WO2022118914A1 - 液体酵素製剤 - Google Patents

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WO2022118914A1
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protein
enzyme
liquid enzyme
sorbitol
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沙紀 乘船
裕介 田中
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天野エンザイム株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01044—Protein-glutamine glutaminase (3.5.1.44)

Definitions

  • the present invention relates to a liquid enzyme preparation. More specifically, the present invention relates to a liquid enzyme preparation of a protein deamidating enzyme having excellent activity stability.
  • Glutaminase and protein glutaminase derived from the chryseobacterium proteolyticum 9670 strain are known. Enzyme pharmaceutical products of such protein deamidating enzymes are currently only commercially available in powder form.
  • Patent Document 2 contains at least one milk in a polyol-water suspension containing a 25% to 100% (w / w) polyol and having a pH value in the range of 4.4 to 5.1.
  • Liquid enzyme preparations comprising protein cross-linking and / or modifying enzymes have been proposed.
  • Patent Document 2 finds that the stability of transglutaminase at pH 5.2 is low, and based on this finding, a transglutaminase preparation in a glycerol-aqueous suspension having a pH of 4.4 to 4.8. Discloses that the stability of the transglutaminase preparation in a sorbitol-water suspension of pH 4.6 is improved, and accompanies this, the tyrosinase preparation in a glycerol-water suspension of pH 4.6. And a protein glutaminase formulation in a glycerol-aqueous suspension of pH 4.6 are also disclosed.
  • Patent Document 2 the stability of the liquid enzyme preparation of the transglutaminase preparation is examined, while the stability of the liquid enzyme preparation of the protein deamidating enzyme is limited to the disclosure of the preparation formulation, and the stability of this enzyme is sufficient. No consideration has been made.
  • an object of the present invention is to provide a liquid enzyme preparation of a protein deamidating enzyme having excellent activity stability.
  • the present invention includes the following inventions.
  • Item 1 A liquid enzyme preparation containing a protein deamidating enzyme and sorbitol of 30 w / v% or more and having a pH of 5.5 or more.
  • Item 2. The liquid enzyme preparation according to Item 1, wherein the content of the sorbitol is 65 w / v% or less.
  • Item 3. Item 2. The liquid enzyme preparation according to Item 1 or 2, which has a pH of 8.2 or less.
  • Item 4. The liquid enzyme preparation according to any one of claims 1 to 3, further comprising a sulfite, a thiosulfate, and / or a pyrosulfate.
  • Item 6. The liquid enzyme preparation according to any one of claims 1 to 3, further comprising a sulfite, a thiosulfate, and / or a pyrosulfate.
  • Item 6. The liquid enzyme preparation according to any one of Items 1 to 5, wherein the protein deamidating enzyme is derived from Chryseobacterium proteolyticum.
  • Item 7. An enzyme activity stabilizer for a liquid enzyme preparation of a protein deamide enzyme, which contains sorbitol as an active ingredient and is used at a concentration of 30 w / v% or more in a liquid enzyme preparation of a protein deamide enzyme having a pH of 5.5 or more.
  • Item 9 A starch inhibitor for a liquid enzyme preparation of a protein deamidating enzyme, which contains sorbitol as an active ingredient and is used at a concentration of 30 w / v% or more in a liquid enzyme preparation of a protein deamidating enzyme having a pH of 5.5 or higher.
  • liquid enzyme preparation of a protein deamidating enzyme having excellent activity stability is provided.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention contains a protein deamidating enzyme and sorbitol of 30 w / v% or more, and is characterized by having a pH of 5.5 or more.
  • a protein deamidating enzyme and sorbitol of 30 w / v% or more, and is characterized by having a pH of 5.5 or more.
  • the protein deamidating enzyme is an enzyme that exhibits an action of degrading an amide group-containing side chain of a protein without cleavage of a peptide bond and cross-linking of the protein, and the type and origin thereof are not particularly limited. Further, as long as the above action is the main activity, it may further have an action of degrading the amide group-containing side chain of the protein accompanied by cleavage of the peptide bond and cross-linking of the protein.
  • protein deamidating enzymes are enzymes that deamidate glutamine residues in proteins and convert them to glutamic acid (eg protein glutaminase), and enzymes that deamidate asparagine residues in proteins and convert them to aspartic acid (eg). Protein asparaginase).
  • protein deamidating enzyme More specific examples of the protein deamidating enzyme are JP2000-50887A, JP2001-218590A, WO2006 / 075772A1, of the genus Chryseobacterium, the genus Flavobacterium, the genus Empedobacter ( Protein deamidenase from the genus Empedobacter, the genus Sphingobacterium, the genus Aureobacterium or the genus Myroides, the genus Lutimiclobium disclosed in WO2015 / 133590.
  • the protein deamidating enzyme are JP2000-50887A, JP2001-218590A, WO2006 / 075772A1, of the genus Chryseobacterium, the genus Flavobacterium, the genus Empedobacter ( Protein deamidenase from the genus Empedobacter, the genus Sphingobacterium, the genus Aureobacterium or the genus Myroides,
  • protein deamidating enzymes derived from the genus Agromyces, Microbacterium, or Leifsonia, and commercially available products of protein glutaminase derived from the genus Chryseobacterium.
  • protein deamidating enzymes one type may be used alone, or a plurality of types may be used in combination.
  • a protein deamide enzyme derived from Chryseobacterium is preferable, and a protein derived from Chryseobacterium is more preferable, from the viewpoint of making a liquid enzyme preparation having further excellent activity stability.
  • Glutaminase more preferably a protein glutaminase derived from the Chryseobacterium proteobacterium species can be mentioned.
  • the protein deamidating enzyme can be prepared from the culture solution of the microorganism from which the above protein deamidating enzyme is derived.
  • Specific preparation methods include a method of recovering protein deamidating enzyme from the above-mentioned microbial culture solution or cells.
  • the enzyme can be separated and / or purified after collecting the cells from the culture solution by filtration, centrifugation or the like in advance, if necessary.
  • the cells were recovered from the culture solution in advance as needed, and then the cells were crushed by pressure treatment, ultrasonic treatment, etc. to expose the enzyme.
  • the enzyme can be separated and / or purified.
  • a known protein separation and / or purification method can be used without particular limitation, and for example, a centrifugation method, a UF concentration method, a salting out method, an ion exchange resin, or the like can be used.
  • Various chromatographic methods using the above can be mentioned.
  • the content of the protein deamidating enzyme in the liquid enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, but is, for example, 0.1 to 10,000 U / mL, 1 to 5,000 U / mL, 10 to 2,500 U / ml, 50 to. Examples thereof include 1,000 U / ml, preferably 100 to 800 U / ml, more preferably 150 to 700 U / ml, still more preferably 250 to 600 U / ml, 250 to 500 U / ml, and even more preferably 300 to 400 U / ml.
  • benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine (Z-Gln-Gly) is used as a substrate, and the amount of the enzyme that liberates 1 ⁇ mol of ammonia per minute is 1 unit (1U).
  • the liquid enzyme preparation of the present invention contains sorbitol. Sorbitol is formulated for the purpose of stabilizing the activity of the protein deamidating enzyme.
  • the content of sorbitol in the liquid enzyme preparation of the present invention is 30 w / v% or more from the viewpoint of obtaining desired activity stability. Further, in the liquid enzyme preparation of the present invention, the amount of sorbitol used per 1 U of protein deamidating enzyme is determined according to each content of protein deamidating enzyme and sorbitol, but from the viewpoint of obtaining desired activity stability. The amount is preferably 0.8 mg or more.
  • the content of sorbitol in the liquid enzyme preparation of the present invention may be preferably 35 w / v% or more or 38 w / v% or more.
  • the amount of sorbitol used per 1 U of protein deamidating enzyme in the liquid enzyme preparation of the present invention may be preferably 0.97 mg or more or 1 mg or more.
  • the pH of the liquid enzyme preparation of the present invention pH at 25 ° C.; the same applies hereinafter) is 5.8 to 8.2, preferably 6.0 to 8.0. Can be mentioned.
  • the content of sorbitol in the liquid enzyme preparation of the present invention may be preferably 45 w / v% or more or 48 w / v% or more.
  • the amount of sorbitol used per 1 U of protein deamidating enzyme in the liquid enzyme preparation of the present invention may be preferably 1.2 mg or more or 1.3 mg or more. ..
  • the pH of the liquid enzyme preparation of the present invention is 6.5 to 7.5, preferably 6.8 to 7.2, and more preferably 6.9 to 7.1. Can be mentioned.
  • the upper limit of the content range of sorbitol in the liquid enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, but from the viewpoint of exhibiting more excellent activity stability and / or from the viewpoint of easy preparation, for example, 65 w / v% or less. It is preferably 60 w / v% or less, more preferably 57 w / v% or less, still more preferably 55 w / v% or less, still more preferably 52 w / v% or less.
  • the upper limit of the range of the amount of sorbitol used per 1U of the protein deamidating enzyme in the liquid enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, but from the viewpoint of exhibiting better activity stability and / or easy preparation. From the viewpoint, for example, 1.8 mg or less, preferably 1.67 mg or less, more preferably 1.59 mg or less, still more preferably 1.53 mg or less, still more preferably 1.4 mg or less can be mentioned.
  • the upper limit of the sorbitol content range in the liquid enzyme preparation of the present invention is preferably 50 w / v% or less, more preferably 47 w / v% or less, still more preferably 45 w. It may be / v% or less, more preferably 42 w / v% or less.
  • the upper limit of the range of the amount of sorbitol used per 1 U of the protein deamidating enzyme in the liquid enzyme preparation of the present invention is preferably 1.4 mg or less, more preferably 1. It may be 0.3 mg or less, more preferably 1.25 mg or less, and even more preferably 1.16 mg or less.
  • the pH of the liquid enzyme preparation of the present invention is 5.5 to 8.0, preferably 5.5 to 7.2, more preferably 5.8 or more and less than 6.5, and further.
  • the case is preferably 5.9 to 6.3, and even more preferably 6.0 to 6.2.
  • sorbitol of 30 w / v% or more in the liquid enzyme preparation may be blended for the purpose of suppressing starch in addition to stabilizing the activity.
  • the content of sorbitol in the liquid enzyme preparation of the present invention is preferably 38 w / v% or more or 45 w / v% or more, more preferably 48 w / v% or more or 55 w. / V% or more, more preferably 58 w / v% or more.
  • sorbitol of 0.8 mg or more per 1 U of protein deamidating enzyme in a liquid enzyme preparation may be added for the purpose of suppressing starch in addition to stabilizing the activity.
  • the amount of sorbitol used per 1 U of protein deamidating enzyme in the liquid enzyme preparation of the present invention is preferably 1 mg or more, 1.25 mg or more, and more preferably 1.3 mg or more.
  • 1.5 mg or more, more preferably 1.6 mg or more can be mentioned. Examples of cases corresponding to these aspects include the case where the pH of the liquid enzyme preparation of the present invention is 5.5 or more and less than 6.75, more preferably 5.5 to 6.5.
  • sorbitol of 38 w / v% or more or 45 w / v% or more in the liquid enzyme preparation of the present invention is blended for the purpose of suppressing starch in addition to stabilizing the activity.
  • the content of sorbitol in the liquid enzyme preparation of the present invention is preferably 48 w / v% or more, 55 w / v% or more, and more preferably 58 w / v% or more. Will be.
  • sorbitol of 1 mg or more or 1.25 mg or more per 1 U of protein deamidating enzyme in the liquid enzyme preparation of the present invention aims at suppressing starch in addition to stabilizing the activity. It may be blended as.
  • the amount of sorbitol used per 1 U of protein deamidating enzyme in the liquid enzyme preparation of the present invention is preferably 1.3 mg or more or 1.5 mg or more, more preferably 1. 6 mg or more can be mentioned. Examples of cases corresponding to these aspects include the case where the pH of the liquid enzyme preparation of the present invention is 6.75 or more and less than 7.5, more preferably 6.8 to 7.2.
  • sorbitol of 48 w / v% or more or 55 w / v% or more in the liquid enzyme preparation of the present invention is formulated for the purpose of suppressing starch in addition to stabilizing the activity.
  • the content of sorbitol in the liquid enzyme preparation of the present invention is preferably 58 w / v% or more.
  • sorbitol of 1.3 mg or more or 1.5 mg or more per 1 U of protein deamidating enzyme in the liquid enzyme preparation of the present invention suppresses starch in addition to stabilizing the activity. It may be blended for the purpose of.
  • the amount of sorbitol used per 1 U of protein deamidating enzyme in the liquid enzyme preparation of the present invention is preferably 1.6 mg or more.
  • An example corresponding to these aspects is the case where the pH of the liquid enzyme preparation of the present invention is 7.5 or higher.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention preferably further contains sulfite, thiosulfate, and / or pyrosulfate as a predetermined salt.
  • these predetermined salts include metal salts of alkali metal salts (potassium salt, sodium salt, etc.) and alkaline earth metal salts (calcium salt, etc.). These predetermined salts may be used alone or in combination of two or more.
  • sulfite and pyrosulfate are more preferable, sulfite is more preferable, or alkali metal salt is more preferable, and sodium salt is more preferable. Further, among these, an alkali metal sulfite salt is particularly preferable, and sodium sulfite is most preferable, from the viewpoint of exhibiting particularly excellent activity stability.
