WO2006028110A1

WO2006028110A1 - 水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法

Info

Publication number: WO2006028110A1
Application number: PCT/JP2005/016389
Authority: WO
Inventors: Kenji Yasugi; Teruo Nakamura; Tsuyoshi Shimoboji; Mika Sato
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2004-09-07
Filing date: 2005-09-07
Publication date: 2006-03-16
Also published as: EP1790665A4; US20140011991A1; US20120183567A1; JP5060131B2; EP1790665A1; KR20070105302A; JPWO2006028110A1; EP1790665B1; US9394379B2; KR101343757B1; TW200612991A; US8143391B2; US20090148534A1

Abstract

　薬物担体として実用的な水溶性ＨＡ修飾物、およびその製造方法を提供する。　本発明は、非プロトン性極性溶媒中で、ＢＯＰ系縮合剤を用い、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基にアミド結合で置換基を下限が５モル％以上導入することにより製造される、実用的なレベルまでその血中滞留時間を延長された水溶性ヒアルロン酸修飾物、およびその製造方法を提供する。　さらに、そのヒアルロン酸修飾物を架橋することにより、従来知られているゲルに比べ、同じ架橋性官能基導入率でも非常に長い薬物徐放が可能となるヒアルロン酸ゲルを提供する。

Description

明細書

水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、薬物担体として有用な水溶性ヒアルロン酸修飾物、該ヒアルロン酸修飾物の製造方法、該ヒアルロン酸修飾物と薬物とのコンジュゲート、および該ヒアルロン酸修飾物から得られるゲルに関する。

背景技術

[0002] 一般に、低分子薬物、ペプチド薬物、タンパク質薬物等の血中滞留性の向上、安定性の向上、溶解性の向上、抗原性の低減等を目的として、薬物と水溶性ポリマーとのコンジユゲーシヨンが試みられている。特に、ポリエチレングリコール（以下、「PEG 」とも称す)は、その不活性な性質と生体内でのタンパク質による薬物の吸着を防ぐ効果を有することから広く用いられており、 PEGコンジユゲートイ匕タンパク質は医薬品として既に実用化の段階に入っている。しかし、 PEGは生分解性ポリマーではない為、長期投与により体内に蓄積した場合の安全性等の問題は明らかでない。更には、最近、 PEGコンジュゲート化リボソームにお、て投与 2回目のクリアランスが異常に早い現象（Accerelated Blood Clearance現象、以下「ABC現象」とも称す）が報告されており（非特許文献 1および 2を参照）、 PEGコンジュゲート化医薬品の安全性、有効性は十分に確立されたとは言、難、。

[0003] ヒアルロン酸（以下、「HA」とも称す）は、 1934年、 K. Meyerによって牛の眼の硝子体から単離された多糖であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。 HAは、 D—グルクロン酸と N—ァセチルダルコサミンとが j8 (1→3)グリコシド結合により連結された二糖単位力も成るダルコサミドダリカンの一種である。ヒアルロン酸は、その化学的および物理的構造に種差が無ぐヒトにおいてもヒアルロン酸の代謝系が存在する。さらに免疫性または毒性の点に関しても非常に安全な生体材料（ Biomaterial)ということができる。近年、細胞の接着、増殖、移動の誘導に関するヒアルロン酸の生理活性物質としての側面が注目されている。また、微生物による高分子量のヒアルロン酸の大量生産が可能となり、関節疾患治療薬などの医薬として実用化されており、化粧品等の分野においても実用化が進んでいる。さらに、薬物をヒアルロン酸とコンジュゲートすることで、薬物の癌組織へのターゲテイング (特許文献

1を参照）、肝臓へのターゲティング (特許文献 2を参照）、抗原性の低減 (特許文献 3 を参照）、血中滞留時間の延長 (特許文献 4、 5および 6を参照)等が達成できるという報告がなされている。

[0004] 汎用されている PEGと比べて、薬物のコンジュゲート担体としてヒアルロン酸を用いる際の利点は、生分解性を有する点、巨大サイズィ匕が可能な点、さらに、 1分子中に多くの反応点を持っため、複数の薬物（同一薬物を複数、或いは 2種類以上の薬物) を 1分子中に担持できるということである。このような利点を有するヒアルロン酸を薬物コンジュゲート担体として用いることは、ターゲティング、徐放等、より高度な薬物動態制御機能を持つコンジュゲートを設計開発する手段となる。また、ヒアルロン酸は生分解性である上に、その化学的構造に種差が無いことから、安全性という点においても PEGよりも優れた担体であると、える。

[0005] しかし、ヒアルロン酸自体の血中滞留時間は短ぐ静脈内注射（以下、「iv」とも称す )で半減期が 2分間であると報告されている (非特許文献 3を参照)。本発明者の検討においても、ただ単にヒアルロン酸を薬物にコンジュゲートしただけでは、薬物の血中滞留時間の大きな延長や、薬効の持続性の向上は確認されなかった。ヒアルロン酸の主代謝部位は肝臓およびリンパ腺であり、その代謝は、主に CD44、 RHAMM、 HARE等のヒアルロン酸に特異的に結合する細胞膜局在レセプターを介した細胞内への取り込みとそれに引き続くヒアル口-ダーゼによる分解によるものである。これらの分子は共に、ヒアルロン酸の連続した遊離のカルボキシ基 (6糖)を主な認識部位にして!/、ることが報告されて、る（非特許文献 4を参照)。

[0006] 従って、血中滞留時間が短いというヒアルロン酸の問題を克服すベぐヒアルロン酸に置換基を導入したヒアルロン酸修飾物を薬物担体として利用する試みもある（特許文献 4、 5および 6を参照)。一般に、ヒアルロン酸に置換基を導入すればその血中滞留時間は延長され、その程度は置換基の導入率と相関すると考えられる。ヒアルロン酸の様々な位置に置換基が導入されたヒアルロン酸修飾物が報告されてヽる。その中でも、ヒアルロン酸におけるグルクロン酸部分のカルボキシ基に加水分解されにく、アミド結合を介して置換基を導入することが、得られるヒアルロン酸修飾物とヒアルロン酸レセプターとの結合阻害において効果的であり、当該ヒアルロン酸修飾物は血中滞留時間の面において優れていると考えられる。

[0007] 一方、ヒアルロン酸をテトラブチルアンモ -ゥム塩にし、ジメチルスルホキシド中で置換基と反応させることによって、ヒアルロン酸のカルボキシ基をアミド化したヒアルロン酸修飾物 (特許文献 7を参照)も報告されているが、この発明は架橋体調製を目的としたもので、血中滞留性延長を目指したものではない。さらに言えば、この発明においては縮合剤として 1, 1—カルボ-ルジイミダゾール (以下、「CDI」とも称す)を用いている。我々の検討では、縮合剤として CDIを用いても血中滞留性が充分に延長された (ヒアル口-ダーゼによる分解に対して充分な耐性を持つような)ヒアルロン酸誘導体を得ることはできず、さらに、反応中にヒアルロン酸分子量が大きく低下することが確認されている。

[0008] これら以外にも、水と極性有機溶媒の混合溶媒中で、ヒアルロン酸のカルボキシ基に置換基を導入した例も報告されている (特許文献 8を参照)。しかしながら、得られたヒアルロン酸修飾物につ、て、血中滞留時間の延長が見られるかどうかににつ!ヽては一切触れられて!/、な、。

[0009] このように、薬物担体として実用的な水溶性ヒアルロン酸修飾物、特に血中滞留時間を実用的なレベルまで延長した水溶性ヒアルロン酸修飾物は知られておらず、その製造方法も知られて、な力つた。

[0010] 近年実用化されている薬効を持つタンパク質、ペプチドの製剤薬物は一般に血中半減期が短ぐまたその大部分が頻回投与の注射剤であるため、薬剤投与における患者の負担は過大なものとなっており、できるだけ少量で薬効を発揮させ且つ投与回数も少なくできる、タンパク質またはペプチド薬剤の実用的な徐放型製剤が望まれている。また、低分子化合物力もなる薬物もその血中半減期の短さから持続製剤のニーズは高い。

[0011] 例えば、ポリ乳酸ーグリコール酸共重合体 (以下、「PLGA」とも称す)等の生分解性高分子を基材にした徐放製剤が試みられている力基材の疎水性、乾燥工程、 p Hの低下に起因するタンパク質の変性、凝集が報告されている（非特許文献 5および 6を参照)。親水性のハイド口ゲルを基材に用いた徐放製剤も報告されているが、やはり実用化には至っておらず、タンパク質またはペプチドの封入率、回収率および安全性の全てにおいて、実用化レベルに達してヽる徐放型製剤は現在のところ実現していない。

非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持ち、安全性の面カゝら好ま U、と考えられる HAを徐放基材に用いた架橋方法、 HAゲルからのタンパク質ゃぺプチド薬物の徐放も多数報告されてヽる。 HAをィ匕学架橋でゲル化させる方法としては、カルポジイミド法 (特許文献 9参照）、ジビニルスルホン法 (特許文献 10参照）、グリシジルエーテル法 (特許文献 11参照）等が知られている。一般に、ゲル中にタンパク質またはペプチドを封入する際、架橋後にタンパク質またはペプチドを導入する方法では、 HAとタンパク質またはペプチドとの相溶性、静電反発等の問題でその導入率は低い。一方でタンパク質またはペプチド存在下で、 in situ架橋を行うと、高封入率でタンパク質またはペプチドを担持させられる利点がある。こうした in situ架橋により、 HAゲル中にタンパク質またはペプチドを封入し、徐放させる製剤についての報告がなされている（例えば、特許文献 12参照)。しかし、こうした方法を用いてタンパク質またはペプチド存在下で HAを in situ架橋すると、回収率の点で問題がある。例えば、ヒドラジド基 (以下、「HZ」とも称す)を導入した HA誘導体 (以下、「HA— HZ」とも称す)を N—ヒドロキシスクシンイミド (以下、「NHS」とも称す)エステルカゝらなる架橋剤で架橋する方法 (特許文献 13参照）が報告されているが、生理条件下での in s itu架橋を目的としているため、 pH7.4〜8. 5で架橋形成反応を行っているが、本発明者らによる検討では、この方法で得られる HAゲルからのタンパク質またはべプチドの回収率は低い。この原因は、架橋反応中にタンパク質またはペプチドの一部（主にァミノ基）が架橋剤と反応し、タンパク質が架橋してしまう点にある。またゲル中に残つた変性したタンパク質またはペプチドは、生物活性が低下しており、むしろ抗原性発現の原因になる等の問題がある。封入した薬物が高回収率で放出されることは、医薬品として必須の条件であり、タンパク質またはペプチドを反応させずに HAをィ匕学架橋、ゲルイ匕させる方法は知られていない。また、高回収率でタンパク質ペプチドを封入する方法として、ポリエチレングリコール (PEG)を基材に不飽和官能基を求核付加反応で架橋する報告もあるが (特許文献 14参照）、生分解性でなヽ PEG断片が残存する問題がある。また、こうした問題点を解決する為、タンパク質、ペプチドとの反応性を極力抑えたヒアルロン酸ゲルも報告されているが（特許文献 15参照）、徐放期間は 1週間程度に留まっている。

[0013] さらに、こうした薬物徐放性物質を注射可能な製剤とするには、これを微粒子化する必要がある。こうした検討にスプレードライヤーは広く使用されており、インシュリン ( 非特許文献 7、非特許文献 8参照)、 rh抗 IgE抗体 (非特許文献 9参照)を微粒子化した報告、ヒアルロン酸の微粒子中に薬物を封入した報告 (特許文献 16、特許文献 17参照）はあるが、共に短時間に皮下で溶解してしまうため薬物徐放期間は非常に短ぐ徐放目的としての実用性は低い。また、スプレードライ中にキトサンの架橋反応を行い、低分子薬物を封入する報告 (非特許文献 10参照)もあるが、放出期間は数分と短ぐ架橋剤に用いるアルデヒドがアミノ基などの官能基と高い反応性を有するため、タンパク質、ペプチド、その他のアミノ基などの官能基を有する低分子薬物には使用することができない。

[0014] このように、水溶性ヒアルロン酸修飾物を基材とした実用的な徐放型製剤は知られておらず、その製造方法も知られていな力つた。

特許文献 1：国際公開 WO92Z06714号パンフレット

特許文献 2：特開 2001— 81103号公報

特許文献 3 :特開平 2— 273176号公報

特許文献 4：特開平 5— 85942号公報

特許文献 5：国際公開 WO01Z05434号パンフレット

特許文献 6:国際公開 WO01Z60412号パンフレット

特許文献 7：特表 2002— 519481号公報

特許文献 8:国際公開 W094Z19376号パンフレット

特許文献 9:国際公開第 94Z02517号パンフレット

特許文献 10：特開昭 61— 138601号公報

特許文献 11 :特開平 5— 140201号公報

特許文献 12 :米国特許第 5827937号明細書特許文献 13 :国際公開 95Z15168号パンフレット

特許文献 14:国際公開第 00Z44808号パンフレット

特許文献 15：国際公開第 04Z046200号パンフレット

特許文献 16：特許第 3445283号公報

特許文献 17:国際公開 W096Z18647号パンフレット

非特許文献 l :Int. J. Pharm.第 255卷、第 167— 174頁、 2003年

非特許文献 2 : Control. Rel.第 88卷、第 35— 42頁、 2003年

非特許文献 3 :J. Inter. Med.第 242卷、第 27— 33頁、 1997年

非特許文献 4:Exp. Cell Res.第 228卷、第 216— 228頁、 1996年

非特許文献 5 : Pharm. Sci.第 88卷、第 166— 173頁、 1999年

非特許文献 6 :J. Microencapsulation 第 15卷、第 699— 713頁、 1998年非特許文献 7 :Int. J. Pharm.第 233卷、第 227— 237頁、 2002年

非特許文献 8 :J. Control. Rel.第 91卷，第 385— 394頁， 2003年

非特許文献 9 : Biotech, and Bioeng.第 60卷，第 301— 309頁， 1998年非特許文献 10 : Int. J. Pharm.第 187卷，第 53— 65頁， 1999年

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0015] 発明が解決しょうとする課題は、薬物担体として実用的な水溶性ヒアルロン酸修飾物、該ヒアルロン酸修飾物の製造方法、該ヒアルロン酸修飾物と薬物とのコンジュゲート、および該ヒアルロン酸修飾物力得られる、タンパク質、ペプチド、核酸または低分子化合物、あるいはそれらと高分子のコンジュゲートを封入し、長期間徐放できる安全性の高いヒアルロン酸ゲルを提供することにある。

課題を解決するための手段

[0016] ヒアルロン酸修飾物を合成するに際し、一般的にヒアルロン酸修飾物の合成において汎用されている方法に従って、水中での脱水縮合反応によりヒアルロン酸に置換基を導入した場合、ヒアルロン酸のカルボキシ基の修飾率は最大でも約 70モル％程度である上、このヒアルロン酸のカルボキシ基を最大限修飾したヒアルロン酸修飾物であっても実用的な薬物担体としては不充分なものであった。例えば、薬物担体としては大きな分子量を有するヒアルロン酸 (分子量 58万ダルトン (Da) )を用い、その力ルボキシ基の 73モル⁰ /₀を修飾したヒアルロン酸修飾物であっても、ラットにおける平均血中滞留時間（MRT)は 16時間程度でしかなぐ実用的な薬物担体としては不充分であった (本願明細書比較例 5— 1)。

[0017] 本発明者は、カゝかる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、非プロトン性極性溶媒中で、特定の縮合剤を用い、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基に置換基をアミド結合で導入することにより得られた水溶性ヒアルロン酸修飾物力従来の水溶性ヒアルロン酸修飾物では得られな、実用的なレベルまでその血中滞留時間を延長できることを見出し、また、得られたヒアルロン酸修飾物を架橋したヒアルロン酸ゲルが従来知られて、る方法で架橋したゲルに比べ、同じ架橋性官能基導入率でも非常に長!ヽ徐放機能を示すことを見出し、本発明を完成させた。

[0018] 本発明の 1つの側面によれば、非プロトン性極性溶媒中で、式 (Π)：

[0019] [化 1]

[0020] [式中、 R^1Q、 R^U、 R¹²、 R¹³、 R¹⁴および R¹⁵は、それぞれ独立に C アルキル基から選

1-6

択され、または R¹⁰および R^U、 R¹²および R¹³、ならびに R"および R¹⁵は、それぞれ独立にそれらが結合する窒素原子と一緒になつて含窒素へテロ環を形成してもよぐ環 B は置換されて、てもよ、単環式または縮環式の含窒素へテロ環基であり、 X—はァ- オンを表す]

で表される縮合剤を使用して、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基を、 5モル％以上の修飾率で置換アミド基に変換する工程を含む、水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法が提供される。

[0021] 当該側面の 1つの態様において、カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の置換基は、少なくとも 1以上の官能基を含む。ここで、前記置換基に官能基が複数存在する場合、当該官能基は同一の種類であっても異なる種類であってもよい。また、前記ヒアルロン酸修飾物に含まれる置換アミド基は全てが同一の種類であってもよく、また異なる種類の置換アミド基が前記ヒアルロン酸修飾物に含まれて、てもよ!/、。

[0022] 置換アミド基に含まれる当該官能基は、例えば、置換されていてもよいアミノ基、水酸基、メルカプト基、カルボキシ基、アルデヒド基、メタクリロイル基、およびアタリロイル基であってもよぐ好ましくは、置換されていてもよいアミノ基、水酸基、メルカプト基、メタクリロイル基およびアタリロイル基である。ここで、当該官能基の種類は、好ましくは 1または 2種類であり、 2種類の場合はその内の 1種類が水酸基であるのが好ましい。置換アミド基 1個あたりの当該官能基の総数は、例えば 1〜： LO個、好ましくは 1〜 9個、さらに好ましくは 1〜4個である。置換アミド基 1個あたりの当該官能基の総数が 2個以上の場合、その内の 1個の官能基が水酸基以外であり、その余の官能基は、全て水酸基であるか、全ての官能基が水酸基であるのが好ましい。当該置換アミド基の置換基は、例えば、アミノアルキル基（このアミノアルキル基のアルキレン鎖は 1個以上、例えば 1〜9個、好ましくは 1〜8個、さらに好ましくは 1〜3個の水酸基で置換されていてもよい。以下全ての「ァミノアルキル基」について、この記述が付加される。 )、ァミノ（ポリアルキレンォキシ)アルキル基、ァミノ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、ヒドロキシアルキル基（このヒドロキシアルキル基のアルキレン鎖は 1個以上、例えば 1〜9個、好ましくは 1〜8個、さらに好ましくは 1〜3個の水酸基で置換されていてもよい。以下全ての「ヒドロキシアルキル基」について、この記述が付加される。）、ヒドロキシ（ポリアルキレンォキシ)アルキル基、ヒドロキシ (ポリアルキレンァミノ)アルキル基、メルカプトアルキル基、メルカプト（ポリアルキレンォキシ）アルキル基、メルカプト（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、メタクリロイルォキシアルキル基、メタクリロイルアミノアルキル基、メタクリロイルァミノ（ポリアルキレンォキシ）アルキル基、メタクリロイルァミノ (ポリアルキレンァミノ）アルキル基、メタクリロイルォキシ（ポリアルキレンォキシ）アルキル基、メタクリロイルォキシ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、アタリロイルォキシァルキル基、アタリロイルァミノアルキル基、アタリロイルァミノ（ポリアルキレンォキシ）ァルキル基、アタリロイルァミノ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、アタリロイルォキシ（ポリアルキレンォキシ)アルキル基またはアタリロイルォキシ (ポリアルキレンァミノ）ァルキル基であってもよ、。

より具体的には、ァミノ C アルキル基（このァミノ C アルキル基のアルキレン鎖

2-10 2-10

は 1個以上、好ましくは 1〜8個、さらに好ましくは 1〜3個の水酸基で置換されていてもよヽ）、ァミノ（ポリ C アルキレンォキシ）アルキル基、ァミノ（ポリ C アルキレンァ

2-10 2-10

ミノ）アルキル基、ヒドロキシ C アルキル基（このヒドロキシ C アルキル基のアルキ

2-10 2-10

レン鎖は 1個以上、好ましくは 1〜8個、さらに好ましくは 1〜3個の水酸基で置換されて！ヽてもよ！/ヽ）、ヒドロキシ（ポリ C アルキレンォキシ）アルキル基、ヒドロキシ（ポリ C

2-10 2- アルキレンァミノ）アルキル基、メルカプト C アルキル基、メルカプト（ポリ C アル

10 2-10 2-10 キレンォキシ）アルキル基、メルカプト（ポリ C アルキレンァミノ）アルキル基、メタタリ

2-10

ロイルォキシ C アルキル基、メタクリロイルァミノ C アルキル基、メタクリロイルァミノ（

2-6 2-6

ポリ C アルキレンォキシ）アルキル基、メタクリロイルァミノ（ポリ C アルキレンァミノ

2-10 2-10

)アルキル基、メタクリロイルォキシ（ポリ C アルキレンォキシ）アルキル基、メタクリロ

2-10

ィルォキシ（ポリ C アルキレンァミノ）アルキル基、ァクリロイルォキシ C アルキル基

2-10 2-6

、ァクリロイルァミノ c アルキル基、ァクリロイルァミノ（ポリ C アルキレンォキシ）ァ

2-6 2-10 ルキル基、ァクリロイルァミノ（ポリ C アルキレンァミノ）アルキル基、ァクリロイルォキ

2-10

シ（ポリ C アルキレンォキシ）アルキル基またはアタリロイルォキシ (ポリ C アルキ

2-10 2-10 レンァミノ）アルキル基であってもよ！/、。

ここで、カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の種類は、単一でも複数でもよい。複数の種類とは 2〜4種類、好ましくは 2または 3種類、さらに好ましくは 2種類を意味する。カルボキシ基の変換により生じる複数種類の置換アミド基を有する本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法としては、あら力じめアミノ基を有する化合物を複数混合しておき、この混合物とヒアルロン酸およびその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基とを縮合させる方法が挙げられる。あるいは、ヒアルロン酸およびその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基が全て反応しない程度の量、例えば 5〜95モル％の第 1のアミノ基を有する化合物を縮合させ、次いで、残存するカルボキシ基に対し第 2のアミノ基を有する化合物を縮合させ、以降必要な回数の同じ操作を繰り返してもよい。カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の種類が複数である場合は、各々の置換アミド基への変換時の修飾率を合算して、ヒアルロン酸およびその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基の修飾率とする。複数の置換アミド基の組み合わせの具体例としては、置換されていてもよ V、ァミノ基で置換されたアミド基と水酸基で置換されたアミド基；置換されて!、てもよ!/ヽァミノ基で置換されたアミド基とメルカプト基で置換されたアミド基；置換されてヽてもよいアミノ基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアタリロイル基で置換されたアミド基；水酸基で置換されたアミド基とメルカプト基で置換されたアミド基；水酸基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアタリロイル基で置換されたアミド基;メルカプト基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアタリロイル基で置換されたアミド基；置換されて、てもよ、ァミノ基で置換されたアミド基と水酸基で置換されたァミド基とメルカプト基で置換されたアミド基；置換されてヽてもよヽァミノ基で置換されたアミド基と水酸基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアタリロイル基で置換されたアミド基；置換されてヽてもよヽァミノ基で置換されたアミド基とメルカプト基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアタリロイル基で置換されたアミド基；水酸基で置換されたアミド基とメルカプト基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアタリロイル基で置換されたアミド基；置換されて!、てもよ、ァミノ基で置換されたアミド基と水酸基で置換されたアミド基とメルカプト基で置換されたアミド基とメタクリロィル基もしくはアタリロイル基で置換されたアミド基という組み合わせが挙げられる力置換されて、てもよ、ァミノ基で置換されたアミド基と水酸基で置換されたアミド基、水酸基で置換されたアミド基とメルカプト基で置換されたアミド基および水酸基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアタリロイル基で置換されたアミド基の組み合わせが好ましぐ置換されていてもよいァミノ基で置換されたアミド基と水酸基で置換されたアミド基の組み合わせがさらに好まし、。

より具体的には、以下の i)〜iv)の 4つの群について、 i)と ii)、 i)と iii)、 i)と）、 ii)と iii)、 ii)と iv)、 iii)と iv)； i)と )と iii)、 i)と ii)と iv)、 i) tin)と iv)、 ii)と iiiリと iv)； i)と )と iii)と )という組み合わせを作成し、それぞれの群から任意の 1つの基を選ぶことによって形成される組み合わせが挙げられる：

i)アミノアルキル基で置換されたアミド基、ァミノ（ポリアルキレンォキシ)アルキル基で置換されたアミド基およびアミノ (ポリアルキレンァミノ)アルキル基で置換されたアミド基；

ii)ヒドロキシアルキル基で置換されたアミド基、ヒドロキシ（ポリアルキレンォキシ）ァルキル基で置換されたアミド基およびヒドロキシ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基で置換されたアミド基；

iii)メルカプトアルキル基で置換されたアミド基、メルカプト（ポリアルキレンォキシ）アルキル基で置換されたアミド基およびメルカプト（ポリアルキレンァミノ）アルキル基で置換されたアミド基；および

iv)メタクリロイルォキシアルキル基で置換されたアミド基、メタクリロイルアミノアルキル基で置換されたアミド基、メタクリロイルァミノ（ポリアルキレンォキシ)アルキル基で置換されたアミド基、メタクリロイルァミノ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基で置換されたアミド基、メタクリロイルォキシ (ポリアルキレンォキシ）アルキル基で置換されたアミド基、メタクリロイルォキシ (ポリアルキレンァミノ）アルキル基で置換されたアミド基、ァクリロイルォキシアルキル基で置換されたアミド基、アタリロイルァミノアルキル基で置換されたアミド基、アタリロイルァミノ（ポリアルキレンォキシ)アルキル基、アタリロイルァミノ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、アタリロイルォキシ（ポリアルキレンォキシ）ァルキル基およびアタリロイルォキシ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基で置換されたァミド基。

