JPH1142086A - 耐塩性グルタミナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】夾雑酵素を含まず、液状で優れた保存安定性を
有する耐塩性グルタミナーゼを提供。 【解決手段】下記性質を有する耐塩性グルタミナーゼ： （１）作用：Ｌ−グルタミンを加水分解してＬ−グルタ
ミン酸とアンモニアを生成する、（２）至適ｐＨ及び安
定ｐＨ：至適ｐＨはＬ−グルタミンを基質として７．５
であり、安定ｐＨ域は４．５〜１０．５である、（３）
耐塩性：３７℃、ｐＨ５．５の条件において、１８％
（Ｗ／Ｖ）食塩存在下で、非存在の場合と同等の相対活
性と残存活性を示す、及び（４）液状での保存安定性：
１８％（Ｗ／Ｖ）食塩存在下、４０℃下で、少なくとも
６ヶ月間安定である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は耐塩性グルタミナー
ゼ、より詳しくは夾雑酵素を含まず保存安定性に優れた
耐塩性グルタミナーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術】本発明者らは、先に新規な耐塩性グルタ
ミナーゼを開発（特開平２−２６１３７９号公報参照）
し、これを商品名「グルタミナーゼダイワＣ−１００」
（大和化成株式会社製）として発売した。これはその高
耐塩性より、醤油業界等で好評の中に利用されてきた
が、該グルタミナーゼダイワＣ−１００中には、比較的
多量のプロテアーゼやα−アミラーゼが含まれており、
これを例えば殺菌工程の無い味噌等の製造に利用する
と、着色褐変が生じ、得られる味噌等の商品価値が低下
することがわかってきた。また、上記耐塩性グルタミナ
ーゼは、之等プロテアーゼやα−アミラーゼの混在によ
って、チーズや肉製品への応用も当然できない不利があ
った。

【０００３】しかして、従来より、夾雑酵素の除去は、
クロマトグラフィー操作等による高度精製によって行な
い得ることが知られているが、かかる操作自体煩雑であ
り、しかもこれによる製品コストの上昇は避けられな
い。

【０００４】更に、グルタミナーゼ剤に限らず、一般
に、酵素剤は使用の簡便さより液状品が要望される場合
があるが、本発明者らの研究によれば、上記「グルタミ
ナーゼダイワＣ−１００」は、これを液状化すると、２
０℃、１ヶ月間の保存で５０％以下の活性に低下し、４
０℃、１ヶ月間では完全に失活することが認められ、こ
のように液状における保存安定性が悪いものであった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、夾雑酵素を実質的に含まず且つ液状で優れた保存安
定性を有する耐塩性グルタミナーゼを提供することにあ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的よ
り鋭意研究を重ねた結果、上記「グルタミナーゼダイワ
Ｃ−１００」とは異なるある種の市販酵素剤の内にグル
タミナーゼ活性を認めると共に、該グルタミナーゼ活性
は液状でアルカリ域で安定であり、従って、上記酵素剤
をかかるアルカリ域で処理するときには、夾雑酵素が失
活して所望のグルタミナーゼのみが残存し、しかも該グ
ルタミナーゼは、上記目的に合致する優れた耐塩性を有
することを認め、ここに本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明によれば、下記性質を有する
ことを特徴とする耐塩性グルタミナーゼが提供される。

【０００８】（１）作用：Ｌ−グルタミンを加水分解し
てＬ−グルタミン酸とアンモニアを生成する。

【０００９】（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ：至適ｐＨは
Ｌ−グルタミンを基質として７．５であり、安定ｐＨ域
は４．５〜１０．５である。

【００１０】（３）耐塩性：３７℃、ｐＨ５．５の条件
において、１８％（Ｗ／Ｖ）食塩存在下で、非存在の場
合と同等の相対活性と残存活性を示す。

【００１１】（４）液状での保存安定性 １８％（Ｗ／Ｖ）食塩存在下、４０℃下で、少なくとも
６ヶ月間安定である。

【００１２】また、本発明によれば、市販ラクターゼ剤
「ビオラクタ」（登録商標）を、ｐＨ９．８、３７℃下
に１６時間処理することを特徴とする上記耐塩性グルタ
ミナーゼの製造方法が提供される。

