WO2003097820A1 - Procede pour utiliser l'activite physiologique d'un saccharide rare et compositions contenant un saccharide rare - Google Patents

Procede pour utiliser l'activite physiologique d'un saccharide rare et compositions contenant un saccharide rare Download PDF

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WO2003097820A1
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psicose
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glucose
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Ken Izumori
Masaaki Tokuda
Toshifumi Itano
Osamu Miyamoto
Toshihiko Ishida
Koji Murao
Taizo Tasaka
Gan Muneuchi
Fuminori Yamaguchi
Terukazu Tanaka
Mohammad Akram Hossain
Masaaki Ueki
Kazuyuki Hirooka
Asahiko Taminato
Keiji Tsusaki
Takeo Takahashi
Mitsuhiro Nagata
Yutaka Ishida
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Fushimi Pharmaceutical Co.,Ltd.
Teikoku Seiyaku Co., Ltd.
Kagawa University
Shikoku Research Institute Incorporated
Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
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Definitions

  • the present invention relates to a method for utilizing the physiologically active action of a rare sugar, and a method for using a rare sugar as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition formulated as a food, especially a functional food, a pharmaceutical or a cosmetic. book
  • Monosaccharides are broadly classified into aldoses having a polyhydroxylaldehyde structure, ketoses having a polyhydroxyl ketone structure, and sugar alcohols obtained by reducing them.
  • monosaccharides are also classified according to their abundance in nature.
  • rare sugars are defined as “sugars that are rare in nature” according to the definition of the International Rare Sugar Society, and are monosaccharides with low abundance in nature.
  • rare sugars often have a low yield in a synthesis reaction in an organic chemical synthesis method. For this reason, rare sugars have many unknown properties, and at present the rare sugars of aldohexoses (alcohols of hexoses), including D-aroose, also have many unknown properties. .
  • rare sugars belonging to this aldohexose include D-gulose, D-idose, D-yugose, D-altrose, L-mannose, L-glucose, L-galactose and the like in addition to D-alose. Is done. The same applies to rare sugars such as ketohexose (hexose ketose), including D-psicose. It is like. Examples of rare sugars belonging to ketohexose include D-psicose, L-psicose, D-sorbose, L-sorbose, D-evening gatose, L-evening gatose, L-fructoses and the like.
  • psicose is ketohexose (hexose). It is known that this psicose has D-form and L-form as optical isomers.
  • D-psicose is a known substance, but it is rarely present in nature, so it is defined as "rare sugar” according to the definition of the International Society for Rare Saccharides.
  • epimerase see, for example, Patent Document 3
  • the prepared D-psicose can be effectively used as a sweetener, a carbon source for fermentation, a reagent, a cosmetic, a raw material for pharmaceuticals, an intermediate, and the like.
  • Patent Document 4 discloses that L-psicose, an optical isomer of D-psicose, can be used as an edible formulation.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 5 Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-2858571
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-1257 / 76
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-1296971
  • the inventors of the present invention have started to focus on the physiological activity of rare sugars and support it by experiments using cells.
  • the 21st century is said to be the century of life science, and DNA and protein research are currently being promoted internationally.
  • Speaking of sugar in bost genome research, sugar chain research is the main focus.
  • the present inventors have focused on “monosaccharides” and are conducting research on whether monosaccharides have physiological activity.
  • the background of the present invention is that exhaustive research on the production of rare sugars has been accumulated for many years, and in recent years, a technique for mass production of some rare sugars has been established.
  • An object of the present invention is to provide a method for utilizing the physiologically active action of rare sugars, particularly D-alose and D-psicose, and to create functional foods and pharmaceuticals utilizing the physiological activities of rare sugars.
  • the present invention relates to the following methods (1) to (9) for utilizing the physiologically active actions of rare sugars.
  • a method for utilizing a physiologically active action of a rare saccharide wherein a rare saccharide is caused to act on a cell which is sensitive to a physiologically active action to change the function of the cell.
  • the rare saccharide is a rare saccharide belonging to Aldose, Nose or Ketos.
  • the gist of the present invention is a composition containing the following rare sugars (10) to (17) as an active ingredient.
  • composition comprising, as an active ingredient, a rare saccharide having an effect of affecting a biologically active action-sensitive cell to change the function of the cell.
  • composition according to the above (10), wherein the cells are human cells.
  • composition according to the above (12), wherein the aldose is D-aroose.
  • the cells are selected from the group consisting of cells sensitive to cancer cell growth inhibitory action and cells sensitive to action to inhibit production of active oxygen.
  • composition according to the above (15), wherein the cells are selected from the group consisting of a chemokine secretion-inhibiting action-sensitive cell, a microdary migration-inhibiting action-sensitive cell, and a hypoglycemic action-sensitive cell. object.
  • composition according to any one of the above (10) to (16), wherein the composition is a functional food, a pharmaceutical or a cosmetic.
  • FIG. 1 is a diagram showing that D-aroose of the present invention has a growth inhibitory effect on liver cancer cells (HepG2).
  • FIG. 2 illustrates the invention!
  • FIG. 1 shows that) -allose has a growth inhibitory effect on uterine cancer cells (Hela).
  • FIG. 3 is a diagram showing that D-aroose of the present invention has a growth inhibitory effect on ovarian cancer cells (0VCAR3).
  • FIG. 4 is a diagram showing that D-Aloose of the present invention has a growth inhibitory effect on skin keratinocytes (HaCaT).
  • FIG. 5 is a diagram showing that D-aroose of the present invention has a concentration dependency on cancer cell growth inhibition.
  • FIG. 6 is a drawing showing the effect of the rare sugar of Example 3 to suppress the growth of HL60.
  • FIG. 7 is a drawing showing the inhibitory effect of the rare saccharide of Example 3 on the growth of Daudi cells.
  • FIG. 8 is a drawing showing the effect of the rare saccharide of Example 3 to suppress the growth of THP1.
  • FIG. 9 is a drawing showing the effect of the rare saccharide of Example 3 to suppress the growth of KS1.
  • FIG. 10 is a drawing showing the MT2 growth inhibitory effect of the rare saccharide of Example 3. is there.
  • FIG. 11 is a drawing showing the growth inhibitory effect of KG1 by the rare saccharide of Example 3.
  • FIG. 12 is a drawing showing the effect of D-Aloose on the cell cycle by flow cytometry.
  • FIG. 13 is a graph showing the change over time in the production of active oxygen from leukocytes.
  • FIG. 14 is a diagram showing that D-aroose according to the present invention is effective in suppressing the production of active oxygen from leukocytes.
  • FIG. 15 is a diagram showing that each sugar has no effect on the suppression of reactive oxygen after leukocyte production of reactive oxygen has begun.
  • FIG. 16 is a diagram showing that D-aroose according to the present invention in Example 9 has a concentration dependency on suppression of active oxygen production.
  • FIG. 17 is a drawing showing the effect of D-Arose on retinal ischemia / reperfusion injury.
  • FIG. 18 is a table showing all data of the engraftment area (%) with respect to the effect of D-Arose of Example 7 for reducing flap ischemia / reperfusion injury.
  • FIG. 19 is a table showing an analysis of variance (one-way arrangement) with respect to the effect of reducing the flap ischemia-reperfusion injury of D-Arose in Example 7.
  • FIG. 20 is a diagram showing an average value and a standard deviation with respect to the effect of Example 7 on reducing the flap ischemia-reperfusion injury by D-aroose.
  • FIG. 21 is a table showing the results of a multiple comparison test on the effect of D-Arose on reducing flap ischemia-reperfusion injury in Example 7.
  • FIG. 22 is a photograph instead of a drawing showing the result of Northern blotting on the effect of rare sugars on rat renal ischemia-reperfusion injury in Example 8. The figure shows the expression level of CINC-1 mRNA. GAPDH as standard
  • FIG. 23 is a drawing showing the inhibitory effect of the rare saccharide of Example 9 on hippocampal neuronal cell death.
  • FIG. 24 is a drawing showing the release of glutamate out of nerve cells due to cerebral ischemia in Example 9 and the release inhibitory effect of arose.
  • FIG. 25 is a drawing showing the release of glutamate out of nerve cells due to cerebral ischemia in Example 9, and the release inhibitory effect of 2-dexoxyglucose.
  • FIG. 26 is a diagram showing that D-psicose has an inhibitory effect on secretion of MCP-1 in Example 10.
  • FIG. 27 is a diagram showing that in Example 10, D-psicose acts on a cytokine that stimulates secretion of MCP-1 to suppress secretion of MCP-1.
  • FIG. 28 is a diagram showing the effect of D-psicose on the number of appearance of microglia in Example 11;
  • FIG. 29 is a diagram showing the effect of D-psicose on the secretion stimulating effect of insulin in Example 12.
  • FIG. 30 is a diagram illustrating an experimental example of the everted intestinal tract used in Example 12.
  • FIG. 31 is a diagram showing the influence of D-psicose on glucose absorption in Example 12.
  • FIG. 32 is a diagram showing the effect of administration of a rare saccharide on rat blood glucose level in Example 12 showing the effect of administration of physiological saline under anesthesia on blood glucose.
  • FIG. 33 is a drawing showing the effect of D-glucose administration under anesthesia on blood glucose with respect to the effect of rare sugar administration on rat blood glucose level in Example 13.
  • FIG. 34 is a drawing showing the effect of D-psicose administration on blood glucose in relation to the effect of rare sugar administration in Example 13 on rat blood glucose levels.
  • FIG. 35 is a graph showing the effect of IVGTT on blood D-glucose concentration with respect to the hyperglycemic condition-improving effect of ketose in Example 14.
  • FIG. 36 is a graph showing the secretory kinetics of insulin, with respect to the effect of improving the hyperglycemic state of ketoses of Example 15;
  • FIG. 37 shows the hyperglycemic state of the ketose of Example 15
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of D-psicose during hyperglycemia on the effect of improving the condition.
  • FIG. 38 is a diagram for explaining the principle of GA measurement with respect to the examination as to whether or not the rare saccharide of Example 15 has a saccharification inhibitory effect under hyperglycemia.
  • FIG. 39 is a diagram showing a study on the dilution using rare sugars in Example 15 regarding whether or not the rare sugars have a saccharification inhibitory effect under hyperglycemia.
  • FIG. 40 is a graph showing a study on the glycation by rare sugars in the presence of darcos, as to whether or not the rare sugars of Example 15 have a saccharification inhibitory effect under hyperglycemia.
  • Figure 41 is an Izmnoring linkage diagram.
  • FIG. 42 is an explanatory diagram of the izmolling C6 in the lower part of FIG. Figure 43 shows the interrupt izmo of Figure 41.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of FIG.
  • “Rare sugars” can be defined as monosaccharides that are present in trace amounts in nature. In the present invention, it is a rare saccharide based on the above definition, and is preferably D-alose which is an aldose, or D-psicose which is a ketose. There are seven types of monosaccharides that exist in large quantities in nature: D-glucose, D-fructose, D-galactose, D-mannose, D-report, D-xylose, and L-arabinose, and other monosaccharides. Are all rare sugars. In addition, sugar alcohols can be formed by reducing monosaccharides.
  • the link diagram connecting all monosaccharides having 4 to 6 carbon atoms is the overall diagram of izmnoring.
  • the monosaccharide has all four, five, and six carbon atoms.
  • the overall diagram shows that the connection in izmo ring C6, the connection in izmo ring C5, the connection in izmo ring C4, and that C4, C5, and C6 are all connected. This idea is important. Fermentation is mainly used to reduce the carbon number. It is also characterized by a large cooperation diagram that connects all monosaccharides with different carbon numbers. It can also be understood that there is no use value.
  • the ismoring of a monosaccharide having 6 carbon atoms has a total of 34 types of monosaccharides having 6 carbon atoms (hexose), 16 types of aldose, There are 8 types of keto and 10 types of sugar alcohol. It is known from studies including the present inventors that these sugars can be converted by oxidoreductase reactions, aldose reductase reactions, and aldose reductase reactions. However, in previous studies, the upper, middle, and lower groups were not linked by enzymatic reactions.
  • D-Dalcose glucose
  • D-fructose are naturally occurring saccharides inexpensive and inexpensive, but rare sugars could not be synthesized from them.
  • an enzyme that connects them was discovered. It originates from the discovery of a completely unexpected D-sorbose in the culture of a bacterium containing an enzyme that synthesizes D-gatose from galactitol. As a result of investigating the cause, they found that this bacterium produced an enzyme called D-gatose 3 epimerase (DTE). As shown in the lower part of Fig. 41 and Fig.
  • DTE D-gatose 3 epimerase
  • this DTE is found to be an enzyme that connects between D-evening gatose and D-sorbose, which had been cut before. And even more surprisingly, this DTE is an enzyme that epoxidizes the 3rd position of all ketoses; D-fructose and D-psicose, L-sorbose and L-tagatose, and D- It was found to be a unique enzyme with a very wide range of substrate specificities, acting on gatose and D-solupose, and on L-psicose and L-fructoses. With the discovery of this DTE, all monosaccharides were connected in a ring, completing the structuring of monosaccharide knowledge, and named it Izumoring.
  • Fig. 42 there is an L-shape on the left, a D-shape on the right, and a DL-shape in the middle, and the L-shape and the D-shape are symmetrical about the center of the ring (star). You can see that there is.
  • D-glucose and L-glucose are point-symmetric with respect to the central point.
  • the value of Izumoring is that it is also a blueprint for the production of all monosaccharides.
  • D-glucose, D-fructose, D-mannose, and D-galactose which can be produced from lactose in milk, are abundant in nature, and the rest are classified as rare sugars, which are only present in trace amounts.
  • DTE has made it possible to produce])-fructose and D-psicose from D-glucose, and also to produce D-alose, aritol and D-talitol.
  • the production process and molecular structure enable all monosaccharides to be structurally organized (structured knowledge), provide an overall picture of monosaccharides, and make research more effective and efficient.
  • the most suitable approach can be selected, the optimal production route can be designed, and the missing parts can be foreseen.
  • the isuzum ring of a monosaccharide having five carbon atoms is a ring having a small isuzum ring having six carbon atoms.
  • This ring is also connected by the same redox and isomerization reactions as those with 5 and 6 carbon atoms.
  • DTE reacts to 4 carbon ketoses Therefore, there is currently no reaction between ketose.
  • the overall configuration is bilaterally symmetric, similar to carbon number 5, and includes all 4 aldoses, 2 ketose and 3 sugar alcohols. That is, it has the same meaning as that of ismolling having 5 or 6 carbon atoms.