中でも、 i)と ii)、 ii)と iii)および ii)と )の組み合わせが好ましぐさらに、アミノアルキル基で置換されたアミド基とヒドロキシアルキル基で置換されたアミド基、アミノアルキル基で置換されたアミド基とヒドロキシ (ポリアルキレンォキシ)アルキル基で置換されたアミド基、ァミノ (ポリアルキレンォキシ)アルキル基で置換されたアミド基とヒドロキシアルキル基で置換されたアミド基およびアミノ（ポリアルキレンォキシ)アルキル基で置換されたアミド基とヒドロキシ (ポリアルキレンォキシ)アルキル基で置換されたアミド基の組み合わせが好ましぐさらにまた、アミノアルキル基で置換されたアミド基とヒドロキシアルキル基で置換されたアミド基の組み合わせが特に好ましい。 [0026] カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の種類としては、単一であるか 2種類であるのが好ましい。

[0027] カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基およびその組み合わせとしては、上記 i)、 iii)および iv)の各群中に記載された置換アミド基単独、並びに、これらと、ヒドロキシアルキル基で置換されたアミド基との組み合わせ、ヒドロキシ (ポリアルキレンォキシ )アルキル基で置換されたアミド基との組み合わせが好まし!/、。

[0028] ヒアルロン酸またはその誘導体と反応させる化合物の例には、式：

HN- CH (CHR⁵) — CH -NH；

2 2 m-2 2 2

HN- CH一 CH一（Y¹- -CH一 CH ) - -NH；

2 2 2 2 2 n 2

HN- CH (CHR⁶) -CH -OH;

2 2 P-2 2

HN- CH一 CH一（Y²- — CH— CH ) - OH;

2 2 2 2 2 r

HN- (CH) SR⁷;

2 2 j

HN- CH一 CH一（Y³- -CH一 CH ) - -SR⁸;

2 2 2 2 2 z

HN- (CH) O— CO — C(R¹⁶)=CH

2 2 1 2 ί

HN- (CH) -NHCO — C(R")=CH

2 2 q 2 ί

HN- CH CH (Y⁴- — CH— CH ) - NHCO-

2 2 2 2 2 t

HN- CH一 CH一（Y⁵- -CH一 CH ) - O— CO

2 2 2 2 2 y

[式中、 m、 1、 p、 jおよび qは、それぞれ独立に 2〜10から選択される整数であり、 n、 r 、 z、 tおよび yは、それぞれ独立に 1〜200から選択される整数であり、 R⁵および R⁶はそれぞれ独立に水素原子または水酸基であり、 R⁷は、水素原子、保護基または S - (CH ) -NHであり、 R⁸は、水素原子、保護基または— S— (CH -CH— Y³)

2 j 2 2 2 z

-CH -CH -NHであり、 R¹⁶、 R¹⁷、 R¹⁸、および R¹⁹はそれぞれ独立して、水素原

2 2 2

子またはメチル基であり、

Υ⁴および Υ⁵は、それぞれ独立して、酸素原子または ΝΗ である]

で表される、化合物が含まれる。

[0029] 上記式中の—（CHR⁵) -において m力以上の場合の R⁵は水素原子または水 m-2

酸基力それぞれ独立に選択されるものであり、 - (CHR⁵) —は例えば (m— 2)個 m-2

ある CHR⁵ が任意の割合および順番で CH—と CHOH とが混在して!/、る状態を示す。（m— 2)個ある— CHR⁵ が任意の割合および順番で— CH—と— C

2

HOH とが混在している状態には、（111 2)個のー( 1¾ ⁵—全てがー( 11—および

2

— CHOH である場合も含まれる。 mが 2である時は—（CHR⁵) —は単結合を意 m-2

味する。

[0030] 上記式中の—（CHR⁶) —において pが 4以上の場合の R⁶は水素原子または水酸

P-2

基力もそれぞれ独立に選択されるものであり、—（CHR⁶) —は例えば (p— 2)個あ

P-2

る CHR⁶ -が任意の割合および順番で CH と一 CHOH -とが混在して、る

2

状態を示す。（p— 2)個ある CHR⁶—が任意の割合および順番で—CH—と—CH

2

OH とが混在している状態には、（p— 2)個の— CHR⁶—全てが— CH—および—

2

CHOH である場合も含まれる。 pが 2である時は—（CHR⁶) -は単結合を意味

P-2

する。

[0031] R⁷および R⁸の定義に含まれる保護基は、メルカプト基の保護が可能な保護基を意味し、その具体例は、例えば T. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective Grou ps in Organic Synthesis, Third Edition, John Wiley & Sons, Inc. , N ew York, 1999〖こ記載されている。中でも基中に 1級アミノ基を有しない基が好ましぐさらにェチルチオ基および tーブチルチオ基等の C アルキルチオ基、並びに 2

1-6

-トロフエ-ルチオ基、 2—カルボキシフエ-ルチオ基等の置換フエ-ルチオ基が好ましい。さらにまた、 2—ピリジルチオ基等のへテロアリールチオ基も好ましい。

[0032] R⁷としては、 S— (CH ) — NHおよび 2 ピリジルチオ基が好ましぐ R⁸としては、

2 j 2

— S— (CH— CH — Y³) — CH— CH — NHおよび 2—ピリジルチオ基が好ましい

2 2 z 2 2 2

[0033] ここで、反応させる化合物の種類は、単一であっても複数であってもよ!/、。反応させる化合物の種類としては、単一である力 2種類であるのが好ま U、。

[0034] 複数の反応させる化合物の組み合わせの具体例としては、以下の i)〜iv)の 4つの群につヽて、 i)と iiリ、 i)と iii)、 i)と ivリ、 ii)と iiu、 ii)と iv)、 iii)と iv) ; i)と )と iii)、 ι)と ii )と）、 i)と iii)と）、 ii)と iii)と）； i)と）と iii)と） t 、う組み合わせを作成し、それぞれの群力任意の 1つの化合物を選ぶことによって形成される組み合わせが挙げられる： i) H N-CH (CHR⁵) —CH—而、および H N CH —CH (Y'-CH

2 2 m-2 2 2 2 2 2 2

— CH ) — NH；

2 n 2

ii) H N— CH — (CHR⁶) — CH — OH、および H N— CH — CH— (Y²— CH

2 2 p-2 2 2 2 2 2 CH ) OH;

2 r

iii) H N— (CH ) — SR⁷、および H N—CH — CH - (Y³— CH — CH ) — SR⁸;

2 2 j 2 2 2 2 2 z および

iv) H N— (CH ) — O— CO— C(R¹⁶) =CH、 H N— (CH ) — NHCO— C(R")

2 2 1 2 2 2 q

=CH、 H N— CH— CH - (Y⁴— CH — CH ) — NHCO— C(R¹⁸) =CH、およ

2 2 2 2 2 2 t 2 ひ N-CH CH —（Y⁵— CH — CH ) O— CO— C(R¹⁹) =CH。

2 2 2 2 2 y 2

[0035] 中でも、 i)と ii)、 ii)と iii)および ii)と )の組み合わせが好ましぐさらに、

H N-CH (CHR⁵) CH — NHと H N— CH — (CHR⁶) CH— OH;

2 2 m-2 2 2 2 2 p-2 2

H N-CH (CHR⁵) CH — NHと H N— CH — CH —（Y²— CH — CH )

2 2 m-2 2 2 2 2 2 2 2 r OH;

H N-CH CH—（Y¹— CH— CH ) 一而と H N-CH (CHR⁶) CH

2 2 2 2 2 n 2 2 2 p-2 2 OH;および

H N-CH CH—（Y¹— CH— CH ) 一而と H N-CH CH—（Y²— CH

2 2 2 2 2 n 2 2 2 2 2 CH ) OH

2 r

の組み合わせが好ましぐさらにまた、 H N— CH— (CHR⁵) — CH— NHと H N

2 2 m-2 2 2 2

-CH - (CHR⁶) -CH—OHの化合物の組み合わせが特に好ましい。

2 p-2 2

[0036] 反応させる化合物およびその組み合わせとしては、上記 i)、 iii)および iv)の各群中に記載された化合物単独、並びに、これらと、 H N— CH— (CHR⁶) -CH -OH

2 2 p-2 2 との組み合わせ、 H N— CH —CH—（Y²— CH—CH ) — OHとの組み合わせが

2 2 2 2 2 r

好ましい。

[0037] 本発明の別の側面にぉ、て、前記水溶性ヒアルロン酸修飾物が式 (I)：

[0038] [化 2]

[0039] [式中、 Ri、 R²、 R³および R⁴は、それぞれ独立に、水素原子、 C アルキル基または C

1-6

アルキルカルボニル基から選択され、

1-6

Raは、水素原子または C アルキル基であり、

1-6

Rbは、水素原子、 C アルキル基または基—CO— C (R²°) = CHであり、

1-6 2

Aは、一 CH— (CHR⁵) - CH 一 NH 、一 CH — CH—（Y¹— CH— CH ) 一

2 m-2 2 2 2 2 2 n

NH 、一 CH — (CHR⁶) 一 CH— O 、一 CH — CH—（Y²— CH— CH ) 一 Ο

2 ρ-2 2 2 2 2 2 r 一、 - (CH ) — S -、 - CH - CH - (Y³— CH— CH ) — S -、 - (CH ) O—、

2 j 2 2 2 2 z 2 1 一 (CH ) 一 NH—、 - CH - CH 一（Y⁴— CH — CH ) 一 NH または一 CH — C

2 q 2 2 2 2 t 2

H (Y⁵- CH - CH ) —O—であり、

2 2 2 y

ここで、 m、 1、 p、 jおよび qは、それぞれ独立に 2〜10から選択される整数であり、 n、 r 、 z、 tおよび yは、それぞれ独立に 1〜200から選択される整数であり、 R⁵および R⁶はそれぞれ独立に水素原子または水酸基であり、 R^2Qは、水素原子またはメチル基であり、

Υ⁴および Υ⁵は、それぞれ独立して、酸素原子または— NH である] で表される繰り返し単位を分子内に少なくとも 1以上含むものである、上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法が提供される。

[0040] ここで、—A—Rbの種類は、単一でも複数でもよぐ—A—Rbの種類としては、単一である力 2種類であるのが好まし!/、。複数の A— Rbの組み合わせの具体例としては、以下の i)〜iv)の 4つの群につ!、て、 i) tii)、 i)と iii)、 i) tiv)、 ii)と iii)、 ii) tiv) 、 iii)と iv)； i)と )と iii)、 i)と )と iv)、 i)と iii)と iv)、 ii)と iii)と iv)； i)と )と iii)と iv)と！、う組み合わせを作成し、それぞれの群から任意の 1つの化合物を選ぶことによって形成される組み合わせが挙げられる： i) CH— (CHR⁵) CH—而と CH— CH—（Y¹— CH— CH ) 一而 ii)— CH - (CHR ) — CH— OHと一 CH— CH - (Y— CH— CH )—OH ;

2 p-2 2 2 2 2 2 r iii) - (CH )— SHと H N— CH— CH - (Y³— CH— CH ) — SH ;および

2 j 2 2 2 2 2 z iv) - (CH )— O— CO— C (R²。） =CH、 - (CH ) — NHCO— C (R²。） =CH、

2 1 2 2 q 2

— CH— CH - (Y⁴— CH— CH )— NHCO— C (R²⁰) =CHおよび— CH— CH

2 2 2 2 t 2 2 2

- (Y⁵-CH -CH ) O— CO— C (R²⁰) =CH。

2 2 y 2

[0041] 中でも、 i)と ii)、 ii)と iii)および ii)と )の組み合わせが好ましぐさらに、 CH— (

2

CHR⁵) -CH -NHと CH— (CHR⁶) —CH—OH、—CH— (CHR⁵) m-2 2 2 2 p-2 2 2 m-2 CH -NHと CH— CH—（Y²— CH— CH ) OH CH— CH—（Y¹—

2 2 2 2 2 2 r 2 2

CH— CH ) — NHと一 CH - (CHR⁶) — CH— OHおよび一 CH— CH - (Y¹

2 2 n 2 2 p-2 2 2 2

-CH -CH ) —NHと CH—CH—（Y²— CH—CH )— OHの糸且み合わせが

2 2 n 2 2 2 2 2 r

好ましぐさらにまた、 CH— (CHR⁵) — CH— NHと一 CH— (CHR⁶) — CH

OHの A—Rbの組み合わせが特に好ましい。

2

[0042] -A— Rbおよびその組み合わせとしては、上記 i)、 iii)および iv)の各群中に記載された A—Rbの各具体例単独、並びに、これらと、 CH— (CHR°) —CH -

OHとの組み合わせ、 CH— CH— (Y²— CH -CH )—OHとの組み合わせが

2 2 2 2 r

好ましい。

[0043] 当該側面の 1つの態様において、上記式 (I)で表される繰り返し単位を分子内に少なくとも 1以上含む水溶性ヒアルロン酸修飾物は、例えば、以下の式 (III)：

[0044] [化 3]

[0045] [式中、 R¹ R²、

R⁴および Raは、既に定義されたとおりであり、それぞれ独立に、水素原子、 C アルキル基または C アルキルカルボニル基から選択され、

1-6 1-6

Rcは、水素原子または C アルキル基であり、

1-6

Gは、一（CH ) または CH -CH (O-CH CH ) 一であり、

2 m 2 2 2 2 n mは 2〜 10から選択される整数であり、 n は 1〜10から選択される整数である] で表される化合物であってもよ、。

[0046] 本発明の一つの態様において、修飾率は、例えば 30モル％以上であり、好ましくは 55モル％以上でありうる。また、別の態様において、当該修飾率は、例えば 70モル％以下であり、好ましくは 60モル％以下、より好ましくは 30%以下でありうる。

[0047] 前記水溶性ヒアルロン酸修飾物は、例えば薬物担体として使用されてもよい。当該修飾物には、ヒアル口-ダーゼによる分解に対して耐性を有するものも含まれる。当該水溶性ヒアルロン酸修飾物の哺乳動物における平均血中滞留時間は、例えば 17 時間以上、好ましくは 18時間以上、さらに好ましくは 30時間以上である。

[0048] 本発明の別の側面によれば、式 (I)の A— Rbの末端が C アルキル基で置換さ

1-6

れて、てもよ、ァミノ基である水溶性ヒアルロン酸修飾物にお!、て、当該ヒアルロン酸修飾物のアミノ基をジカルボン酸でアミドィ匕し、置換基の末端にカルボキシ基を導入する工程をさらに含む、上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法が提供される

。ここでジカルボン酸は特に限定されないが、例えばシユウ酸、 C アルキレンジカ

1-10

ルボン酸または C ァルケ-レンジカルボン酸などを用いることができ、好まし!/ヽジカ

1-10

ルボン酸は、コハク酸、マレイン酸、ダルタル酸またはアジピン酸である。当該アミドィ匕は特に限定されな、が、例えば前記ヒアルロン酸修飾物のアミノ基とジカルボン酸無水物を反応させることにより行うことができる。

[0049] 本発明の別の側面によれば、上記の製造方法により得られる水溶性ヒアルロン酸修飾物が提供される。当該水溶性ヒアルロン酸修飾物は特に限定されないが、ヒアルロン酸をその構成ユニットの 2糖にまで分解することができ且つ分解産物の非還元末端に Δ—4, 5—グルクロン酸残基をもつ不飽和 2糖分解物を生成させるヒアルロニダ一ゼで該水溶性ヒアルロン酸修飾物を分解し、得られる分解産物の 232nmにおける吸収を測定した場合に、分解産物に由来する全ピークエリアに対する 2糖に由来するピークエリアの分率が 30%以下となるものが好ましい。

[0050] 本発明の別の側面によれば、前記水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む薬物担体が提供される。当該薬物担体は、特に限定はされないが、例えば、前記水溶性ヒアルロン酸修飾物により表面修飾された微粒子薬物担体であってもよい。

[0051] 本発明のさらに別の側面によれば、上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む医薬組成物が提供される。

[0052] 本発明のさらに別の側面によれば、上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物と薬物とからなる水溶性ヒアルロン酸修飾物—薬物コンジュゲートが提供される。

[0053] さらに本発明の別の側面によれば、上記のヒアルロン酸修飾物を架橋することで得られるヒアルロン酸ゲルが提供される。当該ヒアルロン酸ゲルは、例えば、薬物の封入に使用されうる。ここで、封入できる薬物は、特に限定されないが、例えば、高分子と薬物とのコンジュゲートであってもよい。このヒアルロン酸ゲルを乾燥させることで、封入する薬物の徐放性をさらに高めることもできる。

[0054] 本発明のさらに別の側面によれば、上記のヒアルロン酸ゲルを含む医薬組成物が提供される。

[0055] 本発明のさらに別の側面によれば、上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む、医療用デバイスが提供される。当該医療用デバイスは、特に限定されないが、例えば上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物で表面修飾を施したものであってもよい。

[0056] さらに本発明の別の側面によれば、上記のヒアルロン酸修飾物からなるヒアルロン酸ゲル微粒子の製造方法であって、 a)当該ヒアルロン酸修飾物を含む希薄溶液を調製する工程；

b)当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および

c)当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該多糖誘導体の架橋反応を進行させる工程を含むヒアルロン酸ゲル微粒子製造方法が提供される。ここで、前記工程 b)は、特に限定はされな、が、例えば前記溶液を噴霧することにより微粒子状の液滴に分散する工程であってもよい。

[0057] さらに本発明の別の側面によれば、上記のヒアルロン酸修飾物からヒアルロン酸ゲル微粒子を製造する方法であって、

a)ヒアルロン酸ゲルを乾燥する工程；

b)得られた乾燥物を凍結する工程；および

c)得られた凍結物を粉砕する工程を含むヒアルロン酸ゲル微粒子製造方法が提供される。ここで、ヒアルロン酸ゲルは、本発明のヒアルロン酸修飾物を架橋することにより得られるちのである。

[0058] また、得られる微粒子の平均粒子径は、特に限定はされないが、例えば 0. 01 m

〜150 111、好ましくは 0. 1 μ m〜50 μ mである。ここで、得られる微粒子は、例えば薬物担体、特に薬物徐放担体であってもよい。

[0059] 当該側面の 1つの態様において、上記製造方法の架橋反応前の希薄溶液が薬物を含み、当該薬物が架橋反応後に得られる微粒子中に担持されて!ヽてもよヽ。

[0060] 本発明の別の側面によれば、上記方法で製造されたヒアルロン酸ゲル微粒子、および当該ヒアルロン酸ゲル微粒子を含む医薬組成物が提供される。

発明の効果

[0061] 本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を用いることで、従来の水溶性ヒアルロン酸修飾物では得られない実用的なレベルまでその血中滞留時間を延長することが可能である。従って、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を担体に用い、薬物をコンジュゲート化すること、あるいは、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を薬物を含有した微粒子，ゲルなどの少なくとも表面近傍に局在化させることで、従来の技術では達成できな力つた、実用的でかつ安全な医薬組成物を提供することが可能である。

[0062] また、本発明のヒアルロン酸修飾物を、架橋し、ゲルィ匕することにより、タンパク質、ペプチド、低分子化合物、核酸あるいはそれらと高分子のコンジュゲート等の薬物を封入、長期間徐放できる安全性の高いヒアルロン酸ゲル徐放製剤の提供を可能にする。

図面の簡単な説明

[図 1]本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物をヒアルロニダーゼ処理した後の GPCデータの一例である。

[図 2]比較例の水溶性ヒアルロン酸修飾物およびヒアルロン酸をヒアル口ニダーゼ処理した後の GPCデータの一例であり、縦軸方向のスケールは図 1と同一である。

[図 3]本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の NMRデータの一例である。

[図 4]CDIを用いた導入 (比較例 1— 14)における、反応前後での GPCデータの一例である。

[図 5]BOPの添カ卩量によるジァミンィ匕合物の導入率の制御に関する NMRデータの一例である（実施例 2)。

[図 6]本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物のアミノ基を変換しカルボキシ基を導入した水溶性ヒアルロン酸修飾物の NMRデータの一例である（実施例 3— 2)。

[図 7]本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物のアミノ基を変換しカルボキシ基を導入した水溶性ヒアルロン酸修飾物のヒアル口-ダーゼ処理後の GPCデータの一例である

[図 8]本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の NMRデータの一例である。

[図 9]本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の NMRデータの一例である。

[図 10]本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の GPCチャートの一例である。

[図 11]本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の NMRデータの一例である。

[図 12]本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物をヒアルロニダーゼ処理した後の GPCデータの一例である。

[図 13]本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物をヒアルロニダーゼ処理した後の GPCデータの一例である。

[図 14]本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の NMRデータの一例である

[図 15]分子量の異なる蛍光標識 HA修飾物 HA— AM— SUCおよび HA— HZ— S ucの血中濃度推移を示した図である。

[図 16]本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の NMRデータの一例である。

[図 17]分子量 200kDaの HAから合成した、アミノ基修飾率の異なる蛍光標識 HA修飾物の血中濃度推移を示した図である。

[図 18]HA修飾物のアミノ基導入率と平均血中滞留時間（MRT)との相関およびアミノ基導入率とヒアル口-ダーゼにより分解される 2糖の分率との相関を示した図である

[図 19]分子量 200kDa HAから合成した置換アミド基上の置換基が異なる蛍光標識 HA修飾物の血中濃度推移を示した図である。

[図 20]本発明の AEMA基導入ヒアルロン酸修飾物の NMRデータの一例である。

[図 21]本発明の APMA基導入ヒアルロン酸修飾物の NMRデータの一例である。

[図 22]本発明のメタクリロイル基導入ヒアルロン酸修飾物の NMRデータの一例である。

[図 23]HAゲル力もの蛍光標識 HA— HZの放出性を示した図である。

[図 24]蛍光標識 HA— HZを封入した HA— AEMA架橋ゲル微粒子の顕微鏡写真の一例である。

[図 25]蛍光標識 HA— AMを封入した HA— AEMA架橋ゲル微粒子の顕微鏡写真の一例である。

[図 26]HAゲル力ゝらの蛍光標識 HA— AMの放出性を示した図である。

[図 27]ラットに HA— FITC標識 Fabコンジュゲートおよび FITC標識 Fabを単回静脈内投与したときの血漿中濃度推移を示した図である。

[図 28]HA— GLP— 1変異体コンジユゲートをラットに静脈内投与したときの血漿中濃度推移を示した図である。

発明の実施の形態

[0064] 以下、本発明を更に具体的に説明する。

[0065] 本発明は、非プロトン性極性溶媒中で、特定の縮合剤を用い、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基に置換基をアミド結合で下限が 5モル％以上導入する、水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法に関する。 [0066] 溶媒は極性有機溶媒でなければならず、特に非プロトン性極性溶媒が好ましい。非プロトン性極性溶媒と水との混合溶媒、あるいは、水を溶媒に使用した場合には、何れの縮合剤を用いても実用上十分な血中滞留性を付与するために必要な修飾率が得られず、また、これまでにない長期間の薬物徐放を実現する、より均一的な架橋性官能基の導入ができない。使用可能な非プロトン性極性溶媒は、ジメチルホルムアミド（以下、「DMF」とも称す）、ジメチルァセトアミド (以下、「DMAc」とも称す）、ジメチルスルホキシド（以下、「DMSO」とも称す）、 1, 3 ジメチルー 2 イミダゾリジノン（以下、「DMI」とも称す）、スルホラン（以下、「SF」とも称す）、 N—メチルピロリドン (以下、「NMP」とも称す)またはそれらの 2種以上の混合溶媒等が挙げられる。好ましくは、ジメチルホルムアミド、ジメチルァセトアミド、ジメチルスルホキシド、 N—メチルピロリドンまたはそれらの 2種以上の混合溶媒であり、特に好ましくは、ジメチルスルホキシドである。

[0067] 本発明の製造方法には、式 (Π) :

[0068] [化 4]

[0069] [式中、 R^1U、 R^u、 R , R"、 R¹⁴、 R^lb、環 Bおよび X—は、既に定義したとおりである] で示される縮合剤が用いられる。ここで、環 Bは、酸性プロトンを有さない含窒素へテ口環基であれば特に限定されず、 C アルキル基またはハロゲン原子などの置換基

1-6

により置換されていてもよい。環 Bには、例えばピロリジン— 2, 5 ジオン— 1—ィル、 3, 4ージヒドロー 3 ヒドロキシー 4 ォキソ 1, 2, 3 べンゾトリアジン、ベンゾトリアゾール—1—ィルなどが含まれる。 X—には、例えばフッ化物イオン、塩ィ匕物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンなどのハロゲン化物イオン、 CF SO―、 BF―、 PF—などが含まれる。

[0070] R^1Qおよび R^U、 R¹²および R¹³、ならびに R¹⁴および R¹⁵が、それらが結合する窒素原子と一緒になつて形成する含窒素へテロ環としては、 5〜7員飽和含窒素へテロ環などが好ましぐ具体的にはピロリジン、ピぺリジン、ホモピぺリジンなどが含まれる。

[0071] 好ましくは、当該縮合剤は環 Bがべンゾトリアゾール 1—ィルである BOP系縮合剤である。好ましい BOP系縮合剤としては、ベンゾトリアゾール 1—ィルォキシ一トリス（ジメチルァミノ）ホスホ-ゥムへキサフルォロホスフェート（以下、「： BOP」とも称す）、ベンゾトリァゾール一 1—ィルォキシ一トリス（ピロリジノ）ホスホ-ゥムへキサフルォロホスフェート（以下、「PyBOP」とも称す）、およびこれらの混合物が挙げられる。 BOP系縮合剤は単独でまたは適宜組み合わせて利用することができる。

