WO2006075772A1 - 乳製品及びその製造方法 - Google Patents

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milk
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seq
protein
protein deamidase
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PCT/JP2006/300574
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Tomohiro Kodera
Hiroyuki Nakagoshi
Noriko Miwa
Nami Nakamura
Hidehiko Wakabayashi
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Amano Enzyme Inc.
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    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
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    • C12Y305/01044—Protein-glutamine glutaminase (3.5.1.44)

Definitions

  • the present invention relates to a dairy product using a protein deamidase with a smooth texture and suppressed acidity and bitterness, and a method for producing the same.
  • Dairy products such as cheese and yogurt were ingredients that were previously unfamiliar to Japanese people, but in recent years they have been eaten due to their health and nutritional functions, and the variety of consumers Various types of dairy products are on the market to adapt to tastes.
  • Rennet koji a cheese curdling enzyme
  • a cheese curdling enzyme is well known for the use of enzymes in dairy products.
  • the method of using lance lanthaminase in cheese Japanese Patent Laid-open No. Hei 8- 1 7 3 0 3 2 And a method used for yogurt (Japanese Patent Laid-Open No. Hei 6- 1 9 7 6 8 8) is also known.
  • 2 00-0 50 8 8 7 describes a method for deamidating casein with protein deamidase to improve dispersibility and solubility
  • a method of adding a protein deaminase for the purpose of stopping the transdaltaminase reaction when producing a purine-like food by using transglutaminase on concentrated milk has been disclosed.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 1 — 2 1 8 5 9 milk caseinate and whey protein are deamidated by protein deamidase to improve foam characteristics, emulsification characteristics, and solubility patents. A method is disclosed.
  • 2000-025 0 4 60 discloses a method for improving foam properties and emulsification properties by deamidating ⁇ -lactoglobulin with a protein deamidase.
  • the dairy product having a smooth texture, sourness and bitterness, particularly a smooth texture and a sourness control.
  • Disclosure of the invention
  • the present invention provides a koji product that has a smooth texture and a suppressed acidity, and a method for producing the same, in order to respond to various consumer preferences.
  • the present inventors can solve the above problems by adding protein deamidase to raw milk and allowing it to act on milk proteins in the raw milk. As a result, the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows.
  • a method for producing a dairy product which comprises adding a protein deamidase to raw milk and causing it to act on milk protein in the raw milk.
  • the protein deamidase in the present invention directly acts on the amide group of the protein and has a deamidating action without cleaving the peptide bond and without irritating the protein.
  • action the kind is not specifically limited.
  • examples of such enzymes include the enzymes disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2 00-0 5 0 8 8 7 or Japanese Patent Application Laid-Open No. 2 0 0 1-2 1 8 5 0. It is not limited.
  • As the protein deamidase one prepared from a culture solution of a microorganism producing protein deamidase can be used. The microorganism used for the preparation of the protein deamidase is not particularly limited.
  • the target enzyme can be obtained by centrifuging the culture solution to remove the cells and then combining salting out, chromatography, and the like.
  • the microbial cell is crushed by pressure treatment, ultrasonic treatment, etc., and then separated and purified in the same manner as described above to obtain the target enzyme.
  • the enzyme may be pulverized by a drying method such as freeze drying or reduced pressure drying, and an appropriate excipient or drying aid may be used.
  • the activity of the protein deamidase of the present invention is measured by a method improved from the method described in JP-A-2000-50887, that is, the following method.
  • Reagent II solution (supplied with F-kit) Add supernatant 1 ⁇ ⁇ ⁇ and 0.1 M Triethanolamine buffer ( ⁇ 8.0) 190/1 to 100 ⁇ 1, and leave at room temperature for 5 minutes. Measure absorbance at 340 nm using ⁇ 1. Add 1.0 ⁇ l of reagent m (included with F-kit, glutamate dehydrogenase) to the remaining 200 ⁇ 1, and leave it at room temperature for another 20 minutes, then measure the absorbance of the remaining 200 1 at 340 nm. . The ammonia concentration in the reaction solution is obtained from a calibration curve that shows the relationship between the ammonia concentration and the change in absorbance (340 nm) created using the ammonia standard solution supplied with the F-kit.
  • Protein concentration is measured by Protein Atsey CBB BSA (Pierce) is used as a standard for measurement at a detection wavelength of 595 nm.
  • the raw milk refers to milk that can be consumed such as cow's milk, buffalo milk, goat milk, sheep milk, and horse milk. Also included are sterilized milk, milk prepared with components such as milk fat, diluted milk, concentrated milk, dried milk, skim milk powder, skim milk solution, and processed milk.
  • the dairy product in the present invention refers to a solid or gel food made from milk such as natural cheese, processed cheese, seto dart, stade yogurt, bavarois, minorex jelly, and pudding.
  • the method for adding protein deamidase to raw milk may be added to raw milk alone or together with other raw materials.
  • the reaction conditions of the protein deamidase (enzyme amount, reaction time, temperature, pH of the reaction solution, etc.) are not particularly limited, but the added amount is 0.:! To 500 units per 1 L of raw milk. Preferably, 0.:! To 100 Yuet is more preferable.
  • processed milk such as diluted milk, concentrated milk, dried milk, skim milk powder, etc., convert it to the volume of raw milk before processing. For example, in the case of skim milk powder obtained from 1 liter of raw milk, 0.:! To 500 units are preferred per 100 g of skim milk powder equivalent to 1 liter of raw milk, and .0.:!
