CN102732619B - 一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用。杂交探针的碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。优选序列如SEQ ID NO:1，其中第3、6、15、20个碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。另一优选序列如SEQ ID NO:2，其中第3、8、13、21个碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。探针的5’和3’端修饰地高辛。本发明还提供了一种含有上述杂交探针的miRNA的原位杂交检测试剂盒。本发明的探针可以分别应用于制备肺癌细胞系或肺癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中和制备食管癌细胞系或食管癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中。本发明的试剂盒价格比较便宜，具有较好的特异性。

Description

一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用。

背景技术

原位杂交技术是根据核酸分子碱基互补原则，将标记的DNA或RNA探针与经过变性后的单链DNA片段或组织、细胞上特定的核苷酸序列，在适宜条件下结合形成专一的核酸杂交分子，再经过相应的检测手段，将待测核酸在染色体、组织或细胞上的位置显示出来。原位杂交技术是由Gall和Parue(1969)利用标记的rDNA探针与非洲爪蟾细胞核杂交首次获得成功。随着植物染色体制备技术的改进，Rayburn(1985)最早将非放射性检测系统应用到植物染色体原位杂交。目前，该技术在基因定位、多倍体起源、非整倍体鉴定以及系统进化和亲缘关系等方面均得到广泛应用。

现有的原位杂交探针包括DNA探针、寡聚核苷酸探针、RNA探针，这些探针需要信号级联放大反应才能观察结果，而且要有一定的Tm值才能保证实验的正确性和准确性。而且为了增强信号，目前多采取长的核酸序列做为探针的靶向序列或采用信号扩大系统。

miRNA是短的非编码的RNA，是致癌基因或抑癌基因的潜在调节子。RT-PCR、Northern印迹法以及生物芯片可以检测miRNA的表达量，但是并不能检测在单个细胞中miRNA的表达也不能在原位研究moRNA的表达，达到研究miRNA在癌细胞增殖或凋亡的机制的目的。为了验证miRNA表达的特异性以及它在癌细胞或癌组织中的定位，需要进行原位杂交。针对miRNA，因为miRNA的片段长度在18-22nt范围内，比较小，Tm值比较小不能满足原位杂交的需要，以上方法均不能很好的解决这些问题。目前，为了解决Tm值偏小，丹麦的一家公司生产检测miRNA的探针，他们的探针是将碱基五碳环上2’氧4’碳亚甲基连接，然后人工合成，该方法有效提高了Tm值，但是其售价昂贵。

发明内容

为克服上述技术缺陷，并降低经济成本，本发明的目的是提供一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用。

为实现上述目的，采用如下的技术方案：

本发明提供了一种miRNA的原位杂交探针，所述杂交探针的碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。修饰的探针是其大部分碱基进行2-F修饰，即在第2位碳原子上修饰一个氟原子，提高Tm值；用长18-22nt的序列和microRNA互补作为探针将修饰后的RNA合并到到探针中。其中，修饰位点如下式：

被氟原子修饰的RNA被合并到所涉及的miRNA探针中

优选的，所述杂交探针的序列为5’-3’：AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA，其中第3、6、15、20个碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。

优选的，所述杂交探针的序列为5’-3’：TCACGCGAGCCGAACGAACAAA，其中第3、8、13、21个碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。

上述杂交探针的5’和3’端修饰地高辛。

本发明还提供了一种含有上述的杂交探针的miRNA的原位杂交检测试剂盒。该还包括对照探针、预杂交液、封闭液和标记物。

对照探针的序列为5’-3’：AGTCTATGGTATTCAGTACTCA。

所述预杂交液20ml中含20×SSC 4ml、硫酸葡聚糖4g、去离子甲酰胺10ml、PolyA(10mg/ml)0.5ml、鱼精ssDNA(10mg/ml)0.5ml、tRNA(10mg/ml)0.5ml、1M二硫代苏糖醇(DTT)2ml、50×Denhardt’s 0.2ml；所述封闭液为：PBS中加入0.1%Triton-X100、3%正常山羊血清、3%BSA；所述标记物为碱性磷酸酶荧光底物。

