JP6785765B2

JP6785765B2 - 乳製品

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Publication number: JP6785765B2
Application number: JP2017527461A
Authority: JP
Inventors: 準季小笠原; 博文堀口
Original assignee: Godo Shusei KK
Current assignee: Godo Shusei KK
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2016-07-05
Publication date: 2020-11-18
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Description

本発明は、新食感の乳製品及びその製造方法に関する。

乳製品の中には、液状のものと固体状のものとがある。固体状の乳製品としては、チーズや発酵乳（ヨーグルト等）などが知られている。ヨーグルトは乳酸発酵の結果として固体状になる。一方チーズは、凝乳酵素であるレンネット（哺乳動物の胃で作られる酵素）のカゼインへの作用により固体状になる（特許文献１）。またレンネットとしては微生物由来、遺伝子組み換え体も知られている（特許文献１、２）。

特開２００４−３３０９３号公報特公平２−１８８３４号公報

しかしながら、レンネットで凝固した乳製品は苦味が生じるという問題がある。また、乳酸発酵によるヨーグルトは、その固さが十分でない場合が多く、流通時及び保存時の保形性を考慮して市販のヨーグルトには増粘剤やゲル化剤が配合されていることもある。
従って、一定の固さを有し、かつ風味の良好な新たな乳製品の開発が望まれている。

そこで本発明者は、レンネットに代わる新たな凝乳成分を見出すべく種々検討した結果、トリコデルマ属に属する微生物が産生すると予測され、アミノ酸配列が予測されているにすぎないタンパク質及びその類縁体が、優れた凝乳作用を有し、特に乳酸菌や酵母とともに発酵させて得られた発酵乳はチーズ様の固さを有し、かつ苦味を有さず風味も良好な乳製品となることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔８〕を提供するものである。

〔１〕カゼインを含有する乳由来原料と、配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質とを含有する乳製品。
〔２〕前記タンパク質が、トリコデルマ属に属する微生物に由来するタンパク質である〔１〕記載の乳製品。
〔３〕さらに乳酸菌又は酵母を含む〔１〕又は〔２〕記載の乳製品。
〔４〕発酵乳又はチーズである〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の乳製品。
〔５〕２バイト法における破断応力が５５００Pa以上であり、破断付着性が８００Ｊ／m³以上である〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の乳製品。
〔６〕増粘剤、安定剤、ゲル化剤及び糊料からなる凝固成分を実質的に含有しない〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の乳製品。
〔７〕カゼインを含有する乳由来原料に、配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質と、乳酸菌とを添加し、発酵させることを特徴とする乳製品の製造方法。
〔８〕配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質を含有する乳製品用凝乳剤。

本発明の乳製品は、チーズのような固さを有し、かつ風味も良好であり、新たな食感の乳製品として有用である。本発明で用いる特定のタンパク質と乳由来原料との反応条件を種々調整することによって、本発明乳製品の固さを、従来のヨーグルトよりも固く、従来のチーズよりも柔らかい範囲で製造することができる。

ＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来プロテアーゼ（配列番号１）の温度依存性を示す。ＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来プロテアーゼ（配列番号１）の温度安定性を示す。ＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来プロテアーゼ（配列番号１）のｐＨ安定性を示す。ＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来プロテアーゼ（配列番号１）のｐＨ依存性を示す。ｐＨ５．５における各酵素のカゼインに対する作用を示す。ｐＨ７．２におけるＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来プロテアーゼ（配列番号１）に対する作用を示す。ＧＯＤＯ−ＴＣＦによるｐＨ調整牛乳の凝固性を示す。上：加熱処理、中：ＧＯＤＯ−ＴＣＦ１％添加、下：ＧＯＤＯ−ＴＣＦ１０％添加。乳酸菌発酵中のヨーグルトにおけるｐＨの経時変化を示す。（矢印は、チューブを傾け表面が動かなくなった点）破断強度解析結果を示す。非破断条件でのテクスチャー解析結果を示す。破断条件でのテクスチャー解析結果を示す。