  • the blending amount of the predetermined salt is not particularly limited and may be appropriately set according to the effect of improving the activity stabilization to be imparted, for example. 0.01 to 2 w / v%, preferably 0.03 to 1 w / v%, preferably 0.04 to 0.8 w / v%, more preferably 0.06 to 0.6 w / v% or 0.08. ⁇ 0.6w / v%, more preferably 0.15 ⁇ 0.55w / v%, 0.2 ⁇ 0.55w / v%, 0.3 ⁇ 0.55w / v%, or 0.4 ⁇ 0 .55w / v% can be mentioned.
  • the blending amount of the predetermined salt per 1 U of the protein deamidating enzyme is, for example, 0.00025 to 0.05 mg, preferably 0.0008 to 0.026 mg, preferably 0.001 to 0.023 mg. It is preferably 0.0015 to 0.017 mg or 0.002 to 0.017 mg, more preferably 0.004 to 0.015 mg, 0.005 to 0.015 mg, 0.008 to 0.015 mg, or 0.01 to 0.01. 0.015 mg is mentioned.
  • liquid enzyme preparation of the present invention may contain other components to the extent that the effects of the present invention are not affected.
  • other components include enzymes other than protein deamidating enzymes, additives and the like.
  • enzymes include, for example, amylase ( ⁇ -amylase, ⁇ -amylase, glucoamylase), glucosidase ( ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucosidase), galactosidase ( ⁇ -galactosidase, ⁇ -galactosidase), protease (acidic protease, medium).
  • Sex protease alkaline protease
  • peptidase leucine peptidase, aminopeptidase
  • lipase lipase
  • esterase cellulase
  • phosphatase acidic phosphatase, alkaline phosphatase
  • nuclease deaminase, oxidase, dehydrogenase, glutaminase, pectinase, catalase, dextranase, trans Examples thereof include glutaminase and pluranase.
  • These other enzymes may be contained alone or in combination of a plurality of types.
  • Additives include excipients, buffers, suspensions, stabilizers, preservatives, preservatives, saline, polyhydric alcohols (referred to as polyhydric alcohols other than sorbitol above; the same shall apply hereinafter), pH. An adjusting agent and the like can be mentioned. These additives may be contained alone or in combination of a plurality of types.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention preferably contains substantially no polyhydric alcohol from the viewpoint of further improving the activity stability of the liquid enzyme preparation of the present invention.
  • the polyhydric alcohol includes non-sugar polyhydric alcohols such as glycerin and propylene glycol, and sugar alcohols other than sorbitol.
  • the fact that the polyhydric alcohol is not substantially contained means that it is permissible to contain the polyhydric alcohol to the extent that the activity stability of the liquid enzyme preparation of the present invention is not impaired.
  • the polyhydric alcohol The content of the above is 1 w / v% or less, preferably 0.1 w / v% or less, more preferably 0.01 w / v% or less, and most preferably 0 w / v%.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention is a liquid preparation.
  • each component to be blended is added to water in a predetermined amount to dissolve it, or unnecessary components such as contaminating polymers are separated and / / from the culture solution of the protein deamidating enzyme-producing strain. Alternatively, it is removed by purification, an aqueous solution of sorbitol is added, and then a pH adjuster is appropriately added to adjust the pH to a predetermined pH, and / or, if necessary, sulfite, thiosulfate, and / or pyrosulfate. It can be prepared by adding salt and sterilizing if necessary.
  • the pH (25 ° C.) of the liquid enzyme preparation of the present invention is 5.5 or more from the viewpoint of obtaining the desired activity stability.
  • the upper limit of the pH range of the liquid enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, but from the viewpoint of exhibiting even more excellent activity stability, it is 8.2 or less, preferably 8.0 or less, more preferably 7.6 or less. , More preferably 7.2 or less, still more preferably 7.0 or less, 6.8 or less, 6.5 or less, 6.2 or less, 6.0 or less, or 5.7 or less.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention can be used for any purpose utilizing the protein deamidating enzyme activity.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention can be used for the purpose of modifying a protein.
  • the specific embodiment of the modification of the protein is not particularly limited, and the protein resulting from the deamidation of the ⁇ -amide group and the ⁇ -amide group of the glutamine residue and the asparagine residue of the protein produces a carboxyl group. Anything that utilizes the characteristic change may be used.
  • Specific examples of protein modification include increased protein solubility, increased water dispersibility, improved emulsifying power, and emulsified stability.
  • the protein deamidating enzyme liquid enzyme preparation of the present invention can be widely used in the food field. Specifically, it is used to improve the solubility, dispersibility, emulsifying property, etc. of animal protein and / or vegetable protein in a weakly acidic environment which is the pH range of ordinary foods (for example, coffee / whitener, juice, etc.).
  • Acidic beverages, dressings, mayonnaise, cream production applications Increased solubility and dispersibility of poorly soluble vegetable proteins (for example, production applications such as tempura flour using wheat gluten); Dow in bread and confectionery Modifications (eg, for making crackers, biscuits, cookies, pizzas and / or pie crusts); for removing or reducing allergens in allergic proteins in foods (eg, for making foods for wheat allergic patients). ); Applications for reducing the mineral sensitivity of proteins, increasing the content of soluble minerals in liquids containing proteins and minerals, and increasing the absorption of minerals into the human body (eg, high mineral (eg calcium) -containing beverages, minerals (eg calcium).
  • high mineral eg calcium
  • minerals eg calcium
  • HAP hydrolyzate of vegetable protein (HVP)), use for producing miso and soy sauce) and the like.
  • Enzyme activity stabilizer for protein deamidating enzyme liquid enzyme preparations and starch inhibitor for protein deamidating enzyme liquid enzyme preparations As described above, in a liquid enzyme preparation having a pH of 5.5 or more containing a protein deamidating enzyme, sorbitol blended at a concentration of 30 w / v% or more has the activity stability of the liquid enzyme preparation, that is, the stability of the protein deamidating enzyme activity. To improve. Therefore, the present invention contains sorbitol as an active ingredient and is used at a concentration of 30 w / v% or more in a liquid enzyme preparation of a protein deamide enzyme having a pH of 5.5 or more. Stabilizers are also provided.
  • the enzyme activity stabilizer of the liquid enzyme preparation of the protein deamidating enzyme of the present invention is, in addition to sorbitol, as a predetermined salt, a sulfite or a thiosulfate, from the viewpoint of exhibiting even more excellent activity stability. , And / or preferably containing pyrosulfate.
  • the present invention contains sorbitol as an active ingredient and is used at a concentration of 30 w / v% or more in a liquid enzyme preparation of a protein deamidating enzyme having a pH of 5.5 or more. Agents are also provided.