本发明所提供的第一种优选探针，其序列为5’-3’：AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA，该探针可以应用于制备肺癌细胞系或肺癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中。

第二种优选探针，其序列为5’-3’：TCACGCGAGCCGAACGAACAAA，该探针可以应用于制备食管癌细胞系或食管癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中。

本发明的检测原理如下：本发明的检测系统采用了碱性磷酸酶底物发光检测系统，根据目的核酸模板，设计地高辛标记的2F探针，与目的核酸进行杂交，然后与抗地高辛碱性磷酸酶复合物进行孵育，洗涤，最后用碱性磷酸酶荧光底物显色，阳性结果则发出黄绿色荧光。

本发明的方法由于采用了2-F修饰的探针和碱性磷酸酶荧光底物，而2F探针和荧光底物相对而言比较便宜，因此，本发明的试剂盒价格比较便宜；另外，由于探针在第二位碳原子上加上一个氟原子，提高了Tm，同时采取了地高辛生物信号放大系统，将2-F修饰的探针上标记了地高辛，并采用碱性磷酸酶荧光底物增强信号，因此，该试剂盒及检测方法具有较好的特异性。

附图说明

图1是在培养细胞水平和组织水平上检测本发明的杂交探针的可靠性；其中，图1A、图 1B、图1C是在培养细胞水平上的检测，图1A是地高辛标记经2-F修饰的探针检测结果，放大倍数200×；图1B放大倍数1000×；图1C是对照组；图1D、图1E、图1F是组织水平的检测；图1D是地高辛标记经2-F修饰的探针检测结果，放大倍数200×；图1E放大倍数1000×；图1F是对照组；

图2是不同检测显色系统的对比实验结果图；其中，图2A、图2B是传统BCIP/NBTELF检测系统验证其结果，图2C是对照组；图2D、图2E是采用ELF检测系统验证其结果，图 2F是对照组；

图3是将本方法与RT-PCR的对比实验结果图；其中图3A是采用所涉及方法标记探针,进行原位杂交的结果；图3B是荧光定量PCR相对表达结果(RT-PCR)；

图4是应用该技术对食道癌组织芯片标本进行检测结果图；其中图4A是用本发明的方法设计检测miR375的探针检测食管癌的实验结果图；图4B是根据分类标准对组织芯片标本进行生存分析的结果图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例中所列举实施例为在肺癌细胞系、肺癌组织和食管癌细胞系、食管癌组织中用本发明的试剂盒中的2-F探针和碱性磷酸酶发光底物检测系统试剂盒进行原位杂交。同时进一步采用BCIP/NBT显色或碱性磷酸酶荧光底物显色系统对检测信号进行对比。我们还进一步采用荧光定量实时PCR以判断miRNA-ISH结果的一致性。最后用该方法对癌组织芯片进行验证。

以下实验操作按常规方法进行，具体操作如下：

实施例1：本发明的一个优选实施例的试剂盒

本实施例中的试剂盒包含miR146-5p杂交探针、对照探针、预杂交液、封闭液和标记物。

miR146-5p杂交探针的序列为5’-3’：AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA，其中第3、6、15、20个碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子，其5’和3’端修饰地高辛。对照探针的序列为5’-3’：AGTCTATGGTATTCAGTACTCA，同样其5’和3’端修饰地高辛。20ml预杂交液中含20×SSC 4ml、硫酸葡聚糖4g、去离子甲酰胺10ml、Poly A(10mg/ml)0.5ml、鱼精ssDNA(10mg/ml)0.5ml、tRNA(10mg/ml)0.5ml、1M二硫代苏糖醇(DTT)2ml、50*Denhardt’s0.2ml；所述封闭液为：PBS中加入0.1%Triton-X100、3%正常山羊血清、3%BSA；所述标记物为碱性磷酸酶荧光底物。

