CN103173527A - Melk基因的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种MELK基因的用途，用于制备诊断肝癌的产品。本发明还公开了一种用于诊断肝癌的试剂盒，该试剂盒包含特异性针对MELK基因的引物或探针，或包含特异性结合MELK蛋白的抗体。本发明的MELK基因，可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种MELK基因的用途。
背景技术
MELK基因(又名HPK38，NM_014791)位于染色体9q13.2区段，编码母体-胚胎亮氨酸拉链激酶，属于Ser/Thr蛋白激酶类，是近年来新发现的AMPK蛋白激酶家族新成员，主要在有丝分裂过程中起作用。
有研究表明MELK与肿瘤的发生发展密切相关。表达谱芯片数据提示MELK在包括肺癌、宫颈癌、肠癌、食管癌等在内的19种肿瘤中显著上调表达，其中在肠癌中上调表达最为明显，在肠癌、乳腺癌、胰腺癌细胞系中抑制MELK表达，观察到细胞生长速度下降和明显的G2/M期阻滞，提示其作为广谱的肿瘤治疗靶点的可能性。MELK在乳腺癌中上调表达并与预后相关，提示其作为乳腺癌诊断标志物的可能性。
但是，目前尚没有关于MELK基因作为肝癌诊断标志物的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种MELK基因的用途，MELK基因可作为诊断肝癌的分子标志物。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种MELK基因的用途，用于制备诊断肝癌的产品。
优选的，所述诊断肝癌的产品包括：用半定量RT-PCR、基因芯片检测、或免疫检测诊断肝癌的产品。
所述用半定量RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增MELK基因的引物。
所述用基因芯片检测诊断肝癌的产品包括：与MELK基因的核酸序列杂交的探针。
所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括：与MELK蛋白特异性结合的抗体。
在本发明的另一方面，还提供了一种用于诊断肝癌的试剂盒，所述试剂盒包含特异性针对MELK基因的引物或探针，或包含特异性结合MELK蛋白的抗体。
利用本发明的试剂盒，可以检测病人MELK基因的表达情况，从而诊断病人是否患有肝癌。
在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在合适条件下诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核苷及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液中并在合适的温度下进行扩增反应。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但一般在15～25个核苷酸之间。
在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。
在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对MELK蛋白特异的抗体。例如，将提纯的人MELK基因产物或它的抗原片段或人工合成的含有与MELK蛋白有连续5个相同的氨基酸的多肽片段注射入动物体内以产生多抗体。同样，表达人MELK蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。
经实验证明，本发明MELK基因在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，因此MELK基因可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的MELK基因在人肝癌组织和癌旁组织中差异表达的半定量RT-PCR结果图。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
实施例1 用半定量RT-PCR方法检测肝癌样本中MELK基因的表达变化
半定量反转录-聚合酶链反应(SqRT-PCR)是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术，较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。
运用半定量RT-PCR方法，检测20对肝癌样本中MELK基因的表达变化，发现其在肝癌组织中呈明显的上调表达趋势。具体实验步骤如下：
1.组织分离
实验用组织来源于HBV阳性并表达甲胎蛋白的原发性肝癌的手术病人(RT-PCR证实AFP在肝癌均为阳性而癌旁为阴性)。手术切除的肝脏一经离体，迅速切取病灶及周围5公分外癌旁组织，放入液氮中(-80℃)保存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。
2.RNA抽提
采用TAKARA公司的Trizol(D9108)对20对肝癌样本(癌和癌旁)组织进行抽提，并用安捷伦2100对产物的纯度和浓度进行检测。具体操作是：
将碾杵和匀浆器等器皿在200℃干烤4h，去除RNA酶，冷却；加入液氮中预冷，将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzol试剂的匀浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4℃离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4℃离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加异丙醇，4℃离心沉淀RNA；用75％乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA进行质量鉴定(用安捷伦2100测定RNA浓度、纯度和完整性)，结果见下表1。质量鉴定好的RNA存放在-80℃冰箱待用。