  • the D-glucose of Ismoling C6 is linked to the D-arabitol of Ismolling C5 and the erythritol of Ismolling C4.
  • This line indicates that fermentation can produce D-arabitol and erythritol from D-glucose. That is, the ismolling C6, the ismolling C5 and the ismolling C4 are connected. This coupling is mainly due to the fermentation reaction of carbon number reduction, and isomerization C6 and izmolling C5, C4 by fermentation methods other than the two) conversion reactions to])-arabitol and erythritol. Connection with is possible. For example, it is also possible to produce])-reports from D-glucose.
  • D-a-hexose used in the present invention is a type of alose that is classified as aldose (aldohexose).
  • Examples of the production method of this D-aloose include a method of reducing lactone D-aronic acid with sodium amalgam, and a method of producing a “Journal of fermentation” by Shaket, Hossein, Bouillon and others. Synthesized from D-psicose using L-rhamnose isomerase, described in “Bioengineering (Journal of Fermentation and Bioengineering)”, Vol. 85, pp. 539-541 (1998). There is a manufacturing method.
  • JP-A-2002-17392 A process has been invented in which D-xylose isomerase is allowed to act on a solution containing D-psicose to produce D-alose from D-psicose.
  • the D-aroose used for the cancer cell growth inhibitor of the present invention may be obtained by any of the above-mentioned production methods or other production methods, but the production method described in the above-mentioned JP-A-2002-17392 may be used. According to the report, mass production is expected and it is expected that it will be easier to obtain. However, the production methods to date have not been completely satisfactory with regard to the separation and recovery of D-arose, and therefore still require uneconomical work for industrial production.
  • L-rhamnose isomerase is a known enzyme published in the above-mentioned literature in 1998, and an enzyme derived from Pseudomonas stutzerii is exemplified as a preferable enzyme.
  • strain Pseudomonas stutzerii LL172a is a known bacterium described in the above literature, and is stored in the Kenmori Imori Laboratory of the Department of Bioresources and Food Chemistry, Faculty of Agriculture, Kagawa University. The same Pseudomonas stutzerii can be obtained from the Fermentation Research Institute. Pseudomonas stutzerii IF0 3773, Pseudomonas
  • L-Ramno Sudno —Suisomerase is readily available from various microorganisms and is produced inductively in culture conditions where L-rhamnose is present. Usually, it can be obtained by culturing a microorganism having an ability to produce L-rhamnose isomerase. For example, when various microorganisms are cultured using L-rhamnose as a carbon source, L-rhamnose isomerase is produced in the cells by using L-rhamnose as an inducer. It is particularly advantageous to use a mutant strain that produces the enzyme constitutively in large quantities, since an expensive carbon source such as L-rhamnose is not required.
  • L-rhamnose isomerase may not necessarily be purified to high purity depending on the purpose of use, and may be a crude enzyme.
  • the crude enzyme As a specific example of the crude enzyme, the above-described microorganism having L-rhamnose isomerase-producing ability itself, a culture thereof, or a partially purified culture can be used.
  • a reactor by using an immobilized enzyme or an immobilized cell according to a specific immobilization method, a reactor can be constructed which has a low liquid sending pressure and can be used continuously for a long period of time.
  • D- psicose used in the present invention is a D-isomer of psicose classified as Kiso scan keto belonging to the rare saccharides is hexose (C 6 H 12 0 6) .
  • Such D-psicose may be obtained by any means, including those extracted from the natural world, those synthesized by chemical or bio synthetic methods, and the like.
  • D-psicose solution can be purified, for example, by deproteinization, decolorization, desalting, etc., and concentrated to collect a syrup-like D-psicose product.
  • a high-purity standard of 99% or more can be easily obtained by fractionation and purification.
  • Such D-psicose can be used as a monosaccharide as it is, and is expected to be used as various derivatives as necessary.
  • the physiologically active cell is a cell capable of changing the function of the cell by the action of a rare saccharide, and is not particularly limited as long as it has such a function.
  • the rare saccharide affects the cell and changes the function of the cell.
  • the physiologically active effects differ depending on the type of the rare sugar, the effects can be predicted by preliminary experiments using cells and can be confirmed by the present experiments.
  • the cells are preferably human cells, but also include non-human cells.
  • the cells may be in the form of living organs or cultured cells.
  • the rare sugar is caused to act on the cell.
  • the rare saccharide used in the present invention is water-soluble, and there is no limitation on the mode of action.
  • the rare sugar can be allowed to act by using an appropriate means depending on the use.
  • the rare saccharide in the form of a substance containing the rare saccharide as an active ingredient to cause the rare saccharide to act on cells.
  • the substance containing the rare saccharide as an active ingredient as the rare saccharide includes any form.
  • D-Fract in izmoring as aldose The D-alose closest to the source is taken as D-psicose as two representative rare sugars as ketose, and its biological activity is explained. First, an example of D-arrow is shown.
  • the present inventors have found that rare sugars, which are aldoses, have the property of inhibiting the production of active oxygen.
  • the present invention can provide an active oxygen production inhibitor containing a rare saccharide, which is an aldose, as an active ingredient.
  • this protective effect against ischemia supports that it has a protective effect on retinal ischemia, a markedly improved flap survival rate, and a protective effect on renal ischemia.
  • the effect was found to be due to suppression of glutamate secretion.
  • the present inventors have found that aldohexose (hexose) belonging to the rare saccharide has a property of suppressing the growth of cancer cells.
  • the present invention can provide a cancer cell proliferation inhibitor comprising an aldohexose belonging to a rare sugar as an active ingredient. That is, the effect on the growth of cancer cells using cell lines derived from human cancer was examined. As shown in the examples below, the results show that cancer cells are spread on petri dishes and grow rapidly when given sufficient nutrition and oxygen.
  • the cancer cell growth inhibitor containing D-aroose as an active ingredient may be orally administered, or may be intravenously injected, arterial injected, intralymphaticly injected or directly administered to a disease site.
  • What is contained in the cancer cell growth inhibitor as an active ingredient is not limited to D-aroose, and other aldose rare sugars having an effect of suppressing cancer cell growth (cancer cell growth inhibitory effect) are also included in cancer cell growth inhibitors. It can be contained as an active ingredient of the inhibitor.
  • Ketohexose which belongs to such a rare sugar, does not affect glucose metabolism and is taken orally, intraperitoneally, or intravenously as a chemokine inhibitor, a microglia migration inhibitor, an insulin secretion promoter or a cancer cell growth inhibitor. It can be used in various routes. It can also be administered parenterally in or around the lesion. In this case, the ketohexose belonging to the rare saccharide alone, or an additive which does not adversely affect the action of the ketohexose belonging to the rare saccharide is added, or a derivative is obtained. (A pharmacologically active ingredient).
  • ketohexose which belongs to a rare saccharide, has a property of suppressing secretion of chemokines.
  • a chemokine secretion inhibitor or substance containing a ketohexose belonging to a rare sugar as an active ingredient can be provided.
  • Atherosclerosis Death due to arteriosclerosis is the leading cause of death. Diabetes, hyperlipidemia, and hypertension have been pointed out as risk factors for arteriosclerosis. Recent reports indicate that these risk factors and the mechanisms of atherosclerosis development are being analyzed at the molecular level.
  • the onset of atherosclerosis is the migration of monocytes to the vascular wall, cholesterol accumulation by scavenger receptor or foaming of macrophages. It has been suggested that various cytokines and chemokines are involved in the progress. In particular, one of the chemokines (cytokines that cause cell migration), MCP-1 (monocyte chemoat tracant protein-1) is secreted from vascular endothelial cells in atherosclerotic nests and is involved in monocyte migration. It is a factor that plays an important role in the progression of atherosclerosis and is attracting attention.
  • MCP-1 monocyte chemoat tracant protein-1
  • MCP-1 is secreted by stimulation by inflammatory cytokines such as IL-113 and TNFi.
  • cytokines such as IL-113 and TNFi.
  • drugs that suppress such cytokine production pyrazolo triazin derivative drugs and nitric oxide (NO) secretion inducers are known and used for organ preservation.
  • Methylprednisolone sodium succinate (potency: corticosteroid) is also commercially available as an inhibitor of inflammatory cytokines and chemokine production (eg, Pharmacia, Fuji Pharma, U.S.C. Japan, Sawai Pharmaceutical).
  • cytokines and chemokine production eg, Pharmacia, Fuji Pharma, U.S.C. Japan, Sawai Pharmaceutical.
  • calcium hexose phosphate such as calcium glucose phosphate which reduces blood cholesterol concentration is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-198630.
  • a spiranopyranone compound that suppresses the synthesis of collagen is disclosed in JP-A-10-330268.
  • the inhibitory effect of ketohexose and its derivatives belonging to rare sugars on the secretion of MCP-1 and the suppression of arteriosclerosis using the same have not yet been known.
  • the inhibitory effect of ketohexose belonging to rare sugars on MCP-1 secretion according to the present invention it is possible to support the usefulness of ketohexoses belonging to rare sugars in arteriosclerosis and the potential for clinical application Can be.
  • the effect of D-psicose as one of ketohexoses belonging to rare sugars on the secretion of MCP-1 from vascular endothelial cells will be examined.
  • a site that stimulates MCP-1 secretion from vascular endothelial cells The effect of D-psicose in the presence of MCP-1 secretion will also be examined.
  • ketohexoses belonging to the rare sugars are effective in preventing or treating arteriosclerosis by suppressing the secretion of MCP-1, alone or in combination with other substances (pharmacologically active ingredients).
  • MCP-1 secretion of MCP-1
  • other substances pharmacologically active ingredients
  • It is also expected to be a preventive and therapeutic substance for diabetes, hyperlipidemia, and hypertension. It is also expected to be used as a substitute for inflammatory site-induced chemokine production, corticosteroids and anti-inflammatory agents.
  • application as an organ preservative is also expected.
  • D-psicose promotes insulin secretion.
  • increasing the concentration of D-glucose a physiological secretion substance, gradually increased the secretion of insulin, depending on the concentration.
  • concentration of D-glucose was set to zero and the concentration of D-psicose was increased, a reaction was observed in which insulin was secreted in a concentration-dependent manner, similarly to D-glucose.
  • the present inventors further studied and confirmed that the action of D-psicose to moderately lower blood glucose levels in animals (rats) for promoting insulin secretion in animals (rats). It was confirmed that the protein had an effect of lowering insulin and promoting insulin secretion, and that glycation of the protein was hardly caused by D-psicose.
  • the application as a pharmaceutical was shown as an example.
  • the effect of suppressing the secretion of the chemokine MCP-1 which is an exacerbation factor of arteriosclerosis from vascular endothelial cells, It is also known to have the effect of suppressing the synthesis of fat, which may lead to the prevention of arteriosclerosis.
  • rare sugars other than pharmaceuticals include foods and beverages, especially functional foods (such as obesity prevention), cosmetics, feed, and pesticides (such as plant growth regulators and plant disease resistance amplifiers). Is shown as an example.
  • Another object of the present inventors is to provide a rare sugar-based plant for the purpose of providing a substance capable of amplifying disease resistance to a plant, which has the potential to dramatically reduce the use of pesticides.
  • a separate invention for a disease resistance amplifier is being filed (Japanese Patent Application No. 2003-95826).
  • Rare sugars are plant resistant to diseases The advantages of using it as a substance that amplifies the properties are as follows: (1) A low-concentration (100 ii g / ml) rare sugar aqueous solution can quickly activate a resistance gene without a spreading agent, and (2) Rare sugars exist only in trace amounts in the natural world, but because they are "natural products", they are expected to be highly safe spraying agents.
  • the blending amount in food, drink, cosmetics, or feed is not particularly limited, but is preferably about 0.01 to 10% by weight.
  • Pharmaceuticals can be administered orally as capsules, powders, tablets, etc., and since they are soluble in water, it is possible to adopt other administration methods such as intravenous injection and intramuscular injection. The dose varies depending on, for example, the degree of diabetes symptoms, body weight, age, sex, and the like, and it is desirable to determine an appropriate amount for use according to the symptoms.
  • the amount of the drug is 0.01 to 2,000 nig for oral administration, 0.01 to 2,000 nig for intravenous injection, 0.01 to 1, OOOmg for intramuscular injection, and 0.01 for intramuscular injection per kg of body weight. ⁇ 1, OOOmg is preferred.
  • the rare saccharide of the present invention is present in a trace amount in food materials, is highly safe, and has a high utility value in terms of cost if mass production technology is developed. In an acute oral toxicity test, it was 5,000 mg / kg or more.
  • the functional food of the present invention is suitable for use in the fields of healthy foods for preventing specific diseases and the like (obesity prevention) and preventive medicines.
  • Can be The food can be eaten in any form, liquid or solid. It can be eaten as a soft capsule encapsulated by encapsulation with gelatin or the like. Capsules are made, for example, by dissolving gelatin in water by adding water and adding a plasticizer (glycerin, D-sorbitol, etc.) to the capsules (prepared with a gelatin film prepared in this manner). Is used not only as such but also as a pharmaceutically acceptable salt thereof, which can be used alone as a pharmaceutical preparation, as well as a pharmaceutically usable carrier or diluent.
  • a plasticizer glycol, D-sorbitol, etc.
  • Such a preparation or a pharmaceutical composition can also be administered by an oral or parenteral route, for example, a solid or fluid for oral administration.
  • (Gel and liquid) formulations or pharmaceutical compositions take the form of tablets, capsules, tablets, pills, powders, granules or gel preparations.
  • the exact dosage of the pharmaceutical or pharmaceutical composition will vary depending on the intended use and the duration of the treatment, and will be such that the attending physician or veterinarian considers appropriate.
  • the dosage may be adjusted as appropriate depending on the form: Oral solid preparations such as tablets, oral liquids, etc., may be taken once or several times a day, and babies such as syrups, troches, and chewable tablets In the case of a formulation that acts locally and also exerts systemic effects due to oral administration, it is sufficient to mix and take 1/2 to 1/10 of the daily dose as a single dose. The amount may not be less than the daily amount.
  • a dose equivalent to the daily dose may be combined into one dose.
  • commonly used diluents and excipients such as fillers, extenders, binders, disintegrants, surfactants, lubricants, coating agents, and sustained release agents can be used. Wear.