实施例2：本发明的另一个优选实施例的试剂盒

本实施例中的试剂盒包含杂交探针miR375、对照探针、预杂交液、封闭液和标记物。miR375杂交探针的序列为5’-3’：TCACGCGAGCCGAACGAACAAA，其中第3、8、13、21个碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子，其5’和3’端修饰地高辛。对照探针的序列为5’-3’：AGTCTATGGTATTCAGTACTCA。20ml预杂交液中含20×SSC 4ml、硫酸葡聚糖4g、去离子甲酰胺10ml、Poly A(10mg/ml)0.5ml、鱼精ssDNA(10mg/ml)0.5ml、tRNA(10mg/ml)0.5ml、1M二硫代苏糖醇(DTT)2ml、50*Denhardt’s 0.2ml；所述封闭液为：PBS中加入0.1%Triton-X100、3%正常山羊血清、3%BSA；所述标记物为碱性磷酸酶荧光底物。

实施例3：在非小细胞肺癌细胞系、肺癌组织中验证本发明的实施例1的试剂盒中的探针的可靠性

（1）材料和方法

细胞培养及组织处理：

非小细胞肺癌细胞系ACC212102和SCC211441培养在含10%太牛血清的DMEM中（含L-谷氨酸）。细胞在5%的CO2中37℃中培养，放置于玻璃盖片上进行培养，当细胞融合达到70%-80%的时候，立即用福尔马林固定2小时，然后进行ISH。

肺癌组织和正常组织，按常规石蜡包埋处理，脱蜡然后浸泡在0.2M HCl溶液中20min，用0.1%的PBST消化组织部分，然后用无RNase酶的PBS洗玻片2min，风干，待杂交。ISH探针：

miR146-5p探针序列5’-3’:AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA，5’和3’修饰地高辛，其中第3、6、15、20个碱基被2-F(2’-fluoro-modified RNA)修饰。对照探针：AGTCTATGGTATTCAGTACTCA。

检测系统：碱性磷酸酶荧光底物检测系统（购自Invitrogen，Ameresco），NCIP/NBT检测体系统（购自罗氏公司）。

（2）实验步骤

1、尽可能地采用新鲜标本，同常规石蜡切片处理脱水、浸蜡、包埋。4%多聚甲醛（含0.1%DEPC）固定，切片5-10um，玻片用防止脱玻片。

2、石蜡切片脱蜡和水化

1）65℃1小时，二甲苯，10分钟/次，2次；

2）100%、95%、80%。60%酒，3分钟/次，各1次；

3）蒸馏水洗涤至透明。

3、0.2M HCl处理20min。

4A、0..3%Triton-100（PBS溶液配制），浸泡15分钟。或选择步骤4B。

4B、消化蛋白（一般单链探针不需要）暴露mRNA核酸片段，切片上滴加蛋白酶K，37℃

消化25分钟。消化时间每3分钟观察一次，具体自行掌握，蒸馏水洗1次。

5、4%福尔马林再固定一次5分钟。

6、PBS洗涤3次，3分钟/次。100%酒精洗涤一次，干燥。

7、预杂交：杂交盒底部加纯水或20%甘油保持湿度。按每张切片20-40μl加预地高辛标

记的探针杂交液。恒温箱38-42℃，2.5小时。吸取多余液体，不要冲洗。

8、杂交：按每张切片20μl杂交液，加在切片上。盖上盖玻片，恒温箱37℃杂交过夜。

9、杂交后洗涤：42℃水温的2×SSC洗涤5分钟1次；室温洗涤2次。

10、滴加封闭液：37℃封闭30分钟。甩去多余液体，滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃60分钟或室温120分钟。

11、洗涤液体洗3次、5分钟/次。

12、滴加碱性磷酸酶标记的生物素100ul，室温30分钟，PBS洗3次，5分钟/次

13、滴加发碱性磷酸酶发光底物：滴加300ul发光底物，室温放置10分钟至1小时，荧光显微镜观察调节。原位杂交用洗涤液体洗5分钟、3次。

14、Hoechst33342复染。镜下观察。

15、酒精脱水1分钟，二甲苯透明1分钟，干燥，封片。

结果见图1，图1是在培养细胞水平和组织水平检测本发明的检测方法的可靠性的结果；其中，图1A、图1B、图1C是在培养细胞水平上的检测，图1A是地高辛标记经2-F修饰的探针检测结果，放大倍数200×；图1B是地高辛标记经2-F修饰的探针检测结果，放大倍数1000×；图1C是对照组；图1D、图1E、图1F是组织水平的检测；图1D是地高辛标记经2-F修饰的探针检测结果，放大倍数200×；图1E是地高辛标记经2-F修饰的探针检测结果，放大倍数1000×；图1F是对照组。由图1可见，该方法可以检测单个细胞中miRNA，而且特异性不同。

