WO2004104203A1 - ヘモグロビンA1c測定法およびそれに用いる酵素とその製造法 - Google Patents

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protease
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hemoglobin
saccharified
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Takeshi Matsuoka
Shinji Koga
Takuji Kouzuma
Issei Yoshioka
Atsuhisa Nishimura
Homare Itou
Toshihiko Kumazawa
Takashi Kuroyanagi
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Asahi Kasei Pharma Corporation
Ichibiki Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for specifically measuring the N-terminal of a saccharified 3-chain hemoglobin) using an enzyme without separation operation, a measurement reagent kit, and a protease that can be used for the specific measurement.
  • the present invention relates to a method for producing the same, a method for screening the same, and a ketoamine oxidase that can be used for the specific measurement. Background art
  • Measurement of glycated protein is very important in diagnosing and managing diabetes.In particular, if the value of hemoglobin A1c is controlled to 7% or less according to recent studies, the risk of developing and developing complications will be reduced. It has been proven to decrease significantly, and is frequently used as an indispensable indicator in clinical settings.
  • electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, immunoassay, and enzyme method are generally known.
  • electrophoresis and chromatography require expensive dedicated equipment and are slow in processing speed, making them unsuitable for clinical tests involving the processing of many samples.
  • immunoassays are relatively simple in analysis method and require only a short period of time, so they use force antigen-antibody reactions that have been rapidly spreading in recent years, so they are not always accurate in terms of reproducibility and the effects of coexisting substances. The point is that it is a problem.
  • hemoglobin is intramolecular lysine ⁇ - amino group and alpha and chain ⁇ terminal heparin alpha - can undergo saccharification and amino groups, but to the the hemoglobin A 1 c Moguro bottle chain N-terminal valine of Because ⁇ -amino group is saccharified hemoglobin
  • protease (P1)-( ⁇ 4) ketoamine oxidase
  • trypsin, proline-specific endopeptidase and carboxypeptidase P used for producing j3 chain terminal glycated peptide from glycated hemoglobin are molecules. There is no description that no site containing internal lysine or glycated ⁇ ⁇ ⁇ -terminal derived glycated amino acid or glycated peptide is generated.
  • angiotensin converting enzyme hardly excises fructosyl valine from N-glycan saccharified peptides under normal reaction conditions.
  • saccharified ⁇ chain saccharified without substantially cutting out saccharified amino acid or saccharified peptide from the saccharified ⁇ chain of saccharified hemoglobin or a fragment thereof.
  • a glycated peptide is cut out, that is, a protease having the specificity of the above (P1) or (3), or a protease devised to achieve the specificity of the above (P1) or ( ⁇ 3).
  • the reaction conditions of Ze have not been known so far.
  • proteases As a screening method for proteases, that is, proteases having the properties of the above (PI) or (P3), the following methods are generally assumed.
  • glycated hemoglobin is separated into glycated ⁇ - chain ⁇ -terminal and glycated ⁇ / 3-chain ⁇ -terminal, and when these are used as a substrate, the glycated ⁇ -terminal is glycated.
  • a protease that cleaves glycated amino acids and / or glycated peptides only selectively, using an enzyme such as ketoamine oxidase that acts on glycated amino acids and ⁇ or glycated peptides cleaved by the protease, using color development as an index. This is a screening method of searching.
  • ketoamine oxidase there are the following about ketoamine oxidase.
  • the step of cutting out FV from hemoglobin 3-chain ⁇ -terminal branylated peptide with a protease generally has the disadvantage that the reaction hardly proceeds and a long time reaction is required with a large amount of enzyme.
  • a ketoamine oxidase used for measuring hemoglobin A 1 c was required to act on glycated peptides cleaved from N-terminal glycated peptides of the hemoglobin chain by a protease. And such
  • ketomamine oxidase derived from Corynebacterium (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-59598) To 1-deoxyfructocinole-L-parirul L-histidine (hereinafter also referred to as FVH) of the genus Conio and the genus Eunicillium (European Patent Application Publication No. 1 291 4 16). A working ketomamine oxidase has recently been reported.
  • ketoamine oxidase belonging to 1) has the property of ( ⁇ 4)
  • the ketoamine oxidase belonging to 2) has the property of ( ⁇ 2), but F There is no description that it has an effect on VH, and ketoamine oxidase belonging to 3) has the lowest effect on FK. 78%? 3 ⁇ 4: acts on glycated amino acid and / or glycated peptide from a site containing intramolecular lysine excised from glycated hemoglobin by a protease (European Patent Application Publication No.
  • ketoamine oxidase having a property of (K1), a property of ( ⁇ 2) and acting on FVH, and a property of ( ⁇ 3) has not been reported so far. It is also considered that ketoamine oxidase having the properties of (K1), ( ⁇ 2) and acting on FVH may be produced by modifying known ketoamine oxidase by amino acid substitution, deletion, or insertion. However, it is not known which amino acid residues in the primary structure of the enzyme contribute to the reduction of the effect on FK or F F.
  • any desired ketoamine oxidase gene can be modified to reduce the activity against FK or ⁇ -l-dexoxyfructosyl- ( ⁇ -benzyloxycarbonyl-L-lysine) (hereinafter also referred to as FZK).
  • FZK ⁇ -l-dexoxyfructosyl- ( ⁇ -benzyloxycarbonyl-L-lysine)
  • glycated amino acid and glycated amino acid which were cut out by simply decomposing moglobin to glycated And glycated peptides are detected by ketoamine oxidase, and a mixture of glycated ⁇ -amino group of intramolecular lysine and ⁇ -amino group of ⁇ and ⁇ -amino group of valine at the chain ⁇ -terminal is detected.
  • glycated hemoglobin was measured in Examples using ketoamine oxidase acting on protease and FVH. There is no statement that measurement can be performed without separation.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-300294 proposes an enzyme method for specifically measuring only the glycated ⁇ -amino group of valine at the ⁇ ⁇ -terminal of the hemoglobin chain. .
  • a protease capable of cleaving the carboxyl group side of the third leucine from the hemoglobin chain ⁇ end followed by a protease capable of cleaving His-Leu from fructosy 1-Va1-His-Leu
  • fructosylparin is generated, and the amount of the ⁇ -amino group of parin at the N-terminal of the hemoglobin chain is specifically measured.
  • this method requires the protease reaction to be performed in two steps, and strictly controls the protease reaction in the first step, which cleaves the carboxyl group side of the third leucine from the ⁇ end of the hemoglobin / 3 chain.
  • the second step of cutting out ⁇ -glycated amino acid from the hemoglobin ⁇ -chain ⁇ -terminal glycated peptide in the second step requires little reaction and a long reaction time with a large amount of enzyme.
  • the method shown in the Examples involves a complicated separation operation called ultrafiltration twice, and the saccharified hemoglobin saccharified ⁇ -chain ⁇ -terminal by the method of the present invention is separated without manipulation. There is no statement that the measurement can be made.
  • glycated proteins such as hemoglobin A1c are converted to morsin, AO protease, peptidase (produced by Kikkoman), carboxypeptidase Y, and protin P (Daiwa Kasei A method has been proposed in which FVH is released by a protease (produced in Japan) and measured with oxidase that can act on FVH.
  • the F produced by the protease is a problem, it can be eliminated with fructosylamine oxidase that acts on FK and then measured with oxidase that can act on FVH, or oxidase that acts on FVH and does not easily act on FK. It has been proposed to measure using. However, no distinction was made between the glycated ⁇ -chain of the glycated hemoglobin and the glycated ⁇ -chain derived from branylated amino acids and glycated peptides, and glycated hemoglobin was glycated by the proposed method. The examples in which the 3 end of the / 3 chain was measured are not specified, and there is no description that the proposed method is possible without the need for a separation operation.
  • An object of the present invention is to provide a method for specifically measuring only the glycated chain N-terminal of glycated hemoglobin without separation, a measuring reagent kit, a protease that can be used for the specific measurement, and a method for producing the same. It is an object of the present invention to provide a screening method and a ketoamine oxidase which can be used for the specific measurement.
  • the present inventors have conducted intensive studies and found that, first, glycated hemoglobin or the ⁇ chain of its fragment A screening method for a protease that cuts out the ⁇ -chain ⁇ -terminal glycated amino acid and / or glycated peptide without substantially cutting out the terminal glycated amino acid or glycated peptide was devised.
  • the glycated a- chain of the glycated hemoglobin becomes a substrate for ketoamine oxidase from the N-terminal of the glycated hemoglobin.
  • the glycated amino acid or glycated peptide serving as a substrate for ketoamine oxidase is not substantially cleaved from the glycated pentapeptide at the chain N-terminal, and the ketoamine salt is converted from the i-chain glycated pentapeptide at the N-terminal.
  • proteases that cut out glycated amino acids and Z or glycated peptides that serve as substrates for oxidase, sales of protease products such as Bacillus sp.-derived neutral proteinase (Toyobo), etc.
  • the protease reaction was found in proteases produced by microorganisms such as 'Enzymogenes'. .
  • elastase has been known as an enzyme that cleaves the peptide bond at the C-terminal side of leucine, isoleucine, palin, and alanine as its substrate specificity.
  • the elastase is a compound of 1-dexoxyfructosyl-L-parisle L-histidyl-L-mouth isyl-L-threonyl-L-proline (hereinafter also referred to as a hemoglobin chain N-terminal glycated pentapeptide).
  • Cut saccharified peptides When glycated hemoglobin or a fragment thereof is also excised from the glycated hemoglobin or a fragment thereof, FK and / or a glycated peptide containing FK can be excised from the glycated chain F and / or F ⁇ without acting on the glycated peptide derived from the terminal.
  • the saccharified hemoglobin or saccharified / 3 chain of saccharified hemoglobin or its fragment can be separated by erasing the saccharified peptides containing FK and / or F ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in advance with ketoamine oxidase that acts on saccharified peptides.
  • ketoamine oxidase that acts on saccharified peptides.
  • the protease converts saccharified amino acid and / or saccharified peptide from the saccharified ⁇ chain of glycated hemoglobin or a fragment thereof without cutting out the saccharified amino acid or saccharified peptide from the saccharified ⁇ chain ⁇ terminus.
  • FK and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ or a peptide containing FK from glycated hemoglobin or a fragment thereof we have found reaction conditions that can greatly reduce the reactivity of ketoamine oxidase to F ⁇ .
  • the glycated ⁇ -chain Only the glycated amino acids and / or glycated peptides cleaved from the sample could be specifically measured. That is, it was discovered that the 58th and 62nd amino acid substitutions of the ketoamine oxidase gene derived from Carburaria clavata contributed to the reduction of the effect on F ⁇ ⁇ , and based on this, the oxidase was prepared and used. This has led to the completion of a method for specifically measuring the saccharified ⁇ end of saccharified hemoglobin or a fragment thereof using an enzyme without performing a separation operation.
  • FK and / or glycated peptide containing FK which can act on the ketoamine oxidase used in combination with the protease, should not be cut out;
  • the glycated peptide of 1-dexoxyfructosyl-L-valyl which is a glycated peptide cleaved from a fragment containing the ⁇ -terminal or the glycated ⁇ -chain of glycated hemoglobin -
  • Saccharified amino acid which is not substantially cleaved from the fragment containing the saccharified ⁇ - chain ⁇ -terminal of the saccharified hemoglobin or the saccharified ⁇ - chain of the saccharified moglobin is 1-deoxy.
  • the glycated peptide which is xyfructosyl-L-parin and is not substantially cleaved is 1-de + xifructosyl-L-paryl-L-leucine
  • protease according to any one of (1) and (4).
  • protease according to any one of (1) to (5) above which is a protease derived from the genus Lysobacter. .
  • protease according to any one of the above (1) to (5) which is a protease derived from Pachirus sp. ASP-842 (FERM BP-08641) or Aeromonas hydrophila NBRC 3820.
  • protease meth port protease a neutral protease, or is either elastase above (1) to flop port tare Ichize 0 according 'to any one of (7)
  • Rhizopactor 'Enzymogenes YK-366 (FERM BP-1 0010) strain.
  • ketoamine oxidase according to the above (14), which further has the following properties (() and (C).
  • (C) is the ketoamine oxidase according to the above (15), wherein the 58th is a substitution of palidine, threonine, asparagine, cystine, serine, alanine, and the 2nd is a substitution of histidine. .
  • the protease of (i) is substantially converted from glycated hemoglobin by the action of ketoamine oxidase of (ii) ⁇ -1-dexoxyfructosyl-L-lysine and the like. Glycated ⁇ -chain of saccharified hemoglobin without cutting out saccharified peptides containing s- and ⁇ -l-deoxyfructosyl-L-lysine. ⁇ or a reaction step of cutting out saccharified peptides
  • reaction step (iii) is carried out under a reaction condition of pH 5.0 to 6.0.
  • reaction step (iV) is under a reaction condition of pH 5.5 to 6.5. .
  • ketoamine oxidase of (ii) is a ketoamine oxidase that acts on a saccharide amino acid and / or a saccharide peptide excised from the N-terminal of the glycated hemoglobin glycated hemoglobin by a protease. 22) The measuring method according to any one of (26) to (26).
  • ketoamine oxidase (ii) is of the following two types (a) and (b).
  • a ketoamine oxysigose which acts on a saccharified amino acid and / or a saccharified peptide which is excised by a protease from the saccharified / 3 chain N-terminus of a saccharified hemoglobin.
  • ketoamine oxidase of (a) is derived from the genus Carburaria and / or the ketoamine oxidase of (b) is derived from the genus Fusarium.
  • Saccharified amino acids or sugar peptides are not substantially cut out from the sugar-terminated chain N-terminal of sugarcane hemoglobin or a fragment thereof.
  • a reagent kit comprising: (i) the following, wherein the glycated chain of glycated hemoglobin is specifically measured without performing a separation operation.
  • a method for specifically measuring only the glycated / 3 chain N-terminal of glycated hemoglobin without separation operation a measurement reagent kit, a protease used for the specific measurement, and production of the protease A method or screening method, and a ketoamine oxidase that can be used for the specific measurement are provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing the homology in the amino acid sequence of ketoamine oxidase.
  • FIG. 2 is a drawing showing the optimum: H of a protease from Pachirus sp. AS P842.
  • FIG. 3 is a diagram showing the pH stability of a protease derived from Aspergillus sp.
  • FIG. 4 is a graph showing the optimal temperature of a protease from Pachira Espi ASP842.
  • FIG. 5 is a graph showing the thermal stability of a protease derived from Aspergillus sp.
  • FIG. 6 is a diagram showing the optimal H of protease from Aeromonas hydrophila NBRC 3820.
  • FIG. 7 is a diagram showing the pH stability of the protease from the air port Motis hydrophila NBRC 3820 c
  • FIG. 8 is a graph showing the optimal temperature of Aeromonas hydrophila NBRC 3820-derived protease.
  • FIG. 9 is a diagram showing the thermal stability of the protease from the air port Monas hydrofila NBRC 3820.
  • FIG. 10 is a diagram showing the optimal pH of a protease derived from Rhizopactor 'enzymogenes YK-366.
  • Figure 1 1 shows a P H stability Rizopakuta-Enzaimogenesu YK- 3 6 6 from Protea one peptidase.
  • FIG. 12 is a diagram showing the optimal temperature of a protease derived from Rhizopactor enzymogenes YK-366.
  • FIG. 13 is a diagram showing the thermal stability of a protease derived from Rhizopactor 'Enzymogenes YK-366'.
  • FIG. 14 is a diagram showing a restriction map of plasmid pPOS FOD923.
  • FIG. 15 is a diagram showing the relationship between the absorbance difference ⁇ As and the FVH concentration.
  • FIG. 16 shows the relationship between the time of the protease reaction and the measured value obtained.
  • Figure 17 shows the measurement scheme when glycated hemoglobin is degraded with protease, the signal derived from the peptide containing glycated lysine and glycated lysine is eliminated by FOD 2, and then the FVH level is measured by FOD 923.
  • Fig. 18 is a diagram showing a measurement scheme for measuring the FVH level by FOD923 without elimination of signals derived from glycated lysine and peptides containing glycated lysine after glycated hemoglobin is degraded with protease. .
  • Fig. 19 is a diagram showing a measurement scheme in the case where glycated hemoglobin is degraded with a protease, and then the FVH amount is measured by FOD932M without elimination of a signal derived from a peptide containing glycated lysine or glycated lysine. .
  • the Amadori compound in the present prominence is a compound represented by the general formula-(CO) -CHR-NH- (R is a compound formed by a Maillard reaction of a compound having an amino group such as protein and a compound having an aldehyde group such as glucose. , Which represents a hydrogen atom or a hydroxyl group).
  • Amadori compounds include glycated peptides such as glycated hemoglobin and glycated protein peptides such as glycated albumin.
  • hemoglobin A 1c is considered to be hemoglobin in which the ⁇ -amino group of argin at the N-terminus of the hemoglobin jS chain is glycated (Clinical Chemistry and aboratory Medicine). 36 (5): 299-308 (1998)).
  • the expression when specifically measuring the glycated i3 chain N-terminus of glycated hemoglobin is expressed as ⁇ 80% of the value obtained by measuring the amount of glycated hemoglobin, 'desirably 90% or more, and Desirably, it is used when 95% or more is derived from saccharification of the ⁇ -amino group of palin at the N-terminal of the hemoglobin 3 chain.
  • the saccharified amino acid in the expression such that the protease does not substantially cut off the saccharified amino acid or saccharified peptide from the saccharified ⁇ -chain of the saccharified hemoglobin or a fragment thereof.
  • Glycopeptide is a peptide with a length of 20 amino acids or less from the ⁇ -chain of hemoglobin, and the valine at the ⁇ -terminal becomes 1-deoxyfructosyl-L-valine.
  • ketoamine oxidase used in combination with a protease for example, 1-% when used in combination with ketoamine oxidase derived from Carburari ⁇ Clavator 923 (FERM BP-10009).
  • Deoxyfructosyl-L-paryl-L-leucine are detected by ketoamine oxidase used in combination with a protease, for example, 1-% when used in combination with ketoamine oxidase derived from Carburari ⁇ Clavator 923 (FERM BP
  • a protease cleaves a glycated amino acid or a glycated peptide from the N-terminal of the glycated chain of glycated hemoglobin or a fragment thereof
  • the glycated amino acid is 1-dexoxyfructosyl-L-parin.
  • a glycated peptide is a ⁇ -chain of hemoglobin that has a length of 20 amino acids or less from the ⁇ terminus, and whose ⁇ terminus is 1-dexoxyfructosyl-L-parin.
  • ketoamine oxidase used in combination with a protease.
  • a glycated peptide is a glycated peptide having a length of 50 amino acids or less in the expression that a protease cleaves a glycated peptide containing ⁇ -1-deoxyfructosyl-L-lysine from glycated hemoglobin.
  • Carbralia's Crabeta 923 (FERM BP-10009) was located on February 12, 2003 at 1-1-1 Higashi, 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan Deposited at the 6th National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary. Substantially
  • the expression that glycated amino acid and ⁇ or glycated peptide are excised from the glycated ⁇ -chain ⁇ -terminus without substantially excising glycated amino acid or glycated peptide from the glycated glycine N-terminus is:
  • the reactivity of excision of glycated amino acids and Z or glycated peptides from the glycated 3-chain N-terminus is 100%
  • the reactivity of glycated amino acids or oxidized peptides from the glycated c-chain N-terminus Is 10% or less, preferably 1% or less, more preferably 0.1% or less.
  • ketoamine oxidase preferably ketoamine oxidase derived from Carbra Vaclavata YH923 (FERM BP-10009) or ketoamine oxidase derived from Fusarium oxasporum. (Made by Asahi Kasei Pharma).
  • the expression that acts on ⁇ -glycated amino acids without substantially acting on glycated amino acids and / or glycated peptides cleaved by the protease from the glycated i3 chain N-terminus is described. Assuming that the reactivity with ⁇ -glycated amino acid is 100%, the reactivity with glycated amino acid and / or glycated peptide cut from the saccharified chain ⁇ -end by a protease is 10% or less. , Preferably 8% or less, more preferably 1% or less, and most preferably 0.1% or less.
  • ketoamine oxidase reaction acts on glycated amino acids and ⁇ or glycated peptides that are cut off from the ⁇ -terminal of the glycated J3 chain by a protease without substantially acting on ⁇ -glycated amino acids.
  • the expression is that the reactivity to ⁇ -glycated amino acids is 8% or less, assuming that the reactivity to glycated amino acids and / or glycated peptides cut out from the saccharified 3 chain ⁇ end by protease is 100%. Preferably, it is 1% or less, more preferably 0.1% or less.
  • the reaction of ketoamine oxidase shall be based on the detection of generated hydrogen peroxide.
  • FZK ketamamine oxidase to ⁇ -l-dexoxyfructosyl- ( ⁇ -benzyloxycarponyl-L-lysine)
  • xyfructosyl-L-paryl-L-histidine (hereinafter also referred to as FVH) when the reaction solution (50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 0 1% Triton x-100, 0.03% 4-Aminoantipyrine, 0.02% TOOS, 5U / m1 peroxidase, 2mM FZK or FVH) 200 ⁇ 1 ketoamine oxidase solution 20 ⁇ 1 was added and reacted at 37 for 5 minutes.After adding 0.5 ml of 0.5% SDS, the absorbance (A1) at 555 nm was measured, and the reaction solution without FZK and FVH was used. When the reactivity is measured from the difference (Al-Ab) from the absorbance (Ab) measured by performing the same operation, the ratio of the reactivity is 5% or less.
  • Separation operation is a series of measurement processes for measuring glycated hemoglobin in a sample using a whole blood sample or a hemolyzed sample as a sample.
  • column chromatography, membrane filtration, adsorption separation, precipitation This refers to an operation performed to increase the purity and concentration of molybdenum or a substance derived from molybdenum to saccharification, such as separation operation.
  • glycated hemoglobin is degraded by a protease, and the excised sugar chain is combined with oxidase, dehydrogenase, kinase, etc., which are enzymes acting on glycated amino acids and / or glycated peptides derived from the terminal.
  • oxidase dehydrogenase
  • kinase etc.
  • the combination according to the specificity is required as follows: (3) glycation using protease and ketoamine oxidase. is there.
  • saccharified ⁇ -chain acts on saccharified amino acids and / or saccharified peptides derived from the ⁇ end. Acts on glycated amino acids and / or glycated peptides from sites containing intramolecular lysines without using ⁇ protease screening>
  • a screening method for obtaining a protease having the specificity of (P 1) or ( ⁇ 3) includes hemoglobin a chain ⁇ terminal glycated peptide and hemoglobin chain N-terminal.
  • a method was devised in which a glycated peptide was used as a substrate and a protease that cleaves a glycated amino acid and / or a glycated peptide only when a hemoglobin chain ⁇ terminal glycated peptide ⁇ was used as a substrate.
  • the lengths of the a-chain N-terminal glycated peptide and the J3 chain N-terminal glycated peptide used at this time are not particularly limited, and it has been found that screening can be performed with a glycated peptide having a length of 3 to 20 amino acids.
  • the origin may be a chemical synthesis or a natural product such as saccharified hemoglobin.
  • 1-dexoxyfructosyl L-paryl-L-histidyl-L-leucyl-L-threonyl-L-proline (produced by Peptide Institute: In the following,) trisaccharified pentapeptide) is converted into 1-deoxyfructosyl-L-valyl-L-mouth isyl-L-seryl-L-prolyl-L-alanine as an a-chain N-terminal glycated peptide.
  • glycated amino acids glycated dipeptides, glycated tripeptides or glycated tetrapeptides may be cleaved by proteases.
  • the glycated amino acids and / or glycated peptides cleaved from the ⁇ -chain N-terminal glycated peptide and the / 3 chain ⁇ -terminal glycated peptide by the protease are the ⁇ - chain N-terminal glycated peptide and the 3-chain N-terminal glycated peptide.
  • Saccharified amino acids and glycans that have been cut out without substantially acting on glycated amino acids and glycated peptides may be detected using an enzyme that acts, and such enzymes include oxidase, dehydrogenase, and kinase.
  • oxidases include ketoamine oxidase
  • ketoamine oxidases include genus Acaetimiera, genus Cacaetomidum, Chelabia, genus Etomicum, geracinospora, genus Microascus, genus Conio, eugenicillium (and above) European Patent Application Publication No.
  • ketoamine oxidase derived from Carbraria clavata YH923 (FERM BP-10009) has 1-dexoxyfructosyl-L-valyl-L-histidyl-L-mouth isine assuming that the substrate specificity is 100% of FVH.
  • the amount of hydrogen peroxide generated can be detected by electrodes, luminescence, fluorescence, absorption, etc. It is convenient to perform absorbance detection using oxidase and a chromogen. For example, 540 to 5 using 4-aminoaminopyrine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and TODB (manufactured by Dojindo Laboratories) as chromogens. The protease activity can be easily confirmed by measuring the change in absorbance at 70 nm.
  • Proteases having the specificity of (P1) or (P3) obtained by the above screening method include proteases derived from microorganisms such as Bacillus genus, Aerial Monas genus, and Lysobacter genus. More specifically, for example, Neutral proteinase derived from SP (Toyobo), Pachiras' SP ASP 842 (FERM BP—08 64 1) Air outlet Monas Hydrofira NB RC 3820, Rizopacta Enzaimogenes YK—366 (FERM BP—100 10) derived protease.
  • proteases derived from microorganisms such as Bacillus genus, Aerial Monas genus, and Lysobacter genus. More specifically, for example, Neutral proteinase derived from SP (Toyobo), Pachiras' SP ASP 842 (FERM BP—08 64 1) Air outlet Monas Hydrofira NB RC 3820, Rizopact
  • Bacillus' SP AS 842 (FERM B P-08 641) and Rhizopactor 'Enzymogenes YK-366 (FERM B P-100 10)'.
  • Bacillus sp. AS P842 (FERM BP-08641) was a strain on February 24, 2004, and Lysopactor Enzymogenes YK-366 (FERM BP-100100) was a strain on January 3, 2004.
  • On 1Q Tsukuba East 1-chome, Ibaraki, Japan 1 Deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), the 6th Central Administrative Institution.
  • the mycological properties of these deposited materials are as follows, and were identified as follows.
  • AS P 842 (FERM BP— 0 864 1) is a gram-positive bacillus (0.8-1.0 x 2.0-3.0- ⁇ ) with the characteristics shown in Table 1, In Manualoi S ystematic B acteriology (1 984), it was identified as Bacillus sp. (a) Morphological properties
  • YK-366 (FERM BP-10010) is a Gram-negative aerobic bacillus with a size of 0.4 X 5 to 50 ⁇ and has the characteristics shown in Table 2 and has the following characteristics: In tic B acteriology (1989), it was identified as Rhizobacter p.enzaimogenes. Table 2
  • the means for culturing the protease-producing bacterium of the present invention may be solid culture or liquid culture, but is preferably aerated liquid culture using a flask or a jar fermenter.
  • the medium those commonly used for culturing microorganisms are widely used.
  • the carbon source is glucose, glycerol, sorbitol, lactose or mannose
  • the nitrogen source is yeast extract, meat extract, tryptone, peptone, etc.
  • the inorganic salt is sodium chloride, magnesium chloride, magnesium sulfate, calcium chloride, etc. Good. culture The conditions may be culture at pH 5.0 to 8.0, at a culture temperature of 25 to 37 ° C, and a culture time at which the target protease has the highest titer or purity, for example, 16 to 72 hours.
  • protease When the protease is secreted outside the cells, use a crude protease-containing solution obtained by removing the cells from the culture by filtration, centrifugation or the like. If the protease is present in the cells, the cells are separated from the culture by filtration, centrifugation, etc., and the cells are added to a buffer such as phosphate buffer or Tris-HCl buffer if necessary. Activators, metal salts, saccharides, amino acids, polyols, chelating agents, etc. are added and suspended, and crushed with lysozyme, ultrasonic waves, glass beads, etc., and then filtered, centrifuged, etc. to remove crude insoluble materials.
  • a buffer such as phosphate buffer or Tris-HCl buffer if necessary.
  • Activators, metal salts, saccharides, amino acids, polyols, chelating agents, etc. are added and suspended, and crushed with lysozyme, ultrasonic waves, glass beads, etc
  • a purified protease can be obtained by treating the crude proteinase-containing solution using known protein and enzyme isolation and purification means. For example, fractional precipitation using organic solvents such as acetone and ethanol, salting out using ammonium sulfate, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, genole filtration, etc.
  • Purified proteases can be obtained by appropriately selecting and combining enzyme purification methods, with appropriate stabilizers such as sucrose, glycerol or amino acids being about 1 to 50%, and coenzymes etc. being about 0.01 to 1%. They may be used alone or in appropriate combination of two or more kinds and stored frozen.
  • a screening method for obtaining a ketoamine oxidase having a property of (K1), a property of acting on (K2) and acting on FVH, and a property of (K3) for example, a proteinase excised from saccharified hemoglobin is used.
  • FVL as a representative example of a glycated amino acid and Z or a glycated peptide derived from the 1 ⁇ end of the chain
  • FVH as a representative example of a glycated amino acid and a glycated amino acid or a glycated peptide derived from the N-terminus of a 3 chain
  • a site containing an intramolecular lysine As a representative example of glycated amino acids and / or saccharide peptides from, a method using FK or FZK as an index of the reactivity to each is used.
  • the reactivity is 5% or less, preferably 4% or less, more preferably 2% or less
  • ketoamine oxidases natural ketoamine oxidase isolated from nature and natural ketoamine oxidase can be obtained by known genetic engineering techniques. Mutant ketoamine oxidase obtained by artificially modifying amino acids such as amino acid substitution, deletion, insertion, etc., and naturally-occurring mutant ketoamine oxidase by polyethylene diol Ketoamine oxidase which can be obtained by chemical modification using a derivative, a succinilimide derivative, a maleimide derivative or the like may be used.
  • ketoamine oxidases acting on FVH the genus Conio eta (European Patent Application Publication No. 129 14 16) and the genus Eunicillium (European Patent Application Publication No. No. 14 16 No. 1), ketoamine oxidase derived from the genus Carbralia and the genus Neocosmospora.
  • amino acids corresponding to the 58th and 62nd amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is substituted, and more preferably the 58th and 58th amino acids are substituted.
  • the corresponding amino acid is substituted by palidine, threonine, asparagine, cysteine, serine, and alanine, and the amino acid of the second corresponding is substituted by histidine.