本発明の乳製品に用いられる配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質としては、トリコデルマ属（Trichoderma）に属する微生物由来のタンパク質が好ましい。より具体的には、Trichoderma reesei ＱＭ６ａ（ＮＣＢＩ記載の入手可能な菌）由来の機能未知の予測タンパク質（配列番号１で示されるアミノ酸配列と１００％同一）、Trichoderma reesei由来の市販セルラーゼＧＯＤＯ−ＴＣＦ中に含まれるタンパク質（配列番号１で示されるアミノ酸配列と１００％同一）、Trichoderma virens Ｇｖ２９−８（ＮＣＢＩ記載の入手可能な菌）由来の仮想タンパク質ＴＲＩＶＩＤＲＡＦＴ＿２１５８０１（配列番号１で示されるアミノ酸配列と９４％同一：配列番号２）、Trichoderma atroviride由来の液胞タンパク質Ａ（配列番号１で示されるアミノ酸配列と９２％同一：配列番号３）、Trichoderma aureoviride由来の液胞タンパク質（配列番号１で示されるアミノ酸配列と９３％同一）等が挙げられる。
より好ましいタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が９２％以上のタンパク質であり、さらに好ましくは前記同一性が９３％以上のタンパク質であり、さらに好ましくは前記同一性が９４％以上のタンパク質であり、さらに好ましくは前記同一性が９５％以上のタンパク質である。

本発明で用いられる前記タンパク質は、トリコデルマ属に属する微生物から抽出してもよく、遺伝子組み換え手法により製造してもよい。なお、当該タンパク質には、凝乳作用を有する限り、糖が結合したタンパク質も含まれる。

本発明で用いられる前記タンパク質は、カゼイン分解活性を有することから、プロテアーゼ活性を有する。また、カゼインのうち、κ−カゼインに対する分解活性が高く、α−カゼイン及びβ−カゼインに対する分解活性はκ−カゼインに対する分解活性よりも弱い。
前記タンパク質は、わずかな添加量で乳由来原料に含まれるκ−カゼインを分解する。これによって、α−カゼイン（分解物を含む）及びβ−カゼイン（分解物を含む）が凝集するため、乳製品の固さが増す。

前記タンパク質は、精製したものを用いてもよいし、前記タンパク質を含有する前記トリコデルマ属に属する微生物の培養物（培養液を含む）、培養物の抽出物等を用いることができる。例えば、前記セルラーゼＧＯＤＯ−ＴＣＦをそのまま用いてもよい。

本発明の乳製品に用いられるカゼインを含有する乳由来原料としては、カゼインを含有すればよく、例えば、牛乳、やぎ乳、羊乳、馬乳、母乳等の液状物及び粉状物が挙げられる。粉乳を使用する場合、水等に混合したものを用いればよい。なお、乳には、生乳、低脂肪牛乳、無脂肪牛乳、加工乳も含まれる。

本発明の乳製品に含まれる前記タンパク質の含有量は、凝乳活性を奏する量であればよい。凝乳活性を奏するか否かは、使用する乳由来原料の種類、当該乳由来原料に含まれるカゼインの量及び製造条件（反応時間、反応温度、反応ｐＨ等）等により変化する。このため、前記タンパク質の含有量は一概には言えないが、例えば、乳由来原料に添加するときにおける前記タンパク質の凝乳活性（カゼイン分解活性）を乳原料１００ｇあたり２０Ｕ〜３００Ｕの範囲にすると、従来にない乳製品の固さを得やすくなる。
カゼイン分解の有無は、得られた乳製品をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等により分析することで確認することができる。

本発明の乳製品に含まれる前記タンパク質の酸性プロテアーゼ活性は、乳原料１００ｇ中に３０００Ｕ以下であることが好ましい。
当該値を超えると、乳製品の風味が悪くなるおそれがある。

本発明の乳製品は、風味及び食感の点から、さらに乳酸菌又は酵母を含有するのが好ましい。前記タンパク質と乳酸菌を併用した乳製品は、従来の発酵乳に比べ固さが増すことから、本発明の乳製品は乳酸菌を含有するのがより好ましい。
ここで乳酸菌としては、ラクトバシラス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、リューコノストック属に属する乳酸菌を用いることができる。