  • dissolution aids if necessary, dissolution aids, buffers, preservatives, solubilizers, tonics, emulsifiers, emulsifiers, suspending agents, dispersants, thickeners, gelling agents, hardeners, absorbents, Adhesives, elasticizers, plasticizers, adsorbents, fragrances, coloring agents, flavoring agents, antioxidants, humectants, light-blocking agents, brighteners, antistatic agents, and the like can be used.
  • the present invention relates to a skin external preparation that utilizes the anti-inflammatory action of rare sugars, that is, a skin external preparation that has improved and preventive effects on skin roughness and roughness, for which there are known therapeutic agents, skin external preparations, and cosmetics.
  • the skin external preparation of the present invention contains a rare sugar as an essential component, and other components usually used in skin external preparations such as cosmetics and pharmaceuticals, for example, an aqueous component, an oily component, a powder component, an alcohol, and a moisturizer.
  • Agents, thickeners, ultraviolet absorbers, whitening agents, preservatives, antioxidants, surfactants, fragrances, coloring agents, various skin nutrition agents, and the like can be appropriately compounded as necessary.
  • sequestering agents such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, dalconic acid, caffeine, tannin, verabamil, licorice extract, grabradine, kalin Hot water extract of the fruit of sorghum, various crude drugs, drugs such as tocopherol acetate, glycyrrhizic acid, tranexamic acid and its derivatives or salts thereof, vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, curcoside ascorbate, alptin, kojic acid, D- Sugars such as glucose, D-fructose, and trehalose can also be appropriately blended.
  • drugs such as tocopherol acetate, glycyrrhizic acid, tranexamic acid and its derivatives or salts thereof, vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, curcoside ascorbate, alptin, kojic acid, D- Sugars
  • the external preparation for skin of the present invention may be in any form used in conventional external preparations for skin, such as, for example, ointments, creams, emulsions, lotions, packs, bath preparations, and the form is not particularly limited.
  • ointments creams, emulsions, lotions, packs, bath preparations
  • the present invention will be described in detail with reference to Examples. It is not limited at all by the examples.
  • Cells to be added Liver cancer cells (HepG2), uterine cancer cells (Hela), ovarian cancer cells (0VCAR3), and skin keratinocytes (HaCaT) were used as cells to be added.
  • HepG2 Liver cancer cells
  • Hela uterine cancer cells
  • ovarian cancer cells (0VCAR3)
  • HaCaT skin keratinocytes
  • Reagent preparation Dissolve a predetermined amount of MTT (tetrazolium saint) in PBS (-) sterilized with an autoclave, and sterilize by filtration to obtain an MTT solution.
  • As an acidic solution add 50 mL of N, N-dimethylformamide and water to a predetermined amount (20 g) of SDS to make 100 mL, and adjust it to pH 4.7 by adding about 200 mL of 1N hydrochloric acid. Store at room temperature and bring to 37 ° C before use.
  • Test method Treat cells with TEP to prepare a cell suspension. Dispense a predetermined number (300 to 52,000 cells / well) of the cell suspension into each well (96-well plate: 0.1 ml of medium, add a predetermined amount of sugar as a drug, and add carbon dioxide. Incubate overnight in an incubator. Add 0.5 mg / mL of the above-mentioned MTT solution, and incubate in a carbon dioxide incubator for 4 hours, and completely remove the medium. Further, add the acidic solution in a room maintained at 37 ° C in an amount of 0.1 lL / well, place on a microplate mixer, and dissolve while shaking with for 20 minutes (dissolve formazan with the acidic solution). Measure absorbance at 570-600 nm using a spectrophotometer. After dissolving with a colored substance (formazan) acidic solution, the absorbance can be directly measured with a plate reader.
  • liver cancer cells HepG2
  • Fig. 1 shows the time course of the number of liver cancer cells (HepG2).
  • Figure 1 shows that D-allose strongly suppressed the growth of HepG2 cells.
  • D-altrose also exhibited an inhibitory effect, but the inhibitory effect on cancer cell proliferation was weaker than that of D-alose. Alcohol had almost no inhibitory effect.
  • He la Uterine cancer cells
  • Fig. 2 shows the time-dependent changes in the number of uterine cancer cells (He la). It can be seen that D-aroose strongly suppressed the proliferation of He1a cells.
  • Fig. 3 shows the time course of the number of ovarian cancer cells (0VCAR3). It can be seen that D-aroose strongly suppressed the proliferation of 0VCAR3 cells. D-altrose also showed an inhibitory effect, but the inhibitory effect on cancer cell growth was weaker than that of D-alose. Glucose acted to promote the growth of cancer cells.
  • HaCaT 4Skin keratinocytes
  • Fig. 4 shows the change over time in the number of skin keratinocytes (HaCaT). It can be seen that D-aroose strongly suppressed the growth of HaCaT cells. Other rare saccharides showed a moderate inhibitory effect on D-altrose, but a weaker inhibitory effect on cancer cell growth than D-alose. From FIG. 1 to FIG. 4, it can be seen that the strength of the inhibitory effect of D-Arose on the growth of cancer cells differs depending on the cell type. D-Arose as an aldose rare sugar has the effect of suppressing the growth of cancer cells, and is expected to be effectively used as an anticancer drug Was.
  • D-altrose a rare keto-sugar
  • D-alose had a weaker inhibitory effect on cancer cell growth than D-alose, so that other aldose rare saccharides as well as D-alose are also effective as anticancer agents.
  • the use can be expected.
  • Example 2 As a second example, the concentration dependence of the cancer cell growth inhibitory effect of D-aroose was examined.
  • Ovarian cancer cells (0VCAR3) were selected as cells to be added, and D-aroose concentrations were added as lmM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, and 100 mM.
  • Experimental conditions such as a method for culturing ovarian cancer cells (0VCAR3) and a method for counting the number of cells (MTT method) are the same as those in Example 1 above.
  • FIG. 5 shows the time course of the number of ovarian cancer cells (0VCAR3) to which D-allose was added at various concentrations.
  • the inhibitory effect on cancer cell growth began to be observed at lOmM and gradually increased to 20mM, 50mM, lOOmM. That is, the inhibitory effect of D-allose was found to be concentration-dependent.
  • the concentration at which the inhibitory effect was observed was lOmM under the experimental conditions of this Example 2 (10% fetal serum), but the effective concentration was the same in other cells.
  • microscopic examination of cells treated with D- arose showed few dead cells, which was confirmed by a trypan blue dye excretion test. From the results of this experiment, it is considered that D-aroose suppresses cell proliferation but does not kill cells.
  • Example 3 shows the time course of the number of ovarian cancer cells (0VCAR3) to which D-allose was added at various concentrations.
  • This example demonstrates the inhibition of cancer cell growth containing aldose belonging to a rare sugar as an active ingredient.
  • anti-inflammatory substances Various antitumor drugs and anticancer drugs are known, but their side effects are generally problematic. At the same time, awareness and expectation of drugs or foods (functional foods) that focus on the prevention of diseases rather than drugs that target them are increasing.
  • oligosaccharides have the effect of reducing constipation by using the intestinal action of intestine and have the effect of reducing colon cancer, and recently polysaccharides such as agaricus have the effect of suppressing cancer Although there are reports such as this, and reports related to sugar chains and cancer metastasis, there are few reports that monosaccharide itself has a cancer cell growth inhibitory effect.
  • Example 1 the effect of aldoseketose belonging to the rare saccharide on the growth of various established cancer cells was examined. As a result, it was confirmed that Aldose, a rare saccharide, inhibited the growth of established cancer cells.
  • aldoses belonging to rare sugars that do not affect glucose metabolism have been confirmed to have the effect of suppressing the growth of established cancer cells is expected to be a therapeutic, prophylactic and growth inhibitor for cancer with few side effects.
  • aldoses belonging to rare sugars are expected to increase the added value as functional foods. D-aroose was the most effective aldose belonging to the rare sugars.
  • D-allose was found to have an inhibitory effect on four types of cells, HL60, Daudi, KS1, and KG1, and was the highest inhibitory effect among the rare sugars used. It was confirmed that the effect of D-allose varies depending on the cell type. Was. Example 4
  • Rat leukocytes (granulocytes) were used.
  • Rare sugars added In addition to D-alose as an aldose rare sugar, other rare sugars to be compared include the rare ketose sugars D-psicose and D-altrose, and the polyol])-talitol Using. In addition, D-glucose and D-fructose were used as sugars that exist in large amounts in nature.
  • Fig. 15 shows the experimental results when rare sugar was added after active oxygen production started. Addition of zymosan to leukocytes, phagocytosis started, and active oxygen production started, followed by the addition of rare sugar at a concentration of 10 mM, showed an inhibitory effect on D-alose.
  • This Example 5 revealed that the time course of the production of active oxygen was the same irrespective of the presence of rare sugars. In addition, among the rare sugars examined, it was found that D-allose had an effect of inhibiting the production of active oxygen (active oxygen production inhibitory effect).
  • ⁇ ⁇ Fig. 16 shows the experimental results of the active oxygen suppression effect at each concentration of D-Arose.
  • this system no effect appears at 5 mM, Only after that, it was found that an inhibitory effect of 50% or more appeared, and that the effective concentration of D- arose was around l OmM.
  • D-Arose has an action of suppressing the production of active oxygen.
  • Other aldoses are also expected to have this effect, and need to be investigated as a future issue.
  • cerebral nervous system diseases transient cerebral ischemic attack, stroke, Parkinson's syndrome, traumatic epilepsy, spinal cord injury, etc.
  • cardiovascular lesions arteriosclerosis, ischemic myocardial injury, etc.
  • respiratory diseases [Adu lt re sp i rat ory dist res s syndrome (ARDS), interstitial pneumonia, pulmonary fibrosis, viral pneumonia, etc.
  • gastrointestinal diseases gastric mucosal lesions, hepatic ischemia, recirculation disorder, jaundice pathology, Knee inflammation
  • kidney disease glomerulonephritis, acute renal failure, chronic renal failure, uremia, etc.
  • diabetes cancer
  • ophthalmic disease retina degeneration, retinopathy of prematurity, cataract, ophthalmitis, corneal disease
  • Transient ocular ischemia model increases intraocular pressure to about 120 mmHg It produced by doing. After 45 minutes of ischemia, reperfusion was performed. The concentration of glutamate released during ischemia reperfusion was measured by the microdialysis method.
  • Example 7 the primary objective was to obtain basic data on the inhibitory action of rare sugars on the production of reactive oxygen, and to effectively prevent the necrosis of insular flaps and randomized flaps.
  • the second purpose is clinical application to prevent injuries, as well as free flaps and preservatives for long-term storage of amputated limbs
  • the third objective is to develop a method of preventing reperfusion injury after recirculation and re-application of perfusion (2)
  • Experimental method 1) Wistar rats ( ⁇ 7-8 weeks, less than 300 g) were treated with pentobarbital ( Nembutal) intraperitoneally Administer and anesthetize. 2) Sharp the entire abdomen with a clipper.
  • D-glucose has the effect of extending the flap engraftment area, and it can be said that administration of 30 mg (0.1 mg / g) or more is necessary for the manifestation of this effect.
  • Yagi K A simple fluorometric assay for lipid peroxide in blood plasma. Biomed Med, 15: 212-216, 1976.
  • Acute renal failure is one of the serious complications that have a negative impact on the prognosis of life, such as during surgery with shock or renal ischemia. Therefore, the efficacy of ischemic preconditioning and various drugs has been studied for renal ischemic injury. In this study, we used a rat renal ischemia-reperfusion injury model. The effects of rare sugars on blood disorders were investigated.
  • Renal ischemia Made by clamping the left renal blood vessels for 45 minutes after removing the right kidney.
  • Drugs used D-allose and D-psicose (both 400 mg / kg) are administered intravenously 30 minutes before renal ischemia.
  • Measurement item The effect on the expression of cyt okine-induced neutrophil l chemoat trac tant (CINC) -l mRNA (2 hours after reperfusion), which is an impairment factor
  • the solution of glutamate oxidase dissolved in the hippocampus is returned to the probe for microdialysis, and the glutamate concentration outside the neurons in the hippocampus is measured. Measured in real time.
  • pre-administration of D- ⁇ lose or 2-deoxyglucose was performed to clarify the relationship between the darcose metabolism associated with ischemia and the mechanism of action of D- ⁇ lose.
  • D-glucose consumption in cerebral ischemia occurs not only in neurons but also in stellate glial cells, indicating that both may compete for D-glucose. It has been reported that D-glucose consumption in stellate glial cells differs from that of nerves in the end product, and that anaerobic metabolism activates and lactate is released. Although preliminary time was observed, lactate secretion was actually observed during ischemia, suggesting that part of the site of action of D-allose might be stellate glial cells. Also, the second peak of glutamate release may be caused by reactive oxygen species.
  • HUVECs Human vascular endothelial cells
  • MCP-1 secretion in vascular endothelial cells is stimulated by cytokinin (TNF- ⁇ , IL-1
  • - ⁇ is the maximum secretion stimulating concentration of 10 ng / mL. From FIG. 27, it is understood that when vascular endothelial cells are stimulated with IL-l Mlng / mL), MCP-1 is secreted, and the secretion is suppressed in a concentration-dependent manner by the added D-psicose.
  • MCP-1 as one of the chemokines, which is a cytokine having chemotactic activity on various blood cell components, has chemotactic activity on monocytes, and is physiologically involved in the accumulation of monocytes and macrophages in inflammatory foci. It plays an important role. Clinically, it plays an important role in the migration of cellular components for the formation of foam cells, following the injury of vascular endothelial cells in the formation of atherosclerotic lesions. Recently, overexpression of MCP-1 in atherosclerotic lesions has been pointed out by immunostaining of atherosclerotic lesions.
  • MCP-1 plays an important role in the formation of atherosclerotic lesions.
  • the inhibitory effect of ketohexose, a rare sugar, on MCP-1 secretion is also important from the viewpoint of prevention of atherosclerosis. It was thought that it could be used for substances that are useful for sclerotherapy (eg, atherosclerosis therapeutic substances and prophylactic substances).
  • ketohexose a rare saccharide
  • MCP-1 secretion Examination of its derivatives and glycosides also suggests the possibility of producing a substance that suppresses MCP-1 secretion.
  • MCP-1 is involved not only in arteriosclerosis but also in the development of other diseases. For example, involvement of MCP-1 in inducing joint inflammation in rheumatoid arthritis has been pointed out.
  • lung diseases such as asthma, it is also involved in disease formation via monocyte migration and activation of monocytes and macrophages.