  • Mutant ketamine oxidase having the properties of (K 1), (K 2) and acting on FVH, and (K 3) can be linked to a plasmid vector as necessary. Then, it is transferred to host microorganisms such as Saccharomyces, Pichia, Acremonium, Pachiras, Pseudomonas, Sirmas, and Escherichia, and cultured, or the encoded gene is transcribed and translated in vitro. It can be obtained by treating with known protein and enzyme isolation and purification means.
  • the method and reagent kit for specifically measuring the glycated chain N-terminus of glycated hemoglobin without separation using protease and ketoamine oxidase are described in Peroxidase, chromogen, and, if necessary, buffer components, salts, detergents, and metals, in addition to a combination of protease and ketoamine oxidase to obtain specificity for the Components such as ions, electron acceptors, chelating agents, sugars, amino acids, ascorbic oxidase, tetrazolium salts, polyols, enzyme stabilizers, enzyme reaction accelerators, antibacterial agents, oxidizing agents, reducing agents, and coenzymes It may be added and configured as appropriate.
  • the protease is (P1) to (P4)
  • the ketoamine oxidase is (K1) to (K1).
  • K5 ⁇
  • 'More specifically, for example, two-neutral proteinase derived from Bacillus sp. (Manufactured by Toyobo Co., Ltd.), Bacillus' SP ASP-842 (FE RM BP-08641) Aeromonas' Hydrofila NBRC3820, Risopactor. FERM BP-10010) Derived proteases. Further, in order to improve the reactivity while maintaining the specificity, it is also possible to use a combination of the screened protease and other proteases as appropriate.
  • the length of the glycoside peptide cut out from the N-terminal of the glycated 3-chain of hemoglobin by the protease is not more than 20 amino acids, and is not particularly limited as long as it can be detected by ketoamine oxidase used in combination.
  • ketoamine oxidase derived from Carbralia Clavator YH923 (FERM BP-10009)
  • the glycosylated peptide cleaved from the ⁇ -chain ⁇ -terminal of glycated hemoglobin by the protease is FV ⁇ . Is desirable.
  • the ketoamine oxidase may be any as long as it can form the above-mentioned combination with the protease.
  • a protease that cleaves a glycated peptide from a glycated amino acid at the end of the chain is preferred.
  • the glycated amino acid and / or glycated peptide derived from the glycated j-chain N-terminus is a glycated peptide derived from the glycated chain N-terminus.
  • ketamine oxidase derived from Clavita YH923 acts on glycated 3-chain N-terminal glycated dipeptide (FV H) and glycated ⁇ -chain N-terminal glycated glycation. Since it does not substantially act on dipeptide (FVL), it can be used as a ketoamine oxidase having the property (3).
  • a mutant whose reactivity with F F is less than 5% of the reactivity with FVH can be used as a ketoamine oxidase having the property of (K1), and a fructosyl amine oxidase derived from Fusarium oxosporum. (Manufactured by Asahi Kasei Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used as a ketoamine oxidase having the property of ( ⁇ 5).
  • the reaction conditions for excision of the glycated amino acid and / or glycated peptide derived from the i3 chain ⁇ -terminal saccharified from the saccharified hemoglobin by the protease may be any conditions as long as the reaction proceeds sufficiently. For example, by adjusting the pH, salt concentration, surfactant addition amount, metal ion addition amount, reaction temperature, redox agent addition amount, and buffer concentration, a protease of (P3) or (P2) nature is usually obtained. It is desirable that the reaction conditions be such that the specificity of the compound is increased and the property of (P 1) is obtained. In particular, neutral proteinase derived from Bacillus sp. (Toyobo), Bacillus sp.
  • ASP-842 (FERM BP-08641) having the property of (P 3), Aeromonas hydrobuiler NBRC 3820, Rizobacter p.enzaimogenes YK-366
  • the protease derived from (FERM BP-10010) at least pH 5.0 to 6.0 is obtained by using a ketoamine oxidase derived from Carburaria Clavator YH923 (FERM BP-10009) as a combination of ketoamine oxidases. Under the above reaction conditions, a protease having the property (P1) is obtained, so this reaction condition is preferable.
  • the reaction conditions for ketoamine oxidase may be any conditions as long as the reaction proceeds sufficiently.
  • FVH which is an amino acid and / or glycated peptide
  • IFCC value a sample marked with the value measured by the method
  • IFCC value can also be obtained by the conversion formula described in -734 (2002).
  • the glycated hemoglobin sample may be prepared from human blood by appropriately combining procedures such as blood cell separation, hemolysis, centrifugation, dialysis, ion exchange chromatography, and affinity chromatography, and the like (Clinical Chemistryand). la boratory Medicine 36 (5): 299-308 (1998)), and commercially available products may be purchased and used.
  • the method for specifically measuring the sugar-bound / 3 chain N-terminus of glycated hemoglobin using a protease and ketoamine oxidase without separation, as described above, and the measurement target of the reagent kit are as follows: Any one may be used as long as it contains glycated hemoglobin, and examples include a whole blood sample, a hemolysis sample, and a purified hemoglobin sample. 'Next, the present invention will be described with reference examples and examples.
  • Carbralia's Clavator YH923 (FERM BP-10009) produces ketominoxidase (hereinafter also referred to as FOD 923) that acts on FVH, but its production is low, so the FOD 923 gene is transformed into E. coli as shown below. After purification, FOD923 was obtained.
  • P11 and P12 primers were designed based on the gene information of ketoamine oxidase known so far.
  • Amplification of the upstream DNA fragment adjacent to the approximately 800 bp DNA fragment obtained in (a) was performed by digesting the chromosomal DNA with the restriction enzyme XbaI and then LA-PCR invitro Cloningkit (Takara Bio Inc.). ) was performed using cassette-1 igatio n-mediated PCR. That is, an XbaI cassette (manufactured by Takara Bio) is ligated to the chromosomal DNA-restricted enzyme-treated fragment, and this DNA is used as type I DNA using C1 primer (manufactured by Takara Bio) and the P13 primer described below.
  • the reaction solution was diluted 100-fold, and then subjected to 35 cycles of PCR using C2 primer (manufactured by Takara Bio) and the P14 primer described below. As a result, a 1,200 bp DNA fragment was specifically amplified. Then, the nucleotide sequence of the DNA fragment (the nucleotide sequence from the 1st to 1044th of SEQ ID NO: 1) was determined.
  • downstream DNA adjacent to the approximately 800 bp DNA fragment obtained in (a) Fragment amplification is performed by digesting chromosomal DNA with the restriction enzyme Sa1I and then using cassette-ligation-mediated PCR using LA-PCR invitro Cloningkit (manufactured by Takara Paio). That is, a Sa1I cassette (manufactured by Takara Bio) was ligated to the chromosomal DNA restriction enzyme-treated fragment, and this DNA was used as a type I DNA using a C1 primer (manufactured by Takara Bio) and the P15 primer described below.
  • this reaction mixture was diluted 100-fold to form a type II, and further subjected to PCR using a C2 primer (manufactured by Takara Bio) and the P16 primer described below for 35 cycles / reaction.
  • a 1,000 bp DNA fragment was specifically amplified.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment (the nucleotide sequence from the 1775th to 2212th in SEQ ID NO: 1) was determined.
  • the nucleotide sequences determined as described above were joined to determine the nucleotide sequence of the FOD923 gene (SEQ ID NO: 1).
  • a DNA fragment P21 to which the sequence of the enzyme NcoI was added and a DNA fragment P28 having a complementary sequence to which a restriction enzyme SacI was added immediately after the termination codon of the FOD923 gene were synthesized.
  • Carburaria 'Clabeta YH923 (FERM BP—1000 The chromosomal DNA of 9) was type III, and four types of PCR were performed using primers P21 and P23, P22 and P25, P24 and P27, and P26 and P28, respectively.
  • the removed 327 b, 480 bp, 471 bp and 254 bp amplified DNA fragments were obtained.
  • the obtained four fragments were mixed to form ⁇ , and PCR was again performed using P21 and P28 as primers, whereby the four fragments were ligated in the homologous region from which three introns had been removed.
  • a DNA fragment of about 1.4 kb having one FOD923 gene was obtained.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 designed to have a ribosome binding sequence region and a multimeric roning site downstream of the promoter of the pyruvate oxidase gene of pKNl9 has DNA fragment P31 and its complementary sequence, a DNA fragment P32 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 were synthesized, annealed, and ligated to pKNl9 cut with Xbal and EcoRI. p POS 2 was prepared.
  • Escherichia coli W3110 was transformed with the obtained pPOS FOD923 to prepare Escherichia coli FAOD923 expressing FOD923.
  • AGTGTTGTGGAAATACTCTTTG (complementary sequence of the nucleotide sequence at positions 725 to 75 and 808 to 832 in SEQ ID NO: 1)
  • CTGTCCCCTGTCGCCAGCACAAAG (complementary sequence to nucleotides 1669 to 1695 and 1751 to 1778 in SEQ ID NO: 1)
  • E. coli FAOD 923 prepared as described above was inoculated into the test tube described above, and cultured with shaking at 28 ° C. for 12 hours to obtain an inoculum.
  • This inoculum was cultured in a medium containing 20 L of 3% sorbitol, 1.5% peptone, 1.5% brewer's yeast extract, 0.1% defoamer, and 50 ⁇ g / m1 ampicillin ( The cells were inoculated into a 30 L jar fan mentor containing pH 7.0) and cultured under agitation at 37 ° C for 18 hours. After completion of the culture, the cells were collected, suspended in 4 L of 1 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5), and the cells were solubilized by sonication (212KU). This lysate is centrifuged at 8000 rpm for 30 minutes, and the centrifuged supernatant is Q-Sepharose.
  • Ion exchange chromatography was performed using Big Beads resin (2L) (Amersham). Elution was performed with a Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0 M, 0.1 M, 0.3 M, and 0.5 M NaCl. As a result, a fraction eluted with 0.3M and 0.51 ⁇ was recovered as an active fraction (180KU).
  • This enzyme solution was concentrated to 750 ml using a module (manufactured by Amicon), and dialyzed overnight against 1 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5). The dialysate was subjected to ion chromatography again using Q-Sepharose • HP resin (500 ml) (manufactured by Amersham).
  • One unit of the enzyme activity was 37, and the amount of the enzyme that produced 1 micromol of hydrogen peroxide per minute was used.
  • Neocosmospora basin fuceta 474 produces ketoamine oxidase (hereinafter also referred to as FOD474) that acts on FVH, but due to low production, expresses the ketoamine oxidase gene in Escherichia coli as shown below. After that, purification was performed to obtain the ketoamine oxidase.
  • FOD474 ketoamine oxidase
  • Neocosmospora basinhuecta 474 would have homology to the gene of FOD923. Therefore, the plasmid pPOSFOD923 containing the FOD923 gene described above was cut with restriction enzymes NcoI and SacI, and a DNA fragment of about 1.4 kb containing the ketoamine oxidase gene was separated.
  • a radioactive DNA probe was prepared using BCaBEST Labeling Kit (manufactured by Takara Bio) and [ ⁇ -32P] dCTP.
  • this chromosome was cut with various restriction enzymes to determine the length of the DNA fragment containing the target gene. The test was performed. First, the chromosomal DNA of Neocosmospora basinfuecta 474 was cut with various restriction enzymes, electrophoresed on a 1.5% agarose gel, and the DNA was transferred from the agarose gel to a nylon membrane (PALLODINE A).
  • a hybridization solution (0.1% ficoll, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% ⁇ serum albumin, 0.75 M sodium chloride, 75 mM Sodium chloride, 50 mM trisodium phosphate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 250 / gZml salmon sperm DNA, 50% formamide
  • prehybridization was performed at 42 ° C for 2 hours.
  • the hybridization solution was replaced with a new one, the radioactive DNA probe prepared in (a) was added, and the hybridization was performed again at 42 ° C for 1 ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the membrane was washed with a washing solution (75 mM sodium chloride, 7.5 mM sodium citrate, 0.1% SDS) at 50 ° C for 10 minutes, and then the membrane was air-dried.
  • the dried membrane was overlaid on an X-ray film and exposed at -70 ° C for 24 hours. After exposure, the film was developed and the size of the positive band indicated by the chromosome cut by each restriction enzyme was observed. As a result, it was revealed that the ketoamine oxidase gene was present on the approximately 8 kb DNA fragment obtained by SacI digestion, and the gene library was obtained using the 8 kb fragment of chromosomal DNA digested with SacI. It was decided to create.
  • the chromosomal DNA of Neocosmospora pasinfuecta 474 obtained by the operation (1) was digested with the restriction enzyme SacI, and an approximately 8 kb DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis.
  • This DNA fragment was cleaved with the restriction enzyme SacI, and ligated with pUC119 whose cleaved end was dephosphorylated with an alkaline phosphatase using a DNA ligation kit (manufactured by Takara Bio).
  • Escherichia coli JM109 competent cells (Takara Bio) were transformed and cultured on LB agar medium (Becton Deckinson) containing 50 g of 1 ampicillin to obtain about 5,000 ampicillin-resistant colonies. And the gene library.
  • the gene library obtained in (c) was replicated on a nylon membrane (PALLODINE A, manufactured by PALL), and the bacterial DNA was fixed to the membrane according to the attached manual.
  • the DNA-immobilized membrane was immersed in the hybridization solution shown in (b), and prehybridization was performed at 42 ° C for 1 hour. After prehybridization, the hybridization solution was replaced with a new one, and the radioactive DNA probe prepared in (a) was added. I went for a high-priced 1 ⁇ ⁇ in C.
  • the membrane was washed with a washing solution at 50 ° C shown in (b) for 10 minutes, and then air-dried. The dried membrane was overlaid on an X-ray film and exposed at -70 ° C for 24 hours. After the exposure, the film was developed, and eight colonies showing positive signals were confirmed.
  • a colony showing a positive signal selected in (d) was inoculated into 1.5 ml of 50 ⁇ g / m1 ampicillin-containing LB liquid medium (manufactured by Becton Dickinson) and cultured with shaking at 37 ° C for 16 hours. Later, the plasmid was extracted. As a result, plasmids derived from the eight colonies contained the same chromosomal DNA fragment. For one of the plasmids, a region having homology to the FOD923 gene was identified in the inserted chromosome fragment, and the nucleotide sequence of the FOD474 gene was confirmed. Determined columns. SEQ ID NO: 9 shows the determined nucleotide sequence of the FOD474 gene and the amino acid sequence encoded thereby.
  • Neocosmospora basinfuecta 474 was transformed into ⁇ type, and PCR was performed for 25 cycles using P41 and P42 as primers to obtain a DNA fragment of about 1.4 kb containing the FOD474 gene.
  • This DNA fragment was digested with BspHI and SacI, incorporated into pPOS2 digested with NcoI and SacI, and the ketoamine oxidase gene was downstream of the pyruvate oxidase promoter.
  • the integrated plasmid pPOSFOD474 was made.
  • this plasmid was inserted into an approximately 1.4 kb DNA fragment plasmid pUC119 containing the FOD474 gene obtained by digesting with XbaI and SacI, and the plasmid p119-FOD474 (FERMBP- No. 08642) was prepared, and the nucleotide sequence was analyzed. It was confirmed that no mutation had occurred by PCR.
  • E. coli W3110 was transformed with the obtained pPOSFOD474 to prepare E. coli FAOD474 that expresses FOD474.
  • the plasmid p119-FOD474 (FERM BP-08642) was obtained on February 24, 2004, 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan Patent Depositary Center for Biological Sciences, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Deposited.
  • Reaction solution (.50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 0.1% Triton x-100, 0.03% 4-aminoaminopyrine, 0.02% TOOS, 5U / m1 (Oxidase, 2 mM substrate)
  • enzyme solution 0.1 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 0.1% Triton x-100, 0.03% 4-aminoaminopyrine, 0.02% TOOS, 5U / m1 (Oxidase, 2 mM substrate
  • FOD 923 FOD 474 used, ketoamine oxidase derived from Fusarium oxosporum (manufactured by Asahi Kasei Pharma; hereinafter also referred to as FOD 2)
  • FOD 2 ketoamine oxidase derived from Fusarium oxosporum (manufactured by Asahi Kasei Pharma; hereinafter also referred to as FOD 2)
  • Enzyme solution concentration, substrate used, absorbance difference (Al-Ab) and relative activity (% ) are shown in Table 3.
  • angiotensin converting enzyme from porcinekidney (Sigma: ACEP) and an angiotensin converting enzyme from rabbit 1ung (Sigma: ACER) are dissolved in an enzyme solution (lO OmM HEPES (pH 8.3), 30 OmM NaC The solution was dissolved at 20 U / m1 in 1) to prepare an ACEP solution and an ACER solution.
  • an enzyme solution, an ACEP solution, and an ACER solution were added to three tubes each containing 2 1 of 2 mM FVHL (manufactured by Peptide Research Laboratories) at 20 / z, and the reaction was carried out at 37 for 1 hour.
  • a coloring solution (5 OmM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1% Triton X-100, 5 U / m 1 POD, 50 U / m 1. FOD 2, 0.02 mM DA -64) After adding 200 ⁇ l and reacting at 37 ° C. for 5 minutes, the coloring reaction was stopped by adding 500 ⁇ l of 0.5% SDS, and the absorbance at 730 nm was measured. Similarly, perform the same reaction using distilled water instead of the 2 mM FVHL solution; add 200 ⁇ l of the coloring solution to 40 ⁇ l of the FV solution (0, 5, 10, 20, 50 / ⁇ ).
  • the main wavelength is 550 nm and the sub wavelength is 595 nm using a microplate reader (model 1505 manufactured by Bio-Rad).
  • Capsulpoxypeptidase ⁇ , carboxylpeptidase w , neutral proteinase, and thermolysin can be used at pH 7.5 without substantially cleaving glycated amino acids or glycated peptides from hemoglobin ⁇ - chain ⁇ terminal glycated pentapeptide. It turns out that it is a protease that cleaves glycated peptides from moglobin ⁇ -chain ⁇ terminal glycated pentapeptide. ⁇ liquid>
  • Samples were Carboxypeptidase II (Sigma), Carboxypeptidase W (Wako Pure Chemical Industries), Carboxypeptidase II (Oriental Yeast Industry), Protease (Type XXV II Nagase: Sigma), Protease (Type VIII Subtilisin Carlsberg: Sigma), Protease (Type XXIV Pacterial: Sigma), Proteinase II (Wako Pure Chemical Industries), Neutral Proteinase (Toyobo), and distilled water
  • the carboxypeptidase is used to convert the hemoglobin chain from the terminal glycated pentapeptide to the glycated peptide without substantially cutting out the glycated amino acid or glycated peptide from the terminally glycated pentapeptide at ⁇ ⁇ 3.5. It can be seen that this is a protease that cuts out.
  • Example 7 The sample was diluted 10-fold with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) to obtain a sample, and the measurement was performed in the same manner as in Example 1.
  • Table 7 The results of the microorganisms cultured in MRS Broth are shown in Table 7, Table 8 shows the results of the microorganisms cultured in the above, and Table 9 shows the results of the microorganisms cultured in the YPG medium (however, Table 9 does not measure the subwavelength).
  • the dialyzed protease solution was adsorbed to a column (26 ⁇ ⁇ 94 mm) of DEAE-Sepharos eFF (Amersham) equilibrated with 1 OmM potassium phosphate buffer (iH7.5), and then 0 M was eluted with a 0.5 M gradient of NaCl to obtain a fraction containing protease activity (217 mU / ml, 54 ml).
  • 0.2 ml of the measurement reagent was placed in a test tube, preliminarily heated at 37 ° C. for 5 minutes, and then 0.02 ml of an enzyme solution was added to react for 10 minutes. After the reaction, the reaction was stopped by adding 0.5 ml of 0.5% 303, and the absorbance (A a) at a wavelength of 555 nm was measured. The same operation was performed using distilled water instead of the enzyme solution as a blank. And measure the absorbance (Ab). The enzyme activity was determined from the difference (Aa-Ab) between the absorbance (Aa) and the absorbance of the blank (Ab). One unit of the enzyme activity was the amount of the enzyme that produced 1 micromol of hydrogen peroxide per minute at 37 ° C. However, ⁇ -glycated pentapeptide was used as the substrate.
  • This protease cleaves FVH from the saccharified pentapeptide (without saccharified amino acid or saccharified peptide from a saccharified pentapeptide) as in the neutral protease (manufactured by Toyobo). .
  • FIG. 2 shows the results of measurement using the j-glycated pentapeptide of M. It can be seen that pH around 6.0 is optimal.
  • the protease was placed in 5 OmM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), treated at 4, 37, 50, 60, and 70 ° C for 10 minutes, and the residual activity was measured.
  • Figure 5 shows the results.
  • YPG medium 2.0% glucose, 1.0% polypeptone, 2.0% yeast extract, 0.1% KH2PO'4, 0.05% Mg S04-7H20, pH 7.0
  • Aeromonas hydrofila NBRC 3820 100 ml of YPG medium (2.0% glucose, 1.0% polypeptone, 2.0% yeast extract, 0.1% KH2PO'4, 0.05% Mg S04-7H20, pH 7.0)
  • sterilized and inoculated with Aeromonas hydrofila NBRC 3820, followed by shaking culture at 30 ° C for 2 days.
  • the obtained culture was centrifuged, and ammonium sulfate was added to the culture supernatant so as to be 40% saturated.
  • the centrifuged supernatant was added with 40% saturated ammonium sulfate in 0.1 M Tris-HCl buffer ( It was applied to a column of Butyl Toyopearl 650M (30 mm ⁇ 50 mm, manufactured by Tosoh) equilibrated at pH 7.3). After washing with 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.3) to which ammonium sulfate was added so as to be 10% saturated, elution was performed with 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.3).
  • the active fraction of the eluate was dialyzed against 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.3) and equilibrated with the same buffer.
  • DEAE-Sepharose Fast Flow (30 ⁇ 150 mm, manufactured by Amersham) Column and eluted with a linear gradient of NaCl from 0 to 0.5 M. Ammonium sulfate was added to the active fraction of the eluate so as to be 40% saturated, and the buffer was equilibrated with 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.3) to which 40% saturated ammonium sulfate was added.
  • the activity of this enzyme was measured as follows. Add 10 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5) in which j3 saccharified pentapeptide is dissolved to 0.5 mM. Place 0.45 m1 in a cell with an optical path length of 1 cm, and reserve for 5 minutes at 37 After heating, 0.05 ml of the enzyme solution was added and reacted for 10 minutes.
  • Table 12 shows the action of the protease derived from Aeromonas hydrophila NBRC 3820 of the present invention on ⁇ -glycated pentapeptide and] 3-glycated pentapeptide.
  • concentration of each substrate during the reaction was 0.25 mM, and Aeromonas' hydrofil NBRC 3820-derived protease (1.0 U) was added and reacted at 30 ° C for 5-60 minutes, and the reaction solution was passed through a protein sequencer (Shimadzu). The N-terminal amino acid sequence of the peptide which was donated and produced by the action of the protease was determined.
  • the protease from Aeromonas hydrophylla NBRC3820 did not act on the ⁇ -glycated pentapeptide, cleaving the peptide bond between histidine and leucine of the glycated pentapeptide, and FVH and leucyl-threonyl-protease.
  • Phosphorus (LTP) was produced.
  • the enzyme solution was treated in various buffer solutions of 1 OmM at 4 ° C for 24 hours, and the residual activity was measured according to the activity measurement method described in ⁇ Purification method> of this enzyme. Fig.
  • the assay reagent (0.04% TOOS, 0,06% 4-aminoantipyrine, 10U peroxidase, Carburaria 'clavita 10U containing ketoamine oxidase from YH923 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)), add 0.5 ml, allow the color to develop for 2 minutes, add 2 ml of 0.5% SDS solution, stop the reaction, and absorb at a wavelength of 550 nm (A a ) Was measured.
  • Various buffers without FVH were added as blanks, and the absorbance was measured in the same manner (Ab).
  • the enzyme activity was determined from the difference (Aa-Ab) between the absorbance (Aa) and the absorbance of the blank (Ab).
  • Fig. 8 shows the results of finding the optimum temperature by changing the temperature in the range of 15 to 70 ° C.
  • the molecular weight of the enzyme was determined by gel filtration using YMC-PacDiol-200G (6.0 ⁇ X 300 mm, manufactured by Jemushi Ichi). Bovine serum albumin, ovalbumin, and soybean trypsin inhibitor (all manufactured by Sigma) were used as standard proteins. As a result, the molecular weight was about 33, Q00.
  • the molecular weight was about 33,000 by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate / polyacrylamide gel electrophoresis) with 10% g e l according to the method of Lae mm1 i.
  • the standard protein used was SDS-PAGE Standard Low (manufactured by Piorad).
  • Aeromonas' hydrobuiler NBRC 3820-derived protease of the present invention is a monomer.
  • Purified enzyme obtained from Aeromonas hydrofila NBRC3820 culture solution was dissolved in distilled water according to the method described above, and analyzed using N-terminal sequence sequencer (PPS Q-21 manufactured by Shimadzu Corporation). The obtained sequence was as shown in the following SEQ ID NO: 12. As a result of searching for homology with a known protease based on the obtained N-terminal partial amino acid sequence, it showed 98% homology with Aeromonas' hydrofila elastase.
  • Table 12 summarizes the properties of the proteases derived from Aeromonas hydrophila NBRC 3820.
  • F-VHLTP P chain
  • F-V ⁇ ⁇ chain
  • F-VLSPA (a chain) N.D.
  • the active fraction was recovered by the same method as the production and purification method described in Example 5, and dialyzed against distilled water to obtain a purified protease.
  • Table 13 summarizes the purification process. The activity was measured in the same manner as in Example 5.
  • Table 14 shows the effects of the protease of the present invention derived from Lysobacter P. enzymogenes YK-366 on ⁇ -glycated pentapeptide and glycated pentapeptide. According to the method described in Example 5, (1), the effect of the protease derived from the lysopactor 'enzymogenes ⁇ -366 of the present invention on ⁇ -glycated pentapeptide and ⁇ -glycated pentapeptide was examined.
  • protease did not act on the ⁇ -sugar pentapeptide, but cleaved the peptide bond between histidine and leucine of ⁇ -glycated pentapeptide, and produced FVH and LTP.
  • FIG. 10 shows the result of examining the optimal ⁇ of the proteases derived from Lysobacter p.enzymogenes ⁇ -366 according to the method described in Example 5, (2).
  • the molecular weight was determined by SDS-PAGE in the case of gel filtration. As a result, the molecular weight was about 35,000.
  • the purified enzyme obtained from the culture solution of Rhizopactor 1'enzymogenes YK-366 was dissolved in distilled water and analyzed using N-terminal sequence sequencer (PPSQ-21, manufactured by Shimadzu Corporation). The obtained sequence was as shown in the following SEQ ID NO: 15.
  • a fragment of the enzyme was obtained and sequenced. That is, 501 of 45 mM dithiothreitol was added, treatment was performed at 50 ° C. for 15 minutes, 5 ⁇ M of 10 OmM rhodocetoamide was added, and the mixture was allowed to stand for 15 minutes.
  • Table 14 summarizes the above '14 quality of the above Aeromonas' hydrobuiler NBRC3820-derived proteases.
  • the construction of the FOD 923 mutation library was created by error-prone PCR utilizing the misreading of DNA polymerase. Error-prone PCR was performed using p POS FOD 923 described in the above reference example as a type I, and using a P51 primer and a P52 primer (shown in the following IE column numbers 18 and 19). Magnesium chloride was added to o-Go PGR beads (manufactured by Amersham) to a final concentration of 2.5 mM. The cycle conditions were 94 ° CX 40 seconds ⁇ 55 ° CX 30 seconds ⁇ 72 ° CX 1 minute; 25 cycles. (Column number 18)
  • the amplified PCR product was purified using GFXPCRDNAandGelBandPurification-kit (manufactured by Amersham).
  • Pre-sterilized expression medium (containing 3% sorbitol, 1.5% polypeptone, 1.5% yeast extract, 50 ig Zm1 ampicillin in a 6-well microplate, pH 7 100 / zl), and the grown transformants were inoculated therewith and cultured at 30 ° C.
  • One selected colony of the strain was inoculated into 5 ml of LB medium (containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin) and cultured with shaking at 30 ° C. for 20 hours. After completion of the culture, the cells are collected by centrifugation, suspended in 5 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and the cells are lysed by sonication. A dagger was performed. This soluble solution was centrifuged (8,000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was used as a crude ketoamine oxidase enzyme solution. Screening of mutant ketoamine oxidase with reduced activity on FZK using FVH and FZK as substrates using these crude enzyme solutions.
  • FZK / FVH Relative activity to FVH activity
  • Mutant enzymes 923-F330L and 923-Fro2 represent the genes for wild-type or mutant enzyme 923-F2 based on the restriction enzyme map of the plasmid P POSFOD923 shown in Fig. 14. A fragment containing the target mutation site was excised by treatment with the restriction enzyme shown in Fig. 15, inserted into the other plasmid treated with the same restriction enzyme, and obtained from E. coli transformed with the obtained plasmid. .
  • the region containing the target mutation was subjected to PCR using the mutation primers P53 and P54 (shown in SEQ ID NOs: 20 and 21), and the resulting fragments are shown in Table 15.
  • the resulting plasmid was treated with the same restriction enzyme, inserted into pP OSF OD923 cut with the same restriction enzyme, and obtained from Escherichia coli transformed with the obtained plasmid.
  • Table 15 shows the results of evaluating these mutant enzymes by the measurement method described in Screening of Mutant Ketoamine Oxidase with Reduced Action on FZK. Substitution of isoleucine (158) at amino acid number 58 with palin or substitution of arginine (R62) at amino acid number 62 with histidine was found to be effective in reducing FZK activity.
  • Table 16 shows the specificity of the mutant fructosylaminooxidase of the present invention for various substrates.
  • concentration of each substrate during the reaction was 1 mM, and the other reaction conditions were the same as those described in Screening for Mutant Ketoamine Oxidase with Reduced Action on FZK.
  • 923-F 2 (hereinafter also referred to as FOD 923 M) shows the highest reactivity to FV and also responds to FVH, but 2.5% for FZK and FVL respectively 0.5%, which is negligible compared to FVH, indicating that this enzyme does not substantially act on FZK or FVL.
  • Ketomamine oxidase (FOD474) from Neocosmospora vasinhuecta 474 has high homology with ketomamine oxidase including FOD923, and as shown in Fig. 1, N-terminal region including I58 of FOD923.
  • the amino acid sequence is highly conserved.
