WO2004050890A1 - マクロライド系化合物の製造方法 - Google Patents

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WO2004050890A1
WO2004050890A1 PCT/JP2003/015170 JP0315170W WO2004050890A1 WO 2004050890 A1 WO2004050890 A1 WO 2004050890A1 JP 0315170 W JP0315170 W JP 0315170W WO 2004050890 A1 WO2004050890 A1 WO 2004050890A1
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ferm
medium
substance
culture
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Akifumi Okuda
Satoshi Yamamoto
Takashi Sakai
Susumu Takeda
Takashi Nakashima
Katsura Kaneko
Tomohiro Sameshima
Taira Kato
Naoto Kawamura
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Mercian Corporation
Eisai Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
    • C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
    • C07D407/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/336—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having three-membered rings, e.g. oxirane, fumagillin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/162—Heterorings having oxygen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. Lasalocid

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a 12-membered macrolide compound 11107D having antitumor activity by biological conversion and a novel strain used for the method.
  • Conventional technology for producing a 12-membered macrolide compound 11107D having antitumor activity by biological conversion and a novel strain used for the method.
  • 12-membered ring macrolide compound 11107D is a 12-membered ring macrolide compound with excellent antitumor activity, and was found in a culture of Streptomyces sp. Mer_11107 strain along with 11107B substance (See WO—A 0 2/0 6 0 8 0 9).
  • the 11107D substance is equivalent to the 16-position hydroxylated product of the 11107B substance, but its productivity is lower than that of the 11107B substance, and it has been desired to establish an efficient production method. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel method for producing a macrolide-based compound 11107D by a biological conversion method using the macrolide-based compound 11107B as a starting material.
  • the present inventors have attempted to screen a microorganism capable of converting the hydrogen atom at position 16 of the macrolide compound 11107B into a hydroxyl group from a wide variety of microorganisms to solve the above-mentioned problems.
  • Strains belonging to the genus Mortierella, strains belonging to the genus Streptomyces, which are classified as actinomycetes, and strains belonging to the family Micromonosporaceae, which are also classified as actinomycetes Have the above conversion ability, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to the following (1) to (3).
  • (B) a step of collecting the macrolide compound 11107D represented by the formula (II) from the incubation solution obtained in the step (A).
  • the strain belonging to the genus Mortierella is Mortierella sp.
  • Streptomyces sp. Streptomyces sp. (Streptomyces sp.) AB-1704 strain (FERM BP-8551), A-1544 strain (FERM BP-8446) or A-1545 strain (FERM BP-8447). )).
  • Streptomyces sp. AB- having the ability to convert the macrolide compound 11107B represented by the formula (I) into the macrolide compound 11107D represented by the formula ( ⁇ ) 1704 strains (FERM BP-8551).
  • Mortierella sp. F-1529 having an ability to convert the macrolide compound 11107B represented by the formula (I) into the macrolide compound 11107D represented by the formula (II). (FERM BP-8547) or F-1530 (FERM
  • a microorganism belonging to the genus Mortierella, the genus Streptomyces or the genus Micromonosporaceae which is represented by the above formula (I)
  • Any microorganism capable of converting the macrolide compound 11107B substance to the macrolide compound 11107D substance represented by the above formula (II) can be used regardless of the species and strain, but is preferred.
  • Mortierella sp. F-1529 strain was obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Depositary at 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566 Japan, Japan. Deposited internationally as FERM BP-8547 on January 12, 2012.
  • Mortierella sp. F-1530 strain was also obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Patent Organism Depositary, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japan, Japan Was deposited internationally as FERM BP-8548 on January 12, 1995.
  • Streptomyces sp. AB-1704 strain was obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Biological Depositary, 1-chome, Tsukuba, Higashi, Ibaraki, 305-8566, Japan. Deposited as FERM P-18999 on September 5, 2015, and 1-1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, 305-8566, Japan on January 12, 2003 1 Central Independent Administration at No. 6 It was transferred to the Patent Organism Depositary Center (IP0D) of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology and transferred to the international depository FERM BP-8551.
  • IP0D Patent Organism Depositary Center
  • A-1544 and A-1545 were also transferred to the Patent Organism Depositary at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566 Japan, Japan Deposited as FERM P-18943 and FERM P-18944 on July 23, respectively, and 1-1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki 305-8566, Japan on July 30, 2003 1 Central 6 Were transferred to FERM BP-8446 and FERM BP-8447, international deposits, respectively, at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary (IP0D).
  • IP0D National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary
  • Oatmeal Agar (hereinafter sometimes abbreviated as OA), Monoretoaga (Malt Agar: 2% Malt extract + 1.5% Agar: hereinafter sometimes abbreviated as MEA), Potato dextrose agar (Potato) Dextrose Agar (hereinafter sometimes abbreviated as PDA)), the colonies show flocose, and the mycelial color is white, exhibiting a white ⁇ -l) color tone. Growth at 25 ° C for 1 week is 75 OA on the OA plate, 75-80 marauders on the MEA plate, and 75-80 marauders on the PDA plate. The mouth has a flower-shape shape. No back coloring and no production of soluble dye is observed. The description of the color tone was based on "Mettune 'Handbook of Color, ethuen Handbook of Color (Kornerup & Wanscher, 1978)".
  • Agar plate culture cells of the F-1529 strain were subjected to DNA extraction using FastPrep FP120 (Q-Blogen) and Fast DNA Kit (Q-Blogen).
  • PCR was performed using puReTaq Ready-To-Go PCR beads (manufactured by Amersham Biosciences) and PCR primers NS1 and NS8 shown in Tables 1 and 2.
  • the PCR product was purified using the QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) and used for the ABI Prism BigDye Terminator Kit (Applied Biosystems). The sequencer primers are shown in Table 1 and Table 2.
  • the resulting 18S rRNA gene of the present strain has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9. 'DNA base sequences of known strains were obtained from the Japan DMA Data Bank (http: @ ww.ddbj.nig.ac.jp /), and the homology of the 18S rRNA gene was examined. As a result, the 18S rRNA gene of Mortierella hyalina (GenBank, accession no.
  • the present inventors have determined that the present strain belongs to the genus Mortierella. ⁇
  • the 18S rRNA gene of the F-1530 strain was analyzed in the same manner as for the F-1529 strain.
  • the obtained 18S rRNA gene of the F-1530 strain has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
  • a DNA base sequence of a known strain was obtained from the Japan DNA Data Bank (http: ⁇ rain.ddbj.nig.ac.jp /), and the homology of the 18S rRNA gene was examined.
  • the 18S rRNA gene of Mortierella hyalina (GenBank, accession no.AY157493) and 100% (803 bases upstream)
  • the 18S rRNA gene of Mortierella chlamydospora (GenBank, accession no. It showed 98% (full length) homology with the 18S rRNA gene of GenBank, accession no. AF157144).
  • this strain belongs to the genus Mortierella.
  • aerial hyphae Extends aerial hyphae (Rectiflexibiles type) from the base hyphae. It forms a spore chain consisting of about 20 to 50 cylindrical spores at the tip of a mature aerial hypha. The size of the spore is 0.6-0.8, 1.0-1.111. The surface of the spore is smooth, and special organs such as spore sac, sclerotium, and flagella are unacceptable.
  • Table 3 shows the culture characteristics after culturing at 28 ° C for about 2 weeks on various media.
  • the description of the color tone is indicated by the color name of Tresner's color wheel (Tresner's Color wheels) and the code shown in parentheses.
  • Table 4 shows the growth after 2 weeks of culture at 28 ° C with various carbon sources added to Prideham-Gottrie agar medium.
  • the present inventors have determined that the present strain belongs to the genus Streptomyces.
  • Spira type aerial hyphae extend from the base hyphae.
  • a spore chain consisting of about 10 to 20 cylindrical spores is formed at the tip of a mature aerial hypha.
  • the size of spores is 1.0 X 1.2 to 1.4 ⁇ , and the surface of spores is spiny, and there are no special organs such as spores, sclerotium, and flagella. .
  • Table 5 shows the culture properties after culturing on various media at 28 ° C for about 2 weeks. The description of the color tone is indicated by the color mark of Tresner's Color Wheels and the code in parentheses.
  • Table 6 shows the growth status after adding varieties of carbon sources to Preedham Gottling agar medium and culturing at 28 ° C for 2 weeks.
  • Salt tolerance (yeast / malt agar medium, cultured for 2 weeks): Grow at a salt content of 7% or less
  • the present inventors have determined that the present strain belongs to the genus Streptomyces.
  • the size of the spores is about 0.8 ⁇ 1.0 ⁇ m, and the surface of the spores is smooth, and there are no special organs such as spores, sclerotium, and flagella.
  • Table 7 shows the culture properties after culturing at 28 ° C for about 2 weeks on various media.
  • the color notation is indicated by the color name of Tresner's color wheels and the sign in parentheses.
  • Table 8 shows the growth after 2 weeks of cultivation at 28 ° C with various carbon sources added to the Preedham-Gottrie agar medium.
  • the present inventors have determined that the present strain belongs to the genus Streptomyces.
  • the AB-1896 strain shows good or moderate growth in culture at 28 ° C for 7 to 14 days on the medium used for strain identification. ⁇ ⁇ No aerial hyphae were observed during cultivation, and spores were observed one by one on the basal hyphae. The spores are spherical, about 0.8-0.9 ⁇ in size, and the spores are warty on the surface. No special organs such as sporangia, sclerotium, and flagella are found.
  • Table 9 shows the culture characteristics after culturing on various media at 28 ° C for about 2 weeks.
  • the description of the color tone is indicated by the name of the color wheel of Tresner's color wheels and the code shown in parentheses. .
  • Table 10 shows the growth status after 2 weeks of culture at 28 ° C with various carbon sources added to Preed Ham's Gottling agar medium.
  • Meso-type diaminopimelic acid was detected from the cell wall of AB-1896 strain. Xylose and mannose were detected as major constituent sugars of all cells. The acyl type in the cell wall peptide glycan was glycolyl type. Mycolic acid was not detected. Major Menakino in as component MK- 9 (H 4), MK- 9 (H 6), MK- 10 (H 4), MK- 10 (H 6) were detected.
  • Purification was performed using Purification Kit (manufactured by QIAGEN) and used as a sample for sequencing.
  • Sequencing was performed according to a standard protocol using an ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (manufactured by Applied Biosystems) and a BigDye Terminator kit.
  • the primer used was 9F, 536R.
  • a DNA base sequence of a known strain was obtained from the Japan DNA Data Bank (http: ⁇ www.ddbj.nig.ac.jp /), and the homology between the 400-500 bases at the 5 'end of the 16s rRNA gene was examined. .
  • 98% of the 16s rRNA Jodenna of the micro image ospora sp.DSM44396 GenBank, accession no.AJ560637
  • 98% of the Micromonospora purpureochromogenes GenBank, accession no. -3 genera reference strain !!
  • AB-1896 strain is not completely identical to the genus Micromonospora in that arabinose was not detected as a major constituent sugar of all the cells and mannose was detected, which is characteristic of the genus Micromonospora.
  • the characteristic spores found in Verrucosispora gifhornensis are not observed on the medium used for strain identification, and thus do not completely match the genus Verrucosispora.
  • the present inventors determined that the AB 1896 strain was an actinomycete belonging to the Family Micromonosporaceae in consideration of these mycological properties comprehensively.
  • a macrolide-based compound 11107B substance as a starting material is incubated in the presence of the above-mentioned strain or a cultured cell preparation thereof, and oxygen.