[0072] なお、上記以外の他の縮合剤、例えば N, N'—カルボ-ルジイミダゾール（以下、「 CDI」とも称す）、 N, Ν'—ジシクロへキシルカルボジイミド（以下、「DCC」とも称す）、 1ーェチルー 3—（3 ジメチルァミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（以下、「EDC」とも称す）、 EDC/3, 4 ジヒドロ一 3 ヒドロキシ一 4—ォキソ 1, 2, 3 ベンゾトリアジン（以下、「HODhbt」とも称す）、 N エトキシカルボ-ルー 2—エトキシ— 1, 2— ジヒドロキノリン（以下、「EEDQ」とも称す）、 4— (4, 6 ジメトキシ一 1, 3, 5 トリアジン 2—ィル）ー4 メチルモルホリウムクロリド n—水和物（以下、「DMT— MM」とも称す）、 2— (1H ベンゾトリアゾール 1—ィル） 1, 1, 3, 3—テトラメチルゥ口 -ゥムテトラフルォロボレート（以下、「TBTU」とも称す)等では、実用上十分な血中滞留性 (例えば平均血中滞留時間（以下、「MRT」とも称す)で 18時間以上）を有するヒアルロン酸修飾物は得られず、またはヒアル口-ダーゼによる分解に対して耐性を付与するために必要な高い導入率が得られない。またさらに、縮合剤として CDI を用いた場合は、縮合反応中に HA分子量が低下してしまうため実用的ではない。さらにまた、これまでにない長期間の薬物徐放を実現する、より均一的な官能基の導入ができない。

[0073] 本発明に用いられるヒアルロン酸 (HA)は HA骨格を有してヽれば特に限定されず、 HAの一部を誘導体化した HA誘導体や、酵素、熱分解等で低分子化した HA、 H A及び HA誘導体の塩（ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ァルミ-ゥム塩、等)なども含まれる。本発明に用いられる HAは、どのようにして得られた HAでもよぐ動物組織力ゝら抽出された HA、発酵法で得られた HA、化学合成で得られた HAなど、その由来は限定されない。また、 HAを有機溶媒に可溶化する為に、テトラプチルアンモ-ゥム塩等の疎水性の高ヽ対イオンにイオン交換したものを用いてもよい。

[0074] 本発明の水溶性 HA修飾物にぉ、て、置換アミド基に変換されて！、るカルボキシ基の割合は、カルボキシ基修飾率として以下の式：

[0075] [化 5] (各分子中の修飾されたカルボキシ基の合計数） _{ν 1 η π} (カルボ干ン基修飾 (各分子中のグルクロン酸の合計数) ^{Χ 1 0} °

[0076] により算出される。本発明の水溶性 ΗΑ修飾物のカルボキシ基修飾率の下限は 5% 以上であればよいが、薬物とのコンジュゲートとした時に実用的な血中滞留時間を得るためのヒアルロン酸修飾物としての観点では、修飾率の下限は 30モル％以上であることが好ましぐ 50モル％以上であることがさらに好ましぐ 55モル％以上であること力 Sさらに好ましぐ 60モル％以上であることがさらに好ましい。また、修飾率の上限は 100モル％以下であればよい。例えば、タンパク質およびペプチドと結合させてコンジュゲートを形成するために用いられる水溶性ヒアルロン酸修飾物の修飾率の具体例としては、 30〜： LOOモル⁰ /₀、 50 100モル⁰ /₀および 60 100モル⁰ /₀が挙げられる。一方、長時間の薬物徐放を実現するためのゲルとなるヒアルロン酸修飾物としての観点では、修飾率の下限は、 5%モル以上が好ましぐ 10%モル以上がさらに好ましい。また、修飾率の上限は、皮下での分解性を維持するためには、 70%モル以下が好ましぐ 60%モル以下がさらに好ましぐ中でも 40モル％以下がさらに好ましぐ 30モル％以下がさらにまた好ましい。例えば、タンパク質およびペプチドを封入するためのハイド口ゲルの基材として用いられる水溶性ヒアルロン酸修飾物の修飾率の範囲の具体 f列としては、 5 70モノレ⁰ /₀、 5 60モノレ⁰ /₀、 5 40% 5 30モノレ⁰ /₀、 10 70モル⁰ /₀、 10 60モル⁰ /₀、 10 40%および 10 30モル⁰ /₀が挙げられる。

[0077] ここで、カルボキシ基修飾率は、プロトン NMRで定量することができる。具体的には、プロトン NMRで得られるアミノ化（以下、「AM化」とも称す)またはメタクリロイルィ匕（以下、「MA化」とも称す)された HA誘導体中のアミノ化合物の量と、 HA由来のピークとの比較力も求めることができる。例えば、エチレンジァミン (以下、「EDA」とも称す)でアミノ基を導入したヒアルロン酸修飾物（以下、「HA— AM」とも称す)のプロトン NMRから得られるアミンィ匕合物由来のピーク（2. 9〜3. lppm:測定溶媒 D O)

2 と、 HA由来のピーク（1. 8〜1. 9ppm:測定溶媒 D O)の比、またはアミノエチルメタ

2

タリレート（以下、「AEMA」とも称す）でメタクリロイル基を導入した HA— AEMAのプ口トン NMRから得られるメタクリロイル化合物由来のピーク（5. 5〜6. 1、 1. 8ppm) と、 HA由来のピーク（1. 8〜1. 9ppm)の比を実測する。

[0078] また、薬物とのコンジュゲートとした時に実用的な血中滞留時間を得るためのヒアルロン酸修飾物としての観点では、本発明の水溶性 HA修飾物の分子量も、その体内動態を左右する。本発明の水溶性 HA修飾物の血中滞留時間は HAの分子量にも依存し、分子量の大きな HA程その血中滞留時間は長い。従って、水溶性 HA修飾物の分子量と水溶性 HA修飾物のカルボキシ基の修飾率を変化させることで、水溶性 HA修飾物の血中滞留時間を制御することが可能である。本発明に用いられる原料 HAの分子量は特に制限されないが、余りに低分子量では得られた水溶性 HA修飾物の血中滞留時間が短くなる。逆に、余りに高分子量になると得られた水溶性 HA 修飾物の粘度が非常に高くなり、高濃度での投与が難しくなる。また、本発明の水溶性 HA修飾物の血中滞留時間は分子量が一定以上大きくなるとほとんど変化しなくなるので、通常、原料 HAの分子量は粘度平均分子量で 5000ダルトン〜 100万ダルトンであることが好ましぐ 1万ダルトン〜 30万ダルトンであることがより好ましぐ 8万ダルトン〜 30万ダルトンであることがさらに好ましい。

[0079] 一方、長時間の薬物徐放を実現するためのゲルの基材としてヒアルロン酸修飾物が使用される場合は、本発明に用いられる原料 HAの分子量は特に限定されず、いかなる分子量の原料 HAでも使用することが可能である力例えば 5000〜350万ダルトン、好ましくは 1万〜 200万ダルトン、さらに好ましくは 2万〜 30万ダルトンの HA を使用してもよい。

[0080] なお、 HA重量平均分子量の測定方法については、例えば、中浜精一他著「エツセンシャル高分子科学」（講談社発行、 ISBN4— 06— 153310— X)に記載された、光散乱法、浸透圧法、粘度法等、各種の公知の方法を利用することができ、本明細書において示される粘度平均分子量もウベローデ粘度計を使用するなど、本発明が属する技術分野において通常用いられる方法により測定することができる。

[0081] 本発明の製造方法により得られる水溶性 HA修飾物の血中滞留時間は、原料 HA の血中滞留時間に比べて延長されているものであることが好ましい。ここで、血中滞留時間は、平均血中滞留時間（例えば、本明細書実施例 5— 3に記載の MRTとして算出される）、血中半減期（以下、「tlZ2」とも称す)、血中クリアランス (以下、「C1」とも称す)などの公知の代表的なパラメーターを利用して適宜比較することができる。本発明製造方法により得られる水溶性 HA修飾物のヒトを含む哺乳動物における血中滞留時間は、実用面から平均血中滞留時間（以下、「MRT」とも称す)の下限が 18 時間以上のものであることが好ましぐ 30時間以上のものがより好ましい。上限は、薬物濃度制御の観点から、 1ヶ月以下、好ましくは 2週間以下である。

[0082] また、本発明の別の側面によれば、本発明の製造方法により得られる水溶性 HA修飾物は、原料 HAに比べてヒアル口-ダーゼによる分解に対して耐性を有するものであることが好ましい。ここで、「ヒアル口-ダーゼによる分解に対して耐性を有する」とは、原料 HAと本発明の水溶性 HA修飾物をそれぞれヒアル口-ダーゼにより酵素分解させた際に、原料 HAよりも分解速度が遅いかまたは分解が進まない性質を有することを指す。例えば、一定時間ヒアル口-ダーゼ処理した際に、原料 HAでは観察される 2糖分解ピークが観察されなければ「分解が進まない」性質を有する（即ち、ヒアル口-ダーゼによる分解に対して耐性を有する）と判定することができる。なお、 HAの分解速度や分解状態はゲル浸透クロマトグラフィー（以下、「GPC」とも称す)などの常法を用いて観察することができる。

[0083] 本発明にお、て、グルクロン酸部分のカルボキシ基を変換して導入されるアミド基の置換基としては、当該変換後に得られる HA修飾物が水溶性であれば特に制限されない。本発明の HA修飾物が有する置換基はどのような置換基であってもよいが、得られた HA修飾物の水溶性を保持するために、親水性の置換基または疎水性の低、置換基を導入することが好ま、。 [0084] 上記のアミド化の際にヒアルロン酸またはその誘導体と反応させる化合物の具体例は、一分子中に 1種類かつ 1個以上の官能基を持ち、窒素原子上に置換基を有していてもよいアミノ基を有するアミン類である。ここで、窒素原子上の置換基を有していてもよいアミノ基を除いた官能基とは置換されていてもよいアミノ基、水酸基、メルカブト基、カルボキシ基、アルデヒド基、メタクリロイル基、アタリロイル基力選択される。その官能基の種類は好ましくは 1つおよび 2種類である。官能基が 1種類かつ 1個場合、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基にアミド結合する化合物は、アルキレンジァミン化合物もしくはァミノ（ポリアルキレンォキシ）アルキルァミン化合物等の 2つのアミノ基を有する化合物（以下、「ジァミンィ匕合物」とも称す）；ァミノ基と水酸基を有する化合物；ァミノ基とメルカプト基を有する化合物；アミノ酸、ペプチド等のアミノ基とカルボキシ基を有する化合物；ァミノ基とアルデヒド基を有する化合物、ァミノ基とメタクリロイル基を有する化合物；または、ァミノ基とアタリロイル基を有する化合物から選択される。上記の化合物はァミノ基に置換基を有していてもよく、当該置換基には例えば C アルキル基、 C アルキルカルボ-ル基などが含まれ

1-6 1-6

る。

[0085] なお、これらの化合物においては、化合物中の任意の炭素原子力、例えば 1〜9個、好ましくは 1〜8個、さらに好ましくは 1〜3個の水酸基で置換されていてもよい。ただし、同一炭素原子が複数の水酸基で置換されることや、既に酸素原子、窒素原子等のへテロ原子が結合している炭素原子がさらに水酸基で置換されていることはない。

[0086] 前述の通り、アミド化の際にヒアルロン酸またはその誘導体と反応させる化合物の種類は単一であっても、複数であってもよい。すなわち、単品であっても混合品であつてもよく、単品を段階的に反応させていってもよい。

[0087] また、これらの化合物で、ヒアルロン酸のカルボキシ基を変換して生じる置換アミド基の置換基としては、アミノアルキル基（このアミノアルキル基のアルキレン鎖は 1個以上、例えば 1〜9個、好ましくは 1〜8個、さらに好ましくは 1〜3個の水酸基で置換されて、てもよ、）、ァミノ（ポリアルキレンォキシ）アルキル基、ァミノ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、ヒドロキシアルキル基（このヒドロキシアルキル基のアルキレン鎖は 1個以上、例えば 1〜9個、好ましくは 1〜8個、さらに好ましくは 1〜3個の水酸基で置換されていてもよい）、ヒドロキシ（ポリアルキレンォキシ）アルキル基、ヒドロキシ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、メルカプトアルキル基、メルカプト（ポリアルキレンォキシ）アルキル基、メルカプト（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、メタクリロイルォキシアルキル基、メタクリロイルァミノアルキル基、メタクリロイルァミノ（ポリアルキレンォキシ）アルキル基、メタクリロイルァミノ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、メタタリロイルォキシ（ポリアルキレンォキシ）アルキル基、メタクリロイルォキシ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、アタリロイルォキシアルキル基、アタリロイルァミノアルキル基、アタリ口ィルァミノ（ポリアルキレンォキシ）アルキル基、アタリロイルァミノ（ポリアルキレンァミノ )アルキル基、アタリロイルォキシ（ポリアルキレンォキシ)アルキル基またはアタリロイルォキシ (ポリアルキレンァミノ）アルキル基等が挙げられる。

特定の実施態様において、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基にアミド結合する化合物の具体例は、

式 N-CH - (CHR⁵) -CH -NHおよび H N— CH— CH - (Y¹— CH

2 2 m- 2 2 2 2 2 2 2 CH ) — NHで表されるジァミン化合物；

2 n 2

式 N-CH - (CHR⁶) -CH— OHおよび H N— CH— CH - (Y²— CH

2 2 ρ-2 2 2 2 2 2 CH )— OHで表されるァミノ基と水酸基を有する化合物；

2 r

式： H N— (CH )— SR⁷および H N-CH— CH - (Y³— CH— CH ) — SR⁸で

2 2 j 2 2 2 2 2 z 表されるァミノ基とメルカプト基を有する化合物；ならびに

ϊζ:Η N— (CH )— O— CO— C (R¹⁶) =CH、 H N— (CH ) — NHCO— C (R¹⁷)

2 2 1 2 2 2 q

=CH、 H N-CH— CH - (Y⁴— CH— CH )— NHCO— C (R¹⁸) =CHおよび

2 2 2 2 2 2 t 2

H N-CH— CH - (Y⁵— CH— CH ) — O— CO— C (R¹⁹) =CHで表されるアミ

2 2 2 2 2 y 2

ノ基とメタクリロイル基もしくはアタリロイル基を有する化合物であり、上記式中にぉヽて、 m、 1、 p、 jおよび qは、それぞれ独立に 2〜10から選択される整数であり、 n、 r、 z 、 tおよび yは、それぞれ独立に 1〜200から選択される整数であり、 R⁵および R⁶はそれぞれ独立して水素原子または水酸基であり、かつ、（m— 2)個ある CHR⁵ および (p— 2)個ある— CHR⁶—が任意の割合および順番で— CH—と— CHOH とが

2

混在している状態を示しており、 R⁷は、水素原子、保護基または— S— (CH ) -NH であり、 R⁸は、水素原子、保護基または— S— (CH -CH— Y³) -CH -CH— N

2 2 2 2 2

Hであり、 R¹⁶、 R"、 R¹⁸、および R¹⁹はそれぞれ独立して、水素原子またはメチル基で

2

あり、

Υ⁴および Υ⁵は、それぞれ独立して、酸素原子または— ΝΗ である]である。

[0089] ここで、分子中で R⁵および R⁶が水酸基である CHR⁵および CHR⁶の個数は、それぞれ 0〜8である力好ましくは 0〜3、さらに好ましくは 0および 1である。 R⁵およびが水酸基である CHR⁵および CHR⁶の個数を調節することで、本発明の水溶性 ΗΑ集修飾物の、水に対する溶解度を調節することができる。 R⁵がすべて水素原子の場合、 m としては 2〜6が好ましぐその具体例として 2および 6が挙げられる。 R⁵の 1つが水酸基である場合、 mの具体例としては 3が挙げられる。 Y¹が酸素原子の場合、 nの具体例としては 2が挙げられる。 Y¹がー NH の場合、 nの具体例としては 1が挙げられる。 1の具体例としては 1が挙げられる。 p、 qの具体例としては 3が挙げられる。 rの具体例としては 1および 3が挙げられる。

[0090] H N-CH - (CHR⁵) -CH -NHの好ましい具体例としては、例えば、 H N

2 2 m-2 2 2 2 (CH ) -NH、 H N— (CH ) NH、 H N— (CH ) NH、 H N— (CH )

2 2 2 2 2 3 2 2 2 4 2 2 2 5

NH、 H N— (CH ) -NH、 H N— (CH ) NH、 H N— (CH ) NH、 H N

2 2 2 6 2 2 2 7 2 2 2 8 2 2 (CH ) -NH、 H N— (CH ) NH、 H N— CH— CHOH— CH— NH、 H

2 9 2 2 2 10 2 2 2 2 2 2

N-CH -CHOH- (CH ) NH、 H N— CH— (CHOH) CH— NH、 H N

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

-CH -CHOH- (CH ) NH、 H N— (CH ) -CHOH- (CH ) NH、 H

2 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2

N-CH (CHOH) (CH ) NH、 H N— (CH -CHOH) CH— NH、

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

H N-CH (CHOH) CH— NH、 H N-CH -CHOH- (CH ) NH、

2 2 3 2 2 2 2 2 4 2

H N— (CH ) -CHOH- (CH ) NH、 H N-CH (CHOH) (CH ) N

2 2 2 2 3 2 2 2 2 2 3

H、 H N-CH CHOH— CH -CHOH- (CH ) NH、 H N-CH CHO

2 2 2 2 2 2 2 2 2

H—（CH ) — CHOH— CH— NH、H N—（CH ) - (CHOH) - (CH ) NH

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

、 H N-CH (CHOH) (CH ) NH、 H N-CH (CHOH) CH— C

2 2 3 2 2 2 2 2 2 2

HOH-CH NH、 H N— (CH ) -CHOH- (CH ) NH、 H N— (CH )

2 2 2 2 2 2 4 2 2 2 3

CHOH- (CH ) — NH、 H N— (CH ) -CHOH- (CH ) — NHおよび H N—

2 4 2 2 2 2 2 6 2 2

(CH ) -CHOH- (CH ) — NHが挙げられ、 H N— (CH ) — NH、 H N— (C

2 5 2 4 2 2 2 2 2 2 H ) -NHおよび H N-CH -CHOH-CH—NHが好ましい。

2 6 2 2 2 2 2

[0091] H N-CH (CHR⁶) —CH— OHの好ましい具体例としては、例えば、 H N—

2 2 p-2 2 2

(CH ) OH H N—（CH ) — OH H N—（CH ) — OH H N—（CH ) — OH

2 2 2 2 3 2 2 4 2 2 5

, H N- (CH ) OH H N—（CH ) — OH H N—（CH ) — OH H N—（CH

2 2 6 2 2 7 2 2 8 2 2 OH H N— (CH ) OH H N-CH -CHOH-CH OH H N-CH

9 2 2 10 2 2 2 2 2 CHOH— (CH ) OH H N-CH (CHOH) CH— OH H N-CH

2 2 2 2 2 2 2 2

CHOH- (CH ) OH H N— (CH ) -CHOH- (CH ) OH H N-CH

2 3 2 2 2 2 2 2 2

(CHOH) (CH ) -OH, H N— (CH -CHOH) CH— OH H N-CH

2 2 2 2 2 2 2 2 2

(CHOH) CH— OH H N-CH -CHOH- (CH ) OH H N— (CH )

3 2 2 2 2 4 2 2 2

CHOH- (CH ) OH H N-CH (CHOH) (CH ) OH H N-CH

2 3 2 2 2 2 3 2 2

CHOH-CH -CHOH- (CH ) OH H N-CH -CHOH- (CH ) CHO

2 2 2 2 2 2 2

H-CH OH H N— (CH ) (CHOH) (CH ) OH H N-CH (CH

2 2 2 2 2 2 2 2 2

OH) (CH ) -OH, H N-CH (CHOH) CH -CHOH-CH OH H

3 2 2 2 2 2 2 2

N—（CH ) — CHOH—（CH ) — OH H N—（CH ) — CHOH—（CH ) — OH

2 2 2 2 4 2 2 3 2 4

H N—(CH ) — CHOH—（CH ) — OHおよび H N—（CH ) -CHOH- (CH

2 2 2 2 6 2 2 5 2

) — OHが挙げられ、 H N— (CH ) — OHおよび H N— CH— CHOH— CH— O

4 2 2 3 2 2 2

Hが好ましい。

なお、これらの化合物は例えばシグマアルドリッチ社などから市販されており、適宜購入して利用することができる。また、文献記載の方法に従い、もしくは文献記載の方法を参考にして合成してもよ、。

[0092] ヒアルロン酸またはその誘導体と反応させる化合物は、担持される薬物がタンパク質およびペプチドの時、薬物を本発明の水溶性 HA修飾物カゝら得られるゲル中に封入する場合は、ァミノ基とメタクリロイル基を有する化合物、ァミノ基とアタリロイル基を有する化合物、ァミノ基とメルカプト基を有する化合物、ァミノ基とメタクリロイル基を有する化合物およびァミノ基と水酸基を有する化合物の組み合わせ、ァミノ基とアタリ口ィル基を有する化合物およびァミノ基と水酸基を有する化合物の組み合わせ、並びにァミノ基とメルカプト基を有する化合物およびァミノ基と水酸基を有する化合物の組み合わせが好ましい。また、薬物と本発明の水溶性 HA修飾物とをコンジュゲートにする場合は、ジァミンィ匕合物、ァミノ基とメルカプト基を有する化合物、ジァミンィ匕合物およびァミノ基と水酸基を有する化合物の組み合わせ、並びにァミノ基とメルカプト基を有する化合物およびァミノ基と水酸基を有する化合物の組み合わせが好ましい。

[0093] ァミノ基と水酸基を有する化合物は、反応性官能基である、アミノ基、メルカプト基、メタクリロイル基、およびアタリロイル基のカルボキシ基への導入率制御に用いることができる。

[0094] 本発明にお、て「アルキル基」とは、炭素数 1以上の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば以下に定義する「C アルキル基」などである。

1-6

[0095] 本発明にお、て「C アルキル基」とは、炭素数 1〜6の直鎖状、分岐鎖状のアルキ

1-6

ル基を意味し、例えば、メチル、ェチル、 n—プロピル、 i—プロピル、 n—ブチル、 s— ブチル、 iーブチル、 t—ブチルなどの「C アルキル基」が含まれ、さらに、 n—ペンチ

1-4

ル、 3—メチルブチル、 2—メチルブチル、 1ーメチルブチル、 1 ェチルプロピル、 n 一へキシル、 4ーメチルペンチル、 3—メチルペンチル、 2—メチルペンチル、 1ーメチルペンチル、 3 ェチルブチル、および 2 ェチルブチルなどが含まれる。

[0096] 本発明において「C アルキルカルボニル基」とは、炭素数 1〜6の直鎖状、分岐鎖

1-6

状のアルキル基を有するアルキルカルボ-ル基を意味し、例えば、ァセチル、プロピォニル、ブチリル、イソブチリル、ピバロィル、バレリル、イソバレリル、へキサノィルなどが含まれる。

[0097] 本発明において「アルキレンォキシ基」とは、炭素数が 1以上のアルキレン鎖を含み、炭素原子と酸素原子で連結する 2価の基であり、例えば以下に定義する「C アル

2-10 キレンォキシ基」などである。

[0098] 「C アルキレンォキシ基」とは、炭素数が 2〜： LOのアルキレン鎖を含む炭素原子と

2-10

酸素原子で連結する 2価の基であり、例えばエチレンォキシ基、プロピレンォキシ基、ブチレンォキシ基などが含まれる。

[0099] 本発明におヽて導入される置換基の導入量は、縮合剤の HAに対する添加量で調節することができる。

[0100] また、本発明の水溶性 HA修飾物の電荷に関して、導入された置換基がカチオン性であった場合、トータルの電荷がプラス側に振れ、血中滞留時間の短縮に繋がるため、本発明の水溶性 HA修飾物を薬物とのコンジュゲートとして血中滞留時間を延長する場合には修飾電荷はノ-オン性カゝ、ァ-オン性であることが好ま、。

[0101] 本発明の水溶性 HA修飾物の調製方法では、例えば、テトラプチルアンモ -ゥム (T BA)塩ィ匕した HAを DMSOに溶解し、分子の両末端にアミノ基を 1つずつ有するジァミノ系化合物を添加、 HAのカルボキシ基に BOP系縮合剤で縮合させ、アミノ基を導入した HA (以下、「HA— AM」とも称す)を合成できる。

[0102] また、本発明の水溶性 HA修飾物のうち、カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の置換基力置換されていてもよいアミノ基である場合、この置換されていてもよいアミノ基をさらに修飾することで、メルカプト基、アタリロイル基、メタクリル基などの官能基を導入できる。この際、残存したアミノ基は、例えば無水コハク酸、無水マレイン酸、無水グルタル酸および無水アジピン酸などのジカルボン酸無水物などで処理するか、マレイン酸、ダルタル酸およびアジピン酸などのジカルボン酸を縮合剤共存下で反応させることで、末端の官能基をカルボキシ基に戻してトータル電荷をァ-ォン性にした方が血中滞留時間の延長には好ましい。ここで用いられる縮合剤は、特に限定されず、例えば、ベンゾトリアゾール—1—ィルォキシ—トリス（ジメチルァミノ）ホスホ-ゥムへキサフルォロホスフェート、ベンゾトリァゾールー 1ーィルォキシートリス（ピロリジノ）ホスホ-ゥムへキサフルォロホスフェート、 N, Ν'—カルボニルジイミダゾール、 Ν, Ν'—ジシクロへキシルカルボジイミド、 1—ェチル—3— (3 ジメチルァミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、 EDCZ3, 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシ一 4— ォキソ 1, 2, 3 ベンゾトリアジン、 Ν エトキシカルボニル一 2 エトキシ一 1, 2- ジヒドロキノリン、 4— (4, 6 ジメトキシ一 1, 3, 5 トリァジン一 2—ィル） 4—メチルモルホリウムクロリド η—水和物、 2—（1H—べンゾトリァゾールー 1ーィル）ー1, 1, 3, 3—テトラメチルゥ口-ゥムテトラフルォロボレートならびにこれらの混合物などを使用することができる。得られるヒアルロン酸修飾物のトータル電荷の観点からは、ァミノ酸またはペプチドなどのアミノ基を、ヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシ基と反応させた化合物、あるいは a)アミノ基; b)メルカプト基、アタリロイル基およびメタクリル基等の官能基力選択される官能基という a)と b)との両方を有するアミン類を、ヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシ基と反応させたィ匕合物なども好まヽ [0103] また、本発明は、上述した製造方法により得られた水溶性ヒアルロン酸修飾物自体にも関する。