实施例4比较癌组织中用ELF和BCIP/NBT检测miRNA ISH的灵敏度

为了探讨该方法是否是较好的检测系统，我们用两种检测系统进行实验对比，考虑实际应用中主要是癌组织的检测，用我们用食管癌组织和正常组织验证探针的可靠性。材料同实施例3。实验步骤如下：

1、尽可能地采用新鲜标本，同常规石蜡切片处理脱水、浸蜡、包埋。4%多聚甲醛（含0.1%DEPC）固定，切片5-10um，玻片用防止脱玻片。

2、石蜡切片脱蜡和水化

1）65℃1小时或过夜，二甲苯，10分钟/次，2次；

2）100%、95%、80%。60%酒，3分钟/次，各1次；

3）蒸馏水洗涤至透明。

3、0.2M HCl处理20min。

4A、0..3%Triton-100（PBS溶液配制），浸泡15分钟。或选择步骤4B。

4B、消化蛋白（一般单链探针不需要）暴露mRNA核酸片段，切片上滴加蛋白酶K，37℃消化15-30分钟（视标本新旧、厚薄自行调整）。消化时间每3分钟观察一次，具体自行掌握，蒸馏水洗1次。（B使用非寡核苷酸探针）

4C、4%福尔马林再固定一次5min，可选步骤。

5、PBS洗涤3次，3min/次。100%酒精洗涤一次，干燥。

6、预杂交：杂交盒底部加纯水或20%甘油保持湿度。按每张切片20-40ul加预地高辛标记的探针杂交液。恒温箱38-42℃，2.5小时。吸取多余液体，不要冲洗。

7、杂交：按每张切片20μl杂交液，加在切片上。盖上盖玻片，恒温箱37℃杂交过夜。

8、杂交后洗涤：42℃水温的2×SSC洗涤5分钟1次；室温洗涤2次。

9、滴加封闭液：37℃封闭30分钟。甩去多余液体，滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃60分钟或室温120分钟。

10、洗涤液体洗3次、5分钟/次。

11、滴加碱性磷酸酶标记的生物素100ul，室温30分钟，PBS洗3次，5分钟/次

12、滴加发碱性磷酸酶发光底物：滴加300ul发光底物，室温放置10分钟-1小时，荧光显微镜观察调节。原位杂交用洗涤液体洗5分钟、3次。

13、Hoechst33342复染。镜下观察。

14、酒精脱水1分钟，二甲苯透明1分钟，干燥，封片。

BCIP/NBT显色系统从第9步骤改为BCIP/NBT显色系统。

图2是不同检测显色系统的对比实验结果图；其中，图2A、图2B是传统BCIP/NBT检测系统验证其结果，图2C是对照组；图2D、图2E是采用碱性磷酸酶荧光底物检测系统验证其结果，图2F是对照组；结果提示，传统BCIP/NBT显色系统可以显示miRNA，但是与碱性磷酸酶荧光底物显色比较，后者更加容易辨认。

实施例5：将本方法与RT-PCR的对比验证

为了验证该探针是否和经典的检测miRNA方法是一致的。我们对几种细胞系同时应用两种检测手段，将其结果标准化后，进行相关性分析，显示有统计意义，说明检测结果是一致的。

材料：miRNA375引物购自锐博生物，名称：the Bulge-loop^TM miRNA qRT-PCR Primer Setsincluded one RT primer and a pair of qPCR primers specific for miR-375。

原位杂交方法同实施例3。

图像分析及统计：采用Image J软件分析图片，采用SPSS 18.0软件分析数据。

miRNA实时荧光RT-PCR：用Triozol提取miRNA，U6作为内参对照，然后逆转录，设计miRNA荧光定量引物，进行PCR荧光定量。

逆转录体系如下：

反应条件：

42℃60min,70℃15min.