【００１３】因みに、上記「グルタミナーゼダイワＣ−
１００」は、これを酸性側及びアルカリ性側で処理し
て、夾雑するプロテアーゼやα−アミラーゼを失活させ
ると、グルタミナーゼも失活し、所望の酵素は得られな
い。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明耐塩性グルタミナー
ゼにつき詳述すれば、該酵素は以下の性質を有すること
により特徴づけられる。

【００１５】（１）作用 Ｌ−グルタミンを加水分解してＬ−グルタミン酸とアン
モニアとを生成する。

【００１６】（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 本酵素は、０．５％（Ｗ／Ｖ）Ｌ−グルタミンを基質と
して、３７℃で１０分間作用させた場合、図１に示すよ
うに、ｐＨ７．５で活性が最も高い。

【００１７】尚、図１は、ｐＨを横軸にとり、各ｐＨで
の相対酵素活性を縦軸としてプロットしたものであり、
ブリトン−ロビンソン（Britton−Robinson）広域緩衝
液を用いた。

【００１８】また、本酵素の安定ｐＨ域は、本酵素を含
有する各ｐＨ緩衝液を３７℃で１６時間放置した後の残
存活性を測定することにより求められたものであり、図
２に示すように、４．５〜１０．５の範囲であることが
判る。

【００１９】（３）活性測定法 本酵素の力価は、以下の方法により求められた。

【００２０】即ち、２％（Ｗ／Ｖ）Ｌ−グルタミン溶液
（ｐＨ６．０、０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解）１．０ｍｌ
に、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈した本
酵素（約０．３Ｕ）１．０ｍｌを加えて、３７℃、１０
分間反応させた後、０．７５Ｎ過塩素酸溶液１．０ｍｌ
を加えて氷水中で反応を停止させ、更に、０．７５Ｎ水
酸化ナトリウム溶液１．０ｍｌで中和した。次に、上記
反応液０．２ｍｌをとり、該反応液中のＬ−グルタミン
酸量を、ヤマサＬ−グルタミン酸測定キットを用いて測
定した。本酵素の１単位（Ｕ）は、３７℃で１分間当り
に１μモルのＬ−グルタミン酸を生成する酵素量とす
る。

【００２１】（４）至適温度及び安定温度 本酵素の至適温度は、０．５％（Ｗ／Ｖ）Ｌ−グルタミ
ンを基質として、ｐＨ７．５（ブリトン−ロビンソン緩
衝液中）で、１０分間反応させた場合、図３〔横軸：温
度（℃）、縦軸：相対活性（％）〕に示す通り、６５℃
で最も高い活性を示した。

【００２２】また、本酵素（ｐＨ７．５、ブリトン−ロ
ビンソン緩衝液）を、グルタミン非存在下及び０．５％
グルタミンの存在下に、それぞれ各温度で１時間放置し
た後、残存活性を求めた。その結果は、図４〔横軸：温
度（℃）、縦軸：残存活性（％）〕に示す通りである。
尚、図中、（１）はグルタミン非存在下の残存活性を、
（２）は０．５％グルタミン存在下の残存活性を示し、
該残存活性は、γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドの
分解力により求めた。

【００２３】上記結果より、本酵素はグルタミン非存在
下で５５℃まで安定であり、０．５％グルタミン存在下
では６５℃まで安定であることが判る。

【００２４】（５）分子量 １０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−１００を充填したカラム（ファルマシア
社製）を用い、ゲル濾過により測定した本酵素の分子量
は、約５４，０００であった。

【００２５】（６）等電点 ファストシステム（ファルマシア社製）による等電点電
気泳動により求めた本酵素の等電点は、約４．５であっ
た。

【００２６】（７）塩存在下での活性及び耐塩性 ０〜２５％（Ｗ／Ｖ）となるように所定量の食塩を加え
た０．５％Ｌ−グルタミン溶液（０．１Ｍ酢酸緩衝液、
ｐＨ５．５）に本酵素を加え、３７℃で１０分間反応さ
せた後、Ｌ−グルタミン酸を定量することにより、本酵
素の塩存在下での活性を測定した。

