 ° C, 1 minute for 40 cycles.
  • the data processing method is ⁇ method, and CT is set to the number of cycles when the reaction reaches the domain value.
  • the patient serum/plasma sample is directly subjected to a reverse transcription reaction with a normal human serum/plasma sample, and the amount of microribonucleic acid contained therein is compared by a quantitative PCR reaction.
  • FIG. 4 is the above-mentioned blood cell-specific miR-181a, miR-181b, miR-223, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-150, myocardium and skeletal muscle microRNA miR-1, The results of quantitative PCR of miR-133a, miR-206, microRNAs miR-9, miR-124a from brain tissue, and miR-122a from the liver in normal human and patient serum.
  • the ratio of the amount of microRNA in the serum of aplastic anemia, breast cancer, osteosarcoma, central nervous system lymphoma, and diabetic patients to the amount of normal humans is up-regulated and down-regulated, respectively, and the same tissue source of microRNA in different diseases
  • the degree of change in the medium indicates that serum/plasma microribonuclease has specific changes in different diseases, and they can be used as a marker for the diagnosis of a new type of disease.
  • microRNA and macroRNA in serum and blood cells By measuring the amount of microRNA and macroRNA in serum and blood cells, it was found that the content of microRNA in serum is very rich. See Figure 5, represented by a U6 molecule with a molecular weight of lOObp and a ribosome RNA molecule with molecular weights of 18S and 28S, respectively.
  • the amount of macromolecular ribonucleic acid in blood cells is at least tens of times higher than that in serum, except for blood cell-specific
  • the amount of microRNA in serum and the amount in blood cells are flat. and so, — ⁇ Serum/plasma is specifically rich in small molecule nuclear nucleic acids, especially tiny ribose ft i_.
  • the small ribonucleic acid was also found to be somewhat resistant to the action of endonuclease, which may be a reason for the stable presence of microRNA in serum/plasma.
  • the total ribonucleic acid extracted from the cultured cell line was treated with the endonuclease R ase A, and then the remaining amount of the macromolecular ribonucleic acid and the small ribonucleic acid was detected, and it was found that the tiny ribonucleic acid can be counteracted to some extent.
  • the nuclease is degraded, and the macromolecular ribonucleic acid is substantially completely cleaved, so the microRNA in the serum/plasma can be stably present.
  • Example 4 Preparation of serum/plasma microribonucleic acid microchips for diagnosing diseases
  • serum/plasma microribose was prepared.
  • Biochip for nucleic acids The chip contains probes for all tiny ribonucleic acids that are normally detected in human serum/plasma, forming a library of probes, see Table 1.
  • some probes in this probe library form a probe set to quantify changes in microRNA in this specific case.
  • a collection of probes interacting with microRNAs numbered 17-5p, 21, 103, 106a, 107, 126*, 143, 145, 150, 155, 210 is used.
  • the interaction with microRNAs numbered 21, 23a, 23b, 24, 27a, 27b, 125b, 195, 199a, 214, 217, 133a was used. Collection of needles.
  • the chip enables high-throughput screening of stable microRNA probes in serum/plasma, while predicting and diagnosing disease through overall changes in serum/plasma microRNAs.
  • microRNAs in serum/plasma are determined by sequencing or quantitative PCR, and then the reverse complementary probes of these microRNAs are synthesized, and these probes are spotted with a chip spotter SmartArrayTM.
  • a chip spotter SmartArrayTM On a 75 25 mm chemically modified glass slide.
  • the samples prepared on the chip also included U6, tR A as an internal standard, an artificially prepared 30-base-length external standard, and a positive control Hex.
  • the entire lattice is divided into 4 sub-arrays, each with 23 rows and 21 columns, a dot pitch of 185 ⁇ m, and a dot diameter of about 130 ⁇ m, and each probe is repeated three times.
  • the chip operation procedure is: (1) extracting total RNA from serum/plasma, detecting the quality of total RNA by formaldehyde gel electrophoresis; (2) separating microribonucleic acid: taking 50-100 ⁇ ⁇ total RNA Ambion's miRNA Isolation Kit (Cat #. 1560 ⁇ ⁇ microRNA; (3) fluorescent labeling of small ribonucleic acid samples: fluorescent labeling using T4 RNA ligase labeling method, then precipitating with absolute ethanol, drying For chip hybridization; (4) Hybridization and washing: The RNA was dissolved in 16 L of hybridization solution (15% guanidinamide; 0.2% SDS; 3xSSC; 50 x Denhardt's solution), and hybridized overnight at 42 ° C.
  • Chip scanning LuxScan 10K for chip /A dual-channel laser scanner for scanning;
  • Data extraction and analysis The image of the chip was analyzed by LuxScan3.0 image analysis software, the image signal was converted into digital signal, and finally the differentially expressed gene was selected by SAM analysis.
  • a type of serum/plasma microRNA probe that is highly differentially expressed under disease and normal physiological conditions which is a combination of quantitative PCR technology and biochip technology, is used for preparing a biochip, and the method is the same as above.
  • the manufacturing process and operation flow of the chip are not greatly improved, but the chip simplifies the probe library, thereby greatly reducing the manufacturing cost and production time of the chip, and is easy to prepare. At the same time, it also increases the pertinence and practicality of the chip. Putting this chip into practice requires only the patient's serum/plasma without any other tissue to detect the disease early and help guide diagnosis and treatment.
  • various acute and chronic infectious diseases such as viral diseases: viral influenza, viral hepatitis, AIDS, SARS, etc., bacterial diseases: tuberculosis, bacterial pneumonia, etc., and various other Acute and chronic infectious diseases caused by pathogenic microorganisms
  • other acute and chronic diseases such as respiratory diseases, immune system diseases, blood and hematopoietic diseases, such as cardiovascular diseases, endocrine system metabolic diseases, digestive diseases, nerves
  • Diagnosis of systemic diseases, urinary system diseases, reproductive system diseases and motor system diseases occurrence of disease complications and prediction of recurrence of malignant diseases, evaluation of efficacy, screening of active ingredients, evaluation of efficacy, and identification of forensic and illicit drugs
  • the manufacturing process and operational procedures of the microRNA kit are based on quantitative and semi-quantitative PCR techniques and biochip technology.
  • the kit includes a batch of serum/plasma microRNA primers, reagents such as Taq enzyme, dNTP and the like.