  • the preferred reaction temperature is 5 to 80 ° C, more preferably 20 to 60 ° C, and the pH of the preferred reaction solution is 2 to 10, more preferably 4 to 8.
  • the preferred reaction time is 10 seconds to 48 hours, more preferably 10 minutes to 24 hours. Also, these conditions can be changed or adjusted as appropriate according to the purity of the enzyme used, the type of protein, the purity, and the like. After enzyme reaction, the enzyme is deactivated by heating, etc. The product may be manufactured or, like rennet, no special deactivation process is required. Protein deamidase is added to raw milk and allowed to act. Modified by deamidation.
  • the dairy products such as skim milk powder can be added to the manufacturing process of other dairy products such as cheese and yogurt.
  • the modified skim milk powder obtained by adding 0.05 unit, preferably 20 to 100 unit, preferably 20 to 100 unit per 100 g of skim milk powder is added to the raw milk. And can be manufactured with smoothness.
  • Example 1 The following examples further illustrate the present invention. The present invention is not limited in any way by this example. Example 1
  • Chryseobacterium-derived plotting noretaminase was used as the protein deamidase.
  • Proteolyticase derived from Chryseobac terium proteolyticui (EC. 3. 5. 1) The sequence of the gene has already been determined.
  • PCR is performed using the DNA having the sequence described above as a saddle type and the primers of the sequences shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and the pro-part of the plotting taminase is matured.
  • the region to be amplified was amplified.
  • This PCR fragment was inserted into the Smal site of pVC7 described in JP-A-9-07029 and introduced into a competent cell of coli JM109 (Takara Shuzo).
  • a strain carrying the plasmid in which the plotting glutaminase gene was cloned was obtained, and the plasmid was recovered.
  • the nucleotide sequence of the fragment cloned into this plasmid was determined and confirmed to match the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the sequence of the TorA gene including the TorA signal peptide derived from E. coli has already been determined (Mol. Microbiol. 11: 1169-1179 (1994)). With reference to this sequence, the primers shown in SEQ ID NO: 7 (5'-ATGAACAATMCGATCTCTTTCAGG-3 ') and SEQ ID NO: 8 (5 CCGGATCCTGG TCATGATTTCACCTG-3') were synthesized, and the conventional method (Saito, Miura's method [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)])).
  • the region encoding TorA and the region containing the signal sequence upstream of it are obtained by PCR. Amplified. PCR reaction was performed using Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo), and the reaction conditions were according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • the sequence of SEQ ID NO: 8 contains the recognition sequence for the restriction enzyme BamHI.
  • the DNA sequence encoding the signal sequence of ToRA is shown in SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: 10 The region encoding the promoter and signal peptide using the plasmid pPKSPTGl described in WO 0 1 _ 2 3 5 9 1 as a saddle and SEQ ID NO: 9 (5 AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3 '), SEQ ID NO: 10 (5 Amplification was carried out by PCR using a primer having the sequence shown as '-AAGAGATCGTTATTGTTCAT AGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAG-3'). The sequence of SEQ ID NO: 10 contains the sequence at the 5 ′ end of the gene encoding the TorA signal peptide.
  • Crossover PCR was performed with primers having sequences.
  • This crossover PCR product was digested with restriction enzymes Seal and BamHI, and then a DNA fragment of about 3.1 kbp was detected by agarose gel electrophoresis.
  • This DNA fragment was cut out from an agarose gel, recovered using EasyTrapVer. 2 (Takara Shuzo), and inserted into the Seal-BamHI site of plasmid pPK4 described in JP-A-9-3 2 27 74. To obtain plasmid pPKT-TorA. As a result of determining the base sequence of the gene sequence inserted into this plasmid, it was confirmed that the expected fusion gene was constructed.
  • a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11 (5'-GATTTCCTGGTTGCCGTTGGAATCCGCAGTCGCACGTCGCGGCG-3 ') is used to copy the promoter region of PS 2 and the TorA signal peptide.
  • the portion including the region to be ligated was amplified by PCR.
  • the sequence shown in SEQ ID NO: 11 has a 5 ′ terminal sequence of a region encoding a pro-structured protein deamidase.
  • primers having the sequences shown in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 12 (5'-GAT TCCAACGGCAACCAGGA-3 ') were used.
  • the region encoding the pro-structured plotting taminase was amplified by PCR.
  • these PCR products were mixed 1: 1, made into a saddle shape, and crossover PCR was performed using a primer having the sequences shown in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 9.
  • a fusion gene comprising a promoter region and a TorA signal sequence and a gene encoding a pro-structured protein glutaminase was amplified.
  • This PCR product was digested with restriction enzymes Seal and BamHI, and then subjected to agarose gel electrophoresis to detect a DNA fragment of about 3.1 kbp.
  • This DNA fragment was excised from an agarose genome, recovered using EasyTrapVer. 2 (Takara Shuzo), and inserted into the seal-BamHI site of plasmid pPK4 described in JP-A-9-3 2 27 74. De pPKT-PPG was obtained. The nucleotide sequence of the inserted sequence in the plasmid was determined, and it was confirmed that the expected fusion gene was produced.