  • This treatment is carried out by adding a substrate to the culture solution when culturing the strain under aerobic conditions, or, if necessary, by preparing a cultured cell of the strain, for example, as it is or homogenized.
  • the suspension may be added with a substrate, and incubated with aeration containing an oxygen-containing gas, for example, air.
  • the substrate may be added to the culture solution at any time before the culturing or when a certain period of time has elapsed after the start of the culturing.
  • the cells can be produced by inoculating any of the above strains into a nutrient-containing medium and aerobically culturing them.
  • the culturing of the strain for preparing the preparation of such cultured cells or the culturing of the strain with the substrate added thereto can be performed in principle according to a general microorganism culturing method. It is preferable to carry out the culture under aerobic conditions such as shaking culture by liquid culture and aeration and stirring culture.
  • the medium used for the culture may be any medium containing a nutrient source that can be used by microorganisms belonging to the genus Mortierella, the genus Streptomyces, or the genus Micromonosporaceae. Any synthetic medium, semi-synthetic medium, natural medium, etc. can be used.
  • the composition of the medium is as a carbon source, such as gnorecose, galactose, sucrose, manolethose, phenol, glycerin, dextrin, starch, Molasses, soybean oil, etc. can be used alone or in combination.
  • Nitrogen sources include pharmamedia, peptone, meat extract, soybean meal, fishmeal, gluten meal, casein, dried yeast, amino acids, yeast extract, NZ-case, organic nitrogen sources such as urea, sodium nitrate, and ammonium sulfate.
  • organic nitrogen sources such as urea, sodium nitrate, and ammonium sulfate.
  • Inorganic nitrogen sources such as platinum can be used alone or in combination.
  • salts such as sodium salt sodium, potassium chloride, calcium carbonate, magnesium sulfate, sodium phosphate, potassium phosphate, copper sulfate, iron sulfate, ⁇ iron salt manganese, salts such as cobalt chloride, salts of heavy metals, vitamin B
  • clathrates such as vitamins such as biotin, and dextrins at the mouth can also be used. If foaming during culturing is remarkable, various antifoaming agents can be appropriately added to the medium. When adding antifoam, it is necessary to use a concentration that does not adversely affect the production of the target substance.
  • Cultivation conditions can be appropriately selected within a range in which the strain can grow well and produce the above-mentioned substance.
  • the pH of the medium is preferably about 5 to 9, usually around neutral.
  • the culture temperature is generally maintained at 20 to 40 ° C, preferably at 24 to 30 ° C.
  • the culture period is about 1 to 8 days, usually about 2 to 5 days.
  • a cultured cell preparation is prepared by suspending the cells isolated by centrifugation or filtration or homogenized cells in an appropriate solution after the completion of the culture.
  • the solution that can be used for suspending the cells is the above-described medium, or a buffer solution such as tris-acetic acid, tris-hydrochloric acid, sodium succinate, sodium citrate, sodium phosphate, or potassium phosphate alone or mixed. Things.
  • the pH of the buffer is between 5.0 and 9.0, preferably between 6.0 and 7.5.
  • the substrate 11107B substance can be added to the culture solution or cell suspension, either as a powder or dissolved in a water-soluble organic solvent such as ethanol, methanol, acetone or dimethyl sulfoxide.
  • a water-soluble organic solvent such as ethanol, methanol, acetone or dimethyl sulfoxide.
  • the addition amount is preferably 50 to 5000 mg per 1 L of the culture solution.
  • shaking or aeration and agitation are performed at 20-31 ° C for about 1-5 days, and the reaction is allowed to proceed under aerobic conditions to convert the 11107B substance as the target Can be converted into a substance.
  • the incubation treatment obtained in the step (A) is performed.
  • the isolation of the 11107D substance from the reaction mixture of step (A) can be carried out by selecting and combining various known purification techniques generally used for isolating microbial metabolites. For example, organic solvent extraction using methanol, ethanol, ptanol, acetone, ethyl acetate, butyl acetate, chloroform, toluene, etc., various ion exchange chromatography, gel filtration using Sephadex LH-20, etc.
  • hydrophobic adsorption resin such as Diaion HP-20, adsorption chromatography using activated carbon, silica gel, etc., adsorption / desorption treatment using thin-layer chromatography, or high-performance liquid chromatography using a reversed-phase column, etc.
  • 0.1 ml of this culture was inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of the same seed culture medium, and cultured at 28 ° C. for 1 day to obtain a second stage seed culture.
  • 800 ml of the second-stage seed culture obtained in this manner was mixed with a production medium (soluble starch 5.0%, formalmedia 0.8%, gluten meal 0.8%, yeast extract 0.5%, calcium carbonate 0.
  • the column was eluted with a mixture (2 L) of n-hexane and ethyl acetate (l: 9; v / v). The fractions eluted from 468 ml to 1260 ml were collected and concentrated under reduced pressure. 25 mg of a crude active fraction was obtained.
  • the crude active fraction obtained was subjected to preparative high performance liquid chromatography under the following HPLC preparative conditions (A) — (HPLC), and the fraction eluted at a retention time of 34 minutes was collected, and acetonitrile was distilled off. Thereafter, the fraction was subjected to desalting by HPLC under the following HPLC preparative conditions (B) to obtain 6 mg of 11107B substance (retention time: 37 minutes).
  • Slope culture of bacterial strain isolated from soil [Soluble starch 0.5%, glucose 0.5%, fish meat ⁇ kiss (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.1%, yeast extract (Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.1% NZ-case (manufactured by Humco 'Sheffield' Chemical) 0.2%, sodium chloride 0.2%, calcium carbonate 0.1%, agar (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1.6%] to 1 ml of seed culture medium [soluble starch 2.0%, glucose 1.0%, polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.5%, yeast extract (Oriental yeast) (Industrial Co., Ltd.) 0.5%, calcium carbonate 0.1%] was inoculated into a 65 ml test tube, and cultured at 28 ° C for 3 days on a shaking incubator for seed culture. A liquid was obtained.
  • 0.5 ml of the seed culture medium was added to 7 ml of a production medium [soluble starch 2.0%, glucose 1.0%, polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.5%, yeast extract (Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.5%, calcium carbonate 0.1%] in 65 ml test tubes, and cultured on a shaking incubator at 28 ° C for 3 days.
  • 11107B substance as a substrate was prepared as a 25 mg / ml ethanol solution, and 0.2 ml was added. After the addition, the mixture was shaken at 28 ° C for 48 hours to perform a conversion reaction. After the reaction, HPLC analysis was performed under the following HPLC analysis conditions (a) to obtain a strain in which 11107D substance was generated in the reaction mixture, strain AB-1704 (FERM BP-8551).
  • 0.6 ml of the seed culture was added to 60 ml of a production medium [soluble starch 2.0%, glucose 2.0 ° / 0 , soybean powder (Essan Meat, Ajinomoto Co., Ltd.) 2.0%, yeast ⁇ kis (Oriental) 0.5%, sodium chloride 0.25%, calcium carbonate 0.32%, copper sulfate 0.0005%, manganese chloride 0.0005%, zinc sulfate 0.0005%, before sterilization
  • the cells were subcultured in a 500 ml Erlenmeyer flask containing ⁇ 7.4] and cultured on a shaking incubator at 28 ° C for 4 days. 2 ml of the resulting culture was dispensed into 15 ml test tubes.
  • the substance 11107B as a substrate was prepared as a 20 mg / ml dimethyl sulfoxide solution, and 0.05 ml ′ was added. After the addition, the mixture was shaken at 28 ° C for 23 hours to perform a conversion reaction. After the reaction, HPLC analysis was performed under the following HPLC analysis conditions (b), and the strain in which the 11107D substance was generated in the reaction mixture, the A-1544 strain (FERM BP-8446) and the A-1545 strain (FERM BP-8447) ).
  • Slope medium of Streptomyces sp. AB-1704 strain (FERM BP-8551) isolated from soil [Soluble starch 0.5%, glucose 5%, fish meat extract (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.1%, yeast extract (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.1%, ⁇ -case (manufactured by Fumco Sheffield Chemical Co.) 0.2%, sodium chloride 0.2%, calcium carbonate 0.1 %, Agar (produced by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 1.6%) and a loop of 100 ml of seed medium [soluble starch 2.0%, glucose 1.0%, polypeptone (produced by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) ) 0.5%, yeast extract (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.5%, calcium carbonate 0.1%] inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask, and shake culture at 28 ° C for 3 days The seed culture was obtained by cult
  • the obtained ethyl acetate solution was concentrated under reduced pressure to obtain 2090 mg of a crude active fraction.
  • This crude active fraction was dissolved in 4 ml of a mixture of tetrahydrofuran-methanol (1: 1, v / v) and 6 ml of a 50% aqueous solution of acetonitrile, and subjected to 0DS column chromatography (0DS-A120- S50 3.6 cm X 43 cm) and eluted with 40% aqueous acetonitrile.
  • the fraction eluted from 336 ml to 408 ml was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 560 mg of a residue.
  • the residue was further dissolved in 10 ml of a 50% aqueous methanol solution, subjected to 0DS-force chromatograph (ODS-AM120-S50, ⁇ 3.6 cm ⁇ 40 cm, manufactured by IEMS Corporation), and eluted with a 50% aqueous methanol solution.
  • ODS-AM120-S50 ⁇ 3.6 cm ⁇ 40 cm, manufactured by IEMS Corporation
  • the fraction eluted from 1344 ml to 182-1 was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 252 mg of 11107D substance.
  • a loop of 25 ml of seed culture medium [Soluble starch 2.0%, glucose 2.0%, soybean flour (Essan Meat, Ajinomoto Co., Ltd.) 2.0%, Yeast extract (Dco) 0.5%, Sodium chloride 0.25%, Calcium carbonate 0.32%, 250ml with ⁇ 7.4 before sterilization]
  • the inoculated Erlenmeyer flask was cultured at 28 ° C. for 2 days on a shaking incubator to obtain a seed culture. 0.75 ml of this culture solution was dispensed into a 2-ml serum tube (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and the same volume of a 40% glycerol aqueous solution was added thereto.
  • Seed mothers were made. This frozen seed mother was thawed, and 0.25 ml of the medium was dissolved in 25 ml of seed mother medium [soluble starch 2.0%, glucose 2.0%, soybean flour (Essan Meat, Ajinomoto Co., Ltd.) 2.0% , Yeast extract (Oriental Yeast Industry 0.5%, 0.25% sodium chloride, 0.32% calcium carbonate, pre-sterilization ⁇ 7.4] inoculated into a 250 ml Erlenmeyer flask and shaken at 28 ° C for 2 days A seed culture was obtained by culturing on an incubator.
  • seed mother medium soluble starch 2.0%, glucose 2.0%, soybean flour (Essan Meat, Ajinomoto Co., Ltd.) 2.0% , Yeast extract (Oriental Yeast Industry 0.5%, 0.25% sodium chloride, 0.32% calcium carbonate, pre-sterilization ⁇ 7.4] inoculated into a 250 ml Erlenmeyer flas
  • seed culture was added to 100 ml of a production medium [soluble starch 2.0%, glucose 2.0%, soybean powder (Essan Meat, Ajinomoto Co., Ltd.) 2.0%, yeast extract (Oriental yeast) (Manufactured by Kogyo Co., Ltd.) 0.5%, 0.25% sodium chloride, 0.32% calcium carbonate, pH 7.4 prior to sterilization. Transfer to a 500 ml Erlenmeyer flask and shake at 28 ° C for 3 days. The cells were cultured on a tomato incubator.