本発明の乳製品中の乳酸菌の含有量は、特に限定されないが、１００万個／１ｍＬ以上が好ましく、５００万個／１ｍＬ以上がより好ましく、１０００万個／１ｍＬ以上がさらに好ましい。

また、本発明の乳製品は、必要に応じて、シロップ等の甘味料の他、それ以外の各種食品素材、例えば、各種糖質、乳化剤、各種ビタミン剤等の任意成分を配合することができる。具体的には、ショ糖、グルコース、フルクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース、麦芽糖等の糖質、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の糖アルコール、アスパルテーム、ソーマチン、スクラロース、アセスルファムＫ、ステビア等の高甘味度甘味料、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、クリーム、バター、サワークリーム等の乳脂肪、クエン酸、乳酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸等の酸味料、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ類等の各種ビタミン類、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガン等のミネラル分、各種フレーバー類を配合することができる。
本発明の乳製品は、前記タンパク質の凝乳作用により十分な固さを有するため、増粘剤、安定剤、ゲル化剤、糊料等の凝固成分を含有させる必要がなく、実質的に含有しないのが好ましい。

本発明の乳製品は、前記乳由来原料と前記タンパク質とを配合して凝乳させるか、あるいは前記乳由来原料と前記タンパク質と乳酸菌又は酵母とを配合し、通常の発酵食品の製造方法に従って製造することができる。発酵食品の製造方法としては、前記乳由来原料及び前記タンパク質を配合し、これに乳酸菌又は酵母を接種して培養し、これを均質化後、シロップ液等の任意成分、フレーバー等を添加する方法が挙げられる。

本発明により得られる乳製品は、増粘剤等を添加しないにもかかわらず、固形状のヨーグルト以上の固さを有するという特有の食感を有し、かつ苦味などがなく風味も良好である。かかる食感は、前記タンパク質による特有の効果である。
本発明乳製品の２バイト法における破断応力は５５００Pa以上であり、破断付着性は８００Ｊ／m³以上であるのが、食感の点で好ましく、さらに破断応力は５５００〜１２０００Paがより好ましく、破断付着性は８００〜１２００Ｊ／m³がより好ましい。

本発明乳製品の好ましい形態としては、発酵乳、チーズ、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイスが挙げられるが、発酵乳、チーズがより好ましい。さらに発酵乳としては、固形タイプのヨーグルトの形態が特に好ましい。

前記タンパク質は、カゼインに作用して凝乳作用を示すので乳製品用凝乳剤として有用である。

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

製造例１
（１）（ＧＯＤＯ−ＴＣＦからプロテアーゼの分離）
ＧＯＤＯ−ＴＣＦ（合同酒精株式会社製、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉＱＭ６ａの変異株）１００ｍＬを、ＵＦペンシル型モジュールＡＰＩ−００１３（分画分子量６０００）にて約５０ｍＬまで濃縮し、１５０ｍＬの２０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた。この手順を４回繰り返した。
得られた濃縮物を、２０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡化したＧｉｇａＣａｐＱ−６５０Ｍ（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）カラムに供し、０−０．５ＭＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出した凝乳活性を含む画分を回収した。回収した活性画分に終濃度が０．５Ｍとなるように硫酸アンモニウム（以下、ＡＳ）を加えた後、０．５ＭＡＳを含む２０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡化したＢｕｔｙｌ−６５０Ｍ（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）カラムに供し、０．５−０ＭＡＳのリニアグラジエントにより溶出した。その後、活性画分を回収し、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ^TM−３０Ｋ（分画分子量３０ｋＤａ）により濃縮後（４０００×ｇ、１２０分間）、０．１５ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡化したＨｉｐｒｅｐ１６／６０ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００ＨＲカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供し、活性画分を回収した。
当該活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、約３３ｋＤａに単一バンドを確認した。