[0104] この水溶性ヒアルロン酸修飾物は、薬物とのコンジュゲートとした時に実用的な血中滞留時間を得るためのヒアルロン酸修飾物としての観点では、好ましくは、ヒアルロン酸をその構成ユニットの 2糖にまで分解することができ且つ分解産物の非還元末端に Δ— 4, 5—グルクロン酸残基をもつ不飽和 2糖分解物（例えば、式 IVの化合物を含む）：

[0105] [化 6]

[0106] を生成させるヒアルロニダ一ゼで該水溶性ヒアルロン酸修飾物を分解し、得られる分解産物の 232nmにおける吸収を測定した場合に、分解産物に由来する全ピークェリアに対する 2糖に由来するピークエリアの分率の上限が 30%以下であるという特徴を有する。このピークエリアの分率の上限は、好ましくは 20%以下、さらに好ましくは 13%以下である。また、下限は 0%以上であればよい。当該測定は、通常の高速液体クロマトグラフィーを用いて当該技術分野において通常用いられる方法により行うことができ、例えば GPCカラム（例えば Superdex200 10/300 GL、 Superdex75 HR 10Z30および Superdex PeptideHR 10/30 (いずれもアマシャムバイオサイエンス株式会社製)など)を使用することができる。また使用する溶離液は特には限定されないが、例えば PBS (例えば、シグマ—アルドリッチ社製 Phosphate Buff ered Saline Tablets 2錠をとり、精製水 400mLに溶解させて得たもの)を使用することがでさる。

[0107] ここで、分解産物に由来する全ピークエリアに対する 2糖に由来するピークエリアの分率は、以下の式：

[0108] [化 7]

2糖のピークエリア

( 液の全ピ一クエリア）一（酵素非添加時全ピークエリア） ^{X 1 0 0}

[0109] で求めることができる。また、ヒアル口-ダーゼとしては、例えばヒアル口-ダーゼ SD ( 生化学工業株式会社製)等を使用することができる。

[0110] 薬物とのコンジュゲートとした時に実用的な血中滞留時間を得るためのヒアルロン酸修飾物としての観点では、本発明の水溶性 HA修飾物は、特に限定はされないが、例えば 10mgZmL〜1000mgZmLの水に対する溶解度を有する。実際に治療を目的として投与される時の HA修飾物の濃度は 10〜500mg/mL程度であるので、本発明の水溶性 HA修飾物の溶解度は、好ましくは室温において生理食塩水に対して lOmg/mL以上である。

[0111] 本発明の水溶性 HA修飾物は、薬物担体として用いることができる。担持される薬物は特に限定されず、低分子化合物、タンパク質、ペプチドおよび核酸等を用いることが可能である。また、薬物を担持させるにおいては、公知の各種の方法を用いることができ、薬物を本発明の水溶性 HA修飾物から得られるゲル中に封入してもよぐ薬物と本発明の水溶性 HA修飾物とをコンジュゲートにしてもよい。

[0112] 本発明の水溶性 HA修飾物と薬物とからなるコンジュゲートの調製方法は、既知のポリマーの、薬物とのコンジユゲートイ匕で使用されている方法を用いることができる。例えば、水溶性 HA修飾物のアミノ基と、薬物のカルボキシ基との脱水縮合反応;薬物のアミノ基と、水溶性 HA修飾物のカルボキシ基との脱水縮合反応；

水溶性 HA修飾物のアミノ基と、イソチオシァネート、イソシァネート、ァシルアジド、 N —ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「NHS」とも称す)エステルおよびエポキシドなどとして修飾基が導入された薬物との反応;薬物のァミノ基と、イソチオシァネート、イソシァネート、ァシルアジド、 NHSエステルおよびエポキシドなどとして修飾基が導入された水溶性 HA修飾物との反応；

水溶性 HA修飾物のアミノ基と、アルデヒドおよびケトンなどのカルボニル化物として修飾基が導入された薬物とのシッフ塩基形成ならびに還元アミノ化反応;薬物のアミノ基と、アルデヒドおよびケトンなどのカルボ-ルイ匕物として修飾基が導入された水溶性 HA修飾物とのシッフ塩基形成ならびに還元アミノ化反応；

水溶性 HA修飾物に導入したメルカプト基と、マレイミド、アクリルエステル、アクリルァミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、ァリール化物、ビニルスルホンおよびメルカプトイ匕物などとして修飾基が導入された薬物との反応;薬物に導入したメルカプト基と、マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、ァリールイ匕物、ビニルスルホンおよびメルカプト化物などとして修飾基が導入された水溶性 HA修飾物との反応；

水溶性 HA修飾物に導入したアビジンと、薬物に導入したピオチンとの結合；薬物に導入したアビジンと、水溶性 HA修飾物に導入したピオチンとの結合；

などを利用することができる。水溶性 HA修飾物あるいは薬物へ、これらの修飾基 (ァビジンおよびピオチン由来の基を含む）を導入するには、これらの修飾基およびカルボキシ基（このカルボキシ基は NHSエステルなどの活性エステルとなって!/、てもよ!/ヽ )から任意に選ばれる 2つ以上、好ましくは 2つの基を分子内に有する化合物が用いられ、この化合物においては、これらの基以外の分子内の構造は、コンジュゲートを調製するまでの間に不都合な反応が進行しないものであれば、特に限定されない。該化合物は試薬として入手可能であるか、または文献公知の方法を参考にして合成してちよい。

[0113] 具体的には、置換アミド基の置換基が、アミノ基を含む本発明の水溶性 HA修飾物を合成し、ここで、ァミノ基の一部を N—スクシンィミジル 3— [2 ピリジルジチォ]プ口ピオネート（N— Succinimidyl 3 - [ 2 - pyridyldithio] propinate； SPDP)と反応させ、メルカプト基を導入した HA (以下、「HA— SH」とも称す)を調製する。

[0114] この際、余剰のアミノ基は、例えば無水コハク酸等で処理、カルボキシ基に戻してト一タル電荷をァ-オン性にした方が好ましい。一方で、タンパク質にメルカプト基と特異的に反応する修飾基を導入して、マレイミド、ビュルスルホンなどとする。これを HA SHと反応させコンジュゲートを調製してもよい。また逆に、例えば、置換アミド基の置換基力アミノ基を含む本発明の水溶性 HA修飾物のアミノ基をマレイミドブチリ口キシスルホサクシンイミドと反応させてマレイミド基が導入された水溶性 HA修飾物（以下、「HA— AM— MI」とも称する）とし、さらに、メルカプト基含有タンパク質またはペプチド等の薬物と反応させコンジュゲートを調製してもよい。あるいは、置換アミド基の置換基が、アミノ基を含む本発明の水溶性 HA修飾物のアミノ基の一部を Sulfo -KMUS (同仁ィ匕学社、 PIERCE (ピアス)社等により販売）等のマレイミド基含有ィ匕合物と反応させ HA— AM— Mlとし、余剰の AM基は、例えば無水コハク酸等で処理する。一方でタンパク質にシスティンを導入するカゝ、またはメルカプト基を有するリンカーを反応させておき、これを HA— AM— Mlと反応させコンジュゲートを調製してもよい。

[0115] ここで、当該コンジュゲートの生物活性を有効に保っためには、薬物と水溶性 HA 修飾物主鎖間のスぺーサ一の長さを調節すること、または部位特異的なコンジュゲ一卜とすることちできる。

[0116] また、本発明は、上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物を架橋することで得られるヒアルロン酸ゲルにも関する。本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を用いた薬物徐放ゲルは、例えば、薬物共存下の溶液中でメタクリロイル基またはアタリロイル基を導入したヒアルロン酸誘導体をメルカプト基含有化合物で架橋することにより、薬物を封入できる。ここで架橋とは、共有結合による、分子間または分子内架橋を含むものであり、同時に分子間および分子内架橋を有する場合もある。

[0117] 架橋時の pHは特に限定されないが、タンパク質またはペプチドを変性させずに不飽和基とメルカプト基の選択的反応を優先させ、タンパク質またはペプチド含有アミノ基との反応を防ぐ pHが好ましい。そのような pHは当業者が適宜選択することが可能である力例えば pH6. 0〜9. 5、好ましくは pH7.0〜9. 5である。

[0118] HAにメタクリロイル基を導入した本発明の水溶性 HA修飾物に用いられる架橋剤としては、不飽和結合と求核付加反応で反応するメルカプト基を 2つ以上同一分子に含む化合物が用いられる。例えば、ジチオトレイトール (以下、「DTT」とも称す）、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール、システィンを 2つ以上含むぺプチド等が挙げられる。

[0119] 薬物を共存させる溶液における溶媒としては、本発明の HA修飾物および封入する薬物が溶解し、かつ封入する薬物が変性しない溶媒であればよぐ例えば、水、エタノール、アセトン、イソプロピルアルコールおよびァセトニトリルならびにこれらの混合溶媒が挙げられ、好ましくは水とエタノールとの混合溶媒および水等が挙げられる。

[0120] メルカプト基の不飽和結合を有する基に対する比率は特に限定されず、当業者が適宜選択することが可能である力タンパク質、ペプチドとの反応を最小にし、且つ、不飽和基のゲル中の残存を防ぎ、且つ、速やかに反応させるため、メルカプト基:不飽和結合を有する基 = 3 : 1〜1： 3が好ましい。更に好ましくは、 2 : 1〜1 : 2である。

[0121] また、架橋反応時のタンパク質またはペプチドの安定性向上、反応速度の向上の為にトリエタノールァミン等の塩基性ィ匕合物を添加することが好ましい。この際好ましい濃度としては、 10〜20 LZmLである。

[0122] さらに、本発明は、本発明のヒアルロン酸修飾物からなるヒアルロン酸ゲル微粒子にも関する。本発明のヒアルロン酸修飾物を用いて、架橋ヒアルロン酸ゲル微粒子を製造する方法としては、

a)本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む希薄溶液を調製する工程； b)当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および

c)当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該ヒアルロン酸修飾物の架橋反応を進行させる工程を含む製造方法が好ましい。当該製造方法の工程 a)における希薄溶液は、架橋反応に必要な基質および試薬などを含む溶液であるが溶媒により高度に希釈されて、るために反応が進行しな、かまたは進行が極めて遅、溶液であり、その濃度は特に限定はされないが、例えば 0. 1%〜5%、好ましくは 0. 2%〜3%である。また本発明に用いる溶媒としては、当該技術分野において通常用いられている溶媒またはそれらの混合物を用いることができ、特に限定はされないが、例えば水、 DMSO、エタノール、 N—メチルピロリドン、超臨界炭酸液などである。この製造方法で得られた架橋ヒアルロン酸ゲル微粒子は、好ましくは、インジェクタブルなものである。

[0123] 上記製造方法の工程 b)の希薄溶液を微粒子状の液滴に分散する方法には、当該技術分野で通常用いられる方法であれば特に限定されないが、当該希薄溶液を噴霧する方法、当該希薄溶液を別の液体と混合することによりェマルジヨンを形成する方法などが含まれ、当該希薄溶液を噴霧する方法が好ましい。ここで微粒子状の液滴は、特に限定されないが例えば 0. 01 μ m〜l. 5mm、好ましくは 0. 1 μ m〜500 μ mの平均粒子径を有することができる。

[0124] 上記製造方法の工程 c)における溶液の濃縮の方法は、架橋反応の進行をより早める濃度まで濃縮することができる手段であれば特に限定されな、。また当該濃縮には、例えば、当該架橋反応が固相反応として進行するような溶媒が完全に除去された状態も含まれる。

[0125] 本発明の架橋ヒアルロン酸ゲル微粒子は、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸修飾物を含む溶液を、架橋反応の進行の遅!、希薄な状態から架橋反応が進行する濃度に濃縮することで、濃縮中に架橋することにより製造することができる。また、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸修飾物と薬物とを含む溶液を、架橋反応の進行の遅い希薄な状態から架橋反応が進行する濃度に濃縮することで、濃縮中に架橋反応を起こさせ、架橋反応と乾燥を同時に行うことで薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持微粒子とすることを特徴とする。

[0126] さらに具体的には、本発明の架橋ヒアルロン酸ゲル微粒子の製造方法としては、微粒子の溶媒留去による乾燥と架橋反応が同時に進行する製造方法であればよい。例えば、液体を噴霧乾燥するスプレードライヤーを用い、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸修飾物と薬物とを含む溶液を噴霧乾燥することで、濃縮乾燥中にヒアルロン酸修飾物を架橋し、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持微粒子を得ればよい。スプレードライを用いる場合は、薬物の変性を防ぐために、乾燥温度は 100°C以下であることが好ましい。

[0127] このようにして、架橋反応前の希薄溶液が薬物を含み、当該薬物が架橋反応後に得られる微粒子中に担持されている、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を基材としたヒアルロン酸ゲル微粒子を得ることができる。

[0128] あるいは、架橋反応可能な HA修飾物 (テトラプチルアンモ -ゥム塩）と薬物を DMS Oなどの極性有機溶媒に溶かしておき、二酸ィヒ炭素等の超臨界液体の添加により極性有機溶媒を抽出しヒアルロン酸修飾物を濃縮することにより、ヒアルロン酸修飾物の架橋反応を生じさせて微粒子を得ても良、。これらの微粒子化方法を用いる時は、 Tween—20、 Tween—80等の界面活性剤を添加（1%〜2%程度）することで、生成された微粒子の回収率を上げることができる。当該製造方法においては、濃縮前のヒアルロン酸修飾物の溶液は架橋反応を起こさない程度の濃度である必要があり、具体的にはヒアルロン酸修飾物の濃度は 0. 1%〜5%が好ましい。

[0129] また、別法としては、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸修飾物と薬物とを含む水溶液を脱水性を有する液体 (例えば、分子量 400ダルトンのポリエチレングリコール等）の中にェマルジヨンィ匕することで、脱水濃縮中にヒアルロン酸を架橋し、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持微粒子を得ることもできる。この方法を用いる時は、封入効率を上げるため、カチオン性カゾ-オン性の薬物が好ましい

[0130] また、微粒子形成後に熱処理をすることでさらに含水率を低下させ、架橋反応を完全に終了させたほうが好ましい。この場合、架橋密度も上がり、徐放期間の延長も期待できる。

[0131] また、

a)本発明のヒアルロン酸修飾物を架橋し、ヒアルロン酸ゲルを得る工程； b)得られたヒアルロン酸ゲルを乾燥する工程；

c)得られた乾燥物を凍結する工程；および

d)得られた凍結物を粉砕する工程を含む製造方法により、架橋ヒアルロン酸ゲル微粒子を製造することができる。

[0132] 当該製造方法の工程 a)における架橋時に薬物を封入することにより、薬物担持ゲルを得ることができ、当該ゲルを使用することにより、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持ゲル微粒子を得ることもできる。

[0133] 当該製造方法の工程 b)における乾燥方法としては、例えば通風乾燥、日光照射による乾燥、恒温槽中での乾燥、減圧下での乾燥、熱風循環式乾燥などが挙げられ、ゲル中に封入する薬物の性質などを考慮して適宜選択される。風速、乾燥時間、温度、圧力は、本発明のヒアルロン酸ゲルが分解や変質を生じない範囲で適宜選択されるが、恒温槽中での乾燥の場合、温度は、 30〜60°Cが好ましぐ 30〜45°Cがさらに好ましい。工程 b)により、工程 a)で得られたヒアルロン酸ゲルの徐放性をさらに高めることちでさる。 [0134] 当該製造方法の工程 c)における凍結方法は、乾燥されたヒアルロン酸ゲルの凍結が達成できる方法であれば特に限定されないが、例えば、ドライアイス、液体窒素、液体酸素、液体ヘリウムと接触させる方法を挙げることができ、また、これらで冷却された金属と接触させてもよい。接触させる時間は特には限定されないが、 3〜30分間が好ましぐ 10〜15分間がさらに好ましい。

[0135] 当該製造方法の工程 d)における粉砕方法としては、乳棒と乳鉢を用いる粉砕ゃミルを用いる粉砕が挙げられる力ミルを用いる粉砕が好ましい。ミル粉砕装置としては、遠心式粉砕機 (日本精機製作所)およびインパクトミル (株式会社ダルトン)等の回転円板型の粉砕装置、アトマイザ一 (東京アトマイザ一製造株式会社)、サンプルミル (東京アトマイザ一製造株式会社)、バンタムミル (東京アトマイザ一製造株式会社)、および SKミル（トッケン)等のスクリーンミルの粉砕装置、超微少量ラボジェットミル (A —Oジェットミル、セイシン企業)等のジェット粉砕装置、並びに、超低温での粉砕が可能なリンレックスミル (リキッドガス株式会社)等が挙げられるが、 SKミルおよびリンレックスミルが好ましい。

[0136] さらに、工程 c)の凍結と工程 d)の粉砕の工程を、 2〜： LO回、好ましくは 3〜5回繰り返してちょい。

[0137] これらの方法に従って得られたヒアルロン酸ゲル微粒子の微粒子径は、用途によつて最適化すればよいが、インジェクタブルにするために通常、 0. 01 μ m〜150 μ m が好ましい。経皮投与の時は、 0. 01 μ πι〜150 /ζ mが好ましぐ経鼻、経肺投与の時は、 0. 01 μ m〜5 μ mが吸入効率の点で好ましぐ静注投与の時には、 0. 01 μ m〜0. 2 /z m程度が血中動態の点力好ましい。

[0138] また、本発明の水溶性 HA修飾物は薬物とのコンジュゲート以外にも、高分子ミセル、リボソーム、ナノ微粒子等の微粒子性薬物キャリアーにおいて、その血中滞留時間の延長を目的として、表面修飾に用いることもできる。ここで表面修飾とは他の合成高分子、天然高分子、脂質、金属、セラミックスあるいはそれらの複合体など力なる物質の表面に、本発明の水溶性 HA修飾物をィ匕学的に結合または物理的に吸着させ、あるいは化学的に結合または物理的に吸着させた本発明の水溶性 HA修飾物をさらに架橋することで、当該物質の最表面に本発明の水溶性 HA修飾物ある、はその架橋体が存在している状態を指す。例えば、本発明の水溶性 HA修飾物と PLG A等の疎水性高分子を結合させた化合物を含む高分子ミセルゃ、本発明の水溶性 HA修飾物をリン脂質に結合させたリボソーム、あるいは、本発明の水溶性 HA修飾物に疎水性分子を結合させ、疎水性相互作用で疎水性微粒子表面をコートした微粒子、あるいは前記コート後さらに架橋した微粒子薬物担体等が挙げられる。

[0139] また、本発明のヒアルロン酸ゲル微粒子は、本発明のヒアルロン酸修飾物と同様、薬物担体としても用いることができる。ここで、本発明のヒアルロン酸ゲル微粒子からなる薬物担体とは、疾患の治療または診断のために用いられる微粒子状の薬物担体を意味する。当該担体の粒径は特に限定はされないが、例えば Inn！〜 200 mである。

[0140] 本発明のヒアルロン酸ゲル微粒子は、好ましくは、薬物徐放担体である。

[0141] 担持される薬物の徐放性能は、架橋された本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の架橋密度に大きく依存するため、カルボキシ基修飾率を制御することで、薬物の徐放性能を制御することができる。

[0142] また、本発明の水溶性 HA修飾物およびそれを架橋して得られる HAゲルを、外科手術後の癒着防止剤などの医療用デバイスの成分とすることもできる。本発明における医療用デバイスとは、疾患の治療または診断、あるいはそれらの補助に用いられるデバイスであれば特に限定されず、例えば人工臓器、インプラント、カテーテル、薬物内包ゲル、薬物内包ペレットなどが含まれる。

[0143] 上記医療用デバイスの具体例としては、本発明の水溶性 HA修飾物で表面修飾を施した医療用デバイスが挙げられる。

[0144] なお、本発明のヒアルロン酸修飾物と結合させる薬物および本発明のヒアルロン酸ゲルに封入する薬物 (低分子化合物、タンパク質、ペプチド、および核酸)の例としては、以下のものを挙げることができる。

[0145] 低分子化合物の例としては、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド等）、免疫抑制剤、抗炎症剤 (ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤、等)、抗リウマチ剤、抗菌剤（ β -ラタタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤、等)などを挙げることができる。

[0146] タンパク質、ペプチドの例としては、例えば、エリスロポエチン (EPO)、ダラ-ュロサイトコ口-一刺激因子（G— CSF)、インターフェロン a、 j8、 γ、（INF— α、 j8、 y )、トロンボポェチン（TPO)、シリアリーニュートロフイクファクター（CNTF)、チューマーネクローシスファクター（TNF)、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質 (TNFbp)、インターロイキン 10 (IL— 10)、 FMS類似チロシンカイネース（Fit— 3 )、成長ホルモン (GH)、インシュリン、インシュリン類似成長因子— 1 (IGF— 1)、血小板由来成長因子（PDGF)、インターロイキン 1レセプターアンタゴ-スト（IL lr a)、ブレイン由来-ユーロトロフイクファクター（BDNF)、ケラチノサイト成長因子（KG F)、幹細胞因子（SCF)、メガカリオサイト成長分ィ匕因子 (MGDF)、ォステオプロテゲリン (OPG)、レブチン、副甲状腺ホルモン (PTH)、塩基性フイブロブラスト成長因子 (b— FGF)、骨形成タンパク質 (BMP)、心房性ナトリウム利尿ペプチド (ANP)、脳性ナトリウム利尿ペプチド (BNP)、 C型ナトリウム利尿ペプチド (CNP)、グルカゴン様ペプチド— 1 (以下、「GLP— 1」とも称す）、抗体、ダイアポディー、ミニボディー、断片化抗体等を挙げることができる。

[0147] 核酸の例としては、例えば、 DNA、 RNA、アンチセンス、デコイ、リボザィム、 small interfering RNA等を挙げることができる。

[0148] また、本発明のヒアルロン酸ゲルに封入する薬物としては、上述の薬物と高分子とのコンジュゲートが好ましい。この場合に用いられる高分子としては、特に限定されないが、例えば、 PEG、 HA、 HA修飾物、デキストラン、プルラン、ポリグルタメート、ポリシアル酸等が挙げられる。

[0149] 本発明の水溶性 HA修飾物、ヒアルロン酸ゲル、およびヒアルロン酸ゲル微粒子は、薬物とのコンジュゲートとして、または薬物を封入して、 1種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む医薬組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。

[0150] 本発明により、従来の方法では得られない、実用的なレベルまで血中滞留時間が延長された水溶性 HA修飾物を製造することが可能となる。さらに本発明により提供される水溶性 HA修飾物を担体に用い、薬物をコンジユゲートイ匕することで、従来の技術では達成できなかった、実用的でかつ安全な医薬組成物を提供することが可能である。

[0151] さらに、本発明の水溶性 HA修飾物を用いることで、従来の HA修飾物では得られない、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物、あるいはそれらと高分子とのコンジュゲートを封入し、長期間徐放できる安全性の高いヒアルロン酸ゲル徐放製剤、医薬組成物を提供することが可能である。

実施例

[0152] 以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明する力本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

[0153] NMR測定は、核磁気共鳴装置 JNM— ECA500 (日本電子株式会社製)を用いて測定した。 NMRの測定条件を以下に示す。

[0154] NMR測定条件

Data point : 16384

Spectral width (X sweep;： l5ppm

Acquisition time (X acq time)： 1. 749s

Pulse delay (Relaxation delay)： 30s

Transients (Scans)： 64

温度：室温

測定溶媒: D O

2

また、以下の記載中の HAユニットとは、ヒアルロン酸中の N ァセチルダルコサミンーグルクロン酸の繰り返し単位（1ユニット）を意味する。

〔実施例 1〕非プロトン性極性溶媒中でのヒアルロン酸修飾物の合成 (縮合剤、溶媒混合比率、酵素分解性）

非極性溶媒中における様々な合成条件を検討し、各条件で得られたヒアルロン酸修飾物の酵素耐性の評価を行った。

(実施例 1 1) テトラプチルノヽイド口オキサイド（シグマアルドリッチ社製)でテトラブチルアンモ- ゥム（TBA)塩化した DOWEX 50WX8-400 (シグマ一アルドリッチ社製）を用いて、分子量 200kDaのヒアルロン酸ナトリウム (HA;電気化学工業株式会社製)を TB A塩化した。得られたテトラプチルアンモ -ゥム塩化ヒアルロン酸（以下、「HA— TBA 」とも称す） 29. lmgを 2. OmgZmL濃度となるよう DMSO (和光純薬株式会社製）に溶解した。 HAユニット ZBOP (和光純薬株式会社製) Zエチレンジァミン (以下、「 EDA」とも称す；シグマ—アルドリッチ社製） = 1/2. 5/100 (mol/mol/mol)の当量比で EDA、 BOPの順で添カ卩し、室温下でー晚反応させた。その後、 1M NaC 1水溶液を 10mL加えた後、 5N HC1を加えて pHを 3まで低下させ、さらに 2N Na OHにて中和を行った。大過剰量の蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量（以下、「MWCO」とも称す）： 12k— 14kDa)、限外ろ過後（YM 10、 MILLIPORE社製）、凍結乾燥して標題のァミノ基が導入されたヒアルロン酸 (以下、「HA— AM」とも称す） 25. 8mgを得た。

(実施例 1 2)

エチレンジァミンの代わりに 2, 2 '—(エチレンジォキシ）ビス（ェチルァミン）（以下、「EDOBEA」とも称す；シグマ一アルドリッチ社製）を用い、 HA— TBA 35. lmgを用い、 HAユニット ZBOPZEDOBEA= lZ2. 5Z50 (molZmolZmol)の当量比で反応させたこと以外は実施例 1 1と同様の方法で行、、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸（HA— AM) 27. 2mgを得た。

(実施例 1 3)

EDOBEAの代わりにへキサメチレンジァミン（HMDA；シグマアルドリッチ社製）を用い、 HA—TBA 62. Omgを用いたこと以外は実施例 1—2と同様の方法で行い、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸（HA— AM) 41. lmgを得た。

(実施例 1 4)

BOPの代わりに PyBOP (国産化学株式会社製）を用い、 HA— TBA 51. 8mgを用いたこと以外は実施例 1—2と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸（ HA-AM) 39. Omgを得た。

