CN111154866A - 用于预测高血压患者并发心肌肥厚的miRNA标记物及其应用 - Google Patents

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李玉琳
马珂
荣玮
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Abstract

本发明涉及一种用于预测高血压患者并发心肌肥厚的miRNA标记物及其应用。所述的miRNA为miR‑15a‑5p/miR‑16‑5p，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。所述的预测高血压患者并发心肌肥厚为：检测待测高血压患者血清中所述的miRNA的浓度，当相比健康人群标准miR‑15a‑5p/miR‑16‑5p血清浓度统计数据浓度降低时，预测该待测高血压患者并发心肌肥厚风险较高。

Description

用于预测高血压患者并发心肌肥厚的miRNA标记物及其应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种用于预测高血压患者并发心肌肥厚的miRNA标记物及其应用。
背景技术
高血压是世界上最常见的疾病，全球约有三分之一的人口受到影响。据《中国心血管病报告2018》数据显示，我国有心血管病患者2.9亿，其中高血压2.45亿。高血压患病率逐年上升，仍未得到充分的控制。高血压常见的病理特征是左室重构和向心性肥厚,约20％～30％的高血压患者存在左室肥厚(LVH)。心肌肥厚表现为心肌纤维化、冠状动脉循环改变和心肌细胞凋亡，可导致心力衰竭、心肌缺血和心律失常的发生。病理性LVH是高血压患者心血管并发症相关的独立危险因素,能显著增加冠状动脉疾病，射血分数保留性心衰(HFpEF)，中风，心律失常和猝死的风险。因此，早期预测高血压引起心肌肥厚有助于维持心功能和避免心力衰竭等不良心血管事件的发生。
目前缺乏有效的方法对高血压患者进行早期预测心血管不良结局的发生。常规的血压测量、传统危险因素评估和心电图等简易筛查试验由于增值量太小而难以用于临床实践中，而其它更复杂的方法，包括超声心动图或心脏磁共振成像(MRI)，需要专业技能且价格昂贵。
miRNAs是非编码的内源性小RNAs，通过在转录后水平降解mRNA或抑制蛋白翻译来调控基因表达。大量研究表明在心血管疾病(CVD)中miRNA是一种有效的循环生物标志物，具有较高的预后能力。van Rooij E等人研究表明特异性miRNAs在控制心肌肥厚性生长和心室重构中对病理信号的反应具有重要作用，并提示miRNAs可能是心脏疾病的治疗靶点。既往研究表明在心脏中大量表达的miR-15家族(miR-15a/b,miR-16,miR-195,miR-497,miR-322)可能抑制心脏纤维化和心肌肥大中的关键通路。
因此，进一步分析相关患者的血清miR-15的水平，寻找心肌肥大的相关靶标，是有很高的临床价值和意义的。
发明内容
本发明首先涉及一组miRNA在制备预测高血压患者并发心肌肥厚风险的试剂盒中的应用，所述的miRNA为miR-15a-5p/miR-16-5p，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。
所述的miRNA为血清来源的miRNA；
所述的预测高血压患者并发心肌肥厚风险为：检测待测高血压患者血清中所述的miRNA的浓度，当相比健康人群标准miR-15a-5p/miR-16-5p血清浓度统计数据浓度降低时，预测该待测高血压患者并发心肌肥厚风险较高。
优选的，所述的试剂盒为qRT-PCR试剂盒。
本发明还涉及使用所述miR-15a-5p/miR-16-5p预测高血压患者并发心肌肥厚风险患者的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)收集待测患者的血清样本；
(2)使用qRT-PCR定量患者血清样本中的miR-15a-5p/miR-16-5p的含量；
(3)当待测患者血清中的miR-15a-5p/miR-16-5p含量与健康人群标准miR-15a-5p/miR-16-5p血清浓度统计数据(cutoff值)相比降低时，预测该患者并发心肌肥厚风险较高。
本发明的有益效果在于，为了探索循环miRNA能否早期预测高血压心肌肥厚，我们鉴定出了高血压无肥厚患者入院血清miRNA(miRNA-15a-5p/miR-16-5p)能够早期预测高血压心肌肥厚的发生。
附图说明
图1、患者入组及随访实验流程图。
图2：出现心肌肥厚时间的患者血清miRNA-15a-5p/miR-16-5p显著下降。
图3：ROC分析显示miRNA-15a-5p/miR-16-5p能区分肥厚和非肥厚事件患者。
图4：COX分析显示miRNA-15a-5p/miR-16-5p降低与远期肥厚事件相关。
图5：在miRNA-15a-5p/miR-16-5p低表达组中，心室肥厚发生率显著高于高表达组。
具体实施方式
实施例1：入组患者筛选和样本处理
选取入院无心肌肥厚的高血压患者(n＝260)，检测入院血清miRNA-15a-5p/miR-16-5p表达，进行中位数为18个月的随访，有32患者出现左室肥厚。患者入组及随访实验流程见图1。
入组患者的血清miRNA检测实验步骤：
1、样本RNA的提取
(1)匀浆：
从-70℃冰箱中取出血浆样品，解冻后于4℃ 12,000×g离心10分钟，去除可能存在的杂质，取250ul血浆液体，转至1.5ml的离心管中，加入750μl的TRIzol LS Reagent试剂和20μl冰醋酸，手动剧烈振荡管体至混匀；
(2)两相分离：
匀浆后样品于15～30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离；随后每750μl的匀浆样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖；手动剧烈振荡管体15秒后，15～30℃孵育2到3分钟；4℃下12,000×g离心15分钟；离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相；RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约是步骤(1)匀浆时加入的TRIzol LS Reagent的60％。
(3)RNA沉淀：
将水相转移到新离心管中，并加入500μl异丙醇，混匀以沉淀其中的RNA；混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃ 12,000×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
(4)RNA清洗：
移去上清液，750μl的TRIzol LS Reagent试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀；振荡后，4℃ 7,500×g离心5分钟。
(5)重新溶解RNA沉淀：
去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟；加入无RNA酶的水溶解RNA样品；获得的RNA溶液保存于-70℃。
2、RNA质量检测
(1)紫外吸收测定法：
使用
Figure BDA0002401302160000021