（２）ＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来のプロテアーゼのアミノ酸配列決定
（１）に記載した精製工程のＢｕｔｙｌ−６５０Ｍカラムクロマトグラフィーにより溶出した活性化画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、約３３ｋＤａの目的酵素バンドを切り出した後、ペプチド断片の配列からＭａｓｃｏｔｓｅａｃｈプログラムによりＮＣＢＩｎｒデータベースよりアミノ酸配列の相同性が高かったｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ［ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉＱＭ６ａ］の遺伝子配列情報を取得した。取得した遺伝子情報を基に、ＰＣＲプライマー５‘−ｔａｃａａａｇａｇｇｃｔｇｇｔｔｃｃｔａｇｃｔｔｃｇｔｃ−３‘（Ｆｏｗａｒｄ：配列番号４）、５‘−ｔａｇｇａｃｔｇｔｃｔｔｃｃｇｃｔｃｔｃａａａｃｔｇｃ−３‘（Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号５）を設計し、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉＱＭ９４１４株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＥＸＴａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いて目的遺伝子の増幅を行った。増幅した約１６００ｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ＦａｓｔＧｅｎｅＧｅｌ／ＰＣＲＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ（日本ジェネティクス）を用いて精製し、ＤＮＡ配列情報を取得し、翻訳プログラムによりアミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列を配列番号１として示した。当該アミノ酸配列は、ＴｒｉｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉＱＭ６ａのアミノ酸配列と１００％一致した。

（３）ＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来プロテアーゼの諸特性
（方法）
（１）に記載した精製工程中の、Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍの活性溶出画分の酵素サンプルを使用した。温度依存性は、２０、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５℃でのキモシン活性を指標とした。キモシン活性測定は、国際標準法を一部改変した方法で行った。基質溶液はＬｏｗ−ｈｅａｔ，Ｌｏｗ−ｆａｔｓｐｒａｙｄｒｉｅｄｍｉｌｋｐｏｗｄｅｒを、１１ｇ／１００ｍＬの濃度で溶解し、ＣａＣｌ₂を終濃度が３ｍＭになるように添加したのち、１規定塩酸にてｐＨを５．５に調整した。測定温度にてプレインキュベートした酵素液０．１ｍＬに、同じくプレインキュベートした基質溶液５ｍＬを加え、泡立てないように撹拌した。その後、各温度で反応を行いながら、約１分おきに試験管を傾け、壁面に凝乳が付着するかを確認し、初めて付着する時間を測定した。測定値既知の標準品と同時に測定し、それぞれの凝乳時間を調べ、活性値を算出した。
温度安定性は、酵素液を４、２０、３０、４０、５０、６０、７０にて２時間インキュベートした後、１００ｍＭＭＥＳｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５，ｒ．ｔ．）にて２倍希釈後の残存したキモシン活性を前記した活性測定法に準じて測定した。
ｐＨ安定性は、酵素液をｐＨ３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．２、７．５、８．０、８．５、９．０の各Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ３．０〜６．０：０．２Ｍクエン酸−クエン酸Ｎａｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．０〜８．０：０．２Ｍリン酸−リン酸Ｎａｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．２〜９．０：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ）にて３倍希釈したものを、４℃で６時間静置した。その後、１００ｍＭＭＥＳｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５，ｒ．ｔ．）にて２倍希釈し、残存したキモシン活性を前記した活性測定法に準じて測定した。
ｐＨ依存性は、酸可溶性ペプチド遊離活性法により評価した。基質溶液は、ミルクカゼイン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）を１．２ｇ秤取し、蒸留水２０ｍＬと０．１ＭＴｒｉｓ溶液を２０ｍｌ加えて溶解させ、６０℃、１０分間沸騰浴中で加熱した。その後、５００ｍＭの各緩衝（ｐＨ３．０〜６．０：０．２Ｍクエン酸−クエン酸Ｎａｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．０〜８．０：０．２Ｍリン酸−リン酸Ｎａｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．２〜９．０：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ）を１００ｍＬ加え、１規定の塩酸または水酸化ナトリウムにて各ｐＨに調整後、蒸留水にて２００ｍＬにメスアップし、調製した。反応は、酵素液０．５ｍＬを５０℃で３分間プレインキュベートし、基質溶液を２．５ｍＬ加えてよく撹拌し、５０℃にて１０分間反応を行った。その後、トリクロロ酢酸を１．８ｇ、無水酢酸を１１．４５ｇ、酢酸を２１ｍＬ混合し、蒸留水にて１Ｌに調整した沈殿試薬を２．５ｍＬ加え、室温で５分程度放置した。その後、ＡＤＶＡＮＴＥＣＮｏ．４Ａろ紙にて濾過した濾液を、２７５ｎｍにおける吸光度を測定し、１分間に１μｇのチロシンに相当する酸可溶性低分子分解物を生じる酵素量を１単位とし、活性値を算出した。。