  • Ketohexoses which belong to rare sugars in diseases involving local inflammation and monocytes / macrophages, may regulate disease activity, and are expected to be applied as therapeutics for a wide range of diseases .
  • Example 11 relates to a microglia migration inhibitory substance containing ketohexose as an active ingredient, which belongs to a rare sugar.
  • Organs in a living body become necrotic when the blood flow is interrupted for a long time and ischemic.
  • An ischemic condition occurs whenever blood flow is temporarily interrupted during surgery on an organ and resumed after surgery.
  • Organ preservation methods include simple cooling, continuous perfusion, and freezing, but the simple clinical cooling is currently the most clinically applied.
  • Example 11 the usefulness of the ketohexose belonging to the rare sugar in preserving the brain and organs and the possibility of its clinical application were examined by confirming the effect of the ketohexose belonging to the rare sugar on microglia migration. I do.
  • Example ⁇ the effect of ketohexose belonging to a rare saccharide on the number of microglia appearing in ischemia will be examined. This suggests that ketohexose, a rare sugar, reduces the number of microglia and is useful for preserving brain organs and effective for clinical application to brain treatment.
  • D-psicose was used as ketohexose belonging to the rare sugar.
  • a cerebral ischemia model a model in which bilateral common facial arteries of a male sand rat weighing about 70 g are ligated for 5 minutes is used. In this model, neurons in the hippocampal CA1 region of the brain specifically undergo ischemic cell death.
  • the subjects were divided into three groups: subjects without ischemia (control: Sham), ischemia + saline treatment, and ischemia + D-psicose treatment.
  • D-psicose treatment D-psicose is dissolved in physiological saline to give a 200 mg / mL D-psicose solution, 200 mg / kg for 5 minutes before ischemia and 200 mg / kg for immediately after ischemia. More administered to the ischemic model.
  • physiological saline only physiological saline was similarly administered instead of the D-psicose solution.
  • the cells were perfused and fixed, 20 frozen brain sections were prepared, and hematoxylin-geosin staining was performed. The results are shown in FIG.
  • microglia which is an inflammatory cell
  • D-psicose the migration of macroglia is surely suppressed by the administration of D-psicose.
  • D-psicose the migration of microdaries, inflammatory cells, was suppressed by administration of D-psicose.
  • neuronal cell death occurs in the hippocampus and is accompanied by impaired memory.
  • ischemic neuronal cell death due to cerebral ischemia, even after temporarily suppressing ischemic neuronal cell death with drugs or hypothermia, microdalia, a type of cerebral dary cell, emits glutamate and reactive oxygen, resulting in post-treatment.
  • Example 12 relates to a hypoglycemic substance containing ketohexose belonging to a rare sugar as an active ingredient.
  • Diabetes is a national illness that far exceeds 10 million people, including impaired glucose tolerance. Diabetes is characterized by glucose-specific insulin secretion deficiency, and is considered to be a metabolic disease that occurs due to a state where insulin secretion from fl ⁇ is weakened and its action is insufficient.
  • drugs that promote insulin secretion include anti-diabetic drugs such as sulfonylurea drugs and phenylalanine derivatives, but they have various problems such as side effects.
  • Example 12 the usefulness of ketohexose, which belongs to a rare sugar, in diabetes and the possibility of its clinical application were examined.
  • the ability of the knee to stimulate insulin secretion from ketohexoses belonging to rare sugars was examined in comparison with glucose, and in the presence of glucose and ketohexoses belonging to rare sugars.
  • insulin secretion from knee j3 cells in rats because darcos is supplied after digestion and decomposition of food and absorption from the intestine, the effects of ketohexose, a rare sugar, on darcos absorption will be examined using the intestinal tract.
  • ketohexose a rare sugar, has the effect of promoting the secretion of insulin.
  • ketohexose belonging to a rare saccharide which does not affect sucrose inhibits the absorption of dalcose suggests that ketohexose belonging to a rare saccharide is useful for prevention or treatment of diabetes.
  • Insulinoma-derived knee 3 cell line INS-1 was cultured in a culture solution (DMEM + 10% FBS) under the conditions of a conventional method. INS-1 cells were dispensed at a density of about 70% into a 96-well culture dish and subjected to the following experiment. D-psicose was used as ketohexose belonging to rare sugars. .
  • the insulin concentration in the culture solution was measured by ELISA (Levis Insulin Kit).
  • ELISA Levis Insulin Kit
  • insulin secretion was stimulated in the insulin / 3 cell line INS-1 cells in response to the glucose concentration in the culture medium. This secretory stimulus reached a plateau at a glucose concentration of 11.2 ⁇ .
  • the rat inverted intestinal tract is immersed in a buffer solution containing glucose, and after a certain period of time, the solution on the serosal side is sampled and the glucose concentration is measured.
  • the effect of D-psicose on glucose transport from the mucosal side to the serosa side by adding various concentrations of D-psicose was examined. The results are shown in FIG.
  • the essential nature of diabetes is glucose-specific insulin secretion deficiency.However, even when glucose-based insulin secretion is deficient, insulin secretion can be effectively promoted by the action of ketohexose, a rare saccharide. Is expected to be possible. ' From this, the action of stimulating insulin secretion from knee i3 cells of ketohexose belonging to a rare saccharide and the action of enhancing the secretion of insulin by ketohexose belonging to a rare saccharide in a hyperglycemic state were revealed. Is expected as a substance with an unprecedented new mechanism of action.
  • ketohexose a rare saccharide
  • ketohexose belonging to the rare saccharide administered enterally and which inhibits glucose absorption and that ketohexose belonging to the rare saccharide does not affect glucose metabolism suppresses postprandial hyperglycemia in diabetes. It is possible and is expected as a useful substance for prevention or treatment of diabetes mellitus.
  • ketohexose a rare sugar, also has a preventive effect on arteriosclerosis, which is highly associated with diabetes and its complications.Since arteriosclerotic diseases are the main cause of diabetes, rare sugars also have an arteriosclerosis inhibitory effect.
  • Ketohexose which belongs to the group, is expected to be a revolutionary antidiabetic drug for improving blood sugar levels and preventing arteriosclerosis.
  • ketohexose which belongs to the rare sugars, is expected to be a health supplement that is expected to have these therapeutic effects and anti-obesity.
  • Blood collection Blood was collected from a silicone tube inserted into the face vein using an Im1 syringe. Blood samples were collected immediately before rare sugar administration, 5, 10, 15, 20, 25, 30,
  • Example 14 In the experimental system under normal rat anesthesia used in this Example 13, nembutal anesthesia and intravenous administration of physiological saline had an effect on blood glucose level and D-glucose load. It was confirmed that it had no effect. In the experiment of Example 13, half of the rats received D-psicose, and the blood glucose level was lowered 30 to 60 minutes after the administration, and a slow recovery was observed thereafter. The remaining rats developed hypoglycemia early and then rose, or gradually showed hypoglycemia. From these facts, it was found that in normal rats, rare sugar (D-psicose) caused mild hypoglycemia in normal rats. It is necessary to analyze the data by increasing the number of experimental animals in the future. It is also necessary to examine the effects in hyperglycemic rats. In a concurrent D-Arose experiment, no hypoglycemia was observed.
  • Example 14 Example 14
  • Diabetes is a nation-wide disease with more than 10 million people including impaired glucose tolerance.
  • the true nature of diabetes is glucose-induced insulin deficiency.
  • D-psicos which is a rare sugar, in diabetes, and its potential for clinical application.
  • the effects of D-psicose on insulin secretion and glucose metabolism are examined.
  • the purpose of this study is to examine the effect of ketose on stimulating insulin secretion from knee 3 cells and the effect of ketoose on insulin secretion in hyperglycemic conditions in vivo. Based on the above, the purpose of this study is to investigate the potential of ketose as a preventive Z treatment in diabetes in the future.
  • IVGTT Intravenous glucose tolerance test
  • Blood sampling time shall be 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 and 9/60 points.
  • IVGTT glucose was used as a control. As shown in Figure 35, glucose loading was found to increase with glucose loading. Vein psicose No increase in blood sugar level was observed even when the drug was administered intravenously. In addition, the blood insul in was measured over time in IVGTT,
  • Example 14 Investigation in Example 14 revealed that D-psicose stimulates insulin secretion from knee 3) cells in vivo without affecting glucose metabolism. With regard to the insulin secretion effect, it has an insulin secretion effect at the time of hyperglycemia, but almost no insulin-stimulating effect was observed in normal blood glucose, and no induction of hypoglycemia was observed. Diabetes is characterized by a specific insulin secretion deficiency caused by glucose.Rare sugar is a substance with an unprecedented new mechanism of action by effectively promoting insulin secretion even in such a condition. Be expected. D-psicose may promote insulin secretion and improve blood glucose levels in diabetic patients with clinically high blood sugar, and may be a useful medicine or dietary supplement for the treatment of diabetes Can be Example 15
  • Example 15 Sustained hyperglycemia in diabetes promotes non-enzymatic glycosylation (glycation) of proteins in vivo. This reaction is based on Amadori products In the meantime, it forms advanced glycat ion end products (AGEs), increases oxidative stress, and develops vascular complications such as retinopathy and renal damage in diabetes. In Example 15, it is examined whether or not rare sugars have an effect of suppressing glycation and oxidative stress under hyperglycemia.
  • AGEs advanced glycat ion end products
  • HbAlc-glycoalbumin and the like are useful as indicators of glycemic control in diabetic patients.
  • the saccharification reaction products of proteins with glucose were measured.
  • the glycation site is said to be valine at the N-terminal of the globin 0 chain of hemoglobin and lysine at positions 199, 281, 439 and 525 of albumin. Since albumin used in the study of the saccharification reaction of rare sugars has more saccharification sites than hemoglobin, data was obtained in a short period of time.
  • D-psicose does not promote saccharification of albumin.
  • Other sugars such as D-fructoses, did not saccharify, but those sugars have metabolic pathways in the body, and their presence in large amounts results in increased aldoses.
  • Future experiments should clarify the metabolism of D-psicose in the human body, but at least doses of D-psicose may not promote the development of complications caused by saccharification reactions.
  • the insulin secretion effect of D-psicose is considered to be useful for diabetic patients.
  • albumin this time, no saccharification-inhibitory effect was observed for rare sugars.
  • rare sugars are different from ordinary sugars. Rare sugars are not assimilated by the body or even if they are assimilated, and the effect of rare sugars on lipid metabolism is expected to suppress body fat accumulation.
  • the disclosure of the present invention is expected to enhance the added value as a functional food in addition to expectations for various pharmaceuticals. Industrial applicability
  • rare sugars in particular, D-allose and D-psicose are taken up or acted on by cells to change the cells, so that the rare sugars can be effectively used as substances having a bioactive effect. Is understood.