  • this kit is that only serum/plasma is needed without the need for other tissue samples, and the trend of microRNAs is detected by the most streamlined probe library, and the trend is used to predict the likelihood of disease occurrence or to diagnose the pathological stage of the disease. . Therefore, putting this kit into practice can increase the possibility of finding lesions at an early stage and help guide diagnosis and treatment.

Description

血清 /血浆微 'J、核糖核酸及其应用 技术领域
本发明涉及微小核糖核酸及其应用， 具体涉及血清 /血浆微小核糖核 酸及其在疾病的诊断与鉴别诊断、 疾病并发症的发生和恶性疾病复发的预 测、 疗效评价、 药物活性成分的筛选、 药效评价以及司法鉴定和违禁药品 检测等方面的应用。 背景技术
寻找疾病标记物并对其进行准确检测已经成为对各种临床疾病（包括 各种肿瘤； 各种急慢性传染病， 例如病毒性疾病： 病毒性流感、 病毒性肝 炎、 艾滋病、 SARS等， 细菌性疾病： 结核、 细菌性肺炎等， 以及其它各 种病原微生物导致的急慢性传染病；其它急慢性疾病，例如呼吸系统疾病， 免疫系统疾病， 血液与造血系统疾病， 如心脑血管疾病的循环系统疾病， 内分泌系统代谢性疾病， 消化系统疾病， 神经系统疾病， 泌尿系统疾病， 生殖系统疾病和运动系统疾病）诊断和治疗的重要前提条件。 尽管越来越 多的疾病标记物已经被发现并应用于临床疾病的普查、 诊断和疗效的监 控， 但是它们的临床应用效果还存在着明显不足。 例如， 肿瘤标记物曱胎 蛋白， 乳酸脱氢酶， 癌胚抗原等已被广泛应用于临床， 但是这些疾病标记 物还远远不能满足对癌症早期诊断的需要， 其主要原因有两个方面： （1 ) 上述疾病标记物的灵敏度和特异性相对较低 , 它们的检测结果还不能作为 疾病确诊的指标； （2 ) 疾病的早期诊断率应与治疗的效果呈现正相关， 而上述任何一种疾病标记物还难以满足疾病的早期诊断的这种要求。 以癌 症为例， 由于存在着肿瘤分化类别特异性过强、 肿瘤整体敏感性较低、 送 检标本难以反复采取、 标本保存要求条件高等缺陷， 同时价格昂贵， 因此 在现有条件下难以广泛推广应用现有的肿瘤标记物。 而一些传统医学手 段， 如组织细胞检测存在着其固有的缺陷， 取材位置不当、 组织细胞标本 材料不足或人为经验的不足等都将导致误诊。 其它技术例如影像学虽然已 被广泛应用于疾病的检查和诊断， 但其在疾病程度的定性上仍存在着很大 的局限性。 因此目前非常有必要寻找能够弥补现有标记物的上述缺陷的新 型、 灵敏并且应用方便的疾病检测标记物。
微小核糖核酸， 英文名为 microR A, 是一类长约 19至 23个核苷酸 的非编码单链小核糖核酸分子。 它们在进化上高度保守， 并与动物的许多 正常生理活动, 如生物个体发 、 组织分化、 细胞调亡以及能量代谢等密 切相关， 同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。 最近的研究 发现慢性淋巴细胞性白血病以及 Burkitt淋巴瘤中的几种微小核糖核酸的 表达水平均有不同程度的下调； 分析比较人肺癌、 乳腺癌组织中的微小核 糖核酸表达时， 发现有若干组织特异性微小核糖核酸的表达水平相对于正 常组织发生了变化。 也有研究证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、 心衰、 动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展，并且与 II型糖尿病等代谢性疾 病有密切关联。 这些实验结果提示微小核糖核酸表达及特异性变化与疾病 发生和发展之间存在着必然联系。
由于微小核糖核酸在基因转录后的表达调控中起着超乎想象的重要 作用， 因此它与疾病存在以下的关联性： 首先， 小核糖核酸的变化可能 是病因， 这是因为疾病的抑制因子以及促进因子都可能是微小核糖核酸的 靶位点， 当微小核糖核酸本身先发生了紊乱表达， 比如本来抑制疾病促进 因子的微小核糖核酸表达量降低了， 或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核 酸表达量升高了， 其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某 些通路的整体紊乱， 进而诱发疾病发生； 其次， 微小核糖核酸的变化也可 能是疾病的结果， 这是因为当疾病 （如癌症）发生时， 会导致染色体片段 的丟失、 基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增， 若微小核糖核酸正好位 于这一变化区段内， 那么其表达量将发生极其显著的变化。 因此， 理论上 微小核糖核酸分子完全可以作为一类新的疾病标志物， 它的特异性变化必 然与疾病产生发展相关联。 同时微小核糖核酸还可以作为潜在的药物作用 靶点， 通过抑制疾病过程中上调的微小核糖核酸和过表达下调的微小核糖 核酸， 将有可能极大地緩解疾病的发生和发展。
本发明人已经开展了以微小核糖核酸作为疾病标志物的相关领域的 研究， 例如选取占恶性肿瘤发病率第 4位的结肠癌作为研究对象， 经研究 发现， 在结肠良性息肉发展成恶性肿瘤期间， 一些微小核糖核酸分子都存 在着特异性变化， 并据此通过测定微小核糖核酸的特异性变化已经建立起 一种更敏感、 更精确的早期确诊结肠癌的方法。 然而由于组织标本的取材 不容易使这种方法在临床上的广泛应用受到了限制。 发明内容
本发明人将研究目光投向较易获得， 甚至常规体检中就可以收集到的 血液。 由于血液会循环至全身所有组织， 并向细胞输送营养并清除废物， 园此血液罷够反映 ώ整个机体的生理病理状况「其检测结果对人体 ιί康具 有指导意义。 已知血清 /血浆中存在着多种蛋白， 如总蛋白、 白蛋白、 球蛋 白等， 多种脂质， 如 HDL胆固醇、 三甘油脂等， 多种糖质， 色素， 电解 质和无机盐， 多种酶， 如淀粉酶、 碱性磷酸酶、 酸性磷酸酶、 胆素脂酶、 醛缩酶等， 同时还汇集了来自全身组织器官的多种信号分子，如细胞因子， 激素等。 目前， 对疾病的诊断仅仅局限于血清 /血浆中的上述生化指标， 还 没有关于血清 /血浆微小核糖核酸的任何报道。 人们传统观念中认为血清 / 血浆中没有核糖核酸分子， 即使有也会很快被核糖核酸酶降解为小分子片 段而检测不到。 但是， 由于微小核糖核酸分子是 19至 23个核苷酸单元组 成，具有结构上的特殊性和相对稳定性，它们极有可能存在于血清 /血浆中， 同时由于微小核糖核酸分子是一类新型疾病标志物， 因此希望通过对血清 /血浆微小核糖核酸是否存在， 能否被检测及其与疾病的相关性的研究， 建 立一种利用血清 /血浆中稳定存在的微小核糖核酸及其特异性变化来进行 各种疾病的早期诊断， 疾病鉴定和病程监控， 恶性疾病复发及预后、 并发 症发生的预测， 药效判定， 用药指南， 个体化治疗， 中药有效成份筛选， 种群分类等研究的新技术。
本发明提供一种用于评价受试者的生理和 /或病理状态的微小核糖核 酸的组合，所述组合包含受试者血清 /血浆中稳定存在且可检测的全部微小 核糖核酸。
本发明还提供一种用于评价受试者的生理和 /或病理状态的方法，该方 法包括测定受试者血清 /血浆中稳定存在且可检测的全部微小核糖核酸。
在上述组合或方法中，所述受试者血清 /血浆中稳定存在且可检测的全 部微小核糖核酸可以为人血清 /血浆中的全部成熟体微小核糖核酸，具体包 括 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 let-7e、 let-7f、 let-7g、 let-7i、 miR-l、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-105、 miR-106a、 miR-106b、 miR-107、 miR-10a、 miR-10b、 miR-122a、 miR-124a、 miR-125a、 miR-125b、 miR-126、 miR-126*、 miR-127、 miR-128a、 miR-128b、 miR-129、 miR-130a、 miR-130b、 miR-132、 miR-133a、 miR-133b、 miR-134、 miR-135a、 miR-135b、 miR-136, miR-137, miR-138、 miR-139, miR-140、 miR-141、 miR-142-3p、 miR-142-5p、 miR-143> miR-144、 miR-145、 miR-146a、 miR-146b、 miR-147、 miR-148a、 miR-148b、 miR-149、 miR-150、 miR-151、 miR-152> miR-153 miR-154、 miR-154*、 miR-155、 miR-15a、 miR-15b、 miR-16、 miR-17-3p、 miR-17-5p、 miR-181a、 miR-181b、 miR-181c、 miR-181d、 miR-182、 miR-182* . miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-187、 miR-188> miR-189、 miR-18a、 miR-18a* > miR-18b、 miR-190、 miR-191、 miR-191*、 miR-192, miR-193a、 miR-193b> miR-194、 miR-195、 miR-196a、 miR-196b、 miR-197、 miR-198、 miR-199a、 miR-199a*、 miR-199b、 miR-19a、 miR-19b、 miR-200a、 miR-200a*、 miR-200b、 miR-200c、 miR-202、 miR-202*、 miR-203 , miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-208 , miR-20a、 miR-20b、 miR-21、 miR-210、 miR-211、 miR-212、 miR-213、 miR-214、 miR-215, miR-216、 miR-217, miR-218、 miR-219、 miR-22、 miR-220、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-224、 miR-23a、 miR-23b> miR-24、 miR-25、 miR-26a、 miR-26b、 miR-27a、 miR-27b miR-28、 miR-296、 miR-299-3p、 miR-299-5p、 miR-29a、 miR-29b、 miR-29c、 miR-301、 miR-302a、 miR-302a*、 miR-302b、 miR-302b* > miR-302c、 miR-302c*、 miR-302d、 miR-30a-3p、 miR-30a-5p、 miR-30b、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e-3p、 miR-30e-5p、 miR-31、 miR-32、 miR-320、 miR-323、 miR-324-3p、 miR-324-5p、 miR-325, miR-326、 miR-328、 miR-329、 miR-33、 miR-330、 mi -33 miR-335、 miR-337、 miR-338, miR-339, miR-33b、 miR-340、 miR-342> miR-345、 miR-346、 miR-34a、 miR-34b、 miR-34c、 miR-361 , miR-362、 miR-363、 miR-363*、 miR-365、 mi -367> miR-368、 miR-369-3p> miR-369-5p、 miR-370, miR-371、 miR-372, miR-373 , miR-373* . miR-374、 miR-375、 miR-376a、 miR-376a*、 miR-376b、 miR-377、 miR-378、 miR-379、 miR-380-3p、 miR-380-5p、 miR-381、 miR-382、 miR-383、 miR-384、 miR-409-3p、 miR-409-5p、 miR-410、 miR-411、 miR-412, miR-421、 miR-422a miR-422b、 miR-423、 miR-424、 miR-425、 miR-425-5p、 miR-429、 miR-431、 miR-432、 miR-432*、 miR-433、 miR-448, miR-449、 miR-450、 miR-451、 miR-452、 miR-452*、 miR-453、 miR-455、 miR-483、 miR-484、 miR-485-3p miR-485-5p、 miR-486、 miR-487a、 miR-487b、 miR-488、 miR-489、 miR-490、 miR-491、 miR-492、 miR-493、 miR-493-3p、 miR-494、 miR-495、 miR-496、 miR-497、 miR-498、 miR-499、 miR-500、 miR-501、 miR-502、 miR-503、 miR-504 miR-505、 miR-506、 miR-507、 miR-508、 miR-509、 miR-510、 miR-511、 miR-512-3p、 miR-512-5p、 miR-513、 miR-514、 miR-515-3p、 miR-515-5p> miR-516-3p、 miR-516-5p> miR-517*、 miR-517a、 miR-517b、 miR-517c、 miR-518a、 miR-518a-2*、 miR-518b、 miR-518c、 miR-518c*、 miR-518d、 miR-518e、 miR-518f、 miR-518 、 miR-519a、 miR-519b、 mi -519c miR-519d、 miR-519e、 miR-519e*、 miR-520a、 miR-520a*、 miR-520b、 miR-520c、 miR-520d、 miR-520d* miR-520e、 miR-520f、 miR-520g、 miR-520h、 miR-521、 miR-522、 miR-523、 miR-524, miR-524* miR-525、 miR-525*、 miR-526a、 miR-526b、 miR-526b*、 miR-526c、 miR-527, miR-532、 miR-542-3p、 miR-542-5p、 miR-544、 miR-545、 miR-548a、 miR-548b、 miR-548c、 miR-548d、 miR-549、 miR-550、 miR-551a、 miR-552、 miR-553、 miR-554、 miR-555、 miR-556、 miR-557、 miR-558、 miR-559、 miR-560、 miR-561、 miR-562、 miR-563、 miR-564、 miR-565、 miR-566、 miR-567, miR-568, miR-569, miR-570、 miR-571 , miR-572、 miR-573 , miR-574、 miR-575 , miR-576、 miR-577, miR-578、 miR-579、 miR-580, miR-581、 miR-582、 miR-583、 miR-584、 miR-585、 miR-586、 miR-587、 miR-588、 miR-589、 miR-590、 miR-591、 miR-592 miR-593、 miR-594、 miR-595、 miR-596、 miR-597, miR-598、 miR-599, miR-600、 miR-601、 miR-602、 miR-603、 miR-604、 miR-605 miR-606、 miR-607、 miR-608, miR-609、 miR-610、 miR-611、 miR-612、 miR-613、 miR-614> miR-615、 miR-616、 miR-617、 miR-618、 miR-619、 mi -620, miR-621、 miR-622, miR-623、 miR-624、 miR-625, miR-626、 miR-627, miR-628、 miR-629、 miR-630、 miR-631、 miR-632、 miR-633、 miR-634、 miR-635、 miR-636、 miR-637、 miR-638、 miR-639、 miR-640、 miR-641、 miR-642、 miR-643、 miR-644、 miR-645、 miR-646、 miR-647> miR-648, miR-649、 miR-650、 miR-651、 miR-652、 miR-653、 miR-654、 miR-655、 miR-656 miR-657、 miR-658, miR-659、 miR-660、 miR-661、 miR-662、 miR-663、 miR-7、 miR-9、 miR-9*、 miR-92、 miR-93、 miR-95、 miR-96、 miR-98、 miR-99a和 miR-99b。