  • the amino acid sequence of the minase is shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence of the TorA signal peptide is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the C-terminal sequence “QTNK” of the pro sequence was changed to “FGPK” so that the pro-sequence was cleaved so that it had the same sequence as the N-terminal sequence of the natural plotting rutaminase.
  • SEQ ID NO: 1 3 (5'-CTT GGG GCC GAA GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG-3 ') and SEQ ID NO: 4 (5'-TTC GGC CCC AAG TTG GCG TCC GTC ATT CCA A primer having the sequence shown in GAT-3) was used.
  • the sequence of SEQ ID NO: 13 is a primer for amplifying the prosequence portion
  • the sequence of SEQ ID NO: 14 is a primer for amplifying the mature portion.
  • pUCPPG pUCPPG
  • FGPK pUC18 site
  • the pro sequence was altered.
  • the pPKT-PPG (FGPK) was constructed by ligating the ail l- ⁇ fragment (large) of pPKT-PPG and the aill-siPI fragment (small) of pUCPPG (FGPK).
  • C. ATCC13869 was transformed and a strain grown on a CM 2 G agar medium containing 2 S mg Z 1 kanamycin was selected. The selected strain is 30 in MM liquid medium containing 2 S mg / 1 kanamycin. Incubated for 48 hours.
  • C. Filtration supernatant (0.45 wm) of Wi / ia / w'ct / yat culture supernatant was filtered, and the filtrate was concentrated using an ultrafiltration membrane (excluding molecular weight of 10,000 or less). .
  • Non-fat dry milk (low heat; all dairy products) 40 g was suspended in 800 ml of distilled water, and the protein deaminase purified product (100 units / mg) prepared by the method described in Example 1 was 0.2 per lg of non-fat dry milk. , 1 unit (20 units per 100 liters of raw material milk, 100 units) added and reacted at 40 ° C for 2.5 hours, then heat deactivation treatment (65 ° C, 30 min in; increase temperature to 1 hr) and lyophilized to prepare modified skim milk powder. Compare this modified skim milk powder with raw milk: ⁇ 5% was added, and yogurt was prepared in the same manner as in Example 2. 0.
  • 2UZg is a condition under which G 1 n in skim milk is slightly deamidated
  • lUZg is a condition under which about 50% of G l n that can be deamidated is deamidated.
  • non-modified milk powder was used as a control.
  • Homogenized non-fat milk preheated to 60 ° C, 30 kgf / cm 2 ), sterilized (75 ° C, 15 seconds), then dispensed 25 L of raw milk cooled to 31 ° C into a pan , Lactic acid bacteria starter (CHN—01: mixed with 4 types)shrimp (1.4% milk), 2 to 10 units of protein deamidase purified product (100 units Zmg) per liter of raw milk Added and left for 1 hour. Furthermore, 0.01% Ca C12 and 0.009% rennet were added, and after 1 hour curd was confirmed and cutting was performed (acidity 0.130 at cutting, temperature 31 ° C).
  • the 1 to 3 amount of whey was removed, and the mixture was lightly stirred with hot water and heated (35 ° C), allowed to stand (about 20 minutes), and then the 1 to 3 amount of whey was excluded.