（結果）
（１）ＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来プロテアーゼ（配列番号１で示されるプロテアーゼ）の温度依存性を図１に、温度安定性を図２に、ｐＨ安定性を図３に、ｐＨ依存性を図４に示す。図１〜図４より、ＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来プロテアーゼは、６０℃付近で最大活性を示しｐＨ３．５〜６．５、６０℃まで８０％以上の残存活性を維持した。ｐＨ依存性では、キモシン活性の至滴ｐＨは５．５より酸性側にあると推察されるのに対し、酸可溶性ペプチド遊離活性はｐＨ６．５付近であることが分かる。

（２）ｐＨ５．５におけるＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来プロテアーゼのカゼインに対する作用と、レンネット中に含まれるキモシン及びペプシンのカゼインに対する作用を検討した。また、ｐＨ７．２におけるＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来のプロテアーゼのカゼインに対する作用を検討した。その結果を図５及び図６に示す。

その結果、ＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来プロテアーゼは、ｐＨ５．５ではκ−カゼインに特異性が高い（図５）が、ｐＨ７．２付近ではα，β−カゼインにも作用することが示唆された（図６）。キモシンはκ−カゼインに対して特異性が高く、ペプシンは全体的にバンドが薄くなっていることが確認できた。ＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来プロテアーゼとその他２つのプロテアーゼを比較すると、ＧＯＤＯ−ＴＣＦ凝乳プロテアーゼの特異性はκ−カゼイン＞α−カゼインであることが分かった。

実施例１
牛乳１０ｍＬに１０％乳酸にてｐＨを５．９に調整した。次いで、この牛乳１０ｍＬにＧＯＤＯ−ＴＣＦ０．１ｍＬ（１％）と滅菌水０．９ｍＬ、又は１ｍＬ（１０％）を添加し、４３℃で６０分静置した。一方、比較例としてＧＯＤＯ−ＴＣＦ中のプロテアーゼ活性を失活させるため、ＧＯＤＯ−ＴＣＦを蒸留水で４倍希釈後、１００℃１２０分加熱処理した。ｐＨを５．９に調整した牛乳に、希釈後加熱処理したＧＯＤＯ−ＴＣＦを０．４ｍＬ（希釈前換算で１％）と滅菌水を０．６ｍＬ添加した。

その結果を図７に示す。図７より、プロテアーゼが失活したＧＯＤＯ−ＴＣＦを添加した場合は、牛乳の凝固は生じなかったが、ＧＯＤＯ−ＴＣＦを１％及び１０％添加した牛乳は凝固した。

実施例２
牛乳１０ｇ（おいしい牛乳、明治乳業製）を１５ｍＬアシストチューブに量り取り、スキムミルク０．２ｇ（２％，ｗ／ｗ）を加えよく攪拌し溶解させ、沸騰水中にて５分間煮沸し、滅菌した。その後、冷却した牛乳を４３煮沸でプレインキュベートし、クリーンベンチ内で０．２μｍフィルターろ過滅菌したＴＣＦ０．１ｍＬ（１％，ｗ／ｖ）と、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水０．３ｍＬを無菌的に添加した。コントロールとして、ＭｉｌｌｉＱ水にて４倍希釈し、沸騰水中で２時間煮沸したＴＣＦ１．２ｍＬを添加したもの、および、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水１．２ｍＬを添加したものを作成した。その後、クリーンベンチ内でスターター（ブルガリアヨーグルト、明治乳牛製）０．５ｇ（５％，ｗ／ｗ）を各チューブに無菌的に添加し、２〜３回静かに転倒攪拌した。各サンプルについてそれぞれ７本作成し、スターター添加直後から６時間後まで１時間ごとに発酵を停止し、ｐＨを測定した。