(比較例 1 1) DMSOの代わりに水を用い、 BOPの代わりに EDC (シグマアルドリッチ社製）を用い、 50. Omgの HA (ナトリウム塩）を 1. OmgZmL濃度とし、 HAユニット ZEDC Zエチレンジァミン ' 2HC1 (以下、「EDA' 2HC1」とも称す;和光純薬株式会社製） = lZ4Zl00(molZmolZmol)の当量比にした。 pHは 7. 0に調整しー晚反応させた。それ以外は実施例 1—1と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸 (H A-AM) 36. lmgを得た。

(比較例 1 2)

DMSOの代わりに水 Zエタノール（90Z10)を用いたこと以外は比較例 1 1と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸 (HA— AM) 36. Omgを得た。 (比較例 1 - 3)

DMSOの代わりに水 Zエタノール（70Z30)を用いたこと以外は比較例 1 1と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸 (HA— AM) 38. 3mgを得た。 (比較例 1 4)

EDCの代わりに EDCZHODhbt (渡辺化学工業株式会社製）を用い、 HAュ-ット/ EDC/HODhbt/EDA' 2HC1= 1/4/4/100 (mol/mol/mol/mol) の当量比にしたこと以外は比較例 1 3と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸（HA— AM) 49. 3mgを得た。

(比較例 1 5)

DMSOの代わりに水 ZDMSO (60/40)を用い、 HAユニット ZEDCZEDA' 2 HC1= 1/2/50 (molZmolZmol)の当量比にしたこと以外は比較例 1 1と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸（HA— AM) 44. Omgを得た。

(比較例 1 6)

EDCの代わりに BOPを用、たこと以外は比較例 1 5と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸（HA— AM) 42. lmgを得た。

(比較例 1 - 7)

EDA' 2HC1の代わりにへキサメチレンジァミン · 2HC1 (HMDA.2HC1;東京化成工業株式会社製)を用いたこと以外は比較例 1— 1と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸（HA— AM) 35. 2mgを得た。 (比較例 1 8)

EDA' 2HC1の代わりに HMDA' 2HC1を用いたこと以外は比較例 1— 3と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸 (HA— AM) 33. 3mgを得た。

(比較例 1 9)

EDA' 2HC1の代わりに HMDA' 2HC1を用い、水 Zエタノーノレ (60/40)を用いたこと以外は比較例 1 3と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸 (HA— AM) 33. 6mgを得た c

(比較例 1 10)

EDA' 2HC1の代わりに HMDA' 2HC1を用い、水 Zエタノーノレ (60/40)を用いたこと以外は比較例 1 4と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸 (HA— AM) 48. 4mgを得た。

(比較例 1 11)

水 ZDMSO (60Z40)の代わりに水 ZDMSO (50Z50)を用い、 51. 9mgの HA を用いたこと以外は比較例 1 5と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸 (HA-AM) 47. 5mgを得た。

(比較例 1 12)

BOPの代わりに DCC (和光純薬株式会社製）を用い、 69. 9mgの HA—TBAを 4 . OmgZmL濃度とし、 HAユニット ZDCCZEDOBEA= lZ4Zl00 (mol/mol /mol)の当量比にしたこと以外は実施例 1 2と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸（HA— AM) 54. 5mgを得た。

(比較例 1 13)

BOPの代わりに DCCを用い、 54. lmgの HA—TBAを用いたこと以外は実施例 1 1と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸 (HA— AM) 40. 7mgを得た。

(比較例 1 14)

BOPの代わりに CDI (シグマ一アルドリッチ社製）を用い、 50. Omgの HA—TBA を用いたこと以外は実施例 1 1と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸 (HA-AM) 31. 6mgを得た。 (比較例 1 15)

BOPの代わりに EDCを用い、 46. 4mgの HA—TBAを用いたこと以外は実施例 1 2と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸 (HA— AM) 30. 4mgを得た。

(比較例 1 16)

BOPの代わりに EEDQ (和光純薬株式会社製）を用い、 58. 4mgの HA—TBAを用いたこと以外は実施例 1—2と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸（ HA-AM) 39. 5mgを得た。

(比較例 1 17)

EEDQの代わりに DMT— MM (和光純薬株式会社製）を用い、 53. 5mgの HA— TBAを用 V、たこと以外は実施例 1 2と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸（HA— AM) 33. 2mgを得た。

(比較例 1 18)

DMT—MMの代わりに TBTU (和光純薬株式会社製）を用い、 56. Omgの HA— TBAを用 V、たこと以外は実施例 1 2と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸（HA— AM) 30. Omgを得た。

(試験例 1)酵素分解性評価

実施例 1— 1〜1— 4および比較例 1— 1〜1— 18で得られた HA— AMを 2mg/m L濃度に蒸留水（ミリ Q水）に溶解した。この溶液 55 μ Lに 0. 2Μリン酸緩衝液 (ρΗ6 . 2) 132 Lおよび水 77 μ Lを加え、ヒアル口-ダーゼ SD (生化学工業株式会社製 ) lU/mL溶液 (0. 01%BSAを含む 0. 05Mリン酸緩衝液 (pH6. 2) )44 /z Lを加えて 37°Cで 24時間インキュベートした。各サンプル 100 μ Lを分取し、 50mM酢酸溶液を 720 L加え反応を停止させた。対照として酵素非添加群も同様に行った (データ省略)。それぞれゲル浸透クロマトグラフィー（以下、「GPC」とも称す）に供して HA AMの分子量の変化、分解産物の生成パターンを観察した（232nmの吸収)。 GP Cの条件を以下に示す。

GPCの沏条件

GPC Column： Superdex200 10/300 GL、 Superdex75HR 10/30, S uperdex PeptideHR 10Z30 (アマシャムバイオサイエンス株式会社製）（3本連結）

Eluent: PBS (pH7. 4)

Flow Rate : 0. 4mL/ mm

Injection Volume : 50 ^ L

Detection： UV (232nm)

2糖分解ピーク (Retention Time : 130分）が観察されたものを X、観察されなかつたものを〇で評価し、表 1に示す。また、典型的な GPCデータを図 1および図 2に示す (実施例 1 1〜1 4、比較例 1 3、 1 5、 1 6、 1 14、参考例)。

[0155] また、実施例 1 1〜1 4のァミノ基導入率をプロトン NMR法で定量した (HA:N ーァセチル基のメチルプロトン、 1. 8〜1. 9ppm、 AM :エチレンジァミン部分のメチレンプロトン、 2. 9〜3. lppm)。プロトン NMRデータを図 3に示す。アミノ基導入率はそれぞれ 97. 5、 75. 5、 88. 3、 84. 5%だった。

[0156] なお、 CDIを用いた導入 (比較例 1— 14)における、反応前後でのゲル浸透クロマトグラムを図 4に示す。また、以下に GPC条件を示す。

[0157] GPCの測定条件

GPC Column :TSKgel G6000PW (TOSOH社製）

XL

Eluent: PBS (pH7. 4)

Flow Rate : 0. 5mL/ mm

Injection Volume : 50 ^ L

Detection： UV (21 Onm)

縮合剤として CDIを用いた場合、明らかな分解が観察され、 CDIを用いる縮合では H Aの分子量が極端に低下したことが確認された。さら〖こ、ヒアル口-ダーゼによる分解に対する耐性が得られな力つたため、 HAへのアミノ化合物の導入には不向きであることが明ら力となった。

[0158] さらに、本試験例においては、 a)溶媒として DMSO単独を用いる、 b)縮合剤として BOPまたは PyBOPを用いる、という条件の両方を満たさない場合も、ヒアルロニダ一ゼによる分解に対する耐性が得られなカゝつたため、 HAへのアミノ化合物の導入には不向きであることが明ら力となった。

[0159] [表 1] 表 1. 合成結果

mm m 縮合剤有機蘭 ¾ 難 mm m：難基

EDA 2HCI ¾0 EDC m 1 ： 1 ： 100 比■ 1 - 1

ιφ/i tm EDC i ]rag/inL X 1 ： 1 ： 100 比翻 1 - 2

EC ' Lng mL I ： 1 ： mo 比棚 1 -3

HjOίΐΟΗ EDC/UOWibt 30¾ KmL ： 4： 1 ： 100 比, 1—4

Η,οmi EDC 40¾ 1 ： 2 1:50 比 1 - 5

BOP Ing/mL 1 ； 1 1:50

顯 ccc ： 2.5 1 ： 100 比翻ト

DMSO CDI - X l ； 1.2 1:50 比糊 1 -14

DMSO BOP 2menL C 1 ： 2.5 1 ： !00 例 1—1

DMSO EDC 2is¼ 1 ： 2.5 1:50

1 -15 扁 EEDQ Zmgat 1 2,5 1:50 itWfl ! - 16 讓 i - 2mg/nt 1 2.5 1:50 比棚 1 -；！ 7 瞧 nl 1 ： 2.5 1:50 t 1 -18 讓 PyBOP - 2m o]L 〇 1 ： 2.5 1:50 実施例 1 -4

HMDA 2HC1 wc 0% 1 ： 4 1 ： 100 比割ト 7

HjO/RlOH EX 30Ϊ Irog mL X 1 ： 4 1 ： 100 8

EDC 40¾ lmg mL 1 ： 1 ： 100

1一 9 ίψ/ΕιΟΗ liDC HODhbt 40¾ X 1 ： 4： 4 1 ： 100 比 il一 10 ιφ/im) EDC lmgmL 1 ： 2 1:50 比 1- 11 瞧圃 BOP - 〇 1 2.5 1:50 実剛 1 - 3

EDO^A 隱 DOP - SmgniL 〇 1 ΙΛ L:50 実細 1― 2 画 ECC 一 WmL X ： 1 ： 100 比糊 1一 12

〔実施例 2〕 B 0 Pの添加率によるジアミン化合物の導入率制御

[0160] 〔実施例 2〕 BOPの添加率によるジァミン化合物の導入率制御

ジァミンィ匕合物の導入率の制御を行うために、様々な比率で縮合剤を添加し、酵素耐性評価を行った。

[0161] HA(200kDa)一 TBAを 2. OmgZmLで DMSOに溶解した溶液を 3つ用意し、各溶液に HAユニットエチレンジァミン (EDA) = 1/50 (mol/mol)の当量比で ED Aを加え、 BOP試薬を HAユニットに対しそれぞれ 1.08、 1.5または 2.0の当量比でカ卩え、一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の 1M NaCl水溶液をカ卩えた後、 5N HC1にて pHを 3まで低下させた後、 2N NaOHにて中和を行った。その後大過剰量の蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO)： 12k- 14kDa)、限外ろ過後（YM— 10、 MILLIPORE社製）、凍結乾燥を行った。

[0162] また、 HA (23kDa)—TBAを 2. OmgZmLで DMSOに溶解した溶液を 3つ用意し、各溶液に HAユニット /2, 2'— (エチレンジォキシ）ビス（ェチルァミン） (EDOBE A) = lZ50 (molZmol)の当量比で EDOBEAを加え、 BOP試薬を HAユニットに対しそれぞれ 1. 0、 1. 5または 2. 0の当量比でカ卩え、一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の 1M NaCl水溶液をカ卩えた後、 5N HC1にて pHを 3まで低下させた後、 2N NaOHにて中和を行った。その後大過剰量の蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO) : 12k— 14kDa)、限外ろ過後（YM— 10、 MILLIPORE社製）、凍結乾燥を行った。

[0163] 実施例 2のァミノ基導入率をプロトン NMR法で定量した (HA:N—ァセチル基のメチルプロトン、 1. 8〜1. 9ppm、 AM :EDA部分のメチレンプロトン、 2. 9〜3. lppm 、 EDOBEA部分のメチレンプロトン、 2. 9〜3. lppm)。プロトン NMRデータを図 5 に示す。また、各 HA修飾物のヒアル口-ダーゼ耐性は試験例 1と同様の方法で評価した。アミノ基導入率およびヒアル口-ダーゼ耐性評価の結果を表 2に示す。アミノ基の導入率は BOPの仕込みで制御可能であり、非プロトン極性有機溶媒中で BOP系試薬を縮合剤として用いることにより、均一的にかつ高導入率までの導入が可能であることが明ら力となった。

[0164] [表 2]

ァミノ基の導入率およびヒアルロニダ一セ Ιίί性評価

[0165] HAは水中で分子内水素結合と、分子内および分子外の疎水性相互作用により、 2次構造、 3次構造を形成していることが知られており（The Biology of Hyaluro nan. Chiba Foundation Symposium 第 143卷，第 6— 14頁（1989年））、均一な化学修飾が難しくなつていると考えられる。このため、水中で HAのカルボキシ基の多くを修飾しても、 HAレセプターに認識されうる連続した 4— 6糖の未修飾ドメインがー部残存しており、ここが体内の HAレセプターに結合してしまうことで比較的短期間に血中力クリアされてしまうと予想される。非プロトン性極性溶媒中では HAの水素結合、疎水性相互作用が減弱されることで HAの高次構造が壊され、高次構造形成に基づくカルボキシ基周辺環境の不均一性が解消され、より均一的な化学修飾が達成され、酵素耐性が得られるものと考えられる。

〔実施例 3〕カルボン酸変換した HA修飾物のヒアル口-ダーゼ耐性評価

酵素耐性をより詳細に評価するために、導入した一級アミンをカルボン酸に変換した HA修飾物（HA— AM - SUC)の合成を行!ヽ、得られた HA修飾物の酵素耐性の評価を行った。

(実施例 3— 1 ) H A— AMの合成

HA(200kDa)— TBAを 4. OmgZmLで DMSOに溶解した溶液を 6つ用意し、各溶液に HAユニット ZEDOBEA= 1/50 (mol/mol)の当量比で 2, 2' - (エチレンジォキシ）ビス（ェチルァミン）（EDOBEA)をカ卩え、 BOP試薬を HAユニットに対し、 0. 4、 0. 6、 1. 0、 1. 5、 1. 85または 2. 5の当量比で加え、ー晚反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の 1M NaCl水溶液をカ卩え、 5N HC1にて pHを 3まで低下させた後、 2N NaOHにて中和を行った。その後 0. 3M NaCl水溶液に対して透析を行い、次に大過剰量の蒸留水 (ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポァ 4、分画分子量（MWCO)： 12k- 14kDa)、凍結乾燥を行い、 EDOBEA導入 H A修飾物を得た。

(実施例 3— 2)—級ァミンのカルボン酸への変換

上記（実施例 3— 1)で得られたサンプルを蒸留水（ミリ Q水）で 20. OmgZmLの溶液とし、これに 0. 2M炭酸緩衝液 (pH9. 0)をカ卩え、 10. 0mg/mLとした。この溶液に HAのユニット（1ユニット =繰り返し単位である N—ァセチルダルコサミン一ダルクロン酸）に対して 20モル倍の無水コハク酸 (和光純薬株式会社製)を HA— AM溶液の 1/10容量の DMSO溶液としてカ卩えて室温で 30分間撹拌した。その後 0. 3M NaCl水溶液に対して透析を行い、次に大過剰量の蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO)： 12k- 14kDa)、凍結乾燥を行ない、 HA— AM— SUCを得た。 NMR ^ベクトルを図 6に示した。ァミノ基の隣のメチレンのピーク（2. 9〜3. 1)が完全に消失し、新たにコハク酸由来のピーク（2. 4〜2. 6 ppm)が観察され、ァミノ基がカルボン酸へ変換されていることが明ら力となった。 (実施例 3— 3)酵素分解性評価

実施例 3— 2で得られた HA— AM— SUCを 4mg/mL濃度で蒸留水（ミリ Q水）に溶解した。この溶液 25 /z Lに 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 2) 200 Lおよび水 25 L を加え、ヒアル口-ダーゼ SD (生化学工業株式会社製） lU/mL溶液 (0. 2Mリン酸緩衝液; PH6. 2)50 Lを加えて 37°Cで 24時間インキュベートした。各サンプル 10 0 Lを分取し、 50mM酢酸溶液を 700 Lカ卩ぇ反応を停止させた。対照として酵素非添加群も同様に行った (データ省略)。それぞれゲル浸透クロマトグラフィー（以下、「GPC」とも称す）に供して HA— AM— SUCの分子量の変化、分解産物の生成パターンを観察した（232nmの吸収)。結果を図 7および表 3に示す。また、 GPCの条件を以下に示す。

GPCの測定条件

GPC Column： Superdex200 10/300 GL、 Superdex PeptideHR 10 Z30 (アマシャムバイオサイエンス株式会社製）（2本連結）

Eluent : PBS (pH7. 4)

Flow Rate : 0. L/ min

Injection Volume : 50 ^ L

Detection： UV (232nm)

[表 3] 表 3 . アミノ基修飾率とヒアルロニダーセ性の相関

全ピークエリアに対する 2

導入率

糖のピークエリァの割合 )

18.0 88.9

30.0 52. 5

45. 5 22. 5

56. 5 11.9

66.5 12.9

94.5 0.0

96.0 0, 0 ここで分解産物のうちの 2糖分率は溶媒由来のピーク (Retention Time： 90分) を除いた範囲で 100 X (2糖のピークエリア) Z (全ピークエリア—酵素非添カ卩時全ピークエリア) (o/o)として算出した。酵素耐性はァミンの導入率、すなわち HAのカルボン酸の修飾率に対応して酵素耐性が上がることが明ら力となった。

〔実施例 4〕様々な官能基を導入した HA修飾物の合成と二成分の官能基の導入率制御

様々な官能基の導入の検討を行った。また長期間の血中滞留性を維持し、反応性官能基の導入率の制御を行うため二つの化合物の導入を行った。

(実施例 4 1)水酸基を導入した HA修飾物 (HA— OH)の合成

(実施例 4— 1 - 1)アミノエタノール (AEtOH)導入 HA修飾物の合成

HA(200kDa)— TBAを DMSOに溶解して 5. OmgZmLの溶液を調製し、そこに HAユニット Z一級アミン = lZ50 (molZmol)の当量比でアミノエタノール（以下、「 AEtOHjとも称す；シグマ一アルドリッチ社製）を添加し、さらに BOP試薬を HAュ- ットに対し 2. 5の当量比で添加し一晩攪拌した。その後反応混合物の容量の半分量の 1M NaCl水溶液をカ卩えた後、 5N HC1にて pHを 3まで低下させた後、 2N Na OHにて中和を行った。その後大過剰量の 0. 3M NaCl水溶液、蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO) : 12k— 14kDa)、凍結乾燥を行った。得られたサンプルの NMRチャートを図 8に示した。

(実施例 4— 1— 2) 2— (2 アミノエチルァミノ）エタノール (AEAEtOH)を導入した HA修飾物の合成

AEtOHの代わりに 2—（2—アミノエチノレアミノ）エタノーノレ（以下、「AEAEtOH」とも称す;シグマ—アルドリッチ社製)を用いたこと以外は実施例 4— 1— 1と同様の方法で行った。得られたサンプルの NMRチャートを図 8に示した。

実施例 4—1— 1および 4—1 2におけるサンプルの¹ H—NMR測定では、それぞれにおいて新たなピークが観察され目的の変換が達成されたことが確認された。しかし、導入化合物のピークが HA由来のピークと重なるため AEtOHおよび AEAEtOH の導入率の算出はできなかった。

(実施例 4 2)二級ァミンおよび水酸基を有するァミン化合物の導入

(実施例 4— 2 - 1)ジエチレントリァミン (DETA)を有する HA修飾物の合成

HA(200kDa)—TBAを DMSOに溶解して 5. OmgZmLの溶液を調製し、そこにジエチレントリァミン（以下、「DETA」とも称す;シグマ—アルドリッチ社製）を HAュ- ット Zジェチレントリアミン= 1/100 (molZmol)の当量比で添加しさらに BOP試薬を HAユニットに対し 1. 5の当量比で添加し 3時間攪拌したその後反応混合物の容量の半分量の 1M NaCl水溶液を加え、 5N HC1にて pHを 3まで低下させ、 2N NaOHにて中和を行った。その後大過剰量の 0. 3M NaCl水溶液、蒸留水（ミリ Q 水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO)： 12k- 14kDa)、凍結乾燥を行った。導入率はプロトン NMR法で定量した。（HA:N ァセチル基のメチルプロトン、 1. 8〜1. 9ppm、 AM :ジエチレントリアミン部分の 3つのメチレンプロトン、 2. 6〜3. lppm)導入率は 89. 8%であった。得られたサンプルの NMRチヤ一トを図 8に示した。

(実施例 4 - 2- 2) 1,3-ジァミノ 2 ヒドロキシプロパン (DAHP)を有する HA修飾物の合成

DETAの代わりに 1,3 ジァミノ一 2 ヒドロキシプロパン（以下、「DAHP」とも称す；シグマ―アルドリッチ社製）を用い、 DAHPを HAユニット ZDAHP = 1/50 (mol Zmol)の当量比で添カ卩し、さらに BOP試薬を HAユニットに対し 2. 5の当量比で添カロし一晩攪拌したこと以外は実施例 4— 2— 1と同様の方法で行った。導入率はプロトン NMR法で定量した。（HA:N ァセチル基のメチルプロトン、 1. 8〜1. 9ppm、 AM : 1,3 ジァミノ一 2 ヒドロキシプロパン部分のメチンプロトン、 2. 6〜2. 8ppm) 導入率は 99. 0%であった。得られたサンプルの NMRチャートを図 8に示した。実施例 4— 2—1および 4— 2— 2における¹ H—NMR測定によりアルキルに水酸基が付加したジァミンィ匕合物、および二級アミンを有するァミン化合物も導入可能であることが明ら力となった。

(実施例 4 3)水酸基およびアミノ基を導入した (HA-AM/OH)の合成

(実施例 4 - 3 - 1) 3-ァミノプロパーノールおよび 1 , 3 ジァミノブタンを導入した H A修飾物の合成

HA(200kDa) TBAを 5. OmgZmLの濃度に DMSOに溶解した溶液を 5つ用意した。反応試薬は 3—ァミノプロパノール (以下、「APrOH」とも称す;シグマ—アルドリツチ社製）、 1, 3 ジァミノプロパン (以下、「DAP」とも称す;シグマ—アルドリッチ社製）を用い、 HAユニット Z反応試薬のアミノ基 (APrOH + DAP) =lZ50(molZ 11101)の当量比で固定し、八？1：011:0八？（11101:11101)が100:0、 95:2.5、 90:5、 8 0:10、 0:100のモル比となるように各溶液に添カ卩した。その後、 BOP試薬を HAュニットに対し 2.5の当量比で各溶液に添加した。その後反応混合物の容量の半分量の 1M NaCl水溶液をカ卩え、 5N HC1にて pHを 3まで低下させた後、 2N NaOH にて中和を行った。その後大過剰量の 0.3M NaCl水溶液、蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO)： 12k- 14kDa)、凍結乾燥を行った。アミノ基および水酸基の導入率はプロトン NMR法で定量した。 NMRチヤートを図 9に示す（HA:N ァセチル基のメチルプロトン、 1.8〜1.9ppm;AM: ジアミノブロノン部分のメチレンプロトン、 1.7〜1.8、 2.9〜3.0ppm;OH:アミノプロノ V—ルのメチレンプロトン、 1.55〜： L 65ppm)₀

それぞれ導入率は 100:0 (APrOH: DAP) =100モル⁰ /₀、 95:2.5(APrOH:D AP)=88.4:10.7モル⁰ /₀、 90:5 ( APrOH： DAP) = 78.9:19.2モル⁰ /₀、 80:1 0(APrOH:DAP)=63.8:36.0モル⁰ /₀、 0: 100 (APrOH: DAP) =93.2モル⁰ /₀ であった（以下、導入率が 0： 100 (APrOH： DAP) = 93.2モル％である HA修飾物を、「HA—DAP」とも称す）。また、 GPCチャートを図 10に示した（対照： 200kDaのヒアルロン酸ナトリウム (HA— Na) )。イオン性基でなヽ官能基を導入することにより、 GPCチャート上でピークが低分子側にシフトし見かけ上の分子量が低下する現象が観察され、静電的もしくは水素結合的な分子内の相互作用が変化した可能性が示唆された。また、 AMの導入に従いカラムとの相互作用によりピークが低分子量側へシフトすることが観察された。実施例 4 3— 1により、ァミノ基と水酸基とを有する水溶性 HA修飾物の合成が可能であり、その導入率が制御可能であることが明ら力となつた o

(実施例 4 -3-2) (2-アミノエトキシ）エタノーノレ (AEEtOH)およびエチレンジァミン (EDA)を導入した HA修飾物の合成

反応試薬であるアミノプロパノール (APrOH)、ジァミノプロパン（DAP)の代わりに (2—アミノエトキシ）エタノール（以下、「AEEtOH」とも称す；シグマ—アルドリッチ社製）、エチレンジァミン (EDA;シグマ一アルドリッチ社製)を用い、 HAユニット/反応試薬のアミノ基 (AEEtOH+EDA) = lZ50 (molZmol)の当量比で固定し、 AEE tOH :EDA(mol:molW 95 : 2. 5、 90 : 5、 80 : 10のモル比となるように各溶液に添加し、反応させた以外は実施例 4— 3—1と同様の方法で行った。ァミノ基の導入率はプロトン NMR法で定量した。 NMRチャートを図 11に示す。（HA:N ァセチル基のメチルプロトン、 1. 8〜1. 9ppm、 AM :エチレンジァミン部分のメチレンプロトン、 2 . 9〜3. lppm)それぞれAM (EDA)の導入率は95 : 2. 5 ( AEEtOH： EDA) = 13 . 0モル⁰ /₀、 90： 5 (AEEtOHH： EDA) = 20モル⁰ /₀、 80 : 10 (AEEtOH： EDA) = 3 3. 0モル％であった。また、 GPCチャートを図 10に示した。実施例 4— 3—1と同様にイオン性基でな!ヽ官能基を導入することにより、 GPCチャート上でピークが低分子側にシフトし見かけ上、分子量が低下する減少が観察され、静電的もしくは水素結合的な分子内の相互作用が変化した可能性が示唆された。また、 AMの導入に従いカラムとの相互作用によりピークが低分子量側へシフトすることが観察された。