  • hot water was gradually added and the temperature reached 38 ° C, the temperature was maintained and the mixture was gently stirred for 1 hr. After that, the bat was pressed for about 30 minutes at 38 ° C, and the molding and cheese curd were reversed. After 30 minutes of pre-squeeze (3 kg / cm 2 ), it was inverted and fully squeezed (5 kg cm 2 ).
  • the present invention it is possible to produce a dairy product that has a smooth texture and has reduced acidity and bitterness, and can improve the curd yield in the production of cheese. Very useful in the field.

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Abstract

　本出願には、原料乳に、タンパク質脱アミド酵素を添加し、該原料乳中の乳タンパク質に作用させることにより、消費者の多様な嗜好性に対応するために、食感が滑らかで酸味、苦味の抑制された乳製品及びその製造方法が開示されている。

Description

乳製品及びその製造方法 技術分野
本発明はタンパク質脱アミ ド酵素を用いた食感がなめらかで酸味、 苦味の抑制さ れた乳製品及びその製造方法に関するものである。
明
背景技術
チーズ、 ヨーグルト等の乳製品は、 かって書は日本人にとって馴染みの薄い食材 であったが、 近年では、 その健康栄養上の機能より、 喫食されるようになってき ており、 消費者の多様な嗜好に適応するべく様々な種類の乳製品が上市されてい る。
乳製品への酵素の利用については、 チーズの凝乳酵素であるレンネッ卜がよく 知られているが、 卜ランスダルタミナーゼをチーズに利用する方法 （特開平 8— 1 7 3 0 3 2号公報） やヨーグルトに利用する方法 （特開平 6— 1 9 7 6 8 8号 公報） も知られている。 タンパク質脱アミ ド酵素の利用については、 特開 2 0 0 0 - 5 0 8 8 7号公報には、 タンパク質脱アミ ド酵素によりカゼインを脱アミ ド 化し、 分散性、 溶解性を向上する方法、 濃縮牛乳にトランスグルタミナ一ゼを作 用させてプリン様食品を製造する際にトランスダルタミナーゼ反応を停止させる 目的でタンパク質脱アミ ド酵素を添加する方法が開示されている。 特開 2 0 0 1 — 2 1 8 5 9 0号公報には、 タンパク質脱アミ ド酵素により乳カゼイネ一ト、 乳 清蛋白質を脱アミ ド化し、 泡沫特性、 乳化特性、 溶解性特許を向上させる方法が 開示されている。 特開 2 0 0 3— 2 5 0 4 6 0号公報には、 タンパク質脱アミ ド 酵素により、 β—ラク 卜グロブリンを脱アミ ドィヒし、 泡沫特性、 乳化特性を向上 させる方法が開示されている。 しかし、 これらの特許文献には、 本発明の食感が なめらかで、 酸味、 苦味の抑制された乳製品、 特に食感がなめらかで、 酸味の抑 制されたチーズ、 ヨーグルトを得る方法について記載されていない。 発明の開示
本発明は、 消費者の多様な嗜好性に対応するために、 食感が滑らかで酸味の抑 制された轧製品及びそれらの製造方法を提供するものである。
本発明者らは、 上記の課題に鑑み鋭意研究を行った結果、 原料乳に、 タンパク質 脱アミ ド酵素を添カ卩し、 該原料乳中の乳タンパク質に作用させることにより上記 課題を解決できることを見出し、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明 は以下の通りである。
1 . 原料乳に、 タンパク質脱アミ ド酵素を添加し、 該原料乳中の乳タンパク質 に作用させることを特徴とする乳製品の製造方法。
2 . 乳製品がチーズ又はヨーグルトであることを特徴とする前記 1記載の方法
3 . タンパク質脱アミ ド酵素の添加量が、 原料乳 1 Lに対して 0 . 1〜5 0 0 ユニットであることを特徴とする前記 1又は 2記載の方法。
4 . 前記 1〜 3のいずれかに記載の方法により得られたことを特徴とする乳製
P
PPo
本発明におけるタンパク質脱アミ ド酵素は、 タンパク質のアミ ド基に直接作用 してべプチド結合の切断及びタンパク質の架橘を伴わず脱アミ ドする作用を有す る。 当該作用を有する限りにおいてその種類は特に限定されるものではない。 こ の様な酵素の例として、 特開 2 0 0 0— 5 0 8 8 7号公報或いは特開 2 0 0 1 - 2 1 8 5 0号公報に開示された酵素があるが、 これらに特に限定されるものでは ない。 タンパク質脱アミ ド酵素は、 タンパク質脱アミ ド酵素を産生する微生物の 培養液より調製したものを用いることができる。 タンパク質脱アミ ド酵素の調製 に用いられる微生物は特に限定されない。
微生物の培養液からのタンパク質脱アミド酵素の調製方法については、 公知の タンパク質分離、 精製方法 （遠心分離、 U F濃縮、 塩析、 イオン交換榭脂等を用 いた各種クロマトグラフィー等） を用いることができる。 例えば、 培養液を遠心 分離して菌体を除去し、 その後塩析、 クロマトグラフィー等を組み合わせて目的 の酵素を得ることができる。 菌体内から酵素を回収する場合には、 例えば菌体を 加圧処理、 超音波処理などによって破砕した後、 上記と同様に分離、 精製を行う ことにより目的の酵素を取得することができる。 尚、 ろ過、 遠心処理などによつ て予め培養液から菌体を回収した後、 上記一連の工程 （菌体の破碎、 分離、 精製 ) を行ってもよい。 酵素は凍結乾燥、 減圧乾燥等の乾燥法により粉末化してもよ いし、 その際に適当な賦形剤、 乾燥助剤を用いてもよい。
本発明のタンパク質脱ァミ ド酵素の活性は、 特開 2000— 50887号公報 記載の方法を改良した方法、 すなわち、 下記の方法で測定する。
( 1 ) 3 OmM Z-Gln- Glyを含む 176mMリン酸バッファ一 （pH6. 5) 1 00 μ 1にタンパク質脱アミ ド酵素を含む水溶液 10 β 1を添加して、 37°Cで 10分間インキュベートした後、 12%丁。 溶液100 1を加えて反応を停 止させる。