その結果、図８より、加熱処理ＧＯＤＯ−ＴＣＦ（プロテアーゼ失活）およびＭｉｌｌｉＱ水添加の両コントロールでは牛乳中のカゼインタンパクの等電点（ｐｌ＝４．６）付近で凝固するのに対し、ＧＯＤＯ−ＴＣＦ添加の場合、ｐＨ５．９付近で凝固することがわかった。

実施例３
（方法）
牛乳５５．８ｇ（おいしい牛乳、明治乳業製）をジャム瓶（ジャム９０ＳＴ、東洋ガラス株式会社）に量り取り、スキムミルク１．２ｇ（２％，ｗ／ｗ）を加えよく攪拌し溶解させ、沸騰水中にて５分間煮沸し、滅菌した。その後、冷却した牛乳を４３℃でプレインキュベートし、クリーンベンチ内で孔径０．２μｍフィルターにてろ過滅菌したＧＯＤＯ−ＴＣＦ６ｍＬ（１％，ｗ／ｖ）を無菌的に添加した。Ｂｌａｎｋとして、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２，ｒ．ｔ．）を０．６ｍＬ（１％）添加した。その後、クリーンベンチ内でスターター（ブルガリアヨーグルト、明治乳業製）３ｇ（５％，ｗ／ｗ）を各チューブに無菌的に添加し、２〜３回静かに転倒攪拌し、４３℃にて４時間発酵を行った。発酵乳サンプルは、容器ごとテクスチャー分析に供した。
分析装置には、クリープメータＲＥ−３３００５Ｃ（山電）を用いた。破断強度解析は、治具Ｎｏ．３を用いて、４℃、アンプ倍率１０倍、格納ピッチ７５０、測定歪率６０％、測定速度１０ｍｍ／ｓｅｃ、サンプル厚さ自動測定の条件で測定した。非破断条件におけるテクスチャー解析は、Ｎｏ．３を用いて、４℃、アンプ倍率１０倍、格納ピッチ８７５、測定歪率５％、測定速度３ｍｍ／ｓｅｃ、戻り距離３０ｍｍサンプル厚さ自動測定の条件で測定した。破断条件におけるテクスチャー解析は、Ｎｏ．３を用いて、４℃、アンプ倍率１０倍、格納ピッチ８７５、測定歪率５０％、測定速度１０ｍｍ／ｓｅｃ、戻り距離３０ｍｍサンプル厚さ自動測定の条件で測定した。

＜テクスチャープロファイルから得られるデータ（２−バイト法）＞
硬さ（Ｈ）：負荷を与えた際の最大荷重。
半固形食品では治具断面積で割った応力になる。
脆さ（Ｂ）：圧縮時、一部的に破壊が起こった時のその果汁の落ち込み量。
粘着力（Ｃ）：圧縮後、戻りの引張時に粘着した最大負荷値。
半固形食品では治具断面積が考慮される。
付着性（Ａ３）：粘着性を持っている場合に引き離されにくいかどうかの量。
凝集性（Ａ２／Ａ１）：１ストローク目と２ストローク目の圧縮エネルギーの比、変形量。
弾力性（Ｔ２／Ｔ１）：最大ピークに至る変化量の１ストローク目と２ストローク目の比。
ガム性（硬さ×凝集性）：値が高いほど硬く、ゴム的であるといえる。
そしゃく性（硬さ×凝集性×弾力性）：値が高いほどそしゃくにエネルギーを要するといえる。