  • pPOSFOD474 a FOD474 mutant strain 474-F1 in which I58 of FOD474 was substituted with a different amino acid (threonine) was obtained.
  • Table 17 shows the specificity of FOD474 and 474-F1 for various substrates.
  • the 58th amino acid region is considered to be a site that is strongly involved in the substrate specificity for FVH in ketoamine oxidase from other bacterial species . 2004/007341
  • Reaction solution 50 ⁇ buffer, 0.1% Triton x-100, 0.03% 4-aminoantipyrine, 0.02% TOOS, 5U / m1 peroxidase, 2mM substrate
  • Enzyme solution in 200 ⁇ 1 After adding / Z1 and incubating at 37 ° C for 5 minutes, 5001 of 0.5% SDS was added, and the absorbance at 555 nm was measured.
  • Buffers are Tris-HCl ( ⁇ 7.5, 8.0, 8.5), PI PES (pH 6.0, 6.5, 7.0), Bistris-HCl (pH 5.0, 5.5, 5.5) 6.0, 6.5), absorbance was similarly measured using a reaction solution containing no substrate, the difference in absorbance when FVH and FZK were used as substrates, and the enzyme used.
  • the enzyme concentration of the solution is shown in Table 18.
  • Table 19 shows the relative activities (%) represented by (F ZK / FVH) when F VH and F ZK were used as substrates. It can be seen that the specificity for FVH is remarkably improved at around pH 6.
  • R2 was added and the absorbance value at 730 nm after 180 seconds (A1)
  • R3 was added and the absorbance value at 730 nm after 90 seconds (A2)
  • R4 was added and 730 nm after 90 seconds.
  • R1 -protease
  • the absorbance at 730 nm (Al) 180 seconds later
  • the absorbance difference ⁇ (A2-A1)-( ⁇ 2b-Alb) is considered to be proportional to the amount of glycated ⁇ -amino group of lysine residue in glycated hemoglobin.
  • Example 10 The protease reaction time in the low and high hemoglobin A1c standard solutions in Example 10 was changed from 30 minutes to 360 minutes, and the obtained measured values of hemoglobin A1c are shown in FIG. Indicated. The reason that the measured value in Example 10 coincided with the theoretical value was not obtained accidentally by limiting the protease reaction time to 60 minutes, but the protease reaction time increased from 30 minutes to 360 minutes. It is almost stable, indicating that the amount of glycated i3 chain N-terminal of true glycated hemoglobin is measured by this method.
  • Example 1 2 The reason that the measured value in Example 10 coincided with the theoretical value was not obtained accidentally by limiting the protease reaction time to 60 minutes, but the protease reaction time increased from 30 minutes to 360 minutes. It is almost stable, indicating that the amount of glycated i3 chain N-terminal of true glycated hemoglobin is measured by this method.
  • Example 1 2 The reason that the measured value in Example 10 coincided
  • FOD2 is used to eliminate peptides containing glycated lysine and glycine lysine, and then FODH is measured by FOD923.
  • R 1 reaction solution (2 OmM buffer, surfactant, sodium chloride, 2 mM calcium chloride, 1.2 kUZm l neutral proteinase (Toyobo)) 324 / l 20 mM WST 3 at 30.4 ⁇ l and glycated hemoglobin 60 seconds after adding sample 36 ⁇ I, add R4.6 reaction solution (100 mM buffer, 50 U / m1 peroxidase, 0.16 mMDA-64) 44.6 ⁇ 1 and add After 300 seconds, add 5 ⁇ l of 0.5 ⁇ EDTA and ⁇ preparation solution 151, add 50 ⁇ l of FOD 2 at 150 OU / m 1 after 50 seconds, and add 50 ⁇ l after 50 seconds.
  • EDTA was added to stop or inhibit the protease reaction.
  • the pH adjusting solution is added to the ketoamine oxidase FOD 2 and FOD 923 reaction to bring the pH to about 7.5, and the buffer, surfactant and sodium chloride concentration used in the R 1 and R 2 reaction solutions are added.
  • Table 21 shows the combinations of and PH preparation solutions and the measurement results.
  • R1 reaction solution (20 mM buffer, surfactant, sodium chloride, 2 mM calcium chloride, 1.2 kU / m1 neutral proteinase (Toyobo)) 3 24 i U: i20mM WST 3 30.4 ⁇ 1 60 seconds after adding 36 ⁇ l of molybbin sample to the saccharification, add R 2 reaction solution (10 OmM buffer solution, 5 OU / m 1 peroxidase, 0.16 mM DA— 64) Add 46.1, add 0.5 M EDTA 51 and pH adjuster 15 ⁇ l after 300 seconds, and add 50 OU / m 1 FOD 9 23 5 ⁇ l after 50 seconds. In addition, the reaction was performed for 150 seconds.
  • the pH adjustment solution is added to the ketoamine oxidase FOD 2 and FOD 923 to achieve a pH of about 7.5 during the reaction, and the buffer, surfactant, and sodium chloride used in the R 1 and R 2 reactions are added.
  • Table 21 shows the combinations of concentrations and pH adjustment solutions, and the measurement results.
  • Example 11-b a protease derived from Bacillus sp. ASP 842 was added so as to obtain 0.85 U / m1 instead of 1.2 kUZml neutral proteinase (manufactured by Toyobo).
  • the combination of the buffer, surfactant, sodium chloride concentration and PH preparation solution used in the R2 reaction solution and the R2 reaction solution was performed in the same manner as in 1-b) as shown in Table 22. Table 22 shows the measurement results. .
  • R1 reaction solution (20 mM buffer, detergent, sodium chloride, 2 mM calcium chloride, 0.43 U / m1 V zopacter. Enzymogenes YK-366-derived protease) with 30.4 ⁇ m of 20 mM WST3 R2 reaction solution (100 mM buffer, 5 OU / m1 peroxidase, 0.16 mM) DA-64) 44.6 ⁇ l was added, and 300 seconds later, ⁇ preparation solution 151 was added. 50 seconds later, 50 OU / m 1 of 00923 was added, and the mixture was reacted for 150 seconds. All reactions were performed at 37 ° C in the cell of the absorbance meter, and the absorbance at 730 nm was monitored. PT / JP2004 / 007341
  • the absorbance difference (Ab) at the time of blank reaction can be obtained by performing the same operation using the protease inactivated in the R1 reaction solution by inactivating the protease at 95 ° C for 10 minutes in advance. You.
  • Example 12 The same operation as 1-b) of Example 12 was performed using the buffer, surfactant, sodium chloride concentration and pH adjustment solution combination used in the R1 and R2 reaction solutions as shown in Table 23. Was done. Table 23 shows the measurement results.
  • the glycated hemoglobin sample used had an IFCC value of 16.7% converted at 5.9 mg / m 1 (the theoretical value of the glycated ⁇ -chain ⁇ terminal concentration was 30.5 ⁇ ). From the results in Tables 21 to 23, ⁇ during the protease reaction was
  • Example 12 the buffer of the R1 reaction solution was Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), the surfactant was 0.1% Triton X-100, and the sodium chloride concentration was 15 OmM. Similar operation except that 5/1 of 32 U / ml FOD 9231 ⁇ is added instead of 5 ⁇ 1 of 500 U / m 1 FOD 923 The measured value of FVH was 30. ⁇ . .
  • the FOD can be increased by using highly specific ketoamine oxidase.
  • the amount of FVH (the amount of glycated chain of glycated hemoglobin ⁇ end) can be measured specifically without the elimination by 2, which means that the amount of hemoglobin A1c can be measured accurately.

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Abstract

糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず酵素を用いて特異的に測定する方法、測定試薬キットを提供する。糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼをスクリーニングする。該スクリーニング法により得たプロテアーゼを用いることで糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず特異的に測定する方法、測定試薬キットを提供できる。本発明によれば、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず特異的に測定する事が可能になる。

Description

明細書 ヘモグロビン A 1 c測定法おょぴそれに用いる酵素とその製造法 技術分野
本発明は、 糠化ヘモグロビンの糖化された) 3鎖 N末端を、 分離操作せずに酵 素を用いて特異的に測定する方法、 測定試薬キット、 該特異的測定に用いるこ とができるプロテアーゼ、 その製造方法、 そのスクリーニング方法、 及ぴ該特 異的測定に用いることができるケトアミンォキシダーゼに関する。 背景技術
糖尿病の診断及び管理を行う上で糖化蛋白質の測定は非常に重要であり、 中 でもヘモグロビン A 1 cは近年の研究により 7%以下に値を管理すれば合併症 の発症および進展の危険率を有意に低下させることが証明され、 臨床の現場で は無くてはならない指標として多用されている。 ヘモグロビン A 1 cの定量法 としては、 通常、 電気泳動法、 イオン交換クロマトグラフィー法、 ァフィニテ ィクロマトグラフィー法、 免疫法及ぴ酵素法が知られている。 しかしながら電 気泳動法、 クロマトグラフィー法は高価な専用装置を必要とするうえに処理速 度が遅く、 多数の検体を処理する臨床検査には適していない。 また免疫法は分 析方法が比較的簡単で時間も短時間で済むことから近年急速に広まってきた力 抗原抗体反応を用いる為に、 再現性や共存物質の影響の点で必ずしも精度が良 くない点が問題となっている。
他方、 酵素法は専用装置が不必要であり、 処理速度が速く、 高精度、 簡便、 安価な定量方法として提案されている （特開平 8-336386号公報、 国際公 開第 97/13872号パンフレツト、 特開 2001—95598每公報、 特開 2000— 300294号公報、 C 1 i n i c a 1 Ch em i s t r y 49
(2) : 2.69-274 (2003))。
しかし、 へモグロビンは分子内リジンの ε-アミノ基と αおよび 鎖 Ν末端の パリンの α -アミノ基とに糖化を受けうるが、 へモグロビン A 1 cとはへモグロ ビン 鎖 N末端のバリンの α-ァミノ基が糖化されたへモグロビンであるから
(C l i n i c a l Ch em i s t r y a n d L a b o r a t o r y Me d i c i n e 40 (1) ： 78— 89 (2002) において国際的に標準 とされる定義)、 糖化へモグロビンの糖化された 鎖 N末端を分離操作せずにプ 口テアーゼおよぴケトアミンォキシダーゼを用いて特異的に測定するためには、 プロテアーゼ、 ケトァミンォキシダーゼのどちらかの酵素反応、 または両方の 酵素反応において特異性が必要とされる。 具体的には、 糖化ヘモグロビンには分子内リジン、 α鎖 N末端、 i3鎖 N末端 の 3種の糖化部位があることから、 糖化された β鎖 Ν末端のみを測定するため には、 以下のように特異性にしたがった組み合わせが必要となる。
すなわち、、 プロテアーゼを （P 1) 〜 （Ρ4)、 ケトァミンォキシダーゼを
(K1) 〜 （Κ5) に分類した場合、 く （P 1) と （K1) または （Κ2) ま たは （Κ3) または （Κ4) >、 < (Ρ 2) と （K1) または （Κ3) >、 く
(Ρ 3) と （K1) または （Κ2) >、 < (Ρ 4) と （K1) >、 < (Ρ 3) と （Κ5) と （Κ3) >、 < (Ρ 3) と （Κ5) と （Κ4) >の組み合わせが 必要となる。
それぞれに分類された酵素の性質は以下の通りである。
( Ρ 1 ) 糖化へモグ口ビンの糖化された β鎖 Ν末端からのみ糖化ァミノ酸およ び/または糖化ペプチドを切り出す （Ρ 2) 糖化ヘモグロビンの糖化された α および) 3鎖 Ν末端からのみ糖化ァミノ酸および/または糖化べプチドを切り出 す （Ρ 3) 糖化ヘモグロビンの糖化された 鎖 Ν末端および分子内リジンを含 む部位からのみ糖化ァミノ酸および/または糖化ぺプチドを切り出す （ Ρ 4 ) 糖化へモグロビンの糖化された αおよび) S鎖 Ν末端およぴ分子内リジンを含む 部位から糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドを切り出す （K1) 組み合 わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化アミ ノ酸および または糖化べプチドのうち、 糖化された 0鎖 Ν末端由来の糖化ァ ミノ酸および Ζまたは糖化ペプチドにのみ作用する （Κ2) 組み合わせて用い るプロテアーゼにより糖化へモグロビンから切り出された糖化ァミノ酸およぴ /または糖化ペプチドのうち、 糖化された αおよび 鎖 Ν末端由来の糖化アミ ノ酸および/または糖化ペプチドにのみ作用する （K3) 組み合わせて用いる プロテアーゼにより糖化へモグロビンから切り出された糖化アミノ酸およぴ Z または糖化ペプチドのうち、 糖化された 鎖 N末端由来および分子内リジンを 含む部位からの糖化アミノ酸および/または糖化ぺプチドにのみ作用する （K 4) 組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化へモグロビンから切り出され た糖化された αおよび 鎖 N末端由来およぴ分子內リジンを含む部位からの糖 化アミノ酸および Zまたは糖化ペプチドに作用する （K5) 組み合わせて用い るプロテアーゼにより糖化へモグロビンから切り出された糖化アミノ酸および /または糖化べプチドのうち、 糖化された β鎖 Ν末端由来の糖化ァミノ酸およ ぴ /または糖化べプチドには作用せずに分子内リジンを含む部位からの糖化ァ ミノ酸および Ζまたは糖化べプチドに作用する。
しかし、 これまで糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからケトアミ ンォキシダーゼの基質となる糖化アミノ酸および ζまたは糖化ペプチドを生じ させるプロテア一ゼは特開平 8- 336386号公報、 国際公開第 97/138 7 2号パンフレット、 特開 2 0 0 1—9 5 5 9 8号公報、 特開 2 0 0 1— 5 7 8 9 7号公報、 国際公開第 0 0 / 5 0 5 7 9号パンフレツト、 国際公開第 0 0 / 6 1 7 3 2号パンフレットおよび C 1 i n i c a 1 C h e m i s t r y 4 9 ( 2 ) : 2 6 9— 2 7 4 ( 2 0 0 3 ) など知られているが、 糖化ヘモグロビン 若しくはそのフラグメントから糖化された α鎖 Ν末端から糖化ァミノ酸または 糖化べプチドを実質的に切り出すことなく糖化された β鎖 Ν末端から糖化ァミ ノ酸および Ζまたは糖化ぺプチドを切り出すといった特異性を示した記載はな レ、。
また、 特開 2 0 0 0 - 3 0 0 2 9 4号公報で記載されているアンギオテンシン 変換酵素についてもその公知の基質特異性から 3鎖 N末端糖化トリぺプチドに 作用する可能性は推定されるが、 糖化へモグロビン若しくはそのフラグメント の糖化された ct鎖 N末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り 出すことなく糖ィヒされた β鎖 Ν末端から糖化アミノ酸およぴ Ζまたは糖化ぺプ チドを切り出すことを具体的に示すような記載、.例えば α鎖 Ν末端糖化トリべ プチドと ]3鎖 Ν末端糖化トリぺプチドに対するアンギオテンシン変換酵素の特 異性を定量して示した記載はない。
また、 特開 2 0 0 0 - 3 0 0 2 9 4号公報では糖化ヘモグロビンから j3鎖 Ν末 端糖化トリぺプチドを生成させる際用いたトリプシン、 プロリン特異ェンドプ 口テアーゼ、 カルボキシぺプチダーゼ Pが分子内リジンを含む部位や糖化され た α^^Ν末端由来の糖化ァミノ酸または糖化べプチドを生成していないことを 示した記載もない。
さらにまた、 本発明者らはアンギオテンシン変換酵素が通常の反応条件にお いては 鎖 N末端糖化トリぺプチドからフルクトシルバリンをほとんど切り出 さないことを確認しており、 アンギオテンシン変換酵素が α鎖 N末端から糖化 アミ 酸または糖化べプチドを実質的に切り出すことなく糖化された 鎖 Ν末 端から糖化アミノ酸および または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼであ るとは言えない。
以上のように、 糖化へモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化された α 鎖 Ν末端から糖化ァミノ酸または糖化べプチドを実質的に切り出すことなく糖 化された β鎖 Ν末端から糖化ァミノ酸およぴ Ζまたは糖化べプチドを切り出す、 つまり、 上記 （P 1 ) または （Ρ 3 ) の特異性をもつプロテアーゼ、 もしくは 上記 （P 1 ) または （Ρ 3 ) の特異性を達成するように工夫されたプロテア一 ゼの反応条件はこれまで知られていなかった。
また、 糖化へモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化された α鎖 Ν末端 から糖化ァミノ酸または糖化べプチドを実質的に切り出すことなく糖化された /3鎖 Ν末端から糖化アミノ酸および/または糖化べプチドを切り出すプロテア ーゼ、 つまり、 上記 （P I ) または （P 3 ) の性質をもつプロテアーゼのスク リーニング法としては、 一般的に次のようなものが想定される。 すなわち、 糖 化へモグロビンを α鎖 Ν末端が糖化されたものと /3鎖 Ν末端が糖化されたもの とに分離し、 これらを基質として用いたときに 鎖 Ν末端が糖化されたものか らのみ選択的に糖化アミノ酸および/または糖化べプチドを切り出すプロテア ーゼを、 プロテアーゼにより切り出された糖化アミノ酸および Ζまたは糖化べ プチドに作用するケトアミンォキシダーゼなどの酵素を用いて、 発色を指標に 探すというスクリーニング方法である。 しかし、 天然に存在するヘモグロビン 糖化物の糖化割合は約 5 %程度と糖化率が低いために、 a鎖 Ν末端が糖化され たもの又は J3鎖 N末端が糖化されたものに分離する収率が極めて悪いのみなら ず、 これらの物質を基質として該プロテアーゼ活性を検出することはへモグロ ビンの赤色ゆえに検出も困難であった。 このように、 簡便で有効なスクリー二 ング方法はこれまで知られていなかった。
一方、 ケトァミンォキシダーゼについては、 以下のものがある。
1 ) フザリウム属 （特開平 7-2 8 9 2 5 3号公報）、 ギべレラ属、 カンジダ 属 （特開平 6 - 4 6 8 4 6号公報）、 又はァスペルギルス属由来 （国際公開第 9 7 / 2 0 0 3 9号パンフレット） のであって、 おもに ε—l -デォキシフルクト シル- L-リジン (以下、 F Kともいう) もしくはそれを含むぺプチドとフルク トシノレパリン （以下、 F Vともいう） に作用するもの、
2 ) コリネパクテリゥム属 （特開昭 6 1— 2 8 0 2 9 7号公報）、 ぺニシリゥ ム属 （特開平 8— 3 3 6 3 8 6号公報）、 トリコスポロン属由来 （特開 2 0 0 0- 2 4 5 4 5 4号公報） であって、 おもに F Vに作用するもの、
また、 一般にプロテアーゼによりヘモグロビン 3鎖 Ν末端糠化ペプチドから F Vを切り出す工程は一般に反応がほとんど進行せず大量の酵素で長時間の反 応が必要といった欠点があるのでその欠点を捕うために、 ヘモグロビン A 1 c を測定する際に用いるケトァミンォキシダーゼとして、 プロテアーゼによりへ モグロビン 鎖 N末端糖化べプチドから切り出された糖化べプチドにも作用す るものが必要とされていた。 そして、 そのような
3 ) コリネバタテリゥム由来のケトァミンォキシダーゼの変異型 （特開 2 0 0 1— 9 5 5 9 8号公報） ゃァカエトミエラ属、 ァカエトミゥム属、 チェラビア 属、力エトミゥム属、 ゲラシノスボラ属、 ミクロァスカス属、 コニォ力エタ属、 ユウぺニシリゥム属 （欧州特許出願公開第 1 2 9 1 4 1 6号明細書） の 1 -デォ キシフルク トシノレ- L-パリルー L-ヒスチジン （以下、 F VHともいう） に作用 するケトァミンォキシダーゼが近年報告されている。
し力 し、 1 ) に属するケトァミンォキシダーゼは （Κ 4 ) の性質のものであ り、 2 ) に属するケトァミンォキシダーゼは （Κ 2 ) の性質のものであるが F VHに作用するという記載はなく、 3) に属するケトァミンォキシダーゼは、 FKに対する作用が最も低いユーぺニシリゥム属のケトァミンォキシダーゼに おいても F VHに対する作用を 100%としたときに 9. 78%も？¾：に対し て作用する （欧州特許出願公開第 1291416号明細書） ことから、 プロテ ァーゼにより糖化へモグロビンから切り出された分子内リジンを含む部位から の糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドに十分に作用すると考えられ、 ま たプロテアーゼにより糖化へモグロビンから切り出された糖化された α鎖 N末 端由来の糖化べプチド、 例えば 1 -デォキシフルクトシル- L-バリル- L-ロイシ ン （以下、 FVLともいう） に対する作用は記載されていないため、 （K1) ま たは （Κ2) または （Κ3) の性質をもつケトァミンォキシダーゼであるとは 言えない。
以上のように、これまで（K1)の性質、 (Κ2)かつ FVHに作用す.る性質、 (Κ3) の性質のケトァミンォキシダーゼはこれまで報告されていなかった。 また、 （K1) の性質、 （Κ2) かつ F VHに作用する性質のケトアミンォキ シダーゼを既知のケトァミンォキシダーゼをアミノ酸置換、 欠失、 揷入などに より改変することで、 作製することが考えられるが、 酵素の一次構造上のどの アミノ酸残基が FKもしくは F ΖΚに対する作用の低減に寄与しているのかは 分っていない。 従って、 任意のケトァミンォキシダーゼ遺伝子を改変し、 FK もしくは ε-l-デォキシフルクトシル- (α-ベンジルォキシカルボニル- L-リ ジン） （以下、 FZKともいう） に対する活性の低減を図ることはこれまででき なかった、 つまり、 （K1) の性質、 （Κ2) かつ FVHに作用する性質のケト アミンォキシダーゼを改変によつて作製することは知られていなかつた。
また、 FVHに作用することのできるケトァミンォキシダーゼの反応条件を 工夫することで、 F Κもしくは F Ζ Κへの活性を F V Ηへの活性と比較して、 その比率を低減させることは知られていなかった。
プロテアーゼとケトァミンォキシダーゼを用いて糖化へモグロビンに存在す る i3鎖 Ν末端のパリンの α-アミノ基の糖化を明確に分別して測定するために は、 プロテアーゼとケトァミンォキシダーゼの特異性を前述のように組み合わ せる必要があるが、 特開平 8- 336386号公報、 国際公開第 97/1387 2号パンフレツト、 特開 200 1— 95598号公報おょぴ C 1 i n i c a 1 Ch em i s t r y 49 (2)： 269— 274 (2003) においてはへモ グロビンの糖化された 鎖 N末端を特異的に測定しているという記述もなく、 HPLC法で得られた値もしくは得られうる値と開示された酵素法による測定 値とが良い相関を示すという記載があるのみである。 そして、 用いたプロテア ーゼとケトァミンォキシダーゼの特異性には言及することなく単にプロテア一 ゼで糖化へモグロビンを分解することにより切り出された糖化ァミノ酸および ノまたは糖化べプチドをケトアミンォキシダーゼにより検出しており、 分子内 リジンの ε—アミノ基と αおよび 鎖 Ν末端のバリンの α—アミノ基が糖化され たものを混合して検出していると考えられる。 さらに、 特開 2 0 0 1 -9 5 5 9 8号公報においてはプロテアーゼと F V Hに作用するケトァミンォキシダーゼ を用いて実施例において糖化へモグロビンを測定しているが、 操作において遠 心分離を行っており、 分離操作なく測定できるとの記載はない。
特開 2 0 0 0 - 3 0 0 2 9 4号公報においてはへモグロビン 鎖 Ν末端のバ リンの α -ァミノ基が糖化されたものだけを特異的に測定する酵素法が提案さ れている。 この方法においてはへモグロビン 鎖 Ν末端から 3番目のロイシン のカルボキシル基側を切断できるプロテアーゼ、 次いで f r u c t o s y 1 -V a 1 -H i s— L e uより H i s—L e uを切り取ることができるプロテアーゼ で順次処理することでフルクトシルパリンを生成させ、 ヘモグロビン 鎖 N末 端のパリンの α -ァミノ基が糖ィ匕された量を特異的に測定するとしている。 しか し、 この方法はプロテアーゼ反応を 2段階で行う必要があり、 第 1段階でのへ モグロビン /3鎖 Ν末端から 3番目のロイ ンのカルボキシル基側を切断するプ 口テアーゼ反応を厳密に制御することが困難である、 第 2段階のヘモグロビン β鎖 Ν末端糖化べプチドから α -糖化ァミノ酸を切り出す工程は一般に反応が ほとんど進行せず大量の酵素で長時間の反応が必要である、 といった欠点があ る上に実施例において示される方法は煩雑な限外ろ過という分離操作を 2回行 つており、 本願発明の方法で糖化へモグロビンの糖化された β鎖 Ν末端を分離 操作せず特異的に測定できるという記载はない。
欧州特許出願公開第 1 2 9 1 4 1 6号明細書においてはヘモグロビン A 1 c などの糖化タンパク質をモルシン、 AOプロテアーゼ、 ぺプチダーゼ （キッコ 一マン販売）、 カルボキシぺプチダーゼ Y、 プロチン P (大和化成販売） といつ たプロテアーゼにより F VHを遊離させ、 F VHに作用しうるォキシダーゼで 測定する方法が提案されている。 そして、 プロテアーゼにより生成する F が 問題となる場合は F Kに作用するフルクトシルァミンォキシダーゼで消去して から F V Hに作用しうるォキシダーゼで測定する、 または F V Hに作用して F Kに作用しにくいォキシダーゼを用いて測定することが提案されている。 しか し、 糖化へモグ口ビンの糖化された α鎖 Ν末端由来による糠化ァミノ酸およぴ または糖化ペプチドとの区別については言及されておらず、 提案された方法 により糖化ヘモグロビンの糖化された /3鎖 Ν末端を測定した実施例も明示され ておらず、 提案された方法が分離操作不要で可能であるとの記載もない。
上記のような糖化へモグロビンに関する測定法はこれまで知られていたが、 糖化ヘモグロビンの糖ィ匕された 鎖 Ν末端を分離操作せず酵素を用いて特異的 に測定する方法およぴ試薬キットはこれまで知られていなかつた。 発明の開示
本発明の課題は、 糖化ヘモグロビンの糖化された 鎖 N末端のみを、 分離操 作せずに特異的に測定できる方法、 測定試薬キット、 該特異的測定に用いるこ とができるプロテアーゼ、 その製造方法、 そのスクリーニング方法、 及ぴ該特 異的測定に用いることができるケトアミンォキシダーゼを提供することにある < 本発明者らは鋭意検討の結果、 まず、 糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグ メントの α鎖 Ν末端の糖化ァミノ酸または糖化べプチドを実質的に切り出すこ となく、 β鎖 Ν末端の糖化ァミノ酸および/または糖化ぺプチドを切り出すプ 口テアーゼのスクリーニング方法を考案した。 すなわち、 糖化ヘモグロビンの a鎖 N末端および 鎖 N末端に存在する糖化べプチドをプロテア一ゼの基質と して用いることで、 糖化へモグロビンの糖化された a鎖 N末端からケトァミン ォキシダーゼの基質となる糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出 すことなく、 糖化された ]3鎖 N末端からケトアミンォキシダーゼの基質となる 糠化アミノ酸および/または糖化べプチドを切り出すプロテアーゼ活性の検出 方法を考案した。
次に、 考案したスクリーニング方法により、 鎖 N末端糖化ペンタペプチド からケトァミンォキシダーゼの基質となる糖化ァミノ酸または糖化べプチドを 実質的に切り出すことなく、 i3鎖 N末端糖化べンタぺプチドからケトアミンォ キシダーゼの'基質となる糖化アミノ酸および Zまたは糖化べプチドを切り出す プロテアーゼを広くスクリーニングした結果、 バチラス ·エスピー由来ニュー トラルプロティナーゼ (東洋紡製） などの巿販プロテアーゼ製剤ゃパチラス . エスピー、 エアロモナス ' ヒドロフイラ、 リゾパクター 'ェンザィモゲネスな どの微生物が産生するプロテアーゼに当該プロテアーゼ反応を見出した。 .