表1 20对肝癌样本的RNA抽提质量检测结果
3.反转录
采用TAKARA公司的反转录试剂盒(DRR047)，对1μgRNA进行反转，该试剂盒较传统反转录试剂盒增加了去除基因组DNA的步骤，可在最大程度上保证RNA的纯度和扩增的特异性。
操作方法：
(1)基因组DNA的去除反应
| 试剂 | 使用量 |
| 5×gDNA Eraser缓冲液 | 2μl |
| gDNA Eraser | 1μl |
| 总RNA | 1μg |
| RNase Free dH2O | 补至10μl |
42℃ 2min，4℃放置。
(2)反转录反应
反应体系配制均在冰上进行，具体体系如下：
| 试剂 | 使用量 |
| 5×PrimeScript缓冲液2 | 4μl |
| PrimeScript RT酶混合物I | 1μl |
| RT引物混合物 | 1μg |
| 去除基因组DNA的RNA反应液 | 10μl |
| RNase Free dH2O | 补至20μl |
37℃ 15min，85℃ 5sec，4℃放置。
4.PCR反应
模板：上述反转录产物按1∶10比例稀释后作为PCR反应的模板。
引物如下：
PCR反应的体系：
PCR反应采用TAKARA公司的耐热性Taq DNA聚合酶(DR001)，以人基因组为模板时，能很好地扩增3.0kbp(p53基因)的DNA片段。
| 试剂 | 使用量 |
| Takara Taq(5U/μl) | 0.1μl |
| 10×PCR缓冲液(Mg2+ Plus) | 2μl |
| dNTP混合物(2.5mM each) | 1.6μl |
| 引物混合物(5μM each) | 1.6μl |
| 模板 | 0.5-4μl |
| ddH2O | 补至20μl |
PCR反应条件：
β-actin：
94℃ 5min.
4℃
目的基因：
94℃ 5min.
4℃
5.实验结果显示，MELK基因在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织中MELK基因的表达水平(见图1)，差异率达100％，MELK特异扩增片断大小为204bp，内参β-actin的产物片断大小为273bp，在图1中，“N”指癌旁组织，“C”指肝癌组织。
6.根据上述实验结果，可通过半定量RT-PCR诊断肝癌：设计MELK基因的PCR引物，检测肝癌组织中MELK基因的表达量，如果MELK基因的表达量显著升高，则说明患肝癌的可能性高，反之则低。
实施例2用基因芯片检测肝癌样本中MELK基因的表达变化
使用基因芯片检测肝癌及癌旁组织中基因表达水平的差异，发现MELK基因表达差异明显。其中，基因芯片实验主要包括如下四个步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。
1.芯片制备目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体。通过点样法将靶基因作为探针按顺序排列在载体上，靶基因可分为基因组DNA、cDNA(或人工合成DNA)。
2.样品制备待测样品中总RNA的抽提步骤如下：分离肝癌及癌旁组织，再用TRIZol法抽提总RNA。
提取的总RNA可进一步用于样品cDNA探针制备，其过程包括荧光探针的制备(cDNA第一链标记)、纯化和定量。定量后的探针吸回至1.5ml离心管中，加热抽干，保存于-20℃，待杂交。
3.芯片杂交
1)准备工作：(1)洗涤盖玻片，将盖玻片依次放入ddH2O、95％乙醇、ddH2O，各3min，最后放入干燥的50ml离心管中1000rpm，离心3min，去除残留的水渍，放置待用；(2)配制10％PBS溶液；(3)平衡杂交炉，用水平仪校准杂交炉，保持水平；(4)配制如下洗片液：20×SSC溶液、10％SDS溶液、洗液I(2×SSC/0.5％SDS)、洗液II(1×SSC/0.1％SDS)、洗片溶液III(0.1×SSC)。
2)预杂交 预杂交液的配制是30μl的总体积中有9μl的20×SSPE缓冲液、3μl的50×Denhandts缓冲液及18μl ddH2O，再从干燥箱中取出芯片，将适量的预杂交液滴加于芯片上，盖上盖玻片，然后将芯片放入加有PBS的杂交盒中，置于42℃杂交箱中预杂交约1小时。预杂交完成之后取出芯片用ddH2O浸洗片刻，待盖玻片脱落后将芯片放入干燥的离心管中离心，去除残留的水渍，放置待用。
3)杂交取出经定量的Cy3和Cy5标记的探针，各用9～15μl ddH2O充分溶解混合于1.5ml离心管内，然后配制杂交液，Cy3/Cy5荧光标记探针的杂交液由20×SSPE缓冲液、50×Denhandts缓冲液和溶解有探针的ddH2O组成，接着，取杂交液滴加在芯片上，并盖上盖玻片。最后，将该杂交芯片放入加有PBS的杂交盒，置于42℃杂交箱中杂交12～20小时。
4.洗涤、扫描和数据分析芯片杂交反应结束后，需进行芯片洗涤。再通过特定的扫描仪比如激光共聚焦扫描仪进行扫描，扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号，随后进行数据分析和处理。由于样本差异、荧光标记效率和检出率的不平衡，需对原始提取信号进行均衡和修正才能进一步分析实验数据。经分析，由基因芯片检测肝癌及癌旁组织中MELK基因的表达差异，结果显示MELK基因在肝癌组织中表达显著上调。