  • the starch inhibitor of the present invention is a protein having a pH of 6.55 or more and less than 7.5 at a concentration of 30 w / v% or more in a liquid enzyme preparation of a protein deamidating enzyme having a pH of 5.5 or more and less than 6.75. It is used at a concentration of 38 w / v% or more in a liquid enzyme preparation of a deamide enzyme, or at a concentration of 48 w / v% or more in a liquid enzyme preparation of a protein deamide enzyme having a pH of 7.5 or more.
  • the obtained liquid enzyme preparation was left at 60 ° C. for 72 hours.
  • the protein deamidating enzyme activity value before and after leaving was measured by the following method.
  • Ammonia test Wako (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used for the solution obtained above to measure the amount of ammonia generated in the reaction solution.
  • the ammonia concentration in the reaction solution was determined from a calibration curve showing the relationship between the ammonia concentration and the absorbance (630 nm) prepared using an ammonia standard solution (ammonium chloride).
  • the activity of the protein deamidating enzyme was calculated from the following formula, with the amount of the enzyme producing 1 ⁇ mol of ammonia per minute as 1 unit (1 U).
  • the amount of the reaction solution is 2.1
  • the amount of the enzyme solution is 0.1
  • Df is the dilution ratio of the enzyme solution.
  • 17.03 is the molecular weight of ammonia.
  • a liquid enzyme preparation containing a protein deamidating enzyme and sorbitol of 30 w / v% or more and having a pH of 5.5 or more was found to have a remarkable improvement in activity stability.
  • Test Example 3 Dispense 1 ml of the liquid enzyme preparation obtained in Test Example 2 into a microtube (capacity 2.0 ml), observe the appearance after leaving at 60 ° C. for 72 hours, and determine the presence or absence of starch and its degree based on the following criteria. Evaluated based on. Table 2 shows a representative diagram of the appearance corresponding to each standard. The results are shown in Table 3.
  • Test Example 4 In addition to the liquid enzyme preparation of Example 1 prepared in Test Example 1 and the liquid enzyme preparation of Example 1, sodium sulfite, sodium thiosulfate, sodium pyrosulfite, magnesium sulfate, ethylenediamine tetraacetate dihydrogen disodium, or chloride is further added. Liquid enzyme preparations containing potassium in the amounts shown in Table 4 were prepared, and the residual activity was measured in the same manner as in Test Example 1 except that the conditions for leaving these liquid enzyme preparations were 40 ° C. and 2 weeks. .. The results are shown in Table 4.

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Abstract

本発明は、活性安定性に優れたタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤を提供する。タンパク質脱アミド酵素と、３０ｗ／ｖ％以上のソルビトールとを含み、ｐＨ５．５以上である液体酵素製剤は、タンパク質脱アミド酵素活性の安定性を向上できる。

Description

液体酵素製剤
　本発明は、液体酵素製剤に関する。より具体的には、本発明は、活性安定性に優れたタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤に関する。
　タンパク質中のグルタミン残基及びアスパラギン残基のγ－アミド基及びβ－アミド基を脱アミドする酵素として、特許文献１等に記載されているように、クリセオバクテリウム・グレウムＪＣＭ２４１０株由来のプロテイングルタミナーゼ及びクリセオバクテリウム・プロテオリティカム９６７０株由来のプロテイングルタミナーゼが知られている。このようなタンパク質脱アミド酵素の酵素製剤製品は、現在、粉末形態で市販されているのみである。
　酵素製剤に関しては、一般的に、ダスティング及びハンドリングの点を考慮すると、粉末形態よりも液体形態の方が望ましい。このため、酵素製剤を液状形態で製剤化する技術が、種々の酵素について検討されている。例えば、特許文献２には、２５％～１００％（ｗ／ｗ）のポリオールを含み、４．４～５．１の範囲内のｐＨ値を有するポリオール－水懸濁液に少なくとも１種の乳タンパク質架橋及び／又は修飾酵素を含むことを特徴とする液体酵素製剤が提案されている。具体的には、特許文献２では、ｐＨ５．２におけるトランスグルタミナーゼの安定性が低いことを見出し、この知見に基づいて、ｐＨ４．４～４．８のグリセロール－水懸濁液中のトランスグルタミナーゼ製剤、ｐＨ４．６のソルビトール－水懸濁液中のトランスグルタミナーゼ製剤の安定性が向上していることを開示するとともに、これに付随して、ｐＨ４．６のグリセロール－水懸濁液中のチロシナーゼ製剤及びｐＨ４．６のグリセロール－水懸濁液中のタンパク質グルタミナーゼ製剤も開示している。