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Description

明
希少糖の生理活性作用の利用方法および希少糖を配合した組成物
技術分野
本発明は、 希少糖の生理活性作用の利用方法、 及び希少糖を有効成分 糸
として配合した組成物、 特に機能性食品、 医薬品または化粧品に関す る。 書
背景技術
単糖はポリヒドロキシルアルデヒド構造を持つアルドース、 ポリヒド ロキシルケトン構造を持つケトース、 およびそれらを還元して得られる 糖アルコールに大別される。 一方単糖は、 自然界における存在量によつ ても分類される。 即ち、 希少糖は国際希少糖学会の定義によれば 「自然 界に希にしか存在しない糖」 と定義されており、 自然界における存在量 が少ない単糖である。 希少糖は、 一般に有機化学的合成方法における合 成反応においては収量の少ないものが多い。 このため、 希少糖は未知の 性質のものが多く、 D-ァロースを含めたアルドへキソース （六炭糖のァ ルド一ス） の希少糖においても未知の性質が多いというのが現状であ る。
このアルドへキソースに属する希少糖としては、 D-ァロースの他に D-グロース、 D -イドース、 D-夕ロース、 D-アルトロース、 L-マンノー ス、 L -グルコース、 L-ガラクトース等が例示される。 また、 D-プシコ一 スを含めたケトへキソース （六炭糖のケトース） の希少糖においても同 様である。 ケトへキソースに属する希少糖としては、 D-プシコース、 L- プシコース、 D-ソルボース、 L-ソルボース、 D-夕ガトース、 L-夕ガト一 ス、 L-フラクト一ス等が例示される。
ここで、 従来、 糖類と癌との関係については、 例えば、 特許文献 1に 記載されているように、 癌の予防に有効である多糖類が知られている。 また、 オリゴ糖が整腸作用を持つことを利用して便秘を解消し大腸癌な になりにくい効果をもつことや、 最近ではァガリスクなどの多糖体が 癌抑制効果を持つことなどの報告、 糖鎖と癌転移関連の報告もある。 一方、 糖類の活性酸素に対する性質を利用したものでは、 例えば、 特 許文献 2に記載されているように、 活性酸素を抑制する性質を有する多 糖類を含有させた活性酸素抑制剤は知られている。
単糖類の中で、 プシコースはケトへキソース （六炭糖） である。 この プシコースには光学異性体として D体と L体とが有ることが知られてい る。 ここで、 D-プシコースは既知物質であるが自然界に希にしか存在し ないので、 国際希少糖学会の定義によれば 「希少糖」 と定義されている が、 この D -プシコースは、 近年、 ェピメラーゼの出現 （例えば、 特許 文献 3参照） により高価ではあるが、 比較的入手が容易となった。 そし て、 この公報に従えば、 調製された D-プシコースは、 甘味料、 醱酵用 炭素源、 試薬、 化粧品 ·医薬品の原料 · 中間体などとして有効に利用で きることが示唆されている。 この公報によれば、 この甘味料としては、 飲食物、 飼料、 歯磨き、 内服薬など経口摂取物の甘味付け嗜好性向上に 利用できる旨記載されているが、 可食配合物としての具体的な構成につ いては開示されていない。 D-プシコースの光学異性体である L-プシコ ースについては、 可食配合物として利用可能であることが、 例えば、 特 許文献 4で詳細に開示されている。
特許文献 1 特開平 5— 1 1 2 4 5 5号公報 特許文献 2 特開平 7— 2 8 5 8 7 1号公報
特許文献 3 特開平 6— 1 2 5 7 7 6号公報
特許文献 4 特開昭 5 7 - 1 2 9 6 7 1号公報
発明の開示
希少糖の生理活性に着目し、 細胞を用いる実験によりその裏付けをす ることは本発明者らによってはじめられた。 21世紀は生命科学の世紀 とも言われており、 現在、 国際的に DNA研究、 タンパク質研究が進めら れている。 ボストゲノム研究における糖と言えば糖鎖研究が中心である が、 本発明者らは 「単糖」 に着目し、 単糖に生理活性はないかという切 り口で研究を進めている。 本発明の背景としては、 希少糖の生産に関す る網羅的な研究が長年積み重ねられてき、 近年になり一部の希少糖の大 量生産技術が確立されたことが挙げられる。
本発明は、 希少糖について、 特に D-ァロース、 D-プシコースの生理 活性作用の利用方法の提供及び希少糖の生理活性を活用した機能性食 品、 医薬品等の創生を目的とする。 本発明は、 以下の（1)ないし（9)の希少糖の生理活性作用の利用方法を
( 1)生理活性作用感受性細胞に希少糖を作用させて当該細胞の機能を 変化させることを特徴とする希少糖の生理活性作用の利用方法。
(2)上記（1)の方法において、 前記細胞がヒト細胞であることを特徴と する方法。
(3)上記（1)または（2)の方法において、 前記希少糖として希少糖を有 効成分として配合した組成物を用いることを特徴とする方法。 (4)上記（3)の方法において、 前記組成物が機能性食品、 医薬品または 化粧品であることを特徴とする方法。
(5)上記（1)ないし（4)のいずれかの方法において、 前記希少糖がアル ド一スおよびノまたはケト一スに属する希少糖であるこ を特徴とする 方法。
(6)上記（5)の方法において、 前記アルド一スが D -ァロースであるこ とを特徴とする方法。
(7)上記（6)の方法において、 前記細胞が、 癌細胞増殖抑制作用感受性 細胞および活性酸素の産生抑制作用感受性細胞よりなる群より選ばれる ことを特徴とする方法。
(8)上記（5)の方法において、 前記ケ卜一スが D-プシコースであるこ とを特徴とする方法。
(9)上記（8)の方法において、 前記細胞が、 ケモカイン分泌抑制作用感 受性細胞、 マイクロダリァの遊走抑制作用感受性細胞および血糖降下作 用感受性細胞よりなる群より選ばれることを特徴とする方法。
本発明は、 以下の（10)ないし（17)の希少糖を有効成分として配合した 組成物を要旨としている。
(10)生理活性作用感受性細胞に影響して当該細胞の機能を変化させる 作用を有する希少糖を有効成分として配合した組成物。 -
(11)上記（10)の組成物において、 前記細胞がヒト細胞であることを特 徴とする組成物。
( 12)上記（10)または（1 1)の組成物において、 前記希少糖がアルドース および Zまたはケトースに属する希少糖であることを特徴とする組成 物。
(13)上記（12)の組成物において、 前記アルド一スが D-ァロースであ ることを特徴とする組成物。 (14)上記（13)の組成物において、 前記細胞が、 癌細胞増殖抑制作用感 受性細胞および活性酸素の産生抑制作用感受性細胞よりなる群より選ば れることを特徴とする組成物。
(15)上記（12)の組成物において、 前記ケトースが D-プシコースであ ることを特徴とする組成物。
(16)上記（15)の組成物において、 前記細胞が、 ケモカイン分泌抑制作 用感受性細胞、 マイクロダリァの遊走抑制作用感受性細胞および血糖降 下作用感受性細胞よりなる群より選ばれることを特徴とする組成物。
(Π)上記（10)ないし（16)のいずれかの組成物において、 前記組成物が 機能性食品、 医薬品または化粧品であることを特徴とする組成物。
図面の簡単な説明
図 1は、 本発明についての D-ァロースが、 肝臓癌細胞（HepG2)に対する増 殖抑制効果があることを示す図である。 図 2は、 本発明についての！)-ァロ ースが、 子宮癌細胞（Hela)に対する増殖抑制効果があることを示す図であ る。 図 3は、 本発明についての D-ァロースが、 卵巣癌細胞（0VCAR3)に対す る増殖抑制効果があることを示す図である。 図 4は、 本発明についての D- ァロースが、 皮膚角化細胞（HaCaT)に対する増殖抑制効果があることを示す 図である。 図 5は、 本発明についての D-ァロースが、 癌細胞増殖抑制に対 する濃度依存性を有することを示す図である。
図 6は、 実施例 3の希少糖による HL60の増殖抑制効果を示す図面であ る。 図 7は、 実施例 3の希少糖による Daudi細胞の増殖抑制効果を示す図面 である。 図 8は、 実施例 3の希少糖による THP1の増殖抑制効果を示す図面 である。 図 9は、 実施例 3の希少糖による KS1の増殖抑制効果を示す図面で ある。 図 10は、 実施例 3の希少糖による MT2の増殖抑制効果を示す図面で ある。 図 11は、 実施例 3の希少糖による KG1の増殖抑制効果を示す図面で める。
図 12は、 フローサイトメトリーによる D-ァロースの細胞周期への影響を 示す図面である。 図 13は、 白血球からの活性酸素産生の経時変化を示す図 である。 図 14は、 本発明についての D—ァロースが、 白血球の活性酸素の 産生の抑制に効果があることを示す図である。 図 15は、 各糖が、 白血球の 活性酸素産生が始まつた後での活性酸素抑制については効果がないことを示 す図である。
図 16は、 実施例 9の本発明についての D—ァロースが、 活性酸素産生抑 制に対する濃度依存性を有することを示す図である。'図 17は、 網膜虚血 · 再環流障害に対する D-ァロースの効果を示す図面である。 図 18は、 実施例 7の D-ァロースの皮弁虚血再環流障害軽減効果に関し、 生着面積 （％) の 全データを示す表である。 図 19は、 実施例 7の D-ァロースの皮弁虚血再環 流障害軽減効果に関し、 分散分析 （一元配置） を示す表である。 図 20は、 実施例 7の D-ァロースの皮弁虚血再環流障害軽減効果に関し、 平均値と標 準偏差を示す図である。 図 21は、 実施例 7の D-ァロースの皮弁虚血再環流 障害軽減効果に関し、 多重比較検定の結果を示す表である。
図 22は、 実施例 8のラット腎虚血再環流障害に及ぼす希少糖の効果に関 し、 ノーザンブロッテイングの結果を示す図面に代わる写真である。 図は CINC-1の mRNAの発現量を示すものである。 標準として GAPDH
(glyceraldehyde 3— phosphate dehydrogenase) の mRNAを取り、 これがほぼ 一定であることを確認した （写真上）。 その上で、 CINC- 1の mRNAの発現量を 比較した。 左から、 虚血前、 虚血後、 D -ァロース投与後虚血、 D-プシコース 投与後虚血での腎臓を示す。 CINC- 1 mRNAは虚血前には全く発現していない が、 虚血により発現し、 D-ァロースと D-プシコース投与により発現量が抑 えられていた。 図 23は、 実施例 9の希少糖による海馬神経細胞死の抑制効果を示す図面 である。 図 24は、 実施例 9の脳虚血に伴う神経細胞外へのグルタミン酸の 放出、 およびァロースによる放出抑制効果を示す図面である。 図 25は、 実 施例 9の脳虚血に伴う神経細胞外へのグルタミン酸の放出、 および 2-デォ キシグルコースによる放出抑制効果を示す図面である。
図 26は、 実施例 1 0で、 D-プシコースが M C P— 1の分泌抑制効果があ ることを示す図である。 図 27は、 実施例 1 0で、 D-プシコースが M C P— 1の分泌を刺激するサイトカインに作用して M C P— 1の分泌を抑制するこ とを示す図である。
図 28は、 実施例 1 1で、 D-プシコースがマイクログリアの出現数に与え る影響を示す図である。
図 29は、 実施例 1 2で、 D-プシコースがィンスリンの分泌刺激効果に与 える影響を示す図である。
図 30は、 実施例 1 2で使用される反転腸管の実験例を説明する図であ る。 図 31は、 実施例 1 2で、 D-プシコースが、 ブドウ糖の吸収に与える影 響を示す図である。 図 32は、 実施例 1 2で、 希少糖投与によるラット血糖 値に対する影響に関し、 麻酔下生理食塩水投与による血糖への影響を示す図 面である。
図 33は、 実施例 1 3の希少糖投与によるラット血糖値に対する影響に関 し、 麻酔下 D-グルコース投与による血糖への影響を示す図面である。 図 34 は、 実施例 1 3の希少糖投与によるラット血糖値に対する影響に関し、 D -プ シコース投与による血糖への影響を示す図面である。
図 35は、 実施例 1 4のケトースの高血糖状態改善効果に関し、 IVGTTで の血中 D-グルコース濃度への影響を示す図である。
図 36は、 実施例 1 5のケト一スの高血糖状態改善効果に関し、 インスリ ンの分泌動態を示す図である。 図 37は、 実施例 1 5のケトースの高血糖状 態改善効果に関し、 高血糖時における D-プシコースの作用を示す図であ る。 図 38は、 実施例 1 5の希少糖に高血糖下における糖化抑制効果がある か否かの検討に関し、 GA測定原理を説明する図である。 図 39は、 実施例 1 5の希少糖に高血糖下における糖化抑制効果があるか否かの検討に関し、 希 少糖によるダリケーシヨンの検討を示す図である。 図 40は、 実施例 1 5の 希少糖に高血糖下における糖化抑制効果があるか否かの検討に関し、 ダルコ ース共存下での希少糖によるグリケ一シヨンの検討を示す図である。
図 41は、 ィズモリング （Izmnoring) 連携図である。 図 42は、 図 4 1の 下段のィズモリング C 6の説明図である。 図 43は、 図 4 1の中断のィズモ
5の説明図である。
発明を実施するための最良の形態
「希少糖」 とは、 自然界に微量にしか存在しない単糖と定義づけるこ とができる。 本発明においても前記定義に基づく希少糖であり、 好まし くはアルドースである D-ァロース、 またはケトースである D-プシコ一 スである。 自然界に多量に存在する単糖は、 D -グルコース、 D-フラク卜 —ス、 D -ガラクトース、 D -マンノース、 D -リポース、 D -キシロース、 L - ァラビノースの 7種類あり、 それ以外の単糖は全て希少糖である。 ま た、 糖アルコールは単糖を還元してできるが、 自然界には])-ソルビト ールが比較的多いが、 それ以外のものは量的には少ないので、 これらも 本発明に従う希少糖と定義される。 これらの希少糖は、 これまで入手が 困難であつたが、 自然界に多量に存在する単糖から希少糖を生産する方 法が開発されつつあり、 その技術を利用して製造することができる。
以下、 これらの単糖の関係を一層容易に理解するために提案された I zumor in に基づき説明を加える。 図 41で示される生産過程と分子構造 （D型、 L型） により、 炭素数 4 から 6の単糖全てをつないだ連携図がィズモリング（I zmnor ing)の全体 図である。 すなわち、 図 41から理解できることは、 単糖は、 炭素数 4、 5、 6全てがつながつているということである。 全体図は、 ィズモリ ング C6の中でのつながりと、 ィズモリング C5の中でのつながりと、 ィ ズモリング C4の中でのつながりと、 C4、 C5、 C6が全てつながっている ことである。 この考え方は重要である。 炭素数を減少させるには主に発 酵法を用いる。 炭素数の異なる単糖全てをつなぐという大きな連携図で あることも特徴である。 また、 利用価値がないということも理解するこ とができる。