  • the resulting cultures (100 ml / 500 ml Erlenmeyer flasks, 10 tubes) were each centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to collect the cells, and suspended in 100 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 6.0).
  • 11107B substance as a substrate was prepared as a 100 mg / ml dimethyl sulfoxide solution, and each was added to the solution. After the addition, the mixture was shaken at 28 ° C for 24 hours to perform a conversion reaction. After completion of the reaction, the reaction solution was collected and separated into a supernatant and bacterial cells by centrifugation at 5000 rpm for 20 minutes. The supernatant was extracted with 1 L of ethyl acetate.
  • the cells were extracted with 500 ml of methanol and filtered to obtain a methanol extract. After methanol was distilled off from the methanol extract under reduced pressure, the mixture was extracted with 1 L of ethyl acetate. The respective ethyl acetate layers were washed with water, dehydrated and dried over anhydrous sodium sulfate, and then combined under reduced pressure to obtain 937 mg of a crude fraction.
  • the cells were extracted with 500 ml of acetone and filtered to obtain an acetone extract. After acetone was distilled off from the acetone extract under reduced pressure, the mixture was extracted with 1 L of ethyl acetate. Each ethyl acetate layer was washed with water, dehydrated and dried over anhydrous sodium sulfate, and then combined and concentrated under reduced pressure to obtain 945 mg of a crude fraction.
  • This crude fraction was subjected to silica gel column chromatography (Kiesel gel 60, 50 g), and a mixture of ethyl acetate and ⁇ -hexane (50:50; v / v) (100 ml), ethyl acetate and n-hexane (75 : 25; v / v) and a mixture of ethyl acetate and n-hexane (90:10; v / v) (600 ml) to obtain 463 mg of a fraction containing 11107D substance.
  • the obtained fraction was subjected to preparative high-performance liquid chromatography (HPLC) under the preparative conditions (C) described in Example 4, and the obtained eluate was subjected to HPLC under the analytical conditions (c) described in Example 4. analyzed.
  • HPLC preparative high-performance liquid chromatography
  • the solvent was distilled off from the thus obtained fraction containing the 11107D substance to obtain 304 mg of the 11107D substance.
  • slant medium potato dextrose agar medium
  • a slant medium potato dextrose agar medium
  • a 20 ml seed mother medium potato starch 2.0%, glucose 1.0%, soybean powder (Essan Meat, Ajinomoto Co., Ltd.) 2.0%, monopotassium phosphate 0.1%, magnesium sulfate heptahydrate (0.05%) was inoculated into a 250 ml Erlenmeyer flask, and cultured on a shaking incubator at 25 ° C for 3 days to obtain a seed culture.
  • 0.6 ml of the seed culture was added to 60 ml of a production medium (potato starch 2.0%, glucose 1.0%, soybean flour (Essan Meat, Ajinomoto Co., Ltd.) 2.0%, phosphoric acid reaper 0 (1%, 0.05% magnesium sulfate heptahydrate) in a 500-ml triangular flask, and cultured at 28 ° C for 4 days on a shaking incubator. 2 ml of the obtained culture was dispensed into 15 ml test tubes. Each was harvested by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes and suspended in 2 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0).
  • a production medium potato starch 2.0%, glucose 1.0%, soybean flour (Essan Meat, Ajinomoto Co., Ltd.) 2.0%, phosphoric acid reaper 0 (1%, 0.05% magnesium sulfate heptahydrate
  • 11107B substance as a substrate was prepared as a 20 tng / ml dimethyl sulfoxide solution, and 0.05 ml of each was added. After the addition, the mixture was shaken at 28 ° C for 23 hours to carry out a hydroxylation reaction. After the reaction, HPLC analysis was carried out under the analysis conditions (c) described in Example 4. The strain showing the peak of the 11107D substance, strain F-1529 (FERM BP8547) and strain F-1530 (FERM BP-8548) I got
  • 0.6 ml of the seed culture medium to 60 ml of a production medium [potato starch 2.0%, glucose 1.0%, soybean powder (Essan Meat, Ajinomoto Co.) 2.0%, monopotassium phosphate 0.1%, magnesium sulfate heptahydrate (0.05%) in a 500 ml Erlenmeyer flask, and cultured on a shaking incubator at 25 ° C for 3 days.
  • the obtained cultures (18 ml of 60 ml / 500 ml Erlenmeyer flasks) were collected by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes, and suspended in 60 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0).
  • 11107B substance as a substrate was prepared as a 100 mg / ml dimethyl sulfoxide solution, and 0.6 ml of each was added. After the addition, the mixture was shaken at 25 ° C for 22 hours to perform a conversion reaction. After the completion of the reaction, the filtrate and the cells were separated by centrifugation at 5000 rpm for 20 minutes. The supernatant was extracted with 1 L of ethyl acetate.
  • the cells were extracted with 500 ml of acetone and filtered to obtain an acetone extract. After distilling off acetone from the acetone extract under reduced pressure, 1 L of acetate Extracted with chill. Each ethyl acetate layer was washed with water, dehydrated and dried over anhydrous sodium sulfate, and then combined under reduced pressure to obtain 1.21 g of a crude fraction containing 11107D substance. The crude fraction containing the 11107D substance was subjected to silica gel column chromatography (Kiesel gel 60, 50 g), and eluted with 1200 ml of a mixture of ethyl acetate and n-hexane (90:10; v / v). A fraction containing 369 mg was obtained.
  • the obtained fraction was subjected to preparative high-performance liquid chromatography (HPLC) under the HPLC preparative conditions (C) described in Example 4 to obtain a fraction containing the eluted 11107D substance. By distilling off the solvent, 180 mg of 11107D substance was obtained.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • 0.6 ml of the seed culture was added to 60 ml of the production medium [potato starch 2.0%, glucose 1.0%, soybean powder (Essan Meat, Ajinomoto Co., Ltd.) 2.0%, monopotassium phosphate 0% .1%, magnesium sulfate heptahydrate (0.05%) in a 500 ml Erlenmeyer flask, and cultured on a shaking incubator at 25 ° C for 3 days.
  • the production medium potato starch 2.0%, glucose 1.0%, soybean powder (Essan Meat, Ajinomoto Co., Ltd.) 2.0%, monopotassium phosphate 0% .1%, magnesium sulfate heptahydrate (0.05%) in a 500 ml Erlenmeyer flask, and cultured on a shaking incubator at 25 ° C for 3 days.
  • the obtained culture solution (18 ml of a 60 ml / 500 ml Erlenmeyer flask) was harvested by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes, and suspended in 60 ml of a 50 mM phosphate buffer (pH 7.0).
  • a substance, 11107B was prepared as a 100 mg / ml dimethyl sulfoxide solution, and 0.6 ml of each was added. After the addition, the mixture was shaken at 25 ° C for 22 hours to perform a conversion reaction. After the completion of the reaction, the filtrate and the cells were separated by centrifugation at 5000 rpm for 20 minutes. The supernatant was extracted with 1 L of ethyl acetate.
  • the cells were extracted with 500 ml of acetone and filtered to obtain an acetone extract. After acetone was distilled off from the acetone extract under reduced pressure, the mixture was extracted with 1 L of ethyl acetate. Each ethyl acetate layer was washed with water, dehydrated and dried over anhydrous sodium sulfate, and then concentrated under reduced pressure to obtain a crude fraction of 0.89 g containing the substance 11107D.
  • the crude fraction containing the 11107D substance is subjected to silica gel column chromatography (Kiesel gel 60, 50 g) and eluted with 1200 ml of a mixture of ethyl acetate and n-hexane (90:10; v / v), and then 500 ml of ethyl acetate to obtain 163 mg of a crude fraction containing 11107D substance.
  • the obtained fraction was subjected to preparative high-performance liquid chromatography (HPLC) under the HPLC preparative conditions (C) described in Example 4 to obtain a fraction containing the eluted 11107D substance. By distilling off, 30 mg of 11107D substance was obtained.
  • AB-1896 strain medium soluble starch 0.5%, glucose 0.5%, fish meat extract (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.1 ° yeast extract (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) 0 1%, NZ-case (manufactured by Humco's Sheffield Chemical) 0.2%, sodium chloride 0.2%, carbonated calcium 0.1%, agar (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1 6%) to 5 ml of seed culture medium (soluble starch 2.0%, glucose 1.0%, polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.5%, yeast extract (Oriental Yeast Co., Ltd.
  • 0.5%, 0.1% calcium carbonate was inoculated into a 65 ml test tube and cultured on a shaking incubator at 28 ° C for 10 days to obtain a seed culture. .
  • 0.1 ml of seed culture was added to 5 ml of production medium (soluble starch 2.0%, glucose 1.0%, polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.5%, yeast extract (Oriental Yeast Kogyo Co., Ltd.) (0.5%, calcium carbonate 0.1%) in a 65 ml test tube, and cultured on a shaking incubator at 28 ° C for 3 days.
  • the substrate, 11107B substance was prepared as a 40 mg / ml ethanol solution in the obtained culture solution (5 ml / 65 ml test tube, 1 tube), and was added to 0.05 ⁇ 0. After the addition, the mixture was shaken at 28 ° C for 24 hours to carry out a hydroxylation reaction. The resulting culture solution was collected 3ml fraction, after shaking by adding 2ml of 1-butanol and centrifuged 10 minutes at 3000 r P m. The obtained supernatant was distilled off, and a 2 ml methanol solution was subjected to HPLC analysis under the following HPLC analysis conditions (e) and (f), and 11107D substance was generated in the reaction mixture. It was confirmed.