(実施例 4 4)酵素分解性評価

実施例 4 1および 4 3で得られたサンプルを 4mg/mLの濃度で蒸留水（ミリ Q水 )に溶解した以外は実施例 3— 3と同様に行った。また、解析に関しては AM基の影響があるために 2糖分率の評価は行わな力た。結果を図 12、 13に示す。

全てのサンプルにおいて、 2糖の分解物は観察されず、電荷および反応性官能基の導入率制が可能な酵素耐性を有する HA修飾物が合成可能であることが示唆された。なお、 2糖の分解物が観察されな力つたということは、ヒアル口-ダーゼで分解して得られる分解産物の 232nmにおける吸収を測定した場合、分解産物に由来する全ピークエリアに対する 2糖に由来するピークエリアの分率が 30%以下であったことを意味する。

〔実施例 5〕ヒアルロン酸修飾物（HA— AM— SUC)の分子量と血中滞留時間との相関 (分子量依存性）

ヒアルロン酸修飾物（HA— AM— SUC)の血中滞留性を分子量の観点カゝら解析するために、 23k、 100kおよび 200kDaの HAから HA修飾物を合成し、蛍光色素である FITCを導入したサンプルを調製し、それぞれの血中滞留性を観察した。

(実施例 5— 1 ) H A— AMの合成 HA(23kDa)—TBAを 2mgZmLの濃度で DMSOに溶解し、また HA(lOOkDa) TBAおよび HA(200kDa)— TBAを 4mgZmLの濃度で DMSOに溶解した溶液を調製した。 HAユニット ZBOPZ2, 2 '—(エチレンジォキシ）ビス（ェチルァミン） (EDOBEA) = 1/2. 5/50 (mol/mol/mol)の当量比で EDOBEA、 BOPの順で各溶液に添加し、室温下で一晩反応させた。その後、反応混合物の容量の半分量の 1M NaCl水溶液をカ卩えた後、 5N HC1をカ卩えて pHを 3まで低下させ、さらに 2 N NaOHにて中和を行った。大過剰量の蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量（MWCO)： 12k- 14kDa)、限外ろ過後（YM— 10、 Ml LLIPORE社製）、凍結乾燥して標題のァミノ基が導入されたヒアルロン酸 (HA— A M)を得た。アミノ基導入率はプロトン NMR法で定量した。 NMRチャートを図 14に示す（HA:N—ァセチル基のメチルプロトン、 1. 8〜1. 9ppm、 AM :EDOBEA部分のメチレンプロトン、 2. 9〜3. lppm)。それぞれ導入率は 23kDa : 87モル⁰ /₀、 10 0kDa: 92. 5モル⁰ /₀、 200kDa : 93. 5モル⁰ /。であった。

(実施例 5— 2)蛍光標識 HA修飾物の合成

上記（実施例 5— 1)で得られた HA— AMを蒸留水（ミリ Q水）で溶解し 20. Omg/ mLの溶液とし、これに 0. 2M炭酸緩衝液 (pH9. 0)をカ卩え、濃度を 10. OmgZmLとした。この溶液に HAのユニット（1ユニット =繰り返し単位である N ァセチルダルコサミンーグルクロン酸）に対して 0. 07モル倍のフルォレセインイソチオシァネート（以下、「FITC」とも称す；ピアス社製）を HA—AM溶液の 1Z10容量の DMSO溶液としてカ卩えて室温で 1時間撹拌した。その後、 HAのユニットに対して 40モル倍の無水コハク酸（和光純薬株式会社製）を HA— AM溶液の 1Z10容量の DMSO溶液として加えて室温で 30分間撹拌した。 PD— 10カラム（アムシャムバイオサイエンス株式会社製）によるゲル濾過で粗精製した後、大過剰量の 0. 5M NaCl水溶液に対して透析精製した (スぺクトラポア 4、分画分子量（MWCO) : 12k— 14kDa)。透析外液を蒸留水 (ミリ Q水）に置換してさらに透析精製し、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識 HA— AM— SUCを得た。

ここで得られた各蛍光標識 HA— AM— SUCを 0. 25mgZmL濃度で 50mM炭酸緩衝液 (PH9. 0)に溶解し、その溶液の 494nmにおける吸光度カゝら FITC由来の N フルォロセィニルチオ力ルバモイル基のモル濃度を定量し、以下の式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、 HA修飾物中の HA由来の重量分率算出を行った。

[0174] 未修飾 HAユニット： X μ mol/mL

HA— AM— SUCユニット： y μ mol/mL (AMが無水コハク酸処理されたュニット）

と定義し、以下の式より算出した。

[0175] [化 8] 式 1： (401.3 X X) + (631.58 X y) + (544.97 X 赚 AM cone.)) + (898.9 X (FITC cone.)) = 250 mg

式 2： x / (y + (残存 AM cone.) + (FITC cone.)) = (100-AM(¾))！ AM (

[0176] なお、式中の残存 AM cone.とは未反応のアミノ基を有するユニットのモル濃度を意味し、 FITC cone.とは FITC基を有するユニットのモル濃度を意味する。

[0177] 得られた結果を表 4にまとめた。

[0178] [表 4] 表 4. 薬物動態試験用 F IT C標識 H A— AM— SUC

残存 HA-AM-F I TC HA— AM— SUC 未膽 HA

AM ( ) AM (¾) ユニットユニットユニット HA

(kD a) N R TNBS (モル％) (モル ¾；) (モル％) (重星？ fi)

23 87.0 1.0 86.0 13.0 63.7

100 92.5 - 0.9 91.6 7.5 62.3

200 93.5 1.5 0.7 91.3 6.5 62.9

-：定量限界以下

[0179] (比較例 5— 1 )蛍光標識 HA -HZ- SUCの合成

580kDaのヒアルロン酸ナトリウム (電気化学工業株式会社製)を 0. 25%濃度 (w /v)で蒸留水に溶解し、 5N塩酸で pHを 4. 7〜4.8に調整した。 1ーェチルー 3—（ 3 -ジメチルァミノプロピル)カルポジイミド (EDC)とアジピン酸ジヒドラジド（以下、「A DH」とも称す）を、 HAのユニット： EDC: ADH= 1： 5 :40のモル比になるよう添加し、 5N塩酸で pHを 4. 7〜4. 8に保ちながら室温で 2時間反応させた。大過剰量の 10 OmM塩化ナトリウム溶液、 25%エタノール水溶液、蒸留水（ミリ Q水）に対して順に透析 (スぺクトラポア 7、分画分子量 (MWCO) : 12k—14kDa)し、凍結乾燥してヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（HA— HZ)を得た。 HA—HZ中の HZ導入率を A DH導入率としてプロトン NMR法で定量したところ、 HAのカルボキシ基の 73%であつた o

[0180] この HA—HZを蒸留水（ミリ Q水）に溶解させた後、等量の lOOmM炭酸緩衝液 (p H9. 0)を加えて終濃度を lmgZmLに調整した。これに FITCZHAのユニット = 3. OmolZmolの仕込比で、 HA— HZ溶液の 1 Z 10容量の DMSOに溶解させた FIT Cを添加し、室温、遮光下に 1時間反応させた。反応溶液 25mLを予め 50mM炭酸緩衝液 (PH9. 0)で平衡ィ匕した PD— 10カラム（10本）に投入し、未反応の FITCを除去した。この租精製した溶液に無水コハク酸 ZHZ = 250molZmolの仕込比で、 DMSOに溶解させた無水コハク酸を添加し（3. 5mL)、同様に反応させた。反応混合物を大過剰量の蒸留水 (ミリ Q水）に対して透析精製し、凍結乾燥して HA— HZを FITC標識した蛍光標識 HA— HZ— SUCを得た。

[0181] 得られた各蛍光標識 HA— HZを 0. 25mgZmL濃度で 50mM炭酸緩衝液 (pH9 . 0)に溶解し、その溶液の 494nmにおける吸光度力も FITC濃度を定量し、以下の式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、 HA修飾物中の HA由来の重量分率算出を行った。

[0182] 未修飾 HAユニット： X μ mol/mL

HA— HZ— SUCユニット： y molZmL (HZが無水コハク酸処理されたュ-ット）と定義し、以下の式より算出した。

[0183] [化 9] 式 1 ： (379.3 X x) + (635. 57 X y) + (924.88 X (FITC cone. )) = 250 mg 式 2 : x / (y + (FITC cone. )) = (100 - HZ (¾)) I HZ (¾)

[0184] なお、式中 FITC cone.とは FITC基を有するユニットのモル濃度を意味する。得られた結果を表 5にまとめた。

[0185] [表 5] 薬物動態試験用 F I T C標識 H A- H Z - S U C

残存 HA-FITC HA-SUC 未修飾 HA

HZ (¾) HZ (%) ュニットュニットュニット HA

腿 TNBS (モリレ » (モル ¾) (モル %) (重量 %)

73 1. 1 71. 9 27. 0 67. 8

-：定量限界以下

[0186] (実施例 5— 3)血中滞留時間評価

H ΑΦ^与ラット ΙΪΠ.撖サンプル

実施例 5— 2および比較例 5— 1の蛍光標識 HA修飾物を lOmgZkgの用量でラット静脈内（iv)および皮下（sc)に単回投与し、投与前および投与後 0. 0833、 0. 25 、 0. 5、 1. 2、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 24、 48、 72、 96、 168時【こ採血（へノリン処理)し、遠心分離により血漿を得た。 (0. 25、 1. 2、 6、 10、 12は比較例 5—1のサンプルにつ V、てのみ）この血漿サンプルは測定まで一 20°C以下で凍結保存した。

[0187] 沏 I 法

GPCにより検量線用標準試料および測定用試料の分析を行った。以下に条件を示す。

[0188] GPC Column : TSKgel G6000PW (TOSOH社製）

XL

Mobile phase： PBS (pH7. 4)

Elution mode : Isocratic

Flow rate : 0. 5mLZ min

Inj ection volume : 40 μ L·

Detection： Fluorescence (EX： 494nm, EM： 518nm)

沏 I定試料の調製

•検量線用試料；

各蛍光標識 HA修飾物を PBS (pH7. 4)を用いて希釈し、 1、 5、 10、 50、 100、 50 0 μ gZmLおよび 0 μ g/mL (対照、 PBS (pH7. 4) )の標準液を調製した。この標準液に等容量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。

•測定用試料の調製； HA修飾物投与ラット血漿サンプルに等容量の PBS (pH7. 4)を添加して測定用試料を調製した。

•血漿中の HA修飾物濃度の算出；

解析ソフト Millenium Ver 3. 21 (Waters社製）を用いてピーク面積を算出した。各標準試料のピーク面積力得られた検量線より血漿中の HA修飾物濃度を算出した。

[0189] 薬物動餱データ

実施例 5— 2および比較例 5— 1の蛍光標識 HA修飾物の蛍光標識 HA修飾物の血中濃度推移のデータについて、 WinNonlin Ver 4. 0. 1 (Pharsight社製）で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の最終測定点 3点のデータを用いてモデル非依存的解析を行い、半減期 (tlZ2)、平均血中滞留時間 (MRT)を算出した。また、皮下投与後の BA (Bioavailability)は皮下投与後の血漿中濃度下面積（ AUCsc)と静脈内投与後の血漿中濃度下面積 (AUCiv)力も以下の式に従い算出した。

[0190] [化 10]

B A (%) =AUC s c /AUC i v X 1 0 0

[0191] 蛍光標識 HA修飾物の血中濃度推移を図 15に示し、算出した薬物動態学的パラメ一ターを表 6に示す。

[0192] [表 6] 表 6 . F I T C標識化 H A修飾物の薬物動態学的パラメ一夕一

分子量 AM (H Z) C 1 BA MRT

(k D a) (¾： NMR) (mL/h r /k g) (%) (h)

23 (iv) 87.0 2.44 ― 86.0 47.3

100 (iv) 92. 5 0. 76 - 91.6 49.3

200 (iv) 93. 5 0.87 91.3 44.7

23 (sc) 87.0 5.40 46.4 83.9 50.8

100 (sc) 92.5 2. 18 37. 2 101.4 56.5

200 (sc) 93.5 3.76 23. 3 98.7 57. fi

580 (iv) 73.0 (HZ) 2.52 一 16. 3 11.2

[0193] 蛍光標識 HA修飾物を用いた薬物動態試験により、非プロトン極性有機溶媒中で合成した本発明の HA修飾物（実施例 5— 2)は HAおよびこれまで報告された HA誘導体 (特許文献 4、 5および 6を参照）と比較して、ラット単回静脈内投与後の血中滞留時間が大幅に改善されることが確認された。また、比較例 5— 1 (分子量 580kDa の HA修飾物（73モル％修飾 (HZ) )のラット単回静脈内投与後の平均血中滞留時間（MRT)は 16時間程度である力これに対しても本発明の HA修飾物は血中滞留性が 5. 5倍程度延長されていることが明ら力となった。 23kDa HA修飾物に関しては、初期段階で血中濃度が減少する傾向が観察され、一部低分子 HA修飾物が腎排泄されて、る可能性が示唆された。 lOOkDaおよび 200kDaの HA修飾物に関しては、血中滞留性に関する特性 (CL、 MRT, tlZ2)はほぼ同様の値となった。しかしながら、分子量依存的に、皮下投与後の BA (Bioavailability)は減少し高分子量の HA修飾物ほど血中への移行がされにくい結果となった。

〔実施例 6〕ヒアルロン酸修飾物（HA— AM— SUC)の修飾率と血中滞留時間との相関

ヒアルロン酸修飾物（HA—AM— SUC)の血中滞留性を修飾率の観点から解析するために、 200kDaの HA力様々な修飾率の HA修飾物を合成し、蛍光色素である FITCを導入したサンプルを調製し、それぞれの血中滞留性を観察した。

(実施例 6— 1) HA— AMの調製

HA(200kDa)—TBAを 4. OmgZmLの濃度で DMSOに溶解した溶液を 5つ調製し、各溶液に HAユニット ZEDOBEA= 1/50 (mol/mol)の当量比で EDOBE Aを添加し、 BOP試薬を HAユニットに対し、 0. 25、 0. 5、 0. 75、 1. 0、または 1. 5 の当量比でそれぞれの溶液に加え、一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の 1M NaCl水溶液をカ卩え、 5N HC1にて pHを 3まで低下させた後、 2N N aOHにて中和を行った。その後大過剰量の蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量（MWCO)： 12k- 14kDa)、限外ろ過後（YM— 10、 Ml LLIPORE社製）、凍結乾燥を行った。アミノ基導入率はプロトン NMR法で定量した。 NMRチャートを図 16に示す。（HA:N—ァセチル基のメチルプロトン、 1. 8〜1. 9 ppm、 AM :EDOBEA部分のメチレンプロトン、 2. 9〜3. lppm)それぞれ導入率は BOP試薬比率 0. 25 : 20. 0モル⁰ /₀、 0. 5 : 36. 5モル⁰ /₀、 0. 75 : 54. 5モル⁰ /₀、 1. 0 : 69. 0モル⁰ /₀、 1. 5 : 90. 5モル⁰ /₀であった。

(実施例 6— 2)蛍光標識 HA修飾物の合成

上記（実施例 6— 1)で得られた HA— AMのそれぞれを、蒸留水（ミリ Q水）で 20. 0 mgZmLの濃度に溶解し、これに 0. 2M炭酸緩衝液 (pH9. 0)をカ卩ぇ濃度を 10. Om gZmLとした。これらの溶液に HAのユニット（1ユニット =繰り返し単位である N—ァセチルダルコサミン一グルクロン酸）に対して 0. 07モル倍（69%および 90. 5%アミン修飾 HAの溶液）、 0. 175モル倍（54. 5%ァミン修飾 HAの溶液）、 0. 28モル倍（ 36. 5%ァミン修飾 HAの溶液）および 0. 63モル倍（20. 0%ァミン修飾 HAの溶液）のフルォレセインイソチオシァネートを HA— AM溶液の 1 Z 10容量の DMSO溶液として加え、室温で 1時間撹拌した。その後、 HAのユニット（1ユニット =繰り返し単位である N ァセチルダルコサミングルクロン酸）に対して 40モル倍の無水コハク酸を HA—AM溶液の 1Z10容量の DMSO溶液として加え、室温でさらに 30分間撹拌した。 20%ァミン修飾物は大過剰量 DMSOへ透析を行った後、またその他のサンプルは直接、大過剰量の 25%EtOH水溶液に対して透析し (スぺクトラポア 4、分画分子量（MWCO) : 12k— 14kDa)、その後、 0. 5M NaCl水溶液に対して透析精製した。透析外液を蒸留水 (ミリ Q水）に置換してさらに透析精製し、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識 HA— AM— SUCを得た。

[0194] ここで得られた各蛍光標識 HA— AM— SUCを 0. 25mgZmL濃度で 50mM炭酸緩衝液 (PH9. 0)に溶解し、その溶液の 494nmにおける吸光度カゝら FITC濃度を定量し、以下の式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、 H A修飾物中の HA由来の重量分率算出を行った。

[0195] 未修飾 HAユニット： X μ mol/mL

HA— AM— SUCユニット： y molZmL (AMが無水コハク酸処理されたュ- ット）

と定義し、以下の式より算出した。

[0196] [化 11] 式 1 ： (401.3 X x) I (631.58 X y) + (544.97 X (残存 AM cone.)) + (898.9 X (FiTC cone.)) = 250 mg

式 2 : x / (y + (残存 AM cone.) + (FITC cone.)) = (100-AM(¾)) I AM(¾)

[0197] なお、式中 FITC cone.とは FITC基を有するユニットのモル濃度を意味する。得られた結果を表 7にまとめた。

[0198] [表 7] 表 7. 薬物動態君纖用 F I TC標識 HA— AM— SUC

EOP比率残存 HA-AM-F I TC HA - AM— SUC 未膽 HA

(BOFモル/ AM {%) AM {%) ユニットユニット HA HAュニッ卜モル） NMR TNBS (モル (モル％) (モル％) (重量％)

0.25 20.0 1.6 0,3 18.1 80.0 87.2

0.50 36.5 2.4 0.9 33.2 63.5 81.7

0.75 54.5 2.4 1.6 50.5 46.5 75.6

1.00 69.0 一 ( 68.4 31.0 68.2

1.50 SO.5 0.9 89.fi 9.5 62.8

-：定量限界以下

[0199] (実施例 6— 3)血中滞留時間評価

HA投与ラッ rfn.瓛サンプル

実施例 6— 2の蛍光標識 HA修飾物を lOmgZkgの用量でラット静脈内に単回投与し、投与前および投与後 0. 5、 2 4、 8、 24, 48, 72, 96,および 168時間で採血 (へパリン処理)し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで 20 °C以下で凍結保存した。

[0200] 沏 I 法

96穴プレートに検量線用標準試料および測定用試料を分注しマイクロプレートリーダーを用いて分析を行った。以下に条件を示す。

[0201] マイクロプレートリーダー： SPECTRA MAX GEMINI (Molecular Device s社製）

Sample volume： 100 μ L/ well

Detection： Fluorescence (EX： 485nm， EM： 538nm)

測定試料の調製

•検量線用試料；各蛍光標識 HA修飾物を PBS (pH7. 4)を用いて希釈し、 1、 5、 10、 50、 100、 50 0 μ gZmLおよび 0 μ g/mL (対照、 PBS (pH7. 4) )の標準液を調製した。この標準液に等容量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。

•測定用試料の調製；

HA修飾物投与ラット血漿サンプルに等容量の PBS (pH7. 4)を添加して測定用試料を調製した。

•血漿中の HA修飾物濃度の算出；

解析ソフト SOFTmax PRO (Molecular Devices社製）を用いて各標準試料の蛍光強度から得られた検量線より血漿中の HA修飾物濃度を算出した。

[0202] データ

実施例 6— 2の蛍光標識 HA修飾物の蛍光標識 HA修飾物の血中濃度推移のデータについて、 WinNonlin Ver 4. 0. 1 (Pharsight社製）で薬物動態学的パラメ一ターを算出した。各個体の血漿中濃度推移にっヽてモデル非依存的解析を行 L、、平均血中滞留時間 (MRT)を算出した。半減期 (tlZ2)は各個体の測定可能な最終 3点のデータを用いて算出した。蛍光標識 HA修飾物の血中濃度推移を図 17に示し、 AM導入率と MRTの関係を図 18に示す。また、算出した薬物動態学的パラメ一ターを表 8に示す。

[0203] [表 8] 表 8 . F I T C標識化 HA修飾物の薬物動態学的パラメ一夕一

AM (%：匪 R) C 1 (mL/h r Zk g) MR T (h) t 1 / 2

20.0 16. 37 2.81 1.95

36. 5 12. 96 2.90 1. 62

54. 5 10.47 4.26 2.76

69.0 1.20 49. 6 36. 7

90.5 0.97 60.6 44. 5 図 18に示される AMの修飾率と MRTとの関係から、修飾率が 50%の後半から急激に MRTの増加すなわち血中滞留性の延長が起こることが示唆された。すなわち修飾率が 55モル⁰ /₀以上、好ましくは 65モル％以上、さらに好ましくは 69モル％以上の場合、 18時間以上の MRTを有する血中滞留時間の面において好ましい HA修飾物が得られる可能性が高、結果となった。

[0205] 酵素耐性を獲得した HA修飾物は、 CD44への認識も大きく低下してヽるため長期間の血中滞留性が得られるものと考えられる。

〔実施例 7〕様々な化合物で修飾したヒアルロン酸修飾物の血中滞留時間

ヒアルロン酸修飾物（HA— AM— SUC)の血中滞留性における修飾の影響を解祈するために、 200kDaの HAを様々なジァミンィ匕合物で修飾し、さらに蛍光色素である FITCを導入した HA修飾物のサンプルを調製し、それぞれの血中滞留性を観

¾πίした。

(実施例 7— 1)蛍光標識 ΗΑ修飾物の合成

実施例 4— 2および 4— 3— 1で得られた HA—DETA、 HA—DAHP、 HA -DA Pを蒸留水（ミリ Q水）に溶解して 20. OmgZmLの溶液を調製し、これに 0. 2M炭酸緩衝液 (PH9. 0)をカ卩え、濃度を 10. Omg/mLとした。この溶液に HAのユニットに対して 0. 07モル倍のフルォレセインイソチオシァネートを H A修飾物溶液の 1 Z 10 容量の DMSO溶液としてカ卩えて室温で 1時間撹拌した。その後、 HAのユニットに対して 40モル倍の無水コハク酸を HA— AM溶液の 1Z10容量の DMSO溶液として加えて室温で 30分間撹拌した。各サンプルは大過剰量の 0. 5M NaCl水溶液に対して透析精製した後、透析外液を蒸留水 (ミリ Q水）に置換してさらに透析精製を行つた。（スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO) : 12k— 14kDa)得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識 HA修飾物を得た。

[0206] ここで得られた各蛍光標識 HA— AM— SUCの濃度 0. 25mgZmLでの 494nm における吸光度から FITC濃度を定量し、以下の式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、 HA修飾物中の HA由来の重量分率算出を行った未修飾 H Aユニット： X μ mol/mL

HA— AM— SUCユニット： y molZmL (AMが無水コハク酸処理されたユニット )

HA— AM— SUCユニット分子量： M g/mol

1

HA— AM— FITCユニット分子量： M g/mol と定義し以下の式より算出を行った。

[0207] [化 12] 式 1 ： (401.3 X x) + CM, X y) + (M_z X (FITC cone.)) = 250 mg

式 2 ： x / (y + (FITC cone.)) = (100-AM(¾)) / AM(¾)

[0208] なお、式中 FITC cone.とは FITC基を有するユニットのモル濃度を意味する。また、 DETA: M =586. 5、 M =853. 9、 DAHP: M =573. 5、 M =840. 8、

1 2 1 2

DAP: M =557. 5、 M =824. 8で算出を行った。

1 2

[0209] 得られた結果を表 9にまとめた。

[0210] [表 9] 表 9. 薬物動態試験用 F I T C標識 H A修飾物

HA-AM-F I TC HA— AM— SUC 未修飾 HA

導入化合物 AM (%) ユニットユニットユニット HA

AM NMR (モル?!;） (モル％) (モル％) (s量？;;）

DETA 89.8 0.9 88.9 10.2 67.4

DAP 93.2 0.9 92.3 6.8 70.0

DAHP 99.0 0.8 98.2 1.0 66.9

[0211] (実施例 7— 2)血中滞留時間評価

HA投与ラット血漿サンプル

実施例 7—1の蛍光標識 HA修飾物を lOmgZkgの用量でラット静脈内に単回投与し、投与前および投与後 0. 5、 2 4、 8、 24、 48、 72、 96および 168時間で採血（へパリン処理)し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで 20°C 以下で凍結保存した。

[0212] 沏 I 法

[0213] マイクロプレートリーダー： SPECTRA MAX GEMINI (Molecular Devices 社製）

Sample volume： 100 μ L/ well Detection： Fluorescence (EX： 485nm, EM： 538nm)

測定試料の調製

'検量線用試料；

各蛍光標識 HA修飾物を PBS (pH7.4)を用いて希釈し、 1、 5、 10、 50、 100、 50 0 μ gZmLおよび 0 μ g/mL (対照、 PBS (pH7.4) )の標準液を調製した。この標準液に等容量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。

•測定用試料の調製；

HA修飾物投与ラット血漿サンプルに等容量の PBS (pH7.4)を添加して測定用試料を調製した。

•血漿中の HA修飾物濃度の算出；

[0214] ¾1 データ

実施例 7— 1の蛍光標識 HA修飾物の蛍光標識 HA修飾物の血中濃度推移のデータについて、 WinNonlin Ver 4.0. 1 (Pharsight社製）で薬物動態学的パラメ一ターを算出した。各個体の血漿中濃度推移についてモデル非依存的解析を行い、平均血中滞留時間 (MRT)を算出した。半減期 (tlZ2)は各個体の測定可能な最終 3点のデータを用いて算出した。蛍光標識 HA修飾物の血中濃度推移を図 19に示した。また、算出した薬物動態学的パラメーターを表 10に示す。

[0215] [表 10] 表 10■ F I TC標識化 H A修飾物の薬物動態学的パラメ—ター

導入化合物 C 1 (mL/h r/kg) MRT (h) t 1/2 (AM)