加えて、 これらのプロテナーゼのうち、 エアロモナス ' ヒドロフイラ、 リゾ パクター ·ェンザィモゲネスが産生するプロテアーゼは既知のエラスターゼと 相同性を示した。 従来、 エラスターゼは、 その基質特異性としてロイシン、 ィ ソロイシン、 パリン、 ァラニンの C末端側のペプチド結合を切断する酵素とし て知られている。 本発明では、 エラスターゼが 1-デォキシフルクトシル- L -パ リスレ— L—ヒスチジスレ- L—口イシルー L—トレオニル—L—プロリン （以下、 へモグ ロビン 鎖 N末端糖化ペンタペプチドともいう） のロイシンの C末端側ではな く、 Ν末端側のペプチド結合を切断し、 F V Hを遊離することをはじめて明ら かにした。
次に、 当該プロテアーゼが、 糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの 糖化された α鎖 Ν末端から糖化ァミノ酸または糖化べプチドを切り出すことな く糖化された β鎖 Ν末端から糠化ァミノ酸およぴ Ζまたは糖化べプチドを切り 出すのみならず、 糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントから F Kおよび /または F Kを含む糖化ペプチドをも切り出す場合においては、 糖化された 鎖 Ν末端由来の糖化べプチドに作用せずに F Κおよび/または F Κを含む糖化 ぺプチドに作用するケトァミンォキシダーゼであらかじめ F Kおよび/または F Κを含む糖化べプチドを消去することで糖化へモグロビン若しくはそのフラ グメントの糖化された /3鎖 Ν末端を分離操作せず酵素を用いて特異的に測定す る方法を完成するに至った。
さらに、 当該プロテアーゼが、 糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメント の糖化された α鎖 Ν末端から糖ィ匕アミノ酸または糖化べプチドを切り出すこと なく糖化された β鎖 Ν末端から糖化ァミノ酸および/または糖化べプチドを切 り出すのみならず、 糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントから F Kおよ ぴ Ζまたは F Kを含むペプチドをも切り出す場合において、.ケトァミンォキシ ダーゼの F Ζ Κに対する反応性が大きく低減できる反応条件を見出し、 また、 F V Hに対する作用を 1 0 0 %としたとき F Ζ Κに対する作用が 5 %以下とい うこれまでにない高特異性のケトアミンォキシダーゼを作製して用いることに より、 糖化された β鎖 Ν末端から切り出された糖化アミノ酸および/または糖 化ペプチドのみを特異的に測定できた。 すなわち、 カーブラリア ·クラベータ 由来ケトァミンォキシダーゼ遺伝子の 5 8番目と 6 2番目のアミノ酸置換が F Ζ Κへの作用低減に寄与していることを発見し、 これにもとづき該ォキシダー ゼを作製し用いることで、 糖化へモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化 された 鎖 Ν末端を分離操作せずに酵素を用いて特異的に測定する方法を完成 するに至った。
さらにまた、 当該プロテアーゼによる糖ィ匕ヘモグロビン若しくはそのフラグ メント分解の反応条件について、
i ) 当該プロテアーゼと組み合わせて用いるケトァミンォキシダーゼが作用 することのできる F Kおよび/または F Kを含む糖化ぺプチドを切り出さなレ、、 力つ、
i i ) 当該プロテアーゼと組み合わせて用いるケトァミンォキシダーゼが作 用することのできる糖化された α鎖 N末端由来の糖ィヒアミノ酸または糖化ぺプ チドを切り出さない、
かつ、
i i i ) 当該プロテアーゼと組み合わせて用いるケトァミンォキシダーゼが 作用することのできる糖化された β鎖 Ν末端由来の糖化ァミノ酸または糖化べ プチドを切り出す、 反応条件を見出した。 これにより、 糖化ヘモグロビン若し くはそのフラグメントの糖化された 鎖 Ν末端を分離操作せず酵素を用いて特 異的に測定する方法を完成するに至つた。 すなわち、 本発明は、 以下の構成を有する。
(1) 糖化ヘモグロビンの糖化された α鎖 N末端から、 糖化アミノ酸または 糖化ぺプチドを実質的に切り出すことなく、 糖化へモグロビンの糖化された 13 鎖 Ν末端から糖ィヒアミノ酸およびノまたは糖化ぺプチドを切り出す、 プロテア ーゼ。
(2) 糖化へモグロビンの糖化された α鎖 Ν末端を含むフラグメントから、 糖化アミノ酸または糖化べプチドを実質的に切り出すことなく、 糖化へモグロ ビンの糖化された i3鎖 Ν末端を含むフラグメントから糖化アミノ酸および Zま たは糖化べプチドを切り出す、 プロテアーゼ。
( 3 ) 糖化へモグ口ビンの糖化された β鎮 Ν末端から糖化ァミノ酸および Ζ または糖化べプチドを切り出す反応を 100 %としたときに糖化へモグロビン の糖化された 鎖 Ν末端から糖ィヒアミノ酸または糖化べプチドを切り出す反応 が 10%以下である、 プロテアーゼ。
(4) 糖化へモグロビンの糖ィ匕された 鎖 Ν末端又は糖ィヒへモグロビンの糖 化された β 鎖 Ν末端を含むフラグメントから切り出される糖化ペプチドが 1- デォキシフルクトシル -L -バリル- L-ヒスチジンである上記 (1) 〜 (3) の いずれかに記載のプロテアーゼ。
(5) 糖化へモグロビンの糖ィ匕された α鎖 Ν末端又は糖ィ匕へモグロビンの糖 化された α鎖 Ν末端を含むフラグメントから実質的に切り出されない糖ィヒアミ ノ酸が 1-デォキシフルクトシル- L -パリンであり、 実質的に切り出されない糖 化ぺプチドが 1 -デォ +キシフルクトシルー L—パリル— L—ロイシンである上記
(1),〜 （4) のいずれかに記載のプロテアーゼ。
(6) リゾパクター属由来のプロテアーゼである上記 （1) 〜 （5) のいず れかに記載のプロテアーゼ。 .
(7) パチラス. エスピー ASP— 842 (FERM BP— 08641) 又はエアロモナス. ヒドロフイラ NBRC 3820由来のプロテアーゼであ る上記 （1) 〜 （5) のいずれかに記載のプロテアーゼ。
(8) プロテアーゼがメタ口プロテアーゼ、 ニュートラルプロテアーゼ、 ま たはエラスターゼのいずれかである上記 （1) 〜 （7) の'いずれかに記載のプ 口テア一ゼ0
(9) タンパク質又はべプチドにおけるロイシンの N末端側のぺプチド結合 を切断するエラスターゼ。
(10) リゾパクター 'ェンザィモゲネス YK—366 (FERM BP—1 0010) 菌株。
(1 1) バチラス 'エスピー ASP— 842 (FERM BP— 08641) 菌株。 (1 2) 上記 （6) に記載のプロテアーゼを製造する方法であって、 以下の (a) 及び （b) の工程を含むプロテアーゼを製造する方法。
(a) リゾパクター属に属する菌を培養液にて培養する。
(b) 培養液からプロテアーゼを抽出する。
(1 3) 上記 （7) に記載のプロテアーゼを製造する方法であって、 以下の (a) 及び （b) の工程を含むプロテアーゼを製造する方法。
(a) パチラス 'エスピー AS P— 842 (FERM B P— 08 64 1) 又は エアロモナス · ヒドロフイラ NBRC 3820を培養液にて培養する。
(b) 培養液からプロテアーゼを抽出する。
(14) 以下の （A) の性質を有するケトアミンォキシダーゼ。
(A) ε一 1ーデォキシフルクトシノレ— (α-ベンジルォキシカルボニル- L-リジ ン） に対する反応性が 1 -デォキシフルクトシル- L-バリル- L-ヒスチジンに対 する反応性に比べて 5%以下であること。
(1 5) さらに以下の （Β) 及び （C) の性質を有する上記 （1 4) に記載 のケトアミンォキシダーゼ。
(Β) 配列番号 1記載のアミノ酸配列と少なくとも 75%の相同性を有するァ ミノ酸配列で構成されること。
(C) 配列番号 1記載のアミノ酸配列において少なくとも 58番目もしくは 6 2番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていること。
(1 6) (C) のアミノ酸置換は 58番目がパリン、 スレオニン、 ァスパラギ ン、 システィン、 セリン、 ァラニン、 6 2番目がヒスチジンへの置換である上 記 （1 5) に記載のケトアミンォキシダーゼ。
(1 7) 上記 （1 4) 〜 （1 6) のいずれかに記載のケトアミンォキシダー ゼのァミノ酸配列をコードする遺伝子。
(1 8) 上記 （1 7) に記載の遺伝子を含有するケトァミンォキシダーゼ発 現ベクター。
(1 9) 上記 （1 8) に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
(20) 糖化ヘモグロビンの糖化された) 3鎖 Ν末端を、 分離操作せず酵素を 用いて特異的に測定する方法。
(2 1) 酵素が （i ) プロテアーゼを含む上記 （20) に記載の測定方法。 (22) 酵素はさらに （i i ) ケトァミンォキシダーゼを含む上記 （2 1) に記載の測定方法。
(23) 以下の （i i i ) および/または （i v) の反応工程を経由して特 異的に測定する上記 （22) に記載の測定方法。
( i i i ) ( i ) のプロテアーゼが糖化ヘモグロビンから実質的に、 （i i ) の ケトァミンォキシダーゼが作用する ε- 1 -デォキシフルクトシル- L-リジンお よびノまたは ε-l-デォキシフルクトシル- L -リジンを含む糖化ぺプチドを切 り出すことなく、 糖化へモグロビンの糖化された β鎖 Ν末端からから糖ィ匕アミ ノ酸およぴ Ζまたは糖化べプチドを切り出す反応工程。
( i v) ( i i )のケトァミンォキシダーゼの ε—l -デォキシフルクトシルー（α -べンジルォキシカルボニル -L-リジン） に対する反応性が 1-デォキシフルク トシル -L -バリル- L-ヒスチジンに対する反応性の 30 %以下となる反応工程。
(24) (i i i) の反応工程が pH5. 0〜6. 0の反応条件下である上記 (23) に記載の測定方法。
(25) ( i V) の反応工程が pH5. 5〜6. 5の反応条件下である上記（ 2 3) 又は （24) に記載の測定方法。 .
(26) ( i ) のプロテアーゼが上記 (1) 〜 （8) のいずれかに記載のプロ テアーゼである、 上記 （21) 〜 （25) のいずれかに記載の測定方法。
(27) ( i i ) のケトァミンォキシダーゼが糖化ヘモグロビンの糖化された ]3鎖 N末端からプロテアーゼにより切り出された糖ィヒアミノ酸および/または 糖ィ匕ペプチドに作用するケトァミンォキシダーゼである上記 （22) 〜 （26) のいずれかに記載の測定方法。
(28) ケトァミンォキシダーゼがカーブラリァ属由来である上記 (27) に記載の測定方法。
(29) ( i i ) のケトアミンォキシダーゼが以下の (a) 及ぴ (b) の 2種 類である上記 （22) 〜 （28) のいずれかに記載の測定方法。
( a ) 糖化へモグ口ビンの糖化された /3鎖 N末端からプロテアーゼにより切り 出された糖ィ匕アミノ酸,および/または糖化ペプチドに作用するケトアミンォキ シグーセ。
(b) 糖化へモグロビンの糖化された ]3鎖 N末端からプロテアーゼにより切り 出された糖化ァミノ酸および zまたは糖化べプチドに実質的に作用することな く、 ε- 1-デォキシフルクトシル -L—リジンおよび/または ε-l—デォキシフ ルクトシル- L-リジンを含む糖化べプチドには作用するケトアミンォキシダー ゼ。 '
(30) (a) のケトァミンォキシダーゼがカーブラリア属由来である及び/ 又は （b) のケトァミンォキシダーゼがフザリウム属由来である上記 （29) に記載の測定法。 '
(31) ( i i ) のケトァミンォキシダーゼが上記 （14) 〜 （16) のいず れかに記載のケトァミンォキシダーゼである、 上記 （22) 〜 （26) のいず れかに記載の測定法。
(32) 糖ィ匕ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖ィ匕された 鎖 N末 端から糖ィヒアミノ酸または糖ィヒぺプチドを実質的に切り出すことなく、 糖化さ れた 鎖 N末端から糖ィヒアミノ酸および/または糖化ペプチドを切り出すプロ テアーゼをスクリーユングする方法であって、 長さが 3アミノ酸から 20アミ ノ酸であるヘモグロビン α鎖 Ν末端糖化べプチドぉよび長さが 3アミノ酸から 20アミノ酸であるヘモグロビ 鎖 Ν末端糖化ペプチドを用いるスクリー二 ング方法。
(33) ヘモグロビン 鎖 Ν末端糖化べプチドぉよぴへモグロビン 鎖 Ν末 端糖化ペプチドの長さが 5アミノ酸である上記 （32) に記載のスクリーニン グ方法。
(34) 糖化ヘモグロビンの糖化された 鎖 Ν末端を、 分離操作せずに特異 的に測定する、 以下の ）、 (i i) を含んでなる試薬キット。
( i) プロテアーゼ
( i i) 上己 （14) に記載のケトァミンォキシダーゼ
このような本発明によれば、 糖化ヘモグロビンの糖化された /3鎖 N末端のみ を分離操作せず特異的に測定できる方法、 測定試薬キット、 該特異的測定に用 られるプロテアーゼ、該プロテアーゼの製造方法若しくはスクリーニング方法、 及び該特異的測定に用いることができるケトアミンォキシダーゼを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ケトアミンォキシダーゼのァミノ酸配列における相同性を示す図 である。
図 2は、 パチラス ·エスピ一 AS P 842由来プロテア^"ゼの至適: H を示す図である。
図 3は、 パチラス ·エスピ一 AS P 842由来プロテアーゼの p H安定 性を示す図である。
図 4は、 パチラ ·エスピ一 AS P 842由来プロテア一ゼの至適温度 を示す図である。
図 5は、 パチラス ·エスピ一 AS P 842由来プロテア一ゼの熱安定性 を示す図である。
図 6は、 エアロモナス · ヒドロフイラ NBRC 3820由来プロテア一 ゼの至適 Hを示す図である。
図 7は、 エア口モチス ·ヒドロフイラ NBRC 3820由来プロテア一 ゼの p H安定性を示す図である c
図 8は、 エアロモナス · ヒドロフイラ NBRC 3820由来プロテア一 ゼの至適温度を示す図である。
図 9は、 エア口モナス · ヒドロフイラ NBRC 3820由来プロテア一 ゼの熱安定性を示す図である。 図 1 0は、 リゾパクター'ェンザィモゲネス YK— 3 6 6由来プロテア一 ゼの至適 p Hを示す図である。
図 1 1は、 リゾパクター ·ェンザィモゲネス YK— 3 6 6由来プロテア一 ゼの P H安定性を示す。
図 1 2は、 リゾパクター ·ェンザィモゲネス YK— 3 6 6由来プロテア一 ゼの至適温度を示す図である。
図 1 3は、 リゾパクター'ェンザィモゲネス YK— 3 6 6由来プロテア一 ゼの熱安定性を示す図である。
図 1 4は、 プラスミド p PO S FOD 9 2 3の制限酵素地図を示す図であ る。
図 1 5は、 吸光度差 Δ A sと FVH濃度との関係を示す図である。
図 1 6は、 プロテァーゼ反応の時間と得られる測定値との関係を示す図で める。
図 1 7は、 糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで分解後、 FOD 2で糖化リ ジンおょぴ糖化リジンを含むペプチド由来のシグナルを消去してから FOD 9 23で FVH量を測定する場合の測定スキームを示す図である。
図 1 8は、 糖化ヘモグロビンをプロ^アーゼで分解後、 糖化リジンおよび 糖化リジンを含むペプチド由来のシグナルを消去することなく FOD 9 2 3で FVH量を測定する場合の測定スキームを示す図である。
図 1 9は、 糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで分解後、 糖化リジンおょぴ 糖化リジンを含むペプチド由来のシグナルを消去することなく FOD 9 2 3M で FVH量を測定する場合の測定スキームを示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
くアマドリ化合物 >
本突明に於けるアマドリ化合物とは、 タンパク質等のァミノ基をもつ化合物 とグルコース等のアル.デヒド基を持つ化合物がメイラード反応により、 生じる 一般式 - (CO) -CHR-NH- (Rは、 水素原子か水酸基を示す） で表される ケトアミン構造を有する化合物のことを指す。 アマドリ化合物には糖化へモグ 口ビンや糖化アルブミンのような糖化タンパク質ゃぺプチドが糖化された糖化 ペプチド等が含まれる。
く糖化ヘモグロビン >
へモグロビンがメイラード反応により糖化されたアマドリ化合物のことをさ し、 a鎖及ぴ β鎖 Ν末端のパリンの α-アミノ基や分子内のリジンの ε -アミノ 基が糖化されていると言われてレヽる。 糖化へモグロビンのフラグメントとは糖 化へモグロビンが分解されることでできるぺプチドのことをいう。
<へモグロビン A 1 c >
国際的に標準とされる定義において、 ヘモグロビン A 1 cとはヘモグロビン jS鎖 N末端のパリンの α-ァミノ基が糖化されたヘモグロビンであるとされて レヽる (C l i n i c a l Ch emi s t r y a n d し a b o r a t o r y Me d i c i n e 36 (5) ： 299-308 (1998))。
<特異的に >
糖化ヘモグロビンの糖化された i3鎖 N末端を特異的に測定するといつた表現 は、 糖化へモグロビンの糖化量を測定して得る値のうち、 80 %以上、 '望まし くは 90%以上、 更に望ましくは 95%以上が、 ヘモグロビン 3鎖 N末端にあ るパリンの α—ァミノ基の糖化由来である場合に用いる。
<糖化アミノ酸、 糖化ペプチド >
プロテアーゼが糖化へモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化された α 鎖 Ν末端から糖化ァミノ酸または糖化ぺプチドを実質的に切り出すことなく、 といった表現のなかでの糖化アミノ酸とは 1-デォキシフルクトシル- L-パリ ンであり、 糖化ペプチドとはヘモグロビンの α鎖 Ν末端から長さが 20ァミノ 酸以下のペプチドであって Ν末端のバリンが 1-デォキシフルクトシル- L -バ リンになっているもののうちプロテアーゼと組み合わせて用いるケトアミンォ キシダーゼにより検出されるもののことであり、 例えばカーブラリ了 ·クラべ ータ ΥΗ923 (FERM BP— 10009) 由来のケトアミンォキシダー ゼを組み合わせて用いる場合は 1-デォキシフルクトシル- L -パリル- L-ロイ シンのことである。
プロテアーゼが糖化へモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化された 鎖 N末端から糖化アミノ酸または糖化べプチドを切り出す、 といった表現のな かでの糖化ァミノ酸とは 1 -デォキシフルクトシル- L -パリンであり、糖化ぺプ チドとはへモグロビンの β鎖 Ν末端から長さが 20ァミノ酸以下のぺプチドで あって Ν末端のパリンが 1 -デォキシフルクトシル- L-パリンになっているも ののうちプロテアーゼと組み合わせて用いるケトァミンォキシダーゼにより検 出されるもののことである。例えば、カーブラリ了 ·クラベータ ΥΗ923 (F ERM BP— 10009) 由 5feのケトァミンォキシダーゼを組み合わせて用 いる場合は 1 -デォキシフルクトシル- L-バリノレ- L-ヒスチジンのことである。 プロテアーゼが糖化ヘモグロビンから ε— 1 -デォキシフルクトシル- L—リジン を含む糖化べプチドを切り出す、 といった表現における糖化べプチドとは長さ が 50アミノ酸以下の糖化ペプチドのことである。
なお、 カーブラリア 'クラベータ ΥΗ923 (FERM BP— 1000 9) は、 平成 15年 2月 12日、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央 第 6の独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した。 く実質的に >
プロテアーゼ反応において、 糖化されたひ鎮N末端から糖化アミノ酸または 糖化ぺプチドを実質的に切り出すことなく糖化された β鎖 Ν末端から糖化ァミ ノ酸および Ζまたは糖化ペプチドを切り出す、 といった表現は、 糖化された 3 鎖 N末端から糖化アミノ酸および Zまたは糖化べプチドを切り出す反応性を 1 00 %としたときに、 糖化された c鎖 N末端から糖化ァミノ酸または耱化ぺプ チドを切り出す反応性が 10 %以下、望ましくは 1 %以下、更に望ましくは 0. 1%以下であることを言う。 ただし、 上記プロテアーゼ反応は切り出された生 成物をケトァミンォキシダーゼ好ましくはカーブラ Vァ ·クラベータ YH92 3 (FERM B P— 10009) 由来のケトァミンォキシダーゼまたはフザ リゥム .ォキシスポラム由来のケトァミンォキシダーゼ （旭化成ファーマ製） を用いて検出することによるものとする。
ケトァミンォキシダーゼ反応において、 糖化された i3鎖 N末端からプロテア ーゼにより切り出された糖化アミノ酸および/または糖化べプチドに実質的に 作用することなく ε -糖化アミノ酸には作用する、 といった表現は、 ε -糖化ァ ミノ酸に対する反応性を 100%とした場合に、 糖化された 鎖 Ν末端からプ 口テアーゼにより切り出された糖化ァミノ酸および/または糖化べプチドに対 する反応性が 10 %以下、 好ましくは 8 %以下、 さらに好ましくは 1 %以下、 最も好ましくは 0. 1%以下であることを言う。 また、 ケトアミンォキシダー ゼ反応において ε -糖化ァミノ酸に実質的に作用することなく糖化された J3鎖 Ν末端からプロテアーゼにより切り出された糖化ァミノ酸および Ζまたは糖化 ペプチドには作用する、 といった表現は、 糖化された 3鎖 Ν末端からプロテア ーゼにより切り出された糖化アミノ酸および/または糖化べプチドに対する反 応性を 100%とした場合に、 ε-糖化アミノ酸に対する反応性が 8%以下、 望 ましくは 1%以下、 更に望ましくは 0. 1%以下であることを言う。 ただし、 ケトアミンォキシダーゼの反応は生成する過酸化水素を検出することによるも のとする。
くケトァミンォキシダーゼ >
ケトァミン構造をもつ化合物に作用して過酸化水素を発生させる酵素のこと で、 別名フルクトシルァミンォキシダーゼともいう。
く ε- 1 -デォキシフルクトシ/レ- （α -ベンジルォキシカルポニル- L-リジン） に対する反応性が 1-デォキシフルクトシ/レ- L-バリル- L-ヒスチジンに対す る反応性に比べて 5 %以下であるケトアミンォキシダーゼ>
ケトァミンォキシダーゼの ε-l -デォキシフルクトシル- (α -べンジルォキ シカルポニル -L-リジン） （以下、 FZKともいう） に対する反応性が 1 -デォ キシフルクトシル- L -パリル- L-ヒスチジン （以下、 FVHともいう） に対す る反応性に比べて 5 %以下であるとは、 反応液 （ 50 mM T r i s -塩酸緩衝 液 （pH7. 5)、 0. 1% Tr i t o nX— 100、 0. 03% 4-ァミノ アンチピリン、 0. 02% TOOS、 5U/m 1 パーォキシダーゼ、 2m M FZKまたは FVH) 200 μ 1にケトァミンォキシダーゼ液 20 μ 1を 添加し、 37でで 5分間反応させた後、 0. 5 % S D Sを 0. 5 m 1加えて から 555 nmの吸光度 （A1) を測定し、 さらに F Z Kおよび F VHを含ま ない反応液で同様の操作を行って測定した吸光度 （Ab) との差 （Al- Ab) から反応性を測定したときに、 その反応性の比率が 5 %以下であることをいう。 ぐ分離操作 >
分離操作とは、 全血検体または血球溶血検体などをサンプルとして、 サンプ ル中の糖化へモグロビンを測定する一連の測定工程の過程において、 カラムク 口マトグラフィー操作、 膜ろ過操作、 吸着分離操作、 沈殿分離操作など糖化へ モグロビンもしくは糖化へモグロビンから派生する物質の純度、 濃度を上げる ために行う操作のことをいう。
糖化へモグロビンの糖化された j3鎖 N末端を、 分離操作せずに酵素を用いて 特異的に測定するためには、 用いる酵素の反応において糖化へモグロビン中に ある分子内リジン、 α鎖. N末端、 3鎖 Ν末端の 3種の糖化部位のうち 鎖 Ν末 端の糖化部位のみに特異性がなければならない。 そのような特異性を出すため に用いる酵素としては、 1種類の酵素でも複数の種類の酵素を組み合わせたも のでもよい。 例えば、 プロテアーゼで糖化ヘモグロビンを分解し、 切り出され た糖ィヒされた 鎖 Ν末端由来の糖化アミノ酸および または糖化べプチドに作 用する酵素であるォキシダーゼ、 デヒドロゲ^ "一ゼ、 キナーゼなどを組み合わ せて特異性を出せばよい。 そして、 プロテアーゼおよびケトアミンォキシダ一 ゼを用いて糖化ざれた) 3鎖 Ν末端のみを測定するためには、 以下のように特異 性にしたがった組み合わせが必要である。
すなわち、プロテアーゼを （Ρ 1) ~ (Ρ 4)、ケトァミンォキシダーゼを（Κ 1) 〜 （Κ5) に分類した場合、 く （P 1) と （K1) または （Κ2) または
(Κ3) または （Κ4) >、 < (Ρ 2) と （K1) または （Κ3) >、 < (Ρ 3) と （K1) または （Κ2) >、 く (Ρ 4) と （K1) >、 く (Ρ 3) と （Κ 5) と （Κ3) >、 く (Ρ.3) と （Κ5) と （Κ4) >の組み合わせが必要で ある。 それぞれに分類された酵素の性質は以下の通りである。
(Ρ 1) 糖化ヘモグロビンの糖化された 鎖 Ν末端からのみ糖化アミノ酸およ び/または糖化ぺプチドを切り出す
(Ρ 2) 糖化ヘモグロビンの糖化された αおよび 鎖 Ν末端からのみ糖化アミ ノ酸およぴノまたは糖化べプチドを切り出す ( P 3 ) 糖化へモグロビンの糖化された 3鎖 N末端および分子内リジンを含む 部位からのみ糖化ァミノ酸および Zまたは糖化べプチドを切り出す
( P 4 ) 糖化へモグロビンの糖化された および ]3鎖 N末端およぴ分子内リジ ンを含む部位から糖化ァミノ酸および/または糖化べプチドを切り出す
(K 1 ) 組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化へモグロビンから切り出 された糖化ァミノ酸および/または糖化べプチドのうち、 糖化された β鎖 Ν末 端由来の糖化アミノ酸および Ζまたは糖化べプチドにのみ作用する
( Κ 2 ) 組み合わせて用レ、るプロテアーゼにより糖化へモグロビンから切り出 された糖化ァミノ酸および Ζまたは糖化べプチドのうち、 糖化された α;および i3鎖 Ν末端由来の糖ィ匕アミノ酸および/または糖化べプチドにのみ作用する
(K 3 ) 組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化へモグロビンから切り出 された糖化ァミノ酸および Zまたは糖化ペプチドのうち、 糖化された β鎖 Ν末 端由来およぴ分子内リジンを含む部位からの糖化アミノ酸および/または糖化 ぺプチドにのみ作用する
(Κ 4 ) 組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化へモグロビンから切り出 された糖化された αおよび3鎖 Ν末端由来および分子内リジンを含む部位から の糖化アミノ酸および Zまたは糖化ぺプチドに作用する
(K 5 ) 組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖ィ匕へモグロビンから切り出 された糖化ァミノ酸および/または糖化べプチドのうち、 糖化された β鎖 Ν末 端由来の糖化アミノ酸および または糖化ペプチドには作用せずに分子内リジ ンを含む部位からの糖ィヒアミノ酸および/または糖化べプチドに作用する <プロテアーゼのスクリーニング >
そして、 本発明者らは鋭意検討の結果、 （P 1 ) もしくは （Ρ 3 ) の特異性を もつプロテアーゼを得るスクリーユング方法としては、 ヘモグロビン a鎖 Ν末 端糖化べプチドおよびへモグロビン 鎖 N末端糖化べプチ を基質として用い、 ヘモグロビン 鎖 Ν末端糖化ぺプチドを基質としたときにのみ糖化アミノ酸お よび/または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼを選択する方法を考案した。 このときに用いる a鎖 N末端糖化ペプチドおよび J3鎖 N末端糖化ペプチドの長 さは特に限定されないが、 長さ 3アミノ酸から 2 0アミノ酸の糖化ペプチドで スクリーニング可能であることを見出した。 その由来は化学合成であっても良 いし、 糖化へモグロビン等の天然物由来であっても良い。