破断強度解析では、ＧＯＤＯ−ＴＣＦ添加サンプルは破断点が無添加サンプルと比べ破断加重が０．０３Ｎ増加し、破断歪率が４．４％減少した（図９，表１）。
非破断のテクスチャー解析では（図１０）、表面圧縮時の最大応力は（［１］、［３］）ＧＯＤＯ−ＴＣＦ添加サンプルが０．５Ｎ増加した。また、凝集性、付着性（［２］）に関してはＧＯＤＯ−ＴＣＦ添加サンプルでは減少していた。
破断のテクスチャー解析では（図１１）、ＧＯＤＯ−ＴＣＦ添加サンプルでは破断時の応力が増加した（［４］）。また、カード内部の破断応力を表す波形は（［５］、［７］）、ＧＯＤＯ−ＴＣＦ添加サンプルでは比較的なめらかであるのに対し、無添加サンプルでは破断点が数か所確認できた。さらに、凝集性、付着性では（［６］、［８］）ＧＯＤＯ−ＴＣＦ添加サンプルは無添加と比べ高かった。引き抜き時の付着性（［６］、［８］）の波形では、ＧＯＤＯ−ＴＣＦ添加サンプルはなめらかに引き抜かれるのに対し、無添加は波形が乱れ、抵抗がかかることが分かった。

実施例４
（方法）
実施例３の発酵乳調整方法に準じて、２００ｇスケールで発酵乳サンプルを調整した。スミチームＣ（新日本科学工業製セルラーゼ製剤）は、製造例１（３）に記載したキモシン活性法にて、ＧＯＤＯ−ＴＣＦと同等のキモシン活性になるように希釈したものを用いた。Ｂｌａｎｋは、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２，ｒ．ｔ．）を０．６ｍＬ（１％）添加した。
分析装置は味認識装置ＴＳ−５０００Ｚ（Ｉｎｓｅｎｔ）を使用した。味覚センサー分析用サンプルは、発酵乳サンプルを精製水にて二倍希釈（ｗ／ｗ）したものを用いた。分析のコントロールとして、ブルガリアヨーグルト（明治）を同様に希釈したものを用いた。分析に使用したセンサーは、ブレンド膜、プラス膜、マイナス膜、ＧＬ１（甘味センサー）を使用した。

味覚センサー分析の結果を表２に示す。各分析値は、ブルガリアヨーグルトの分析値を基準とした相対値で示している。
１％ＧＯＤＯ−ＴＣＦ添加サンプルは、コントロール、０．１％ＧＯＤＯ−ＴＣＦ、クエン酸緩衝液添加サンプルと比較して甘味、苦味雑味が減少した。０．１％ＧＯＤＯ−ＴＣＦ添加サンプルは、クエン酸緩衝液添加サンプルとほぼ同様の結果であった。また、スミチームＣ添加サンプルは、苦味雑味および一般苦味が上昇した。
以上の結果より、塩類や緩衝液成分の影響を除くと苦味雑味、甘味以外の味覚の変化は起こらないことが分かった。またＧＯＤＯ−ＴＣＦ由来プロテアーゼを乳タンパク質に作用させても苦味が発生しにくいことが分かった。

Claims

カゼインを含有する乳由来原料と、配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなる酸性プロテアーゼとを含有する乳製品。
前記酸性プロテアーゼが、トリコデルマ属に属する微生物に由来する酸性プロテアーゼである請求項１記載の乳製品。
さらに乳酸菌又は酵母を含む請求項１又は２記載の乳製品。
発酵乳又はチーズである請求項１〜３のいずれか１項に記載の乳製品。
２バイト法における破断応力が５５００Pa以上であり、破断付着性が８００Ｊ／m³以上である請求項１〜４のいずれか１項に記載の乳製品。
増粘剤、安定剤、ゲル化剤及び糊料からなる凝固成分を実質的に含有しない請求項１〜５のいずれか１項に記載の乳製品。
カゼインを含有する乳由来原料に、配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなる酸性プロテアーゼと、乳酸菌とを添加し、発酵させることを特徴とする乳製品の製造方法。
配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなる酸性プロテアーゼを含有する乳製品用凝乳剤。