CN102433375A - 一种与药源性肝损伤相关的微小核糖核酸标志物及其检测试剂盒 - Google Patents

一种与药源性肝损伤相关的微小核糖核酸标志物及其检测试剂盒 Download PDF

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CN102433375A CN2011102560127A CN201110256012A CN102433375A CN 102433375 A CN102433375 A CN 102433375A CN 2011102560127 A CN2011102560127 A CN 2011102560127A CN 201110256012 A CN201110256012 A CN 201110256012A CN 102433375 A CN102433375 A CN 102433375A
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苏钰文
陈熹
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Abstract

本发明属于生物技术和制药技术领域，涉及一种与药源性肝损伤相关的血清/血浆微小核糖核酸标志物及其检测试剂盒在药源性肝损伤的早期检测，以及在药物肝脏毒性安全性评价等方面的应用。该标志物为miR-122、miR-192和miR-193中的一种或多种，其检测试剂盒有助于药源性肝损伤的早期发现，比传统血液生化学指标更具有早期敏感性，有潜力应用到临床前实验室以及全国各级医院的临床诊断，同时也为新药开发过程中的肝脏毒性安全性评价提供有力参考依据，更大限度地提高药物肝脏毒性的检出率。

Description

一种与药源性肝损伤相关的微小核糖核酸标志物及其检测试剂盒
技术领域：
本发明属于生物技术和制药技术领域，涉及一种与药源性肝损伤相关的血清/血浆微小核糖核酸标志物及其检测试剂盒在药源性肝损伤的早期检测，以及在药物肝脏毒性安全性评价方面的应用。
背景技术
随着各种新药的广泛应用以及联合用药的增多，药源性肝损伤(Drug-induced Liver Injury，DILI)已成了医疗卫生工作者、制药工业和药品管理部门共同面对的重要问题。据报道，药源性肝损害占药物不良反应10％-15％，临床上实际发生的药源性肝损伤的案例远较报道数要多。DILI是药物从市场上撤回的最常见的原因。在过去的数年，由于具有较高的肝损伤发病率和死亡率，美国食品与药品管理局已经从市场上撤回了较多药物，包括：溴芬酸、乙溴替丁、曲格列酮等，其他诸如氟烷、氯丙嗪、他克林等药物均因为肝毒性而限制了其治疗应用。近年来，中草药引发的肝损伤问题也受到越来越多的关注。临床上报道的引发DILI的中草药有黄药子、雷公藤、千里光、复方制剂有壮骨关节丸、疳积散、小柴胡汤等。
目前临床上以及实验室研究中所应用的药源性肝损伤诊断指标为肝功能相关血液生物化学指标。主要有谷丙转氨酶(Alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(Aspartate transaminase，AST)、碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)、总胆红素(Total bilirubin，TBIL)、直接胆红素(Direct bilirubin，DBIL)、间接胆红素(Indirect bilirubin，IBIL)、胆汁酸(Total bile acid，TBA)等指标。然而即便是作为临床诊断肝损伤金标准的血清ALT和/或AST也不能满足药源性肝损伤诊断的需要，其主要原因有三方面：首先，存在检测特异性的问题：血清AST活性的增高与心肌和骨骼肌损伤相关；同时血清ALT活性也和肌肉坏死存在联系。所以容易导致检测值出现误差。其次，包括ALT和AST在内的这一系列血液生物化学指标对检测样本的保存要求较高，因为它们多为具有活性的蛋白质，临床样本保存条件不当或者保存时间过长常导致这些蛋白质活性的丧失，检测值也会随之下降。最后，临床诊断中，在观测血清ALT和/或AST值的同时还会参考上述其他指标，但其他指标的敏感性和特异性远远达不到作为中药药源性肝损伤早期诊断标志物的要求。所以，优于或等同于血清ALT和/或AST值诊断价值的标志物亟待开发。寻找在药源性肝损伤早期诊断方面有指示作用的，同时能够弥补现有标志物缺陷的新型分子标志物的研究和开发工作一直在不懈的探索中，目前已发现的新型分子标志物的代表有：苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase，MDH)，嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorlyase，PNP)，对氧磷酶1(Paraoxonase-1，PON1)等。然而，它们和临床中正在使用的标志物一样，都是容易失去活性的蛋白质，而且它们的检测敏感性和特异性还有待进一步考证，进而限制了其临床上的开发应用。