DETA 2. 5 45. 0 51. 5 DAP 1. 3 34. 8 24. 5 DAHP 1. 1 62. 8 50， 1

[0216] 実施例 5に示されるヒアルロン酸誘導体の修飾と同様に MRTの増加すなわち血中滞留性の延長が起こることが示唆された。様々なァミノ基含有化合物での修飾に関しても同様に 18時間以上の MRTを有しており、用途により導入するァミノ基含有ィ匕合物を変化させることが可能であることが明ら力となった。〔実施例 8〕メタクリロイル基を導入した HA修飾物の合成

ゲル調製用の基材としてメタクリロイル基を有する HA修飾物の合成を行った。 (実施例 8— 1) HA— AEMAの合成

分子量 200kDaのヒアルロン酸ナトリウム (HA;電気化学工業株式会社製)をテトラブチルノヽイド口オキサイド（シグマ—アルドリッチ社製)でテトラブチルアンモ -ゥム (T BA)塩化した DOWEX 50WX8 - 400 (シグマアルドリッチ社製）を用ヽて TBA 塩ィ匕し、得られたテトラプチルアンモ -ゥム塩化ヒアルロン酸（HA—TBA)を 2. Omg ZmL濃度となるよう DMSO (和光純薬株式会社製）に溶解した溶液を 2つ調製した。 HAユニット ZBOP (和光純薬株式会社製） Zアミノエチルメタタリレート (AEMA；シグマ—アルドリッチ社製） =1Z2. 5Z50 (molZmolZmol)の当量比および 1Z 0. 5/50 (mol/mol/mol)の当量比で AEMA、 BOPの順でそれぞれの溶液に添加し、室温下で一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の 1M NaC 1水溶液をカ卩えた後、 5N HC1をカ卩えて pHを 3まで低下させ、さらに 2N NaOHにて中和を行った。大過剰量の 0. 3M NaCl水溶液、続いて蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製 (スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO) : 12k— 14kDa)した後、凍結乾燥して標題のメタクリロイル基が導入されたヒアルロン酸 (HA— AEMA)を得た。

[0217] 得られた HA— AEMA中の AEMA導入率をプロトン NMR法で定量したところ、それぞれ、 56. 5% (BOP : 2. 5倍当量）、 38. 0% (BOP : 0. 5倍当量）が AEMAィ匕されていた（HAおよび HA— AEMAの N ァセチル基、（1. 9〜2. lppm) (3H)、H A— AEMAのメタクリロイル基由来部分、 5. 5〜6. lppm (各 2H)を比較、図 20を参照)。

[0218] (実施例 8— 2) HA— APMAの合成

AEMAの代わりにァミノプロピルメタクリルアミド（APMA;ポリサイエンス社製）を用い、 HAユニット ZBOP (和光純薬株式会社製） ZAPMA=lZ2. 0/5 (mol/mo lZmol)の当量比で反応させた。それ以外は実施例 8— 1と同様の方法で HA— AP MAを得た。 [0219] 得られた HA— APMA中の APMA導入率をプロトン NMR法で定量したところ、 47 . 5%が APMA化されていた（HAおよび HA— APMAの N—ァセチル基、（1. 9〜 2. lppm) (3H)、 HA— APMAのメタクリロイル基由来部分、 5. 2〜5. 8ppm (各 2 H)を比較、図 21を参照)。

〔実施例 9〕 BOP添加量によるメタクリロイル基導入制御

メタクリロイル基の導入率の制御を行うために、様々な比率で縮合剤を添加し合成を行い、導入率の解析を行った。

[0220] HA(200kDa)— TBAを 5. OmgZmL (AEMA用）もしくは 4. Omg/mL (APM A用）で DMSOに溶解した溶液を調製し、 HAユニット ZAEMA (ポリサイエンス社製)もしくは APMA (ポリサイエンス社製） = 1/5 (mol/mol)の当量比で AEMAもしく ίま APMAを添カロし、 BOP試薬を HAユニットに対し、 0. 2、 0. 25、 0. 4、また ίま 1 . 0の当量比で添加し一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の 1M NaCl水溶液を加え、 5N HC1にて pHを 3まで低下させた後、 2N NaOHにて中和を行った。その後、大過剰の 0. 3M NaCl水溶液、続いて蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO)： 12k- 14kDa)、凍結乾燥を行った。

[0221] メタクリロイル基導入率をプロトン NMR法で定量した (HA： N—ァセチル基のメチルプロ卜ン、 1. 8〜1. 9ppm、 MA:メタク!;ロイル基由来、 5. 5〜6. lppm (AEMA) 、 5. 2〜5. 8ppm(APMA) )。プロトン NMRデータを図 22に示す。メタクリロイル基導入率を表 11に示す。メタクリロイル基の導入率は BOPの仕込みで制御可能であることが分力つた。

[0222] [表 11] 表 1 1 . B O Pの添、加量とメ夕クリロイル基の導入率の関係

導入率 (%)

置換基 HA ：縮合剤

( MR)

A E MA 100 . 20 9. 7

100 ： 25 11. 0

100 ： 40 19. 0

100： 100 48. 0

A PMA 100 ： 20 9. 0

100 ： 40 12. 0

100： 100 45. 0

[0223] 〔実施例 10〕蛍光標識 HA— HZ合成

ゲル内封サンプルとして使用するために、蛍光標識ィ匕した HA—HZの合成を行つた。

(実施例 10— 1) HA— HZの合成

分子量 200kDaのヒアルロン酸 (HA;電気化学工業株式会社製)を 0. 5%濃度で蒸留水（ミリ Q水）に溶解し、 5N塩酸で pHを 4. 7〜4. 8に調整した。 1—ェチル— 3 一（3—ジメチルァミノプロピル）カルボジイミド（EDC)とアジピン酸ジヒドラジド (ADH )を、

lZO. 05Z40(molZmolZmol)のモル比になるよう添加し、 5N塩酸で pHを 4. 7〜4. 8に保ちながら室温で攪拌下 2時間反応させた。 lOOmM塩化ナトリウム溶液、 25%エタノール水溶液、続いて蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO) : 12k— 14kDa)、凍結乾燥してヒドラジドが導入されたヒアルロン酸 (HA— HZ)を得た。

[0224] 得られた HA— HZ中の HZ導入率をプロトン NMR法で定量したところ、それぞれ、 HAのカルボン酸の 3. 75%が HZ化されて!/、た（HAおよび HA— HZの N—ァセチル基、 2. lppm (3H)、 HA— HZのアジピン酸由来部分のメチレン基、 1. 7ppm、 2 . 4ppm (各 2H)を比較)。

(実施例 10— 2) HA— HZの蛍光標識ィ匕

上記（実施例 10— 1)で得られた HA—HZを蒸留水（ミリ Q水）で 20. OmgZmLの濃度に溶解し、これに 0. 25M炭酸緩衝液 (pH9. 0、4. 84mL)および 101. 3mg/ mLの FITCの DMSO溶液（2. 42mL)をカ卩えて遮光下、室温で 1時間、穏やかに振とうした。その後、大過剰量の PBSに対して透析精製した。透析外液を蒸留水 (ミリ Q 水）に置換してさらに透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO)： 12k- 1 4kDa)、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識 HA— HZ (227. 63mg)を得た。〔実施例 11〕蛍光標識 HA— HZ封入 HA— AEMA架橋ゲル調製

メタクリロイル基を導入した HA修飾物を用い、メタクリロイル基とメルカプト基とのマィケル付加反応を利用し、蛍光標識した HA— HZを内封したバルタ状のゲルを作成し、その徐放性の評価を行った。

[0225] 実施例 8— 1で得られた AEMAの導入率が 56. 5%である HA— AEMA 3. 97m gと、実施例 10— 2で得られた蛍光標識 HA— HZ (107 /z g)を蒸留水（ミリ Q水、 60 /z L)に溶かした。これにトリエタノールァミン (TEA、 1. 3 L)、ジチオトレイトール（ DTT)溶液（9. 25mg/mL 200mMリン酸緩衝液（pH8. 3)、 40 /z L)を加えた。遮光下、 37°Cで 1時間反応させるとゲルになった。

[0226] また、 BOP試薬を HAユニットに対し 0. 4の当量比で添カ卩しー晚反応させた以外は実施例 9と同様に合成した導入率 18. 8%の HA— AEMA (3. 92mg)と、実施例 5 2で得られた蛍光標識 HA— AM— SUC (410 g)を蒸留水（ミリ Q水、 60 μ L)に溶かした。これにジチオトレイトール（DTT)溶液（9. 25mg/mL 200mMリン酸緩衝液 (_PH8. 3)、 40 L)を加えた。遮光下、 37°Cで 1時間反応させるとゲルになつた（HA— AEMA4%gel)。ここで、 HA— AEMA4%gelとは、水分量 100 /z Lにつき 4mgの HA-AEMAが含まれているゲルであることを意味する。

(比較例 11 - 1)比較対照用のゲル基材合成 (HA-HZ-SH)およびゲル調製実施例 10— 1と同様の方法で H Aュ-ット ZEDCZ ADH = 1/0. 2/40 (mol/ molZmol)のモル比合成した HZの導入率が 26. 0%の HA—HZ (369. 81mg)を蒸留水（ミリ Q水）で 20. OmgZmLの濃度に溶解し、 2—イミノチオラン塩酸塩 (ITL; ピアス社製）を HZZITL= 1/2モル比になるよう 200mMリン酸緩衝液 (pH8. 3)に溶解、添加し、室温で攪拌下 2時間反応させた。エタノールで沈殿、 3回洗浄し、乾燥させメルカプト基が導入されたヒァルロン酸（11八ー112— 311、 321. 68mg)を得た。得られた HA— HZ— SH中の SH基導入率をプロトン NMR法で定量した結果、 H Aの力ノレボン酸の 22. 0%が SHィ匕されていた。（HAおよび HA— HZ— SHの N—ァセチル基（1. 9ppm、 3H)、 HA— HZ— SHの ITL由来部分のメチレン基（2. lppm と 2. 7ppm、各 2H)を比較）。次に、ここで合成した HA— HZ— SHを 1. 99mg(HA — HZ— SH2%gel)および 4. 08mg(HA— HZ— SH4%gel)と実施例 10— 2の蛍光標識 HA— HZを 98 μ gおよび 105 μ gとを蒸留水（ミリ Q水、 60 μ L)に溶かした。これに四チオン酸ナトリウム二水和物（以下、「STT」とも称す) ZSH = 0. lZlモル比になるように STT^液（200mMリン酸緩衝液 (pH8. 3)、 40 L)を添加し、遮光下、 37°Cで 1時間反応させるとゲルになった。ここで、 HA—HZ— SH2%gelとは、水分量 100 /z Lにっき 2mgの HA—HZ— SHが含まれているゲルであることを意味する。 HA— HZ— SH4%gelとは、 HA— HZ— SH2%gelにおける HA— HZ— SH 力 S4mgであることを意味する。

(比較例 11— 2)比較対照用のゲル基材合成 (HA -HZ- MA)とゲル調製

HA/EDC/ADH= 1/5/40 (mol/mol/mol)のモル比にした以外は実施例 10— 1と同様に合成し、 HAのカルボン酸が 63%HZ化した HA— HZを得た。次に得られた HA— HZ (207. 46mg)を蒸留水（ミリ Q水、 9mL)に溶解した後に、 1M リン酸緩衝液 (PH8. 8)を添カ卩し、 HA濃度 20mg/mLに調整した。メタクリル酸無水物を HZの 20倍当量を滴下して添加し、室温で 4時間反応させた。テトラヒドロフランで沈殿後、回収し乾燥させた。沈殿物を蒸留水（ミリ Q水）に溶解し、再びテトラヒド口フランで沈殿、乾燥させた後、乾燥物を蒸留水 (ミリ Q水）に溶解し、凍結乾燥して HA-HZ- MAを得た。得られた HA— HZ— MA中の MA基導入率をプロトン NM R法で定量した結果、 HAのカルボン酸の 17. 0%が MA化されていた（HA:N—ァセチル基のメチルプロトン（1. 8〜1. 9ppm)、 MA:メタクリロイル基の CH = (5. 5

2

〜6. lppm)を比較）。次に、ここで合成した HA— HZ— MAを 4. 07mg(HA— HZ — MA4%gel)と実施例 10— 2で得られた蛍光標識 HA— HZを 99 μ gとを蒸留水（ミリ Q水、 60 L)に溶力した。これにトリエタノールァミン (TEA、 1. 3 L)と DTT溶液 (2. 71mgZml200mMリン酸緩衝液（pH8. 3)、 40 /z L)を加えた。遮光下、 37°C でー晚反応させるとゲルになった。 [0227] (試験例 2) HA— AEMA架橋ゲルからの蛍光標識 HA— HZ徐放性能評価実施例 11、比較例 11— 1および比較例 11— 2で得られたゲルを lmLの PBS中、 3 7°Cでインキュベートし、経時的に全量サンプリングした。 GPCでバッファ一中に放出された蛍光標識 HA— HZを定量した。 GPCの測定条件は下記に示す。ゲル中に封入した蛍光標識 HA—HZを 100%とした時のゲルからの蛍光標識 HA—HZ放出性を図 23に示す。なお、比較例 11—1および比較例 11— 2で得られたゲルは 5週間後までサンプリングし、実施例 11で得られた HA— AEMAゲルにつ!、てはおよそ 10週間後にヒアルロニダーゼを 0. 25Uを添加し分解さ全ての内封物を放出させた。

[0228] GPC Column : TSKgel G6000PW (TOSOH社製）

XL

Mobile phase： PBS (pH7. 4)

Elution mode : Isocratic

Flow rate : lmL/ min

Injection volume : 25 μ L·

Detection： UV (494nm)

図 23より HA— AEMAから作成したゲルは AEMAの導入率に関わらず、放出挙動は大きく変化せず、反応する官能基は 18. 8%程度でも同様の放出プロファイルを取り、十分長期の徐放が可能であることが示唆された。また、本発明の HA— AEMA 力作製したゲルはジスルフイド形成によるゲル (比較例 1 1 - 1)に比べて非常に長期間の徐放が可能であることが明らかとなった。また、メタクリル酸を直接アミド結合で導入した HA— HZ— MA (比較例 11 2)と比較しても同様に長期間の徐放が可能となった。メタクリロイル基の結合様式に起因する反応性の違、や修飾官能基の均一性等による結果と考えられ、エステルによるメタクリル酸の結合様式を有する AEMA の HA修飾物を用いることにより、より長期の徐放が可能なゲルの調製が可能になつた。

〔実施例 12〕スプレードライヤーによる蛍光標識 HA— HZ封入 HA— AEMA架橋ゲル微粒子調製

HA— AEMAを用い、スプレードライヤーを用いて注射可能なマイクロゲルの調製を調製を行った。 [0229] 実施例 9および実施例 8—1で得られた AEMA基の導入率が 11モル⁰ /₀、 19モル %、 38モル⁰ /₀である HA— AEMAのそれぞれ 50mgと、実施例 10— 2で得られた蛍光標識 HA— HZ5mgを蒸留水（ミリ Q水、 5mL)に溶かした（一晩）。これに DTTを A EMA/SH= 1/1モル比になるように DTT^液（200mMリン酸緩衝液 (pH8. 3) 250 /z L)を添加し、以下の条件でスプレードライし、微粒子を得た。得られた微粒子の粒子径は 1〜3 /ζ πιであった。各試料の粒子をプレパラート上に置き、乾燥状態および PBS (pH7. 4)を添加して膨潤させた状態を顕微鏡で観察した。顕微鏡写真を図 24に示す。 PBSを添カ卩した際に AEMA基の導入率が 11モル％、 19モル％の微粒子は溶解した。これらの微粒子は、 50°C恒温槽 (ャマト科学社製 DN— 42)でキユアリングし、 72時間後にサンプリングした。これらの微粒子をプレパラート上に置き、これに pH7. 4の PBSを添加してその粒子状態を顕微鏡で観察したところ、微粒子は PBSに溶解しなかった。以上の操作により AEMA基の導入率が 11モル％、 19モル %、 38モル％の蛍光標識 HA— HZ封入 HA— AEMA架橋ゲル微粒子が得られた（図 24を参照)。

[0230] スプレードライ条件

スプレードライヤー：ビュッヒ社製、ミニスプレードライヤー B—191

Solution feed rate : 0. 5mL/mm (Tygon tuoe, Pump speed= 15%)

Feed solution cone. ： 10mg/ mL

Atomizing air flow rate : 650L/hr

Drying air flow rate： 40kL/ hr (Aspiration speed= 100%)

Inlet temp. : 90°C

Outlet temp. : 55〜65。C

〔実施例 13〕凍結粉砕による蛍光標識 HA— AM封入 HA— AEMA架橋ゲル微粒子調製

HA— AEMAを用い、凍結粉砕法により注射可能なマイクロゲルの調製を行った。

[0231] 実施例 9で得られた AEMA基の導入率が 19モル％である HA— AEMA 4mgと、実施例 5— 2で得られた蛍光標識 HA— AM— SUC 0. 4mgを蒸留水（ミリ Q水、 50 μ L)に溶かした（一晩）。これに AEMAZSH= lZlモル比になるように DTT溶液（ 200mMリン酸緩衝液 (pH8. 3)、 50 L)を添カ卩し、遮光下、 37°Cで 1時間反応させるとゲルになった。このゲルを 37°C恒温槽（ャマト科学社製 Incubator IS42)で乾燥させ、蛍光標識 HA— AM— SUC封入 HA— AEMA架橋乾燥ゲル (以下、「乾燥ゲル」とも称す）が得られた。更にここで得られた乾燥ゲルを液体窒素で凍結、 SK ミル（トッケン製 SK— 100)で粉砕を繰り返した。以上の操作により蛍光標識 HA— AM— SUC封入 HA— AEMA架橋凍結粉砕ゲル微粒子（以下、「凍結粉砕ゲル」とも称す)が得られた。各試料の粒子をプレパラート上に置き、乾燥状態を顕微鏡で観察した。顕微鏡写真を図 25に示す。得られた凍結粉砕ゲルの粒子径は 2〜6 mでめつに。

(試験例 3) HA— AEMA架橋ゲル力ゝらの蛍光標識 HA— AM徐放性能評価実施例 13で得られた乾燥ゲルおよび凍結粉砕ゲルを lmLの PBS中、 37°Cでインキュペートし、経時的に 200 Lサンプリングを行った。 GPCでバッファ一中に放出された蛍光標識 HA— AM— SUCを定量した。 GPCの測定条件は試験例 2と同様である。ゲル中に封入した蛍光標識 HA— AM— SUCを 100%とした時のゲルからの蛍光標識 HA— AM— SUC放出'性を図 26に示す。

図 26より本発明の乾燥ゲルは、長期間の徐放が可能であることが明ら力となった。また、凍結粉砕ゲルは、乾燥ゲルに比べ、微粒子化による表面積の増大により初期バーストが大きくなる傾向が見られるものの、充分に長期間の徐放が可能であることが明ら力となり、注射可能な微粒子で長期の徐放が可能なマイクロゲルの調製が可能であることが明ら力となった。

〔実施例 14〕水溶性 HA修飾物— Fabコンジュゲートおよび Fabの調製

(実施例 14— 1) IgG Fabの調製

リン酸緩衝液に溶解された IgG溶液（54. Omg/mL, 0. 85mL)に PBS (1. 445 mL)をカ卩えて希釈した。この液の 0. 5mLについて、 IgG Fab調製キット（Immuno Pure (登録商標） Fab Preparation kit、消化酵素として Papainを含む、 PIERC E (ピアス)社製）に供し、添付文書記載の通り操作して、 Protein Aカラム (調製キットに含有）による非吸着画分を得た。なお、 Papainによる消化は 37°Cで 15時間行つた。得られた溶液を遠心式限外ろ過器 (Amicon Ultra— 4、アミコン製)を用いて濃縮後、 PBSで再希釈し、最終的に約 1. 5mLとした。また、 IgG Fab調製キットによる操作力も濃縮までの操作は同一条件で計 4回行った。 4回の調製で得られた液を混合して、約 11. 8mgの IgG Fab (以下、「Fab」とも称す） (1. 96mg/mL, 6. OmL )を得た。なお、 Fabの濃度定量は紫外可視吸光度測定法により決定した。

(実施例 14 2) Fabの FITC標識

実施例 14— 1で得られた Fab PBS溶液（1. 96mg/mL, 6. OmL)のうちの 5mL を脱塩カラム（PD— 10、アマシャムバイオサイエンス株式会社製）で 150mM NaCl および 10mM EDTA含有 50mM 炭酸緩衝液（ρΗ9. 5、以下「FITCバッファー」とも称す） (7mL)に溶媒置換した。遠心式限外濾過（Centricon— 30、アミコン製）で約 5mLに濃縮し、このうちの 4. 78mLに、 FITC濃度が 2mgZmLである 1%DM SO含有 FITCバッファー溶液（342 L)をカ卩えて室温、遮光下に 2時間反応させた。反応溶液を 4°C、遮光下に 1Lの PBSに対して透析精製（Slide— A— Lyzer MW CO : 10000、ピアス社製)した。透析外液は 2、 4、 6、 15時間後に全量交換し、更に室温、遮光下に 2時間透析した後に FITC標識 Fab溶液を回収した。脱塩カラムで FI TCバッファーに溶媒置換し、遠心式限外濾過（Centricon— 30)で約 4. 5mLに濃縮して、 FITC標識 Fabの FITCバッファー溶液とした。

(実施例 14— 3) ファーマコカイネテイクス (PK)試験用 FITC標識 Fab溶液の調製実施例 14 2で得られた FITC標識 Fabの FITCバッファー溶液約 4. 5mLのうちの約 1. 75mLを脱塩カラム（PD— 10)で PBS (3. 5mL)に溶媒置換した。遠心式限外濾過（Centricon— 30)で約 0. 5mLまで濃縮して、 PK試験用 FITC標識 Fab溶液を得た。得られた溶液から 2. 取り PBSで 40倍希釈して 280および 495nmの吸光度を測定した。以下の 2つの式で Fab濃度および FITCZFab比を算出したところ、 Fab : 5. 97mg/mL, FITC/Fab： 3. 24 (molZmol)であった。

[化 13] 式 1： Fab (mg/mL) = { (Abs. at 280 nm) - 0. 35 x (Abs. at 495 nm) } I 1- 48

式 2： FITC /Fab (mol/mol) = 1.01 x (Abs. at 495 nm) I { (Abs. at 280 nm) - (0. 35

X (Abs. at 495 nm)) } [0234] (実施例 14— 4) メルカプト基を導入した FITC標識 Fab (FITC標識 Fab— SH)の調製

実施例 14一 2で得られた FITC標識 Fab溶液約 4. 5mLのうちの 2. 75mLに 2—ィミノチオラン塩酸塩（2— Iminothiolane · HC1； ITL；ピアス社製） FITCバッファー溶液（2mgZmL、 283 /z L)を加え、室温、遮光下に 30分間反応させた。脱塩カラム（ PD— 10)で未反応低分子量成分を除去するとともに ImM EDTA含有 PBSに溶媒置換した。得られた溶液を遠心式限外濾過（Centricon— 30)で約 1. 2mLに濃縮して、 FITC標識 Fab— SH溶液とした。得られた FITC標識 Fab— SH溶液から 2. 取り、 PBSで 40倍希釈して 280および 495nmの吸光度を測定した。実施例 14 3と同様に Fab— SH濃度および FITC/Fab— SH比を算出したところ、 Fab— S H : l. 05mgZmL、 FITC/Fab -SH : 3. 20(molZmol)であった。また、得られた液から 15 μ L取り、 Ellman試薬でメルカプト基を定量した。メルカプト基および Fa b— SH濃度からメルカプト基導入率を算出したところ、メルカプト基 ZFab SH : 1. 97 (mol/mol)であった。以下に Ellman試薬によるメルカプト基の定量法を示す。

[0235] エルマン (Ellman)試蓉を用いたメルカプト某の定量方法

C試薬]

反応溶媒： ImM EDTA含有 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH8. 0)

エルマン試薬溶液:エルマン試薬 40mg/mL DMSO溶液を反応溶媒で 10倍希釈

[標準物質]

システィン塩酸塩一水和物（以下、「Cys」とも称す)を反応溶媒に溶カゝして 10. 54 mg/mL (60mM)に調製した。

[0236] この液 100 μ Lを反応溶媒で 10倍希釈し、さらに希釈された液 200 μ Lを反応溶媒で 5倍希釈した（終濃度 Cys 1. 2mM)。

[0237] Cys 1. 2mM溶液から 2倍希釈列を調製した (濃度 8点： 0. 0094-1. 2mM)。

[定量]

反応溶媒 150 Lにエルマン試薬溶液 3 μ Lをカ卩えた。エルマン試薬を含む反応溶媒に標準物質あるいは試料溶液 15 Lを加えて撹拌混和した。室温で 15分間静置した後に 412nmにおける吸光度を測定した。標準物質の測定値力も検量線を作成し、試料溶液中のメルカプト基を定量した。

(実施例 14— 5) HA— AM— MlZSUCの調製

BOP試薬を HAユニットに対し 2. 5とした以外は実施例 3— 1と同様にして得た HA AM (EDOBEA導入率： 95. 5%)水溶液（lOmgZmLゝ 8. 5mL)〖こ 0. 2Mリン酸緩衝液（PH7. 0、 10. 625mL)を加えた。 N— [ κ マレイミドウンデカノィルォキシ]—スノレホスクシンイミドエステノレ (Ν— [ κ— Maleimidoundecanoyloxy]— sul fosuccinimide ester; Sulfo— KMUS；ピアス社製）の DMSO溶液（1. 074mg/ mL、 2. 125mL)をカ卩え、室温で 30分間振とうした。無水コハク酸 DMSO溶液（283 . 95mgZmL、 2. 125mL)をカ卩えて更に室温で 1. 5時間振とうした。 4°Cで大過剰量の蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、 MWCO : 12k- 14kDa )、得られた溶液を凍結乾燥して HA— AM— MlZSUC (98. 15mg)を得た。