具体的な 1例として、 /3鎖 N末端糖化ペプチドとして 1 -デォキシフルクトシ ルー L—パリル— L—ヒスチジル—L—ロイシル— L—トレオニル— L—プロリン （ぺプ チド研究所製：以下、 ）3糖化ペンタペプチドともいう） を、 a鎖 N末端糖化べ プチドとして 1ーデォキシフルクトシルー L-バリル—L—口イシルー Lーセリル—L 一プロリル- L—ァラニン （ペプチド研究所製：以下、 a糖化ペンタペプチドとも いう） が挙げられ、 これらの糖化ペンタペプチドを基質として用いる場合、 糖 化アミノ酸、 糖化ジペプチド、 糖化トリペプチドまたは糖化テトラペプチドが プロテアーゼにより切り出される可能性がある。 そして、 α鎖 N末端糖化ぺプ チドおよび /3鎖 Ν末端糖化べプチドからプロテアーゼにより切り出された糖化 アミノ酸および/または糖化べプチドは、 α鎖N末端糖化べプチドおよび 3鎖 N末端糖化べプチドに実質的に作用することなく切り出された糖化ァミノ酸お よびノまたは糖化べプチドには作用する酵素を用いて検出すればよく、 そのよ うな酵素としてォキシダーゼ、 デヒドロゲ "一ゼ、 キナーゼが挙げられる。 例えば、 ォキシダーゼとしてはケトァミンォキシダーゼがあり、 ケトァミン ォキシダーゼとしてはァカエトミエラ属、 ァカエトミゥム属、 チェラビア属、 力エトミゥム属、 ゲラシノスポラ属、 マイクロァスカス属、 コニォ力エタ属、 ユーぺニシリウム属 （以上、 欧州特許出願公開第 1.291416号明細書）、 コ リネパクテリゥム属 （特開昭 61-268178号明細書）、 ァスペルギルス属 (特開平 3— 155780)、ぺニシリゥム属（特開平 4一 4874号明細書)、 フザリゥム属 （特開平 5—192193号公報、 特開平 7— 289253号公 報、 特開平 8—154672号公報）、 ギべレラ属 （特開平 5— 192153号 公報、 特開平 7— 289253号公報、）、 カンジダ属 （特開平 6— 46846 号公報、）、 ァスペルギルス属 （特開平 10— 33177号公報、 特開平 10— 33180号公報）、ネオコスモスポラ 'バシンフエクタ （NBRC 7590)、 コニオケチジゥム ·サポリ (ATCC 36547)、 ァルスリニゥム 'エスピー TO 6 (FERM P—19211)、 ァルスリニゥム ·ファェォスペルマム （N BRC 31950)、ァルスリニゥム 'ファェォスペルマム（NBRC6620)、 ァルスリニゥム .ジャポニカム （NBRC 31098)、 ピレノケータ 'エスピ 一 YH807 (FERM P— 19210)、 ピレノケータ ·ゲンチアニコラ （M AF F 425531), ピレノケータ 'テレストリス （NBRC 30929)、 レプトスフエリア .ノドラム （分生芋世代名フォーマ 'ヘンネベルギー） （NB RC7480)、 レプトスフエリア · ドリオラム （J CM 2742)、 レプトス フエリア ·マクランス (分生子世代名フォーマ . リンガム） (MAFF 7265 28)、 プレオスポラ 'ハーブラム （NBRC32012)、 プレオスポラ 'ベ タエ （分生子世代名フォーマ'ベタエ） （NBRC 5918)、 オフィオボラス · へルポトリカス（NBRC6158)、カーブラリア'クラベータ YH 923 (F ERM BP— 10009) 由来のもの、 およびそれらの変異型の酵素が挙げ られる。
カーブラリア ·クラベータ YH923 (FERM BP— 10009) 由来 のケトァミンォキシダーゼは基質特異性が FVHに対して 100%とすると 1 -デォキシフルクトシル- L -バリル- L-ヒスチジル -L -口イシン （以下、 3糖化 トリペプチドまたは FVHLともいう） に対して 0. 0 9%、 1ーデォキシフル クトシル— L—パリル- L—ヒスチジル—L—口イシルー L-トレオニン （以下、 J3糖 化テトラペプチドまたは FVHLTともいう） に対して 0. 000 9%、 糖 化ペンタペプチドに対して 0%、 1—デォキシフルクトシルー L—バリルー L 一口イシン （以下、 FV.Lともいう） に対して 3. 4%、 a 糖化ペンタぺプチ ドに対して 0. 0 1%であるから、 このケトァミンォキシダーゼを用いると 糖化べンタペプチドから F V Hを切り出すプロテァーゼ活性および 糖化べン タペプチドから FVLを切り出すプロテアーゼ活性を検出できる。 ォキシダー ゼを用いてプロテアーゼにより切り出された糖化アミノ酸および Zまたは糖化 ペプチドを検出する場合には生成した過酸化水素の量を電極、 発光、 蛍光、 吸 光などで検出することができるが、 パーォキシダーゼと色原体を用いて吸光検 出することが簡便であり、 例えば色原体として 4-ァミノアンチピリン （和光純 薬工業製） および TODB (同仁化学研究所製） をもちいて 540〜5 70 n mにおける吸光度変化を測定すればプロテアーゼ活性を簡便に確認ができる。 上記スクリーニング方法により得られた （P 1) もしくは （P 3) の特異性 をもつプロテアーゼとしてバチラス属、 エア口モナス属、 リゾパクター属等の 微生物由来のプロテアーゼが挙げられ、 より具体的には例えばパチラス. エス ピー由来のニュートラルプロティネース （東洋紡製)、 パチラス 'エスピー A S P 842 (FERM B P— 08 64 1 ) エア口モナス · ヒ ドロフイラ NB R C 38 20、 リゾパクター ·ェンザィモゲネス YK— 3 66 (FERM B P— 1 00 1 0) 由来のプロテアーゼが挙げられる。
これらの菌株のうち、 バチラス 'エスピー AS P 842 (FERM B P- 08 64 1)、 リゾパクター 'ェンザィモゲネス YK— 36 6 (FERM B P- 1 00 1 0) は本発明者等が新規に単離した菌株であり、 バチラス ·エス ピー AS P 842 (FERM B P - 0864 1 )は、 2004年 2月 24日 リゾパクター.ェンザィモゲネス YK— 36 6 (FERM B P— 100 1 0) は、 平成 1 6年 1月 3 Q日に日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 の独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した。 寄託したこれらの菌学的性質を示すと次の通りであり、 以下のように同定し た。
1. AS P 842 (FERM B P— 0 864 1) はグラム陽性の桿菌 （0. 8 一 1. 0 x 2. 0-3. 0 μτα) で表 1に示すような特徴により、 B e r g y' s Ma n u a l o i S y s t e ma t i c B a c t e r i o l o g y (1 9 84) では、 バチラス. エスピーと同定された。 (a)形態的性質
培養条件（培地 Nutrient Agar 30°C)
細胞の形態 0.8-1.0 X 2.0-3.0 m 細胞の多形成の有無 ―
運動性 + (周毛) 胞子の有無 +
(b)培養的性質
培養条件（培地 Nutrient Agar 30°C)
色 クリーム
光沢 ―
色素産生 ―
培養条件（液体培地 Nutrient Broth 30°C)
表面発育の有無 +
培地の混濁の有無 ―
培養条件 (ゼラチン穿刺培養 30°C)
生育状態 +
ゼラチン液化 +
培養条件（リトマス'ミルク 30°C)
凝固 一
液化 ―
(C)生理学的性質
1 )グラム染色性 +
2)硝酸塩の還元 +
3)脱窒反応 一
4) MRテスト ―
5)VPテスト +
6)インドールの生成 ―
7)硫化水素の生成 ―
8)デンプンの加水分解 +
9)クェン酸の利用 Koser/Christensen -/ +
1 0)無機窒素源の利用 硝酸塩 Zアンモニゥム塩
1 2)ゥレアーゼ活性 一
1 3)ォキシダ一ゼ + 表 1の続き
14)カタラーゼ +
1 5)生育の範囲 pH 5/8/10
生育の範囲 温度 20/25/45/50 + + + +
1 6)生育条件 (好気性/嫌気性） + /-
1 7) 0— Fテスト (酸化 Z発酵） -/-
1 8)糖類からの酸産生 Zガス産生
Lーァラビノース 一ノー
D—グルコース - + —
D—フラク I ^一ス + Z— マルトース +/- ラク卜ース +/-
D—ソルビ! ル +/- イノシ! ^一ル +/-
D—キシロース +ノー
D—マンノース + —
D—ガラク卜ース -/- サークロース + — トレハロース +/-
D—マンニ I ^一ル +/- グリセリン +/-
(d)その他の生理学的性質
β—ガラクトシダーゼ活性 ―
アルギニンジヒドロラ" Hi活性 ―
リジンデカルボキシラーゼ活性 ―
トリプトファンデァミナ一ゼ活性 +
ゼラチナーゼ活性 +
Phosphatase活性 +
Propionate利用 te ―
1 0%NaCI存在下での生育性 +
カゼインの加水分解性 +
馬尿酸の加水分解性 一 2. YK-366 (FERM BP—10010) はグラム陰性の好気性桿菌 で大きさが 0. 4 X 5〜50 μπιで表 2に示すような特徴により、 B e r g y' s Ma nu a l o r S y s t ema t i c B a c t e r i o l o g y (1989) では、 リゾパクター .ェンザィモゲネスと同定された。 表 2
Figure imgf000023_0001
くプロテアーゼの培養物からの製造 >
次に、 本発明に使用しうるプロテアーゼ生産菌の培養方法おょぴプロテア一 ゼの製造方法について述べる。 本発明のプロテアーゼ生産菌の培養手段として は固体培養でも液体培養でもよいが、 好ましくはフラスコまたはジャーファー メンター等による通気液体培養である。 培地としては微生物の培養に通常用い られるものが広く使用される。 炭素源としてはグルコース、 グリセロール、 ソ ルビトール、 ラクトースまたはマンノースなど、 窒素源としては酵母エキス、 肉エキス、 トリプトン、 ペプトンなど、 無機塩としては塩化ナトリウム、 塩化 マグネシウム、 硫酸マグネシウム、 塩化カルシウムなどを用いればよい。 培養 条件としては pH5. 0〜8. 0、 培養温度 25〜37°Cで目的とするプロテ ァーゼが最高力価または最高純度となる培養時間、 例えば 16時間〜 72時間 培養をすればよい。
次いで、 プロテアーゼの採取について説明する。 プロテア一ゼが菌体外に分 泌される場合には、 培養液から菌体を濾過、 遠心分離等によって除くことで得 られた粗製のプロテア ゼ含有液を用いる。 また、 プロテア一ゼが菌体内にあ る場合には培養液から菌体を濾過、 遠心分離等によって分離し、 菌体をリン酸 衝液、 トリス塩酸緩衝液等の緩衝液に必要の応じて界面活性剤、 金属塩、 糖 類、 アミノ酸、 ポリオール、 キレート剤などを加えて懸濁し、 リゾチーム、 超 音波、 ガラスビーズ等によって破碎した後濾過、 遠心分離などにより不溶物を 除去して得られる粗製のプロテアーゼ含有液を用いる。 これらの粗製のプロテ ァーゼ含有液を公知の蛋白質、 酵素の単離、 精製手段を用いて処理することに より、 精製されたプロテアーゼを得ることができる。 例えば、 アセトン、 エタ ノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、 硫安アンモニゥムなどによる塩析法、 イオン交換クロマトグラフィー法、 疎水クロマトグラフィー法、 ァフィ二ティ 一クロマトグラフィ一法、 ゲノレ濾過法などの一般的な酵素精製法を適宜選択、 組み合わせて精製プロテアーゼを得ることができ、 適宜安定化剤、 例えばショ 糖、 グリセロールまたはアミノ酸などを 1〜50%程度、 補酵素などを 0. 0 1〜 1 %程度として単独または 2種以上適宜組み合わせて加えて凍結保存して もよい。
<ケトァミンォキシダーゼのスクリ一ニング>
また、 （K1) の性質、 （K2) かつ FVHに作用する性質、 （K3) の性質を もつケトァミンォキシダーゼを得るスクリーニング法としては、 例えば、 プロ テアーゼにより糖化へモグロビンから切り出された、 "鎖1^末端由来の糖化ァ ミノ酸および Zまたは糖化べプチドの代表例として FVLを、 ；3鎖 N末端由来 の糖化アミノ酸およびノまたは糖化ペプチドの代表例として FVHを、 分子内 リジンを含む部位からの糖化アミノ酸および/または糖ィ匕ペプチドの代表例と して FKもしくは FZKを用いて、 それぞれに対する反応性を指標にする方法 が挙げられる。 特に、 FKもしくは F ZKに対する反応性においては FVHに 対する反応性の 5%以下であることが指標となる。 好ましくは 4%以下、 さら に好ましくは 2%以下である。 このようにして得られた （K1) の性質、 （K2) かつ FVHに作用する性質、 （K3) の性質をもつケトァミンォキシダーゼとし ては自然界から分離してきた天然型ケトァミンォキシダーゼおよび天然型ケト ァミンォキシダーゼを既知の遺伝子工学技術を利用してアミノ酸置換、 欠失、 挿入など人工的に改変することで得られる変異型ケトアミンォキシダーゼ、 さ らに天然型おょぴ変異型のケトァミンォキシダーゼをポリエチレンダリコ-ル 誘導体、 スクシ二ルイミド誘導体、 マレイミ ド誘導体などを用いて化学修飾す ることで得ることができるケトアミンォキシダーゼでも良い。
く変異型ケトァミンォキシダーゼ >
既存のケトアミンォキシダーゼの 1つもしくは複数のァミノ酸を置換、欠失、 揷入など人工的に改変することで （K 1 ) の性質、 （K 2 ) かつ F VHに作用す る性質、 （K 3 ) の性質をもつ変異型ケトァミンォキシダーゼを得る際に用いる ことができる既存のケトァミンォキシダーゼとしては特に限定はしない。 例え ば、 前述の （P 1 ) もしくは （P 3 ) の特異性をもつプロテアーゼを得るスク リ一ユング方法で述べたケトアミンォキシダーゼが挙げられる。
また、 F VHに作用するケトァミンォキシダーゼとして、 コニォ力エタ属（欧 州特許出願公開第 1 2 9 1 4 1 6号明細書)、 ユーぺニシリゥム属 （欧州特許出 願公開第 1 2 9 1 4 1 6号 ¾細書）、 カーブラリア属、 ネオコスモスポラ属由来 のケトァミンォキシダーゼが挙げられる。
そして、 これらの酵素は遺伝子レベルでも解析され、 その一次構造も図 1に 示したように推定されており、 これらの酵素のアミノ酸レベルでの相同性は 7 5 %以上で、 *がついたところのように保存された領域が存在しているので、 配列番号 1記載のァミノ酸配列と少なくとも 7 5 %の相同性を有するァミノ酸 配列で構成されるケトァミンォキシダーゼの例としても挙げられる。 また、 （K 1 ) の性質、 （K 2 ) かつ F VHに作用する性質、 （K 3 ) の性質をもつような 変異であるならばどのようなアミノ酸を置換、 欠失、 揷入であってもよいが、 例えば、 配列番号 1記載のアミノ酸配列において 5 8番目、 6 2番目に対応す るのアミノ酸のうち少なくとも 1ケ所が置換されていることが望ましく、 さら に望ましくは 5 8番目に対応するアミノ酸がパリン、 スレオニン、 ァスパラギ ン、 システィン、 セリン、 ァラニンに、 6 2番目に対応するのアミノ酸がヒス チジンに置換されていることである。
く変異型ケトァミンォキシダーゼ発現ベクター、 宿主細胞 >
(K 1 ) の性質、 （K 2 ) かつ F VHに作用する性質、 （K 3 ) の性質をもつ 変異型のケトァミンォキシダーゼは、 それをコードする遺伝子を必要に応じて プラスミドベクターに連結してサッカロマイセス属、 ピキア属、 アクレモニゥ ム属、 パチラス属、 シユードモナス属、 サーマス属、 ェシエリヒア属などの宿 主微生物に移入して培養し、 またはコードする遺伝子を試験管内で転写、 翻訳 し、 その後、 公知の蛋白質、 酵素の単離、 精製手段を用いて処理することによ り得ることができる。
<測定試薬キット>
糖化へモグロビンの糖化された 鎖 N末端をプロテアーゼとケトアミンォキ シダーゼを用いて分離操作せず特異的に測定する方法および試薬キットは、 糖 化された i3鎖 N末端に対して特異性を得るためのプロテアーゼとケトアミンォ キシダーゼの組み合わせに加えてパーォキシダーゼ、 色原体、 および必要に応 じて緩衝液成分、 塩類、 界面活性剤、 金属イオン、 電子受容体、 キレート剤、 糖、 アミノ酸、ァスコルビンォキシダーゼ、テトラゾリゥム塩、 ポリオール類、 酵素安定化剤、 酵素反応促進剤、 抗菌剤、 酸化剤、 還元剤、 補酵素などの成分 を適宜追加して構成しても良レ、。
糖化された i3鎖 N末端に対して特異性を得るためのプロテアーゼとケトアミ ンォキシダーゼの組み合わせとしては、 前述のようにプロテアーゼを （P 1) 〜 （P4)、 ケトァミンォキシダーゼを （K1) 〜 （K5) に分類した場合、 <
(P 1) と （K1) または （K2) または （K3) または （K4) >、 < (P 2) と (K 1) または （K3) >、 く （P 3) と (K 1) または (K2) >、 く (P 4) と （K1) >、 く (P 3) と （K5) と （K3) >、 < (P 3) と
(K5) と （K4) >の組み合わせであればどれでも良い。 ただし、 プロテア ーゼは、 一般的に、 蛋白質の N末端のァミノ基が糖ィ匕を受けている場合、 N 末端領域から糖化ァミノ酸を切り出してくることは反応性が悪いため、 /3鎖 N 末端の糖化ァミノ酸より糖化べプチドを切り出すプロテアーゼが望ましい。 例 えば、 上記のプロテアーゼのスクリーニングで得られた （P 3) の性質であつ て糖化された 鎖 N末端から FVHを切り出す性質をもつプロテアーゼとして バチラス属、 エア口モナス属、 リゾパクター属等の微生物由来のプロテアーゼ が挙げられる。 'より具体的には、 例えば、 バチラス. エスピー由来の二ユート ラルプロティネース （東洋紡製）、 バチラス 'エスピー ASP— 842 (FE RM B P— 08641) エアロモナス ' ヒドロフイラ NBRC3820、 リ ゾパクター .ェンザィモゲネス YK— 366 (FERM BP— 10010) 由 来のプロテアーゼが挙げられる。 また、 特異性を持たせたまま反応性を向上さ せるために、 スクリーニングしたプロテアーゼと他のプロテア:一ゼとを適宜組 み合わせたものも用いることができる。
プロテアーゼによりヘモグロビンの糖化された 3鎖 N末端から切り出される 糖ィ匕ペプチドの長さは 20アミノ酸以下で、 かつ、 組み合わせにより用いられ るケトァミンォキシダーゼにて検出できるのであれば特に限定されない。 例え ば、 カーブラリア. クラベータ YH923 (FERM BP- 10009) 由来のケトァミンォキシダーゼを用いた場合は、 プロテアーゼによりへモグロ ビンの糖化された β鎖 Ν末端から切り出される糖化べプチドは F V Ηであるこ とが望ましい。
ケトァミンォキシダーゼは、 プロテアーゼと上記の組み合わせを構成できる ものであればいずれでも良いが、 反応性の点から 鎖 Ν末端の糖化アミノ酸よ り糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼが望ましいため、 （K1) 〜 （K5) に おける糖化された j3鎖 N末端由来の糖化アミノ酸および/または糖化ペプチド は糖化された 鎖 N末端由来の糖化ペプチドであることが望ましレ、。 例えば力 一ブラリア. クラベータ YH923 (FERM BP— 10009) 由来のケ トァミンォキシダーゼは、 糖化された 3鎖 N末端由来の糖化ジペプチド （FV H) に作用し、 糖化された α鎖 N末端由来の糖化ジペプチド （FVL) に実質 的に作用しないので （Κ3) の性質をもつケトァミンォキシダーゼとして用い ることができる。 また、 F ΖΚに対する反応性が FVHに対する反応性の 5% 以下になった変異体はこれを （K1) の性質をもつケトァミンォキシダーゼと して用いることができ、 フザリウム. ォキシスポラム由来のフルクトシルアミ ンォキシダーゼ （旭化成ファーマ製） を （Κ5) の性質をもつケトアミンォキ シダーゼとして用いることができる。
<反応条件 >
プロテアーゼにより糖化へモグロビンから糖化された i3鎖 Ν末端由来の糖化 アミノ酸および/または糖化ぺプチドを切り出す反応条件は、 その反応が十分 に進行する条件であればいずれでも良い。 例えば、 pH、 塩濃度、 界面活性剤 添加量、 金属イオン添加量、 反応温度、 酸化還元剤添加量、 緩衝液濃度を調節 することで、 通常は、 （P3) もしくは （P2) の性質のプロテアーゼの特異性 を高めて、 （P 1) の性質にするような反応条件が望ましい。 特に、 （P 3) の 性質をもつバチラス.エスピー由来のニュートラルプロティネース（東洋紡製）、 バチラス ·エスピー ASP— 842 (FERM B P— 08641 )、 エアロモ ナス . ヒドロブイラ NBRC 3820、 リゾパクター ·ェンザィモゲネス Y K-366 (FERM BP— 10010) 由来のプロテアーゼにおいては、 組 み合わせのケトァミンォキシダーゼとしてカーブラリァ. クラベータ YH9 23 (FERM BP— 10009) 由来のケトァミンォキシダーゼを用いる と、 少なくとも pH5. 0〜6. 0の反応条件において （P 1) の性質のプロ テアーゼとなるのでこの反応条件が望ましい。 - ケトァミンォキシダーゼの反応条件は、 その反応が十分に進行する条件であ ればいずれでも良いが、 例えば、 pH、 塩濃度、 界面活性剤添加量、 金属ィォ ン添加量、 反応温度、 酸化還元剤添加量、 緩衝液濃度を調節することで FZK に対する反応性が 30%以下となる反応条件、 特に pH5. 5-6. 5の反応 条件はプロテアーゼにより切り出された 鎖 N末端由来の糖化アミノ酸および /または糖化ぺプチドである F V Hに対する特異性を高めることができるので 望ましい。
上記に示した糖化へモグロビンの糖化された 鎖 N末端を、 分離操作せず、 プロテアーゼとケトァミンォキシダーゼを用いて特異的に測定する方法おょぴ 試薬キットにより、 糖化ヘモグロビンの糖化された i3鎖 Ν末端を正確に測定し ていることは、 ヘモグロビン含量とそのヘモグロビンの /3鎖 N末端の糖化され た割合とが正確に示されているサンプルを用いることで確認できる。 へモグロ ビン含量とヘモグロビンの 鎖 N末端の糖化された割合とが正確に示されてい るサンプルとしては、 C l i n i c a l Ch emi s t r y a nd La b o r a t o r y Me d i c i n e 40 (1) : 78-89 (2002) に 記載の方法で測定された値 （I FCC値） が標記されているサンプルを用いる ことが望ましいが、 他の方法で測定された値が標記されているサンプルにおい ても臨床検查 46 (6) 729-734 (2002) に記载の換算式によつ ても I FCC値を得ることができる。 また、 糖化ヘモグロビンサンプルはヒト 血液から、血球分離、溶血、遠心分離、透析、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二テイク口マトグラフィ一等の操作を適宜組み合わせて調製しても良い し (C l i n i c a l Ch em i s t r y a n d la b o r a t o r y Me d i c i n e 36 (5) ： 299— 308 (1998))、 市販のものを購 入して用いても良い。
ぐ測定対象物 >
上記に示した糖化へモグロビンの糖ィヒされた /3鎖 N末端を、 分離操作せずプ 口テアーゼとケトァミンォキシダーゼを用いて特異的に測定する方法および試 薬キットの測定対象物は糖化へモグロビンを含むものであればいずれでも良い が、 例えば、 全血サンプル、 血球溶血サンプル、 精製ヘモグロビンサンプルが 挙げられる。 ' 次に、 参考例、 実施例によって本発明を説明する。
[参考例：カーブラリァ 'クラベータ YH 923 (FERM BP— 10009) 由来のケトァミンォキシダーゼの製法]
カーブラリア 'クラベータ YH923 (FERM BP— 10009) が F VHに作用するケト ミンォキシダーゼ （以下、 FOD 923ともいう） を生 産しているが生産量が低いため以下に示すように FOD 923遺伝子を大腸菌 において発現をさせた後、 精製して FOD923を得た。
(1) カープラリア. クラベータ YH923 (FERM BP— 10009) 染色体 DN Aの調製
サブロー培地 （グルコース 4. 0%、 ポリペプトン 1. 0%、 pH5. 6) 100mlを 500 m 1容坂ロフラスコに入れてオートクレーブで滅菌し、 力 一ブラリア'クラベータ YH 923 (FERM BP— 10009) を植菌し、 25 °Cで 4日間振盪培養した後、 No. 2ろ紙で培養液をろ過して菌体を回収 した。 回収した菌体を液体窒素で凍結し、 乳鉢で微粉末になるまで粉砕し、 D N A抽出用緩衝液 （5. 0% SDS、 0. 1M Na C l、 50 mM T r i s— HC 1、 pH8. 0) 15m 1を加え、 ゆっくり振盪して溶解した。 続い て、 遠心分離 （5， 000 r m, 6m i n、 室温） により上清を回収し、 フ ェノール/クロ口ホルム抽出を 3回、 エーテル抽出を 2回行い、 水層に残存す るエーテルを蒸発させた後、 3M酢酸ナトリウム 1ml、 エタノール 25ml を加え、 -30°Cで 30分間放置した後、 遠心分離 （12， 000 r r>m、 10 mi n、 4°C) により染色体 DNAを回収し、 70 %エタノールにて洗浄した 後、 TE400 1に溶解した。 次に、 得られた DNA溶液に RNa s e 1 0 μ 1 (0. 132 U) を加え、 37 °Cで 1時間処理した後、 プロティナーゼ Kを 5 μ 1 (0. 6 U) を加え、 50°Cで 1時間処理し、 フエノール/クロ口 ホルム抽出 （2回）、 クロ口ホルム/イソァミルアルコール抽出 （1回） を行つ た後、 エタノール沈殿にて DNAを回収した。 続いて 70%エタノール溶液に より洗浄した後、 エタノールを除去し、 ΤΕ 200 μ 1に溶解し、 染色体 DN Α溶液を得た。'
(2) FOD 923遺伝子断片の増幅
(a) FOD 923遺伝子断片の取得
これまでに知られているケトァミンォキシダーゼの遺伝子情報を基に下記の P 11および P 12プライマーを設計した。
P 11 AA (A/G) GC (C/T) AT (C/T) AACGC (C/T) AT (C/T) GG (配列番号 2)
P 12 AC (C/G) ACGTGCTT (A/G) CC (A/G) ATGT T (配列番号 3) 前述の方法で得られた染色体 DNAを铸型 DNAとして P 1 1プライマーと P 12プライマーの組み合わせで PC Rを 35サイクル行った 結果、 約 800 b pの DNA断片が特異的に増幅され、 増幅 DNA断片の塩基 配列 （配列番号 1の 1021— 1790番目までの塩基配列） を決定した。
(b) FOD 923遺伝子の塩基配列の決定
(a) で得られた約 800 b pの DNA断片に隣接する 5， 上流域の DNA 断片の増幅は、 染色体 DNAを制限酵素 Xb a Iで消化した後、 LA- PCR i n v i t r o C l o n i n g k i t (タカラバイオ製） を用いて、 c a s s e t t e— 1 i g a t i o n- m e d i a t e d P CRで行った。 即ち、 染色体 DNA制限酵素処理断片に Xb a Iカセット （タカラバイオ製） を結合 させ、 この DNAを鑤型 DNAとして C 1プライマ- (タカラバイオ製） 及ぴ下 記の P 13プライマ-を使用して、 PCRを 35サイクル行った後、 この反応液 を 100倍希釈したものを铸型として C 2プライマ- （タカラバイオ製） 及び下 記の P 14プライマーを使用して PCRをさらに 35サイクル行った結果、 1， 200 b pの DNA断片が特異的に増幅した。 そして、 その DN A断片の塩基 配列 （配列番号 1の 1〜1044番目までの塩基配列） を決定した。