近年来，作为新的研究切入点，microRNA为癌症的诊断与治疗开辟了一条新途径。microRNA，简称miRNA，是一类由动物、植物和病毒基因组所编码的长约19-23个核苷酸的小分子单链RNA，它们不具有开放阅读框，不编码蛋白质，但却参与机体的各种重要的生理和病理过程。miRNA广泛存在于血清、血浆、唾液、痰、尿液、乳汁、羊水、精液、胸腹水、脑脊液、汗液等各种各样的体液中，其特异性的表达谱可以作为识别多种疾病的生物标志物，应用前景广阔。而所有这些标志物之中，最引人瞩目的、应用潜力最大的自然是血清/血浆miRNA在癌症的诊断中的应用。血清/血浆miRNA作为肿瘤标志物的优越性在于：(1)已有的对正常人和不同癌症病人的血清/血浆miRNA的检测结果表明，miRNA分子广泛存在于正常人和不同癌症病人的血清/血浆中，并且随着生理状况、肿瘤的种类和病程的不同，miRNA分子在血清/血浆中存在的种类和数量将发生显著变化，该结果提示血清/血浆miRNA作为癌症诊断和预后的标志物具有灵敏度高、特异性好的特点，可改进癌症诊断、分类、预后估计、疗效预测的精度；(2)血清/血浆miRNA是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，而且定量精确，该类小分子RNA生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的改进，将为癌症的防治开创全新局面；
(3)血清/血浆miRNA监测系统是一种实时、全面的诊断方法，能够明确癌症进展情况，全面的反映患者的疾病状态，避免既往繁杂检测，节约了成本和时间，为临床医生快速准确的掌握患者病情、及时采取个性化的防治方案提供支持；(4)血清/血浆miRNA指纹图谱的筛选采用严密、多阶段的验证和评价体系，规范化的程序和策略的应用保证了血清/血浆miRNA生物标志物在临床上应用的准确性，也为包括药源性肝损伤在内的其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
目前，已有研究表明miRNA和肝脏疾病也存在着千丝万缕的联系。在肝细胞性肝癌的研究中发现miR-122、miR-21、miR-195、miR-18、miR-199a等的异常表达与之有关；在肝纤维化研究中发现miR-29、miR-15b、miR-16均与其相关。miRNA作为生物标志物的研究也随之涌现。已有研究证明血清miR-21、miR-122、miR-223、miR-25、miR-375和let-7f是肝细胞性肝癌和慢性肝炎的新型标志物；血浆miR-122可以作为病毒性、酒精性和化学性肝脏疾病的标志物；血浆miR-885-5p也是具有潜力的指征肝脏疾病进展的标志物；在小鼠对乙酰氨基酚肝损伤模型中发现一些在血清中高表达的miRNA，如miR-122在小鼠血清中持续高表达，这些血清中的miRNA在肝损伤早期就可以检测出来。将上述miRNA开发为肝脏疾病的的诊断标志物，还有待进一步深入研究。然而miR-122在各种肝脏疾病的血清中都高表达，为了区分不同的肝脏疾病，同时开发出多个针对特定肝脏疾病的miRNA将起到良好的区分作用。
目前尚未有检测血液标本的药源性肝损伤特异性miRNA标志物组合及其检测试剂盒的报道。本发明致力于研究并开发出基于血液miRNA的药源性肝损伤早期检测新型分子标志物，其成果有潜力应用到临床前实验室以及全国各级医院的临床诊断，为千千万万的患者带来福音；同时也为制药工业和药品管理部门在新药开发过程中肝脏毒性的安全性评价提供有力参考依据，最大限度地提高新药肝脏毒性的检出率，更好地实现早期评价、早期淘汰的目标，将会产生巨大的社会经济效益。
发明内容
目前，在DILI检测与药物肝脏毒性安全性评价研究领域中，相关的标志物仅仅局限于血液生化学的各种蛋白类指标，尚未有关于血清/血浆miRNA应用于DILI检测和与药物肝脏毒性安全性评价的相关报道。基于血清/血浆miRNA已为癌症的诊断开辟了一条新途径，以及为了克服传统的以及开发中的用于DILI检测的蛋白类标志物的上述缺陷，寻找一种具有DILI特异性、敏感性、非侵入性和稳定性的新型标志物，本发明将研究切入点瞄准向具有重大应用前景的外周血液中的miRNA。