(2) このとき、 酵素濃度が 0. 05mgZm 1 となるように 2 OmMリン酸バ ッファー （pH6. 0) で適宜希釈し、 遠心分離 （ 12000 r p m、 4 °C、 5 分間） 後、 上清について F- kitアンモニア （Roche製） による NH3の定量を行う
( 3 ) 試薬 II液 （F-kit付属品） 100 μ 1に上清 Ι Ο μ Ιと 0. 1Mトリエタ ノールァミンバッファー （ρΗ8. 0) 190/ 1を加え、 室温で 5分間放置 後 100 μ 1を用いての 340 nmの吸光度を測定する。 残りの 200 μ 1に、 1. 0 μ 1の試薬 m (F- kit付属、 グルタメートデヒ ドロゲナーゼ） を加えた後 、 更に 20分間室温に放置した後に残り 200 1の 340 n mの吸光度を測定 する。 F- kit に付属のアンモニア標準液を用いて作成したアンモニア濃度と吸 光度 （340 nm) の変化量の関係を表す検量線より、 反応液中のアンモニア濃 度を求める。
(4) タンパク質濃度の測定は、 プロテインアツセィ CBB (クマシーブリリア ン卜ブルー） 溶液 （ナカライテスク製） を用い、 検出波長 595 nmで測定する Standardとして、 BSA (Pierce) を用いる。
(5) タンパク質脱アミ ド酵素の活性を以下の式により求める。 比活性 （UZmg) = (反応液中のアンモニア濃度 （； u mo l Zm l ) X反応 液量 （m l ) X酵素希釈率） ÷ (酵素量 （m l ) タン パク質濃度 （mgZm l ) X反応時間 （m i n) ) 本発明における原料乳とは牛乳、 水牛乳、 山羊乳、 羊乳、 馬乳等喫食可能な乳 を指す。 また、 殺菌された乳、 乳脂肪分等成分調整した乳、 希釈された乳、 濃縮 された乳、 乾燥された乳、 脱脂粉乳、 脱脂粉乳溶液、 加工乳もこれに含まれる。 本発明における乳製品とは、 ナチュラルチーズ、 プロセスチーズ、 セットョー ダルト、 スタ一ドヨーグルト、 ババロア、 ミノレクゼリー、 プリン等乳を原料とし た固形状、 ゲル状食品を指す。
原料乳へのタンパク質脱アミ ド酵素の添加方法は、 原料乳に単独であるいは他 の原料とともに添加すればよい。 タンパク質脱アミ ド酵素の反応条件 （酵素量、 反応の時間、 温度、 反応溶液の pHなど） は、 特に限定されないが、 添加量は原 料乳 1 Lに対して 0. ：!〜 500ユニットが好ましく、 0. ：!〜 100ユエット がより好ましい。 尚、 希釈された乳、 濃縮された乳、 乾燥された乳、 脱脂粉乳等 の加工乳を用いる場合は、 加工前の原料乳の容量に換算する。 例えば、 生乳 1 L から 100 g得られる脱脂粉乳の場合、 原料乳 1 Lに相当する脱脂粉乳 100 g 当り 0. ：!〜 500ユニットが好ましく、 .0. ：!〜 100ユニットがより好まし い。 好ましい反応温度は、 5〜80°C、 より好ましくは 20〜60°Cであり、 好 ましい反応溶液の pHは 2〜10、 より好ましくは 4〜8である。 好ましい反応 時間は 10秒〜 48時間、 より好ましくは 10分〜 24時間である。 また、 これ らの条件は、 使用する酵素の純度やタンパク質の種類、 純度などに応じて適宜変 更ないし調整することができる。 酵素反応後、 加温などにより酵素失活して乳製 品を製造しても良いし、 レンネッ卜と同様に特別な失活工程を行わなくても良い 原料乳へタンパク質脱アミ ド酵素の添加、 作用させて得られる、 脱アミ ド化に より改質された脱脂粉乳等の乳製品を、 チーズ、 ヨーグルト等他の乳製品の製造 工程にぉレ、て添加してもよレヽ。 例えば、 脱脂粉乳 1 0 0 g当り 0 . ：! 〜 5 0 0ュ ニット、 好ましくは 2 0〜 1 0 0ュニット添加して得られる改質脱脂粉乳を生乳 に対し 1〜 5 %添カ卩して滑らかさの付与されたョ一ダルトを製造することができ る。 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げ、 本発明をさらに詳しく説明する。 本発明は、 この実施例 により何ら限定されない。 実施例 1
本実施例では、 タンパク質脱アミ ド酵素として、 Chryseobacterium由来のプロ ティングノレタミナーゼを使用した。 Chryseobac terium proteolyticui 由来プロ ティングルタミナーゼ （EC. 3. 5. 1) 遺伝子の配列はすでに決定されている i£ur.
J. Biochem. 268. 1410-1421 (2001) ] 。 この配列を参考にして、 Corynebacter ium gJutamicwnにお 、て使用頻度の高いコドンへの変換を行レ、配列番号 1に示し た遺伝子配列を構築した。 この配列はプロティングルタミナーゼのシグナル配列
(プレ部分） とプロ部分および成熟型プロティングルタミナ一ゼをコ一ドする領 域を含んでいる。 この全遺伝子配列を合成により作製した。 構築した配列番号 1 の遺伝子配列情報に基づいて、 配列番号 5 (5'- CATGAAGMCCTTTTCCTGTC- 3') と配 列番号 6 (5'-GTAAAAGGATCCATTAATTAAAATCC-3') に示した配列のプライマーを合 成した。 配列番号 5に示したプライマーはプロティングルタミナーゼのシグナル 配列の N末端配列を含んでおり、 配列番号 6に示したプライマーは成熟型プロテ ィングルタミナーゼの C末端と BamHIの認識配列を含んでいる。 配列番号 1に示 した配列を有する D N Aを銪型として配列番号 5と配列番号 6に示した配列のプ ライマーを用いて P C Rを行い、 プロティングルタミナーゼのプロ部分おょぴ成 熟型プロティングルタミナ一ゼをコ一ドする領域を増幅した。 この P C R断片を 特開平 9— 0 7 0 2 9 1号公報記載の pVC7の Smal部位に揷入した後^ coli JM10 9のコンビテントセル （宝酒造社製） に導入した。 プロティングルタミナーゼ遺 伝子がクローン化されたプラスミ ドを保持する菌株を取得し、 プラスミ ドを回収 した。 このプラスミ ドにクローン化された断片の塩基配列を決定し、 配列番号 1 に示した配列と一致することを確認した。
大腸菌に由来する TorAシグナルぺプチドを含む TorA遺伝子の配列は既に決定さ れている (Mol. Microbiol. 11 : 1169 - 1179 (1994) ) 。 この配列を参考にして、 配列番号 7 (5'- ATGAACAATMCGATCTCTTTCAGG - 3') と配列番号 8 (5 CCGGATCCTGG TCATGATTTCACCTG-3') に示したプライマーを合成し、 常法 （斉藤、 三浦の方法 [ Biochim. Biophys. Acta, 72， 619 (1963) ] ) に従って調製した大腸菌 W 3 1 1 0株の染色体 D N Aを铸型として、 TorAをコードする領域およびその上流にある シグナル配列を含む領域を P C R法にて増幅した。 P C R反応は Pyrobest DNA p olymerase (宝酒造社製） を用い、 反応条件は業者の推奨するプロトコルに従つ て行った。 なお、 配列番号 8の配列は制限酵素 BamHIの認識配列を含んでいる。 T orAのシグナル配列をコ一ドする D N A配列を配列番号 3に示す。