(a) で得られた約 800 b pの DNA断片に隣接する 3， 下流域の DNA 断片の増幅は、 染色体 DNAを制限酵素 S a 1 Iで消化した後、 LA- PCR i n v i t r o C l o n i n g k i t (タカラパイォ製） を用いて、 c a s s e t t e - 1 i g a t i o n - m e d i a t e d P C Rで行つに。 即ち、 染色体 DNA制限酵素処理断片に S a 1 Iカセット （タカラバイオ製） を結合 させ、 この DNAを铸型 DNAとして C 1プライマー （タカラバイオ製） 及ぴ下 記の P 15プライマ-を使用して、 PCRを 35サイクル行った後、 この反応液 を 100倍希釈したものを鎵型として C2プライマ— （タカラバイオ製） 及び下 記の P 16プライマ-を使用して PCRをさらに 35サイク/レ行った結果、 1， 000 b pの DNA断片が特異的に増幅した。 そして、 その DNA断片の塩基 配列 （配列番号 1の 1775〜 2212番目までの塩基配列） を決定した。 以上のようにして決定した塩基配列をつなぎ合わせて、 FOD 923遺伝子 の塩基配列 （配列番号 1) を決定した。
P 13 GCCAAAAGAGGCTGCTTGAACGAT
(配列番号 1の 1083〜 1106番目までの塩基配列の相補配列）
P 14 CGATCCAGCACCACCAAAACCAAAC
(配列番号 1の 1062~1086番目までの塩基配列の相補配列）
(配列番号 1の 1713〜 1738番目までの塩基配列）
P 16 ACCTGGTTTGCCTAGGCACACA
(配列番号 1の 1736〜 1757番目までの塩基配列）
(3) カーブラリア 'クラベータ YH923 (FERM BP— 10009) 由 来ケトァミンォキシダーゼを発現する大腸菌の作製
FOD 923を大腸菌で発現させるため、 ぺニシリゥム ·ヤンシネラムのケ トァミンォキシダーゼ (特開平 11— 46769号公報） とァスペルギルス · 二ドランスのケトァミンォキシダーゼとの相同性からイントロンとして 3つの 領域、 すなわち配列番号 1の塩基配列の 753〜 807番目と、 配列番号 1の 塩基配列の 1231〜 1279番目と、 配列番号 1の塩基配列の 1696〜 1
750番目を推定した。
イントロンを除去して大腸菌での発現プラスミドを作成するために次の操作 を行った。
まず、 イントロン存在領域を挟み込むようなイントロンが除去された 40〜 50塩基の配列の正配列と相捕配列を有する DN A断片 P 22— P 27と、 F OD 923遺伝子の開始コドン ATG上に制限酵素 N c o Iの配列を付加した DNA断片 P 21、 および FOD 923遺伝子の終止コドン直後に制限酵素 S a c Iを付加した相補配列を有する DNA断片 P 28を合成した。
続いて、 カーブラリア 'クラベータ YH923 (FERM BP— 1000 9) の染色体 DNAを铸型とし、 P 21と P 23、 P 22と P 25、 P 24と P27、 P 26と P 28のプライマーをそれぞれ組み合わせとして 4種の P C Rを行い、それぞれからイントロン領域が除去された 327 b , 480 b p、 471 b p、 254 b pの増幅 DNA断片を得た。 そして、 得た 4本のフラグ メントを混合して铸型とし、 P 21と P 28をプライマーとして再度 PCRを 行うことにより 4本のフラグメントが 3ケ所のィントロンの除去された相同領 域で連結している 1本の FOD 923遺伝子を有する約 1. 4 k bの DNA断 片を得た。
FOD 923を大腸菌内で高生産させるために高発現プロモーターであるェ ァロコッカス . ビリダンス由来のピノレビン酸ォキシダーゼプロモーター （特公 平 7— 67390号公報） を使用した。 その具体的手順を以下に述べる。
1) 特公平 7— 67390号公報に示された^ァロコッカス · ピリダンスの ピルビン酸ォキシダーゼ遺伝子を含むプラスミド pOX I 3力 ら、 ピルビン酸 ォキシダーゼ遺伝子のプロモーター領域を得るため、 p〇X I 3を D r a Iで 切断して、 配列番号 6記載の 202 b pの DNA配列を有するピルビン酸ォキ シダーゼ遺伝子のプロモーター領域を分取し、 これと pUC13を S a 1 Iで 切断した後 T4DNAポリメラーゼにて平滑末端にしたものとを連結し、 pU C 13のアンピシリン耐性遺伝子とピルビン酸ォキシダーゼ遺伝子のプロモー ター領域が同じ向きのプラスミド pKNl 9を得た。
2) さらにプロモーターによる発現を効率的にするため pKNl 9のピルビ ン酸ォキシダ一ゼ遺伝子のプロモーター下流にリボゾーム結合配列領域とマル チタローニングサイトができるように設計した配列番号 7記載の塩基配列を有 する DNA断片 P 31と、 その相補配列で配列番号 8記載の塩基配列を有する DNA断片 P 32を合成し、 ァニーリングさせた後、 Xb a lと E c oR Iで 切断した pKNl 9に連結してプラスミド p POS 2を作製した。
3) 先に述べたイントロンを除去した FOD 923遺伝子を含む約 1. 4 k bの DNA断片を Nc o Iと S a c Iで切断し、 同じく Nc o lと S a c lで 切断した p POS 2へ組み込み、 ピルビン酸ォキシダーゼ遺伝子のプロモータ 一下流に FOD 923遺伝子が組み込まれたプラスミド p POSFOD923 を作製した。
4) 得られた p POS FOD 923で大腸菌 W3110を形質転換し FOD 923を発現する大腸菌 F AOD 923を作製した。
TCAAGAGCAAAC (配列番号 4)
GACTGTGCACATGGGGAAGAGG (配列番号 1の 725〜 75 2番目と 808〜832番目の塩基配列）
P 23 C
AGTGTTGTGGAAATACTCTTTG (配列番号 1の 725〜75 2番目と 808〜 832番目の塩基配列の相補配列）
4〜1230番目と 1280〜1308番目の塩基配列）
41230番目と 1280〜 1308番目の塩基配列の相補配列）
〜 1695番目と 1751〜 1778番目の塩基配列）
CTGTCCCCTGTCGCCAGCACAAAG (配列番号 1の 1669 〜 1695番目と 1751〜 1778番目の塩基配列の相補配列）
CTTGGACTTGACAAC (配列番号 5)
7)
8)
(4) カーブラリア 'クラベータ ΫΗ 923 (FERM BP - 10009) 由来ケトアミンォキシダーゼの製造
10 m 1の 3 %のソルビトール、 1. 5 %のぺプトン、 1. 5 %のビール酵 母エキス、 50 // g/m 1のアンピシリンを含有する培地 （ρΗ7. 0) の入 つた 8分の試験管に、 前述のように作製した大腸菌 FAOD 923を植菌し、 28°C、 12時間振盪培養し、 種菌とした。 この種菌を 20 Lの 3%のソルビ トール、 1 · 5 %のペプトン、 1. 5 %のビール酵母ェキス、 0. 1 %の消泡 剤、 50 μ g/m 1のアンピシリンを含有する培地 （pH7. 0) の入った 3 0 Lのジャーファンメンターに植菌し、 37°Cで 18時間、'攪拌培養を行った。 培養終了後、 集菌し、 4Lの 1 OmMのトリス塩酸緩衝液 （pH7. 5) に 菌体を懸濁させ、 超音波破砕により菌体の可溶化を行った （212KU)。 この 可溶化液を 8000 r pmで 30分間遠心し、 その遠心上清を Q -セファロー ス .ビッグビーズ樹脂 （2L) (アマシャム社製） を用いてイオン交換クロマト グラフィーを行った。 溶出は 0M、 0. 1M、 0. 3M、 0. 5Mの Na C l を含むトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5) にて行った。 その結果、 0. 3Mと 0. 51^の &じ 1溶出画分が活性画分として回収された （180KU)。 この酵素 液をモジュール （アミコン社製） にて 750m 1まで濃縮した後 1 OmMのト リス塩酸緩衝液 (pH7. 5) に一夜透析した。 この透析液を Q-セファロース • HP樹脂 （500ml) (アマシャム製） を用いて再度イオンクロマトグラフ ィーを行った。 溶出は 0〜0. 3 Mの N a C 1を含むトリス塩酸緩衝液 (pH 7. 5) によるリニアグラジェントにより行い、 0. 15〜0. 2MのNa C 1の溶出画分 （92KU) を回収した。 この酵素液を 50 Om 1まで濃縮し、 1 OmMのトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5) にて一夜透析した後、 凍結乾燥を 行い、 精製 FOD 923を得た。 なお、 FOD 923活性測定試薬おょぴ測定 方法を以下に記載する。
く測定試薬〉
5 OmM トリス-塩酸緩衝液 （pH 7. 5)
ImM FVH (ペプチド研究所製）
0. 02% 4—ァミノアンチピリン （和光純薬工業製）
0. 02% TOOS (同仁化学研究所製）
5U/m 1 パーォキシダーゼ (シグマ製)
(TOOS： N—ェチル— N - (2 -ヒ ドロキシ- 3 -スルホプロピル) —3 -メ トキ シァユリン）
<測定方法 >
測定試薬 lmlを試験管に入れ、 37 °Cで 5分間予備加温した後、 0. 05 m 1の酵素液を添加して 5分間反応させた。 反応後、 0. 5%の SDSを 2m 1添加して反応を停止させ、 波長 550 nmにおける吸光度 （A a ) を測定し た。 また、 ブランクとして FVHを含まない測定試薬を用いて同様の操作を行 つて吸光度を測定した （Ab)。 この吸光度 （Aa) とブランクの吸光度 （Ab) の吸光度差 （Aa- Ab) より酵素活性を求めた。
酵素活性 1単位は 37でで 1分間に 1マイクロモルの過酸化水素を生成させる 酵素量とした。
[参考例：ネオコスモスポラ. バシンフエクタ 474由来のケトアミンォキシダ ーゼの製法]
ネオコスモスポラ. バシンフエクタ 474が FVHに作用するケトアミンォ キシダーゼ （以下、 FOD474ともいう） を生産しているが、 生産量が低い ため、 以下に示すように当該ケトァミンォキシダーゼ遣伝子を大腸菌において 発現させた後、 精製して当該ケトァミンォキシダーゼを得た。 (1) ネオコスモスポラ. パシンフエクタ 474染色体 DNAの調製
サブロー培地 （グルコース 4. 0%, ポリペプトン 1. 0%、 p H5. 6) 1 0 Om 1を 50 Om 1容坂ロフラスコに入れてオートクレーブで滅菌し、 ネオ コスモスポラ ·バシンフエクタ 474を植菌し、 25°Cで 4日間振盪培養した 後、 No. 2ろ紙で培養液をろ過して菌体を回収した。 回収した菌体を液体窒 素で凍結し、 乳鉢で微粉末になるまで粉碎し、 DNe a s y P l a n t M a x i K i t (キアゲン製） を使用して染色体 DNA溶液を得た。
(2) ケトァミンォキシダーゼ遺伝子のクローニング
(a) 放射性 DNAプローブの作製
ネオコスモスポラ. バシンフエクタ 474のケトァミンォキシダーゼ遺伝子 は FOD 923の遺伝子と相同性を有することが予想された。 そこで前記の F OD 923の遺伝子を含むプラスミド p POSFOD 923を制限酵素 N c o Iと S a c Iで切断し、 ケトアミンォキシダーゼ遺伝子を含む約 1. 4 k bの DNA断片を分離し、 この DNA断片を B c aBEST L a b e l i n g K i t (タカラバイオ製） と [α— 32P] dCTPを使用して放射性 DNAプ ローブを作製した。
(b) サザンハイプリダイゼーションによるケトァミンォキシダーゼ遺伝子 含有 DN A断片の検定
(1) の操作で得られたネオコスモスポラ. パシンフエクタ 474の染色体 DNAから遺伝子ライブラリーを作成するため、 本染色体を各種制限酵素で切 断し、 目的遺伝子が含有される DNAフラグメントの鎖長を検定する操作を行 つた。 まず、 ネオコスモスポラ. バシンフエクタ 474の染色体 DNAを各種 制限酵素で切断し、 1.. 5%ァガロースゲルで電気泳動し、 ァガロースゲルか らナイロンメンブレン （PALL製：パイオダイン A) に DN Aを転写した。 次に、 このメンプレンを風乾後、 ハイブリダィゼーシヨン溶液 '（0. 1% フ イコール、 0. 1% ポリビュルピロリ ドン、 0. 1% ゥシ血清アルブミン 、 0. 75M 塩化ナトリウム、 75mM クェン酸ナトリウム、 50 mM リン酸 3ナトリウム、 0. 1% ドデシル硫酸ナトリウム、 250 / gZml サケ精子 DNA、 50% ホルムアミド） に浸し、 42°Cで 2時間プレハイプ リダイゼーションを行つた。 プレハイブリダイゼーション後、 ハイブリダイゼ ーシヨン溶液を新しいものに交換し、 （a) で作成した放射性 DNAプローブを 添加し、 同じく 42 °Cでハイブリダイゼーション処理を 1晚行った。 ハイブリ ダイゼーシヨン後、 メンプレンを洗浄液 （75mM 塩化ナトリウム， 7. 5mM クェン酸ナトリウム、 0. 1% SDS) で 50°C、 10分間洗浄後、 メンブレンを自然乾燥した。 この乾燥したメンブレンを X線フィルムに重ね、 - 70 °Cで 24時間感光させた。 感光後、 フィルムを現像し、 各制限酵素による切断染色体が示すポジティブ バンドのサイズを観察した。 その結果、 S a c I切断による約 8 k bの DNA フラグメント上にケトアミンォキシダーゼ遺伝子が存在することが明らかとな り、 S a c Iで切断した染色体 DNAの 8 k bフラグメントを用いて遺伝子ラ ィブラリ一を作成することとした。
(c) 遺伝子ライブラリーの作成
(1) の操作で得られたネオコスモスポラ. パシンフエクタ 474の染色体 DNAを制限酵素 S a c Iで切断し、 ァガロース電気泳動で約 8 k bの D N A フラグメントを分離した。 この DNAフラグメントを、 制限酵素 S a c Iで切 断した後、 アル力リフォスファターゼで切断末端を脱リン酸化した p U C 11 9と、 DNAライゲーシヨンキット （タカラバイオ製） で連結させた。 これを 用いて大腸菌 JM109コンビテントセル （タカラバイオ製） を形質転換して 50 g 1アンピシリン含有 L B寒天培地 （ベク トンデツキンソン製） に て培養することで、 約 5， 000個のアンピシリン耐性コロニーを得、 遺伝子 ライブラリ一とした。
(d) コロニーハイプリダイゼーションによるケトァミンォキシダーゼ遺伝子 含有 DN A断片保持糸且換え大腸菌のスクリ一ユング
(c) により得た遺伝子ライブラリーを、 ナイロンメンプレン （PALL製： パイオダイン A) にレプリカし、 このメンブレンに添付のマニュアルに従って 菌体の DNAを固定した。 この DNAを固定したメンブレンを （b) に示した ハイブリダイゼーション溶液に浸し、 42 °Cで 1時間プレハイブリダイゼーシ ョン行った。 プレハイブリダイゼーション後、 ハイブリダイゼーション溶液を 新しいものに交換し、 （a) で作成した放射性 DNAプローブを添加し、 同じく 42。Cでハイプリダイゼーシヨンを 1晚行つた。 ハイブリダイゼーション後、 メンブレンを （b) に示した 50°Cの洗浄液で 10分間洗浄後、 自然乾燥した。 この乾燥したメンプレンを X線フィルムに重ね、 -70°Cで 24時間感光させた。 感光後フィルムを現像し、 ポジティプシグナルをしめすコロニーを 8個確認し た。
( e ) 組み換えブラスミドの抽出とケトアミンオキシダ^^ゼ遺伝子の塩基配列 の決定
(d) で選ばれたポジティブシグナルを示すコロニーを 50 μ g/m 1のァ ンピシリン含有 LB液体培地 （べク トンデッキンソン製） 1. 5mlに植菌し 37 °Cで 16時間振盪培養した後、 プラスミドを抽出した。 その結果、 8個の コロニー由来のプラスミドは同じ染色体 DNA断片を含むものであった。 この プラスミドのうちの 1つについて、 揷入された染色体断片のなかに、 FOD9 23の遺伝子と相同性を有する領域を確認し、 FOD 474の遺伝子の塩基配 列を決定した。 決定した FOD474の遺伝子の塩基配列とそのコードするァ ミノ酸配列を配列番号 9に示した。
(3) ネオコスモスポラ ·パシンフエクタ 474由来ケトァミンォキシダーゼ を発現する大腸菌の作製
FOD474を大腸菌で発現させるため、 FOD474遺伝子の開始コドン ATG上に制限酵素 B s pH Iの配列を付加した P 41プライマー （配列番号 10)、 およぴケトァミンォキシダーゼ遺伝子の終止コドン直後に制限酵素 S a c Iを付加した相捕配列を有する P 42プライマー （配列番号 11) を合成し た。
続いて、 ネオコスモスポラ ·バシンフエクタ 474の染色体 DN Aを錄型と し、 P41と P42をプライマーとして PCRを 25サイクル行い、 FOD4 74遺伝子を含む約 1. .4 k bの DNA断片を得た。. この DNA断片を B s p H Iと S a c Iで切断し、 N c o Iと S a c Iで切断した p P O S 2に組み込 み、 ピルビン酸ォキシダーゼ遺伝子のプロモーター下流にケトアミンォキシダ ーゼ遺伝子が組み込まれたプラスミド p POSFOD474を作製した。 また このプラスミドを Xb a Iと S a c Iで切断して得られる F OD 474遺伝子 を含む約 1. 4 k bの DNA断片プラスミド pUC 119に組み込んで、 プラ スミド p 119-FOD 474 (FERM B P-08642) を作成し、 塩基 配列の解析を行い、 PCRによる変異が発生していないことを確認した。 得ら れた p POSFOD474で大腸菌 W3110を形質転換し FOD474を発 現する大腸菌 FAOD474を作製した。
なお、プラスミド p 119-FOD474 (FERM B P— 08642) は、 2004年 2月 24日、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6の独 立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した。
ACCGTCCTC (配列番号 10 ) TCGTGCTTC (配列番号 11)
(4) ネオコスモスポラ ·パシンフエクタ 474由来ケトァミンォキシダーゼ の製造
大腸菌 FAOD474を用いて、上記の FOD 923と同様に行った。また、 FOD474活性測定試薬おょぴ方法も上記の FOD 923と同様に行った。
[参考例：カーブラリア. クラベータ YH923 (FERM BP— 10009) 由来のケトアミンォキシダーゼ、 ネオコスモスポラ. パシンフエクタ 474由 来のケトアミンォキシダーゼ、 フザリウム. ォキシスポラム由来のケトァミン ォキシダーゼ （旭化成ファーマ製） の基質特異性]
反応液 （.50 mM T r i s -塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 0. 1% T r i t o nX— 1 00、 0. 03% 4 -ァミノアンチピリン、 0. 02% TOOS、 5U/m 1 パーォキシダーゼ、 2mM 基質） 200 μ 1に酵素液 20 μ 1 を添加し、 3 7 °Cで 5分間反応させた後、 0. 5% 303を0. 5m l加え てから 5 5 5 nmの吸光度 （A 1 ) を測定し、 基質を含まない反応液で同様の 操作を行って測定した吸光度 （Ab) との差 （Al- Ab) 力 ら反応性を測定し た。 用いる FOD 923、 FOD 4 74、 フザリウム. ォキシスポラム由来の ケトァミンォキシダーゼ （旭化成ファーマ製：以下、 FOD 2ともいう） 酵素 液の濃度、 用いた基質、 吸光度差 （Al- Ab) および相対活性 （％) を表 3に 示した。
[参考例：アンギオテンシン変換酵素による FVHLからフルク トシルバリンの 遊離反応]
p o r c i n e k i d n e y由来アンギオテンシン変換酵素 （シグマ製： 以下 ACEPという） と r a b b i t 1 u n g由来アンギオテンシン変換酵 素 （シグマ製：以下 ACERという） を酵素溶解液 （l O OmM HEPES (pH8. 3)、 30 OmM N a C 1 ) で 20 U/m 1になるように溶解し、 ACEP液と ACER液を作製した。 つぎに 2mMの FVHL (ペプチド研究 所製）溶液が 2 1入 όたチューブ 3本にそれぞれ酵素溶解液、 ACEP液、 A C E R液を 20 /z 1づっ添加し、 3 7でで 1時間反応させた後、 発色液 （ 5 OmM T r i s-塩酸 （pH7. 5)、 0. 1 % T r i t o n X - 1 00、 5 U/m 1 POD, 50 U/m 1. FOD 2、 0. 0 2mM DA - 64) 2 00 μ 1を加えて 3 7°Cで 5分間反応させた後、 0. 5%SDSを 500 μ Ι 加えて発色反応を停止させて 73 0 nmの吸光度を測定した。 同様に 2mMの FVHL溶液のかわりに蒸留水でも同; j な反応を行い、 また 40 μ 1の FV溶 液 （0、 5、 1 0、 20， 50 /ζΜ) に発色液 200 μ 1を加えて同様の測定 を行い検量線を作成することで、 ACE P、 ACERが FVHLから FVを遊 離する量を測定した。 FVの検量線で FV (μΜ) と吸光度差は、 それぞれ 5 μ Μで 0. 0 1 9、 1 0 μ Μで 0. 03 3、 20 μ Μで 0. 0 6 5、 50 μΜ で 0. 0 1 54であったが、 ACEPの反応による FV遊離を示す吸光度差は - 0. 00 6であり、 ACERの反応による FV遊離を示す吸光度差は 0. 00 0であった。 これらの結果から、 ACE Pおよび ACERは F VHLから F V を通常の反応においてほとんど遊離しないことがわかった。 また、 40 /z lの サンプル （2 5 / M FV、 1 OU/m 1 ACER) に発色液を添加して同 様の測定を行ったときの吸光度差が 0. 062であったことから、 ACER力 S 発色液での発色反応をほとんど阻害しないことがわかる。
Figure imgf000038_0001
実施例 1
ヘモグロビン A 1 c測定用プロテアーゼのスクリーニング （p H 7. 5) ヘモグロビン α鎖 N末端糖化べンタペプチドから糖化アミノ酸または糖化べ プチドを実質的に切り出すことなく、 ヘモグロビン ]3鎖 Ν末端糖化ペンタぺプ チドから糖化べプチドを切り出すプロテアーゼのスクリ一ユング方法を示す。 9 6穴プレートにおいてスクリーユング対象サンプルを 1 0 μ 1ずつ 3箇所の ゥエルに入れた後、 1箇所目に α液 5 0 μ I、 2箇所目に i3液 5 0 μ 1、 3箇 所目に対照液を 5 0 μ 1を入れてから、 3 7°Cで 6 0分保温した後、 蒸留水 5
0 μ 1、 発色液 5 0 μ 1を入れて室温で 3 0分放置した後にマイクロプレート リーダー （バイオラッド製 mo d e 1 5 5 0) で主波長 5 5 0 nm、 副波 長 5 9 5 nmで吸光度を測定し、 a 液添加ゥエルの吸光度と対照液添加ゥエル の吸光度差に比べて、 . β 液添加ゥエルの吸光度と対照液添加ゥエルの吸光度差 が大きいものを選ぶことで目的のプロテアーゼをスクリーニングした。 サンプ ルはカルボキシぺプチダーゼ Β (シグマ製）、 カルボキシぺプチダーゼ W (和光 純薬工業製）、 カルボキシぺプチダーゼ Υ (オリエンタル酵母工業製)、 プロテ ァーゼ （タイプ XXV I I ナガーゼ：シグマ製）、 プロテアーゼ （タイプ V I
1 I ズプチリシンカールスベルグ： シグマ製）、 プロテアーゼ (タイプ XX I V パクテリアル：シグマ製)、 プロティネース Κ (和光純薬工業製)、 ニュー トラルプロティネース （東洋紡製）、 力ルポキシぺプチダーゼ A
(和光純薬工業製)、サーモライシン（和光純薬工業製）および蒸留水を用いた。 また、 発色液による発色の度合いを確認するために I mMの FVH (ペプチド 研究所製） および I mMの FVL (ペプチド研究所製） を Ι Ο μ Ιゥエルに入 れた後、 対照液 5 0 μ 1を入れ 3 7°Cで 6 0分保温した後、 蒸留水 5 0 μ 1、 発色液 5 0 μ 1を入れて室温で 3 0分放置した後に上記と同様に測定した。 そ の結果を表 4およぴ表 5に示した。 力ルポキシぺプチダーゼ Β、 力ルボキシぺ プチダーゼ w、 ニュートラルプロティネース、 サーモライシンが、 pH 7. 5 においてへモグロビン α鎖 Ν末端糖化ペンタぺプチドから糖化アミノ酸または 糖化べプチドを実質的に切り出すことなく、へモグロビン β鎖 Ν末端糖化ペン タぺプチドから糖化べプチドを切り出すプロテアーゼであることがわかる。 < α液 >
5 0 mM T r i s -塩酸 （ p H 7. 5)
0. 1 % T r i t o n X - 1 00
0. 2mM α糖化ペンタペプチド （ペプチド研究所製）
< 液 >
5 OmM T r i s -塩酸 (pH 7. 5)
0. 1 % T r i t o n X - 1 00 0. 2mM /3糖化ペンタペプチド （ペプチド研究所製）
<対照液 >
5 OmM T r i s -塩酸 （ ρ H 7. 5)
0. 1 % Tr i t o n X-l 00
<発色液 >
10 OmM Tr i s -塩酸 （ p H 7. 5)
0. 09% 4—ァミノアンチピリン (和光純薬工業製）
0. 06% TODB (同仁化学研究所製）
15U/m 1 パーォキシダーゼ （シグマ製)
18. 75U/m 1 FOD 923
(TODB ： N， N -ビス （4—スルホプチル） —3—メチルァ
表 4
RAW DATA(pH7.5)
O
寸
！
O
O
Figure imgf000040_0001
表 5
RAW DATA(pH7.5)
液 β液 対照液 カルボキシぺプチダ一ゼ A(10O0U/ml) 0.022 0.018 サ一モリシン（75kU/ml) 0.053 0.249 0.055 蒸留水 0.013 0.011
ImM フルクトシルバリルヒスチジン 0. 169
1mM フルクトシルバリルロイシン 0. 161 実施例 2
ヘモグロビン A l c測定用プロテアーゼのスクリーニング （p H3. 5) ヘモグロビン α鎖N末端糖化ぺンタペプチドから糖化アミノ酸または糖化ぺ プチドを実質的に切り出すことなくヘモグロビン 鎖 N末端糖化ペンタぺプチ ドから糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼのスクリーニング方法をしめす。 9 6穴プレートにおいてスクリ一二ング対象サンプルを 1 0 μ 1ずつ 3箇所の ゥエルに入れた後、 1箇所目にひ液 5 0 /Ζ 1、 2箇所目に 液 5 0 μ 1、 3箇 所目に対照液を 5 0 /ζ 1を入れてから、 3 7 °Cで 6 0分保温した後、 p H調整 液 5 0 μ し 発色液 5 0 μ 1を入れて室温で 3 0分放置した後にマイクロプレ ートリーダー （パイォラッド製 mo d e l 5 5 0) で主波長5 5 011111、' 副波長 5 9 5 nmで吸光度を測定し、 α 液添加ゥエルの吸光度と対照液添加ゥ エルの吸光度差に比べて、 13 液添加ゥエルの吸光度と対照液添加ゥエルの吸光 度差が大きいものを選ぶことで目的のプロテア一ゼを クリーニングした。 サ ンプルはカルボキシぺプチダーゼ Β (シグマ製〉、力ルポキシぺプチダーゼ W (和 光純薬工業製）、 カルボキシぺプチダーゼ Υ (オリエンタル酵母工業製）、 プロ テアーゼ （タイプ XXV I I ナガーゼ：シグマ製)、 プロテアーゼ （タイプ V I I I ズブチリシンカールスベルグ：シグマ製）、 プロテアーゼ （タイプ XX I V パクテリアル：シグマ製）、 プロティネース Κ (和光純薬工業製）、 ニュ ートラルプロティネース （東洋紡製)、 および蒸留水を用いた
。 また、 発色液による発色の度合いを確認するために l mMの FVH (ぺプチ ド研究所製） および I mMの FV L (ペプチド研究所製） を 1 0 ^ 1ゥエルに 入れた後、 対照液 5 0 μ 1を入れ 3 7°Cで 6 0分保温した後、 p H調整液 5 0 μ 1、 発色液 5 0 μ 1を入れて室温で 3 0分放置した後に上記と同様に測定し た。 その.結果を表 6に示した。 カルボキシぺプチダーゼ Βが、 ρ Η3· 5に おいてへモグロビンひ鎖 Ν末端糖化ペンタぺプチドから糖化アミノ酸または糖 化ペプチドを実質的に切り出すことなく、 ヘモグロビン 鎖 Ν末端糖化ペンタ ぺプチドから糖化べプチドを切り出すプロテアーゼであることがわかる。
く CK液 >
5 OmM 酢酸—酢酸ナトリウム （ρΗ3 ·. 5)
0. 1 % T r i t o n X - 1 0 0
0. 2mM α糖化ペンタペプチド （ペプチド研究所製）
く β液〉 .