本发明通过平行建立具有典型肝脏毒性的化学类药物(对乙酰氨基酚)和中草药(黄药子)所致的肝损伤大鼠的动物模型，分离和研究正常大鼠、对乙酰氨基酚所致DILI大鼠和黄药子所致DILI大鼠的血清和肝脏组织中的miRNA，寻找一类可用于DILI早期检测的DILI特异性的血清/血浆miRNA。并研制出便于临床应用与药物肝脏毒性安全性评价的DILI早期检测试剂盒，为DILI早期检测和筛查提供参考依据。
本发明需要解决的技术问题包括：(1)提供DILI相关的血清/血浆miRNA标志物组合；(2)提供检测DILI相关的血清/血浆miRNA标志物组合的探针/引物组合；(3)提供DILI检测试剂盒和相应试剂。
本发明采取以下技术方案来解决上述技术问题。
一种DILI相关的血清/血浆miRNA标志物组合：miR-101a、miR-101b、miR-1188-5p、miR-122、miR-183、miR-183*、miR-187、miR-192、miR-193、miR-200a、miR-200c*、miR-214、miR-22*、miR-292-3p、miR-322、miR-323、miR-327、miR-33*、miR-342-3p、miR-380、miR-455*、miR-543*和miR-878，所述标志物组合包括以上在血清/血浆中稳定存在且可检测的miRNA成熟体中的一种或一种以上，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23种。
优选地，所述标志物组合为包括以下在血清/血浆中稳定存在且可检测的miRNA成熟体中的任意一种或多种：miR-122、miR-192和miR-193。
所述血清/血浆miRNA标志物组合在制备DILI检测试剂盒中的应用。
所述血清/血浆miRNA标志物组合的探针，这些探针为：miR-122的探针是SEQ ID No.1；miR-192的探针是SEQ ID No.2；miR-193的探针是SEQ ID No.3(见表1)。
上述任意一种或多种血清/血浆miRNA标志物的探针在制备DILI检测试剂盒中的应用。
所述血清/血浆miRNA标志物组合的引物，这些引物为：miR-122引物是SEQ ID No.4和SEQ ID No.5；miR-192引物是SEQ ID No.6和SEQ ID No.7；miR-193引物是SEQ ID No.8和SEQ ID No.9(见表2)。
上述任意一对或多对血清/血浆miRNA标志物的引物在制备DILI检测试剂盒中的应用。
一种DILI检测试剂盒，该试剂盒包含血清/血浆微小核糖核酸中miR-122、miR-192和miR-193的探针/引物组合。
所述检测试剂盒，该试剂盒包含下列任意一种或多种探针/引物组合：miR-122的探针是SEQ ID No.1；miR-192的探针是SEQ ID No.2；miR-193的探针是SEQ ID No.3；miR-122的引物是SEQ ID No.4和SEQID No.5；miR-192的引物是SEQ ID No.6和SEQ ID No.7；miR-193的引物是SEQ ID No.8和SEQ ID No.9(见表1和表2)。
所述检测试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如逆转录酶、Taq酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2和DEPC H2O等；还可以包括标准品和/或对照品(见图1)。
表1：标志物的探针序列
Figure BSA00000566063700041
表2：标志物的引物序列
Figure BSA00000566063700042
具体而言，本发明解决技术问题的技术方案包括：(1)以标准操作程序(SOP)建立分别由化学类药物(对乙酰氨基酚)和中草药(黄药子)所致的两个平行的肝损伤大鼠的动物模型，并采集符合标准的血液样本和肝脏组织样本，并进行血液生化学和病理学检测和分析。(2)血清/血浆miRNA差异表达谱分析：检测两个DILI动物模型和正常动物的血清/血浆miRNAs的表达谱及含量，分析DILI给药组和正常组之间差异表达的miRNAs，并比较两个DILI动物模型的差异表达的miRNAs的共性，筛选出潜在的DILI特异性的差异表达的血清/血浆miRNAs。(3)DILI检测试剂盒的制备：根据可以作为标志物的DILI特异性的差异表达的血清/血浆miRNAs制备DILI检测试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)建立分别由化学类药物(对乙酰氨基酚)和中草药(黄药子)所致的两个平行的DILI大鼠的动物模型，建立每个样本的血液生化学和病理学检测数据库，并采用了RT-PCR(Reverse Transcriptional PCR，逆转录PCR)方法、Real4ime PCR方法和TaqMan Low Density Array(TLDA)芯片检测技术等来解决上述的技术问题。