上述测定受试者血清 /血浆中稳定存在且可检测的全部微小核糖核酸 的方法选自： RT-PCR方法、 Real-time PCR方法、 Northern blotting方法、 RNase protection assay、 Solexa sequencing technology以及生物芯片方法中 的一种或几种。
其中所述 RT-PCR方法包括以下步骤：
( 1 )提取受试者的血清 /血浆总 RNA, 通过 RNA 逆转录反应得到 cDNA样品； 或者收集受试者的血清 /血浆样本， 以血清 /血浆作为緩冲液 进行逆转录反应来制备 cDNA样品；
( 2 ) 用微小核糖核酸设计引物进行 PCR反应；
( 3 )进行 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
( 4 ) EB染色后在紫外灯下观察结果。 所述 Real-time PGR方法包括以下步骤：
( 1 )提取受试者的血清 /血浆总 R A, 通过 RNA 逆转录反应得到 cDNA样品； 或者收集受试者的血清 /血浆样本， 以血清 /血浆作为緩冲液 进行逆转录反应来制备 cDNA样品；
( 2 )用微小核糖核酸设计引物；
( 3 )加入荧光探针进行 PCR反应；
( 4 )检测并比较血清 /血浆样本相对于正常血清 /血浆中微小核糖核酸 的量的变化。
本发明还提供一种用于评价受试者的生理和 /或病理状态的试剂盒，该 试剂盒包含测定受试者血清 /血浆中稳定存在且可检测的全部微小核糖核 酸的工具。所述试剂盒可以包含人血清 /血浆中的全部成熟体微小核糖核酸 的引物，具体包括 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 let-7e、 let-7f、 let-7g、 let-7i、 miR- miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-105、 miR-106a、 miR-106b、 miR-107、 miR-10a、 miR-10b、 miR-122a、 miR-124a、 miR-125a、 miR-125b、 miR-126、 miR-126*. miR-127、 miR-128a、 miR-128b、 miR-129, miR-130a、 miR-130b、 miR-132、 miR-133a、 miR-133b、 miR-134、 miR-135a、 miR-135b、 miR-136、 miR-137、 miR-138, miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-142-3p、 miR-142-5p> miR-143. miR-144、 miR-145、 miR-146a、 miR-146b、 miR-147、 miR-148a、 miR-148b、 miR-149、 miR-150、 miR-151、 miR-152. miR-153、 miR-154、 miR-154*、 miR-155、 miR-15a> miR-15b、 miR-16、 miR-17-3p、 miR-17-5p miR-181a、 miR-181b、 miR-181c、 miR-181d、 miR-182、 miR-182*、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-187、 miR-188、 miR-189、 miR-18a、 miR-18a*、 miR-18b、 miR-190、 miR-191、 miR-191*、 miR-192、 miR-193a、 miR-193b、 miR-194、 miR-195、 miR-196a、 miR-196b、 miR-197、 miR-198、 miR-199a、 miR-199a*、 miR-199b、 miR-19a、 miR-19b、 miR-200a、 miR-200a*、 miR-200b、 miR-200c、 miR-202, miR-202*. miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-208、 miR-20a、 miR-20b、 miR-21 miR-210、 miR-211、 miR-212、 miR-213 , miR-214、 miR-215、 miR-216、 miR-217、 miR-218、 miR-219、 miR-22、 miR-220、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-224、 miR-23a、 miR-23b、 miR-24> miR-25、 miR-26a、 miR-26b、 miR-27a、 miR-27b、 miR-28、 miR-296, miR-299-3p、 miR-299-5p、 miR-29a、 miR-29b、 miR-29c、 miR-301、 miR-302a、 miR-302a*、 miR-302b、 miR-302b*、 miR-302c、 miR-302c*、 miR-302d、 miR-30a-3p、 miR-30a-5p、 miR-30b、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e-3p、 miR-30e-5p、 miR-31、 miR-32、 miR-320, miR-323、 miR-324-3p、 miR-324-5p、 miR-325、 miR-326, miR-328、 miR-329、 miR-33、 miR-330. miR-331、 miR-335, miR-337、 miR-338、 miR-339、 miR-33b、 miR-340、 miR-342、 miR-345、 miR-346、 miR-34a、 miR-34b、 miR-34c、 miR-361、 miR-362、 miR-363、 miR-363*、 miR-365、 miR-367、 miR-368、 miR-369-3p、 miR-369-5p、 miR-370, miR-371、 miR-372、 miR-373、 miR-373*、 miR-374、 miR-375、 miR-376a、 miR-376a* > miR-376b、 miR-377> miR-378、 miR-379、 miR-380-3p, miR-380-5p、 miR-381、 miR-382、 miR-383、 miR-384、 miR-409-3p、 miR-409-5p、 miR-410、 miR-411、 miR-412、 miR-421、 miR-422a、 miR-422b> miR-423、 miR-424、 miR-425、 miR-425-5p、 miR-429、 miR-431、 miR-432、 miR-432*、 miR-433 , miR-448、 miR-449、 miR-450、 miR-451、 miR-452、 miR-452*、 miR-453、 miR-455、 miR-483、 miR-484、 miR-485-3p、 miR-485-5p、 miR-486、 miR-487a、 miR-487b、 miR-488、 miR-489、 miR-490、 miR-491、 miR-492、 miR-493、 miR-493-3p、 miR-494、 miR-495, miR-496、 miR-497、 miR-498, miR-499> miR-500、 miR-501、 miR-502, miR-503、 miR-504、 miR-505, miR-506、 miR-507、 miR-508、 miR-509、 miR-510、 miR-511、 miR-512-3p、 miR-512-5p、 mi -513 , miR-514、 miR-515-3p、 miR-515-5p、 miR-516-3p、 miR-516-5p、 miR-517*、 miR-517a、 miR-517b、 miR-517c、 miR-518a、 miR-518a-2*、 miR-518b、 miR-518c、 miR-518c*、 miR-518d、 miR-518e、 miR-518f、 miR-518 , miR-519a、 miR-519b、 miR-519c、 miR-519d、 miR-519e、 miR-519e*、 miR-520a miR-520a*、 miR-520b、 miR-520c > miR-520d、 miR-520d*、 miR-520e、 miR-520f、 miR-520g、 miR-520h、 miR-521、 miR-522、 miR-523、 miR-524、 miR-524*、 miR-525、 miR-525*、 miR-526a、 miR-526b、 miR-526b*、 miR-526c、 miR-527、 miR-532、 miR-542-3p、 miR-542-5p、 miR-544、 miR-545、 miR-548a、 miR-548b、 miR-548c、 miR-548d、 miR-549、 miR-550、 miR-551a、 miR-552、 miR-553 , miR-554、 miR-555、 miR-556, miR-557, miR-558、 miR-559、 miR-560、 miR-561、 miR-562、 miR-563 , miR-564、 miR-565、 miR-566, miR-567、 miR-568, miR-569、 miR-570、 miR-571、 miR-572、 miR-573、 miR-574、 miR-575, miR-576、 miR-577、 miR-578、 miR-579、 miR-580、 miR-581、 miR-582、 miR-583、 miR-584、 miR-585 , miR-586、 miR-587、 miR-588、 miR-589、 miR-590、 miR-591、 miR-592, miR-593、 miR-594, miR-595、 miR-596、 miR-597, miR-598, miR-599, miR-600、 miR-601、 W miR-602、 miR-603、 mi -0U4, miR-605、 miR-606、 miR-607、 miR-608、 miR-609、 miR-610、 miR-611、 miR-612、 miR-613、 miR-614、 miR-615、 miR-616> miR-617、 miR-618、 miR-619、 miR-620、 miR-621、 miR-622、 miR-623、 miR-624, miR-625、 miR-626、 miR-627、 miR-628、 miR-629、 miR-630、 miR-631、 miR-632、 miR-633、 miR-634、 miR-635、 miR-636、 miR-637、 miR-638、 miR-639、 miR-640、 miR-641、 miR-642、 miR-643、 miR-644、 miR-645、 miR-646, miR-647、 miR-648、 miR-649、 miR-650、 miR-651、 miR-652, miR-653 , miR-654, miR-655、 miR-656、 miR-657、 miR-658、 miR-659、 miR-660、 miR-661、 miR-662、 miR-663、 miR-7、 miR-9、 miR-9*、 miR-92、 miR-93、 miR-95, miR-96、 miR-98, miR-99a和 miR-99b 的引物。
本发明还提供一种评价受试者的生理或病理状态的生物芯片， 该生物 芯片包含测定受试者血清 /血浆中稳定存在且可检测的全部微小核糖核酸 的元件。所述生物芯片可以包含人血清 /血浆中的全部成熟体微小核糖核酸 的探针， 所述探针具体包括表 1所示的探针：
表 1 人血清 /血浆中的全部成熟体微小核糖核酸的探针
Figure imgf000010_0001
-6-
Figure imgf000011_0001
£9 £00/L00Z l3/13d 6.6SS0/600Z OAV -οι -
Figure imgf000012_0001
£9 £00/L00Z^D/13d 6.6SS0/6001 O 一 π -
Figure imgf000013_0001
6.6SS0/600Z OAV
C9 C00/Z.00ZN3/X3d -ζι一
Figure imgf000014_0001
C9^C00/.00lN3/X3d 6Z.6SS0/600Z OAV -ei-
Figure imgf000015_0001
£9t£00/L00ZSiD/13d 6.6SS0/6001 OAV - I -
Figure imgf000016_0001
£9 £00/L00Z l3/13d 6.6SS0/600Z OAV - ζ\一
Figure imgf000017_0001
£9 £00/Z.00ZN3/X3d 6Z.6SS0/600J OAV 一 9ΐ -
Figure imgf000018_0001
£9 £00/L00Z l3/13d 6.6SS0/600Z OAV - L\ -
Figure imgf000019_0001
£9t£00/L00ZSiD/lDd 6.6SS0/600J OAV -81一
Figure imgf000020_0001
£9 £00/Z.00ZN3/X3d 6Z.6SS0/600J OAV -6ΐ-
Figure imgf000021_0001