ND-1000测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零，操作方法如下：
A.滴加1ul DEPC水或者RNA样品至测量基座的表面。
B.液滴会自动在上下基座之间形成液柱并自动完成测定，RNA浓度及质量的各种参数将在电脑中自动生成文件。
C.一次测定完成后，用柔软的擦镜纸擦去上下基座表面上的样本液，便可进行下一个样品的测量。
D.测定结果(电脑自动生成的EXCEL和JPEG文件附于实验报告文件夹中)：
浓度测定：260nm处读值为1表示40ng RNA/ul。样品RNA浓度计算公式为：A260 X40ng/ul。具体计算如下：RNA溶于20μl DEPC水中，取1ul用于测定，测得A260＝65.003：RNA浓度＝65.003X 40ng/ul＝2600.12ng/ul；取1ul用来测量以后，剩余样品RNA为19μl，剩余RNA总量为：19μl X 2600.12ng/ul＝49.4μg。
(2)纯度检测：
RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。即使比值超出这个范围，RNA样品也一样可以用于一些普通实验中如Northern杂交，RT-PCR和RNA酶保护实验。
(3)变性琼脂糖凝胶电泳：
A.制胶：1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37％甲醛溶液(12.3M)。
Figure BDA0002401302160000031
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
B.准备RNA样品：取1μg RNA，加1倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育5分钟使样品变性。
C.电泳：上样于胶孔中，5-6V/cm电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。
D.紫外透射光下观察并拍照：28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带。RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
3、使用提取到的RNA进行cDNA合成
Figure BDA0002401302160000032
(1)制备RT混合反应液：
Figure BDA0002401302160000033
(2)在PCR扩增仪进行RT反应：
Figure BDA0002401302160000034
Figure BDA0002401302160000041
反应结束后，将其放在冰上待用或-20℃保存。
(3)合成的cDNA用于实时定量PCR
1)进行Realtime PCR反应
A.将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下：
Figure BDA0002401302160000042
轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。
B.加样：
a.将8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中。
b.再加入对应的2μl cDNA。
c.小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。
d.在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。
C.将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。
目的miRNA和内参miRNA(hsa-miR-191-5p)均按以下程序进行：
95℃，10min；
40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒)。
为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒)。
2)结果与计算：
各样品的目的miRNA和内参hsa-miR-191-5p分别进行Realtime PCR反应。
数据采用2-△△CT法进行分析。
实施例2：心肌肥厚事件的患者血清中的miRNA-15a-5p/miR-16-5p分析
1、根据随访结果，32位高血压患者出现心肌肥厚事件，统计该部分高血压患者入组时采集的血清中的miRNA-15a-5p/miR-16-5p，与未出现心肌肥厚的高血压患者入组时采集的血清miRNA-15a-5p/miR-16-5p的含量比对结果如图2所示，结果显示，出现心肌肥厚的患者的的血清miRNA-15a-5p/miR-16-5p浓度显著降低。
2、ROC分析和COX分析miRNA-15a-5p/miR-16-5p区分高血压患者发生肥厚和非肥厚事件的结果分别见图3、图4，结果同样表明，入组时采集的血清miRNA-15a-5p/miR-16-5p样本浓度，能够很好的区分高血压患者是否发生心肌肥厚事件。
3、基于ROC分析的约登指数最大值选择cut-off值，分为miRNA-15a-5p/miR-16-5p高表达和低表达组，在miRNA-15a-5p/miR-16-5p低表达组中心室肥厚发生率显著高于高表达组(图5)，说明使用miRNA-15a-5p/miR-16-5p的血清浓度，能够很好的预测高血压患者发生心肌肥厚的概率。
最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做限定本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京市心肺血管疾病研究所
<120> 用于预测高血压患者并发心肌肥厚的miRNA标记物及其应用
<130> CP120020121C
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
uagcagcaca uaaugguuug ug 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
uagcagcacg uaaauauugg cg 22

Claims (4)

1.一组miRNA在制备预测高血压患者并发心肌肥厚风险的试剂盒中的应用，其特征在于，所述的miRNA为miR-15a-5p/miR-16-5p，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的miRNA为血清来源的miRNA。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的预测高血压患者并发心肌肥厚风险为：
(1)检测待测高血压患者血清中所述的miRNA的浓度；
(2)当相比健康人群标准miR-15a-5p/miR-16-5p血清浓度统计数据浓度降低时，预测该待测高血压患者并发心肌肥厚风险较高。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒为qRT-PCR试剂盒。
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