具体来说，研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1研究样本的制备
1.1由化学类药物(对乙酰氨基酚)和中草药(黄药子)诱导的DILI大鼠的动物模型的建立
1.2每个样本的血液生化学和病理学检测和分析
1.3以与DILI同批次的SPF SD雄性大鼠作为正常对照。
2TRIzol试剂(Invitrogen公司)、miRNeasy mini kit和RNeasy mini kit(QIAGEN公司)提取血清/血浆以及肝脏组织总RNA，按试剂所附的说明书进行操作。
3血清/血浆样本的TLDA(Applied Biosystems公司)芯片检测
3.1总RNA经RT-PCR反应后获得cDNA样品
3.2对cDNA样品进行预扩增
3.3对预扩增后的cDNA样品进行TLDA芯片检测，得到血清/血浆miRNA表达谱
3.4数据分析和处理
4Real-time RT-PCR(qRT-PCR)检测方法
4.1取待检测的血清/血浆总RNA经RT-PCR反应后获得cDNA样品
4.2加入探针或染料进行Real-time PCR检测
4.3制备标准品的标准曲线
4.4数据分析和处理
5统计分析方法
5.1TLDA芯片结果中，miRNA平均表达水平以2-ΔΔCT表示，ΔCT＝CT样本-CT内参，ΔΔCT＝ΔCT 实验组-ΔCT正常组。
5.2qRT-PCR结果中，将荧光定量PCR检测得到的某血清/血浆miRNA的CT值代入该miRNA的标准曲线方程，得到该血清/血浆miRNA的浓度，再和正常组相比较，得到检测组和正常组之间的血清/血浆miRNA平均表达水平的差异表达倍数；或者对荧光定量PCR检测得到的某血清/血浆miRNA的CT值以2-ΔCT法进行数据分析，其中，ΔCT＝CT检测组-CT正常组，检测组和正常组之间的miRNA平均表达水平的差异倍数即为2-ΔCT。采用student-t检验比较各个实验组和正常组之间miRNA平均表达水平的差异程度。
以下是本发明的进一步说明：
在上述两组平行的DILI模型大鼠以及正常对照大鼠中，我们统一采用SPF级别SD雄性大鼠为研究对象，给药后24小时对每个样本进行血液生化学和病理学检测和分析：选取ALT水平大于5倍正常组正常值，同时病理检查结果呈明显肝损伤的动物的血液样本进行TLDA芯片检测。
经TLDA芯片检测，本发明人检测到“化学药物(对乙酰氨基酚)”组与“正常对照”组的血清中存在差异表达(ΔΔCT大于3)的miRNA包括：miR-1、miR-101a、miR-101b、miR-1188-5p、miR-122、miR-125a-5p、miR-133a、miR-133b、miR-142-5p、miR-183、miR-183*、miR-187、miR-192、miR-193、miR-200a、miR-200c*、miR-206、miR-214、miR-22*、miR-223、miR-292-3p、miR-322、miR-323、miR-327、miR-33*、miR-342-3p、miR-380、miR-425、miR-455*、miR-543*、miR-878和miR-99b。
经TLDA芯片检测，本发明人检测到“中草药(黄药子)”组与“正常对照”组的血清中存在差异表达(ΔΔCT大于3)的miRNA包括：miR-101a、miR-101b、miR-1188-5p、miR-122、miR-128、miR-139-5p、miR-151、miR-152、miR-182、miR-183、miR-183*、miR-187、miR-192、miR-193、miR-193*、miR-195、miR-200a、miR-200b、miR-200c*、miR-21、miR-214、miR-22、miR-22*、miR-26b、miR-27b、miR-292-3p、miR-29c、miR-29c*、miR-31、miR-31*、miR-322、miR-323、miR-327、miR-33*、miR-342-3p、miR-370、miR-380、miR-409-3P、miR-455*、miR-484、miR-500、miR-505、miR-543*和miR-878。
表3：血清中差异表达的miRNAs
Figure BSA00000566063700061
Figure BSA00000566063700071