Description

明細書 ， マクロライド系化合物の製造方法 発明の属する技術分野
本発明は、 抗腫瘍活性を有する 12員環マクロライド系化合物 11107D物質の生物学 的変換による製造方法およびそれに用いられる新規菌株に関する。 従来の技術
12員環マクロライド系化合物 11107D物質は、 優れた抗腫瘍活性を有する 12員環マ クロライ ド系化合物であり、 11107B物質とともにストレプトミセス エスピー (Streptomyces sp. ) Mer_11107株の培養物より見出されたものである（WO— A 0 2 / 0 6 0 8 9 0参照）。 11107D物質は、 11107B物質の 16位水酸化体に相当するが、 その生産性は 11107B物質の生産性よりも少なく、 効率的な製造方法の確立が望まれ ていた。 発明の開示
本発明の課題は、 マクロライド系化合物 11107B物質を出発原料とした、 生物学的 変換方法によるマクロライド系化合物 11107D物質の新規な製造方法を提供するこ とにある。
本発明者らは、 上記課題を解決するために広範な微生物群からマクロライド系化 合物 11107B物質の 16位水素原子を水酸基に変換しうる微生物のスクリーニングを 試みたところ、 糸状菌に分類されるモルティエレラ （Mortierella) 属に属する菌 株、 放線菌に分類されるストレプトミセス（Streptomyces)属に属する菌株および同 じく放線菌に分類されるミクロモノスポラセァェ （Micromonosporaceae) 科に属す る菌株が前記変換能を有することを見出し、 本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、 以下の （1 ) 〜 （3 ) に関する。
( 1 ) 式 （I )
Figure imgf000004_0001
( I )
で示されるマクロライド系化合物 11107B物質の、 式（II)
Figure imgf000004_0002
(II) で示されるマクロライド系化合物 11107D物質への生物学的変換方法による、 式 (II) で示されるマクロライド系化合物 11107D物質の製造方法であって、 下記工程 （A) 及び （B) を含むことを特徴とする製造方法。
(A) 前記生物学的変換方法を行いうるものであって、 かつ、 モルティエレラ (Mortierella) 属、 ストレプトミセス（Streptomyces)属またはミクロモノスポラ セァェ (Mi cromonosporaceae) 科に属する菌株またはその培養菌体の調製物の存在 下で、 式 (I) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質をインキュベーション 処理する工程。
(B) 工程 (A) で得られるインキュベーション処理液から式 (II)で示されるマク 口ライド系化合物 11107D物質を採取する工程。 ( 2 ) 前記モルティエレラ属に属する菌株がモルティエレラ エスピー
(Mortierella sp. ) F - 1529株 (FERM BP - 8547)または F- 1530株 (FERM BP- 8548)である 前記 （1 ) 記載の製造方法。
( 3 ) 前記ストレプトミセス属に属する菌株がストレプトミセス エスピー (Streptomyces sp. ) AB- 1704株（FERM BP- 8551)、 A- 1544株（FERM BP- 8446)または A- 1545株 (FERM BP- 8447)である前記 （1 ) 記載の製造方法。
( 4 ) 前記ミクロモノスポラセァ工科に属する菌株カ B- 1896株 (FERM BP- 8550)で ある前記 （1 ) 記載の製造方法。
( 5 ) 前記式 （I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質から前記式 (Π) で示されるマクロライド系化合物 11107D物質への変換能を有する、 ストレプトミセ ス エスピー（Streptomyces sp. ) AB-1704株（FERM BP- 8551)。
( 6 ) 前記式 （I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質から前記式（II)で 示されるマクロライド系化合物 11107D物質への変換能を有する、 モルティエレラ エスピー (Mortierella sp. ) F- 1529株 (FERM BP- 8547)または F- 1530株 (FERM
BP- 8548)。
( 7 ) 前記式 （I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質から前記式（II)で 示されるマクロライド系化合物 11107D物質への変換能を有する、 AB-1896株（FERM BP- 8550)。 発明の詳細な説明
本発明の生物学的変換方法では、 モルティエレラ （Mortierella) 属、 ストレプ ト ^セス (Streptomyces)属またはミクロモノスホラセァェ (Micromonosporaceae) 科に属する微生物であって、 前記式 （I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B 物質から前記式 (I I)で示されるマクロライド系化合物 11107D物質へ変換する能力 を有する微生物であれば、 種および株の種類を問うことなく使用できるが、 好まし い微生物として、 いずれも土壌から分離されたモルティエレラ属に属するモルティ エレラ エスピ一（Mortierella sp. ) F- 1529株および F- 1530株、 ストレプトミセス 属に属するストレプトミセス エスピー（Streptomyces sp. ) AB-1704株、 A- 1544株 および A- 1545株、 ミクロモノスポラセァ工科に属する AB- 1896株等を挙げることが できる。 '
Mer- 11107株は、FERM P - 18144として平成 12年 12月 19日付で日本国 305 - 8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託さ れ、さらに平成 13年 11月 27日付で日本国 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番 地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IP0D) において、これを国際寄託 FERM BP- 7812に移管された。
モルティエレラ エスピー（Mortierella sp. ) F- 1529株は、 日本国 305- 8566茨 城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所特許 生物寄託センターに平成 1 5年 1 1月 1 2日付けで FERM BP - 8547として国際寄託 されている。 また、 モルティエレラ エスピー（Mortierella sp. ) F-1530株は、 同 じく日本国 305-8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 1 5年 1 1月 1 2日付けで FERM BP-8548として国際寄託されている。
ストレプトミセス エスピー（Streptomyces sp. ) AB-1704株は、 日本国 305- 8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所特許 生物寄託センターに平成 1 4年 9月 5日付で、 FERM P-18999として寄託され、 さら に平成 1 5年 1 1月 1 2日付で日本国 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央 第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IP0D)におレヽて、 これを国際寄託 FERM BP - 8551に移管された。また、 A - 1544株、 A - 1545株は、 同じく 日本国 305-8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術 総合研究所特許生物寄託センターに平成 1 4年 7月 2 3日付でそれぞれ FERM P- 18943および FERM P- 18944として寄託され、 さらに平成 1 5年 7月 3 0日付で日 本国 305- 8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター（IP0D)において、それぞれ国際寄託 FERM BP- 8446お よび FERM BP - 8447に移管された。
ミクロモノスポラセァ工科に属する AB- 1896株は、 日本国 305- 8566茨城県つくば 巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン ターに平成 1 5年 1 1月 1 2日付けで FERM BP - 8550として国際寄託されている。 なお、 上記菌株の菌学的性状は次のとおりである。
[F-1529株の菌学的性状]
(1) 形態
オートミールァガー （Oatmeal Agar：以下 OAと略称する場合がある） ， モノレトァガ 一 (Malt Agar： 2% Malt extract + 1. 5% Agar：以下 MEAと略称する場合がある） ， ポテトデキストロースァガー （Potato Dextrose Agar：以下 PDAと略称する場合が ある） のプレートにおいて、 コロニーは羊毛状（floccose)を示し、菌糸色は白色で white Α-l)の色調を呈する。 25°C、 1週間培養における生育は OAプレートで 75隱、 MEAプレートで 75〜80匪、 PDAプレートで直径 75〜80匪に達する。 コ口ニーは花笠状 の形状を示す。 裏面着色及び可溶性色素の産生は認められない。 色調に関する記述 は「メチューン 'ハンドブック ·ォプ，カラー [ ethuen Handbook of Colour (Kornerup & Wanscher, 1978) ]に従った。
光学顕微鏡による観察の結果、栄養菌糸は無色、表面は平滑で、隔壁は無く、 菌糸 の幅は 4〜5 μ πιとなる。 菌糸の一部に球状で 26. 5〜33 /z m位の厚壁胞子の様な膨らん だ構造が観察された。 供試した培地においては最長 3週間の培養でも生殖器官と思 われる構造は形成しなかった。
(2) 18S rRNA遺伝子解析
F - 1529株の寒天平板培養菌体を FastPrep FP120 (Q- BlOgene社製）及び Fast DNA Kit (Q- BlOgene社製）を用いて DNA抽出を行った。 PCRは puReTaq Ready- To- Go PCR beads (Amersham Biosciences社製）と表 1及ぴ表 2に示す PCRプライマー NS1及び NS8を用いて実施した。 PCR産物は QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を 用いて精製し、 ABI Prism BigDye Terminator Kit (Applied Biosystems社製）に用 いた。 シークェンシンダプライマ一は表 1及び表 2に示す
1, ^2, ^3，^4, 5, ^6, ^7及ぴ^8を用ぃた。 反応生成物は DyeEx2. 0 Spin Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems社製）で配列解読を行い、 AutoAssembler (Applied Biosystems社製）を用 いて各シークェンス断片を結合し、目的塩基配列を得た。 表 1 18S rRNA遺伝子の塩基配列決定に使用したプライマー （順方向）
Figure imgf000008_0001
得られた本菌株の 18S rRNA遺伝子は、 配列番号 9に記載の塩基配列を有する。 ' 日本 DMAデータバンク（http：〃 ww. ddbj. nig. ac. jp/)より公知菌株の DNA塩基配 列を入手し、 18S rRNA遺伝子の相同性を調べた。 その結果、 Mortierella hyalina (GenBank, accession no. AY157493)の 18S rRNA遺伝子と 99% (上流 803塩基）、 Mortierella chlaraydospora (GenBank, accession no. AF157143)の 18S rRNA遺 1s 子と 98% (全長) N Mortierella multidivaricata (GenBank, accession no. AF157144) の 18S rRNA遺伝子と 98% (全長） の相同性を示した。
以上の菌学的性質から本発明者らは本菌株がモルティエレラ（Mortierella)属に属 すると判断した。 ·
[F- 1530株の菌学的性状]
(1) 形態
オートミーノレァガー （Oatmeal Agar) ， モノレトァガー （Malt Agar) , ポテトデキ ストロースァガー (Potato Dextrose Agar) のプレートにおいて、 コロニーは綿毛 状（cottony)を示し、菌糸色は白色で white lA- 1)の色調を呈する。 25°C、 1週間培養 における生育は 0Aプレートで 80〜85腿、 MEAプレートで 85mm、 PDAプレートで直径 85mmに達する。 コロニーは花笠状の形状を示す。 裏面着色及び可溶性色素の産生は 認められない。 色調に関する記述は 「メチューン 'ハンドブック 'ォブ 'カラー LMethuen Handbook of Colour (Kornerup k Wanscher, 1978) ]に従った。