国際公開パンフレツ ト WO 0 1 _ 2 3 5 9 1記載のプラスミ ド pPKSPTGlを踌型 としてプロモータ一およびシグナルペプチドをコードする領域を、 配列番号 9 ( 5 AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG- 3') 、 配列番号 1 0 (5'- AAGAGATCGTTATTGTTCAT AGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAG-3') に示す配列を有するプライマーを用いて P C Rを 行うことにより増幅した。 配列番号 1 0の配列は、 TorAシグナルぺプチドをコ一 ドする遺伝子の 5 ' 末端の配列を含んでいる。 次にこの P C R産物、 並びに、 配 列番号 7と配列番号 8に示す配列を有するプライマーにより増幅された TorAをコ 一ドする遺伝子配列およびその上流にあるシグナル配列を含む領域を含む P C R 産物とを 1 ： 1で混合し、 これらを铸型とし、 配列番号 8と配列番号 9に示した 配列を有するプライマーによりクロスオーバー P C Rを実施した。 これにより P S 2プロモータ一領域を含む配列、 TorAシグナル配列、 および TorAをコ一ドする 配列を含む融合遺伝子が増幅された。 このクロスオーバー P C R産物を制限酵素 Sealおよび BamHIにて消化した後、 ァガロースゲル電気泳動により約 3 . 1 k b pの D NA断片を検出した。 この D N A断片をァガロースゲルより切り出し、 Ea syTrapVer. 2 (宝酒造社製） を用いて回収し、 特開平 9— 3 2 2 7 7 4号公報記 載のプラスミ ド pPK4の Seal- BamHI部位に揷入してプラスミ ド pPKT-TorAを得た。 このプラスミ ドに挿入された遺伝子配列の塩基配列を決定した結果、 予想される 融合遺伝子が構築されていることが確認された。 このプラスミ ドを铸型とし、 配 列番号 9と配列番号 1 1 (5' - GATTTCCTGGTTGCCGTTGGAATCCGCAGTCGCACGTCGCGGCG- 3') に示す配列を有すプライマーを用いて、 P S 2のプロモーター領域および To rAシグナルぺプチドをコ一ドする領域を含む部分を P C Rにより増幅した。 なお 、 配列番号 1 1に示した配列は、 プロ構造つきタンパク質脱アミ ド酵素をコード する領域の 5 ' 末端の配列を持っている。 次に、 タンパク質脱アミ ド酵素がクロ —ン化されているプラスミ ドを踌型として、 配列番号 6と配列番号 1 2 (5'-GAT TCCAACGGCAACCAGGA-3') に示す配列を有するプライマーを用いた P C Rにより、 プロ構造付きプロティングルタミナーゼをコードする領域を増幅した。 更に、 こ れらの P C R産物を 1 ： 1で混合し、 それらを铸型とし、 配列番号 6と配列番号 9に示す配列を有するプライマ一を用いてクロスオーバー P C Rを実施すること により、 P S 2プロモーター領域および TorAシグナル配列とプロ構造つきプロテ イングルタミナーゼをコードする遺伝子との融合遺伝子を増幅した。 この P C R 産物を制限酵素 Sealおよび BamHIにて消化した後、 ァガロースゲル電気泳動を実 施し、 約 3 . 1 k b pの D N A断片を検出した。 この D N A断片をァガロースゲ ノレより切り出し、 EasyTrapVer. 2 (宝酒造社製） を用いて回収し、 特開平 9— 3 2 2 7 7 4号公報記載のプラスミ ド pPK4の Seal- BamHI部位に挿入してプラスミ ド pPKT-PPGを得た。 プラスミ ド中の挿入配列の塩基配列を決定し、 予想される融合 遺伝子ができていることが確認された。 なお、 プロ構造付きのプロティングルタ ミナーゼのァミノ酸配列を配列番号 2に、 TorAシグナルぺプチドのァミノ酸配列 を配列番号 4に示す。 しかしながら、 天然型プロティングルタミナ一ゼのァミノ 酸配列のままで、 市販プロテア一ゼによる成熟化を行った場合に、 プロ配列が正 しく切断されないことが予想された。 そこで、 天然型プロティングルタミナ一ゼ の N末端配列と同じ配列にもつようにプロ配列の切断が行われるよう、 プロ配列 の C末端配列" QTNK" を" FGPK" に変更した。 " FGPK" への変更は、 配列番号 1 3 (5'- CTT GGG GCC GAA GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG- 3') と配列番号 1 4 (5 '-TTC GGC CCC AAG TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT- 3，） に示す配列を有するプラ イマ一を用いた。 配列番号 1 3の配列は、 プロ配列部分を増幅するためのプライ マー、 配列番号 1 4の配列は、 成熟体部分を増幅するためのプライマーである。 pPKT_PPGを錡型として、 配列番号 1 2と配列番号 1 3に示す配列を有するプライ マーを用いてプロティングルタミナーゼのプロ配列部分を、 配列番号 1 4と配列 番号 6に示す配列を有するプライマーを用いてプロティングルタミナーゼの成熟 体部分をそれぞれ増幅した。 さらに、 これらの P C R産物を 1 ： 1で混合し、 こ れらを铸型として配列番号 6と配列番号 1 2に示す配列を有するプライマーを用 いてクロスオーバ一 P C Rを実施することにより、 プロ配列 C末端が FGPKに変更 されたプロ構造付きプロティングルタミナーゼ遺伝子を増幅した。 このクロスォ —バ一 P C R産物を pUC18の サイ 卜にクローユングし （pUCPPG (FGPK) ) 、 塩基配列の確認を行ったところ、 pro配列が変更されていた。 次に、 pPKT - PPGの ail l- ίΡΙ断片 (大) と pUCPPG (FGPK) の aill - siPI断片 （小） を連結して、 p PKT-PPG (FGPK) を構築した。
構築したプラスミ ド pPKT- PPG (FGPK) を用いて、 C.