根据TLDA检测的结果，选择在“DILI给药组”与“正常对照”组之间的ΔΔCT大于4的miRNAs用qRT-PCR方法进一步验证。满足上述条件的miRNAs包括23种：miR-101a、miR-101b、miR-1188-5p、miR-122、miR-133b、miR-183、miR-183*、miR-187、miR-192、miR-193、miR-200a、miR-200c*、miR-206、miR-21、miR-22*、miR-292-3p、miR-29c、miR-31*、miR-327、miR-33*、miR-380、miR-455*和miR-543*。经探针法qRT-PCR验证后，发现有3种miRNAs(miR-122、miR-192和miR-193)在两组平行的“DILI模型”组的血清中共同差异表达，与此同时，这3中miRNAs在“DILI给药组”与“正常对照”组之间的ΔΔCT大于4，且P值小于0.01。上述结果中的这3个与DILI高度相关的miRNAs对于DILI检测的敏感程度大于传统的血液生化学指标(ALT和AST)，且与病理学检查结果保持高度关联性(见表4和附图3)。
表4：DILI标志物的qRT-PCR验证和筛选
Figure BSA00000566063700072
Figure BSA00000566063700081
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能应用于DILI的检测试剂盒，该试剂盒包含血清/血浆微小核糖核酸中miR-122、miR-192和miR-193的探针/引物组合。
具体而言，由miR-122、miR-192和miR-193探针/引物组合等检测试剂构成的检测试剂盒有助于DILI的早期检测以及新药肝脏毒性安全性评价，有潜力应用到临床前实验室以及全国各级医院的临床诊断，为千千万万的患者带来福音；同时也为制药工业和药品管理部门在新药开发过程中肝脏毒性的安全性评价提供有力参考依据，最大限度地提高新药肝脏毒性的检出率，更好地实现早期评价、早期淘汰的目标。
本申请中“血清/血浆”和“探针/引物”中的“/”表示“和”及“或”的关系。
综上所述，本发明具有的有益效果如下：(1)血清/血浆miRNA作为新型非蛋白类DILI检测标志物，除了样本采集方便和检测样本量小的优点之外，更具有性质稳定且易于保存特点；(2)血清/血浆miRNA与作为金标准的传统的DILI标志物相比，更具早期敏感性。(3)由平行DILI动物模型的血清/血浆miRNA谱筛选出来的miRNA组合具有较高的DILI特异性，克服单一标志物低特异性的缺陷。
附图说明
图1：miRNA的荧光定量PCR的标准曲线。其中，图1A为miR-122标准曲线；图1B为miR-192标准曲线；图1C为miR-193标准曲线。
图2：标志物的时间依赖性检测图。其中，图1A为miR-122检测结果；图1B为miR-192检测结果；图1C为miR-193检测结果；图1D为ALT检测结果；图1E为AST检测结果；图1F为病理学检查结果。
图3：标志物的剂量依赖性检测图。其中，图1A为miR-122检测结果；图1B为miR-192检测结果；图1C为miR-193检测结果；图1D为ALT检测结果；图1E为AST检测结果；图1F为病理学检查结果。
具体实施方式
实施例1标志物的时间依赖性检测
DILI动物模型的建立：正常组动物为SPF级雄性SD大鼠，体重250g±20g，直接给予等体积5％CMC-Na溶液。化学药物(对乙酰氨基酚)所致肝损伤动物模型：雄性SPF级SD大鼠，给药剂量高剂量组(1600mg/kg体重)；中草药(黄药子，水提取物)所致肝损伤动物模型：雄性SPF级SD大鼠，给药剂量分高剂量组(70g/kg体重)(剂量以生药量计算)。两种药物均溶于5％CMC-Na溶液。
研究样本的获取：标志物的时间依赖性分析中，分别在给药后3小时、6小时和12小时收集血液和肝脏组织样本。动物由股动脉(大量)或眼眶静脉丛(小量)采血，分离血清/血浆，进行血液生化学指标(ALT和AST)的检测；肝脏组织在动物处死后立即放入10％中性福马林为固定液固定，制作的切片经H.E.染色后进行常规病理学检查。
应用本发明中的检测试剂盒进行血清/血浆miRNA标志物miR-122、miR-192和miR-193的检测：
(1)总RNA提取：(1)取100μl待检样本，加入300μlDEPC H2O混匀；(2)相分离：加入200μl苯酚(pH4.7-5.5酸性酚)，混匀后再加入200μl氯仿，混匀后离心(12,000g×15min，室温)；(3)RNA沉淀：取上清，加入2倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积的醋酸钠(pH 5.23M)，-20度，沉淀60min后离心(12,000g×20min，4℃)；(4)RNA洗涤：弃去上清，加入75％乙醇1ml洗涤RNA沉淀，离心(12,000g×10min，4℃)。(5)RNA溶解：弃去上清，加入20μl DEPC H2O溶解RNA。