光学顕微鏡による観察の結果、栄養菌糸は無色、表面は平滑で、隔壁は無く、 菌糸 の幅は 2. 5〜5 // 111となる。 菌糸の一部に球状で 10 μ πι位の厚壁胞子の様な膨らんだ構 造が観察された。 供試した培地にお！/、ては最長 3週間の培養でも生殖器官と思われ る構造は形成しなかった。
(2) 18S rRNA遺伝子解析
F - 1529株と同様の手法で F- 1530株の 18S rRNA遺伝子を解析した。
得られた F-1530株の 18S rRNA遺伝子は、 配列番号 1 0に記載の塩基配列を有する。 日本 DNAデータバンク（http :〃雨. ddbj. nig. ac. jp/)より公知菌株の DNA塩基配 列を入手し、 18S rRNA遺伝子の相同性を調べた。 その結果、 Mortierella hyalina (GenBank, accession no. AY157493)の 18S rRNA遺伝子と 100% (上流 803塩基）、 Mortierella chlamydospora (GenBank, accession no. AF157143)の 18S rRNA遺伝子 と 98% (全長) 、 Mortierella multidivaricata (GenBank, accession no. AF157144) の 18S rRNA遺伝子と 98% (全長） の相同性を示した。
以上の菌学的性質から本発明者らは本菌株がモルティエレラ（Mortierella)属に 属すると判断した。
[AB-1704株の菌学的性状]
(1) 形態
基生菌糸より直状 (Rectiflexibiles type)の気中菌糸を伸長する。 成熟した気中 菌糸の先に 20〜50個程度の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。 胞子の大きさ は0. 6〜0. 8ズ1. 0〜1. 1 111位で、 胞子の表面は平滑状 （smooth)を示し、 胞子のう、 菌核、 鞭毛などの特殊な器官は認められない。
(2) 各種培地における生育状態
各種培地上で 28°C、 約 2週間培養後の培養性状を表 3に示す。 色調の記載はトレ ズナ一のカラー 'ホイールズ （Tresnerの Color wheels) の色標名と括弧内に示す 符号で表示する。
表 3
Figure imgf000010_0001
(3) 各種炭素源の同化性
プリ ドハム · ゴトリープ寒天培地に各種の炭素源を加え、 28°C、 培養 2週間後 の生育状況を表 4に示す。
表 4
Figure imgf000010_0002
+：同化する、 士：多少同化する、 ―：殆ど同化しない
(4) 生理学的諸性質
本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。
(a)生育温度範囲（ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 5°C 33°C
(b)生育至適温度（ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 15°C 33°C
(c)ゼラチンの液化（グルコース ·ペプトン ·ゼラチン培地） ：陽性 (d)ミルクの凝固（スキムミルク培地） ：陽性
(e)ミルクのぺプトン化 (スキムミルク培地) ：陽性
(f)スターチの加水分解 (スターチ ·無機塩寒天培地） ：陽性
(g)メラニン様色素の産生 (ぺプトン 'イース ト .鉄寒天培地） ：陰性
(チロシン培地） ：陰性
(h)硫化水素の産生 (ペプトン 'イース ト '鉄寒天培地） ：陰性
(i)硝酸塩の還元 (0. 1%硝酸カリ含有プロス） ：陽性
(j)食塩の耐性 (ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ：食塩含有量 7 %以下で生 育
(5) 菌体成分
本菌の細胞壁から LL型のジァミノピメリン酸が検出された。
以上の菌学的性質から本発明者らは本菌株がス トレブトミセス （Streptomyces) 属に属すると判断した。
[A-1544株の菌学的性状]
(1) 形態
基生菌糸より螺旋状 (Spira type)の気中菌糸を伸長する。 成熟した気中菌糸の先 に 10〜20個程度の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。 胞子の大きさは 1. 0 X 1. 2〜1. 4 μ πι位で、 胞子の表面はトゲ状 （spiny)を示し、 胞子のう、 菌核、 鞭毛な どの特殊な器官は認められない。
(2) 各種培地における生育状態
各種培地上で 28°C、 約 2週間培養後の培養性状を表 5に示す。 色調の記載はトレ ズナ一のカラー ·ホイールズ （Tresnerの Color wheels) の色標名と括弧内に示す 符号で表示する。
表 5
Figure imgf000012_0001
(3) 各種炭素源の同化性
プリードハム · ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え、 28°C、 培養 2週間後 の生育状況を表 6に示す。
表 6
Figure imgf000012_0002
+：同化する、 一：殆ど同化しない
(4) 生理学的諸性質
本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。
(a)生育温度範囲（ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 15°C〜41°C (b)生育至適温度（ィースト .麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 20°C〜37°C
(c)ゼラチンの液化（グルコース 'ペプトン 'ゼラチン培地） ：陽性
(d)ミルクの凝固（スキムミルク培地） ：陽性
(e)ミルクのぺプトン化（スキムミルク培地） ：陽性
(f)スターチの加水分解（スターチ ·無機塩寒天培地） ：陽性
(g)メラニン様色素の産生 (ぺプトン 'イース ト ·鉄寒天培地） ：陽性
(チロシン培地） ：陰性
(h)硫化水素の産生 (ぺプトン 'イースト .鉄寒天培地） ：陽性
(i)硝酸塩の還元（0. 1%硝酸カリ含有ブロス） ：陰性
G)食塩の耐性 (イースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ：食塩含有量 7 %以下で生 育
(5) 菌体成分
本菌の細胞壁から LL型のジァミノピメリン酸が検出された。
以上の菌学的性質から本発明者らは本菌株がストレプトミセス （Streptomyces) 属に属すると判断した。
[A- 1545株の菌学的性状]
(1) 形態
基生菌糸より直状（Rectiflexibiles type)の気中菌糸を伸長する。 成熟した気中 菌糸の先に 50個以上の胞子からなる胞子鎖を形成する。 胞子の大きさは 0. 8 Χ 1. 0 μ m位で、 胞子の表面は平滑状 （smooth)を示し、 胞子のう、 菌核、 鞭毛などの特殊な 器官は認められない。
(2) 各種培地における生育状態
各種培地上で 28°C、 約 2週間培養後の培養性状を表 7に示す。 色調の記载はトレ ズナ一のカラー ·ホイールズ （Tresnerの Color wheels) の色標名と括弧内に示す 符号で表示する。
表 7
Figure imgf000014_0001
(3) 各種炭素源の同化性
プリ一ドハム · ゴトリープ寒天培地に各種の炭素源を加え、 28°C、 培養 2週間後 の生育状況を表 8に示す。
表 8
Figure imgf000014_0002
+：同化する、 土：多少同化する、 一：殆ど同ィ匕しない
(4) 生理学的諸性質 本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。
(a)生育温度範囲（ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 10°C〜37°C
(b)生育^適温度 (ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 20°C〜33°C
(c)ゼラチンの液化（グルコース 'ペプトン 'ゼラチン培地） ：陰性
(d)ミルクの凝固（スキムミルク培地） ：陽性
(e)ミルクのぺプトン化（スキムミルク培地） ：陽性
(f)スターチの加水分解 (スターチ ·無機塩寒天培地） ：陽性
(g)メラニン様色素の産生 (ぺプトン 'イースト '鉄寒天培地） ：陰性
(チロシン培地） ：陰性
(h)硫化水素の産生 (ぺプトン 'イース ト '鉄寒天培地） ：陽性
(i)硝酸塩の還元（0. 1%硝酸力リ含有ブロス） ：陰性
(j)食塩の耐性 (ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ：食塩含有量 7 %以下で生 育
(5) 菌体成分
本菌の細胞壁から LL型のジァミノピメリン酸が検出された。
以上の菌学的性質から本発明者らは本菌株がストレプトミセス （Streptomyces) 属に属すると判断した。
[AB - 1896株の菌学的性状]
(1)形態
AB- 1896株は菌株同定に使用した培地上 28°C、 7〜14日間培養において良好もしく は中程度の生育を見せる。 ±咅養中気菌糸は観察されず、 基生菌糸上に 1個ずつ胞子 が観察される。胞子は球形で、大きさは約 0. 8〜0. 9 μ ηι、胞子の表面はイボ状 (warty) である。 胞子嚢、 菌核、 鞭毛などの特殊な器官は認められない。
(2)各種培地における生育状態 '
各種培地上で 28°C、 約 2週間培養後の培養性状を表 9に示す。 色調の記載はトレ ズナ一のカラー ·ホイールズ（Tresner の Color wheels)の色標名と括弧内に示す 符号で表示する。 .
表 9
Figure imgf000016_0001
(3)各種炭素源の同化性
プリードハム ' ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え、 28°C、 培養 2週間後 の生育状況を表 1 0に示す。
表 1 0
Figure imgf000016_0002
+は同化する、 一は殆ど同化しない。
(4)生理学的諸性質
本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。
(a)生育温度範囲 （イースト '麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 20°C 41°C
(b)生育至適温度 （イースト '麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 25。C 37。C
(c)ゼラチンの液化 （グルコース .ペプトン 'ゼラチン培地） ：陰性
(d)ミルクの凝固 （スキムミルク培地） ：陽性
(e)ミルクのペプトン化 （スキムミルク培地） ：陽性
(f)スターチの加水分解 スターチ '無機塩寒天培地） ：陽性
(g)メラニン様色素の産生 （ぺプトン 'イースト '鉄寒天培地） ：陰性
(チロシン培地) ：陰性 (h)硫化水素の産生 （ぺプトン .イースト .鉄寒天培地） ：陰性
(i)硝酸塩の還元 （0. 1%硝酸力リ含有ブロス） ：陽性
(j)食塩の耐性 （ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ：食塩含有量 4%でも生育 しない
(5)菌体成分
AB - 1896株の細胞壁から meso型のジァミノピメリン酸が検出された。 全菌体の主要 構成糖としてキシロースとマンノースが検出された。 細胞壁ぺプチドグリカン中の ァシル型はグリコリル型であった。 ミコール酸は検出されなかった。 主要メナキノ ン成分として MK- 9 (H4)、 MK- 9 (H6)、 MK- 10 (H4)、 MK- 10 (H6)が検出された。
(6) 16S rRNA遺伝子解析
AB - 1896株の培養液を集菌後、 Fast DNA Kit (Q_BI0gene社製）を用いて DNA抽出を行 つた。 PCRは 96°C20秒、 50°C20秒、 72°C1分を 30サイクルの反応条件で行った。 プラ イマ一は 9F (5' -GTGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ) (配列番号 1 1 ) 及び 536R
(5' -GTATTACCGCGGCTGCTG-3' ) (配列番号 1 2 ) を用いた。 PCR産物は MinElute PCR
Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 シークェンシング用サンプルと した。
シークェンシングは ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems社製） 装置、 及ぴ BigDye Terminatorキットを用い、 標準のプロトコールに従った。 プラ イマ一は 9F, 536Rを用いた。
得られた本菌株の 16s rRNA遺伝子の 5'末端側の約 500塩基は、 配列番号 1 3の通り •でめる。
日本 DNAデータバンク（http：〃 www. ddbj. nig. ac. jp/)より公知菌株の DNA塩基配 列を入手し、 16s rRNA遺伝子の 5'末端側 400〜500塩基間の相同性を調べた。 その結 果、 Micro画 ospora sp. DSM44396 (GenBank, accession no. AJ560637)の 16s rRNA 城伝ナとは 98%、 Micromonospora purpureochromogenes (GenBank, accession no. X92611)遺伝子と 98%、1^ 011)0003 01-3属の基準株でぁる¾!. chalcea IF012135 (GenBank, accession no. D85489)遺伝子と 95%、Verrucosispora属の基準株である Verrucosispora gifhornensis (GenBank, accession no. Y15523)遺伝子と 95%の 相同性を示した。