炭素数が 6つの単糖 （へキソース） のィズモリングは、 図 41の下段 および図 42に示すように、 炭素数が 6つの単糖 （へキソース） は全部 で 34種類あり、 アルドースが 16種類、 ケト一スが 8種類、 糖アルコー ルが 10種類ある。 これらの糖は、 酸化還元酵素の反応、 アルド一ス異 性化酵素の反応、 アルドース還元酵素の反応で変換できることは、 本発 明者らの研究を含めた研究で知られている。 しかしながら、 これまでの 研究では上のグループ、 真ん中のグループ、 下のグループは酵素反応で つながっていなかった。 つまり、 上のグループに属している ]) -ダルコ ース （ブドウ糖） や D-フラクトースは自然界に多量に存在する糖であ り安価であるが、 これらから希少糖を合成することができなかった。 と ころが、 本発明者らの研究の過程で、 これを結ぶ酵素が発見された。 そ れはガラクチトールから D 夕ガト一スを合成する酵素を持つ菌の培養 液中に、 全く予期しなかった D-ソルポースが発見されたことに端を発 する。 その原因を調べた結果、 この菌が D-夕ガトース 3ェピメラーゼ (DTE) という酵素を産生していることを発見した。 図 41の下段および図 42に示すように、 この DTEはこれまで切れてい た D -夕ガトースと D-ソルポースの間をつなぐ酵素であることがわか る。 そしてさらに驚くことに、 この DTEは全てのケトースの 3位をェピ 化する酵素であり、 これまで合成接続できなかった D-フラクトースと D -プシコース、 L -ソルポースと L-タガトース、 D -夕ガトースと D-ソル ポース、 L-プシコースと L-フラクト一ス、 に作用するという非常に幅 広い基質特異性を有するユニークな酵素であることが分かった。 この DTEの発見によって、 すべての単糖がリング状につながり、 単糖の知識 の構造化が完成し、 ィズモリング （Izumor ing) と名付けた。
この図 42をよく見てみると、 左側に L型、 右側に D型、 真ん中に DL 型があり、 しかもリングの中央 （星印） を中心として L型と D型が点対 称になっていることもわかる。 例えば、 D-グルコースと L-グルコース は、 中央の点を基準として点対称になっている。 しかもィズモリング (I zumor ing)の価値は、 全ての単糖の生産の設計図にもなつていること である。 先の例で、 D -グルコースを出発点として L -グルコースを生産 しょうと思えば、 D-グルコースを異性化→ェピ化→還元→酸化→ェピ化 —異性化すると L -グルコースが作れることを示している。
炭素数が 6つの単糖（へキソース）のィズモリング（Izumor ing)を使つ て、 自然界に多量に存在する糖と微量にしか存在しない希少糖との関係 が示されている。 D -グルコース、 D-フラクトース、 D -マンノースと、 牛 乳中の乳糖から生産できる D-ガラクトースは、 自然界に多く存在し、 それ以外のものは微量にしか存在しない希少糖と分類される。 DTEの発 見によって、 D-グルコースから ])-フラクトース、 D-プシコースを製造 し、 さらに D-ァロース、 ァリ トール、 D -タリ トールを製造することが できるようになった。
炭素数が 6つの単糖（へキソース）のィズモリング（I zumor ing)の意義 をまとめると、 生産過程と分子構造（D型、 L型）により、 すべての単糖 が構造的に整理され（知識の構造化）、 単糖の全体像が把握できること、 研究の効果的、 効率的なアプローチが選択できること、 最適な生産経路 が設計できること、 欠落部分について予見できること、 が挙げられる。 炭素数が 5つの単糖（ペントース）のィズモリングは、 図 41の中段お よび図 43に示すように、 炭素数 6のィズモリングょりも小さいリング である。 しかし、 C6のィズモリングと同じようにアルドース 8個、 ケ トース 4個および糖アルコール 4個全てを含むことに変わりは無く、 全 てが酵素反応で結ばれる。 異なる点は、 酸化還元反応、 異性化反応のみ でリング状に全てが連結できることである。 一方、 DTEを用いることに よって、 さらに効率のよい生産経路が設計できることがわかる。 炭素数 5のィズモリングの特徴は、 特に図 43から明らかなように、 炭素数 6 のィズモリングが点対象に全単糖が配置されているのに対し、 左右が対 象に配置されていることが大きな特徴である。 これら全ペントースは、 酵素反応により連結されていることから、 炭素数 6のィズモリングの場 合と全く同様に、 すべてのペントースが構造的に整理され（知識の構造 化）、 全体像が把握できること、 研究の効果的、 効率的なアプローチが 選択できること、 最適な生産経路が設計できること、 欠落部分について 予見できる意義を持っている。 炭素数が 4つの単糖（テトロース）のィズモリングは、 図 41の上段に 示すように、 テトロースの構造上の特性のため、 リングが完成しないと いう特徴がある。 炭素数 5のィズモリング上部半分の構造を持ってい る。 このリングの場合も、 炭素数 5, 6の場合と同様の酸化還元および 異性化反応によって連結されている。 DTEが炭素数 4のケトースに反応 しないため、 ケトース間の反応は現在のところ存在しない。 しかし、 新 規のェピメラーゼの存在が予測され、 この研究は現在研究途上である。 全体の配置は、 炭素数 5と同様に左右対称であり、 アルドース 4個、 ケ トース 2個および糖アルコール 3個全てを含んでいる。 すなわち炭素数 5, 6のィズモリングと同様の意義が存在する。 ィズモリング C6の D-グルコースは、 ィズモリング C5の D-ァラビト —ルおよびィズモリング C4のエリスリ トールとつながつている。 この 線は、 発酵法によって D -グルコースから D-ァラビトールおよびエリス リ トールを生産できることを示している。 すなわち、 ィズモリング C6, ィズモリング C5およびィズモリング C4は連結されている。 この連 結は、 炭素数の減少という主に発酵法による反応であり、 この ])-ァラ ビトールおよびエリスリ 卜一ルへの転換反応の二つ以外の発酵法による ィズモリング C6とィズモリング C5, C4との連結は可能である。 例えば D-グルコースから ]) -リポースの生産も可能である。 このように、 3つの ィズモリングにより全ての炭素数 4, 5, 6の単糖 （アルドース、 ケトー ス、 糖アルコール） が連結されたことで、 それぞれの単糖が全単糖の中 でその存在場所を明確に確認できる。
最も有名なキシリ トールは、 未利用資源の木質から生産できる D -キ シロースを還元することで容易に生産できることを明確に確認できる。 もしも特定の単糖が生物反応によって多量に得られた場合には、 それを 原料とした新たな単糖への変換の可能性が容易に見いだすことが可能で ある。 すなわち、 この全体像から全ての単糖の原料としての位置を確実 にっかむことができるため、 有用な利用法を設計することができる。 特 に廃棄物や副産物から単糖が得られた場合の利用方法を容易に推定でき るのである。 希少糖の生産分野ばかりではなく、 希少糖の持つ生理活性 を探索する研究においても有効性を発揮する。 例えば、 ある希少糖に生 理活性が判明したとき、 図 41で示される連携図の存在位置を確認す る。 そして構造の近い希少糖に関しての生理活性との比較、 あるいは、 構造的に鏡像関係にある希少糖の生理活性を検討することで、 生理活性 の機構を分子の構造から類推する助けになるであろう。 また、 希少糖の 生理機能を解析し、 ィズモリング上に性質を集積することにより、 これ まで単純な羅列的理解から、 単糖全体を、 「単糖の構造」、 「単糖の生産 法」、 および 「単糖の生理機能」 を包括的に理解することに大いに利用 できると期待される。 希少糖のうち、 現在大量生産ができている D-ァロースと D-プシコ一 スという二つの希少糖について説明する。
本発明で用いられる ])-ァロース （D-ァ口へキソ一ス） は、 アルド一 ス （アルドへキソース） に分類されるァロースの！）体であり、 融点が 178°Cの六炭糖 （C6H1 206) である。
そして、 この D-ァロースの製法としては、 D-ァロン酸ラクトンをナ トリウムアマルガムで還元する方法による製法や、 また、 シェイクヮッ ト ·ホセィン ·ブイヤン等による 「ジャーナル'ォブ 'ファーメンテーシ ヨン 'アンド'バイオエンジニアリング （Journal of Fermentat ion and B ioenginee r ing)」 第 85巻、 539乃至 541頁 （1998年） において記載さ れている、 L -ラムノース ·ィソメラ一ゼを用いて D-プシコースから合 成する製法がある。
さらに近年では、 特開 2002-17392号公報に記載されている。 D-プシ コースを含有する溶液に D-キシロース ·ィソメラーゼを作用させて、 D -プシコースから D-ァロースを生成する製法が発明されている。 本発明の例えば癌細胞増殖抑制物質に用いる D-ァロースは、 前記製 法、 或いはその他の製法のいずれによって得られたものでもよいが、 前 記特開 2002- 17392号公報に記載されている製法によれば、 大量生産が 期待されるため、 より容易に入手することができるようになることが期 待される。 しかし、 これまでの製造法は、 D-ァロースの分離回収に関し て完全に満足できるものではなく、 従って工業的製造をするには未だ不 経済な作業を必要としている。 D-ァロースを分離回収することに関する 従来技術の不利な点 「最もエネルギーの必要な過程」 を克服すること、 すなわち、 効率よく分離回収する方法を提供すること、 ならびに、 高純 度 D-ァロースの製造に関して技術的に実行可能な連続的製造法を提供 することを目的として、 D-ァロースの結晶化法による分別法とその大量 生産への応用について別途出願中である（特願平 2003-95828号）。 当該 高純度 D-ァロースの分離回収法は、 D-プシコースの一部分を D-アロー スに変換した酵素反応産物である例えば 35%D-プシコースと 15%D -ァ ロースの混合溶液から D-ァロースを回収するに際し、 D-アロースのェ 夕ノールおよび/またはメタノールに難溶性の性質を利用して！)-アロー スを結晶化させ、 該！) -アロースの結晶を分離することを特徴とする。 上記の方法において、 D-プシコースを酵素反応で D-ァロースに変換す る際に用いる酵素は 「L-ラムノースイソメラ一ゼ」 が例示される。 L -ラ ムノースイソメラーゼは、 上記 1998年の文献で発表された公知酵素で あり、 Pseudomonas stutzerii 由来の酵素を好ましいものとして例示さ れる。 菌株 Pseudomonas stutzerii LL172a は、 上記文献に記載された 公知菌であり、 香川大学農学部生物資源食糧化学科の何森健研究室に保 存されている。 財団法人発酵研究所から同一の Pseudomonas stutzerii は得られる。 Pseudomonas stutzerii IF0 3773, Pseudomonas
stutzerii IF0 13596 が同一の活性を持っていると思われる。 L-ラムノ —スイソメラーゼは各種の微生物から容易に入手が可能であり、 L-ラム ノースが存在する培養条件の時に、 誘導的に生産される。 通常、 L -ラム ノースィソメラーゼ産生能を有する微生物を培養して得ることができ る。 例えば、 L-ラムノースイソメラーゼは各種の微生物を L -ラムノ一 スを炭素源として培養すると、 L-ラムノースが誘導剤となって菌体内に 生産される。 酵素を大量に構成的に産生する変異株を用いることは、 L- ラムノースなどの高価な炭素源を必要としないので特に有利である。 得 られた培養菌体から L-ラムノースィソメラーゼを抽出したもの、 また は菌体そのものを用いる。 L-ラムノースイソメラ一ゼは、 使用目的に応 じて、 必ずしも高純度に精製されたものでなくてもよく、 粗酵素であつ ても用いることができる。 粗酵素の具体的例としては、 上記の L-ラム ノースイソメラ一ゼ産生能を有する微生物自体を、 また、 その培養物や 部分精製した培養物を用いることができる。 本発明では特定の固定化法 による固定化酵素または固定化菌体の形態で用いることにより、 送液圧 力が低く安定で長期間連続使用可能なリアクターを構築することができ る。
上記の高純度 D-ァロースを連続的に製造する方法によって、 D-ァロ ースの分離と同時に脱塩、 脱イオン、 そして濃縮、 結晶化が行え、 従 来、 すべて別々の工程で行っていた分離方法をワンステツプに統合処理 できる。 したがって、 短時間に大量の処理が可能である。 本発明で用いられる D-プシコースは、 希少糖に属するケトへキソー スに分類されるプシコースの D体であり六炭糖 （C6H1206) である。 こ のような D-プシコースは、 自然界から抽出されたもの、 化学的又はバ ィォ的な合成法により合成されたもの等を含めて、 どのような手段によ り入手してもよい。 比較的容易には、 例えば、 ェピメラーゼを用いた手 法 （特開平 6-125776号公報等参照） により調製されたものでもよい。 得られた D -プシコース液は、 必要により、 例えば、 除蛋白、 脱色、 脱 塩などの方法で精製され、 濃縮してシラップ状の D-プシコース製品を 採取することができ、 更に、 カラムクロマトグラフィーで分画、 精製す ることにより 9 9 %以上の高純度の標品も容易に得ることができる。 こ のような D-プシコースは単糖としてそのまま利用できるほか、 必要に 応じて各種の誘導体として用いることも期待される。 本発明において、 生理活性作用感受細胞とは希少糖を作用させて当該 細胞の機能を変化させることができる細胞をいい、 このような機能を備 えた細胞であれば特に限定されない。 希少糖は当該細胞に影響して当該 細胞の機能を変化させる。 希少糖の種類により生理活性作用が異なる が、 細胞を用いた予備実験によりその作用を予測することができ、 本実 験により確認することができる。 当該細胞としては、 好ましくはヒト細 胞であるが、 ヒト以外の細胞をも包含する。 細胞の形態は生体の臓器、 培養細胞のどちらでもよい。
生理活性作用感受細胞に希少糖を影響して当該細胞の機能を変化させ る作用を発揮させるためには、 細胞に希少糖を作用させることにより行 う。 本発明に用いられる希少糖は水溶性であり、 作用させる態様には制 限はない。 用途に応じて適宜な手段を採用して希少糖を作用させること ができる。
希少糖を有効成分とする物質の形態で用いて、 細胞に希少糖を作用さ せることが好ましい。 希少糖として希少糖を有効成分として配合した物 質はいかなる形態のものも包含する。 希少糖のうち、 アルドースとしてィズモリングにおいて D-フラクト ースから最も近い D-ァロースを、 ケトースとして D-プシコースを 2つ の代表的な希少糖としてとりあげその生理活性について説明する。 まず第 1に、 D-ァロースについての例を示す。
本発明者らは、 アルドースである希少糖が活性酸素の産生を抑制する 性質を有することを見いだした。 本発明は、 アルドースである希少糖を 有効成分とする活性酸素産生抑制剤を提供することができる。