ε9^εθΟ/.ΟΟΖΝ3/Χ3<Ι 6Z.6SS0/600Z OAV pfobe-miR-648 miR-648 ACCAGTGCCCTGCACACTT probe-miR-649 miR-649 GACTCTTGAACAACACAGGTTT probe-miR-650 miR-650 GTCCTGAGAGCGCTGCCTCCT probe-miR-651 miR-651 CAAAAGTCAAGCTTATCCTAAA probe-miR-652 miR-652 TGCACAACCCTAGTGGCGCCATT probe-miR-653 miR-653 GTTCAGTAGAGATTGTTTCAA probe-miR-654 miR-654 GCACATGTTCTGCGGCCCACCA probe-miR-655 miR-655 AAAGAGGTTAACCATGTATTAT probe-miR-656 miR-656 AGAGGTTGACTGTATAATATT probe-miR-657 miR-657 CCTAGAGAGGGTGAGAACCTGCC probe-miR-658 miR-658 ACCAACGGACCTACTTCCCTCCGCC probe-miR-659 miR-659 TGGGGACCCTCCCTGAACCAAG probe-miR-660 miR-660 CAACTCCGATATGCAATGGGTA probe-miR-661 miR-661 ACGCGCAGGCCAGAGACCCAGGCA probe-miR-662 miR-662 CTGCTGGGCCACAACGTGGGA probe-miR-663 miR-663 GCGGTCCCGCGGCGCCCCGCCT probe-miR-7 miR-7 CAACAAAATCACTAGTCTTCCA probe-miR-9 miR-9 TCATACAGCTAGATAACCAAAGA probe-miR-9* miR-9* ACTTTCGGTTATCTAGCTTTA probe-miR-92 miR-92 CAGGCCGGGACAAGTGCAATA probe-miR-93 miR-93 CTACCTGCACGAACAGCACTTT probe-miR-95 miR-95 TGCTCAATAAATACCCGTTGAA probe-miR-96 miR-96 GCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA probe-miR-98 miR-98 AACAATACAACTTACTACCTCA probe-miR-99a miR-99a CACAAGATCGGATCTACGGGTT probe-miR-99b miR-99b CGCAAGGTCGGTTCTACGGGTG 具体而言， 在上述组合、 方法、 试剂盒或生物芯片中， 所述评价受试 者的生理和 /或病理状态为测定受试者给予待测物后的生理和 /或病理状 态， 具体用于筛选待测物的预防和 /或治疗疾病的活性； 所述评价受试者的 生理和 /或病理状态为诊断和 /或鉴别诊断受试者的疾病； 所述评价受试者 的生理和 /或病理状态为评价对受试者的疾病进行治疗的有效性；所述评价 受试者的生理和 /或病理状态为对受试者发生疾病进行预测，所述发生疾病 具体为疾病并发症的发生和 /或恶性疾病的复发； 上述组合、 方法、 试剂盒 或生物芯片还可用于检测受试者服用违禁药品的情况。
上述疾病包括各种肿瘤； 各种急慢性传染病， 例如病毒性流感、 病毒 ¾肝炎、 艾^病、 SARS 的病毒性疾病 Γ例如结核、 细菌性肺炎的细菌性 疾病， 以及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病； 其它急慢性疾病， 例如呼吸系统疾病， 免疫系统疾病， 血液与造血系统疾病， 如心脑血管疾 病的循环系统疾病， 内分泌系统代谢性疾病， 消化系统疾病， 神经系统疾 病， 泌尿系统疾病， 生殖系统疾病和运动系统疾病。
上述血清 /血浆来源于受试者活体、 组织、 器官和 /或尸体。
本发明需要解决的问题包括： （1 ) 分析鉴定人及小鼠， 大鼠等各种 动物中血清 /血浆^小核糖核酸分子及其稳定性； （ 2 )研究各种临床疾病 (包括各种肿瘤； 各种急慢性传染病， 如病毒性疾病： 病毒性流感、 病毒 性肝炎、 艾滋病、 SARS等， 细菌性疾病： 结核、 细菌性肺炎等， 以及其 它各种病原微生物导致的急慢性传染病； 其它急慢性疾病， 如呼吸系统疾 病， 免疫系统疾病， 血液与造血系统疾病， 例如心脑血管疾病的循环系统 疾病， 内分泌代谢系统疾病， 消化系统疾病， 神经系统疾病， 泌尿系统疾 病， 生殖系统疾病和运动系统疾病）的发病过程中血清 /血浆微小核糖核酸 的特异性变化； （ 3 )通过血清 /血浆微小核糖核酸的生物芯片和测序技术 测定不同疾病血清 /血浆微小核糖核酸的变化； （4 )将筛选到的在疾病及 正常生理状态下差异表达程度大的一类血清 /血浆微小核糖核酸分子用于 血清 /血浆微小核糖核酸检测技术的研制，来制备应用于疾病诊断等领域的 生物芯片和诊断试剂盒。
具体而言， 本发明通过 RT-PCR、 Real-time PCR、 Northern blotting、 R ase protection assay > Solexa sequencing technology和生物芯片等方法分 析并鉴定人及小鼠、 大鼠等各种动物血清 /血浆中微小核糖核酸分子的存 在。通过比较血清 /血浆中脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶作用后微小核糖核 酸的变化来研究血清 /血浆微小核糖核酸的稳定性。 通过将血清 /血浆微小 核糖核酸的 PCR产物进行测序和比对， 进一步验证血清 /血浆微小核糖核 酸分子的存在和序列的正确性。
具体的血清 /血浆微 d、核糖核酸的制备及分析如下：
RT-PCR方法。 收集血清 /血浆样本； 将血清 /血浆进行逆转录反应制备 cDNA样品或使用 Trizol试剂提取血清 /血浆总 RNA再进行逆转录反应制 备 cDNA样品； 通过成熟体微小核糖核酸设计引物进行 PCR反应； 进行 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳； EB染色后在紫外灯下观察结果并拍照。
Real-time PCR方法。 收集血清 /血浆样本； 将血清 /血浆进行逆转录反 应制备 cDNA样品或使用 Trizol试剂提取血清 /血浆总 RNA再进行逆转录
Figure imgf000024_0001
荧光探针 EVA GREEN进行 PCR反应； 分析处理数据并比较结果。
Northern blotting方法。 收集血清 /血浆样本； 通过 Trizol试剂提取血 清 /血浆总 R A; 进行变性 PAGE电泳和膜转移实验； 制备同位素标记微 小核糖核酸探针；进行膜杂交反应； 同位素信号检测如磷屏扫描检测结果。
RNase protection assay。 首先进行反义 RNA探针的合成， 同位素标记 与纯化； 收集血清 /血浆样本并提取 RNA; 将提取后的 RNA溶解在杂交緩 冲液中并加入反义 RNA探针进行杂交反应；加入 RNase消化液进行反应； 进行电泳与放射自显影； 分析结果。
Solexa sequencing technology。 》1史集血清 /血浆样本； 通过 Trizol试剂 提取血清 /血浆总 RNA;进行 PAGE电泳回收 17-27nt RNA分子；将 adaptor prime酶联在小 RNA分子的 3'与 5'端； 进行 RT-PCR反应后并进行测序； 数据分析与处理。
生物芯片方法。 将全部五百多个成熟体微小核糖核酸库点阵并制备生 物芯片； 收集血清 /血浆样本； 提取血清 /血浆总 RNA; 通过柱分离来分离 微小核糖核酸； 利用 T4 RNA连接酶进行微小核糖核酸荧光标记; 与生物 芯片进行杂交反应； 数据检测与分析。
通过上述的 RT-PCR , Real-time PCR, Northern blotting, RNase protection assay, Solexa sequencing technology和生物芯片等技术分析在不 同疾病发生中血清 /血浆微小核糖核酸的变化趋势及变化量，以及它们与不 同疾病的相关性。其中，首先检测分析 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 let-7e、 let-7f、 let-7g、 let-7i、 miR-l、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-105、 miR-106a、 miR-106b、 miR-107、 miR-lOa, miR-10b、 miR-122a、 mi -124a miR-125a、 miR-125b、 miR-126> miR-126*、 miR-127、 miR-128a、 miR-128b、 miR-129、 miR-130a、 miR-130b、 miR-132、 miR-133a、 miR-133b、 miR-134、 miR-135a、 miR-135b、 miR-136、 miR-137、 miR-138、 miR-139、 miR-140> miR- 141、 miR- 142-3p、 miR- 142-5p、 miR- 143、 miR- 144、 miR- 145、 miR- 146a、 miR-146b、 miR-147、 miR-148a、 miR-148b、 miR-149、 miR- 150, miR-151、 miR- 152、 miR- 153、 miR- 154、 miR- 154*、 miR- 155、 miR-15a、 miR-15b、 miR-16、 miR-17-3p、 miR-17-5p、 miR-181a、 miR- 18 lb > miR-181c、 miR-181d、 miR- 182、 miR- 182*、 miR- 183、 miR- 184、 miR- 185、 miR- 186、 miR- 187、 miR-188、 miR- 189. miR- 18a, miR-18a*、 miR-18b、 miR-190、 miR-191、 miR-191*、 miR-192、 miR-193a、 miR- 193b > miR-194、 miR- 195, miR-196a、 miR-196b、 miR-197、 miR-198、 miR-199a、 miR-199a*、 miR-199b、 miR-19a miR-19b、 miR-200a、 miR-200a*、 miR-200b、 miR-200c、 miR-202, miR-202*、 miR-203 , miR-204、 miR-205、 miR-206、 piR-208、 miR-20a、 miR-20b、 miR-21、 miR-210、 miR-211、 miR-212、 mi -213 , miR-214、 miR-215、 miR-216、 miR-217、 miR-218、 miR-219、 miR-22、 miR-220、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-224、 miR-23a、 miR-23b、 miR-24、 miR-25、 miR-26a、 miR-26b、 miR-27a> miR-27b、 miR-28、 miR-296、 miR-299-3p、 miR-299-5p、 miR-29a、 miR-29b、 miR-29c、 miR-301、 miR-302a、 miR-302a*、 miR-302b、 miR-302b*、 miR-302c、 miR-302c*、 miR-302d、 miR-30a-3p、 miR-30a-5p、 miR-30b、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e-3p、 miR-30e-5p、 miR-31、 miR-32、 miR-320. miR-323 , miR-324-3p> miR-324-5p、 miR-325、 miR-326、 miR-328、 miR-329 miR-33、 miR-330 , miR-331、 miR-335、 miR-337, miR-338、 miR-339、 miR-33b、 miR-340、 miR-342、 miR-345、 miR-346, miR-34a、 miR-34b、 miR-34c、 miR-361、 miR-362、 miR-363、 miR-363*、 miR-365 , miR-367、 miR-368、 miR-369-3p、 miR-369-5p、 miR-370、 miR-371、 miR-372、 miR-373、 miR-373* > miR-374、 miR-375、 miR-376a、 miR-376a*、 miR-376b、 miR-377, miR-378、 miR-379、 miR-380-3p、 miR-380-5p、 miR-381、 miR-382、 miR-383、 miR-384、 miR-409-3p、 miR-409-5p、 miR-410、 miR-411、 miR-412、 miR-421、 miR-422a、 miR-422b、 miR-423、 miR-424、 miR-425、 miR-425-5p、 miR-429、 miR-431、 miR-432、 miR-432*、 miR-433、 miR-448、 mi -449 miR-450、 miR-451、 miR-452、 miR-452*、 miR-453 , miR-455、 miR-483、 miR-484、 miR-485-3p、 miR-485-5p、 miR-486、 miR-487a、 miR-487b、 miR-488、 miR-489. miR-490、 miR-491、 miR-492、 miR-493、 miR-493-3p、 miR-494、 miR-495、 miR-496、 miR-497、 miR-498、 miR-499、 miR-500、 miR-501、 miR-502、 miR-503、 miR-504、 miR-505, miR-506、 miR-507、 miR-508、 miR-509、 miR-510、 miR-511、 miR-512-3p、 miR-512-5p、 miR-513、 miR-514、 miR-515-3p、 miR-515-5p、 miR-516-3p miR-516-5p、 miR-517*、 miR-517a、 miR-517b、 miR-517c、 miR-518a、 miR-518a-2*、 miR-518b、 miR-518c、 miR-518c*、 miR-518d、 miR-518e、 miR-518f、
Figure imgf000025_0001