实施例3免疫检测肝癌样本中MELK蛋白的表达变化
1.抗原蛋白获得
(1)利用基因工程表达：可从Genbank数据库中获得人MELK基因的cDNA序列，通过PCR扩增获得编码框，插入原核生物或真核生物表达载体中，表达MELK蛋白，并按基因工程表达产物的纯化体系纯化蛋白质。
(2)通过培养高表达MELK基因的人体来源细胞或组织，再分离纯化MELK蛋白。
2.抗体制备
可采用以下几种方法制备抗体：
(1)细胞融合法：用上述制备的MELK蛋白免疫动物(包括兔子、山羊等)，获得脾脏细胞，再与骨髓瘤细胞融合，并按常规单克隆抗体制备技术制备单克隆抗体。
(2)利用噬菌体表面展示库，克隆免疫动物的脾脏IgG可变区并表达成基因工程单克隆抗体。
(3)利用纯化的蛋白质免疫动物，制备多抗血清。
3.检测
(1)用制备的抗体(多抗或单抗)，用组织化学方法进行肝癌的病理检测，阳性信号为肝癌。
(2)取患者血清，用ELISA方法检测，阳性反应为肝癌可疑病人。
(3)将MELK抗体作为蛋白质芯片的探针之一，用于肝癌诊断。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>上海生物芯片有限公司
<120>MELK基因的用途
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
<223>引物
<400>1
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<223>引物
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aatcatcttc acaccaatca t 21
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<211>22
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<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223>引物
<400>4
actgtgttgg cgtacaggtc tt 22
Claims (8)
1.一种MELK基因的用途，其特征在于，用于制备诊断肝癌的产品。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断肝癌的产品包括：用半定量RT-PCR、基因芯片检测、或免疫检测诊断肝癌的产品。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用半定量RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增MELK基因的引物。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用基因芯片检测诊断肝癌的产品包括：与MELK基因的核酸序列杂交的探针。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括：与MELK蛋白特异性结合的抗体。
6.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性针对MELK基因的引物对。
7.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性针对MELK基因的探针。
8.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性结合MELK蛋白的抗体。
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| CN 201110436911 CN103173527A (zh) | 2011-12-22 | 2011-12-22 | Melk基因的用途 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106232878A (zh) * | 2013-11-12 | 2016-12-14 | 丹娜法伯癌症研究院 | Melk活性的生物标记物及使用其的方法 |
| US10254283B2 (en) | 2013-11-12 | 2019-04-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Biomarker for MELK activity and methods of using same |
-
2011
- 2011-12-22 CN CN 201110436911 patent/CN103173527A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
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| US10254283B2 (en) | 2013-11-12 | 2019-04-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Biomarker for MELK activity and methods of using same |
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| PB01 | Publication | ||
| C05 | Deemed withdrawal (patent law before 1993) | ||
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