The real-time PCR

SYBR mix 2×(ABI system,USA),10μl;

RT product 2μl;

2mM miR-375 or U6 primer 2μl

PCR条件

9510sec,60℃20sec,70℃10sec,40循环

RT-PCR结果和图像分析结果见图3，图3是将本方法与RT-PCR的对比实验结果图；其中图3A是荧光原位杂交的结果，图3B是采用RT-PCR对该miRNA进行检测的相对表达量。该实验将该探针图片结果量化，和标准的RT-PCR做对比，验证其结果的可靠性。结果显示，两种检测方法存在相关性，P<0.05,R=0.9329。

实施例6：应用该技术对食道癌组织芯片标本进行检测

探针和其他材料同实施例3，实验步骤同实施例3。图4是应用该技术对食道癌组织芯片标本进行检测结果图；其中图4A是用本发明的方法设计检测miR375的探针检测食管癌的实验结果图；图4B是根据分类标准对组织芯片标本进行生存分析的结果图。根据图4A的分类标准，对组织芯片标本进行评分。结合组织芯片的患者临床特征资料分析。结果提示总体生存率和miRNA375有关，P<0.05，有统计学意义，见图4B。进一步的生存曲线分析，结果表明低表达的miRNA375和食管癌的预后有关。该实验也表明经过2-F修饰的寡核苷酸探针经地高辛标记是可以考虑科研应用和临床应用来检测miRNAs的。

                           序列表

<120>一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用

<160>3

<210>1

<211>22

<212>人工序列P1

<400>l

agcctatgga attcagttct ca                                        22

<210>1

<211>22

<212>人工序列P2

<400>2

tcacgcgagc cgaacgaaca aa                                        22

<210>1

<211>22

<212>人工序列P3

<400>3

agtctatggt attcagtact ca                                        22

Claims (6)

1.miRNA的原位杂交探针，其特征在于，所述杂交探针中的碱基的五碳环第2位碳原子修饰了一个氟原子，所述杂交探针的5’和3’端修饰地高辛，当所述杂交探针的序列为5’－3’：AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA，其中第3、6、15、20个碱基五碳环第2位碳原子修饰了一个氟原子；当所述杂交探针的序列为5’－3’：TCACGCGAGCCGAACGAACAAA，其中第3、8、13、21个碱基五碳环第2位碳原子修饰了一个氟原子。

2.一种含有权利要求1所述的原位杂交探针的miRNA的原位杂交检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的原位杂交检测试剂盒，其特征在于，还包括对照探针、预杂交液、封闭液和标记物。

4.根据权利要求3所述的原位杂交检测试剂盒，其特征在于，所述对照探针的序列为5’－3’：AGTCTATGGTATTCAGTACTCA；20ml所述预杂交液中含20×SSC4ml、硫酸葡聚糖4g、去离子甲酰胺10ml、10mg/ml的Poly A0.5ml、鱼精10mg/ml的ssDNA0.5ml、10mg/ml的tRNA0.5ml、1M二硫代苏糖醇2ml、50*Denhardt’s0.2ml；所述封闭液为：PBS中加入0.1%Triton-X100、3%正常山羊血清、3%BSA；所述标记物为碱性磷酸酶荧光底物。

5.一种原位杂交探针在制备肺癌细胞系或肺癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述原位杂交探针是如权利要求1所述的探针序列为5’－3’：AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA，其中第3、6、15、20个碱基五碳环第2位碳原子修饰了一个氟原子的探针。

6.一种原位杂交探针在制备食管癌细胞系或食管癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述原位杂交探针是如权利要求1所述的探针的序列为5’－3’：TCACGCGAGCCGAACGAACAAA，其中第3、8、13、21个碱基五碳环第2位碳原子修饰了一个氟原子的探针。

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