AB- 1896株は大方 Micromonospora属の特徴を持つ力 S、全菌体の主要構成糖として ァラビノースが検出されずマンノースが検出された点で Micromonospora属とは完 全には一致しない。 また Verrucosispora gifhornensisで見られる特徴的な胞子が 菌株同定に使用した培地上では観察されない点で Verrucosispora属とも完全には 一致しない。 本発明者らは、 これらの菌学的性質を総合的に考慮して、 AB 1896株を ミクロモノスポーラセァ工科 (Family Micromonosporaceae) に属する放線菌と判 断した。
本発明によれば、まず工程（A)において、前記菌株またはその培養菌体調製物、 さらに酸素の存在下で、 出発原料 (基質)であるマクロライド系化合物 11107B物質が インキュベーション処理される。 この処理は前記菌株を好気的条件下で培養する際 に、 その培養液中に基質を添カ卩して行う力 あるいは場合により前記菌株の培養菌 体を、 例えばそのまま、 もしくはホモジナイズした調製物の懸濁液中に基質を添カロ し、 酸素を含む気体、 例えば空気を通気しながらインキュベーションして行うこと もできる。
培養液への基質の添加は、 培養前または培養開始後一定期間経過したときのいず れの時期に行ってもよい。 上記菌体は上記いずれかの菌株を栄養源含有培地に接種 し、 好気的に培養することにより製造できる。 かかる培養菌体の調製物を用意する ための菌株の培養または基質が添加された状態で行われる菌株の培養は、 原則的に は一般微生物の培養方法に準じて行うことができるが、 通常は液体培養による振と う培養、 通気攪拌培養などの好気的条件下で実施するのが好ましい。
培養に用いられる培地としては、 モルティエレラ （Mortierella) 属、 ストレプ 卜ミセス (Streptomyces 属 §たはミク口モノスホラセァェ (Micromonosporaceae) 科に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、 各種の合成培 地、 半合成培地、 天然培地などいずれも利用可能である。 培地組成としては炭素源 としての、 グノレコース、 ガラク トース、 シユークロース、 マノレト-ース、 フノレク 卜一 ス、 グリセリン、 デキストリン、 澱粉、 糖蜜、 大豆油等を単独または組み合わせて 用いることができる。 窒素源としては、 フアルマメディア、 ペプトン、 肉エキス、 大豆粉、 魚粉、 グル テンミール、 カゼイン、 乾燥酵母、 アミノ酸、 酵母エキス、 NZ- case、 尿素等の有 機窒素源、 硝酸ナトリウム、 硫酸アンモ-ゥム等の無機窒素源を単独または組み合 わせて用いうる。 その他、 例えば、 塩ィ匕ナトリウム、 塩化カリウム、 炭酸カルシゥ ム、 硫酸マグネシウム、 燐酸ナトリウム、 燐酸カリウム、 硫酸銅、 硫酸鉄、 ±玺ィ匕マ ンガン、 塩化コバルト等の塩類、 重金属類塩、 ビタミン Bおよびピオチン等のビタ ミン類、 シク口デキストリン類のような包接剤も必要に応じ添加使用することがで きる。 なお、 培養中発泡が著しい場合には、 各種消泡剤を適宜培地中に添加するこ とができる。 消泡剤の添カ卩にあたっては目的物質の生産に悪影響を与えない濃度と する必要がある。
咅養条件は該菌株が良好に生育して上記物質を生産し得る範囲内で適宜選択し 得る。 例えば培地の pHは 5〜 9程度、 通常中性付近とするのが望ましい。 培養温度 は、 通常 20〜40°C、 好ましくは 24~30°Cに保つのが良い。 培養日数は 1〜 8日程度 で、 通常 2〜5日程度である。 上述した各種の培養条件は、 使用微生物の種類ゃ特 性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できるのはいうまでもない。 また、 培養菌体調製物は、 培養終了後、 遠心分離または濾過により分離した菌体 またはホモジナイズした菌体を適当な溶液に懸濁して調製する。 菌体の懸濁に使用 できる溶液は、 前記した培地であるか、 あるいはトリスー酢酸、 トリスー塩酸、 コ ハク酸ナトリウム、 クェン酸ナトリウム、 リン酸ナトリウム、 リン酸カリウムなど の緩衝液を単独または混合したものである。 緩衝液の pHは、 5. 0〜9. 0、好ましくは 6. 0〜7. 5である。
基質となる 11107B物質は、 粉末のままか、 あるいは水溶性有機溶媒、 例えばエタ ノール、 メタノール、 アセトン、 ジメチルスルホキシドなどに溶解して培養液また は菌体の懸濁液に添加することができ、 その添加量は、 例えば、 培養液の場合、 培 養液 1 L当り 50〜5000mgが好ましい。 基質添加後は、 20〜31°Cで約 1〜 5日間、 振 とうあるいは通気攪拌などの操作を行い、 好気的条件下で反応を進行させることに より基質である 11107B物質を目的の 11107D物質に変換することができる。
次に、 工程 （B ) において、 前記工程 （A) で得られたインキュベーション処理 液から目的の 11107D物質を採取する。 11107D物質を工程 （A) の反応混合物から単 離するには、 一般に微生物代謝産物を単離するために用いられる種々の既知精製手 段を選択、 組合せて行うことができる。 例えば、 メタノール、 エタノール、 プタノ ール、 アセトン、 酢酸ェチル、 酢酸プチル、 クロ口ホルム、 トルエン等を用いた有 機溶媒抽出、 各種のイオン交換クロマトグラフィー、 セフアデックス LH- 20等を用 いたゲル濾過ク口マトグラフィー、 ダイャイオン HP-20等の疎水性吸着樹脂、 活性 炭、 シリカゲル等による吸着クロマトグラフィー、 もしくは薄層クロマトグラフィ 一による吸脱着処理、 あるいは逆相カラム等を用いた高速液体クロマトグラフィー 等を、 単独あるいは適宜組合せ、 場合により反復使用することにより、 分離精製す ることができる。 実施例
以下、 本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、 本発明をこれらの 例に限定することを意図するものではない。なお、下記の例中のパーセント（％)は、 特に断りのない限り、 重量パーセント （％(w/v) ) を示す。
参考例 1 (原料である 11107B物質の製造）
ストレプトミセス エスピー（Streptomyces sp. ) !^1-11107株 81¾1 BP- 7812)の 斜面培養（ISP- 2培地）から 1白金耳を 50mlの種母培地 [グルコース 2. 0%、 大豆粉（ェ スサンミート、 味の素 （株） 製） 1. 0%、 酵母エキス（オリエンタル酵母工業 （株） 製） 0. 5%、 塩化ナトリウム 0. 25%、 炭酸カルシウム 0. 32%、 殺菌前 pH6. 8]を入れた 500ml容の三角フラスコに接種し、 28°Cで 2日間培養して第一段種母培養液を得た。 この培養液 0· 1mlを同じ種母培地 100mlを入れた 500ml容の三角フラスコに接種し、 28°Cで 1日間培養して第二段種母培養液を得た。 このようにして得た第二段種母培 養液 800mlを生産培地 [可溶性澱粉 5. 0%、 フアルマメディァ 0. 8%、 グルテンミール 0. 8%、 酵母エキス 0. 5%、 炭酸カルシウム 0. 1%、 殺菌前 pH6. 8] 100 Lを入れた 200 Lタンクに接種し、 培養温度 28°Cで攪拌数 90rpm、 通気量 1. 0vvm、 内圧 20kPaの条件 で 5日間通気攪拌培養を行って培養液を得た。
このようにして得た培養液の一部（10 L)を 10 Lの 1ーブタノールにて抽出後、 ブ タノール層を減圧乾固し、 100 gの粗活性画分を得た。 この粗活性画分をセフアデ ックス LH - 20 (フアルマシア社製、 1500 ml)上に添加し、 テトラヒドロフラン一メタ ノール（1 : 1)の溶媒で溶出した。 540 mlから 660 mlまでに溶出した画分を減圧下で 濃縮乾固し、 残渣 (660 mg)を得た。 さらにこの残渣を酢酸ェチルおよびメタノール (9 : 1 ; v/v)の混液に溶解し、 シリカゲル力ラムクロマトグラフィー（ヮコ一ゲル 0200、 50 g)に付した。 このカラムを n—へキサンおよび酢酸ェチル（l : 9 ;v/v)の 混液（2 L)で溶出し、 468 mlから 1260 mlまでに溶出した画分を集め、 減圧下で濃 縮し、 粗活性画分を 25mg得た。
得られた粗活性画分を下記の HPLC分取条件 (A)で分取高速液体ク口マトグラフィ — (HPLC)に付し、保持時間 34分に溶出される画分を集め、ァセトニトリルを留去後、 下記 HPLC分取条件 (B)にてその画分を HPLCによる脱塩を行うことにより 11107B物質 (保持時間： 37分）を 6 mg得た。
HPLC分取条件 (A)
カラム ： YMC-PACK ODS-AM SH - 343 - 5AM, φ 20mmX 250mm (ヮイエムシ—社製) 温度：室温
流速： 10ml/分
検出： 240nm
溶出液：ァセトニトリル /0. 15%リン酸一カリウム（pH3. 5) (2: 8〜8 : 2, v/v, 0〜50 分， リニアグラジェント）
HPLC分取条件 (B)
カラム ： YMC-PACK ODS-AM SH-343 - 5AM, φ 20議 X 250mm (ヮイエムシ—社製） 温度：室温
流速： 10ml/分
検出： 240nm
溶出液：メタノール/水（2: 8〜10: 0， v/v, 0〜40分, リニアグラジェント）
実施例 1 (AB-1704株の取得）
土壌から分離された菌株の斜面培地 [可溶性澱粉 0. 5%、 グルコース 0. 5%、 魚肉 ヱキス（和光純薬工業 （株） 製) 0. 1%、 酵母エキス（オリエンタル酵母工業 （株） 製） 0. 1%·、 NZ-case (フムコ 'シェフィールド 'ケミカル社製） 0. 2%、 塩化ナトリウ ム 0. 2%、 炭酸カルシウム 0. 1%、 寒天 (和光純薬工業 （株） 製) 1. 6%]から 1白金耳 を Ί mlの種母培地 [可溶性澱粉 2. 0%、 グルコース 1. 0%、 ポリペプトン（日本製薬 (株） 製) 0. 5%、 酵母エキス（オリエンタル酵母工業 （株） 製) 0. 5%、 炭酸カルシ ゥム 0. 1%]を入れた 65ml容の試験管に接種し、 28°Cで 3日間振とう培養機上で培養 して種母培養液を得た。
さらに種母培養液 0. 5mlを 7 mlの生産培地 [可溶性澱粉 2. 0%、 グルコース 1. 0 %、 ポリペプトン（日本製薬 （株） 製) 0. 5%、 酵母エキス（オリエンタル酵母工業 （株） 製） 0. 5%、 炭酸カルシウム 0. 1%]の入った 65ml容の試験管に植え継ぎ、 28°Cで 3日 間振とう培養機上で培養した。 次に基質である 11107B物質を 25mg/mlエタノール溶 液として調製し、 0. 2ml添加した。 添加後、 28°Cで 48時間振とうし、 変換反応を行 つた。 反応後、 下記の HPLC分析条件 (a)で HPLC分析を行い、 反応混合物中に 11107D 物質が生成している株、 AB-1704株（FERM BP-8551)を取得した。
HPLC分析条件 (a)
カラム ： CAPCELL PAK C18 SG120, φ 4. 6mmX 250匪（資生堂 （株） 製）
温度： 40°C
流速： 1 ml/分
検出 ： 240nm
溶出液： ァセトニトリノレ /0. 15%リン酸一カリウム（pH3. 5) (3 : 7〜5 : 5, v/v, 0〜18 分， リニアグラジェント）， ァセトニトリル /0. 15%リン酸一力リウム（pH3. 5) (5： 5 —85： 15, v/v, 18〜22分， リニアグラジェント）
保持時間： 11107D物質 9. 9分、 11107B物質 19. 4分
実施例 2 (A- 1544株および A- 1545株の取得）
土壌から分離された菌株の斜面培地 (ィースト ·麦芽寒天培地）から 1白金耳を 20mlの種母培地 [可溶性澱粉 2. 4%、 グルコース 0. 1%、 大豆粉（エスサンミート、 味 の素（株）製） 0. 5%、牛肉エキス（Difco社製) 0. 3%、酵母エキス（Difco社製） 0. 5%、 トリプトン.ペプトン (Difco社製） 0. 5%、 炭酸カルシウム 0. 4%]を入れた 250ml容 の三角フラスコに接種し、 28°Cで 3日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得 た。
さらに種母培養液 0. 6mlを 60mlの生産培地 [可溶性澱粉 2. 0%、 グルコース 2. 0°/0、 大豆粉 (エスサンミート、 味の素 （株） 製) 2. 0%、 酵母ヱキス（オリエンタル酵母ェ 業 (株)製) 0. 5%、塩化ナトリウム 0. 25%、炭酸カルシゥム 0. 32%、硫酸銅 0. 0005%、 塩化マンガン 0. 0005%、 硫酸亜鉛 0. 0005%、 殺菌前 ρΗ7· 4]の入った 500ml容の三角 フラスコに植え継ぎ、 28°Cで 4日間振とう培養機上で培養した。 得られた培養液 2 mlを 15ml試験管に分注した。 次に基質である 11107B物質を 20mg/mlジメチルスルホ キシド溶液として調製し、 0. 05ml'添加した。 添加後 28°Cで 23時間振とうし、 変換反 応を行った。 反応後、 下記の HPLC分析条件 (b)で HPLC分析を行い、 反応混合物中に 11107D物質が生成している株、 A- 1544株 (FERM BP- 8446)および A- 1545株 (FERM BP- 8447)を取得した。
HPLC分析条件 (b)
カラム ： CAPCELL PAK C18 SG120, φ 4. 6mm X 250讓（資生堂 （株） 製）
温度： 40°C
流速： 1 ml/分
検出： 240mn .