(実施例 14— 6) PK試験用 HA— FITC標識 Fabコンジュゲート溶液の調製実施例 14 5で得られた HA— AM— MlZSUC水溶液（20mgZmL、 2. 2mL) に実施例 14 4で得られた FITC標識 Fab— SH溶液約 1. 2mLのうちの 1. lmLおよび ImM EDTA含有 PBS (1. lmL)をカ卩えて 37°Cで 2時間インキュベートした。ョード酢酸の ImM EDTA含有 PBS溶液（55. 8 ,u g/mL, 1. lmL)をカ卩えて、更に 1時間インキュベートした。反応混合液を下記の条件で GPCに供してコンジユゲート画分を分取した。 GPC条件を下記に示す。分取した溶液に 1Z10容量の 10mMグリシン含有 PBSをカ卩え、遠心式限外濾過（Vivaspin20、 MWCO : 50000、フナコシ株式会社製)で約 3. OmLまで濃縮して、 HA— FITC標識 Fabコンジュゲート溶液とした。得られた HA—FITC標識 Fabコンジュゲート溶液から 10 Lを取り、 PBSで 10 倍希釈して 280および 495nmにおける吸光度を測定した。実施例 14— 4で測定した FITC標識 Fab - SHの（495nmにおける吸光度） / (280nmにおける吸光度）比を用いて Fab濃度を算出したところ、 Fab : l . 05mgZmLであった。

GPC条件

System :FPLCあるいは AKTA explorer (ともに、アマシャムバイオサイエンス株式会社製） GPC Column :HiLoad 16/60 Superdex 200prep grede (；アマシャムノィォサイエンス株式会社製）

Mobile phase： PBS (pH7. 4)

Flow rate： 1. OmL/ mm

Detection :UV (280nm)

〔試験例 4〕ラットに HA— FITC標識 Fabコンジュゲートおよび FITC標識 Fabを単回静脈内投与したときの血漿中濃度推移

雄性ラット（sic： SD、日本エスエルシー (株））に、実施例 14— 6で得られた HA— F ITC標識 Fabコンジュゲート溶液および実施例 14— 3で得られた PK試験用 FITC標識 Fab溶液 (いずれも、 10mMグリシン含有 PBSで希釈して、 Fab濃度 lmgZmLとした）を 3mgZkgで単回尾静脈内投与した (n= 3)。投与 15、 30分、 1、 2、 4、 6、 8 、 24時間後に頸静脈よりへノリン処理した 25G注射針付テルモシリンジを用いて採血した。また、 HA—FITC標識 Fabコンジュゲート投与群に関しては、投与 48、 72、 96および 168時間後にも採血した。採取した血液は直ちに 4°C、 15, OOOrpmで 5分間遠心し、血漿を分離した。

[0238] 血漿試料 50 /z Lに Tween 20 0. 05%含有 PBS50 /Z Lを添加後、溶液の蛍光強度を蛍光検出器にて測定した。また、投与液を用いて標準曲線を作成し、それを基に総蛍光強度に基づく血漿中濃度を算出した。蛍光強度測定後、血漿試料を下記の条件で GPCに供し、総蛍光強度に対する HA— FITC標識 Fabコンジユゲートおよび FITC標識 Fabの蛍光強度の割合を測定した。総蛍光強度に基づく血漿中濃度に上記割合を乗じて血漿中 HA— FITC標識 Fabコンジュゲートおよび FITC標識 Fab濃度を算出した。

[0239] HA— FITC標識 Fabコンジュゲートおよび FITC標識 Fab投与群ともに血漿中濃度は二相性で減少した（図 27)。 FITC標識 Fabの消失相の半減期は 1. 50時間であり、 FITC標識 Fabは素早く循環血より消失したのに対し、 HA— FITC標識 Fabコンジュゲートの半減期は 38. 89時間であり、 HA— FITC標識 Fabコンジュゲートの血中滞留性の大幅な延長が確認された。

GPC条件 System： LC - 10A (島津製作所）ある!/、は Waters 600S (Waters)

蛍光検出器： L 7480(日立製作所)あるいは Waters 474 (Waters)

GPC Column :TSKgel G6000PW (TOSOH社製）

XL

Mobile phase :Tween 20 0. 05%含有 PBS

Flow rate : 0. 5mL/ min

Detection: 490nm励起による 518nmの蛍光強度

〔実施例 15〕水溶性 HA修飾物 GLP— 1コンジュゲートの調製

(実施例 15— 1) HA— AM— MlZSUCの調製

BOP試薬を HAユニットに対し 2. 5の等量比とした以外は実施例 3—1と同様にして得た HA— AM (EDOBEA導入率： 95. 5%)水溶液（10mgZmL、 17. 66mL) に 0. 2Mリン酸緩衝液 (pH7. 0、 22. 075mL)をカ卩えた。 N— [ κ—マレイミドウンデカノィルォキシ]—スルホスクシンイミドエステル (Sulfo-KMUS；ピアス社製）の D MSO溶液（0. 573mgZmL、 4. 415mL)をカ卩え、室温で 30分間振とうした。無水コハク酸 DMSO溶液（283. 95mgZmL、4. 415mL)を加えて、更に室温で 1. 5 時間振とうした。 4°Cで大過剰量の蒸留水 (ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、 MWCO： 12k- 14kDa)、得られた溶液を凍結乾燥して、マレイミド基およびコハク酸が導入されたヒアルロン酸修飾物（以下、「HA— AM— MIZSUCJとも称す、 177. 80mg)を得た。

(実施例 15— 2) HA— GLP— 1変異体コンジュゲート溶液の調製

天然型の GLP— l (Human、 7— 37 ;特表平 7— 504679号公報記載）の 2番目（8 位)のァラニンをグリシンに、 31番目（37位)のグリシンをシスティンに変更した変異体 (以下、「GLP— 1変異体」とも称す)を固相法ペプチド合成法で得た (ペプチド研究所社 (株)製)。 GLP—1変異体の 0. 2Mリン酸緩衝液 (pH7. 0)の溶液 (2. Omg ZmL)にトリス [2—カルボキシェチル]ホスフィン塩酸塩（以下、「TCEP」とも称す）水溶液（20mM)を 1Z20容量カ卩えた。この TCEPを含む GLP— 1変異体溶液（1. 3 263mL)を実施例 15— 1で得た HA— AM— MlZSUC水溶液（20mgZmL、 1. 2 mL)に加え、 37°Cで 2時間インキュベートした。同じ TCEPを含む GLP— 1変異体溶液（1. 3263mL)を再度添カ卩し、同様にインキュベートした。システィン塩酸塩一水和物の 0. 1Mリン酸緩衝液（pH7. 0)の溶液（3. 6mgZmL、0. 3853mL)を加え、更に 37°Cで 1時間インキュベートした。反応混合液を 3回に分けて下記の条件で GP Cに供してコンジユゲート画分を分取した。分取した画分を遠心式限外濾過 (Vivasp in20、 MWCO : 50000、フナコシ株式会社製）で約 4. 85mLまで濃縮して、標題の HA—GLP— 1変異体コンジュゲート溶液を得た。 GLP— 1変異体を使用せずに本実施例と同様の操作を行なって得られた試料を対照として補正に用い、得られた HA — GLP— 1変異体溶液の 280nmにおける吸光度と力ルバゾール—硫酸法で、 GLP 1変異体濃度、 HA— AM— MIZSUC濃度および GLP— 1変異体導入率を算出した。 GLP— 1変異体が 42. 6nmolZmL、 HA— AM— MlZSUCが 3. 54mg/ mL、 GLP— 1変異体が 3. 7ZHA(molZmol)であった。

GPC条件

System： FPLC (アマシャムバイオサイエンス株式会社製）

GPC Column :HiLoad 16/60 Superdex 200prep grede (；アマシャムノィォサイエンス株式会社製）

Mobile phase： PBS (pH7. 4)

Flow rate： 1. OmL/ mm

Detection :UV (280nm)

力ルバゾール法による _HA修飾去

C試薬]

硫酸溶液: Na B O - 10H Oの硫酸溶液（25mM)

2 4 7 2

力ルバゾール溶液：力ルバゾールのエタノール溶液（1. 25mg/mL : 0. 125%)

[標準物質]

N— [ κ—マレイミドウンデカノィルォキシ]—スルホスクシンイミドエステルの DMS O溶液をカ卩えないこと以外は実施例 15— 1と同様にして、 HA— AMに無水コハク酸のみが導入されたヒアルロン酸修飾物（HA—AM— SUC)を調製し、 PBSに溶解して 0. 5mgZmLとした。この 0. 5mgZmLの HA—AM— SUC溶液から 2倍希釈列を調製した (濃度 5点： 0. 03125-0. 5mgZmL)。

[定量] 氷冷した硫酸溶液（lmL)に、 PBS (対照）および標準物質 (各 0. 2mL)、ならびに実施例15— 2で得られた11八ー01^—1変異体コンジュゲート溶液を1¾3で19. 8 倍希釈して得た溶液 (0. 2mL)を加え、混合した。熱水浴中で 25分間加熱した後、流水で室温まで冷却した。それぞれに力ルバゾール溶液 (40 μ L)を加えて混合した。再度熱水浴中で約 30分間加熱した後、流水で室温まで冷却した。 530nmにおける吸光度を測定し、対照および標準物質の吸光度から検量線を作成し，試料溶液に含まれる HA修飾物の濃度を定量した。

〔試験例 5〕HA— GLP— 1変異体コンジュゲートの血中滞留時間評価

HA— GLP— 1変異体コンジュゲート投与ラット血漿サンプル

実施例 15— 2で得られた HA— GLP— 1変異体コンジュゲート溶液を Tween 80 を 0. 05%含有する PBS (pH7. 4 ;以下、「溶媒 Z」とも称す)で希釈し、 50 gZkg の用量でラット静脈内に単回投与し、投与後 1、 4、 8、 24、 48、 72、 96、および 168 時間で採血 (へパリン処理)し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで— 20°C以下で凍結保存した。

GLP - 1 (Active) ELISA KIT(Linco Research, Inc. America;以下、「キッ W」とも称す)の 96穴プレートに検量線用標準試料および測定用試料を分注し、マイク口プレートリーダーを用いて分析を行った。以下に条件を示す。

マイクロプレートリーダー： SPECTRA MAX GEMINI (Molecular Devices 社製）

Detection： Fluorescence (EX： 355nm, EM： 460nm)

測定試料の調製

•検量線用試料；

実施例 15— 2で得られた HA— GLP— 1変異体コンジュゲート溶液を溶媒 Zおよびキット Wに同封された Assay Bufferを用いて希釈し、 12. 8、 6. 4、 3. 2、 1. 6、 0. 8、 0. 4、 0. 2、 0. 1 gZmLおよび 0/z gZmLの標準液を調製した。この標準液に 5 μ Lの正常ラット血漿を添加し、検量線用試料を調製した。

'測定用試料の調製； HA— GLP— 1変異体コンジュゲート投与ラット血漿サンプルに、キット Wに同封された Assay Bufferを添加して測定用試料を調製した。

•血漿中の HA修飾物濃度の算出；

解析ソフト SOFTmax PRO (Molecular Devices社製）を用いて各標準試料の蛍光強度力得られた検量線より血漿中の HA—GLP— 1変異体コンジュゲート濃度を算出した。

，データ

投与した HA— GLP— 1変異体コンジュゲートの血中濃度推移のデータについて、 WinNonlin Ver 4. 0. 1 (Pharsight社製）で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の血漿中濃度推移についてモデル非依存的解析を行い、平均血中滞留時間 (MRT)を算出した。半減期 (tl/2)は各個体の測定可能な最終 3点のデータを用いて算出した。 HA GLP 1変異体コンジュゲートの血中濃度推移を図 28に示す。また、算出した薬物動態学的パラメーターを表 12に示す。

[表 12] 表 1 2 HA—G L P— 1変異体コンジユゲートをラットに静脈内投与したときの薬物動態学的パラメーター

平均値標準偏差

半減期 23. 6 3. 1 (hr)

1 ^一タルクリアランス 1. 8 0. 1 (mL/hr/kg)

平均血中滞留時間 30. 2 4. 3 (hr)

分布容積 53. 4 4. 9 (mLAg) 天然型の GLP— 1および天然型の GLP— 1の 2番目のァラニンをグリシンに変更した変異体を、ヒトおよびブタに静脈内投与したときの半減期力 Sl〜5分であることが報告されている（Current Medicinal Chemistry、第 10卷、第 2471— 2483頁、 2 003年および Diabetologia、第 41卷、第 271— 278頁、 1998年）。図 28および表 1 2から、 HA— GLP—1変異体コンジユゲートをラットに静脈内投与したときの半減期は、 23. 6時間、 MRTは 30. 2時間となり、天然型の GLP— 1などと比較して大幅に血中滞留性の延長が起きたことが示唆された。

〔試験例 5〕経口糖負荷試験 8週齢の雄性 BKS . Cg— + Lepr^dV + Lepr^dbZjclマウス（日本クレア株式会社製)を一晩絶食した後、実施例 15— 2で得られた HA— GLP— 1変異体コンジュゲート溶液を溶媒 Zで希釈したもの（ペプチド量として、 1. 5 g/kg、 15 g/kgまたは 150 gZkg)または溶媒 Zを静脈内投与し、静脈内投与 1分後に 50%グルコース溶液 ( (株）大塚製薬工場)を 3gZkgになるように経口投与した。同様に GLP - 1 (H uman、 7— 37 ;株式会社ペプチド研究所製)を溶媒 Zで希釈したもの（150 gZkg または 1500 gZkg)または溶媒 Zを静脈内投与し、静脈内投与 1分後に 50%ダルコース溶液を 3gZkgになるように経口投与した。

[0243] グルコース投与前（0時間の値とする）、グルコース投与 0. 5、 1、 2、および 4時間後に尾部より血液を採取し、血糖値を酵素法 (へキソキナーゼ法、オートセラ S GLU ( 第一化学薬品 (株）；機器名： BioMajesty JCA— BM1250 (日本電子 (株)）にて測定した。

以下の式より血糖降下率を算出した。

[0244] [化 14]

f^^ ff rfn »ト¾値の A U Cの平均値―棚体の血糖上昇値の AU C _{χ ι 0 0} ώι»降下率（％) = ― ~ 溶媒投与群の Λυβ上袢値の A U Cの平均値

[0245] ここで、血糖上昇値の AUCとは、横軸にグルコース投与後の時間、縦軸に各個体の血糖値をプロットし、各点を直線で結んで得られるグラフの曲線下面積から、各個体のグルコース投与前の血糖値がグルコース投与 4時間後まで変化無く一定であつたとした場合のグラフの曲線下面積を減算したものである。具体的には、 =ダルコース投与前の血糖値、グルコース投与 30分後の血糖値、 =グルコース投与 1 時間後の血糖値、グルコース投与 2時間後の血糖値、グルコース投与 4時間後の血糖値としたとき、血糖上昇値の AUCは、以下の式：

[0246] [化 15]

AUC ₊ 2X - 4XA'

[0247] 力も求めることができる。

[0248] 算出された血糖降下率から、各群ごとに平均値及び標準偏差を算出し、表 13および表 14に示した。 HA- GLP— 1変異体コンジュゲートでは、 GLP— l(Human、 7 — 37)と比較して、血糖降下作用が大幅に増大し、糖尿病治療剤としての有用性が示唆された。

[0249] [表 13]

GLP-1 (Human, 7 _ 37 ) 投与時の血糖降下率（％) 投与量平均値標準偏差

150 g/kg 15.3 35.6

1500^ g/kg 59.6 42.4

[0250] [表 14] 表 14 HA— GLP— 1変異体コンジュゲート投与時の血糖降下率（％) 投与量平均値標準偏差

1.5 i g/k g 3.0 28.1

15 u s/ g 60.1 51.4

150w g/k g 120.3 35.6

Claims

請求の範囲

非プロトン性極性溶媒中で、式 (Π)：

[式中、 R^1Q、 R^u、 R¹²、 R¹³、 R¹⁴および R¹⁵は、それぞれ独立に C アルキル基から選

1-6

択され、または R¹⁰および R^U、 R¹²および R¹³、ならびに R"および R¹⁵は、それぞれ独立にそれらが結合する窒素原子と一緒になつて含窒素へテロ環を形成してもよぐ環 B は置換されて、てもよ、単環式または縮環式の含窒素へテロ環基であり、 ΧΊまァ- オンを表す]

で表される縮合剤を使用して、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基を、 5モル％以上の修飾率で置換アミド基に変換する工程を含む、水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[2] カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の置換基が、少なくとも 1以上の官能基を含み、当該官能基が、置換されていてもよいアミノ基、水酸基、メルカプト基、力ルポキシ基、アルデヒド基、メタクリロイル基、およびアタリロイル基力選択される、請求項 1に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[3] カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の置換基が、置換されて!、てもよ!/、ァミノ基、水酸基、メルカプト基、カルボキシ基、アルデヒド基、メタクリロイル基、およびアタリロイル基力選択される 1つの官能基を含む、請求項 1に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[4] カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の置換基力置換されて!、てもよ!/、ァミノ基、水酸基、メルカプト基、メタクリロイル基またはアタリロイル基力選択される 1または 2種類の官能基を各置換基中に 1〜9個含む、請求項 1〜3のいずれ力 1項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[5] 各置換アミド基中の官能基数が 1〜4個である、請求項 4に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[6] カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の置換基力アミノアルキル基 (このァミノアルキル基のアルキレン鎖は 1以上の水酸基で置換されて、てもよ、）、ァミノ（ポリアルキレンォキシ）アルキル基、ァミノ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、ヒドロキシアルキル基（このヒドロキシアルキル基のアルキレン鎖は 1以上の水酸基で置換されていてもよい）、ヒドロキシ（ポリアルキレンォキシ）アルキル基、ヒドロキシ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、メルカプトアルキル基、メルカプト（ポリアルキレンォキシ）アルキル基、メルカプト（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、メタクリロイルォキシアルキル基、メタクリロイルァミノアルキル基、メタクリロイルァミノ（ポリアルキレンォキシ)アルキル基、メタクリロイルァミノ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、メタクリロイルォキシ (ポリアルキレンォキシ）アルキル基、メタクリロイルォキシ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、アタリロイルォキシアルキル基、アタリロイルァミノアルキル基、アタリロイルァミノ（ポリアルキレンォキシ）アルキル基、アタリロイルァミノ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基、アタリロイルォキシ (ポリアルキレンォキシ)アルキル基またはアタリロイルォキシ（ポリアルキレンァミノ）アルキル基である、請求項 4に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[7] ヒアルロン酸またはその誘導体と、以下の式：

H N- CH (CHR⁵) — CH -NH；

2 2 m-2 2 2

H N- CH 一 CH 一（Y¹- -CH 一 CH ) - -NH；

2 2 2 2 2 n 2

H N- CH (CHR⁶) - -CH -OH ;

2 2 P-2 2

H N- CH 一 CH 一（Y²- -CH— CH ) - OH ;

2 2 2 2 2 r

H N- (CH ) SR⁷ ;

2 2 j

H N- CH 一 CH 一（Y³- -CH 一 CH ) - -SR⁸;

2 2 2 2 2 z

H N- (CH ) O— CO -C (R¹⁶) =CH ί

2 2 1 2

H N- (CH ) -NHCO — C (R") =CH H N-CH CH—（Y⁴— CH— CH ) NHCO— C (R¹⁸) =CH；または

2 2 2 2 2 t 2

H N-CH CH—（Y⁵— CH— CH ) O— CO— C (R¹⁹) =CH

2 2 2 2 2 y 2

2 j 2 2 2 z

-CH -CH -NHであり、 R¹⁶、 R"、 R¹⁸、および R¹⁹はそれぞれ独立して、水素原

2 2 2

子またはメチル基であり、

から選択される 1以上の化合物と反応させることにより置換アミド基を形成する、請求項 1〜4および 6のいずれか 1項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[8] 水溶性ヒアルロン酸修飾物が 2以上の種類の置換アミド基を含む、請求項 1〜7のいずれか 1項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[9] 前記水溶性ヒアルロン酸修飾物が式 (I) :

[化 2]

[式中、 R¹ R²、 R³および R⁴は、それぞれ独立に、水素原子、 C アルキル基または C

1-6

アルキルカルボニル基から選択され、

1-6

Raは、水素原子または C アルキル基であり、

1-6

Rbは、水素原子、 C アルキル基または基—CO— C (R²°) =CHであり、

1-6 2

Aは、 CH—（CHR⁵) -CH NH CH—（CHR⁶) — CH— O

2 m-2 2 2 p-2 2

(CH )—S—、 -CH -CH (Y³-CH—CH ) —S—、—CH—CH—（Y⁴— C H— CH )— NH または— CH— CH - (Y⁵— CH— CH ) — O であり、

2 2 t 2 2 2 2 y

ここで、 m、 p、および jは、それぞれ独立に 2〜10から選択される整数であり、 z、 tおよび yは、それぞれ独立に 1〜200から選択される整数であり、 R⁵および R⁶はそれぞれ独立に水素原子または水酸基であり、 R^2Qは、水素原子またはメチル基であり、 Y³, Y⁴および Y⁵は、それぞれ独立して、酸素原子または— NH である]

で表される繰り返し単位を分子内に少なくとも 1以上含むものである、請求項 1〜8のいずれか 1項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[10] 前記水溶性ヒアルロン酸修飾物が薬物担体として使用される、請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[11] 前記水溶性ヒアルロン酸修飾物力ヒアル口-ダーゼによる分解に対して耐性を有するものである、請求項 1〜10のいずれか 1項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[12] 前記水溶性ヒアルロン酸修飾物の哺乳動物における平均血中滞留時間が 18時間以上である、請求項 1〜： L 1のいずれか 1項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[13] 非プロトン性極性溶媒力ジメチルホルムアミド、ジメチルァセトアミド、ジメチルスルホキシド、 1, 3 ジメチルー 2 イミダゾリジノン、スルホラン、 N メチルピロリドンまたはこれらの 2種以上の混合溶媒力選択される請求項 1〜12のいずれ力 1項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[14] 非プロトン性極性溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項 13に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[15] 式 (Π)において、環 Bがべンゾトリアゾール—1—ィルである、請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[16] 前記縮合剤が、ベンゾトリァゾール一 1—ィルォキシ一トリス (ジメチルァミノ)ホスホ -ゥムへキサフルォロホスフェート、ベンゾトリアゾール 1—ィルォキシ一トリス（ピロリジノ）ホスホ-ゥムへキサフルォロホスフェート、およびこれらの混合物から選択される BOP系縮合剤である、請求項 1〜15のいずれか 1項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[17] 修飾率が 30モル％以上である、請求項 1〜16に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[18] 修飾率が 70モル％以下である、請求項 1〜17に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。

[19] 請求項 1〜18のいずれか 1項に記載の製造方法により得ることができる水溶性ヒアルロン酸修飾物。

[20] 請求項 19に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物であって、ヒアルロン酸をその構成ユニットの 2糖にまで分解することができ且つ分解産物の非還元末端に Δ—4, 5— グルクロン酸残基をもつ不飽和 2糖分解物を生成させるヒアルロニダ一ゼで該水溶性ヒアルロン酸修飾物を分解し、得られる分解産物の 232nmにおける吸収を測定した場合に、分解産物に由来する全ピークエリアに対する 2糖に由来するピークエリアの分率が 30 %以下である、水溶性ヒアルロン酸修飾物。

[21] 請求項 19または 20に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む薬物担体。

[22] 請求項 19または 20に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物により表面修飾された微粒子薬物担体。

[23] 請求項 19または 20に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む医薬組成物。

[24] 請求項 19または 20に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物および薬物を含んでなる水溶性ヒアルロン酸修飾物薬物コンジユゲート。

[25] 請求項 19または 20に記載のヒアルロン酸修飾物を架橋することで得ることができるヒアルロン酸ゲル。

[26] 請求項 25に記載のヒアルロン酸ゲルを乾燥させることで得ることができるヒアルロン酸ゲル。

[27] 薬物の封入に使用される、請求項 25または 26に記載のヒアルロン酸ゲル。

[28] 封入できる薬物力高分子と薬物とのコンジュゲートである、請求項 25〜27のいずれカ 1項に記載のヒアルロン酸ゲル。

[29] 請求項 27または 28に記載のヒアルロン酸ゲルを含む医薬組成物。

[30] 請求項 19または 20に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む、医療用デバイス。

[31] 請求項 19または 20に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物で表面修飾を施した、請求項 30に記載の医療用デバイス。

[32] 請求項 19または 20に記載のヒアルロン酸修飾物カゝらヒアルロン酸ゲル微粒子を製造する方法であって、

a)請求項 19または 20に記載のヒアルロン酸修飾物を含む希薄溶液を調製するェ程；

b)当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および

c)当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該ヒアルロン酸修飾物の架橋反応を進行させる工程を含むヒアルロン酸ゲル微粒子製造方法。

[33] 前記工程 b)が、前記溶液を噴霧することにより微粒子状の液滴に分散する工程である、請求項 32に記載の製造方法。

[34] 請求項 19または 20に記載のヒアルロン酸修飾物カゝらヒアルロン酸ゲル微粒子を製造する方法であって、

a)請求項 25に記載のヒアルロン酸ゲルを乾燥する工程；

b)得られた乾燥物を凍結する工程；および

c)得られた凍結物を粉砕する工程を含むヒアルロン酸ゲル微粒子製造方法。

[35] 得られる微粒子の平均粒子径が 0. 01 μ m〜150 μ mである、請求項 32〜34のいずれか 1項に記載の製造方法。

[36] 得られる微粒子が薬物担体である、請求項 32〜35のいずれか 1項に記載の製造方法。

[37] 得られる微粒子が薬物徐放担体である、請求項 32〜36のいずれか 1項に記載の製造方法。

[38] 架橋反応前の希薄溶液が薬物を含み、当該薬物が架橋反応後に得られる微粒子中に担持されている、請求項 32、 33、および 35〜37のいずれ力 1項に記載の製造方法。

[39] 請求項 32〜38の!、ずれ力 1項に記載の方法で得ることができるヒアルロン酸ゲル微粒子。

[40] 請求項 39に記載のヒアルロン酸ゲル微粒子を含む医薬組成物。