、 miR-519a、 miR-519b、 miR-519c、 miR-519d、 miR-519e、 miR-519e*、 miR-520a、 miR-520a*、 miR-520b、 miR-520c、 miR-520d、 miR-520d*、 miR-520e、 miR-520f、 miR-520g、 miR-520h、 mi -521 , miR-522、 miR-523、 miR-524、 miR-524*、 miR-525、 miR-525*、 miR-526a、 miR-526b、 miR-526b*> m: R-526c、 miR-527、 miR-532、 miR-542-3p、 miR-542-5p、 miR-544、 miR-545、 m R-548a、 miR-548b、 miR-548c、 miR-548d、 mi -549, mi -550 miR-551a m R-552、 miR-553、 miR-554、 miR-555、 miR-556、 miR-557、 miR-558、 m R-559、 miR-560、 miR-561、 miR-562, miR-563、 miR-564、 miR-565、 m R-566、 miR-567、 miR-568、 miR-569、 miR-570> miR-571、 miR-572、 m R-573、 miR-574、 miR-575、 miR-576, miR-577、 miR-578 miR-579、 m R-580、 miR-581、 miR-582、 miR-583 , miR-584、 miR-585, miR-586、 m R-587, miR-588、 miR-589、 miR-590、 miR-591、 miR-592、 miR-593, m -594> miR-595、 miR-596, miR-597、 miR-598, miR-599、 miR-600、 m R-601、 miR-602、 miR-603、 miR-604、 miR-605、 miR-606、 miR-607、 m R-608、 miR-609、 miR-610、 miR-611、 miR-612、 miR-613、 miR-614, m R-615、 miR-616、 miR-617、 miR-618、 miR-619、 miR-620、 miR-621、 m R-622、 miR-623 , miR-624, miR-625、 miR-626、 miR-627、 miR-628、 m R-629、 miR-630、 miR-631、 miR-632、 miR-633、 miR-634, miR-635、 m R-636、 miR-637, miR-638、 miR-639, miR-640、 miR-641、 miR-642 m R-643、 miR-644 miR-645> miR-646、 miR-647、 miR-648、 miR-649、 m R-650、 miR-651、 miR-652、 miR-653 > miR-654、 miR-655> miR-656、 m R-657、 miR-658、 miR-659, miR-660、 miR-661、 miR-662、 miR-663、 m R-7、 miR-9、 miR-9*、 miR-92、 miR-93、 miR-95、 miR-96、 miR-98、 m R-99a和 miR-99b在各种临床疾病（包括各种肿瘤； 各种急慢性传染病， 如病毒性疾病： 病毒性流感、 病毒性肝炎、 艾滋病、 SARS等， 细菌性疾 病： 结核、 细菌性肺炎等， 以及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病； 其它急慢性疾病， 如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，血液与造血系统疾病， 例如心脑血管疾病的循环系统疾病， 内分泌系统代谢性疾病， 消化系统疾 病， 神经系统疾病， 泌尿系统疾病， 生殖系统疾病和运动系统疾病 ) 中的 变化， 制备血清 /血浆微小核糖核酸生物芯片测定不同疾病中血清 /血浆微 小核糖核酸的变化，同时对不同疾病血清 /血浆中微小核糖核酸进行 Solexa 测序分析。
疾病相关的血清 /血浆微小核糖核酸检测技术的研制。 具体地说， 将疾 病相关的特异性变化的微小核糖核酸筛选出来，将它们的引物收集到 PCR 试剂盒（RT-PCR或 Real-time PCR ) 中制备疾病诊断试剂盒， 或将其反向 互补序列作为探针点在芯片，就制成了专门针对某种疾病的血清 /血浆微小 核糖核酸检测生物芯片。 目前对疾病 ¾行临床 ^断的传统 物化 及分子生物学 ¾术还比 繁瑣和粗糙。 近年来发展起来的有可能用于疾病诊断的新型技术有基因芯 片和蛋白质 (抗体)芯片技术等。 基因芯片所测量的 mRNA水平变化并不能 完全反映真正的蛋白质水平的改变。 因为蛋白质的生物活性与转录后修饰 如糖基化， 磷酸化等密切相关。 并且， 对于许多疾病检测而言， 基因芯片 技术无法检测体液和血液中标志物分子。 蛋白质 (抗体)芯片技术和蛋白质 组学技术也有其局限性。人体内特别是血清 /血浆中含有数以万计的蛋白和 多肽片断， 它们浓度分布广， 明确报道的蛋白很少， 定量化的就更少了。 在这数量庞大的蛋白质组中找寻与特定疾病有密切关联的蛋白质， 并理解 其在组织病变中的作用仍然是一项极其艰巨的工作， 而且， 缺乏完善的抗 体资源将会是制约抗体芯片技术发展的一个瓶颈问题。血清 /血浆微小核糖 核酸检测技术，基于血清 /血浆微小核糖核酸的生物芯片和诊断试剂盒巧妙 地将血清 /血浆微小核糖核酸的独特性质和常规分子生物学检测技术结合 为一体 ,它们可以快速地高通量地分析各种病人血清 /血浆中微小核糖核酸 的组成， 临床适用性极强。 由于器官组织的生理状态变化会引起血清 /血浆 微小核糖核酸组成的改变， 因此血清 /血浆微小核糖核酸可以作为 "疾病指 纹，， , 实现疾病的早期诊断。
血清 /血浆微小核糖核酸检测技术的优越性：
( 1 )血清 /血浆微小核糖核酸作为新型的疾病标志物， 具有检出谱系 广、 灵敏度高、 检测成本低、 取材方便、 样本易存放（血清 /血浆 -20 °C存 放即可）等优点， 该方法可广泛用于疾病普查等相关工作， 成为早期诊断 疾病的有效手段。
( 2 )血清 /血浆微小核糖核酸作为新的疾病标记物将改进单一的标记 物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度， 显著提高疾病的 临床检出率和实现疾病的早期诊疗。
( 3 )血清 /血浆微小核糖核酸检测技术的优势在于其检测的是一系列 疾病相关标记物，因而能够克服病人个体之间的差异 (即年龄、性别、种族、 饮食和环境等）， 而这正是单一疾病标记物所无法逾越的一个主要问题。
总之， 使用血清 /血浆微小核糖核酸检测技术可以早期确诊组织病变， 这种新的血清 /血浆疾病标记物不仅为人们在分子水平上全面了解组织病 变的机理提供了物质基础， 也加速了临床疾病诊断学和治疗学的进步。 当 然， 早期检测疾病的绝大多数分子诊断技术还正处于初步的实验阶段， 其 有效性有待进一步的验证和提高。 况且， 每一种疾病都有自己的特征， 需 ——— 要自己独特的检测方法， 不可能通过一种或少数种类的检测方法检测出所 有的疾病。 但是， 基于血清 /血浆微小核糖核酸的优越性， 相信不久的将 来， 对重症疾病如癌症的血清 /血浆微小核糖核酸诊断技术将会成为常规 体检的一部分， 而且微小核糖核酸相关的基因治疗也会广泛地应用， 征服 这些疾病不再是梦想。 附图的筒要说明
以下， 结合附图来详细说明本发明的实施例， 其中：
图 1显示正常人血清中直接检测到的部分微小核糖核酸的 RT-PCR结 果。
图 2显示提取正常人血清中 RNA并检测其中微小核糖核酸的 RT-PCR 结果。
图 1和图 2中 U6是分子量为 lOObp的 snRNA, 作为鼓小核糖核酸实 验的内参照分子， 其余的 12个代号分别代表血细胞特异性的微小核糖核 酸 miR-181a ( 181a ) 、 miR-181b ( 181b ) 、 miR-223 ( 223 ) 、 miR-142-3p ( 142-3p ) 、 miR-142-5p ( 142-5p ) 、 miR-150 ( 150 ) , 来自心肌及骨酪 肌的微小核糖核酸 miR-1 ( 1 ) 、 miR-133a ( 133a ) 、 miR-206 ( 206 ) ， 来 自脑组织的微小核糖核酸 miR-9 ( 9 ) 、 miR-124a ( 124a ) , 以及来自肝脏 的 ί 小核糖核酸 miR-122a ( 122a ) 。
图 3分别显示小鼠、 大鼠、 胎牛、 小牛和马血清中直接检测到的部分 微小核糖核酸 RT-PCR结果。
图 4显示患有所示疾病的病人血清中部分微小核糖核酸相对于正常人 血清中微小核糖核酸的变化量。
图 5显示大分子核糖核酸和微小核糖核酸在血细胞与血清中的比率。 图 6显示大分子核糖核酸及微小核糖核酸的酶切效果。 实施发明的最佳方式
实施例 1 血清 /血浆中微小核糖核酸的 RT-PCR实验
使用 RT-PCR技术发现并证明人和动物血清 /血浆中稳定存在各种微 小核糖核酸， 而且其表达量相当丰富。 具体步骤为：
( 1 ) 收集小鼠、 大鼠、 正常人及某些病人的血清 /血浆；
( 2 )制备 cDNA样品。 该操作有两种方案， 一种方案为将 ΙΟμΙ血清 /血浆直接进行逆转录反应 ,另一种为使用 Trizol试剂（Invitrogen公司）先提 取血清 /jk浆总 RNA ( 10mi血清/ 常能富集约 10μβ左右^ RNA )一， 然后通过 RNA逆转录反应得到 cDNA。逆转录的反应体系包括 4μ1 5xAMV buffer ^ 2μ1 lOmM each dNTP mixture ( Takara公司）、 0.5μ1 RNase Inhibitor ( Takara公司） 、 2μ1 AMV ( Takara公司） 以及 1.5μ1基因特异性反向引 物混和物。 反应步骤为 16°C孵育 15分钟， 42°C反应 1小时， 85°C孵育 5 分钟；
( 3 )PCR及电泳观察。将 cDNA按 1/50稀释，取 Ιμΐ稀释后的 cDNA, 力口入 0.3 l Taq酶（Takara公司 ) , 0.2μ1 ΙΟμΜ正向引物, 0.2μ1 ΙΟμΜ通 用反向引物， 1.2μ1 25mM MgCl2 , 1 ·6μ1 2.5mM each dNTP mixture ( Takara 公司） , 2μ1 lOxPCR buffer, 13.5μ1Η20, 20μ1体系进行 PCR。 PCR的反 应条件是： 95 °C、 5分钟进行 1个循环→95 °C、 15秒， 60°C、 1分钟进行 40个循环。 PCR产物取 ΙΟμΙ进行 3%琼脂糖凝胶电泳， ΕΒ染色后在紫外 灯下观察。
具体实验结果见图 1。 图 1是以正常人血清为研究对象， 将血清直接 进行 RT-PCR的实验结果。 选用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸进行 PCR反应， 图 1显示其中的 12种^:小核糖核酸， 它们分别是血细胞特异 性的微小核糖核酸 miR-181a、 miR-181b、 miR-223、 miR-142-3p、 miR-142-5p , miR-150 , 来自心肌及骨骼肌的微小核糖核酸 miR-1、 miR-133a、 miR-206, 来自脑组织的微小核糖核酸 miR-9、 miR-124a, 以及 来自肝脏的微小核糖核酸 miR-122a。从结果可以看出上述四种组织来源的 微小核糖核酸在血液中都能检测到， 并非全部五百多个成熟体微小核糖核 酸在血清 /血浆中都有高丰度表达，有些微小核糖核酸是很微量的， 甚至不 能正常检测到。
为了进一步验证血清 /血浆中稳定存在这些微小核糖核酸，先提取正常 人血清中的 R A,然后选用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸进行 PCR 实验，结果如图 2所示。 图 2的结果与图 1的结果很吻合， PCR产物单一， 表明这两种实验方法都能检测到人血清 /血浆微小核糖核酸的表达和丰度， 证明在人血清 /血浆中稳定地存在多种组织来源微小核糖核酸。此外， 用同 样的方法检测了小鼠、 大鼠、 胎牛、 小牛和马血清中五百多个微小核糖核 酸的表达和丰度， 同样发现不同組织来源的微小核糖核酸在小鼠、 大鼠、 胎牛、 小牛和马血清中有稳定表达（见图 3 ) 。 实施例 2 血清 /血浆中微小核糖核酸的 real-time PCR实验 为了研究各种疾病， 包括各种肿瘤; 种 慢性传染病， 如病毒性疾 病： 病毒性流感、 病毒性肝炎、 艾滋病、 SARS等， 细菌性疾病： 结核、 细菌性肺炎等， 以及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病； 其它急慢 性疾病， 如呼吸系统疾病， 免疫系统疾病， 血液与造血系统疾病， 例如心 脑血管疾病的循环系统疾病， 内分泌系统代谢性疾病， 消化系统疾病， 神 经系统疾病， 泌尿系统疾病， 生殖系统疾病和运动系统疾病过程中血清 / 血浆微小核糖核酸的特异变化，进行了血清 /血浆微小核糖核酸的定量 PCR 实验。定量 PCR实睑原理及实验步骤同 RT-PCR—样，唯一不同是在 PCR 的时候加入了荧光染料 EVA GREEN。 仪器使用的是 ABI Prism 7300荧光 定量 PCR仪， 反应条件为 95°C、 5分钟进行 1个循环→95 °C、 15秒， 60 °C、 1分钟进行 40个循环。 数据处理方法为 ΔΔσΓ 法， CT设为反应达到 域值时的循环数， 则每个微小核糖核酸相对于标准内参的表达量可以用方 程 2- A CT表示， 其中 A CT = CT样品 -CT 内参。 将病人血清 /血浆样本与正常 人血清 /血浆样本直接进行逆转录反应， 通过定量 PCR反应比较其中所含 微小核糖核酸的量。
选取再生障碍性贫血、 乳腺癌、 骨肉瘤、 中枢神经系统淋巴瘤、 糖尿 病病人血清样品， 同时用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸进行 PCR 实验。 图 4是上述提及的血细胞特异性 miR-181a、 miR-181b、 miR-223, miR-142-3p、 miR-142-5p、 miR-150, 心肌及骨骼肌的微小核糖核酸 miR-1、 miR-133a、 miR-206, 来自脑組织的微小核糖核酸 miR-9、 miR-124a, 以及 来自肝脏的啟小核糖核酸 miR-122a在正常人和病人血清中进行定量 PCR 的实验结果。 再生障碍性贫血、 乳腺癌、 骨肉瘤、 中枢神经系统淋巴瘤、 糖尿病病人血清中微小核糖核酸的量相对于正常人的量的比值分别有上 调和下调， 而且同一组织来源微小核糖核酸在不同疾病中变化程度不同， 表明血清 /血浆微小核糖核酸在不同疾病中有特异性变化，它们可以作为一 类新的疾病诊断的标志物。 实施例 3 血清 /血浆微小核糖核酸作为疾病标志物的优越性
通过检测血清及血细胞中微小核糖核酸和大分子核糖核酸的量， 发现 血清中微小核糖核酸的含量是很丰富的。 见图 5 , 以分子量为 lOObp的 U6 分子、 分子量分别为 18S和 28S的核糖体核糖核酸分子为代表， 血细胞中 大分子核糖核酸的量至少是血清中的数十倍， 但除了血细胞特异性的微小 核糖核酸外， 血清中微小核糖核酸的量和血细胞中的量是持平的。 所以， —― 血清 /血浆中会特异性富粜小分子核籍核酸特别是微小核糖 ft i_。 ^ ' 还发现敫小核糖核酸能一定程度上对抗内切核酸酶的作用， 这可能是 血清 /血浆中微小核糖核酸能稳定存在的一个原因。如图 6所示，将培养细 胞系中提取的总核糖核酸用内切核酸酶 R ase A处理， 然后检测大分子核 糖核酸和微小核糖核酸的剩余量， 发现微小核糖核酸能一定程度上对抗内 切核酸酶的降解作用， 而大分子核糖核酸基本上被完全切断了， 所以血清 /血浆中微小核糖核酸可以稳定存在。
基于血清 /血浆中微小核糖核酸含量丰富并且稳定这两个性质，它可以 很好地应用于临床检验。 实施例 4 用于诊断疾病的血清 /血浆微小核糖核酸芯片的制作 为了验证通过定量 PCR筛选出的与疾病相关的一类血清 /血浆微小核 糖核酸探针的可靠性， 制作了血清 /血浆微小核糖核酸的生物芯片。该芯片 包含了人血清 /血浆中能正常检测到的全部微小核糖核酸的探针，构成了一 个探针库， 见表 1。
当具体应用到某种疾病诊断或药效筛查时， 此探针库中的某些探针构 成一个探针集， 就可以定量检测这种具体情况中微小核糖核酸的变化。 比 如， 在诊断结肠癌时， 使用的是与编号为 17-5p、 21、 103、 106a, 107、 126*、 143、 145、 150、 155、 210的微小核糖核酸相互作用的探针的集合。 又如， 在诊断心肌肥厚及慢性心衰时， 使用的是与编号为 21、 23a、 23b、 24、 27a、 27b, 125b, 195、 199a、 214、 217、 133a 的微小核糖核酸相互 作用的探针的集合。 此外， 芯片能高通量地筛选血清 /血浆中稳定变化的微 小核糖核酸探针，同时通过血清 /血浆中微小核糖核酸的整体变化预测和诊 断疾病。