溶出液：ァセトニトリノレ/水 (50 ： 50, v/v)ァイソクラティック
保持時間： 11107B物質 7. 2分、 11107D物質 3. 6分
実施例 3 (フラスコスケールにおける AB-1704株による変換)
土壌から分離されたストレプトミセス エスピー（Streptomyces sp. ) AB - 1704株 (FERM BP-8551)の斜面培地 [可溶性澱粉 0. 5%、 グルコース 5%、 魚肉エキス（和光 純薬工業 （株） 製) 0. 1%、 酵母エキス（オリエンタル酵母工業 （株） 製) 0. 1%、 ΝΖ - case (フムコ ·シェフィールド .ケミカル社製） 0. 2%、 塩化ナトリウム 0· 2%、 炭酸カルシウム 0. 1%、 寒天 (和光純薬工業 （株） 製） 1. 6%]から 1白金耳を 100mlの 種母培地 [可溶性澱粉 2· 0%、 グルコース 1. 0%、 ポリペプトン（日本製薬 （株） 製) 0. 5%,酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製) 0· 5%、炭酸カルシウム 0. 1%] を入れた 500ml容の三角フラスコに接種し、 28°Cで 3日間振とう培養機上で培養し て種母培養液を得た。 さらに 100mlの生産培地 [可溶性澱粉 2. 0°んグルコース 1. 0%、 ポリペプトン（日本製薬 （株） 製) 0. 5%、 酵母エキス（オリエンタル酵母工業 （株） 製） 0. 5%、 炭酸カルシウム 0. 1%]の入った 500ml容の三角フラスコ 150本に種母培養 液を 2 mlずつ植え継ぎ、 28°Cで 2日間振とう培養機上で培養した。
得られた培養液 a00ml/500ml容三角フラスコ、 150本）に、 20mg/mlエタノール溶 液として調製した、基質である 11107B物質をそれぞれ 0. 44ml添加した。添加後、 28°C で 9時間振とうし、 変換反応を行った。 反応終了後、 培養液を集め、 2700rpm、 10 分間の遠心分離によって培養上清と菌体に分離した。 菌体は 5 Lのメタノールで抽 出後、 ろ過してメタノール抽出液を得た。 メタノール抽出液から減圧下でメタノー ルを留去した後、 培養上清と合わせて、 10 Lの酢酸ェチルにて抽出した。 得られた 酢酸ェチル溶液を減圧下で濃縮し、 2090mgの粗活性画分を得た。 この粗活性画分を テトラヒ ドロフラン一メタノール（1： 1， v/v)の混液 4 mlおよび 50%ァセトニトリ ル水溶液 6 mlに溶解し、 0DSカラムクロマトグラフィー（ヮイエムシ一社製、 0DS-A 120-S50 3. 6cm X 43cm)に付し、 40%ァセトニトリル水溶液で溶出した。 336mlか ら 408mlまでに溶出した画分を減圧下で濃縮乾固することにより 560mgの残渣を得 た。 さらにこの残渣を 50%メタノール水溶液 10mlに溶解し、 0DS力ラムクロマトグ ラフィー（ヮイエムシ一社製 ODS-AM 120-S50 φ 3. 6cm X 40cm)に付し、 50%メタノー ル水溶液で溶出した。 1344mlから 182½1までに溶出した画分を減圧下で濃縮乾固す ることにより、 11107D物質 252mgを得た。
実施例 4 (フラスコスケールにおける A- 1545株による変換）
A - 1545株 (FERM BP- 8447)の斜面培地（ィースト .麦芽寒天培地）から 1白金耳を 25mlの種母培地 [可溶性澱粉 2. 0%、 グルコース 2. 0%、 大豆粉（エスサンミート、 味 の素 （株） 製) 2. 0%、 酵母エキス（D co社製 ) 0. 5%、 塩化ナトリウム 0. 25%、 炭酸 カルシウム 0. 32%、 殺菌前 ρΗ7· 4]を入れた 250ml容の三角フラスコに接種し、 28°C で 2日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得た。 この培養液 0. 75mlを 2 ml容 のセラムチューブ (住友ベークライト （株） 製）に分注し、 同量の 40%グリセロール 水溶液を添カ卩し、 攪拌後— 70°Cで凍結し、 凍結種母を作製した。 この凍結種母を融 解し、 そのうち 0. 25mlを 25mlの種母培地 [可溶性澱粉 2. 0%、 グルコース 2. 0%、 大 豆粉 (エスサンミート、 味の素 （株） 製) 2. 0%、 酵母エキス（オリエンタル酵母工業 (株） 製) 0. 5%、 塩化ナトリウム 0· 25%、 炭酸カルシウム 0. 32%、 殺菌前 ρΗ7. 4]を 入れた 250ml容の三角フラスコに接種し、 28°Cで 2日間振とう培養機上で培養して 種母培養液を得た。 さらに種母培養液 0. 5mlを 100mlの生産培地 [可溶性澱粉 2. 0%、 グルコース 2. 0%、 大豆粉 (エスサンミート、 味の素 （株） 製) 2. 0%、酵母エキス（ォ リェンタル酵母工業（株）製) 0. 5%、塩化ナトリウム 0. 25%、炭酸カルシウム 0. 32%、 殺菌前 pH7. 4]の入った 500ml容の三角フラスコに植え継ぎ、 28°Cで 3日間振とう培 養機上で培養した。
得られた培養液（100ml/500ml容三角フラスコ、 10本）、それぞれについて 3000rpm、 10分間の遠心分離を行い集菌し、 50mMリン酸緩衝液 (pH6. 0) 100mlに懸濁した。 次に 基質である 11107B物質を 100mg/mlジメチルスルホキシド溶液として調製し、 それぞ れ ΙηιΓ添加した。 添加後、 28°Cで 24時間振とうし、変換反応を行った。反応終了後、 反応液を集め、 5000rpm、 20分間の遠心分離によって、 上清と菌体に分離した。 上 清は 1 Lの酢酸ェチルにて抽出した。 菌体は 500mlのメタノールで抽出後、 ろ過し てメタノール抽出液を得た。 メタノール抽出液から減圧下でメタノ一ルを留去した 後、 1 Lの酢酸ェチルで抽出した。 それぞれの酢酸ェチル層を水洗し、 無水硫酸ナ トリウムにて脱水乾燥後、 合わせて減圧下で濃縮し、 937mgの粗画分を得た。 この 粗画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kiesel gel 60，50g)に付し、 酢酸 ェチルおよび n—へキサン（90： 10； v/v)の混液 1200mlで溶出し、 11107D物質を含 む画分 234mgを得た。 得られた活性画分を下記分取条件 (C)で分取高速液体クロマト グラフィー (HPLC)に付し、 得られる溶出液を下記の分析条件 (c)で HPLC分析した。 こうして得られた 11107D物質を含む画分から、 溶媒を留去することにより、 11107D 物質 80mgを得た。 '
HPLC分取条件 (C)
カラム ： CAPCELL PAK C18 UG120, ψ 30mmX 250mm (資生堂 （株） 製）
流速： 20ml/分
検出： 240nm
溶出液：ァセトニトリル/水（30： 70, v/v)アイソクラティック
HPLC分析条件 (c) カラム： CAPCELL PAK C18 SG120, φ 4. 6瞧 X 250議（資生堂 （株） 製） 温度： 40°C
流速： 1 ml/分
検出： 240nm
溶出液：ァセトニトリノレ/水（35： 65, v/v)アイソクラティック
保持時間： 11107D物質 7. 8分
実施例 5 (フラスコスケールにおける A - 1544株による変換)
実施例 4と同様の方法にて得られた A- 1544株（FERM BP - 8446)の培養液
(100ml/500ml容三角フラスコ、 10本）、 それぞれについて、 3000rpm、 10分間の遠心 分離を行い集菌し、 50mMリン酸緩衝液 (pH6. 0) 100mlに懸濁した。 次に基質である 11107B物質を 100mg/mlジメチルスルホキシド溶液として調製し、 それぞれ 1 ml添カロ した。 添加後、 28°Cで 24時間振とうし、 変換反応を行った。 反応終了後、 反応液を 集め、 5000rpm、 20分間の遠心分離によって、 上清と菌体に分離した。 上清は 1 L の酢酸ェチルにて抽出した。 菌体は 500mlのアセトンで抽出後、 ろ過してアセトン 抽出液を得た。 アセトン抽出液から減圧下でアセトンを留去した後、 1 Lの酢酸ェ チルで抽出した。 それぞれの酢酸ェチル層を水洗し、 無水硫酸ナトリウムにて脱水 乾燥後、 合わせて減圧下で濃縮し、 945mgの粗画分を得た。 この粗画分をシリカゲ ルカラムクロマトグラフィー（Kiesel gel 60， 50g)に付し、 酢酸ェチルおよび η— へキサン（50： 50； v/v)の混液 100ml、酢酸ェチルおよび n—へキサン（75： 25； v/v) の混液 200ml、 酢酸ェチルおよび n—へキサン（90 ： 10 ； v/v)の混液（600ml)で溶出 し、 11107D物質を含む画分 463mgを得た。 得られた画分を実施例 4記載の分取条件 (C)で分取高速液体ク口マトグラフィー (HPLC)に付し、 得られる溶出液を実施例 4 記載の分析条件（c)で HPLC分析した。 こうして得られた 11107D物質を含む画分から、 溶媒を留去することにより、 11107D物質 304mgを得た。
実施例 6 (F- 1529株およぴ F- 1530株の取得）
土壌から分離された菌株の斜面培地 （ポテトデキストロース寒天培地） から 1白金 耳を 20mlの種母培地 （馬鈴薯澱粉 2. 0%、 グルコース 1. 0%、 大豆粉 （エスサンミー ト、 味の素 (株)製） 2. 0%、 リン酸一カリウム 0. 1%、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 05%) を入れた 250ml容の三角フラスコに接種し、 25°Cで 3日間振とう培養機上 で培養して種母培養液を得た。 さらに種母培養液 0. 6mlを 60mlの生産培地 （馬鈴薯 澱粉 2. 0%、 グルコース 1. 0%、 大豆粉 （エスサンミート、 味の素 (株)製） 2. 0%、 リン酸一力リゥム 0. 1%、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 05%) の入った 500ml容の三 角フラスコに植え継ぎ、 28°Cで 4日間振とう培養機上で培養した。 得られた培養液 2mlを 15ml試験管に分注した。 それぞれについて 3000rpm、 5分間の遠心分離によつ て集菌し、 50mMリン酸緩衝液 (pH7. 0) 2mlに懸濁した。次に基質である 11107B物質を 20tng/mlジメチルスルホキシド溶液として調製し、 それぞれ 0. 05ml添加した。 添加 後 28°Cで 2 3時間振とうし、 水酸化反応を行った。 反応後、 実施例 4記載の分析条 件（c)で HPLC分析を行い、 11107D物質の'ピークが現れる株、 F- 1529株 (FERM BP8547) およぴ F-1530株（FERM BP-8548)を取得した。
実施例 7 (フラスコスケールにおける F-1529株による変換)
モルティエレラ エスピー（Mortierella sp. ) F- 1529株（FERM BP-8547)の斜面培地
(ポテトデキストロース寒天培地） から 1白金耳を 25mlの種母培地 [馬鈴薯澱粉 2. 0%、 グルコース 1. 0%、 大豆粉 (エスサンミート、 味の素 (株) 製） 2. 0%、 リ ン酸一力リゥム 0. 1%、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 05%]を入れた 250ml容の三角 フラスコに接種し、 25°Cで 2日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得た。 さ らに種母培養液 0. 6mlを 60mlの生産培地 [馬鈴薯澱粉 2. 0%、 グルコース 1. 0%、 大豆 粉 （エスサンミート、 味の素 （社） 製） 2. 0%、 リン酸一カリウム 0. 1%、 硫酸マグ ネシゥム 7水和物 0. 05%]の入った 500ml容の三角フラスコに植え継ぎ、 25°Cで 3日 間振とう培養機上で培養した。