(2)RT-PCR：通过对总RNA样本进行特定miRNA的逆转录得到cDNA。(1)探针法：逆转录反应体系包括2μl 5×缓冲液，1μl 100mM的dNTP混合物，0.5μlAMV逆转录酶，1μl待检测miRNA的逆转录引物，2μl总RNA样本，DEPC H2O补足至10μl。PCR反应程序为16℃×30min，42℃×30min，85℃×5min。(2)染料法：逆转录反应体系包括2μl 5×缓冲液，1μl 100mM的dNTP混合物，0.5μlAMV逆转录酶，1μl待检测miRNA的50μM特异性下游引物，2μl总RNA样本，DEPC H2O补足至10μl。PCR反应程序为16℃×15min，42℃×60min，85℃×5min。
(3)Real-time PCR：(1)探针法：将上述cDNA样本加入如下反应体系：1μl cDNA、0.3μl Taq酶、0.33μl TaqMan探针、1.2μl25mM MgCl2、0.4μl 2.5mM dNTP混合物、2μl10×PCR缓冲液，DEPC H2O补足至20μl。各种待检miRNA分别按上述配方配制Real-time PCR反应体系后分别测定，不同miRNA使用相对应的探针。Real-time PCR反应程序为95℃×5min后进行40个循环的95℃×15sec，60℃×1min。(2)染料法：1μl cDNA、0.3μl Taq酶、1μl 20×Eva Green、0.5μl 50μM的miRNA特异性上游引物、0.5μl 50μM的通用下游引物(URP)、1.2μl 25mM MgCl2、0.4μl 2.5mM dNTP混合物、2μl10×PCR缓冲液，DEPC H2O补足至20μl。各种待检miRNA分别按上述配方配制Real-time PCR反应体系后分别测定，不同miRNA使用相对应的引物。Real-time PCR反应程序为95℃×5min后进行40个循环的95℃×15sec，60℃×1min。
(4)数据分析：将荧光定量PCR检测得到的某血清/血浆miRNA的CT值代入该miRNA的标准曲线方程，得到该血清/血浆miRNA的浓度，再和正常组的血清/血浆miRNA浓度比较，得到检测组和正常组之间的血清/血浆miRNA平均表达水平的差异表达倍数；或者对荧光定量PCR检测得到的某血清/血浆miRNA的CT值以2-ΔCT法进行数据分析，其中，ΔCT＝CT检测组-CT正常组，检测组和正常组之间的miRNA平均表达水平的差异倍数即为2-ΔCT。采用student-t检验比较各个实验组和正常组之间miRNA平均表达水平的差异程度。其中，miRNA的标准曲线方程的方程通过以下实验方法获得：以不同浓度人工合成的miR-122、miR-192和miR-193成熟体作为标准品绘制标准曲线，从而对血清/血浆miRNA进行绝对定量，获得其浓度。人工合成的miRNA原液逆用DEPC水分别稀释成107，106，105，104和103fmol/L的浓度，逆转录PCR制备cDNA和荧光定量PCR检测的条件与上述血清中miRNA的条件一致。根据miR-122、miR-192和miR-193成熟体的标准品浓度和每个浓度对应的CT值绘制标准曲线：CT值是荧光定量PCR检测所得，R代表pearson相关系数，根据所得的线性方程以及待检血清中相对应的miRNA所测得的CT值，可以计算得到该血清/血浆miRNA的绝对含量(见图1)。
检测结果表明：对于药源性肝损伤，血清/血浆miR-122、miR-192和miR-193的检测结果具有良好的时间依赖性，其敏感程度大于传统的血液生化学指标(ALT和AST)，且与病理学检查结果保持高度关联性(见图2)。
实施例2标志物的剂量依赖性检测
DILI动物模型的建立：正常组动物为SPF级雄性SD大鼠，体重250g±20g，直接给予等体积5％CMC-Na溶液。化学药物(对乙酰氨基酚)所致肝损伤动物模型：雄性SPF级SD大鼠，给药剂量高剂量组(1600mg/kg体重)、中剂量组(800mg/kg体重)和低剂量组(400mg/kg体重)；中草药(黄药子，水提取物)所致肝损伤动物模型：雄性SPF级SD大鼠，给药剂量分高剂量组(70g/kg体重)、中剂量组(35g/kg体重)和低剂量组(18g/kg体重)(剂量以生药量计算)。两种药物均溶于5％CMC-Na溶液。
研究样本的获取：标志物的剂量依赖性分析中，按高、中和低三个剂量组在给药后24小时收集血液和肝脏组织样本。动物由股动脉(大量)或眼眶静脉丛(小量)采血，分离血清/血浆，进行血液生化学指标(ALT和AST)的检测；肝脏组织在动物处死后立即放入10％中性福马林为固定液固定，制作的切片经H.E.染色后进行常规病理学检查。
应用本发明中的检测试剂盒进行血清/血浆miRNA标志物miR-122、miR-192和miR-193的检测：