首先通过测序的方法或定量 PCR方法确定血清 /血浆中有一个以上拷 贝的微小核糖核酸， 然后合成这些微小核糖核酸的反向互补探针， 再把这 些探针用芯片点样仪 SmartArray TM点制在一张 75 25 mm经过化学修饰 的载玻片上。 点制在芯片上的样品还包括作为内标的 U6、 tR A, 人工制 备的 30个碱基长度的外标， 阳性对照 Hex等。 整个点阵分成 4个亚阵， 每个亚阵有 23行， 21列， 点间距为 185μιη, 点的直径约为 130μπι, 每条 探针重复三次。
芯片操作流程为： （1 )提取血清 /血浆中总 RNA, 甲醛变性胶电泳检 测总 RNA的质量； （2 )微小核糖核酸的分离： 取 50-100μ§总 RNA用 Ambion's miRNA Isolation Kit ( Cat #. 1560 Γ务离微小核糖核酸; （ 3 )徵 小核糖核酸样品的荧光标记：利用 T4 RNA连接酶标记方法进行荧光标记， 然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交； （4 )杂交与清洗： 将 RNA 溶于 16 L 杂交液中 （ 15%曱酰胺； 0.2% SDS; 3xSSC; 50 x Denhardt's solution ) , 于 42°C杂交过夜。 杂交结束后， 先在 42°C左右含 0.2% SDS, 2xSSC的液体中洗 4分钟， 而后在 0.2xSSC液体中室温洗 4分钟， 玻片甩 干后即可用于扫描； （ 5 ) 芯片扫描： 芯片用 LuxScan 10K/A双通道激光 扫描仪进行扫描； （6 )数据提取及分析： 采用 LuxScan3.0图像分析软件 对芯片图像进行分析， 把图像信号转化为数字信号， 最后用 SAM分析挑 选差异表达基因。
将定量 PCR技术和生物芯片技术双重猃证的在疾病及正常生理状态 下差异表达程度大的一类血清 /血浆微小核糖核酸探针， 用于制备生物芯 片， 方法同上。 此芯片与传统芯片相比， 制作工艺和操作流程没有很大改 进， 但是此芯片简化了探针库， 由此将大大减少芯片的制作成本和生产时 间， 易于制备。 同时也增加了芯片的针对性和实用性。将此芯片投入实践， 仅仅需要病人的血清 /血浆而不需要任何其它组织就可以在早期发现疾病， 帮助指导诊断和治疗。 实施例 5 用于疾病诊断与预测的微小核糖核酸试剂盒的制作
用于所有疾病， 包括各种肿瘤； 各种急慢性传染病， 如病毒性疾病： 病毒性流感、 病毒性肝炎、 艾滋病、 SARS等， 细菌性疾病： 结核、 细菌 性肺炎等， 以及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病； 其它急慢性疾 病， 如呼吸系统疾病， 免疫系统疾病， 血液与造血系统疾病， 例如心脑血 管疾病的循环系统疾病， 内分泌系统代谢性疾病， 消化系统疾病， 神经系 统疾病， 泌尿系统疾病， 生殖系统疾病和运动系统疾病的诊断、 疾病并发 症的发生和恶性疾病复发的预测， 疗效评价， 以及药物活性成分的筛选、 药效评价以及司法鉴定和违禁药品检测等方面的微小核糖核酸试剂盒的 制作工艺和操作流程是基于定量和半定量 PCR技术和生物芯片技术。
首先通过测序的方法或 PCR方法确定正常血清 /血浆中有一个以上拷 贝的微小核糖核酸。然后通过定量 PCR技术和生物芯片技术筛选在疾病及 正常生理状态下表达量和差异程度大的一类血清 /血浆微小核糖核酸， 作 为预测是否发生癌变或其它疾病以及诊断病变程度的指标。 最后筛选出的 对应每种疾病的血清 /血浆微小核糖核酸的数量控制在十几至几十条， 这 是在芯片探针库的基础上做出的最优化的精筒。 此试剂盒包括一批血清 / 血浆微小核糖核酸引物， Taq酶、 dNTP等试剂。 此试剂盒的价值在于只 需要血清 /血浆而不需要其它组织样品， 通过最精简的探针库检测微小核 糖核酸的变化趋势， 再通过该变化趋势预测疾病发生的可能性或诊断疾病 的病理阶段。因此将此试剂盒投入实践，可以增加在早期发现病变的可能， 帮助指导诊断和治疗。

Claims

权 利 要 ^
1. 一种用于评价受试者的生理和 /或病理状态的微小核糖核酸的组 合， 其特征在于， 所述组合包含受试者血清 /血浆中稳定存在且可检测的全 部微小核糖核酸。
2. 根据权利要求 1 所述的组合， 其特征在于， 所述受试者血清 /血浆 中稳定存在且可检测的全部微小核糖核酸为人血清 /血浆中的全部成熟体 微小核糖核酸。
3. 根据权利要求 1或 2所述的组合， 其特征在于， 所述受试者血清 / 血浆中稳定存在且可检测的全部微小核糖核酸为 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 let-7e、 let-7f、 let-7g、 let-7i、 miR-l、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-105、 miR-106a、 miR-106b、 miR-107、 miR-10a、 miR-10b、 miR-122a、 miR-124a、 miR-125a、 miR-125b、 miR-126, miR-126*、 miR-127、 miR-128a、 miR-128b、 miR-129、 miR-130a、 miR-130b、 miR-132、 miR-133a、 miR-133b、 miR-134、 miR-135a、 miR-135b、 miR-136、 miR-137、 miR-138、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR- 142-3p、 miR-142-5p、 miR-143 , miR-144、 miR-145、 miR-146a、 miR- 146b, miR-147、 miR-148a、 miR- 148b, miR- 149, miR- 150, miR-151、 miR- 152、 miR- 153、 miR- 154、 miR- 154*、 miR- 155、 miR-15a、 miR- 15b, miR-16、 miR-17-3p、 miR-17-5p、 miR-181a、 miR-181b、 miR-181c、 miR-181d、 miR-182、 miR-182*、 miR- 183 , miR-184、 miR-185 miR-186、 miR- 187、 miR- 188、 miR- 189、 miR- 18a, miR- 18 a* , miR-18b、 miR- 190、 miR-191、 miR-191*、 miR-192、 miR- 193 a, miR- 193b ^ miR- 194, miR- 195, miR- 196a, miR- 196b, miR-197、 miR-198、 miR- 199a, miR- 199a* ^ miR- 199b, miR- 19a, miR-19b、 miR-200a、 miR-200a*、 miR-200b、 miR-200c、 miR-202, miR-202*、 miR-203、 miR-204, miR-205、 miR-206、 miR-208、 miR-20a、 miR-20b、 miR-21、 miR-210、 miR-211、 miR-212、 miR-213、 miR-214、 miR-215、 miR-216, miR-217 , mi -218 miR-219 , miR-22、 miR-220、 miR-221 , miR-222, miR-223、 miR-224、 miR-23a、 miR-23b、 miR-24、 miR-25 > miR-26a、 miR-26b、 miR-27a、 miR-27b、 miR-28、 miR-296、 miR-299-3p、 miR-299-5p、 miR-29a、 miR-29b、 miR-29c、 miR-301、 miR-302a> miR-302a*、 miR-302b、 miR-302b*、 miR-302c、 miR-302c*、 miR-302d、 miR-30a-3p、 miR-30a-5p、 miR-30b、 miR-30c、 miR-30d miR-30e-3p、 miR-30e-5p、 miR-31、 miR-32、 miR-320、 miR-323 , miR-324-3p, miR-324-5p、 miR-325、 miR-326、 miR-328 > miR-329 miR-33 , miR-330, miR-33 miR-335、 miR-337, miR-338, miR-339、 miR-33b、 miR-340、 miR-342、 miR-345 miR-346, miR-34a、 miR-34b、 miR-34c、 miR-361、 miR-362, miR-363 , miR-363* miR-365, miR-367, miR-368 miR-369-3p miR-369-5p、 miR-370、 miR-371、 miR-372、 miR-373、 miR-373*、 miR-374, miR-375、 miR-376a、 miR-376a*、 miR-376b、 miR-377、 miR-378、 miR-379、 miR-380-3p、 miR-380-5p、 mi -381、 miR-382、 miR-383、 miR-384、 miR-409-3p、 miR-409-5p> miR-410、 miR-411、 miR-412、 miR-421 , miR-422a、 miR-422b、 miR-423、 miR-424、 miR-425、 miR-425-5p、 miR-429、 miR-431、 miR-432 miR-432*、 miR-433、 miR-448> miR-449、 miR-450、 miR-451、 miR-452、 miR-452*、 miR-453、 miR-455、 miR-483、 miR-484、 miR-485-3p、 miR-485-5p、 miR-486、 miR-487a、 miR-487b、 miR-488, miR-489、 miR-490、 miR-491、 miR-492、 miR-493、 miR-493-3p、 miR-494、 miR-495、 miR-496、 miR-497、 miR-498、 miR-499、 miR-500、 miR-501、 miR-502, miR-503、 miR-504、 miR-505、 miR-506、 miR-507、 miR-508、 miR-509、 miR-510、 miR-511、 miR-512-3p、 miR-512-5p、 miR-513、 mi -514, miR-515-3p、 miR-515-5p、 miR-516-3p、 miR-516-5p、 miR-517*、 miR-517a> miR-517b、 miR-517c、 miR-518a、 miR-518a-2*、 miR-518b、 miR-518c、 miR-518c*、 miR-518d、 miR-518e、 miR-518f、 ιηϋ -518 、 miR-519a、 miR-519b、 miR-519c、 miR-519d、 miR-519e、 miR-519e*、 miR-520a、 miR-520a*、 miR-520b、 miR-520c、 miR-520d、 miR-520d*、 miR-520e、 miR-520f、 miR-520g > miR-520h、 miR-521、 miR-522、 miR-523 , miR-524、 miR-524*、 miR-525、 miR-525*、 miR-526a、 miR-526b、 miR-526b*、 miR-526c、 miR-527, miR-532, miR-542-3p、 miR-542-5p、 miR-544、 miR-545、 miR-548a、 miR-548b、 miR-548c、 miR-548d miR-549、 miR-550, miR-551a、 miR-552, miR-553, miR-554, miR-555 miR-556, miR-557、 miR-558、 miR-559、 miR-560、 miR-561、 miR-562 miR-563、 miR-564, miR-565、 miR-566、 miR-567、 miR-568、 miR-569、 miR-570、 miR-571、 miR-572、 miR-573 , miR-574、 miR-575, miR-576、 miR-577、 miR-578, miR-579、 miR-580、 miR-58K miR-582, miR-583 miR-584、 miR-585、 miR-586、 miR-587、 miR-588、 miR-589、 miR-590、 miR-591、 miR-592、 miR-593 , miR-594、 miR-595、 miR-596、 miR-597、 miR-598、 miR-599、 miR-600、 miR-601、 miR-602, miR-603、 miR-604, miR-605、 miR-606、 miR-607、 miR-608、 miR-609、 miR-610、 miR-611、 miR-612、 miR-613、 miR-614、 miR-615、 miR-616、 miR-617、 miR-618、 miR-619、 miR-620、 miR-621、 miR-622、 miR-623 > miR-624、 miR-625、 miR-626、 miR-627、 miR-628、 miR-629、 miR-630、 miR-631 miR-632、 miR-633、 miR-634、 miR-635、 miR-636、 miR-637, miR-638, miR-639、 miR-640、 miR-641 > miR-642、 miR-643、 miR-644, miR-645、 miR-646、 miR-647、 miR-648、 miR-649、 miR-650、 miR-651、 miR-652、 miR-653、 miR-654、 miR-655、 miR-656, miR-657、 miR-658、 miR-659, miR-660、 miR-661 , miR-662、 miR-663、 miR-7、 miR-9、 miR-9*、 miR-92、 miR-93、 miR-95、 miR-96、 miR-98、 miR-99a和 miR-99b。
4. 根据权利要求 1至 3中任一项所述的组合， 其特征在于， 所述评价 受试者的生理和 /或病理状态为测定受试者给予待测物后的生理和 /或病理 状态。
5. 根据权利要求 4所述的组合， 其特征在于， 所述组合用于筛选待测 物的预防和 /或治疗疾病的活性。
6. 根据权利要求 1至 3中任一项所述的组合， 其特征在于， 所述评价 受试者的生理和 /或病理状态为诊断和 /或鉴别诊断受试者的疾病。
7. 根据权利要求 1至 3中任一项所述的组合， 其特征在于， 所述评价 受试者的生理和 /或病理状态为评价对受试者的疾病进行治疗的有效性。
8. 根据权利要求 1至 3中任一项所述的组合， 其特征在于， 所述评价 受试者的生理和 /或病理状态为对受试者发生疾病进行预测。
9. 根据权利要求 8所述的组合， 其特征在于， 所述发生疾病为疾病并 发症的发生和 /或恶性疾病的复发。
10. 根据权利要求 5至 9中任一项所述的组合， 其特征在于， 所述疾 病包括各种肿瘤； 各种急慢性传染病， 例如病毒性流感、 病毒性肝炎、 艾 滋病、 SARS 的病毒性疾病， 例如结核、 细菌性肺炎的细菌性疾病， 以及 其它各种病原微生物导致的急慢性传染病； 其它急慢性疾病， 例如呼吸系 统疾病， 免疫系统疾病， 血液与造血系统疾病， 如心脑血管疾病的循环系 统疾病， 内分泌系统代谢性疾病， 消化系统疾病， 神经系统疾病， 泌尿系 统疾病， 生殖系统疾病和运动系统疾病。