【００２７】その結果は図５〔横軸：食塩濃度（Ｗ／Ｖ
％）、縦軸：相対活性（％）〕に示す通りであり、本酵
素は食塩非存在下での活性を１００とした場合、２０％
（Ｗ／Ｖ）食塩濃度においては失活せず、２５％（Ｗ／
Ｖ）食塩濃度においても約９０％の活性が認められた。

【００２８】また、同様にして、１８％（Ｗ／Ｖ）食塩
を含む酵素液（０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．５）を３
７℃、１６時間放置した後、その残存活性を調べた結
果、本酵素は１００％活性を維持していた。これに対し
て、「グルタミナーゼダイワＣ−１００」を用いて同一
試験を行なった結果、該酵素の残存活性は６０％であっ
た。

【００２９】（８）エチルアルコール存在下における活
性及び耐アルコール性 ０〜２０％（Ｖ／Ｖ）となるように所定量のエチルアル
コールを加えた０．５％Ｌ−グルタミン溶液（０．１Ｍ
酢酸緩衝液、ｐＨ５．５）に本酵素を加え、３７℃で３
０分間反応させた後、Ｌ−グルタミン酸を定量して、酵
素活性を調べた。

【００３０】その結果は図６〔横軸：エチルアルコール
濃度（Ｖ／Ｖ％）、縦軸：相対活性（％）〕に示す通り
であり、本酵素は２０％エチルアルコール存在下にあっ
ても全く失活は認められなかった。

【００３１】また、１５％（Ｖ／Ｖ）エチルアルコール
を含む酵素液（０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．５）を３
７℃、１６時間放置した後、その残存活性を測定した結
果によれば、本酵素はほぼ１００％の残存活性を示し
た。

【００３２】（９）Ｌ−グルタミンからＬ−グルタミン
酸への転換 本酵素を０．０７Ｕ／ｍｌの濃度で、１８％（Ｗ／Ｖ）
食塩を含む０．５％Ｌ−グルタミン（０．１Ｍ酢酸緩衝
液、ｐＨ５．５）溶液と、食塩を含まない０．５％Ｌ−
グルタミン（０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．５）溶液
とに、それぞれ３７℃で作用させ、各時間におけるＬ−
グルタミン酸を定量して、本酵素によるＬ−グルタミン
酸転換率（〔L-Glu〕／〔L-Gln〕initial、％）の経時
変化を調べた。

【００３３】横軸に反応時間（時間）を、縦軸にＬ−グ
ルタミン酸変換率（％）をとり、その結果を描いたグラ
フを図７に示す。但し、図中、（１）は食塩を含まない
場合を、（２）は１８％（Ｗ／Ｖ）食塩を含む場合を、
それぞれ示す。

【００３４】該図７より、本酵素は食塩存在下でもＬ−
グルタミンからＬ−グルタミン酸への転換作用を実質的
に阻害されることなく、その転換率は２４時間目でほぼ
１００％に達することが判る。

【００３５】（１０）液状酵素の長期保存安定性 「グルタミナーゼダイワＣ−１００」と本酵素とを、１
８％食塩を含む水中にそれぞれ約２０単位となるように
溶解して酵素液を作成し、之等をそれぞれ２０℃と４０
℃で６ヶ月間保存し、その保存安定性を調べた。

【００３６】横軸に保存日数（日）を、縦軸に残存活性
（％）をとり、得られた結果をプロットしたグラフを図
８に示す。但し、図中、（１）は本酵素の２０℃におけ
る保存安定性を、（２）は「グルタミナーゼダイワＣ−
１００」の２０℃における保存安定性を、（３）は本酵
素の４０℃におけるそれを、（４）は「グルタミナーゼ
ダイワＣ−１００」の４０℃におけるそれを、それぞれ
示す。

【００３７】該図８より、本酵素は液状酵素として２０
℃及び４０℃のいずれにおいても、少なくとも６ヶ月間
安定であるのに対し、「グルタミナーゼダイワＣ−１０
０」は２０℃では１ヶ月間で４０％の残存活性となり、
４０℃では１ヶ月間ですべて失活してしまうことが判
る。

【００３８】（１１）実質的に夾雑酵素を含まない耐塩
性グルタミナーゼの調整 後記実施例に詳述するとおり、本酵素はアルカリ性で極
めて安定であり、ｐＨ９．８、３７℃、１６時間処理す
ることによりプロテアーゼ、α−アミラーゼ等の夾雑酵
素活性を除き、グルタミナーゼ活性のみを残すことがで
きる。