Figure imgf000009_0001
ATCC13869を 形質転換し、 2 S m g Z 1のカナマイシンを含む C M 2 G寒天培地で生育した菌 株を選択した。 選択した菌株を 2 S m g / 1のカナマイシンを含む MM液体培地 において 3 0。じで 4 8時間培養した。 C. Wi/ia/w'ct/yat咅養液の遠心上清をフィノレ ター （0 . 4 5 w m) 濾過し、 その濾液を限外濾過膜 （分子量 1万以下排除） を 用いて濃縮した。 5 O mMリン酸バッファー （p H 7 . 5 ) によりバッファ一交 換を行い、 トリプシンによりタンパク質脱アミ ド酵素のプロ構造部を切断し、 成 熟化を行った。 その後、 再び濃縮、 バッファー交換 （2 OmM酢酸バッファー、 pH5. 0) を行い、 その濃縮サンプルを陽イオン交換クロマトグラフィーに供 し、 タンパク質脱アミ ド酵素の活性画分を回収し、 酵素精製品とした。 前述の方 法に従い、 酵素精製品のタンパク質あたりの活性を測定したところ約 100〜1 40 U/m gであった。
脂肪分無調製牛乳をホモジナイズ （60°Cに予備加熱、 30 k g i'Zcm2) 、 殺菌 （72°C、 15秒） 後、 31°Cまで冷却した原料乳 25 Lを寸胴鍋に分注 し、 乳酸菌スターター （CHN— 01 ： 4種混合） 添加 （対乳 1%) し、 前記の タンパク質脱アミ ド酵素精製品 （100ユニット Zmg) を原料乳 1 L当り 2, 10, 50ユニット添カ卩した。 さらに Ca C l 2を 0. 01%、 レンネットを 0 . 003%添加し、 カッティングを行った （カッティング時 pH6. 2) 。 熱水 を入れながら軽く攪拌し加温 （32°C) 、 静置し、 pH5. 8に下がったところ でホエーを排除した。 さらに、 マツティング （設定温度 34°C、 pH5. 2まで ) 、 モールディング （30分毎に反転 2、 3回） を行い、 20°Cで 1晚放置した (pH5. 2) 。 その後、 125 g 個にカットし、 加塩 （飽和食塩水； 3分 浸漬） 、 乾燥 （3日間、 5°C) 、 真空包装し、 13°Cで熟成した。 モールディン グし一晩放置後のカード重量を測定することにより、 カード収率を算出した。 ま た、 1週間後のフレッシュチーズを官能評価した。 これらの結果を表 1に示す。 表 1に示したように、 原料乳にタンパク質脱アミ ド酵素を添加することにより 、 カード収率が向上し、 食感が滑らかで、 酸味の抑制されたチーズを製造するこ とができることが明らかになった。 表 1. フレッシュチーズのカード収量及び官能評価結果
Figure imgf000011_0002
土 ： コント口一ル、 +：增加
Figure imgf000011_0001
実施例 2
市販低温殺菌牛乳 800mLをジョツキに入れ、 湯浴中で攪拌しながら、 90 °C達温後、 48°Cまで冷却した。 スターター （ 「ダノン」 ヨーグルト） を 80m 1添加し 100 m 1づっ分注した。 実施例 1記載の方法で調製したタンパク質脱 アミ ド酵素精製品 （100ユニット Zmg) を牛乳 1 L当り 1, 5， 10, 50 , 100ユニット添加し、 よく攪拌後、 冷めないうちに約 2 OmLずつ容器に分 注した。 それらを 48°Cに設定したインキュベーターにいれ、 3〜4時間後、 ョ 一ダルトの pHが 4. 4-4. 5の幅に入った時点で、 冷蔵庫に入れ発酵を終了 した。 ー晚、 4°Cで冷蔵し、 翌日にテクスチャーアナライザーによる物性測定及 び官能評価を行った。 結果を表 2に示す。
表 2に示したように原料乳にタンパク質脱ァミ ド酵素を添加することにより、 食感が滑らかで、 酸味の抑制されたョーダルトを製造することができることが明 らかになつた。 同様に、 原料乳にタンパク質脱アミ ド酵素を 50°C90分作用さ せた後、 90°Cで 5分加熱失活させ、 その後、 スターターを加え、 38°Cで pH 4. 5まで発酵する方法においても、 食感が滑らかな、 特に食べ終わりに感じら れる滑らかさが良好なヨーグルトが得られた。 表 2. ヨーグルトの p H及び官能評価結果
Figure imgf000012_0001
土 ： コン卜ロール、 + ：増加、 一：減少 実施例 3