5 OmM 酢酸-酢酸ナトリウム （p H3. 5)
0. 1 % T r i t o n X - 1 0 0
0. 2mM j3糖化ペンタペプチド （ペプチド研究所製）
ぐ対照液 > 5 OmM 酢酸一酢酸ナトリウム （pH3. 5)
0. 1% Tr i t o n X-l 00
く H調整液 >
10 OmM CAP S-Na OH (p H 11. 0)
(CAP S ： 3—シクロへキシルァミノプロパンスルフォニックアシッド：同仁 化学研究所製）
く発色液 >
10 OmM T r i s -塩酸 （ p H 7. 5)
0. 09% 4-ァミノアンチピリン （和光純薬工業製）
0. 06% TODB (同仁化学研究所製）
15U/m 1 パーォキシダーゼ （シグマ製）
18. 75U/m 1 FOD923
(TODB ： N， N—ビス (4 -スルホブチル) —3 -メチルァニリン） 表 6
RAW DATA(pH3.5)
Figure imgf000042_0001
実施例 3
微生物からのへモグロビン A 1 c測定用プロテアーゼのスクリーニング 各種徼生物を D i f c o La c t o b a c i l l i MR S B r o t h (べクトンデッキンソン製）、 MM培地 （2. 5%マンノース、 2. 5%ビール 酵母エキス、 pH7. 0)、 YPG培地 （2%グルコース、 1%ポリペプトン、 2%酵母エキス、 0. 1°/。リン酸 2水素 1カリウム、 0. 05%硫酸マグネシ ゥム 7水和物、 pH7. 0) で 28〜30° (、 1〜7日間振盪培養し、 培養液 から遠心分離により菌体を除去して培養上清を得た。 得られた培養上清を 10 mMリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 5) で 10倍に希釈してサンプルとし、 実施例 1と同様に測定をした。 MRS B r o t hで培養した微生物の結果を 表 7に、 MM培地で培養した微生物の結果を表 8に、 Y P G培地で培養した微 生物の結果を表 9 (ただし、 表 9は副波長を測定していない） に示す。 表 7
RAW DATA(pH7.5)
Figure imgf000043_0001
実施例 4
パチラス. エスピー ASP 842 (FERM BP— 08641) 由来のプ 口テアーゼの精製方法と理化学的性質
1 50 mlの D i f c o L a c t o b a c i l l i MR S B r o t h (べクトンデッキンソン製） を入れた 500m 1容三角フラスコ 4本でパチ ラス. エスピー ASP 842 (FERM BP— 08641) を 28°C、 3日 間振盪培養した後、 培養液から遠心分離により菌体を除き培養上清 （77mU Zml、 560ml) を得た。 この培養上清に硫酸アンモニゥム 210 gとパ 一ライト （東興パーライト工業製） 8. 4 g加えて撹拌した後に径 90 mmの 濾紙 No. 5 A (東洋濾紙製） で濾過することで析出したプロテア一ゼを捕集 し、 続いてこの析出物を 1 OmMリン酸カリウム緩衝液 ( H 7. 5) で懸濁 した後径 90 mmの濾紙 5 A (東洋濾紙製） で濾過することでプロテアーゼ活 性を含む濾液 （215 mU/m 1、 90ml) を得て、 10 mMリン酸カリゥ ム緩衝液 （PH7. 5) 5 Lに透析をした。 透析済みプロテア一ゼ液を 1 Om Mリン酸カリウム緩衝液 （i H7. 5) で平衡化した DEAE - S e p h a r o s eFF (アマシャム製） のカラム （26 φ χ 94mm) に吸着させた後、 0 Mから 0. 5Mの Na C 1のグラジェントで溶出させてプロテアーゼ活性を含 む画分 （217mU/ml、 54ml) を得た。 この画分に 1 Mになるように 硫酸アンモニゥムを添加した後、 1M硫酸アンモニゥム、 1 OmMリン酸カリ ゥム緩衝液 （ρΗ 7. 5) で平衡化した Ph e n y 1— S e p h a r o s e C L-4 B (アマシャム製） のカラム （15 φ χ 150πιπι) に吸着させた。 その 後、 1M硫酸アンモニゥム、 0%エチレングリコールから 0Μ硫酸アンモニゥ ム、 20%エチレングリコールのグラジェントで溶出させた後プロテアーゼ活 性を含む画分（237 mU/m 1、 18ml) を Am i c o n U l t r a 1 000 OMWCO (ミリポア製） で濃縮して精製プロテアーゼ （13. 9U/ ml、 0. 42m l) を得た。 なお、 本プロテアーゼの活性測定試薬おょぴ方 法を以下に記载する。
く測定試薬〉
50 mM Tr i s -塩酸 （ ρ H 7. 5)
2mM 塩化カルシウム
0. 1 % Tr i t o n X- 100
0. 03% 4 -ァミノアンチピリン
0. 02% TOOS
5 U/m 1 パーォキシダーゼ
5U/m 1 FOD923
0. 25 mM 基質
ぐ測定方法 >
測定試薬 0. 2mlを試験管に入れ、 37°Cで 5分間予備加温した後、 0. 02m 1の酵素液を添加して 10分間反応させた。 反応後、 0. 5%の303 を 0. 5 ml添加して反応を停止させ、 波長 555 nmにおける吸光度 （A a ) を測定した。 また、 ブランクとして酵素液の代わりに蒸留水で同様の操作を行 つて吸光度を測定する （Ab)。 この吸光度 （Aa) とブランクの吸光度（Ab) の吸光度差 （Aa- Ab) より酵素活性を求めた。 酵素活性 1単位は 37°Cで 1 分間に 1マイクロモルの過酸化水素を生成させる酵素量とした。 ただし、 基質 は β糖化ペンタぺプチドを用いた。
<理化学的性質 >
(1) 基質特異性
実施例 4に記載の <測定方法 >において、 FOD 923の濃度を 50UZm 1に変更し、 基質として 0. 25 mMの i3糖化ペンタペプチド、 0. 25 mM の a糖化ペンタペプチド、 0. 03mMの FVH、 0. 03mMの FVL、 0. 03mMの FVを用いて測定した。 また、 これと同様の測定を FOD 923に かえて FOD 2を用いて行った。 さらにまた、 比較のためにニュートラルプロ テアーゼ （東洋紡製） においても同様の測定を行った。 得られた吸光度差 （A a - Ab) を表 10に示した。 本プロテアーゼがニュートラルプロテアーゼ （東 洋紡製） と同様に a糖化ペンタぺプチドから糖化ァミノ酸または糖化ぺプチド を切り出すことなく）3糖ィ匕ペンタペプチドから FVHを切り出していることが ゎカゝる。
表 10
Figure imgf000045_0001
(2) 至適 pH
実施例 4に記載の測定法において 5 OmMの T r i s-塩酸 (pH7. 5) の かわりに 5 OmMの T r i s—塩酸 （pH8. 0、 8. 5)、 50mMの P I P E S (pH6. 0、 6. 5、 7. 0)、 50 mMのクェン酸一クェン酸ナトリウ ム （pH5. 5、 6. 0、 6. 5) を用いて、 0. 25mMの基質を 0. lm
Mの j3糖化ペンタペプチドにして測定をした結果を図 2に示す。 pH6. 0付 近が至適であることがわかる。
(3) pH安定性
酵素を 50mMの Tr i s—塩酸 (pH7. 5、 8. 0、 8. 5) および 50 mMの P I PES (pH6. 0、 6. 5、 7. 0) 中で 50°C、 20分間処理 し、 その残存活性を測定した。 その結果を図 3に示す。
(4) 至適温度
プロテアーゼ溶液 20 μ 1を反応液（5 OmM T r i s—塩酸（pH7. 5)、 2mM 塩化カルシウム、 0. 1% Tr i t o nX - 100、 2. 5 mM β ペンタペプチド） 100 1.に添力卩レ、 30， 37， 42， 50， 55, 60， 65 °Cの各温度で 10分間反応させた後、 0. 5M EDTAを 5 μ 1加えて 反応を停止させた。その後、発色液（0. 03% 4-ァミノアンチピリン、 0· 02% TOOS、 5 OU/m 1 パーォキシダーゼ、 10. 5 UZm 1 F OD 923) 95 μ 1添加して 37°C5分間反応させ、 続いて 0. 5% SD Sを 0. 5ml添加してから 555 n mの吸光度を測定することで至適温度を 測定した。 結果を図 4に示す。
(5) 熱安定性
5 OmM T r i s—塩酸（pH7. 5) 中にプロテアーゼを入れ、 4、 37、 50、 60、 70°Cの各温度で 10分間処理した後に残存活性を測定した。 結 果を図 5に示す。
(6) 分子量
35 kD a (SDS- PAGE)
32721 D a (MALD I-TOF MASS分析) ' 実施例 5
エアロモナス ' ヒ ドロフイラ NBRC3820 菌株由来のプロテアーゼの 培養方法、 精製方法および酵素学的性質
ぐ培養方法 >
500ml容坂ロフラスコ 10本に 100 mlの YPG培地 （2. 0%グル コース、 1. 0%ポリペプトン、 2. 0%酵母エキス、 0. 1% KH2PO'4、 0. 05% Mg S04 - 7H20, pH 7. 0) を入れ、 殺菌後、 エアロモ ナス . ヒドロフイラ NBRC 3820を植菌し、 30°C、 2日間振盪培養し た。
ぐ精製方法 > 得られた培養液を遠心分離して培養上清に 40 % 飽和になるように硫酸ァ ンモニゥムを加え、 遠心分離した上清を 40%飽和硫酸アンモニゥムを加えた 0. 1 Mトリス塩酸緩衝液 (pH 7. 3) で平衡化した Bu t y l To y o p e a r l 650M (30 Χ ΐ 50 mm, 東ソー製） のカラムに供与し た。 10%飽和になるように硫酸アンモニゥムを加えた 0. 1 M トリス塩酸 緩衝液 (pH 7. 3)で洗浄を行い、 0 · 1 M トリス塩酸緩衝液 (pH 7. 3) で溶出した。 その溶出液の活性画分を 50 mM トリス塩酸緩衝液 (pH 7. 3) で透析した後、 同緩衝液で平衡化した DEAE—S e p h a r o s e Fa s t F l ow (30 ΦΧ 150 mm, アマシャム製） のカラムに 供与し、 0 から 0. 5 M までの Na C l のリニアグラジェントで溶出し た。 その溶出液の活性画分に 40 % 飽和になるように硫酸アンモニゥムを加 え、 40%飽和硫酸アンモユウムを加えた 0. 1 Mトリス塩酸緩衝液.（pH 7. 3 ) で平衡化した Bu t y l— To y o p e a r l 650M ( 18 X 15 0 mm, 東ソー製） のカラムに供与し、 40% から 0% までの飽和硫酸ァ ンモニゥムのリニアグラジェントで溶出した。 活性画分を回収し、 蒸留水に対 して透析し、 精製プロテアーゼを得た。 精製の過程を表 11にまとめた。
本酵素の活性は次のようにして測定した。 j3糖化ペンタペプチドを 0. 5 m Mになるように溶解した 10 OmMのトリス塩酸緩衝液 （pH7. 5) 0. 4 5 m 1を光路長 1 c mのセルに入れ、 37でで 5分間予備加温した後、 0. 0 5mlの酵素液を添加して 10分間反応させた。反応後、測定試薬（0. 04% TOOS、 0. 06% 4-ァミノアンチピリン、 パーォキシダーゼ 10 U、 力 一ブラリア ·クラベータ YH 923由来ケトァミンォキシダーゼ 10Uを含む 10 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH7. 5)) 0. 5mlを加え、 2分間発色さ せた後、 Q. 5%SDS 2m 1を添加して反応を停止させ、 波長 550 nmに おける吸光度 （Aa) を測定した。 また、 ブランクとして基質を含まない各種 緩衝液を加え、 同様の操作を行って吸光度を測定した （Ab)。 この吸光度 （A a) とプランクの吸光度 （Ab) の吸光度差 （Aa- Ab) より酵素活性を求め た。 表 11
Aeromonas hydrophila NBRC3820由来プロテアーゼの精製 精製ステップ 総 曰里 (A280) 総活性 (u) 比活性 (U/A28。） 回収率 (%)
40-80%硫酸アンモニゥム
32,500 455 0.01 100.0 塩析
Butyl-Toyopearl 650M 31.5 302 9.60 66.5
DtAE-sepharose FF 13.4 132 9.82 29.0
Butyl-Toyopearl 650M 11.4 112 9.85 24.7
<理化学的性質 >
(1) 作用
本発明のエアロモナス · ヒドロフイラ NBRC 3820由来プロテアーゼ の α糖化ペンタペプチドと ]3糖化ペンタペプチドに対する作用は表 12の通り である。 反応時の各基質濃度を 0. 25mM とし、 エアロモナス 'ヒドロフ イラ NBRC 3820由来プロテアーゼ （1. 0 U) を加えて 30°Cで 5— 60分間反応させ、 反応液をプロテインシーケンサー（島津製）に供与し、 プロ テアーゼの作用により生成したぺプチドの N末端アミノ酸配列を決定した。 その結果、 エアロモナス 'ヒドロフイラ NBRC3820由来プロテア一 ゼは α糖化ペンタペプチドには作用せず、 糖化ペンタぺプチドのヒスチジン とロイシンの間のぺプチド結合を切断し、 F VHとロイ.シル-トレオニル-プロ リン （LTP) を生成した。
(2) 至適 ρΗ
]3糖化ペンタペプチドを 0. 5mMになるように溶解した ρΗ3. 0〜11. 0の各種緩衝液 （ρΗ3〜5は 100 mMの酢酸緩衝液、 pH5〜7は 100 πιΜのクェン酸緩衝液、 ρΗ7〜9は 100 mMのトリス塩酸緩衝液、 p H 9 〜11は 10 OmMのホウ酸緩衝液） 0. 45m 1を光路長 1 cmのセルに入 れ、 37 °Cで 5分間予備加温した後、 0. 05mlの酵素液を添加して 10分 間反応させた。 反応後、 測定試薬 （0. 04% TOOS、 0. 06% 4-アミ ノアンチピリン、 パーォキシダーゼ 10 U、 カーブラリア .クラベータ YH 9 23由来ケトァミンォキシダーゼ 10Uを含む 10 OmMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)) 0. 5m Iを加え、 2分間発色させた後、 0. 5%SDS 2m 1を添加して反応を停止させ、 波長 550 nmにおける吸光度 （A a ) を測定 した。 また、 ブランクとして基質を含まない各種緩衝液を加え、 同様の操作を 行って吸光度を測定した （Ab)。 この吸光度 (Aa) とブランクの吸光度 （A b)の吸光度差 (Aa-Ab) より酵素活性を求めた。その結果を図 6に示した。
(3) pH安定性
酵素液を 1 OmMの各種緩衝液中で 4°C、 24時間処理し、 その残存活性を 本酵素の <精製方法 >で記載した活性測定法に従って測定した。 その結果を図
7に示した。
(4) 至適温度
J3糖化ペンタぺプチドを 0. 5 mMになるように溶解した 100 mMトリス 塩酸緩衝液 （ρΗ 7. 5) 0. 45m 1を光路長 1 cmのセルに入れ、 15— 70 で 5分間予備加温した後、 0. 05m lの酵素液を添加して 10分間反 応させた。 反応後氷中で冷却した後、 測定試薬 （ 0. .04% TOOS, 0, 0 6% 4-ァミノアンチピリン、 パーォキシダーゼ 10 U、 カーブラリア 'クラ ベータ YH923由来ケトァミンォキシダーゼ 10Uを含む 100 mMトリス 塩酸緩衝液 (pH7. 5)) 0. 5mlを加え、 2分間発色させた後、 0. 5%S DS溶液 2m Iを添加して反応を停止させ、波長 550 nmにおける吸光度（A a) を測定した。 また、 ブランクとして FVHを含まない各種緩衝液を加え、 同様の操作を行って吸光度を測定した （Ab)。 この吸光度 （Aa) とブランク の吸光度（A b )の吸光度差（A a - A b ) より酵素活性を求めた。 15〜 70 °C の範囲で変化させて至適温度を求めた結果を図 8に示した。
(5) 熱安定性
酵素液を 100 mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5) 中で各温度 30分間加 熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。 その結果を 図 9に示した。
(6) 分子量
YMC-P a c k D i o l— 200G (6. 0 φ X 300 mm、 ヮイエムシ 一製） によるゲル濾過から本酵素の分子量を求めた。 標準蛋白質として牛血清 アルブミン、 オボアルブミン、 大豆トリプシンインヒビター （全てシグマ製） を使用した。 その結果、 分子量は約 33， Q 00であった。
L a e mm 1 iの方法での 10% g e l による SDS— PAGE (ドデ シル硫酸ナトリウム ·ポリアクリルアミドゲル電気泳動） では、 分子量は約 3 3, 000 であった。 尚、 標準蛋白質は SDS— PAGE スタンダード Lo w (パイオラッド製） を使用した。
以上の結果から、 本発明のエアロモナス ' ヒドロブイラ NBRC 3820 由来プロテアーゼは単量体であることが明らかである。
(7) N末端部分アミノ酸配列 4007341
前記方法に従って、 エアロモナス ' ヒドロフイラ NBRC3820培養液 から得た精製酵素を蒸留水に溶解し、 N末端配列シークェンサ一 （島津製作所 製 P P S Q- 21 ) を用いて解析した。 得られた配列は次の配列番号 12に示 すようになった。 得られた N末端部分アミノ酸配列をもとに、 既知のプロテア ーゼとの相同性を検索した結果、 エアロモナス ' ヒドロフイラ由来エラスター ゼと 98%の相同性を示した。
Val Asp Ala Thr Gly Pro Gly Gly Asn Val Lys Thr Gly Lys Tyr Phe Tyr Gly (配列番号 12)
(8) 部分アミノ酸配列
前記方法に従って、 エアロモナス . ヒドロフイラ NBRC 3820培養液 から得た精製酵素の凍結乾燥品 60 gを用い、 「マイクロシークェンスのため の微量タンパク質精製法、 P 48- 52、 羊土社 （1992年）」.に準じて、 酵 素の断片を得て、 その配列を決定した。 即ち、 50 ;ί 1の 45 mMジチオスレ ィトールを加え、 50°C、 15分間処理を行い、 5 μ 1の 10 OmMョードア セトアミドを加え、 15分間放置した。 続いて、 140 μ 1の蒸留水を加え、 1. 0 μ gエンドプロテー "一ゼ Ly s— C (ロッシュ 'ダイァグノスティック ス製） を添加後、 37°C、 一晚インキュベートした。 その断片化した酵素を H PLCにより分離し、 各酵素断片を取得した。 その各断片を N末端配列シーク ェンサ一 （島津製作所製 PPSQ-21) を用いて解析した。 得られた配列は 次の配列番号 13， 14に示すようになった。 得られた 2つの部分アミノ酸配 列はいずれもエアロモナス · ヒドロフイラ由来エラスターゼのアミノ酸配列と 完全に一致した。
Leu Asp Val Ala Ala His Glu Val Ser His (配列番号 13 )
Phe Gly Asp Gly Ala Thr (配列番号 14 )
以上のエアロモナス · ヒ ドロフイラ NBRC 3820由来のプロテアーゼの 性質を表 12にまとめた。
T/JP2004/007341
表 12
Aeromonas hydrophila NBRC3820
分子量（Da)
SDS-PAGE 33,000
反応最適 pH (37°C, 10min) pH6.5-7.0
pH安定性（5°C, 24h) pH6.0-11.0
反応最適温度（PH7.5, 10min) 50°C
温度安定性（PH7.5, 10min) 〜60°C
基質特異性
I
F-VHLTP(P鎖） 100 F-V Π (β鎖） N.D.
I
F-VLSPA(a鎖） N.D.
エラスチンの分解 +
N末端アミノ酸配列 VNATGPGGNVKTGKYFYG
心様; ct
Frc一 Va卜 His- iLeu— Thr-Pro
実施例 6
リゾパクター .ェンザィモゲネス YK— 366 (FERM BP—1001 0) 菌株由来のプロテアーゼの培養方法、 精製方法および酵素学的性質 ぐ精製方法 >
実施例 5で記載した製造及び精製法と同様の方法により活性画分を回収し、 蒸留水に対して透析し、 精製プロテアーゼを得た。 精製の過程を表 13にまと めた。 活性測定法も実施例 5と同様に行った。 表 13
Lysobacter enzymogenes YK-366由来プロ亍ァーゼの精製 精製ステップ 総蛋 Ed . (A280) 総活性 (u) 比活性 (U/A28。） 回収率 (%)
40-80%硫酸アンモニゥム
39,500 524 0.01 100.0 塩析
Butyl-Toyopearl 650M 36.8 261 7.09 49.8
DEAE-sepharose FF 5.6 49 8.75 9.4
Butyl-Toyopearl 650M 5.1 41 8.04 7.8
<理化学的性質〉
(1) 作用
本発明のリゾパクター'ェンザィモゲネス YK— 366由来プロテアーゼの α糖化ペンタペプチドと 糖化ペンタペプチドに対する作用は表 14の通りで ある。 実施例 5の （1) で記載した方法に従って、 本発明のリゾパクター 'ェ ンザィモゲネス ΥΚ-366由来プロテアーゼの α糖化ペンタぺプチドと β 糖化ペンタペプチドに対する作用を調べた結果、 リゾパクター ·ェンザィモタ ネス ΥΚ- 366由来プロテアーゼは α糖ィヒペンタペプチドには作用せず、 β 糖化ペンタぺプチドのヒスチジンとロイシンの間のぺプチド結合を切断し、 F VHと LTPを生成することがわかった。
(2) 至適 ρΗ
実施例 5の （ 2 ) に記載した方法に従って、 リゾパクター .ェンザィモゲネ ス ΥΚ- 366由来プロテア一ゼの至適 ρΗを調べた結果を図 10に示した。
(3) ρΗ安定性
実施例 5の （3) に記載に方法に従って、 本発明のリゾパクター 'ェンザィ モゲネス ΥΚ- 366由来プロテア一ゼの ρΗ安定性を調べた結果を図 1 1 に示した。
(4) 至適温度
実施例 5の （4) に記載の方法に従って、 本発明のリゾパクター 'ェンザィ モゲネス ΥΚ- 366由来プロテア一ゼの至適温度を調べた結果を図 12に 示した。
(5) 熱安定性
実施例 5の （5) に記載の方法に従って、 本発明のリゾパクター 'ェンザィ モゲネス ΥΚ- 366由来プロテア一ゼの熱安定性を調べた結果を図 13に 示した。
(6) 分子量
実施例 5の （6) で記載した方法に従ってゲル濾過ならぴに SDS- PAGE による分子量を求めた結果、 分子量は約 35， 000であった。
以上の結果から、 本発明のリゾパクター ·ェンザィモゲネス YK- 366由 来プロテアーゼは単量体であることが明らかである。
(7) N末端部分アミノ酸配列
前記方法に従って、 リゾパクタ一'ェンザィモゲネス Y K- 366培養液か ら得た精製酵素を蒸留水に溶解し、 N末端配列シークェンサ一 （島津製作所製 PPSQ-21) を用いて解析した。 得られた配列は次の配列番号 15に示すよ うになった。
Ala Leu Val Gly Thr Gly Pro Gly Gly Asn Gin Lys Thr Gly Gin Tyr Glu Tyr Gly Thr (配列番号 15 )
(8) 部分アミノ酸配列
前記方法に従って、 リゾパクター ·ェンザィモゲネス YK- 366培養液か ら得た精製酵素の凍結乾燥品 60 μ gを用い、 常法 (マイクロシークェンスの ための微量タンパク質精製法、 p 48- 52、 羊土社、 1992年） に準じて、 酵素の断片を得て、 その配列を決定した。 即ち、 50 1の 45mMジチォス レイ トールを加え、 50°C、 15分間処理を行い、 5 μΐの 10 OmMョードア セトアミドを加え、 15分間放置した。 つづいて 140 1の蒸留水を加え、 1. 0 gエンドプロテーナーゼ L y s— C (ロッシュ 'ダイァグノスティック ス製） を添加後、 37°C、 一晩インキュベートした。 その断片化した酵素を H PLCにより分離し、 各酵素断片を取得した。 その各断片を N末端配列シーク ェンサ一 （島津製作所製 PPSQ-21) を用いて解析した。 得られた配列は 次の配列番号 16、 1ケに示すようになった。
Tyr Ser Xaa Asn Tyr Glu Asn Ala (配列番号 16 )
Phe Gly Asp Gly Ala Thr (配列番号 17 )
以上のエアロモナス 'ヒドロブイラ NBRC3820由来のプロテアーゼの '14質を表 14にまとめた。 1
表 14
Lysobacter enzymogenes YK-366
分子量（Da)
SDS-PAGE 35,000
反応最適 pH (37°C, 10min) ρΗ6·0- 6.5
pH安定性（5°C, 24h) ρΗ5.0 - 11.0
反応最適温度（pH7.5, 10mir 50°C
温度安定性（PH7.5, 10min) 〜60。C
基質特異性
F - VHLTP(P鎖） 100
1
F-VHLTP(B鎖） N.D.
i
F - VI_SPA(Ct鎖） N.D.
エラスチンの分角军 +
N末端アミノ酸配列 ALVGTGPGGNQ TGQYEYG1
、様ェ C
Frc-Va卜 His一 Leu-Thr一 Pro 実施例 7
遺伝子改変による F ZKへの作用が低下した変異型ケトァミンォキシダーゼ の取得
くカーブラリア ·クラベータ YH 923由来ケトナミンォキシダーゼの変異ラ イブラリーの構築 >
FOD 923の変異ライブラリーの構築は DN Aポリメラーゼの誤読を利用 したエラープローン P CRにより作成した。 エラープローン P CRは上記参考 例に記載の p POS FOD 923を铸型とし、 P 51プライマー及ぴ P 52プ ライマー （次の IE列番号 18及ぴ 19に示す） を用いて R e a d y- T o- G o PGR b e a d s (アマシャム製） で塩化マグネシウムを終濃度 2. 5 mMに なるよう添加して行なった。 サイクル条件は 94°CX 40秒→55°CX 30秒 →72°CX 1分； 25サイクノレで行つた。 列番号 18)
P 52 7341
CGTC (配列番号 1 9)
増幅された P C R産物は G FX P CR DNA a n d G e l B a n d P u r i f i c a t i o n—キット （アマシャム製） を用いて精製した。
この精製された P C R産物 0. 2 μ gを制限酵素 N c o I及び S a c Iで消 化した後、 エタノール沈殿により回収した。 一方、 0. 5 μ§の p POS FOD 9 2 3も同じ制限酵素で消化し、 ケトアミンォキシダーゼ遺伝子を含まない 2 · 9 k b pの DNA断片をァガロースゲル電気泳動により分離し、 GFX P CR DNA a n d G e l B a n d P u r i f i c a t i o n—キットを用いて 回収した。 L i g a t i o n H i g hキット （東洋紡製） にて前述の両 DNA 断片を 1 6 °Cにて 3 0分間反応させて結合し、 大腸菌 J Ml 0 9のコンビテン トセルを形質転換した。 形質転換体は 5 0 /z g/m 1のアンピシリンを含む L B寒天培地に塗布し、 コロニーが 1一 2mm程度に生育するまで 3 7°Cで静置 培養した。
く F ZKへの作用が低下した変異型ケトァミンォキシダーゼのスクリーニング >
9 6穴マイクロプレートにあらかじめ滅菌しておいた発現用培地 （3%のソ ルビトール、 1. 5%のポリペプトン， 1. 5%の酵母エキス、 5 0 i gZm 1のアンピシリンを含み、 p H 7. 0に調整した培地） 1 0 0 /z lを加え、 そ こに生育した形質転換体を接種し、 3 0°Cで一晚培養した。 培養終了後、 培養 液から 5 1ずつ 9 6穴プレートの 2つのゥエルに分注し、 測定試薬 （I mM FVHまたは F ZK：、 0. 0 2% TOOS、 0. 0 2% 4—ァミノアンチピ リン、 1 0 U/m 1 パーォキシダーゼを含む 5 0 mM トリス塩酸緩衝液 (p H 7. 5)) 5 0 /z lを加え、 3 0°Cで 1 0— 6 0分間反応させた。 0. 5% S D Sを 1 5 0 μ 1添加して反応を停止させ、 マイクロリーダー （パイオラッド 製 mo d e 1 4 5 0) で 5·5 0 nmの吸収を測定した。
構築した変異ライブラリーより、 FVHには作用するが、 F Z Kへの作用が低 下したケトァミンォキシダーゼを生産している組換え体を選抜した。 スクリー ユングの結果、 優良変異株として 9 2 3- F 1及ぴ 9 2 3- F 2を得た。 これら の変異株の有するケトァミンォキシダーゼ遺伝子の塩基配列を決定したところ、 表 1 5に示したような塩基に変異が導入されていた。 表 15 対応するァミノ 使用した制限
退伝ナ変異 FZK/FVH
酸変異 酵素
FOD923 - - - 1.1
923-F1 185 g→a 62 →H 一 0.24
172 a→g 58 I→V
923 F2 185 g→a 62 R→H 0.025
988 t→c 330 F→L
923-I58V 172 a→g 58 I→V Xbal 0.12
Wool
923-F330L 988 t→c 330 F→L 0.95
Bsi1107I
172 a→g 58 I→V Ncol
923- Fro2 0.025
185 g→a 62 R→H Sst1107I ただし、塩基番号の表記は配列番号 1記載の塩基配列において 471番目
を 1番目とし、 イントロン部分を除いて数えた番号である。
<変異型ケトアミンォキシダーゼの基質特異性の確認 >
選抜した 1株のコロニーを LB培地 （50 μ g/m 1のアンピシリンを含む） 5mlに植菌し、 30°C， 20時間振盪培養を行った。 培養終了後の培養液か ら遠心分離により菌体を集菌し、 0. 1Mトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5) 5 mlに菌体を懸濁させ、 超音波破砕により菌体の可溶ィ匕を行った。 この可溶ィ匕 液を遠心分離 （8， 000 r pm, 10分間） し、 .その上清をケトアミンォキ シダーゼ粗酵素液とした。 これらの粗酵素液を用いて FVHと FZKを基質と してく F ZKへの作用が低下した変異型ケトァミンォキシダーゼのスクリー二 ング >で記載した活性測定方法に従って特異性 （F Z Kへの活性の F VHへの 活性に対する相対活性、 以後 FZK/FVHと示す） を求めた。 その結果、 表 15に示したように 923-F 1と 923-F 2の F Z KZF VHはそれぞれ 0. 24と 0. 025であり、 変異型酵素は F ZKへの作用が大きく低下したとい える。
<有効変異箇所の特定 >
前述した基質特異性の改良に影響した有効変異箇所を特定するために表 15 に示した点変異が導入された変異型ケトァミンォキシダーゼを以下に示す方法 により作成した。
1 ) 変異型酵素 923-F 330Lと 923— F r o 2は、 図 14に示したプラ スミ ド P POSFOD923の制限酵素地図を基に、 野生型もしくは変異型酵 素 923- F 2の遺伝子を表 15に示した制限酵素で処理し、 目的とする変異箇 所を含む断片を切り出し、 同じ制限酵素で処理した他方のプラスミドに揷入し、 得られたプラスミドを用いて形質転換した大腸菌から取得した。
2) 変異型酵素 923-158 Vは目的とする変異を含む領域を変異プライマー P 53と P 54 (配列番号 20， 21に示す） を用いて PCRを行い、 得られ た断片を表 15に示した制限酵素で処理し、同じ制限酵素で切断した pP O S F OD 923に挿入し、 得られたブラ ミドを用いて形質転換した大腸菌から取 得した。 これらの変異型酵素をく F ZKへの作用が低下した変異型ケトァミン ォキシダーゼのスクリ一ユング >で記載した測定法で評価した結果を表 15に 示した。 アミノ酸番号 58番のイソロイシン （158) のパリンへの置換、 ま たは 62番のアルギニン （R62) のヒスチジンへの置換が F ZKに対する活 性の低減に有効であることが分つた。
C (配列番号 20 ： p POS 2のマルチクローニングサイト下流の Xb a Iサ ィトを含む）
FOD 923において 58 I→Vとなるような変異を含む配列番号 1記載の 6 37番目から 694番目の配列の相補配列）
<有効変異ァミノ酸残基の点変異試験 >
効果の高いアミノ酸番号 58番のイソロイシン （158) を他のアミノ酸に 置換し、 有 な点変異型ケトァミンオ^シダーゼの検索を試みた。 P 53 (配 列番号 20) と （表 15— 2) に示した配列をもつプライマー （P 55〜P 6 4) とを用いて、 <有効変異箇所の特定 >の 2) に示す方法で変異株を作成し た。 得られた変異型酵素の FVHに対する F ZKの活性を <F ZKへの作用が 低下した変異型ケトァミンォキシダーゼのスクリーニング >で記載した方法で 測定した結果を （表 15— 2) に示した。 表 1 5— 2
58番目アミノ 使用したプライマ一 (逆鎖側）
株名 酸に対応す アミノ酸変異 FZK/FVH プライマー
るコドン 配列 配列番号
FOD923 ate - - - 一 0.95
I58V, R62H,
923-F2 gtc - 一 - 0.025
F330L
923-I58V gtc I58V P54 GCTTCTAGACTCAA TGGAGATCGACGTTGTTCCGCAAGGGGATACCGATGAGCTTAT 21 0.12
923-I58F ttt 158 F P55 GCTTGTAGACTCAATTGGAGATGGACCTTGTTCCGGAAGCGGATACCCAT ACTTAT 22 6.4
923-I58L ctg I58L P56 GCTTCTAGACTCAATTGGAGATCGACCTTGTTCCGCAAGCGGATACCCATGAQCTTAT 23 1.6
923-I58 atg I58M P57 GCTTGTAGACTCAATTGGAGATCGAGCTTGTTCCGCAAGCGGATACCCATGAICTTAT 24 2.3
923-I58T acc I58T P58 GCTTCTAGACTCAATTGGAGATCGACCTTGTTCCGCAAGCGGATACCCATGQTCTTAT 25 0.12
923-I58A gcg I58A P59 GCTTCTAGACTCAATTGGAGATCGACCTTGTTCCGCAAGCGGATACCCATCQCCTTAT 26 0.30
923-I58Y tat I58Y P60 GCTTCTAGACTGAATTGGAGATCGACCTrGTTCCGCAAGCGGATACCCATAIACTTAT 27 54