すなわち、 D-ァロースが臓器の虚血障害を保護するというデータがあ る。 肝臓などの臓器の手術の際には、 必ず血流を一時的に止める。 その 結果、 臓器は虚血状態に陥る。 手術終了後、 再び血液を流すと、 この 時、 白血球から活性酸素が多量に産生され、 これが臓器障害を起こす一 つの大きな原因と考えられている。 本発明者らは、 希少糖を用いてラッ トで 90分間というかなり長い時間肝臓を虚血にし、 その後再還流して 3ヶ月後の生存率を調べた。 通常では 3割くらいしか生存しないもの が、 虚血前に D -ァロースを 0. 2g/kg還流しておくと、 生存率が約 7割 に増加した。 これを実証するために白血球を用いて様々な希少糖および 現在自然界に多量に存在する糖 （ブドウ糖など） を用いて、 白血球から の活性酸素の産生に対する効果を調べた。 白血球から活性酸素を産生さ せておき様々な糖を加えると、 D-ァロースのみが非常に強い活性酸素の 産生抑制効果を示した。 これが臓器保護の一つの要因であると考えられ る。
このような虚血に対する保護作用は小腸、 あるいは、 脳の神経細胞死 にも有効であることがわかった。 神経細胞は特に虚血に弱く、 海馬の神 経細胞は 5分間の虚血でも死滅することがわかっている。 ラットの脳を 用いて 5分間の虚血を起こすと、 海馬の神経細胞の 8割が死んでしまう が、 虚血の前に D-ァロースを含む溶液で還流しておくと 5分間の虚血 でも約 7割の生存が確認された。 D-プシコースではこの作用は認められ なかった。
さらに、 この虚血保護作用は、 網膜の虚血の保護作用があること、 皮 弁の生着率が著しく向上すること、 腎臓虚血保護作用があることを裏付 け、 脳神経細胞虚血保護作用がグルタミン酸分泌抑制によることがわか つた。 本発明者らは、 希少糖に属するアルドへキソース（六炭糖）が癌細胞の 増殖を抑制する性質を有することを見いだした。 本発明は、 希少糖に属 するアルドへキソースを有効成分とする癌細胞増殖抑制剤を提供するこ とができる。 すなわち、 ヒトがん由来の株化細胞を用いたがん細胞の増 殖に対する効果を調べた。 後述する実施例に結果を示しているが、 がん 細胞はシャーレに撒いておき、 十分な栄養と酸素を与えるとどんどん増 殖する。 ここに D-ァロ一スを添加すると増殖を非常に強力に押えると いう効果があることが分かった。 この効果は肝臓がんや皮膚がんの細胞 においても同様に認められた。 D -ァロースを有効成分とする癌細胞増殖 抑制剤は、 用法としては経口投与でもよく、 また、 静脈注射、 動脈注 射、 リンパ管内注射および疾患部位への直接投与でもよい。 また、 癌細 胞増殖抑制剤に有効成分として含有させるものは D-ァロースに限定さ れず、 癌細胞の増殖を抑制する効果 （癌細胞増殖抑制効果） を有する他 のアルドース希少糖も癌細胞増殖抑制剤の有効成分として含有させるこ とができる。
さらに D-ァロースの白血病細胞に対する影響について、 ある種の白 血病細胞の増殖を抑制することを確認し、 細胞増殖の抑制は細胞周期の G2-M期を延長するという D-ァロースの細胞周期への影響のメカニズム を解明した。 . 次に、 ケトへキソースの生理活性についての例を示す。
このような希少糖に属するケトへキソースは糖代謝に影響を及ぼさ ず、 ケモカイン抑制物質、 マイクログリア遊走抑制物質、 インスリン分 泌促進物質又は癌細胞増殖抑制物質として経口摂取、 腹腔内投与、 静脈 投与など種々の経路で使用することができる。 また、 病巣内或いは病巣 周辺に非経口的に投与することもできる。 この場合、 希少糖に属するケ トへキソースは単独で、 又は希少糖に属するケトへキソースの作用に悪 い影響を与えない添加物を添加したり、 誘導体としたり、 また、 他の物 質 （薬理活性成分） と併用して用いることもできる。
以下、 各用途に分けてこの発明の実施の形態を詳細に説明する。
本発明者等は希少糖に属するケトへキソースがケモカインの分泌を抑 制する性質を有することを見出した。 これにより、 希少糖に属するケト へキソースを有効成分とするケモカイン分泌抑制剤又は物質を提供する ことができる。
動脈硬化症に起因する死亡は、 死因の第一位である。 動脈硬化症の危 険因子としては、 糖尿病、 高脂血症、 高血圧などが指摘されている。 最 近の報告によれば、 これら危険因子と動脈硬化症発症の機序について、 分子レベルでの解析が進んでいる。 動脈硬化症発症の契機は、 単球の血 管壁への遊走および s cavenge r recep t orによるコレステロール蓄積と マクロファージの泡沫細胞化である。 その進展には種々のサイトカイン ゃケモカインの関与が示唆されている。 特にケモカイン（細胞遊走を起 こすサイ トカイン）の一つである MCP- 1 (monocyt e chemoat t rac t ant pro t e in- 1 )は動脈硬化巣の血管内皮細胞から分泌され単球の遊走に関 係する因子であり、 動脈硬化進展に重要な役割を演じている因子として 注目されている。
MCP- 1又は MCP- 1の受容体である CCR2をノックアウトしたマウスに おいては動脈硬化が起こりにくく、 MCP- 1が動脈硬化発症において中心 的な役割を持っていることが明らかになった。
MCP-1は、 IL- 113や TNFiという炎症性サイ トカインにより刺激されて 分泌される。 こうしたサイ トカインの産生を抑制する薬剤として、 pyrazolo t r i az in誘導体薬剤や ni t r ic oxide (NO)分泌誘発剤が知られて おり、 臓器保存に使用されている。
炎症性サイ トカイン ·ケモカイン産生抑制剤としてコハク酸メチルプ レドニゾロンナトリウム （薬効：副腎皮質ホルモン剤） も市販されてい る （例えば、 フアルマシア社、 富士製薬社、 ユーシービ一ジャパン社、 沢井製薬社）。 一方、 糖類又はその誘導体の動脈硬化治療剤としては、 血中コレステ ロール濃度を低下させるへキソースリン酸カルシウム（グルコースリン 酸カルシウムなど）が特開昭 63- 198630号公報で公表されている。
また、 コラ一ゲンの合成を抑制するビラノピラノン化合物が特開平 10-330268号公報で公表されている。
しかしながら、 希少糖に属するケトへキソース及ぴその誘導体による MCP-1分泌の抑制効果やこれを利用した動脈硬化抑制についてはまだ知 られていない。 本発明により、 希少糖に属するケトへキソースの MCP- 1分泌の抑制効 果を確認することにより希少糖に属するケトへキソースの動脈硬化にお ける有用性及び臨床応用への可能性を裏付けることができる。 以下の実 施例では、 第一に希少糖に属するケトへキソースの一つとしての D -プ シコースによる血管内皮細胞からの MCP-1分泌に対する影響について検 討する。 また、 血管内皮細胞からの MCP-1分泌を刺激するサイ ト力イン 存在下における D-プシコースの MCP-1分泌抑制効果についても検討す る。
これにより、 希少糖に属するケ卜へキソースは MCP-1の分泌を抑制す ることにより、 単独で、 又は他の物質（薬理活性成分）と併用して、 動脈 硬化症の予防又は治療に有効である可能性が示唆される。 また、 糖尿 病、 高脂血症、 高血圧などの予防物質、 治療物質として期待される。 ま た、 炎症性サイ ト力イン ·ケモカイン産生抑制物質、 副腎皮質ホルモン 剤ゃ抗炎症剤の代用物質としての利用が期待される。 更に、 臓器保存剤 としての適用も期待される。
D -プシコースはィンスリン分泌を促進する。 ィンスリンを分泌するラ ッ卜の塍臓 /3細胞株を用いた実験において、 生理的な分泌物質である D -グルコースの濃度を徐々に上げていくと、 濃度に依存してィンスリン の分泌が増えていく。 D -グルコースの濃度をゼロにしておき、 D-プシコ ースの濃度を上げていくと、 D-グルコースと同じように濃度依存性にィ ンスリンを分泌するという反応が見られた。 また、 D-グルコースを 11. 2πιΜ投与すると最大のィンスリン分泌となるが、 その状態でさらに D -プシコースを加えると D -グルコースと等濃度くらいまで加えた時さ らにィンスリン分泌が促進され、 D -グルコースでの最大分泌量と D -プ シコースでの最大分泌量を足した量のィンスリンが分泌された。 このように、 希少糖が生理活性を持つということが次々と分かってき た。 希少糖を細胞の外に投与した場合、 （1)輸送体を通って細胞の中に 入ってくる可能性、 （2)受容体に結合する可能性、 あるいは、 （3)細胞内 の代謝を希少糖が存在することで変える可能性、 などが考えられる。 そ れらいずれの経路でも、 恐らく情報は核に伝わり核の丽 Αの転写に変化 が起こり、 蛋白の発現に変化が生じ、 その結果、 細胞機能が変化するの ではないかと考えている。 D-プシコースのィンスリン分泌の例を見て も、 今まで知られているメカニズムと異なっている可能性が高い。 希少 糖の作用メカニズムについては、 これまでほとんど行われておらず、 そ のような場合においてメカニズムを探るためには、 希少糖を処理した細 胞あるいは臓器での情報経路を網羅的に解析する手法を取らなければな らないと考えている。
そこで、 本発明者らはさらに研究をすすめて、 インスリン分泌促進作 用について、 D-プシコースが血糖値を緩やかに押さえる作用を動物（ラ ット）で裏付け、 D-プシコースが高血糖時の血糖降下とィンスリン分泌 促進作用があること、 ならびに、 D-プシコースにより蛋白質の糖化がほ とんどおこらないことを確認した。 以上、 医薬品としての応用を例に示したが、 その他にも、 D-プシコ一 スでは動脈硬化の増悪因子であるケモカイン MCP- 1の血管内皮細胞から の分泌を抑制する効果に加え、 肝臓での脂肪の合成を抑制する効果があ ることもわかっており動脈硬化予防作用などにつながる可能性がある。 また血管新生に対する作用や免疫抑制作用など、 さまざまな生理活性効 果の可能性が出てきている。 また、 希少糖の用途としては医薬品以外の 可能性については、 食品、 飲料、 特に機能性食品（肥満予防など）、 化粧 品、 飼料、 農薬（植物成長調整剤、 植物病害抵抗性増幅剤など）が例示さ れる。
農薬の使用量を飛躍的に減少させる可能性のある、 植物に対して病害 抵抗性を増幅する作用の物質を提供することを目的として、 本発明者ら の別のグループは、 希少糖による植物病害抵抗性増幅剤の発明を別途出 願中である （特願平 2003- 95826号）。 希少糖を、 植物に対して病害抵抗 性を増幅する作用の物質として用いる場合の利点は、 （1)低濃度 （100 ii g/ml ) の希少糖水溶液が、 展着剤なしで、 抵抗性遺伝子を迅速に起動 し、 （2)希少糖は自然界に微量しか存在しないが、 「天然物」 であるた め、 安全性の高い散布剤であることが期待され、 （3)希少糖は病原菌に 対する作用は強い殺菌作用ではないので、 耐性菌の発生を考慮する必要 がなく、 （4)希少糖単独の剤としてのみならず、 殺菌剤との混合商品等と しての開発が期待される点が挙げられる。 食品、 飲料または化粧品、 あるいは飼料における配合量は特に制限さ れないが 0. 0 1〜 10重量％程度が好ましい。 医薬品の場合、 カプセルや 粉末、 錠剤などとして経口投与することができ、 水に溶けることから経 口投与以外に静脈注射、 筋肉注射などの投与方法を採用することが可能 である。 投与量は例えば糖尿病の症状の度合いや体重、 年齢、 性別など により異なるものであり、 使用に際して適当な量を症状に応じて決める ことが望ましい。 医薬品における配合量は特に制限はされないが、 体重 l kgあたり、 経口投与の場合 0. 01〜2, 000nig、 静脈注射投与の場合 0. 0 1〜1, OOOmg, 筋肉注射投与の場合 0. 01〜1, OOOmg程度が好ましい。 また本発明の希少糖は食品素材に微量に存在し、 安全性が高く、 大量 生産技術が開発されればコスト面でも利用価値は高いものである。 なお 急性経口毒性試験では 5， 000mg/kg以上であった。 本発明の機能性食品は、 特定の疾病などを予防 (肥満予防）する健康食 品、 予防医薬品の分野の利用に適している。 特定の疾病を予防する健康 食品においては、 必須成分である希少糖の他に、 任意的成分として、 通 常食品に添加されるビタミン類、 炭水化物、 色素、 香料など適宜配合す ることができる。 食品は液状または固形の任意の形態で食することがで きる。 ゼラチンなどで外包してカプセル化した軟カプセル剤として食す ることができる。 カプセルは、 例えば、 原料ゼラチンに水を加えて溶解 し、 これに可塑剤（グリセリン、 D-ソルビトールなど）を加えること（こよ り調製したゼラチン皮膜でつくられる。 本発明の薬剤においては、 有効成分である希少糖はそれ自体のみなら ずそれの薬剤として許容される塩として使用される。 該薬剤は、 希少糖 を単独で製剤として用いることができるほか、 製薬上使用できる担体も しくは希釈剤を加えた製剤組成物に加工したものを用いることもでき る。 このような製剤または薬剤組成物は、 経口または非経口の経路で投 与することができる。 例えば、 経口投与用の固体または流体（ゲルおよ び液体）の製剤または薬剤組成物は、 タブレッ ト、 カプセル、 錠剤、 丸 剤、 粉末、 顆粒もしくはゲル調製品の形態をとる。 製剤または薬剤組成 物の正確な投与量は、 その目的とする使用形態および処置時間により変 化するため、 担当の医師または獣医が適当であると考える量になる。 月艮 用および投与用量は製剤形態によって適宜調整できる。 錠剤などの経口 固形製剤、 経口液剤などとして 1 日服用量を 1回ないし数回に分けて服 用してもよい。 また、 例えばシロップやトローチ、 チユアブル錠などの 幼児頓服して、 局所で作用させるとともに内服による全身性作用をも発 揮させる製剤形態では 1日服用量の 1/2〜1/ 10を 1回量として配合し服 用すればよく、 この場合全服用量が 1 日量に満たなくてもよい。
逆に、 製剤形態からみて無理な服用容量とならなければ 1 日服用量に 相当する量を 1回分として配合してもよい。 製剤の調製にあたっては、 通常使用される充填剤、 増量剤、 結合剤、 崩壊剤、 表面活性剤、 滑沢 剤、 コーティング剤、 徐放化剤など、 希釈剤や賦形剤を用いることがで きる。 この他、 必要に応じて溶解補助剤、 緩衝剤、 保存剤、 可溶化剤、 張化剤、 乳化剤、 懸濁化剤、 分散剤、 増粘剤、 ゲル化剤、 硬化剤、 吸 収剤、 粘着剤、 弾性剤、 可塑剤、 吸着剤、 香料、 着色剤、 矯味剤、 抗酸 化剤、 保湿剤、 遮光剤、 光沢剤、 帯電防止剤などを使用することができ る。 本発明は、 希少糖の抗炎症作用を利用する皮膚外用剤、 すなわち治療 薬、 皮膚外用剤、 化粧料等が知られている肌荒れ、 荒れ性に対して改 善 ·予防効果を有する皮膚外用剤を提供することができる。 本発明の皮 膚外用剤には、 希少糖を必須成分とし、 それ以外に、 通常化粧品や医薬 品等の皮膚外用剤に用いられる成分、 例えば水性成分、 油性成分、 粉末 成分、 アルコール類、 保湿剤、 増粘剤、 紫外線吸収剤、 美白剤、 防腐 剤、 酸化防止剤、 界面活性剤、 香料、 色剤、 各種皮膚栄養剤等を必要に 応じて適宜配合することができる。 その他、 ェデト酸ニナトリウム、 ェ デト酸三ナトリウム、 クェン酸ナトリウム、 ポリリン酸ナトリウム、 メ タリン酸ナトリウム、 ダルコン酸等の金属封鎖剤、 カフェイン、 タン二 ン、 ベラバミル、 甘草抽出物、 グラブリジン、 カリンの果実の熱水抽出 物、 各種生薬、 酢酸トコフエロール、 グリチルリチン酸、 トラネキサム 酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、 ビタミン C、 ァスコルビン 酸リン酸マグネシウム、 ァスコルビン酸クルコシド、 アルプチン、 コゥ ジ酸、 D -グルコース、 D-フルクトース、 トレハロース等の糖類なども適 宜配合することができる。 本発明の皮膚外用剤は、 例えば軟膏、 クリー ム、 乳液、 ローション、 パック、 浴用剤等、 従来の皮膚外用剤に用いら れる形態であればいずれでもよく、 剤型は特に問わない。 以下、 本発明の詳細を実施例に基づき説明するが、 本発明はこれらの 実施例により何ら限定されない。