国際公開第２０１０／０２９６８５号 国際公開第２０１３／０６４７３６号
　特許文献２には、トランスグルタミナーゼ製剤の液体酵素製剤については安定性が検討されている一方で、タンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤については製剤処方の開示のみにとどまり、この酵素の安定性について十分な検討はなされていない。
　そこで本発明の目的は、活性安定性に優れたタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤を提供することにある。
　本発明者は、鋭意検討の結果、ｐＨ５．５以上に調整し且つ３０ｗ／ｖ％以上のソルビトールを配合する新たな処方により、タンパク質脱アミド酵素の活性安定性が向上することを見出した。本発明は、この知見に基づいて完成された。本発明は、以下に掲げる発明を含む。
項１．　タンパク質脱アミド酵素と、３０ｗ／ｖ％以上のソルビトールとを含み、ｐＨ５．５以上である、液体酵素製剤。
項２．　前記ソルビトールの含有量が６５ｗ／ｖ％以下である、項１に記載の液体酵素製剤。
項３．　ｐＨ８．２以下である、項１又は２に記載の液体酵素製剤。
項４．　さらに、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、及び／又はピロ硫酸塩を含む、請求項１～３のいずれかに記載の液体酵素製剤。
項５．　タンパク質脱アミド酵素活性が０．１～１０,０００Ｕ／ｍｌである、項１～４のいずれかに記載の液体酵素製剤。
項６．　前記タンパク質脱アミド酵素がクリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来である、項１～５のいずれかに記載の液体酵素製剤。
項７．　ソルビトールを有効成分として含み、ｐＨ５．５以上のタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤中で３０ｗ／ｖ％以上の濃度で用いられる、タンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤の酵素活性安定化剤。
項８．　さらに、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、及び／又はピロ硫酸塩を含む、項７に記載のタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤の酵素活性安定化剤。
項９．　ソルビトールを有効成分として含み、ｐＨ５．５以上のタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤中で３０ｗ／ｖ％以上の濃度で用いられる、タンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤の澱抑制剤。
　本発明によれば、活性安定性に優れたタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤が提供される。
試験例２で得られた、タンパク質脱アミド酵素（プロテイングルタミナーゼ：ＰＧ）の液体酵素製剤の活性安定性の試験結果である。
［１．液体酵素製剤]
　本発明の液体酵素製剤は、タンパク質脱アミド酵素と、３０ｗ／ｖ％以上のソルビトールとを含み、ｐＨ５．５以上であることを特徴とする。以下、本発明の液体酵素製剤について詳述する。
［１－１．タンパク質脱アミド酵素］
　タンパク質脱アミド酵素は、ペプチド結合の切断及びタンパク質の架橋を伴わないタンパク質のアミド基含有側鎖を分解する作用を示す酵素であって、その種類及び由来等は特に限定されない。また、上記作用が主活性である限り、ペプチド結合の切断及びタンパク質の架橋を伴うタンパク質のアミド基含有側鎖を分解する作用をさらに有していても良い。タンパク質脱アミド酵素の例として、タンパク質中のグルタミン残基を脱アミド化し、グルタミン酸に変換する酵素（例えばプロテイングルタミナーゼ）、及びタンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化し、アスパラギン酸に変換する酵素（例えばプロテインアスパラギナーゼ）が挙げられる。タンパク質脱アミド酵素のより具体的な例としては、ＪＰ２０００－５０８８７Ａ、ＪＰ２００１－２１８５９０Ａ、ＷＯ２００６／０７５７７２Ａ１に開示された、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンペドバクター（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属又はミロイデス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ）属由来のタンパク質脱アミド酵素、ＷＯ２０１５／１３３５９０に開示された、ルテイミクロビウム（Ｌｕｔｅｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、アグロマイセス（Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はレイフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）属由来の蛋白質脱アミド酵素、及びクリセオバクテリウム属由来のプロテイングルタミナーゼの市販品が挙げられる。これらのタンパク質脱アミド酵素としては、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　これらのタンパク質脱アミド酵素の中でも、より一層活性安定性に優れた液体酵素製剤とする観点から、好ましくはクリセオバクテリウム属由来のタンパク質脱アミド酵素、より好ましくはクリセオバクテリウム属由来のプロテイングルタミナーゼ、さらに好ましくはクリセオバクテリウム・プロテオリティカム種由来のプロテイングルタミナーゼが挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素は、上記のタンパク質脱アミド酵素の由来元となる微生物の培養液より調製することができる。具体的な調製方法としては、上記の微生物の培養液又は菌体よりタンパク質脱アミド酵素を回収する方法が挙げられる。例えば、タンパク質脱アミド酵素分泌型微生物を用いる場合は、培養液から、必要に応じて予めろ過、遠心処理等によって菌体を回収した後、酵素を分離及び／又は精製することができる。また、タンパク質脱アミド酵素非分泌型微生物を用いる場合は、必要に応じて予め培養液から菌体を回収した後、菌体を加圧処理、超音波処理等によって破砕して酵素を露出させた後、酵素を分離及び／又は精製することができる。酵素の分離及び／又は精製法としては、公知のタンパク質分離及び／又は精製法を特に限定されることなく用いることができ、例えば、遠心分離法、ＵＦ濃縮法、塩析法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー法等が挙げられる。
　本発明の液体酵素製剤におけるタンパク質脱アミド酵素の含有量としては特に限定されないが、例えば０．１～１０，０００Ｕ／ｍＬ、１～５，０００Ｕ／ｍＬ、１０～２，５００Ｕ／ｍｌ、５０～１，０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１００～８００Ｕ／ｍｌ、より好ましくは１５０～７００Ｕ／ｍｌ、さらに好ましくは２５０～６００Ｕ／ｍｌ、２５０～５００Ｕ／ｍｌ、一層好ましくは３００～４００Ｕ／ｍｌが挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素の活性については、ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミニルグリシン（Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ）を基質とし、１分間に１μｍｏｌのアンモニアを遊離する酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
［１－２．ソルビトール］
　本発明の液体酵素製剤は、ソルビトールを含有する。ソルビトールは、タンパク質脱アミド酵素の活性を活性安定化させる目的で配合される。