923-I58N aac I58N P61 GCTTCTAGAGTCAATTGGAGATCGACCTTGTTCCGCAAGCGGATACCCATGIICTTAT 28 0.16
923-I58C tgc I58C P62 GCTTCTAGACTCAATTGGAGATCGACCTTGTTCCGCAAGCGGATACCCATfiCACTTAT 29 0.16
923-I58S age I58S P63 GCTTCTAGACTCAATTGGAGATCGACCTTGTTCCGGAAGCGGATACCCATGGIGTTAT 30 0.19
923-I58G ggc I58G P64 GCTTCTAGACTCAATTGGAGATCGACCTTGTTGCGCAAGCGGATACCCATSCCCTTAT 31 0.73
アミノ酸番号 58番のイソロイシン （1 58) のバリンへの置換の他に、 スレ ォニン、 ァスパラギン、 システィン、 セリン、 ァラニンへの置換が FZKに対 する活性の低減に有効であることが分かった。
<変異型ケトアミンォキシダーゼの製造 >
変異型ケトァミンォキシダーゼの精製は参考例に記載の方法と同様の方法で 行い製造した。
本発明の変異型フルクトシルァミノキシダーゼの各種基質に対する特異性は 表 16の通りである。 なお、 反応時の各基質濃度は 1 mM とし、 その他の反応 条件はく F ZKへの作用が低下した変異型ケトァミンォキシダーゼのスクリー ユング >で記載した活性測定方法に従った。 923-F 2 (以後、 FOD 923 Mともいう） は FVに対して最も高い反応性を示し、 かつ、 FVHにも高く反 応するが、 FZK、 FVLに対しては、 それぞれ 2. .5%、 0. 5%と FVHと 比較してごくわずかであり、 本酵素は F ZKや FVLへ実質的に作用しない酵 素であるといえる。 表 16
923- — F 923— F
基質 FOD923
1 2
FVH 100 100 100
FZK 95 24 2.5
FV 630 680 220
FVL 2.6 ― 0.5 くネオコスモスポラ · ヴァシンフエクタ 474由来ケトァミンォキシダーゼの 変異型 >
ネオコスモスポラ ·ヴァシンフエクタ 474 由来ケトァミンォキシダーゼ (FOD474) は、 FOD 923を含むケトァミンォキシダーゼと高い相同 性があり、 図 1に示したように、 F O D 923の I 58を含む N末端側領域の アミノ酸配列が高く保存されている。 p POSFOD474を用い、 FOD4 74の I 58を異なるアミノ酸（トレオニン）に置換した FOD474変異株 4 74- F 1を獲得した。 表 1 7には FOD474及ぴ 474- F 1の各種基質に 対する特異性を示す。 FOD474においても FVHに対する基質特異性が改 良されたことから、 他の菌種由来のケトァミンォキシダーゼにおいても 58番 目ァミノ酸領域は F V Hに対する基質特異性に強く関与する部位であると考え られる。 2004/007341
表 17
FOD47 474— F
基質
4 1
FVH 100 100
FZK 40 20
FV 540 380
実施例 8
ケトァミンォキシダーゼ FOD 923、 FOD474、 FOD923Mの FV H、 F ZKへの作用の pH依存性
反応液 （50πχΜ 緩衝液、 0. 1% Tr i t o nX— 100、 0. 03% 4—ァミノアンチピリン、 0. 02% TOOS、 5U/m 1 パーォキシダー ゼ、 2mM 基質） 200 μ 1に酵素液 20 /Z 1を添加し、 37 °C 5分間保温 後、 0. 5% SDSを 500 1加えてから 555 nmの吸光度を測定した。 緩衝液は T r i s—塩酸 （ρΗ7· 5、 8. 0、 8. 5)、 P I PES (pH6. 0、 6. 5、 7. 0)、 B i s t r i s -塩酸 （pH5. 0、 5. 5、 6. 0、 6. 5) を用いて測定し、 基質を含まない反応液を用いて同様に吸光度を測定 し、 基質に FVHと F ZKとを用いたときのそれぞれの吸光度差、 用いた酵素 液の酵素濃度を表 18に記載した。基質に F VHと F ZKとを用いたときの（F ZK/FVH) で表される相対活性 （％) を表 19に示した。 pH6付近で F VHに対する特異性が著しく向上することがわかる。 実施例 9
ケトァミンォキシダーゼ FOD 923 Mの基質特異性
く参考例：カーブラリア 'クラベータ YH923 (FERM BP— 100 09) 由来のケトアミンォキシダーゼ、 ネオコスモスポラ 'バシンフエクタ 4 74由来のケトアミンォキシダーゼ、 フザリウム. ォキシスポラム由来のケト アミンォキシダーゼ （旭化成ファーマ製） の基質特異性 >で記載した方法と同 様に測定した。 結果を表 3に示した。 表 1 8
Bistris PIPES 1 ns
(U/ml) 基質 5.0 5.5 6.0 6.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
FOD923 0.1 FVH 一 0.002 0.020 0.048 0.063 0.057 0.073 0.070 0.066 0.042 0.025
0.1 FZK -0.001 0.005 0.011 0.015 0.013 0.022 0.033 0.030 0.041 0.049
FOD474 0.167 FVH 0.023 0.084 0.187 0.273 0.265 0.303 0.243 0.163 0.104 0.063
0.833 FZK 0.012 0.022 0.042 0.063 0.066 0.093 0.132 0.162 0.200 0.210
FOD923IV 0.04 FVH 0.005 0.057 0.168 0.189 0.192 0.181 0.075 0.062 0.017 0.009
0.64 FZK -0.001 0.012 0.030 0.045 0.033 0.038 0.045 0.036 0.049 0.060
¾1 9
Bistris PIPES Ί ns
5.0 5.5 6.0 6.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
FOD923 25.0 22.9 23.8 17.8 30.1 47.1 45.5 97.6 196.0
FOD474 10.4 5.2 4.9 4.6 5.0 6.1 10.9 19.9 38.5 66.7
FOD923 1.3 1.1 1.5 1.1 1.3 3.8 3.6 18.0 41.7
実施例 10
くへモグロビン A 1 cの測定 >
まず検量線を作製するために、 光路長 1 cmのセルの中で FVH添加へモグ ロビン Al c標準液 36 μ 1に R 1 (—プロテアーゼ） を 324 1および R2 を 90 μ 1加えて 37°Cで 200秒保温した後に R3を 10 μ 1加えて 37°C で 100秒保温し、 続いて R 4を 10 μ 1加えて 37 で 100秒保温する。 その過程で R 2を加えて 180秒後の 730 nmの吸光度値 （A 1 s：)、 R 3を 加えて 90秒後の 730 nmの吸光度値 （A2 s)、 R 4を加えて 90秒後の 7 30 nmの吸光度値 （A3 s) を測定する。 また、 同様に FVH未添加へモグ 口ビン A 1 c標準液においても同様の操作を行い、 R 2を加えて 180秒後の 730 nmの吸光度値 (A 1 s ), R 3を加えて 90秒後の 730 nmの吸光 度値 （A2 s b)、 R4を加えて 90秒後の 730 nmの扱光度値 （A3 s b) を測定する。 吸光度差 Δ A s = (A3 s-A2 s) - (A3 s b-A2 s b) と F VH濃度との関係から図 15の検量線を作製した。
次に、 低値おょぴ高値へモグロビン A 1 c標準液 36 μ 1に R 1 (+プロテ ァーゼ） を 324 μ 1加え 37°Cで 60分保温した後に R 2を 90 μ 1加えて、 光路長 1 cmのセルの中において 37°Cで 200秒保温した後に R 3を 10 β 1加えて 37。Cで 100秒保温し、 続いて R4を 10 μ 1加えて 37°Cで 10 0秒保温する。その過程で R 2を加えて 180秒後の 730 nmの吸光度値 (A 1)、 R3を加えて 90秒後の 730 nmの吸光度値 （A2)、 R 4を加えて 9 0秒後の 730 nmの吸光度値 （A3) を測定する。 また、 同一サンプルで R 1 (+プロテアーゼ） のかわりに R1 (-プロテアーゼ） を用いた以外は上記と 同一の操作をして、 R2を加えて 180秒後の 730 nmの吸光度値 (Al ) 、 R 3を加えて 90秒後の 730 nmの吸光度値 （A2b；)、 R 4を加えて 90 秒後の 730 nmの吸光度値 (A 3 b ) を測定する。 低値おょぴ高値へモグロ ビン Al c標準液におけるヘモグロビン 鎖 N末端の糖化の量は吸光度差 Δ A = (A3— A 2) - (A3 b - A 2 b) と、 F VH濃度と吸光度の関係から得るこ とができ、 表 20に示すように理論値と測定値が良く一致していることがわか る。 なお、 吸光度差 ΔΑε = (A2-A1) - (Α 2 b-Al b) は糖化へモグロ ビン中のリジン残基の ε-アミノ基が糖化されている量と比例するものと考え られる。
く R1 (+プロテアーゼ） >
2 OmM T r i s -塩酸 （ p H 7. 5)
0. 1% Tr i t o n X- 100
15 OmM 塩化ナトリウム
2mM 塩化カルシウム 2. l kU/ml パチラス. エスピー由来のニュートラルプロティネース （東 洋紡製）
<R 1 (—プロテアーゼ） >
2 OmM T r i s -塩酸 （ p H 7 · 5)
0. 1% Tr i t o n X- 100
150 mM 塩ィ匕ナトリウム
2mM 塩化カルシウム
<R 2 >
2 OmM T r i s -塩酸 （ p H 7. 5)
6. 35mM WST 3 (同仁化学研究所製）
0. 08mM DA— 64 (和光純薬工業製）
25U/m 1 パーォキシダーゼ （シグマ製)
(WST-3 ： 2- (4—ィォドフエニル） —3— (2， 4ージニトロフエニル） —5 一 (2, 4—ジスノレホフェ二/レ） —2H -テトラゾリゥム） （DA— 64 ： N— (力ノレ ポキシメチルァミノカルボニル） -4， 4 ビス （ジメチルァミノ） -ジフエ二 ルァミン）
<R 3 >
50 OU/m 1 FOD 2
<R4>
50 OU/m 1 FOD 923
<低値へモグロビン A 1 c標準液 >
巿販凍結乾燥品へモグロビン測定用キヤリブレーター （デタミナ一コントロー ル HbAl c用：協和メデッタス製） 低値 （表示ヘモグロビン A 1 c値 （JD S値） ： 5. 6%) を蒸留水で 4m g/mlになるように溶解して作製。
なお、 臨床検査 46 (6) 729- 734 (2002) に記載の換算式 （J DS値） =0. 9259 (I FCC値） +1. 6697よりヘモグロビン A 1 c値（I FCC値）： 4. 2%と換算される。 よって、ヘモグロビンが α鎖 2本、 /3鎖 2本からなる 4量体で分子量 64550であるとすると、 この標準液の糖 化された β鎖 Ν末端の濃度は理論値として 0. 0052 mMとなる。
く高値へモグロビン A 1 c標準液 >
巿販凍結乾燥品へモグロビン測定用キヤリブレーター （デタミナ一コント口 ール HbAl c用：協和メデックス製） 高値 （表示ヘモグロビン A 1 c値 （J D S値） ： 10. 2 %) を蒸留水で 4 m g Zm 1になるように溶解して作製。 なお、 臨床検查 46 (6) 729-734 (2002) に記載の換算式 ( J DS値） =0. 9259 (I FCC値） +1. 6697よりヘモグロビン A 1 c値（I FCC値）： 9, 2%と換算される。 よって、ヘモグロビンが α鎖 2本、 1
]3鎖 2本からなる 4量体で分子量 645 50であるとすると、 この標準液の糖 化された /3鎖 N末端の濃度は理論値として 0. O i l 4mMとなる。
< F V H添加へモグ口ビン A 1 c標準液 >
上記の低値へモグロビン A 1 c標準液に F VH (ぺプチド研究所製） を 0 · 03 OmMおよび 0. 0 1 5 mMになるように添加して作製。
<FVH未添加ヘモグロビン Al c標準液 >
上記の低値ヘモグロビン A 1 c標準液を用いる。 実施例 1 1
<プロテアーゼ反応時間とへモグロビン A 1 cの測定値の関係 >
実施例 1 0での低値おょぴ高値ヘモグロビン A 1 c標準液におけるプロテア ーゼ反応の時間を 30分から 3 60分まで変化させ、 得られるへモグロビン A 1 cの測定値を図 1 6に示した。 これは実施例 1 0での測定値が理論値と一致 したのはプロテアーゼ反応の時間を 60分に限定したことにより偶然得られた ものではなく、 プロテアーゼ反応の時間が 30分から 3 60分において経時的 にほぼ安定しており、 真の糖化ヘモグロビンの糖化された i3鎖 N末端の量を本 測定法により測定していることを示すものである。 実施例 1 2
1) パチラス .エスピー由来のニュートラルプロティネース （東洋紡製） によ る糠化へモグロビン分解反応における p Hの影響評価
1-a) プロテアーゼ反応後、 FOD 2で糖化リジンおよぴ糖ィヒリジンを含むぺ プチドを消去してから FOD 9 23で FVH量を測定する場合
R 1反応液 （2 OmM 緩衝液、 界面活性剤、 塩ィヒナトリウム、 2mM 塩 化カルシウム、 1. 2 kUZm l ニュートラルプロティネース （東洋紡製)） 324 / l 20mM WST 3を 30. 4 μ 1と糖化ヘモグロビンサンプル 3 6 μ Iを添加してから 60秒後に R 2反応液 （ 1 00 mM 緩衝液、 50 U /m 1 パーォキシダーゼ、 0. 1 6mMDA - 64) 44. 6 μ 1加えて、 さ らに 3 00秒後に 0. 5Μ EDTAを 5 μ 1と ρΗ調製液 1 5 1を加え、 さらに 50秒後に 1 5 0 OU/m 1の FOD 2を 1 0 μ 1加え、 さらに 2 50 秒後に 50 OU/m 1の FOD 9 23を 5 μ 1加えて、 1 50秒間反応させた。 反応はすべて 3 7 °Cで吸光度計のセル中で行い、 730 nmの吸光度をモニタ 一しておき、 FOD 2を加えてから 240秒後の吸光度と FOD 9 23を加え てから 14 0秒後の吸光度の差 （A1) を求めた。 測定スキームを図 1 7に示 した。
R 1反応液にあらかじめ 3. 3 3 / Mになるように FVHを入れておいた場 合に同様の操作を行い、 吸光度差 （A2) を求めた。 また 0. 5M EDTA を 5 μ 1と p Η調製液 1 5 μ 1を R 2反応液を加えた後ではなく糖化へモグロ ビンを添加する前に加える以外は同様の操作を行うことでブランク反応時の吸 光度差 （Ab) を求めることができた。
これらの吸光度差からプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出され た FVHは 「測定値 M) = (Al-Ab) / (A2-A1) X 30」 で計算 できる。 なお、 EDT Aはプロテアーゼの反応を停止または阻害するために添 加した。 pH調製液はケトァミンォキシダーゼ FOD 2および FOD 9 23反 応時に pHが約 7. 5になる目的で添加し、 R 1および R 2反応液中で用いる 緩衝液と界面活性剤と塩化ナトリウム濃度と P H調製液の組み合わせ、 およぴ 測定結果を表 21に示した。
1-b) プロテアーゼ反応後、 FOD 2で糖化リジンおょぴ糖化リジンを含むぺ プチドを消去することなく FOD 923で FVH量を測定する場合
R 1反応液 （20mM 緩衝液、 界面活性剤、 塩化ナトリウム、 2mM 塩 化カルシウム、 1. 2 kU/m 1 ニュートラルプロティネース (東洋紡製)) 3 24 i U:i20mM WST 3を 30. 4 μ 1添カ卩し、 さらに糖化へモグロ ビンサンプル 3 6 μ 1を添加してから 6 0秒後に R 2反応液 （1 0 OmM 緩 衝液、 5 OU/m 1 パーォキシダーゼ、 0. 1 6mM DA— 64) 44. 6 1加えて、 さらに 3 00秒後に 0. 5M EDTAを 5 1と pH調製液 1 5 μ 1を加え、 さらに 50秒後に 50 OU/m 1の FOD 9 2 3を 5 μ 1加え て、 1 50秒間反応させた。 反応はすべて 3 7 °Cで吸光度計のセル中で行い、 730 nmの吸光度をモニターしておき、 0. 5M EDTAと pH調製液を 加えてから 40秒後の吸光度と FOD 9 23を加えてから 140秒後の吸光度 の差 （A1) を求めた。 測定スキームを図 1 8に示した。
R 1反応液にあらかじめ 3. 3 3 AiMになるように FVHを入れておいた場 合に同様の操作を行い、 吸光度差 （A2) を求めた。 また 0. 5M EDTA を 5 μ 1と p Η調製液 1 5 μ \を R 2反応液を加えた後ではなく糖化へモグロ ビンを添加する前に加える以外は同様の操作を行うことでプランク反応時の吸 光度差 （Ab) を求めることができた。 これらの吸光度差からプロテアーゼに より糖化ヘモグロビンから切り出された FVHは 「測定値 (βΜ) = (A1-A b) / (A2-A1) X 30」 で計算できる。 なお、 EDTAはプロテアーゼの 反応を停止または阻害するために添加した。 pH調製液はケトアミンォキシダ ーゼ FOD 2および FOD 9 23反応時に pHが約 7. 5になる目的で添加し、 R 1および R 2反応液中で用いる緩衝液と界面活性剤と塩化ナトリウム濃度と pH調製液の組み合わせ、 および測定結果を表 2 1に示した。 表 20
Figure imgf000066_0001
(2) バチラス. エスピー AS P 842由来のプロテアーゼによる糖化へモグ 口ビン分解反応における P Hの影響評価
2-a) プロテアーゼ反応後、 FOD 2で糖化リジンおょぴ糖化リジンを含むぺ プチドを消去してから FOD 923で FVH量を測定する場合
実施例 12の 1— a) の R 1反応液において 1. 2 kU/ml ニュートラ ルプロティネース （東洋紡製） のかわりに 0. 85U/m 1になるようにバチ ラス. エスピー AS P 842由来のプロテアーゼを入れ、 R1および R2反応 液中で用いる緩衝液と界面活性剤と塩化ナトリゥム濃度と P H調製液の組み合 わせを表 22で示したものを用い、 1- a) と同様の操作を行った。 測定結果を 表 22に示した。
2-b) プロテアーゼ反応後、 FOD 2で糖化リジンおょぴ糖化リジンを含むぺ プチドを消去することなく FOD 923で FVH量を測定する場合
実施例 12の 1一 b) の R1反応液において 1. 2 kUZml ニュートラ ルプロティネース （東洋紡製） のかわりに 0. 85U/m 1になるようにバチ ラス. エスピー AS P 842由来のプロテアーゼを入れ、 R1および R2反応 液中で用いる緩衝液と界面活性剤と塩化ナトリゥム濃度と P H調製液の組み合 わせを表 22で示したようにして 1 -b ) と同様の操作を行つた。 測定結果を表 22に示した。 .
(3) リゾパクター.ェンザィモゲネス YK- 366由来のプロテアーゼによ る糖化へモグロビン分解反応における p Hの影響評価
R 1反応液 （ 20 mM 緩衝液、 界面活性剤、 塩化ナトリウム、 2 mM '塩 化カルシウム、 0. 43U/m 1 Vゾパクター .ェンザィモゲネス YK-3 66由来のプロテアーゼ） に 20mM WST3を 30. 4 μ 1と糖ィヒへモグ ロビンサンプル 36 μ 1と蒸留水 5 ;ζ 1を添加してから 60秒後に R 2反応液 (100 mM 緩衝液、 5 OU/m 1 パーォキシダーゼ、 0. 16 mM D A— 64) 44. 6 μ 1加えて、さらに 300秒後に ρΗ調製液 15 1を加え、 50秒後に 50 OU/m 1の 00923を5 1加えて、 150秒間反応さ せた。 反応はすべて 37 °Cで吸光度計のセル中で行い、 730 nmの吸光度を モニターしておき、 pH調整液を加えてから 40秒後の吸光度と FOD923 P T/JP2004/007341
を加えてから 140秒後の吸光度の差 （A1) を求めた。 測定スキームを図 1 9に示した。
Figure imgf000067_0001
7341
R 1反応液にあらかじめ 3. 33 μΜになるように FVHを入れておいた場合 に同様の操作を行い、 吸光度差 （A2) を求めた。 また R1反応液に入れるプ 口テアーゼをあらかじめ 95°Cで 10分間処理して失活させたものを用いて同 様の操作を行うことでブランク反応時の吸光度差 （Ab) を求めることができ る。
これらの吸光度差からプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出され た FVHは 「測定値 (μΜ) = (Al-Ab) / (A2-A1) X30」 で計算 できる。
R 1および R 2反応液中で用レヽる緩衝液と界面活性剤と塩化ナトリウム濃度 と p H調製液の組み合わせを表 23で示したようにして実施例 12の 1 -b ) と 同様の操作を行った。 測定結果を表 23に示した。 なお、 糖化ヘモグロビンサンプルとしては 5. 9mg/m 1で換算 I FCC 値 16. 7 %のもの （糖化された β鎖 Ν末端濃度の理論値は 30. 5 μ Μとな る） を用いた。 表 21〜23の結果からプロテアーゼ反応時の ρΗが 5· 0〜
6. 0においてはプロテアーゼが糖化ヘモグロビンから FOD 923が作用す ることができる糖化リジンを含むペプチドを切り出さず、 F O D 2による消去 なく特異的に FVH量 （糖化ヘモグロビンの糖化された jS鎖 Ν末端の量） を正 確に測定でき、 つまりヘモグロビン A 1 c量を正確に測定できたことがわかる。 実施例 13
特異性の高い変異型ケトァミンォキシダーゼ FOD 923Mを用いたプロテ ァーゼによる糖化へモグ口ビン分解産物中の F V Hの測定
1 - a ) プロテアーゼ反応後、 FOD 2で糖化リジンぉよぴ糖化リジンを含むぺ プチドを消去してから FOD 9231^で？¥11量を測定する場合
実施例 12の 1- a) において、 R1反応液の緩衝液を Tr i s -塩酸 ( H
7. 5)、 界面活性剤を 0. 1% Tr i t o n X— 100、 塩化ナトリウム 濃度を 15 OmMとし、 500 U/m 1の FOD 923を 5 μ 1添加する代わ りに、 32UZmlの FOD 923Mを 5 μ 1添加すること以外は同様の操作 をして測定したところ、 ¥11の測定値は28. 6μΜであった。
1-b) プロテアーゼ反応後、 FOD 2で糖化リジンおょぴ糖化リジンを含むぺ プチドを消去することなく FOD 923Mで FVH量を測定する場合
実施例 12の 1— b) において、 R1反応液の緩衝液を Tr i s -塩酸 （pH 7. 5)、 界面活性剤を 0. 1% Tr i t o n X— 100、 塩化ナトリウム 濃度を 15 OmMとし、 500 U/m 1の FOD 923を 5 ^ 1添加する代わ りに、 32U/mlの FOD 9231^を5 / 1添加すること以外は同様の操作 をして測定したところ、 FVHの測定値は 30. ΟμΜであった。。
以上のことから、 ρΗ7. 5つまりプロテアーゼが糖化ヘモグロビンから糖 化リジンおょぴ糖化リジンを含むぺプチドを切り出してくるような条件におい ても特異性の高いケトァミンォキシダーゼを用いることで、 FOD 2による消 去なく特異的に FVH量 （糖化ヘモグロビンの糖化された 鎖 Ν末端の量） を 測定でき、 つまりヘモグロビン A 1 c量を正確に測定できることがわかる。 産業上の利用可能性
糖化へモグロビンの糖化された iS鎖 N末端を分離操作せず酵素を用いて特異 的に測定する方法、 測定試薬キットを提供することが可能となる。
[寄託生物材料への言及]
(1)
ィ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305-8566) 口 ィの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成 15年 2月 12日 （原寄託日）
平成 16年 4月 12日 （原寄託によりブタぺスト条約に基づく寄託への移 管日）
ハ ィの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM B P- 10009
(2)
ィ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305-8566) 口 ィの寄託機関に生物材料を寄託した日付
2004年 2月 24日 （原寄託日）
ハ ィの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM BP— 08641
(3)
ィ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305-8566) 口 ィの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成 16年 1月 30日 （原寄託日） 7341
平成 16年 4月 12日 （原寄託によりブタぺスト条約に基づく寄託への移 管日）
ハ ィの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM BP— 10010
(4)
ィ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305-8566) 口 ィの寄託機関に生物材料を寄託した日付
2004年 2月 24日 （原寄託日）
ハ ィの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM BP— 08642 '

Claims

請求の範囲
1. 糖化ヘモグロビンの糠ィ匕されたひ鎖 N末端から、 糖化アミノ酸または糖化 ペプチドを実質的に切り出すことなく、 糖化ヘモグロビンの糖ィヒされた ]3鎖 N 末端から糖化ァミノ酸および/または糖ィ匕ぺプチドを切り出す、 プロテアーゼ。
2. 糖ィヒヘモグロビンの糖化されたひ鎖 N末端を含むフラグメントから、 糖ィ匕 アミノ酸または糖化べプチドを実質的に切り出すことなく、 糖化へモグロビン の糖化された iS鎖 N末端を含むフラグメントから糖化アミノ酸および Zまたは 糖化ペプチドを切り出す、 プロテアーゼ。
3. 糖ィヒヘモグロビンの糖化された ]3鎖 N末端から糖ィヒアミノ酸および/また は糖化べプチドを切り出す反応を 100 %としたときに糖化へモグロビンの糖 化された
Figure imgf000071_0001
ミノ酸または糖化べプチドを切り出す反応が 1 0%以下である、 プロテア一ゼ。
4. 糖化へモグロビンの糖ィ匕された β鎖 Ν末端又は糖化へモグロビンの糖ィ匕さ れた β 鎖 Ν末端を含むフラグメントから切り出される糖ィ匕ペプチドが 1 -デォ キシフルクトシル- L -パリル- L-ヒスチジンである請求項 1〜 3のいずれかに 記載のプロテアーゼ。
5. 糖化へモグロビンの糖化された α鎖 Ν末端又は糖化へモグロビンの糖ィ匕さ れた α鎖 Ν末端を含むフラグメントから実質的に切り出されない糠化ァミノ酸 が 1 -デォキシフルクトシル- L-パリンであり、 実質的に切り出されない糖ィ匕ぺ プチドが 1-デォキシフルクトシル- L-パリル- L-ロイシンである請求項 1〜 4のいずれかに記載のプロテアーゼ。
6. リゾパクター属由来のプロテアーゼである請求項 1〜 5のいずれかに記載 のプロテアーゼ。
7. パチラス 'エスピー ASP— 842 (FERM BP— 08641) 又は エアロモナス ' ヒドロフイラ NBRC3820由来のプロテアーゼである請 求項 1〜 5のいずれかに記載のプロテアーゼ。
8. プロテアーゼがメタ口プロテアーゼ、 ニュートラルプロテアーゼ、 または エラスターゼのいずれかである請求項 1〜 7のいずれかに記載のプロテアーゼ。
9. タンパク質又はぺプチドにおけるロイシンの N末端側のぺプチド結合を切 断するエラスターゼ。
10. リゾパクター 'ェンザィモゲネス YK— 366 (FERM BP—100 10) 菌株。
11. バチラス 'エスピー ASP— 842 (FERM BP— 08641) 菌 株。
12. 請求項 6に記載のプロテアーゼを製造する方法であって、 以下の （a) 及び （b) の工程を含むプロテアーゼを製造する方法。
(a) リゾパクター属に属する菌を培養液にて培養する。
(b) 培養液からプロテアーゼを抽出する。
13. 請求項 7に記載のプロテアーゼを製造する方法であって、 以下の （a) 及び （b) の工程を含むプロテアーゼを製造する方法。
(a) バチラス ·エスピー AS P— 842 (FERM BP— 08641) 又は エアロモナス ' ヒドロフイラ NBRC3820を培養液にて培養する。
(b) 培養液からプロテアーゼを抽出する。
14. 以下の （A) の性質を有するケトアミンォキシダーゼ。
(A) ε -1-デォキシフルク トシル- （α-ベンジルォキシカルボニル- L-リジ ン） に対する反応性が 1-デォキシフルク 1、シル- L—バリノレ—L—ヒスチジンに対 する反応性に比べて 5 %以下であること。
15. さらに以下の （Β) 及び （C) の性質を有する請求項 14に記載のケト アミンォキシダーゼ。
( Β ) 配列番号 1記載のァミノ酸配列と少なくとも 75 %の相同性を有するァ ミノ酸配列で構成されること。
(C) 配列番号 1記載のァミノ酸配列において少なくとも 58番目もしくは 6 2番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていること。
16. (C) のアミノ酸置換は 58番目がパリン、 スレオニン、 ァスパラギン、 システィン、 セリン、 ァラニン、 62番目がヒスチジンへの置換である請求項 15に記載のケトアミンォキシダーゼ。
1 7. 請求項 14〜 16のいずれかに記載のケトアミンォキシダーゼのァミノ 酸配列をコードする遺伝子。
18. 請求項 17'に記載の遺伝子を含有するケトァミンォキシダーゼ発現べク タ ' ~
19. 請求項 18に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
20. 糖化ヘモグロビンの糖化された 鎖 N末端を、 分離操作せず酵素を用い て特異的に測定する方法。
21. 酵素が （i) プロテアーゼを含む請求項 20に記載の測定方法。
22. 酵素はさらに （ i i ) ケトアミンォキシダーゼを含む請求項 21に記載 の測定方法。
23. 以下の （i i i) および/または （i v) の反応工程を経由して特異的 に測定する請求項 22に記載の測定方法。
( i i i ) ( i ) のプロテアーゼが糖化ヘモグロビンから実質的に、 （i i) の ケトアミンォキシダーゼが作用する ε- 1-デォキシフルクトシル- L-リジンお よび/または ε-l-デォキシフルクトシル- L-リジンを含む糖化ぺプチドを切 り出すことなく、 糠化へモグロビンの糖化された β鎖 Ν末端から糖化ァミノ酸 および Ζまたは糖化べプチドを切り出す反応工程。
( i v) ( i i ) のケトァミンォキシダーゼの ε_1 -デォキシフルクトシル—（α -ベンジルォキシカルボニル - L -リジン） に対する反応性が 1-デォキシフルク トシル- L -パリル -L-ヒスチジンに対する反応性の 30 %以下となる反応工程。
24. (i i i) の反応工程が pH 5. 0〜6. 0の反応条件下である請求項 2 3に記載の測定方法。
25. ( i V) の反応工程が pH5. 5〜6. 5の反応条件下である請求項 23 又は請求項 24に記載の測定方法。
26. ( i ) のプロテアーゼが請求項 1〜 8のいずれかに記載のプロテアーゼで ある、 請求項 21~25のいずれかに記載の測定方法。.
27. ( i i) のケトァミンォキシダーゼが糖化ヘモグロビンの糖化された ]3鎖 N末端からプロテアーゼにより切り出された糖化アミノ酸および/または糖化 ペプチドに作用するケトァミンォキシダーゼである請求項 22〜26のいずれ かに記載の測定方法。
28. ケトァミンォキシダーゼがカーブラリア属由来である請求項 27に記載 の測定方法。
29. (i i) のケトァミンォキシダーゼが以下の （a) 及び （b) の 2種類で ある請求項 22〜 28のいずれかに記載の測定方法。
(a) 糖化ヘモグロビンの糖化された 鎖 N末端からプロテアーゼにより切り 出された糖化ァミノ酸および/または糖ィ匕ぺプチドに作用するケトアミンォキ シグーセ。
( b ) 糖化へモグロビンの糖化された ;3鎖 N末端からプロテアーゼにより切り 出された糖化ァミノ酸おょぴ Zまたは糖化ぺプチドに実質的に作用することな く、 ε- 1-デォキシフルクトシルー L—リジンおよび/または ε-l-デォキシフ ルクトシル- L-リジンを含む糖化べプチドには作用するケトアミンォキシダー ゼ。
30. (a) のケトァミンォキシダーゼが力一ブラリア属由来である及び/又は
(b) のケトァミンォキシダーゼがフザリゥム属由来である請求項 29に記載 の測定法。
31. ( i i ) のケトアミンォキシダーゼが請求項 14〜 16のいずれかに記載 のケトァミンォキシダーゼである、 請求項 22〜26のいずれかに記載の測定 法。
32. 糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖ィヒされた α鎖 N末端か ら糖化アミノ酸または耱化ぺプチドを実質的に切り出すことなく、 糖化された 鎖 N末端から糖化アミノ酸および/または糖化ぺプチドを切り出すプロテア ーゼをスクリーユングする方法であって、 長さが 3アミノ酸から 20アミノ酸 であるへモグロビン α鎮 Ν末端糖化ぺプチドぉよび長さが 3アミノ酸から 20 アミノ酸であるヘモグロビン 3鎖 Ν末端糖化べプチドを用いるスクリーニング 方法。
33. へモグロビン (X鎖 N末端糖化ぺプチドぉよぴへモグロビン 鎖 N末端糖 化ペプチドの長さが 5アミノ酸である請求項 32に記載のスクリーユング方法。
34. 糖化ヘモグロビンの糖化された J3鎖 N末端を、 分離操作せずに特異的に 測定する、 以下の （i)、 (i i) を含んでなる試薬キット。
(i) プロテアーゼ
(i i) 請求項 14に記載のケトァミンォキシダーゼ
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