【００３９】上記性質を有する本発明耐塩性グルタミナ
ーゼは、その生産能を有する微生物を常法に従い培養す
ることによって製造することができるが、より簡便に
は、上記微生物が産生する市販酵素製剤を原料として、
該製剤中から単離、精製することができる。

【００４０】該市販酵素製剤の代表例としては、「ビオ
ラクタＮ５」及び「ビオラクタＦＮ５」（いずれも大和
化成株式会社製、尚「ビオラクタ」は登録商標である）
を挙げることができる。上記「ビオラクタ」は、バチル
ス・サーキュランスが生産するラクターゼ（乳糖分解酵
素、β−galactosidase, EC 3.2.1.23）であり、至適温
度６５℃、至適ｐＨ６．０、温度安定性５０℃以下、ｐ
Ｈ安定性５．０−９．５なる性質を有しており、特に
「ビオラクタＮ５」は、ビフィズス因子としてのガラク
トオリゴ糖製造用として開発されたものであり、また
「ビオラクタＦＮ５」は、酵素使用上問題とならない程
度にプロテアーゼ活性を低減させて牛乳処理用としたも
のである。

【００４１】かかる市販酵素製剤からの本酵素の単離、
精製は、本酵素の物理化学的性質等を利用した既知の各
種方法の単独もしくは組合わせにより実施することがで
きる。

【００４２】上記単離、精製手段の具体例としては、例
えば遠心分離法、透析法、エバポレーター、限外濾過等
による濃縮法、硫安等を用いた塩析法、エタノール等に
よる有機溶媒沈澱法、各種クロマトグラフィー（陽イオ
ン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、疎水性樹脂、ゲル濾過
等）を例示でき、いずれも本発明酵素の製造に利用でき
るが、より好ましくは、本酵素は、例えばヒドロキシル
アパタイトを用いたカラムクロマトグラフィーや、セフ
ァデックスＧ−１００を用いたカラムクロマトグラフィ
ー等の組合せにより単離、精製することができる。その
詳細は、後記実施例に示す通りである。

【００４３】かくして、本発明所期の耐塩性グルタミナ
ーゼを単離することができる。

【００４４】該酵素は、特に味噌、肉類、チーズ等、夾
雑酵素が作用すると本来の性質が損なわれる食品に好適
に利用することができ、かかる利用によって所望食品に
おけるグルタミン酸の増強を図ることができる。即ち、
本発明酵素は、之等食品中の遊離のＬ−グルタミンに作
用して、ピログルタミン酸を生じさせることなく、旨味
のもとであるＬ−グルタミン酸を増強させ得、之等食品
の品質を顕著に向上させ得ると共に、食品本来の風味に
は何等の悪影響をも与えない。また、本発明酵素は、液
状酵素製剤として、粉塵をたてることなく、溶解の手間
が省ける使い易い製剤として利用できる。

【００４５】本発明酵素は、高濃度の食塩存在下におい
ても非常に優れた活性と安定性を具備しており、特に高
濃度食塩を含む食品の長期熟成、製造時に利用できるの
みならず、夾雑酵素が作用すると不具合な食品であって
グルタミナーゼ活性の作用のみを期待される食品にも利
用でき、また液状酵素製剤として食品製造に携わる者の
作業環境、易作業性に益するものである。

【００４６】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、本
発明グルタミナーゼの単離調製例を挙げ、次いで本発明
液状酵素製剤の調製例を挙げる。

【００４７】

【実施例１】 本発明精製酵素の調製 市販ラクターゼ剤「ビオラクタＦＮ５」（大和化成株式
会社製）１０ｇを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
に溶解し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対
し、５℃、１日、透析して、賦形してある乳糖を除くと
共に平衡化した。得られた粗酵素液を、予め１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化しておいたヒドロキ
シルアパタイトカラム（２．５×１０ｃｍ、和光純薬
製）に通液して、ラクターゼの一部を吸着させた。

【００４８】次いで、素通り画分の一部（素通り画分の
うちフラクションNo．１０の１０ｍｌを１．５ｍｌにま
でエバポレーターで濃縮し、その１ｍｌ）を、１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したセファデ
ックスＧ−１００カラム（３×５０ｃｍ、ファルマシア
製）にのせ、２０ｍｌ／時間の流速で３．０ｍｌずつ分
取した。