得られた培養液 （60ml/500ml容三角フラスコ、 18本） をそれぞれ 3000rpm、 5分間 の遠心分離によって集菌し、 50mMリン酸緩衝液 (pH7. 0) 60mlに懸濁した。 次に基質 である 11107B物質を 100mg/mlジメチルスルホキシド溶液として調製し、 それぞれ 0. 6ml添加した。 添加後、 25°Cで 2 2時間振とうし、 変換反応を行った。 反応終了 後、 5000rpm、 2 0分間の遠心分離によって、 ろ液と菌体に分離した。 上清は 1 L の酢酸ェチルにて抽出した。 菌体は 500mlのアセトンで抽出後、 ろ過してアセトン 抽出液を得た。 アセトン抽出液から減圧下でアセトンを留去した後、 1 Lの酢酸ェ チルで抽出した。 それぞれの酢酸ェチル層を水洗し、 無水硫酸ナトリウムにて脱水 乾燥後、 合わせて減圧下で濃縮し、 11107D物質を含む 1. 21gの粗画分を得た。 この · 11107D物質を含む粗画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Kiesel gel 60， 50g)に付し、 酢酸ェチルおよび n-へキサン（90 : 10 ;v/v)の混液 1200mlで溶出し、 11107D物質を含む画分 369mgを得た。
得られた画分を実施例 4に記載した HPLC分取条件 (C)で分取高速液体ク.口マトダラ フィー (HPLC)に付し、 溶出される 11107D物質を含む画分を得た後、溶媒を留去する ことにより、 11107D物質 180mgを得た。
実施例 8 (フラスコスケールにおける F - 1530株による変換)
モルティエレラ エスピー（Mortierella sp. ) F- 1530株（FERM BP- 8548)の斜面培地
(ポテトデキストロース寒天培地） から 1白金耳を 25mlの種母培地 [馬鈴薯澱粉 2. 0%、 グルコース 1. 0%、 大豆粉 (エスサンミート、 味の素 (株)製) 2. 0%、 リン 酸一力リゥム 0. 1%、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 05%]を入れた 250ml容の三角フ ラスコに接種し、 25°Cで 2日間振とう培養機上で培養して種母培養液を得た。 さら に種母培養液 0. 6mlを 60mlの生産培地 [馬鈴薯澱粉 2. 0%、 グルコース 1. 0%、 大豆粉 (エスサンミート、 味の素 （株） 製） 2. 0%、 リン酸一カリウム 0. 1%、 硫酸マグネ シゥム 7水和物 0. 05%]の入った 500ml容の三角フラスコに植え継ぎ、 25°Cで 3日間 振とう培養機上で培養した。
得られた培養液 （60ml/500ml容三角フラスコ、 1 8本） をそれぞれ 3000rpm、 5分 間の遠心分離によって集菌し、 50mMリン酸緩衝液 (pH7. 0) 60mlに懸濁した。 次に基 質である 11107B物質を 100mg/mlジメチルスルホキシド溶液として調製し、 それぞれ 0. 6ml添加した。 添加後、 25°Cで 2 2時間振とうし、 変換反応を行った。 反応終了 後、 5000rpm、 2 0分間の遠心分離によって、 ろ液と菌体に分離した。 上清は 1 L の酢酸ェチルにて抽出した。 菌体は 500mlのアセトンで抽出後、 ろ過してアセトン 抽出液を得た。 アセトン抽出液を減圧下でアセトンを留去した後、 1 Lの酢酸ェチ ルで抽出した。 それぞれの酢酸ェチノレ層を水洗し、 無水硫酸ナトリウムにて脱水乾 燥後、 合わせて減圧下で濃縮し、 11107D物質を含む 0. 89gの粗画分を得た。 この 11107D物質を含む粗画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kiesel gel 60, 50g)に付し、 酢酸ェチルおよび n—へキサン（90:10;v/v)の混液 1200ml、 次いで 酢酸ェチル 500mlで溶出し、 11107D物質を含む粗画分 163mgを得た。 得られた画分を 実施例 4に記載した HPLC分取条件 (C)で分取高速液体ク口マトグラフィー (HPLC)に 付し、 溶出される 11107D物質を含む画分を得た後、 溶媒を留去することにより、 11107D物質 30mgを得た。
実施例 9 (AB- 1896株の収得）
土壌から分離された菌株の斜面培地 [可溶性澱粉 0.5%、 グルコース 0.5%、 魚肉ェ キス （和光純薬工業 （株） 製） 0.1%、 酵母エキス （オリエンタル酵母工業 （株） 製） 0.1%、 NZ-case (フムコ ' シエフィールド 'ケミカル社製） 0.2%、 塩化ナト リウム 0.2%、 炭酸カルシウム 0·1%、 寒天 （和光純薬工業 （株） 製） 1.6%]から 1 白金耳を 5mlの種母培地 （可溶性澱粉 2.0%、 グルコース 1.0%、 ポリペプトン （日 本製薬社製） 0.5%、 酵母エキス （オリエンタル酵母 （株） 製） 0.5%、 炭酸カルシ ゥム 0.1%) を入れた 65ml容の試験管に接種し、 28°Cで 1ひ日間振とう培養機上で培 養して種母培養液を得た。 さらに種母培養液 0. lmlを 5mlの生産培地 （可溶性澱粉 2.0。/0、 グルコース 1.0%、 ポリペプトン （日本製薬 （株） 製） 0.5%、 酵母エキス
(オリエンタル酵母工業 （株） 製） 0.5%、 炭酸カルシウム 0.1%) の入った 65ml容 の試験管に植え継ぎ、 28°Cで 3日間振とう培養機上で培養した。 次に基質である 11107B物質を 40mg/mlエタノール溶液として調製し、 それぞれ 0.05ml添加した。 添 加後、 28°Cで 24時間振とうし、 水酸化反応を行った。 反応後、 下記の分析条件 (d) で HPLC分析を行い、 11107D物質が現れる株、 AB- 1896株を取得した。
HPLC分析条件 (d)
カラム ： UNISON UK-C18, φ 4· 6讓 X 50mm (Imtakt社製）
温度： 30°C
流速： 2ml/分
検出： 240nm
溶出液：水/ァセトニトリノレ/ギ酸 （1000:10:1〜10:1000:1, v/v/v, 0〜4分， リニ アグラジェント）
保持時間： 11107D物質 2.5分 実施例 1 0 (試験管スケールにおける AB - 1896株による変換）
AB - 1896株の斜面培地 （可溶性澱粉 0. 5%、 グルコース 0. 5%、 魚肉エキス （和光純 薬工業（株）製） 0. 1°ん酵母エキス （オリエンタル酵母工業（株）製） 0. 1%、 NZ-case (フムコ 'シェフィ一ルド ·ケミカル社製） 0. 2%、 塩化ナトリゥム 0. 2%、 炭酸力 ルシゥム 0. 1%、 寒天 （和光純薬工業 （株） 製） 1. 6%) から 1白金耳を 5mlの種母 培地（可溶性澱粉 2· 0%、グルコース 1. 0%、ポリペプトン（日本製薬（株）製） 0. 5%、 酵母エキス （オリエンタル酵母工業 （株） 製） 0· 5%、 炭酸カルシウム 0. 1%) を入 れた 65ml容の試験管に接種し、 28°Cで 10日間振とう培養機上で培養して種母培養液 を得た。 さらに種母培養液 0. lmlを 5mlの生産培地 （可溶性澱粉 2. 0%、 グルコース 1. 0%、 ポリペプトン （日本製薬 （株） 製） 0. 5%、 酵母エキス （オリエンタル酵母 工業（株）製） 0. 5%、炭酸カルシウム 0. 1%)の入った 65ml容の試験管に植え継ぎ、 28°Cで 3日間振とう培養機上で培養した。
得られた培養液 （5ml/65ml容試験管、 1本） に基質である 11107B物質を 40mg/mlェ タノール溶液として調製し、 0. 05πιΓ添加した。 添加後、 28°Cで 24時間振とうし、 水 酸化反応を行った。 得られた培養液を 3ml分取し、 2mlの 1—ブタノールを加えて振 とうした後、 3000rPmにて 10分間遠心分離した。 得られた上清を留去し、 2mlのメタ ノール溶液として、 下記の HPLC分析条件 (e)および HPLC分析条件 (f)にて HPLC分析を 行い、 反応混合物中に 11107D物質が生成していることを確認した。
HPLC分析条件 (e)
カラム ： UNISON UK-C18, φ 4. 6mmX 50mm(Imtakt社製）
温度： 40°C
流速： 2ml/分
検出： 240nm
溶出液：ァセトニトリル /0. 01%トリフルォロ酢酸 （2 :8〜5 : 5, v/v， 0〜10分，リニァ グラジェント）
保持時間： 11107D物質 6. 1分
HPLC分析条件 (f)
カラム ： UNISON UK-C18, φ 4. 6mmX 50隱（Imtakt社製） 温度： 40°C
流速： 2ml/分
検出： 240nm
溶出液：メタノール /0.01%トリフルォロ酢酸 （4:6〜7:3， v/v，0〜10分，リニアグラ ジェント）
保持時間： 11画物質 6.1分

Claims

請求の範囲 式 （I )
Figure imgf000032_0001
( I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質の、 式（II)
Figure imgf000032_0002
( II ) で示されるマクロライド系化合物 11107D物質への生物学的変換方法による、 式 (II) で示されるマクロライド系化合物 11107D物質の製造方法であって、 下記工程 (A) 及び （B ) を含むことを特徴とする製造方法。
(A) 前記生物学的変換方法を行いうるものであって、 かつ、 モルティエレラ (Mortierella) 属、 ストレプトミセス（Streptomyces)属またはミクロモノスポラ セァェ (Micromonosporaceae) 科に属する菌株またはその培養菌体の調製物の存在 下で、 式 （I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質をインキュベーション 処理.する工程。
(B ) 工程 （A) で得られるインキュベーション処理液から式（II)で示されるマク 口ライド系化合物 11107D物質を採取する工程。
2 . 前記モルティエレラ属に属する菌株がモルティエレラ エスピー .
(Mortierella sp. ) F-1529株 (FERM BP- 8547)または F- 1530株 (FERM BP-8548)である 請求項 1記載の製造方法。
3 . 前記ストレプトミセス属に属する菌株がストレプトミセス エスピー (Streptomyces sp. ) AB-1704株（FERM BP - 8551)、 A- 1544株（FERM BP- 8446)または A - 1545株（FERM BP- 8447)である請求項 1記載の製造方法。
4 . 前記ミクロモノスポラセァ工科に属する菌株が AB- 1896株 (FERM BP-8550)で ある請求項 1記載の製造方法。
5 . 前記式 （I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質から前記式（II)で 示されるマクロライド系化合物 11107D物質への変換能を有する、 ストレプトミセス エスピー（Streptomyces sp. ) AB- 1704株（FERM BP- 8551)。
6 . 前記式 （I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質から前記式（II)で 示されるマクロライド系化合物 11107D物質への変換能を有する、 モルティエレラ エスピー（Mortierella sp. ) F- 1529株（FERM BP- 8547)または F- 1530株（FERM BP-8548)。
7 . 前記式 （I ) で示されるマクロライド系化合物 11107B物質から前記式（II)で示 されるマクロライド系化合物 11107D物質への変換能を有する、 AB-1896株 (FERM BP-8550)。
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