(1)总RNA提取：(1)取100μl待检样本，加入300μl DEPC H2O混匀；(2)相分离：加入200μl苯酚(pH 4.7-5.5酸性酚)，混匀后再加入200μl氯仿，混匀后离心(12,000g×15min，室温)；(3)RNA沉淀：取上清，加入2倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积的醋酸钠(pH 5.23M)，-20度，沉淀60min后离心(12,000g×20min，4℃)；(4)RNA洗涤：弃去上清，加入75％乙醇1ml洗涤RNA沉淀，离心(12,000g×10min，4℃)。(5)RNA溶解：弃去上清，加入20μl DEPC H2O溶解RNA。
(2)RT-PCR：通过对总RNA样本进行特定miRNA的逆转录得到cDNA。(1)探针法：逆转录反应体系包括2μl 5×缓冲液，1μl 100mM的dNTP混合物，0.5μlAMV逆转录酶，1μl待检测miRNA的逆转录引物，2μl总RNA样本，DEPC H2O补足至10μl。PCR反应程序为16℃×30min，42℃×30min，85℃×5min。(2)染料法：逆转录反应体系包括2μl 5×缓冲液，1μl 100mM的dNTP混合物，0.5μl AMV逆转录酶，1μl待检测miRNA的50μM特异性下游引物，2μl总RNA样本，DEPC H2O补足至10μl。PCR反应程序为16℃×15min，42℃×60min，85℃×5min。
(3)Real-time PCR：(1)探针法：将上述cDNA样本加入如下反应体系：1μl cDNA、0.3μl Taq酶、0.33μl TaqMan探针、1.2μl 25mM MgCl2、0.4μl 2.5mM dNTP混合物、2μl10×PCR缓冲液，DEPC H2O补足至20μl。各种待检miRNA分别按上述配方配制Real-time PCR反应体系后分别测定，不同miRNA使用相对应的探针。Real-time PCR反应程序为95℃×5min后进行40个循环的95℃×15sec，60℃×1min。(2)染料法：1μl cDNA、0.3μl Taq酶、1μl 20×Eva Green、0.5μl 50μM的miRNA特异性上游引物、0.5μl 50μM的通用下游引物(URP)、1.2μl 25mM MgCl2、0.4μl 2.5mM dNTP混合物、2μl10×PCR缓冲液，DEPC H2O补足至20μl。各种待检miRNA分别按上述配方配制Real-time PCR反应体系后分别测定，不同miRNA使用相对应的引物。Real-time PCR反应程序为95℃×5min后进行40个循环的95℃×15sec，60℃×1min。
(4)数据分析：将荧光定量PCR检测得到的某血清/血浆miRNA的CT值代入该miRNA的标准曲线方程，得到该血清/血浆miRNA的浓度，再和正常组的血清/血浆miRNA浓度比较，得到检测组和正常组之间的血清/血浆miRNA平均表达水平的差异表达倍数；或者对荧光定量PCR检测得到的某血清/血浆miRNA的CT值以2-ΔCT法进行数据分析，其中，ΔCT＝CT检测组-CT正常组，检测组和正常组之间的miRNA平均表达水平的差异倍数即为2-ΔCT。采用student-t检验比较各个实验组和正常组之间miRNA平均表达水平的差异程度。其中，miRNA的标准曲线方程的方程通过以下实验方法获得：以不同浓度人工合成的miR-122、miR-192和miR-193成熟体作为标准品绘制标准曲线，从而对血清/血浆miRNA进行绝对定量，获得其浓度。人工合成的miRNA原液逆用DEPC水分别稀释成107，106，105，104和103fmol/L的浓度，逆转录PCR制备cDNA和荧光定量PCR检测的条件与上述血清中miRNA的条件一致。根据miR-122、miR-192和miR-193成熟体的标准品浓度和每个浓度对应的CT值绘制标准曲线：CT值是荧光定量PCR检测所得，R代表pearson相关系数，根据所得的线性方程以及待检血清中相对应的miRNA所测得的CT值，可以计算得到该血清/血浆miRNA的绝对含量(见图1)。
检测结果表明：对于药源性肝损伤，血清/血浆miR-122、miR-192和miR-193的检测结果具有良好的剂量依赖性，其敏感程度大于传统的血液生化学指标(ALT和AST)，且与病理学检查结果保持高度关联性(见图3)。
Figure ISA00000566063900011
Figure ISA00000566063900021
Figure ISA00000566063900041

Claims (9)

1.一种与药源性肝损伤相关的血清/血浆微小核糖核酸标志物组合，其特征在于该标志物组合包括以下微小核糖核酸中的一种或多种：miR-122、miR-192和miR-193。
2.权利要求1所述标志物组合在制备药源性肝损伤检测试剂盒中的应用。