　本発明の液体酵素製剤におけるソルビトールの含有量は、所望の活性安定性を得る観点から、３０ｗ／ｖ％以上である。また、本発明の液体酵素製剤において、タンパク質脱アミド酵素１Ｕ当たりのソルビトールの使用量については、タンパク質脱アミド酵素及びソルビトールの各含有量に応じて定まるが、所望の活性安定性を得る観点から、好ましくは０．８ｍｇ以上が挙げられる。
　より優れた活性安定性を発現する観点から、本発明の液体酵素製剤におけるソルビトールの含有量は、３５ｗ／ｖ％以上又は３８ｗ／ｖ％以上が好ましい場合がある。同様に、より優れた活性安定性を発現する観点から、本発明の液体酵素製剤におけるタンパク質脱アミド酵素１Ｕ当たりのソルビトールの使用量は、０．９７ｍｇ以上又は１ｍｇ以上が好ましい場合がある。これらの場合に該当する例としては、本発明の液体酵素製剤のｐＨ（２５℃でのｐＨ。以下において同様。）が５．８～８．２、好ましくは６．０～８．０の場合が挙げられる。
　さらに、より一層優れた活性安定性を発現する観点から、本発明の液体酵素製剤におけるソルビトールの含有量は、４５ｗ／ｖ％以上又は４８ｗ／ｖ％以上が好ましい場合がある。同様に、より一層優れた活性安定性を発現する観点から、本発明の液体酵素製剤におけるタンパク質脱アミド酵素１Ｕ当たりのソルビトールの使用量は、１．２ｍｇ以上又は１．３ｍｇ以上が好ましい場合がある。これらの場合に該当する例としては、本発明の液体酵素製剤のｐＨが６．５～７．５、好ましくは６．８～７．２、さらに好ましくは６．９～７．１の場合が挙げられる。
　本発明の液体酵素製剤におけるソルビトールの含有量範囲の上限としては特に限定されないが、より優れた活性安定性を発現する観点、及び／又は、易調製性の観点から、例えば６５ｗ／ｖ％以下、好ましくは６０ｗ／ｖ％以下、より好ましくは５７ｗ／ｖ％以下、さらに好ましくは５５ｗ／ｖ％以下、一層好ましくは５２ｗ／ｖ％以下が挙げられる。同様に、本発明の液体酵素製剤におけるタンパク質脱アミド酵素１Ｕ当たりのソルビトールの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、より優れた活性安定性を発現する観点、及び／又は、易調製性の観点から、例えば１．８ｍｇ以下、好ましくは１．６７ｍｇ以下、より好ましくは１．５９ｍｇ以下、さらに好ましくは１．５３ｍｇ以下、一層好ましくは１．４ｍｇ以下が挙げられる。
　より一層優れた活性安定性を発現する観点から、本発明の液体酵素製剤におけるソルビトールの含有量範囲の上限として、好ましくは５０ｗ／ｖ％以下、より好ましくは４７ｗ／ｖ％以下、さらに好ましくは４５ｗ／ｖ％以下、一層好ましくは４２ｗ／ｖ％以下となる場合がある。同様に、より一層優れた活性安定性を発現する観点から、本発明の液体酵素製剤におけるタンパク質脱アミド酵素１Ｕ当たりのソルビトールの使用量範囲の上限として、好ましくは１．４ｍｇ以下、より好ましくは１．３ｍｇ以下、さらに好ましくは１．２５ｍｇ以下、一層好ましくは１．１６ｍｇ以下となる場合がある。これらの場合に該当する例としては、本発明の液体酵素製剤のｐＨが５．５～８．０、好ましくは５．５～７．２、より好ましくは５．８以上６．５未満、さらに好ましくは５．９～６．３、一層さらに好ましくは６．０～６．２である場合が挙げられる。
　本発明の特定態様においては、液体酵素製剤における３０ｗ／ｖ％以上のソルビトールは、活性の安定化に加えて、澱の抑制を目的として配合する場合がある。この態様において、澱抑制効果を高める観点から、本発明の液体酵素製剤におけるソルビトールの含有量としては、好ましくは３８ｗ／ｖ％以上又は４５ｗ／ｖ％以上、より好ましくは４８ｗ／ｖ％以上又は５５ｗ／ｖ％以上、さらに好ましくは５８ｗ／ｖ％以上が挙げられる。同様に、本発明の特定態様においては、液体酵素製剤におけるタンパク質脱アミド酵素１Ｕ当たり０．８ｍｇ以上のソルビトールは、活性の安定化に加えて、澱の抑制を目的として配合する場合がある。この態様において、澱抑制効果を高める観点から、本発明の液体酵素製剤におけるタンパク質脱アミド酵素１Ｕ当たりのソルビトールの使用量としては、好ましくは１ｍｇ以上又は１．２５ｍｇ以上、より好ましくは１．３ｍｇ以上又は１．５ｍｇ以上、さらに好ましくは１．６ｍｇ以上が挙げられる。これらの態様に該当する例としては、本発明の液体酵素製剤のｐＨが５．５以上６．７５未満、より好ましくは５．５～６．５である場合が挙げられる。
　また、本発明の別の特定態様においては、本発明の液体酵素製剤における３８ｗ／ｖ％以上又は４５ｗ／ｖ％以上のソルビトールは、活性の安定化に加えて、澱の抑制を目的として配合する場合もある。この態様において、澱抑制効果を高める観点から、本発明の液体酵素製剤におけるソルビトールの含有量としては、好ましくは４８ｗ／ｖ％以上又は５５ｗ／ｖ％以上、より好ましくは５８ｗ／ｖ％以上が挙げられる。同様に、本発明の別の特定態様においては、本発明の液体酵素製剤におけるタンパク質脱アミド酵素１Ｕ当たり１ｍｇ以上又は１．２５ｍｇ以上のソルビトールは、活性の安定化に加えて、澱の抑制を目的として配合する場合もある。この態様において、澱抑制効果を高める観点から、本発明の液体酵素製剤におけるタンパク質脱アミド酵素１Ｕ当たりのソルビトールの使用量としては、好ましくは１．３ｍｇ以上又は１．５ｍｇ以上、より好ましくは１．６ｍｇ以上が挙げられる。これらの態様に該当する例としては、本発明の液体酵素製剤のｐＨが６．７５以上７．５未満、より好ましくは６．８～７．２である場合が挙げられる。
　さらに、本発明のさらに別の特定態様においては、本発明の液体酵素製剤における４８ｗ／ｖ％以上又は５５ｗ／ｖ％以上のソルビトールは、活性の安定化に加えて、澱の抑制を目的として配合する場合もある。この態様において、澱抑制効果を高める観点から、本発明の液体酵素製剤におけるソルビトールの含有量としては、好ましくは５８ｗ／ｖ％以上が挙げられる。同様に、本発明の別の特定態様においては、本発明の液体酵素製剤におけるタンパク質脱アミド酵素１Ｕ当たり１．３ｍｇ以上又は１．５ｍｇ以上のソルビトールは、活性の安定化に加えて、澱の抑制を目的として配合する場合もある。この態様において、澱抑制効果を高める観点から、本発明の液体酵素製剤におけるタンパク質脱アミド酵素１Ｕ当たりのソルビトールの使用量としては、好ましくは１．６ｍｇ以上が挙げられる。これらの態様に該当する例としては、本発明の液体酵素製剤のｐＨが７．５以上の場合が挙げられる。
［１－３．亜硫酸塩、チオ硫酸塩、及びピロ硫酸塩］
　本発明の液体酵素製剤は、より一層優れた活性安定性を発現する観点から、さらに、所定の塩として、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、及び／又はピロ硫酸塩を含むことが好ましい。これら所定の塩としては、具体的には、アルカリ金属塩（カリウム塩、ナトリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩等）の金属塩が挙げられる。これら所定の塩は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　これらの中でも、更に優れた活性安定性を発現する観点から、亜硫酸塩及びピロ硫酸塩がより好ましく、亜硫酸塩がより一層好ましく、若しくは、アルカリ金属塩がより好ましく、ナトリウム塩が一層好ましい。さらにこれらの中でも、特に優れた活性安定性を発現する観点から、亜硫酸アルカリ金属塩が特に好ましく、亜硫酸ナトリウムが最も好ましい。
　本発明の液体酵素製剤が上記所定の塩を含む場合、当該所定の塩の配合量としては特に限定されず、付与すべき活性安定化の向上効果に応じて適宜設定すればよいが、例えば、０．０１～２ｗ／ｖ％、好ましくは０．０３～１ｗ／ｖ％、好ましくは０．０４～０．８ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０６～０．６ｗ／ｖ％又は０．０８～０．６ｗ／ｖ％、一層好ましくは０．１５～０．５５ｗ／ｖ％、０．２～０．５５ｗ／ｖ％、０．３～０．５５ｗ／ｖ％、又は０．４～０．５５ｗ／ｖ％が挙げられる。あるいは、タンパク質脱アミド酵素１Ｕ当たりの当該所定の塩の配合量としては、例えば、０．０００２５～０．０５ｍｇ、好ましくは０．０００８～０．０２６ｍｇ、好ましくは０．００１～０．０２３ｍｇ、より好ましくは０．００１５～０．０１７ｍｇ又は０．００２～０．０１７ｍｇ、一層好ましくは０．００４～０．０１５ｍｇ、０．００５～０．０１５ｍｇ、０．００８～０．０１５ｍｇ、又は０．０１～０．０１５ｍｇが挙げられる。
［１－４．他の成分］