【００４９】上記分離結果を図９に示す。

【００５０】図において、縦軸は蛋白の吸光度（ＯＤ
₂₈₀、結果は線（１）として示す）及びグルタミナーゼ
活性（Ｕ／ｍｌ、結果を線（２）として示す）を、横軸
はフラクションNo．をそれぞれ示す。グルタミナーゼ活
性ピークトップのフラクション（フラクションNo．３
３）は電気泳動的に単一で、その等電点は４．５、ま
た、分子量マーカー溶出位置から、該グルタミナーゼの
分子量は５４，０００と計算された。

【００５１】かくして２．３Ｕ／ＯＤ₂₈₀の精製酵素
（本発明耐塩性グルタミナーゼ）を得た。このものの物
理化学的及び酵素的性質は、前述した通りであった。

【００５２】

【実施例２】 本発明耐塩性グルタミナーゼの調製 市販酵素製剤「ビオラクタＮ５」（大和化成株式会社
製）１００ｇを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５
００ｍｌに溶解し、限外濾過モジュールＵＦ−ＬＭＳII
（東ソー株式会社製）により水で透析して乳糖を除い
た。この液５２０ｍｌを２規定水酸化ナトリウムにより
ｐＨ９．８とし、３７℃、１６時間放置した。放置後の
ｐＨは９．３であった。得られた酵素液に対し、１％の
活性炭を加えて遠心分離（８０００rpm、３０分）を行
ない、上清を４７５ｍｌ得た。冷却した上記上清（酵素
液）を冷エタノール１６６０ｍｌに加え、遠心分離（８
０００rpm、３０分）を行なって沈澱物を集め、これを
室温下に真空乾燥した。上記結果を下記表１に示す。

【００５３】

【表１】

【００５４】該表より、上記方法によって、夾雑酵素を
含まない本発明所期の耐塩性グルタミナーゼが得られる
ことが明らかである。また、該酵素剤は、前述した物理
化学的及び酵素的性質を有するものであった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明耐塩性グルタミナーゼのｐＨの変動によ
る相対活性を調べたグラフである。

【図２】本発明耐塩性グルタミナーゼのｐＨの変動によ
る残存活性を調べたグラフである。

【図３】本発明耐塩性グルタミナーゼの温度変化による
相対活性を求めたグラフである。

【図４】本発明耐塩性グルタミナーゼの温度変化による
残存活性を調べたグラフである。

【図５】本発明耐塩性グルタミナーゼの食塩存在下にお
ける相対活性を求めたグラフである。

【図６】本発明耐塩性グルタミナーゼのエタノール存在
下における相対活性を求めたグラフである。

【図７】本発明耐塩性グルタミナーゼの食塩存在下及び
食塩非存在下におけるＬ−グルタミンからＬ−グルタミ
ン酸への経時的変換率を求めたグラフである。

【図８】本発明耐塩性グルタミナーゼの液状における長
期保存安定性を調べたグラフである。

【図９】セファデックスＧ−１００を用いて行なった本
発明耐塩性グルタミナーゼのゲル濾過の結果を示すグラ
フである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記性質を有することを特徴とする耐塩
   性グルタミナーゼ。 （１）作用：Ｌ−グルタミンを加水分解してＬ−グルタ
   ミン酸とアンモニアを生成する。 （２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ：至適ｐＨはＬ−グルタミ
   ンを基質として７．５であり、安定ｐＨ域は４．５〜１
   ０．５である。 （３）耐塩性：３７℃、ｐＨ５．５の条件において、１
   ８％（Ｗ／Ｖ）食塩存在下で、非存在の場合と同等の相
   対活性と残存活性を示す。 （４）液状での保存安定性：１８％（Ｗ／Ｖ）食塩存在
   下、４０℃下で、少なくとも６ヶ月間安定である。
2. 【請求項２】 市販ラクターゼ剤「ビオラクタ」（登録
   商標）を、ｐＨ９．８、３７℃下に１６時間処理するこ
   とを特徴とする請求項１に記載の耐塩性グルタミナーゼ
   の製造方法。