3.一种用于检测权利要求1所述标志物的探针组合，其特征在于该探针组合包括以下探针中的一种或多种：miR-122的探针是SEQ ID No.1；miR-192的探针是SEQ ID No.2；miR-193的探针是SEQ ID No.3。
4.权利要求3所述探针组合在制备药源性肝损伤检测试剂盒中的应用。
5.一种用于检测权利要求1所述标志物的引物组合，其特征在于该引物组合包括以下引物中的一对或多对：miR-122的引物是SEQ ID No.4和SEQ ID No.5；miR-192的引物是SEQ ID No.6和SEQ ID No.7；miR-193的引物是SEQ ID No.8和SEQ ID No.9。
6.权利要求5所述引物组合在制备药源性肝损伤检测试剂盒中的应用。
7.一种药源性肝损伤检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括血清/血浆微小核糖核酸中miR-122、miR-192和miR-193的探针/引物组合。
8.根据权利要求7所述检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求3所述的探针组合和/或权利要求5所述的引物组合。
9.根据权利要求7或8所述检测试剂盒，其特征在于该试剂盒还可以包括PCR技术的常规试剂、标准品和域对照品。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111926073A (zh) * 2020-08-21 2020-11-13 山东农业大学 评估咖啡酸苯乙酯抗镉诱导肾损伤的miRNA及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009008720A9 (en) * 2007-07-06 2009-02-26 Konink Nl Akademie Van Wetensc Small rna molecules, precursors thereof, means and methods for detecting them, and uses thereof in typing samples
EP2133431A1 (en) * 2007-11-02 2009-12-16 Jiangsu Mingma Biotech CO., LTD Micrornas in serum/blood plasma and their uses
CN101921759A (zh) * 2010-09-08 2010-12-22 南京医科大学 一种与宫颈癌及其癌前病变相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009008720A9 (en) * 2007-07-06 2009-02-26 Konink Nl Akademie Van Wetensc Small rna molecules, precursors thereof, means and methods for detecting them, and uses thereof in typing samples
EP2133431A1 (en) * 2007-11-02 2009-12-16 Jiangsu Mingma Biotech CO., LTD Micrornas in serum/blood plasma and their uses
CN101921759A (zh) * 2010-09-08 2010-12-22 南京医科大学 一种与宫颈癌及其癌前病变相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAI WANG ET AL.: "Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury", 《PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA》 *
邹健等: "MicroRNA在人结肠癌干细胞中的表达谱", 《世界华人消化杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111926073A (zh) * 2020-08-21 2020-11-13 山东农业大学 评估咖啡酸苯乙酯抗镉诱导肾损伤的miRNA及其应用
CN111926073B (zh) * 2020-08-21 2022-08-26 山东农业大学 评估咖啡酸苯乙酯抗镉诱导肾损伤的miRNA及其应用

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