　本発明の液体酵素製剤は、上記のタンパク質脱アミド酵素及びソルビトール以外に、本発明の効果に影響を与えない程度に、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、タンパク質脱アミド酵素以外の他の酵素、添加剤等が挙げられる。
　他の酵素としては、例えば、アミラーゼ（α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、グルコアミラーゼ）、グルコシダーゼ（α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ）、ガラクトシダーゼ（α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ）、プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ）、ペプチダーゼ（ロイシンペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ）、リパーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ホスファターゼ（酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ）、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、デキストラナーゼ、トランスグルタミナーゼ、プルラナーゼ等が挙げられる。これらの他の酵素は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　添加剤としては、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水、多価アルコール（上記ソルビトール以外の多価アルコールを指す。以下において同様。）、ｐＨ調整剤等が挙げられる。これらの添加剤は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　これらの添加剤の中でも、本発明の液体酵素製剤の活性安定性をより一層向上させる観点から、本発明の液体酵素製剤は、多価アルコールを実質的に含まないことが好ましい。多価アルコールには、グリセリン、プロピレングリコール等の非糖多価アルコール、及びソルビトール以外の糖アルコールが包含される。なお、多価アルコールを実質的に含まないとは、本発明の液体酵素製剤の活性安定性を損なわない程度の多価アルコールを含むことを許容する意味であり、具体的には、多価アルコールの含有量として、１ｗ／ｖ％以下、好ましくは０．１ｗ／ｖ％以下、より好ましくは０．０１ｗ／ｖ％以下が挙げられ、最も好ましくは０ｗ／ｖ％が挙げられる。
［１－５．製剤形態等］
　本発明の液体酵素製剤は液剤である。本発明の液体酵素製剤は、水に対して、配合される各成分を所定量添加して溶解させ、又は、タンパク質脱アミド酵素産生株の培養液から夾雑高分子等の不要成分を分離及び／又は精製によって除去してソルビトール水溶液を加え、その後、適宜ｐＨ調整剤を添加して所定のｐＨとなるように調整、並びに／若しくは、必要に応じて亜硫酸塩、チオ硫酸塩、及び／又はピロ硫酸塩を配合し、さらに必要に応じて滅菌することによって調製することができる。
　本発明の液体酵素製剤のｐＨ（２５℃）は、所望の活性安定性を得る観点から、５．５以上である。本発明の液体酵素製剤のｐＨ範囲の上限としては特に限定されないが、より一層優れた活性安定性を発現する観点から、８．２以下、好ましくは８．０以下、より好ましくは７．６以下、さらに好ましくは７．２以下、一層好ましくは７．０以下、６．８以下、６．５以下、６．２以下、６．０以下、又は５．７以下が挙げられる。
［１－６．用途］
　本発明の液体酵素製剤の用途としては、タンパク質脱アミド酵素活性を利用する任意の用途に利用することができる。例えば、本発明の液体酵素製剤は、タンパク質の改質を目的として用いることができる。タンパク質の改質の具体的な態様としては特に限定されず、タンパク質のグルタミン残基及びアスパラギン残基のγ－アミド基及びβ－アミド基の脱アミド化によりカルボキシル基が生じることでもたらされるタンパク質の特性変化を利用するものであればよい。具体的には、タンパク質の改質としては、タンパク質の可溶性の増大、水分散性の増大、乳化力の向上、及び乳化安定性等が挙げられる。
　従って、本発明のタンパク質脱アミド酵素液体酵素製剤は、食品分野において広く用いることができる。具体的には、通常の食品のｐＨ範囲である弱酸性条件環境において動物性蛋白質及び／又は植物性蛋白質の可溶性、分散性、乳化性などを向上させる用途（例えば、コーヒー・ホワイトナー、ジュースなどの酸性飲料、ドレッシング、マヨネーズ、クリームの製造用途）；植物性難溶解性蛋白質の可溶性、分散性の増大化（例えば、小麦グルテンを用いた天ぷら粉等の製造用途）；製パン・製菓におけるドウの改質用途（例えば、クラッカー、ビスケット、クッキー、ピザや或いはパイのクラストの製造用途）；食品中のアレルギー性蛋白質におけるアレルゲンの除去又は低減化用途（例えば、小麦アレルギー患者用の食品の製造用途）；蛋白質のミネラル感受性を低下させ、蛋白質及びミネラルを含む液体中の可溶性ミネラル含量を高め、ミネラルの人体への吸収性を高める用途（例えば、高ミネラル（例えばカルシウム）含有飲料、ミネラル（例えばカルシウム）の吸収促進剤の製造用途）；苦みを低下させる用途、プロテアーゼの蛋白質分解率を向上させる用途、及び／又はグルタミン酸含有量を増強させる用途（例えば、アミノ酸系調味料（動物性蛋白質の加水分解物（ＨＡＰ）、植物性蛋白質の加水分解物（ＨＶＰ））、味噌・醤油の製造用途）等が挙げられる。
［２．タンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤の酵素活性安定化剤及びタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤の澱抑制剤］
　上述の通り、タンパク質脱アミド酵素を含むｐＨ５．５以上の液体酵素製剤において、３０ｗ／ｖ％以上の濃度で配合されるソルビトールは、液体酵素製剤の活性安定性つまりタンパク質脱アミド酵素活性の安定性を向上させる。従って、本発明は、ソルビトールを有効成分として含み、ｐＨ５．５以上のタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤中で３０ｗ／ｖ％以上の濃度で用いられる、タンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤の酵素活性安定化剤も提供する。本発明のタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤の酵素活性安定化剤は、より一層優れた活性安定性を発現する観点から、ソルビトールに加えて、さらに、所定の塩として、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、及び／又はピロ硫酸塩を含むことが好ましい。
　また、上述の通り、タンパク質脱アミド酵素を含むｐＨ５．５以上の液体酵素製剤において、３０ｗ／ｖ％以上の濃度で配合されるソルビトールは、液体酵素製剤の澱を抑制することができる。従って、本発明は、ソルビトールを有効成分として含み、ｐＨ５．５以上のタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤中で３０ｗ／ｖ％以上の濃度で用いられる、タンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤の澱抑制剤も提供する。
　より好ましくは、本発明の澱抑制剤は、ｐＨ５．５以上６．７５未満のタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤中で３０ｗ／ｖ％以上の濃度で、ｐＨ６．７５以上７．５未満のタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤中で３８ｗ／ｖ％以上の濃度で、又は、ｐＨ７．５以上のタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤中で４８ｗ／ｖ％以上の濃度で用いられる。