11. 根据权利要求 1至 3中任一项所述的组合， 其特征在于， 所述组 合用于检测受试者服用违禁药品的情况。
12.根据权利要求 1至 11中任一项所述的组合， 其特征在于， 所述受 试者血清 /血浆来源于受试者的活体、 组织、 器官和 /或尸体。
13. 一种用于评价受试者的生理和 /或病理状态的方法， 其特征在于， 所述方法包括测定受试者血清 /血浆中稳定存在且可检测的全部微, F核糖 核酸。
14. 根据权利要求 13 所述的方法， 其特征在于， 所述受试者血清 /血 浆中稳定存在且可检测的全部微小核糖核酸为人血清 /血浆中的全部成熟 体微小核糖核酸。
15. 根据权利要求 13或 14所述的方法， 其特征在于， 所述受试者血 清 /血浆中稳定存在且可检测的全部微小核糖核酸为 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 let-7e、 let-7f、 let-7g、 let-7i、 miR-l、 miR-100, miR-101、 miR-103、 miR-105、 miR-106a、 miR-106b、 miR-107、 miR-lOa, miR-10b、 miR-122a、 miR-124a、 miR-125a、 miR-125b、 miR-126, miR-126*、 miR-127、 miR-128a、 miR-128b、 miR-129, miR-130a、 miR-130b、 miR-132、 miR-133a、 miR-133b、 miR-134> miR-135a、 miR-135b、 miR-136、 miR-137、 miR-138、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-142-3p、 miR-142-5p、 miR-143、 miR-144, miR-145、 miR-146a、 miR-146b、 miR-147、 miR-148a、 miR-148b、 miR-149、 miR-150、 miR-151、 miR-152、 miR-153、 miR-154、 miR-154*、 miR-155> miR-15a、 miR-15b、 miR-16、 miR-17-3p、 miR-17-5p、 miR-181a、 miR-181b、 miR-181c、 miR-181d、 miR-182、 miR-182*、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186> miR-187、 miR-188、 miR-189、 miR-18a、 miR-18a*、 miR-18b、 miR-190、 miR-191、 miR-191*、 miR-192、 miR-193a、 miR-193b、 miR-194、 miR-195、 miR-196a、 miR-196b、 miR-197、 miR-198、 miR-199a、 miR- 199a*、 miR- 199b、 miR-19a、 miR-19b、 miR-200a、 miR-200a*、 miR-200b、 miR-200c、 miR-202、 miR-202*、 miR-203、 miR-204, miR-205、 miR-206、 miR-208 miR-20a、 miR-20b、 miR-21、 miR-210、 miR-211、 miR-212、 miR-213、 miR-214、 miR-215、 miR-216、 miR-217、 miR-218 , miR-219、 miR-22、 miR-220、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-224, miR-23a、 miR-23b、 miR-24、 miR-25 > miR-26a、 miR-26b、 miR-27a、 miR-27b、 miR-28、 miR-296、 miR-299-3p、 miR-299-5p、 miR-29a、 miR-29b、 miR-29c、 miR-301、 miR-302a、 miR-302a*、 miR-302b、 miR-302b*、 miR-302c、 miR-302c*、 miR-302d> miR-30a-3p、 miR-30a-5p、 miR-30b、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e-3p、 miR-30e-5p、 miR-31、 miR-32、 miR-320、 miR-323、 miR-324-3p、 miR-324-5p、 miR-325 , miR-326, miR-328、 miR-329、 miR-33 , miR-330、 miR-331、 miR-335, miR-337、 miR-338、 miR-339、 miR-33b、 miR-340、 miR-342、 miR-345 , miR-346、 miR-34a、 miR-34b、 miR-34c、 miR-361 miR-362, miR-363、 miR-363*、 miR-365、 miR-367、 miR-368、 miR-369-3p、 miR-369-5p miR-370、 miR-371、 miR-372、 miR-373、 miR-373*、 miR-374、 miR-375 miR-376a、 miR-376a*、 miR-376b miR-377、 miR-378、 miR-379、 miR-380-3p、 miR-380-5p、 miR-381、 miR-382、 miR-383、 miR-384、 miR-409-3p、 miR-409-5p、 miR-410、 miR-411 miR-412, miR-421、 miR-422a、 miR-422b miR-423、 miR-424、 miR-425、 miR-425-5p、 miR-429、 miR-431、 miR-432 miR-432*、 miR-433 > miR-448、 miR-449、 miR-450、 miR-451、 miR-452 miR-452*、 miR-453、 miR-455、 miR-483、 miR-484、 miR-485-3p、 miR-485-5p、 miR-486、 miR-487a、 miR-487b、 miR-488、 miR-489、 miR-490、 miR-491 , miR-492、 miR-493. miR-493-3p、 miR-494、 miR-495、 miR-496、 miR-497、 miR-498, miR-499、 miR-500、 miR-501、 miR-502、 miR-503、 miR-504、 miR-505, miR-506、 miR-507、 miR-508、 miR-509、 miR-510、 miR-511、 miR-512-3p、 miR-512-5p、 miR-513、 miR-514、 miR-515-3p、 miR-515-5p、 miR-516-3p> miR-516-5p、 miR-517*、 miR-517a、 miR-517b、 miR-517c、 miR-518a、 miR-518a-2*、 miR-518b、 miR-518c、 miR-518c*、 miR-518d、 miR-518e、 miR-518f、 miR-S lS 5 miR-519a、 miR-519b、 miR-519c、 miR-519d、 miR-519e、 miR-519e*、 miR-520a、 miR-520a*、 miR-520b、 miR-520c、 miR-520d、 miR-520d*、 miR-520e、 miR-520f、 miR-520g、 miR-520h、 miR-521、 miR-522, miR-523、 miR-524、 miR-524*、 miR-525、 miR-525*、 miR-526a、 miR-526b、 miR-526b*、 miR-526c、 miR-527、 miR-532、 miR-542-3p、 miR-542-5p、 miR-544、 miR-545、 miR-548a、 miR-548b、 miR-548c、 miR-548d、 miR-549、 miR-550、 miR-551a、 miR-552、 miR-553、 miR-554、 miR-555、 miR-556、 miR-557, miR-558、 miR-559、 miR-560、 miR-561、 miR-562, miR-563、 miR-564、 miR-565、 miR-566、 miR-567、 miR-568、 miR-569> miR-570、 miR-571、 miR-572、 miR-573 , miR-574、 miR-575、 miR-576, miR-577、 miR-578、 miR-579、 miR-580、 miR-581、 miR-582、 miR-583、 mi -584, miR-585 , miR-586、 miR-587、 miR-588、 miR-589、 miR-590、 miR-591、 miR-592 miR-593、 miR-594、 miR-595、 miR-596、 miR-597、 miR-598、 miR-599、 miR-600, miR-601、 miR-602、 miR-603、 miR-604、 miR-605、 miR-606, miR-607, miR-608、 miR-609、 miR-610、 miR-611、 mi -612, miR-613、 miR-614、 miR-615、 miR-616、 miR-617、 miR-618、 miR-619、 miR-620、 miR-621、 miR-622, miR-623、 miR-624、 miR-625、 miR-626、 miR-627、 miR-628、 miR-629、 miR-630、 miR-631 miR-632 , miR-633 , miR-634、 miR-635、 miR-636、 miR-637、 miR-638、 miR-639 ^ miR-640、 miR-641、 miR-642, miR-643、 miR-644、 miR-645、 miR-646、 miR-647、 miR-648、 miR-649、 miR-650. miR-651、 miR-652、 miR-653、 miR-654、 miR-655、 miR-650、 miR-657、 miR-658、 miR-659、 miR-660、 miR-661、 miR-662、 miR-663、 miR-7、 miR-9、 miR-9*、 miR-92、 miR-93、 miR-95、 miR-96、 miR-98、 miR-99a和 miR-99b。
16. 根据权利要求 13至 15中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述 评价受试者的生理和 /或病理状态为测定受试者给予待测物后的生理和 /或 病理^ 态。
17.根据权利要求 16所述的方法， 其特征在于， 所述方法用于筛选待 测物的预防和 /或治疗疾病的活性。
18. 根据权利要求 13至 15中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述 评价受试者的生理和 /或病理状态为诊断和 /或鉴别诊断受试者的疾病。
19. 根据权利要求 13至 15中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述 评价受试者的生理和 /或病理状态为评价对受试者的疾病进行治疗的有效 性。
20. 根据权利要求 13至 15中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述 评价受试者的生理和 /或病理状态为对受试者发生疾病进行预测。
21. 根据权利要求 20所述的方法， 其特征在于， 所述发生疾病为疾病 并发症的发生和 /或恶性疾病的复发。
22. 根据权利要求 17至 21中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述 疾病包括各种肿瘤； 各种急慢性传染病， 例如病毒性流感、 病毒性肝炎、 艾滋病、 SARS 的病毒性疾病， 例如结核、 细菌性肺炎的细菌性疾病， 以 及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病； 其它急慢性疾病， 例如呼吸 系统疾病， 免疫系统疾病， 血液与造血系统疾病， 如心脑血管疾病的循环 系统疾病， 内分泌系统代谢性疾病， 消化系统疾病， 神经系统疾病， 泌尿 系统疾病， 生殖系统疾病和运动系统疾病。
23. 根据权利要求 13至 15中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述 方法用于检测受试者服用违禁药品的情况。
24. 根据权利要求 13至 23中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述 测定受试者的血清 /血浆中稳定存在且可检测的全部微小核糖核酸的方法 选自： RT-PCR方法、 Real-time PCR方法、 Northern blotting方法、 RNase protection assay、 Solexa sequencing technology以及生物芯片方法中的一种 或 L种。
25. 根据权利要求 24所述的方法， 其特征在于， 所述方法为 RT-PCR 方法且包括以下步骤：
( 1 )提取受试者的血清 /血浆总 RNA, 通过 RNA 逆转录反应得到 cDNA样品； 或者收集受试者的血清 /血浆样本， 以血清 /血浆作为緩冲液 进行逆转录反应来制备 cDNA样品；
( 2 )用微小核糖核酸设计引物进行 PCR反应；
( 3 )进行 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
( 4 ) EB染色后在紫外灯下观察结果。
26. 根据权利要求 24所述的方法，其特征在于，所述方法为 Real-time PCR方法且包括以下步骤：
( 1 )提取受试者的血清 /血浆总 RNA, 通过 R A 逆转录反应得到 cDNA样品； 或者收集受试者的血清 /血浆样本， 以血清 /血浆作为緩冲液 进行逆转录反应来制备 cDNA样品；
( 2 )用微小核糖核酸设计引物；
( 3 )加入荧光探针进行 PCR反应；
( 4 )检测并比较血清 /血浆样本相对于正常血清 /血浆中微小核糖核酸 的量的变化。
27. 根据权利要求 13至 26中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述 血清 /血浆来源于受试者活体、 组织、 器官和 /或尸体。
28. 一种用于评价受试者的生理和 /或病理状态的试剂盒， 其特征在 于，所述试剂盒包含测定受试者血清 /血浆中稳定存在且可检测的全部微小 核糖核酸的工具。
29. 根据权利要求 28所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含人 血清 /血浆中的全部成熟体微小核糖核酸的引物。