脱脂粉乳 （low heat；全酪連製） 40 gを 800mlの蒸留水に懸濁し、 実施 例 1記載の方法で調製したタンパク質脱アミ ド酵素精製品 （100ュニット /m g) を脱脂粉乳 l g当り 0. 2, 1ユニット （原料乳 1 L当りに換算すると 20 ユニット、 100ユニット） 添加し、 40 °Cで 2. 5時間反応させた後、 加熱失 活処理 （65°C、 30m i n ；昇温に 1 h r) 、 凍結乾燥を行い、 改質脱脂粉乳 を調製した。 この改質脱脂粉乳を生乳に对し、 ：！〜 5%添加し、 実施例 2と同様 の方法でヨーグルトを調製した。 0. 2UZgは脱脂粉乳中の G 1 nが僅かに脱 アミ ド化される条件、 lUZgは脱アミ ド化され得る G l nの約 50%が脱アミ ド化される条件である。 コントロールとして改質処理していない脱月旨粉乳を用い た。
各試料について官能評価を行ったところ、 酵素処理をしていない脱脂粉乳添カロ により、 ヨーグルトの固形分が上昇するため、 脱脂粉乳無添加と比較して食感が 改善され、 高級感が付与された。 一方、 0. 2 UZgのタンパク質脱アミ ド化酵 素で処理した脱脂粉乳を添加すると、 1%から滑らかさが付与され、 3%以上の 添加で明確な効果として判断できた。 lU/gの酵素処理脱脂粉乳の場合は 1% 添加から顕著な滑らかさの付与が確認され、 ヨーグルトの硬さも維持され、 好ま しさが明らかに上昇していた 実施例 4
脂肪分無調製牛乳をホモジナイズ （60°Cに予備加熱、 30 k g f /cm2) 、 殺菌 （75°C、 15秒） 後、 31°Cまで冷却した原料乳 25 Lを寸胴鍋に分注 し、 乳酸菌スターター （CHN— 01 ： 4種混合） 添カ卩し （対乳 1. 4%) 、 前 記のタンパク質脱アミ ド酵素精製品 （100ユニット Zmg) を原料乳 1 L当り 2, 10ユニット添加し 1時間放置した。 さらに Ca C 12を 0. 01%、 レン ネットを 0. 009%添加し、 1時間後に凝乳を確認しカッティングを行った （ カッティング時酸度 0. 130、 温度 31°C) 。 カッティング後、 1ノ3量のホ エーを排除し、 熱水を入れながら軽く攪拌し加温 （35°C) 、 静置し （約 20分 ) 、 更に 1ノ 3量のホエーを排除した。 徐々に熱水を添加し 38°Cに達したら、 温度を維持し 1 h r緩やかに攪拌した。 その後、 約 30分間、 38°Cでバット内 圧搾し、 モールディング、 チーズカード反転した。 30分間の予備圧搾 （3 k g /cm2) 後、 反転して本圧搾した （5 k gノ cm2) 。 その後、 水中にモール ドのまま沈めて冷却 （10°C、 ー晚） し、 加塩 （飽和食塩水； 4時間浸漬） 、 乾 燥 （10日間、 12°C) 、 真空包装し、 12 °Cで熟成して硬質チーズを製造した 。 チーズの評価はカード作成時と熟成後に実施した。 チーズカード製造時の評価 を表 3に、 6力、月熟成後の官能評価を表 4に記した。
表 4に示したように、 原料乳にタンパク質脱アミ ド酵素を添加することにより 、 食感が滑らかで、 酸味、 苦味の抑制された熟成チーズを製造することができる ことが明らかになった ズカード製造時の評価結果
Figure imgf000014_0001
土 ： コントロール、 + ：増加、 一：減少 表 4 . チーズ力一ド 6か月熟成後の官能評価
Figure imgf000014_0002
土 ： コントロール、 +：増加、 一：減少 産業上の利用可能性
本発明によれば、 食感が滑らかで酸味、 苦味の抑制された乳製品を製造するこ とができ、 またチーズの製造においてはカード収率を向上させることができるの で、 本発明は食品分野において極めて有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 原料乳に、 タンパク質脱アミ ド酵素を添加し、 該原料乳中の乳タンパク質 に作用させることを特徴とする乳製品の製造方法。
2 . 乳製品がチーズ又はョーダル卜であることを特徴とする請求項 1記載の方 法。
3 . タンパク質脱ァミ ド酵素の添加量が、 原料乳 1 Lに対して 0 . 1〜 5 0 0 ユニットであることを特徴とする請求項 1又は 2記載の方法。
4 . 請求項 1〜 3のいずれかに記載の方法により得られたことを特徴とする乳 製品。
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