　本発明のタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤の酵素活性安定化剤及びタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤の澱抑制剤において、各成分の種類、及び使用量等については、前記「１．液体酵素製剤」の欄に示す通りである。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［試験例１］
　プロテイングルタミナーゼ産生株であるクリセオバクテリウム・プロテオリティカム株の培養液から夾雑高分子等の不要成分を除去し、ソルビトール水溶液及び／又はグリセリン水溶液を加え、その後、１Ｎ塩酸又は１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを５．０又は６．０に調整し、タンパク質脱アミド酵素としてのプロテイングルタミナーゼ（ＰＧ）、ソルビトール、グリセリンの濃度が表１中の通りである液体酵素製剤を調製した。
　得られた液体酵素製剤を６０℃で７２時間放置した。放置前後におけるタンパク質脱アミド酵素活性値を、以下の方法で測定した。
　３０ｍＭ　Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１ｍＬにタンパク質脱アミド酵素を含む試料溶液０．１ｍＬを添加して、３７℃、１０分間放置した後、０．４Ｍ　ＴＣＡ溶液を１ｍＬ加えて反応を停止した。ブランクとして、３０ｍＭ　Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１ｍＬに０．４Ｍ　ＴＣＡ試液を１ｍＬ加え、さらにタンパク質脱アミド酵素を含む試料溶液０．１ｍＬを添加して、３７℃で１０分間放置した。
　前記で得られた溶液についてアンモニアテストワコー（富士フイルム和光純薬）を用い、反応液中に生じたアンモニア量の測定を行った。アンモニア標準液（塩化アンモニウム）を用いて作成したアンモニア濃度と吸光度（６３０ｎｍ）との関係を表す検量線より、反応液中のアンモニア濃度を求めた。
　タンパク質脱アミド酵素の活性を、１分間に１μｍｏｌのアンモニアを生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とし、以下の式から算出した。式中、反応液量は２．１、酵素溶液量は０．１、Ｄｆは酵素溶液の希釈倍率である。また、１７．０３はアンモニアの分子量である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　放置前におけるタンパク質脱アミド酵素活性値を１００％とした場合の、放置後におけるタンパク質脱アミド酵素活性値の相対値（％）を、残存活性として算出した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示すように、ＰＧの液体酵素製剤にグリセリンを配合した場合（比較例２～６）、ソルビトールを２０ｗ／ｖ％配合した場合（比較例７）、及びソルビトールを３０ｗ／ｖ％配合しｐＨを５．０に調整した場合（比較例８）のいずれにおいても、比較例１と対比して、活性安定性はあまり向上しなかったが、ソルビトールを３０ｗ／ｖ％配合しｐＨを６．０に調整した場合（実施例１）には、活性安定性の顕著な向上が認められた。
［試験例２］
　ｐＨを５．５、６．０、６．５、７．０又は８．０に調整し、ソルビトールの配合量を０ｗ／ｖ％、２０ｗ／ｖ％、３０ｗ／ｖ％、４０ｗ／ｖ％、５０ｗ／ｖ％、又は６０ｗ／ｖ％としたことを除いて、試験例１と同様にして、タンパク質脱アミド酵素としてのプロテイングルタミナーゼ（ＰＧ）及びソルビトールを含む（グリセリン不含）液体酵素製剤を調製した。液体酵素製剤中のＰＧ含有量は、３６０Ｕ／ｍｌであった。得られた液体酵素製剤について、試験例１と同様にして、６０℃、７２時間放置後の残存活性を測定した。結果を図１に示す。
　図１に示す通り、タンパク質脱アミド酵素と、３０ｗ／ｖ％以上のソルビトールとを含み、ｐＨ５．５以上である液体酵素製剤には、活性安定性の顕著な向上が認められた。
［試験例３］
　試験例２で得た液体酵素製剤を、１ｍｌずつマイクロチューブ（容量２．０ｍｌ）に分注し、６０℃、７２時間放置後の外観を観察し、澱の有無及びその程度を以下の基準に基づいて評価した。それぞれの基準に該当する外観の代表図を表２に示す。結果を表３に示す。
　　　－：澱が認められず、液体酵素製剤が澄明であった
　　　＋：ごくわずかな澱が認められた
　　＋＋：少量の澱が認められた
　＋＋＋：大量の澱が認められた
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３に示すとおり、ソルビトールを含まない場合には大量の澱が発生したが、ソルビトールを３０ｗ／ｖ％以上加えることによって、澱の抑制が認められた。特に液体酵素製剤のｐＨが５．５、６．０、及び６．５の場合は、ソルビトールを３０ｗ／ｖ％以上加えることによって優れた澱抑制効果が認められ、液体酵素製剤のｐＨが７．０の場合は、ソルビトールを４０ｗ／ｖ％以上加えることによって優れた澱抑制効果が認められ、液体酵素製剤のｐＨが８．０の場合は、ソルビトールを５０ｗ／ｖ％以上加えることによって優れた澱抑制効果が認められた。
［試験例４］
　試験例１で調製した実施例１の液体酵素製剤、及び実施例１の液体酵素製剤に、更に、亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ピロ硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム、又は塩化カリウムを表４に示す量で配合した液体酵素製剤を調製し、これらの液体酵素製剤の放置条件を４０℃、２週間としたことを除いて、試験例１と同様にして残存活性を測定した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表４から明らかなとおり、プロテイングルタミナーゼと３０ｗ／ｖ％のソルビトールとを含むｐＨ６．０の液体酵素製剤にさらに様々な塩を配合した場合にも、効果的に酵素活性安定化効果が得られていた。中でも、亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、又はピロ硫酸ナトリウムがさらに配合された場合に、より一層高い酵素活性安定化効果が得られており、この傾向は、亜硫酸ナトリウム及びピロ硫酸ナトリウムを配合した場合、特に亜硫酸ナトリウムを配合した場合に顕著であった。

Claims (9)

  1. 　タンパク質脱アミド酵素と、３０ｗ／ｖ％以上のソルビトールとを含み、ｐＨ５．５以上である、液体酵素製剤。
  2. 　前記ソルビトールの含有量が６５ｗ／ｖ％以下である、請求項１に記載の液体酵素製剤。
  3. 　ｐＨ８．２以下である、請求項１又は２に記載の液体酵素製剤。
  4. 　さらに、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、及び／又はピロ硫酸塩を含む、請求項１～３のいずれかに記載の液体酵素製剤。
  5. 　タンパク質脱アミド酵素活性が０．１～１０,０００Ｕ／ｍｌである、請求項１～４のいずれかに記載の液体酵素製剤。
  6. 　前記タンパク質脱アミド酵素がクリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来である、請求項１～５のいずれかに記載の液体酵素製剤。
  7. 　ソルビトールを有効成分として含み、ｐＨ５．５以上のタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤中で３０ｗ／ｖ％以上の濃度で用いられる、タンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤の酵素活性安定化剤。
  8. 　さらに、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、及び／又はピロ硫酸塩を含む、請求項７に記載のタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤の酵素活性安定化剤。
  9. 　ソルビトールを有効成分として含み、ｐＨ５．５以上のタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤中で３０ｗ／ｖ％以上の濃度で用いられる、タンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤の澱抑制剤。
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