30. 根据权利要求 28或 29所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒 包含 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 let-7e、 let-7f、 let-7g、 let-7i、 miR-l、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-105、 miR-106a、 miR-106b、 miR-107、 miR-10a、 miR-10b、 miR-122a、 miR-124a、 miR-125a、 miR-125b、 miR-126、 miR-126*、 miR-127、 miR-128a、 miR-128b、 miR-129、 miR-130a、 miR-130b、 miR-132、 miR-133a、 miR-133b、 miR-134、 miR-135a、 miR-135b、 miR-136、 miR-137、 miR-138、 miR-139, miR-140、 miR-14K miR-142-3p> miR-142-5p、 miR-143 , miR-144、 miR-145、 miR-146a、 miR-146b、 miR-147、 miR-148a、 miR-148b miR-149、 miR-150、 miR-151、 miR-152、 miR-153、 miR-154、 miR-154* miR-155、 miR-15a、 miR-15b、 miR-16、 miR-17-3p、 miR-17-5p> miR-181a miR-181b、 miR-181c、 miR-181d、 miR-182、 miR-182*、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-187、 miR-188、 miR-189、 miR-18a、 miR-18a* miR-18b、 miR-190、 miR-191、 miR-191*、 miR-192、 miR-193a、 miR-193b miR-194、 miR-195 miR-196a、 miR-196b、 miR-197、 miR-198、 miR-199a miR-199a*、 miR-199b、 miR-19a、 miR-19b、 miR-200a、 miR-200a*、 miR-200b miR-200c、 miR-202, miR-202*、 miR-203、 miR-204, miR-205、 miR-206、 miR-208 > miR-20a、 miR-20b、 miR-21、 miR-210、 miR-211、 miR-212, miR-213、 miR-214 miR-215 , miR-216、 miR-217、 miR-218、 miR-219、 miR-22、 miR-220 , miR-221、 miR-222 , miR-223、 miR-224、 miR-23a、 miR-23b、 miR-24、 miR-25、 miR-26a、 miR-26b、 miR-27a、 miR-27b、 miR-28、 miR-296、 miR-299-3p、 miR-299-5p、 miR-29a、 miR-29b、 miR-29c、 miR-301、 miR-302a、 miR-302a*、 miR-302b miR-302b*、 miR-302c、 miR-302c*、 miR-302d、 miR-30a-3p、 miR-30a-5p、 miR-30b、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e-3p、 miR-30e-5p、 miR-31 > miR-32、 miR-320、 miR-323 > miR-324 3p、 miR-324-5p、 miR-325、 miR-326 ^ miR-328、 miR-329 > miR-33 , miR-330 miR-331、 miR-335、 miR-337、 miR-338、 miR-339, miR-33b、 miR-340 miR-342、 miR-345 , miR-346、 miR-34a ^ miR-34b, miR-34c ^ miR-361 miR-362、 miR-363、 miR-363*、 miR-365 miR-367、 miR-368、 miR-369 3p、 miR-369-5p, miR-370 , miR-37 K miR-372、 miR-373 , miR-373* miR-374 miR-375 ^ miR-376a、 miR-376a* . miR-376b ^ miR-377 ^ miR-378, miR-379 miR-380-3p、 miR-380-5p、 miR-381、 miR-382、 miR-383、 miR-384、 miR-409 3p、 miR-409-5p、 miR-410、 miR-411、 miR-412、 miR-421、 miR-422a miR-422b、 miR-423 , miR-424、 miR-425、 miR-425-5p、 miR-429、 miR-431 miR-432, miR-432*、 miR-433、 miR-448、 miR-449、 miR-450、 miR-451、 miR-452、 miR-452* . miR-453、 miR-455、 miR-483、 miR-484、 miR-485-3p、 miR-485-5p、 miR-486、 miR-487a、 miR-487b、 miR-488、 miR-489、 miR-490、 miR-491、 miR-492、 miR-493 , miR-493-3p、 miR-494、 miR-495、 miR-496、 miR-497、 miR-498、 miR-499、 miR-500、 miR-501、 miR-502、 miR-503、 miR-504、 miR-505 , miR-506、 miR-507、 miR-508、 miR-509、 miR-510、 miR-511、 miR-512-3p、 miR-512-5p、 miR-513、 miR-514、 miR-515-3p、 miR-515-5p、 miR-516-3p、 miR-516-5p、 miR-517*、 miR-517a、 miR-517b、 miR-517c、 miR-518a、 miR-518a-2*、 miR-518b、 miR-518c、 miR-518c*、 miR-518d、 miR-518e、 miR-518f、 miR-518P , miR-519a、 miR-519b、 miR-519c、 miR-519d、 miR-519e、 miR-519e*、 miR-520a、 miR-520a*、 miR-520b、 miR-520c、 miR-520d、 miR-520d*、 miR-520e、 miR-520f、 miR-520g、 miR-520h、 miR-521、 miR-522、 miR-523、 miR-524, miR-524*、 miR-525、 miR-525*、 miR-526a、 miR-526b、 miR-526b*、 miR-526c、 miR-527、 miR-532、 miR-542-3p、 miR-542-5p、 miR-544、 miR-545、 miR-548a、 miR-548b、 miR-548c、 miR-548d、 miR-549、 miR-550、 miR-551a、 miR-552、 miR-553 , miR-554、 miR-555、 miR-556、 miR-557、 miR-558、 miR-559、 miR-560, miR-561、 miR-562、 miR-563、 miR-564, miR-565、 miR-566, miR-567、 miR-568、 miR-569、 miR-570、 miR-571、 miR-572, miR-573、 miR-574、 miR-575、 miR-576、 miR-577、 miR-578 miR-579、 miR-580、 miR-581、 miR-582、 miR-583, miR-584、 miR-585、 miR-586、 miR-587、 miR-588、 miR-589、 miR-590、 miR-591、 miR-592、 miR-593、 miR-594、 miR-595、 miR-596、 miR-597、 miR-598、 miR-599, miR-600、 miR-601、 miR-602, miR-603、 miR-604、 miR-605、 miR-606 mi -607, miR-608、 miR-609、 miR-610、 miR-611、 miR-612、 miR-613 , miR-614、 miR-615、 miR-616, miR-617、 miR-618, miR-619、 miR-620、 miR-621、 miR-622, miR-623、 miR-624、 miR-625、 miR-626, miR-627, mi -628 miR-629、 miR-630、 miR-631、 miR-632、 miR-633、 miR - 634、 miR-635、 miR-636、 miR-637、 miR-638, miR-639、 miR-640、 miR-641、 miR-642、 miR-643 , miR-644、 miR-645、 miR-646、 miR-647、 miR-648、 miR-649、 miR-650、 miR-651、 miR-652, miR-653、 miR-654、 miR-655、 miR-656, miR-657、 miR-658, miR-659、 miR-660、 miR-661、 miR-662、 miR-663、 miR-7、 miR-9、 miR-9*、 miR-92、 miR-93、 miR-95、 miR-96、 miR-98、 miR-99a和 miR-99b 的引物。
31. 根据权利要求 28至 30中任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所 述评价受试者的生理和 /或病理状态为测定受试者给予待测物后的生理和 / 或病理状态。
32. 根据权利要求 31所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒用于筛 选待测物的预防和 /或治疗疾病的活性。
33. 根据权利要求 28至 30中任一项所迷的试剂盒， 其特征在于， 所 述评价受试者的生理和 /或病理状态为诊断和 /或鉴别诊断受试者的疾病。
34. 稂据权剎要求 28至 30 ¥—项所述 试剂盒, 其 手, 述评价受试者的生理和 /或病理状态为评价对受试者的疾病进行治疗的有 效性。
35. 根据权利要求 28至 30中任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所 述评价受试者的生理和 /或病理状态为对受试者发生疾病进行预测。
36. 根据权利要求 35所述的试剂盒， 其特征在于， 所述发生疾病为疾 病并发症的发生和 /或恶性疾病的复发。
37. 根据权利要求 32至 36中任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所 述疾病包括各种肿瘤； 各种急慢性传染病， 例如病毒性流感、病毒性肝炎、 艾滋病、 SARS 的病毒性疾病， 例如结核、 细菌性肺炎的细菌性疾病， 以 及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病； 其它急慢性疾病， 例如呼吸 系统疾病， 免疫系统疾病， 血液与造血系统疾病， 如心脑血管疾病的循环 系统疾病， 内分泌系统代谢性疾病， 消化系统疾病， 神经系统疾病， 泌尿 系统疾病， 生殖系统疾病和运动系统疾病。
38. 根据权利要求 28至 30中任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所 述试剂盒用于检测受试者服用违禁药品的情况。
39. 根据权利要求 28至 38中任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所 述受试者血清 /血浆来源于受试者的活体、 组织、 器官和 /或尸体。
40. —种用于评价受试者的生理和 /或病理状态的生物芯片， 其特征在 于，所述生物芯片包含测定受试者血清 /血浆中稳定存在且可检测的全部微 小核糖核酸的元件。
41. 根据权利要求 40所述的生物芯片， 其特征在于， 所述生物芯片包 含人血清 /血浆中的全部成熟体微小核糖核酸的探针。
42. 根据权利要求 40或 41所述的生物芯片， 其特征在于， 所述生物 芯片包含下列探针：
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
£9K 0/L00Z^D/lJd 6^6SS0/6003 ΟΛΧ
Figure imgf000045_0001
£9fC00/Z.00ZN3/X3d 6I6SS0/600I OAV
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000047_0001
6L6SS0/600Z O -9P-
Figure imgf000048_0001
C9^C00/.00ZN3/X3d 6.6SS0/6001 OAV
Figure imgf000049_0001
C9^C00/.00ZN3/X3d 6.6SS0/600Z OAV
Figure imgf000050_0001
£9 £00/L00ZSlD/lJd
6/.6£S0/600r OAV -6 -
Figure imgf000051_0001
C9l7C00/.00ZN3/X3d 6.6SS0/600Z OAV
Figure imgf000052_0001
£9l7C00/.00ZM3/X3d 6.6SS0/600Z OAV 一 \ς-
Figure imgf000053_0001
C9l7C00/.00iN3/X3d 6.6SS0/600Z O -Ζζ-
Figure imgf000054_0001
C9^C00/.00ZN3/X3d 6.6SS0/600Z OAV - ζζ-
Figure imgf000055_0001
£9 £00/L00Z 3/13d
6.6SS0/600Z O
43. 根据权利要求 40至 42中任一项所述的生物芯片， 其特征在于， 所述评价受试者的生理和 /或病理状态为测定受试者给予待测物后的生理 和 /或病理状态。
44. 根据权利要求 43所述的生物芯片， 其特征在于， 所述生物芯片用 于筛选待测物的预防和 /或治疗疾病的活性。
45. 根据权利要求 40至 42中任一项所述的生物芯片， 其特征在于， 所述评价受试者的生理和 /或病理状态为诊断和 /或鉴别诊断受试者的疾 病。
46. 根据权利要求 40至 42中任一项所述的生物芯片， 其特征在于， 所述评价受试者的生理和 /或病理状态为评价对受试者的疾病进行治疗的 有效性。
47. 根据权利要求 40至 42中任一项所述的生物芯片， 其特征在于， 所述评价受试者的生理和 /或病理状态为对受试者发生疾病进行预测。
48.根据权利要求 47所述的生物芯片， 其特征在于， 所述发生疾病为 疾病并发症的发生和 /或恶性疾病的复发。
49. 根据权利要求 44至 48中任一项所述的生物芯片 , 其特征在于， 所述疾病包括各种肿瘤； 各种急慢性传染病， 例如病毒性流感、 病毒性肝 炎、 艾滋病、 SARS的病毒性疾病， 例如结核、 细菌性肺炎的细菌性疾病， 以及其它各种病原 生物导致的急慢性传染病； 其它急慢性疾病， 例如呼 吸系统疾病， 免疫系统疾病， 血液与造血系统疾病， 如心脑血管疾病的循 环系统疾病， 内分泌系统代謝性疾病， 消化系统疾病， 神经系统疾病， 泌 尿系统疾病, 生殖系统疾病和运动系统疾病。
50. 根据权利要求 40至 42中任一项所述的生物芯片， 其特征在于， 所述生物芯片用于检测受试者服用违禁药品的情况。
51. 根据权利要求 40至 50中任一项所述的生物芯片 , 其特征在于， 所述受试者血清 /血浆来源于受试者的活体、 组织、 器官和 /或尸体。
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