実施例 1
(希少糖の培養細胞増殖に及ぼす影響）
以下の条件により、 各種の希少糖を培養液中に 50mMの濃度で添加し て、 各希少糖が株化癌細胞の増殖進行に及ぼす影響を調べた。
( 1) 添加対象細胞：肝臓癌細胞（HepG2)、 子宮癌細胞（He l a)、 卵巣癌 細胞（0VCAR3)、 皮膚角化細胞（HaCaT)を、 添加する対象細胞とした。
(2) 添加した希少糖： D-ァロースの他に、 比較する他の糖として、 グ ルコース、 及びケトース希少糖の D-アルトロースを各添加対象細胞に 添加した。 また、 コントロールとしては、 D -フルクトースを採用した。
(3) 実験方法： 96穴のマルチウエルプラスティックディッシュ（ゥェ ル）に各添加対象細胞を 3， 000〜5, 000個撒き、 細胞種により 5〜10 %の Fe t a l Bov ine Se rum (FBS)を添加した媒体で 4〜5 日間培養した。 D-ァロ ース、 D -グルコース、 D-アルト口一スを、 各々 50mMの濃度で各添加対 象細胞に添加した。 コントロールとしての！)-フルクト一スを、 前記同 様に 50mMの濃度で添加した。 細胞増殖に及ぼす影響を調べるため、 24 時間毎に下記の MTT法により細胞数を確認した。
<MTT法〉
①試薬の調製： MTT (t e t razo l i um s a l t)の所定量をォートクレープで 滅菌した PBS (-)で溶解し、 濾過滅菌し MTT溶液を得る。 酸性溶液とし ては、 SDSの所定量（20g)に N, N -ジメチルホルムアミ ドの 50mL及び水を 加えて l OOmLとし、 1Nの塩酸約 200mLを加えて PH4. 7に調整する。 室 温で保存して使用前に 37°Cとする。
②試験方法：細胞を TEPで処理し、 細胞浮遊液を調製する。 その細胞 浮遊液を所定数（300〜52000細胞/ゥエル）、 各ゥエルに分注する（96ゥ エルプレート：培地 0. lmL 薬剤としての糖を所定量添加し、 炭酸ガス ィンキュベータ一で一昼夜前培養する。 上述の MTT液 0. 5mg/mLを添加 し、 炭酸ガスインキュベーター内で 4時間培養後、 培地を完全に取り除 く。 さらに、 37°Cに保たれた室内で酸性溶液を 0. lniL/ゥエルの量で加 え、 マイクロプレートミキサーに載せ、 で 20分間振動させながら 溶解させる（formazanを酸性溶液で溶解させる）。 分光光度計を用い て、 570〜600nmの波長で吸光度を測定する。 着色物質（formaz an)酸性 溶液で溶解させた後、 そのままプレートリーダで吸光度を測定できる。
(4) 実験結果：①肝臓癌細胞 (HepG2)…肝臓癌細胞 (HepG2)の細胞数の 経時変化を図 1に示す。 図 1により、 D -アロースが HepG2細胞の増殖を 強く抑制したことがわかる。 D-アルトロースにも抑制作用が認められた が、 D-ァロースと比し癌細胞増殖抑制効果は弱いものであった。 ダルコ 一スにはほとんど抑制効果が認められなかった。
②子宮癌細胞（He l a)…子宮癌細胞（He l a)の細胞数の経時変化を図 2に 示す。 D -ァロースは H e 1 a細胞の増殖を強く抑制したことがわかる。
③卵巣癌細胞 (0VCAR3)…卵巣癌細胞 (0VCAR3)の細胞数の経時変化を図 3に示す。 D-ァロースは 0VCAR3細胞の増殖を強く抑制したことがわか る。 D-アルトロースにも抑制作用が認められたが、 D-ァロースと比し癌 細胞増殖抑制効果は弱いものであった。 グルコースは癌細胞の増殖に対 して促進的に働いた。
④皮膚角化細胞 (HaCaT)…皮膚角化細胞 (HaCaT)の細胞数の経時変化を 図 4に示す。 D-ァロースは HaCaT細胞の増殖を強く抑制したことがわか る。 他の希少糖では D-アルトロースに中等度の抑制効果が認められた が、 D-ァロースと比し癌細胞増殖抑制効果は弱いものであった。 図 1〜 図 4より、 D-ァロースの癌細胞増殖抑制効果は、 細胞種により強さが異 なっていることがわかる。 アルド一ス希少糖としての D-ァロースには 癌細胞の増殖を抑制する効果があり、 制癌剤としての有効利用が期待さ れた。 さらに、 D-ァロースと比しケト一ス希少糖の D-アルトロースの 癌細胞増殖抑制効果は弱いものであったことから、 D-ァロースだけでな く他のアルドース希少糖も制癌剤としての有効利用が期待できる。 実施例 2
(D-ァロースの癌細胞増殖抑制効果の濃度依存性）
実施例 2として、 D-ァロースの癌細胞増殖抑制効果の濃度依存性を調 ベた。
(1) 実験方法：添加対象細胞として、 卵巣癌細胞（0VCAR3)を選択し、 D -ァロース濃度を lmM、 5mM、 10mM、 20mM、 50mM、 l OOmMとして添加し た。 卵巣癌細胞（0VCAR3)の培養方法、 細胞数の計測方法（MTT法）等の実 験条件は前記実施例 1と同様である。
(2) 実験結果：各濃度の D-アロースを添加した卵巣癌細胞（0VCAR3) の細胞数の経時変化を図 5に示す。 癌細胞増殖抑制効果は l OmMで認め られ始め、 20mM、 50mM、 l OOmMと次第に強くなつた。 すなわち、 D-ァロ ースの抑制効果には濃度依存性が認められた。 抑制効果が見られる濃度 は本実施例 2の実験条件（10 %胎仔血清）では l OmMであったが、 この有 効濃度は他の細胞においても同じであった。 さらに、 D-ァロースを投与 した細胞を顕微鏡で見ると、 死んだ細胞はほとんどなく、 このことはト リパンブルー色素排泄試験でも確かめられた。 本実験結果からは、 D-ァ ロースは細胞増殖を抑制するものの、 細胞を殺す働きはないと考えられ る。 実施例 3
(希少糖の血液系の癌細胞株の増殖への影響）
この実施例は、 希少糖に属するアルドースを有効成分とする癌細胞増殖抑 制物質に関する。 各種の抗腫瘍薬 ·制ガン剤が知られているが、 一般的にそ の副作用が問題となっている。 また、 現在では疾患の治療にターゲットを置 いた薬剤より、 むしろその予防に夕ーゲッ卜を置いた薬剤又は食品（機能性 食品）に対する意識や期待が高まっている。 糖と癌との関係では、 オリゴ糖 が整腸作用を持つことを利用して便秘を解消し大腸癌などになりにくい効果 を有することや、 最近ではァガリクスなどの多糖体が癌抑制効果を持つこと などの報告、 糖鎖と癌転移などの関連の報告などはあるが、 単糖そのものが 癌細胞増殖抑制効果を持つことについてはほとんど報告がない。 本実施例で は、 希少糖に属するアルド一スゃケトースの各種の株化癌細胞に対する増殖 の影響を検討した。 これにより、 希少糖に属するアルド一スが株化癌細胞の 増殖抑制が確認された。 糖代謝に影響を及ぼさない希少糖に属するアルドー スが株化癌細胞の増殖を抑制させる効果が確認されたことは、 副作用の少な い癌の治療剤、 予防剤、 増殖抑制剤として期待される。 また、 希少糖に属す るアルドースは機能性食品としての付加価値が高まることが期待される。 な お、 希少糖に属するアルドースとしては D-ァロースが最も有効であった。
(1) 目的：希少糖による細胞株の増殖抑制効果を比較検討する。
(2) 方法： Myeloid (HL- 60, THP-1, KG - 1)、 T - eel 1 (MT- 2)、 B- cell (Daudi, KS- 1)の合計 6株、 希少糖 3種（D- psicose, D-altrose, D- allose)を使用した。 培養液と各細胞を 1 x 105個、 計 lmlになるように し、 4日目と 7日目の細胞数をコール夕一カウンターでカウントした。 糖はそれぞれ 0.05、 0.5、 5、 50 で添加し、 コントロールには D- glucoseを用レ た。
培地； FBS10%添加 RPMI 1460 .
培養条件； 37°C, 5%C02
培養容器； FALCON, MULTIWELL, 12well 培養日数； 7 日間
糖濃度； 0.05、 0.5、 5、 50mM
(3) 結果 （図 6〜図 11) ： 6株の細胞のうち、 HL60と Daudi細胞にお いて効果が認められたが、 他の細胞においては明らかな影響は認められ なかった。
1) 図 6に示すように、 psicoseと alloseで抑制が見られたが、 alt roseでは見られなかった。
① allose; 糖濃度が高くなる程、 7 日目の細胞増殖抑制は強くなる傾 向にあった。 0.05mM; 62.6¾, 0.5mM; 67.7%, 5mM; 41.5%, 50mM;
30.7%, (glucoseを 100%とする)
② psicose; 細胞増殖抑制は、 糖濃度には関わりなく、 ほぼ一定であ つた。 0.05mM; 84.7%, 0.5mM; 80.7% 5mM; 84.2%, 50mM; 93.6%, (glucoseを 100%とする）
2) 図 7に示すように、 alloseで抑制が見られたが、 psicoseと altroseでは認められなかった。
① allose; 糖濃度が大きくなる程、 7日目の細胞増殖抑制は大きくな る傾向にあった。 0.05mM; 85.9%, 0.5mM; 80.6% 5mM; 62.2%, 50mM; 3.9%, (glucoseを 100%とする）
3) 図 8および図 9に示すように、 allose 50mMで細胞増殖抑制が見ら れたが、 他の糖、 濃度でははつきりとした抑制は見られなかった。
4) 図 10および図 11に示すように、 コントロールを含め、 すべての 糖および濃度で抑制が見られたため、 糖そのものにこれら細胞にたいす る非特異的な影響があることが想定された。
以上より、 D- alloseは、 HL60, Daudi, KS1, KG1の 4種類の細胞にお いて抑制効果が認められ、 使用した希少糖の中で最も抑制効果が高かつ た。 D- alloseの効果には細胞の種類により差があることが確認され た。 実施例 4
(D-ァロースの細胞周期に及ぼす影響）
(1) 目的：様々な糖を試した中で、 D-ァロースのみがミリ M濃度で癌 細胞の増殖を抑えた。 作用メカニズムは未だ不明だが、 そのために、 D- ァロースが細胞周期に及ぼす影響を調べることとした。
(2) 方法： フローサイトメーターによる解析を行った。 使用した細胞 は、 0VCAR- 3 (卵巣癌）細胞である。
1)細胞をトリプシンで処理し、 細胞浮遊液を調製する。
2)直径 100mmの plastic tissueに細胞を撒き、 C02 インキュベータ 一で 24時間培養する （overnight)。
3)希少糖（D-ァロース 50mM)を添加と無添加 （control として D -ダル コース）して、 3 日間培養する。
4)分離した細胞を PBS ( ）で 2回洗浄する。
5)遠心後 PBS (-) 3mlを加えピぺッティングにより撹拌する。
6) 7ml 100% ethanolを加える、 4°Cで、 2h固定する。
7) 1500rpm, 5min遠心する。
8) Cold PBS (-)で 2回洗浄する。
9)遠心後， RNase200ug/mlを加える、 37°Cで 30分インキュベーショ ンする。
10) 0.5mlPI (propidium iodide) を加える、 15分インキュベーショ ンする。
11)フローサイ トメ一夕一で測定する。
(3) 結果： D -ァロースを添加した細胞は細胞周期において G2— M期の 細胞の割合が 22.6%であり、 コン卜ロールでの細胞の割合 12.6%に比 ベて有意に多かった（図 12)。
(4) 考察： 1)希少糖はこれまでほとんど研究されていないため、 その 生理機能もほとんど知られていないのが現状である。 そのなか D-ァロ —スは癌細胞の増殖を抑制効果があることは、 今まで全く知られていな い新規な働きである。 2)そのメカニズムについてはまだ明らかでない が、 今回の解析によって、 細胞周期 G2期を遅延させる効果があること がわかった。 実施例 5
(希少糖の白血球からの活性酸素の産生に対する影響）
以下の条件により、 各種の希少糖の白血球からの活性酸素の産生に対 する影響を調べた。 ここでは白血球からの活性酸素産生に対する作用 . を、 L012化学発光により調べた。
(1) 添加対象白血球： ラット白血球 （顆粒球） を用いた。
(2) 添加した希少糖： アルドース希少糖としての D-ァロースの他 に、 比較する他の希少糖として、 ケトース希少糖の D-プシコースと D - アルトロースを、 ポリオールの ]) -タリ トールを用いた。 さらに、 自然 界に多量存在する糖として D -グルコースと D-フラクトースを使用し た。
(3) 実験方法：①ラット白血球からの活性酸素産生の経時変化…ラッ ト白血球 （顆粒球） に zymosan粒子を添加することにより起こる活性酸 素産生の時間経過を調べた。 さらに、 各希少糖の存在化における活性酸 素産生の時間経過も調べた。
②活性酸素産生に希少糖が及ぼす影響…白血球からの活性酸素産生系 に対して、 さまざまな糖を添加して産生量を測定した。 添加した糖の濃 度はそれぞれ 10mMを使用した。 また、 糖を添加しない条件下でも測定 を行った。
③希少糖の活性酸素産生に対する作用…白血球において zymosan添加 し貪食が始まり活性酸素産生が始まった後にそれぞれ lOmMの濃度の各 希少糖を添加した。
④ D-ァロースの活性酸素産生抑制効果の濃度依存性… D-ァロースの活 性酸素産生抑制効果の濃度依存性を調べた。 D-ァロース濃度を 0 、 5mM、 10mMとして添加した。
(4) 実験結果：①ラット白血球からの活性酸素産生の経時変化…ラッ ト白血球（顆粒球）に zymos an粒子を添加することにより起こる活性酸素 産生の時間経過を調べた結果を図 13に示す。 活性酸素産生は、 2〜3分 で極大になりその後は随時減少することが判明した。 また、 この結果 は、 希少糖存在下でも変化しなかった。
②活性酸素産生に希少糖が及ぼす影響…各糖を添加して産生量を測定 した結果を図 14に示す。 活性酸素産生は、 D-ァロースのみにより抑制 された（n =4)。 グルコースをはじめ、 他の希少糖（D-プシコース、 D -ァ ルトロース、 D -タリ トール）では全く抑制が認められなかった。
③希少糖の活性酸素産生に対する作用…活性酸素産生が始まった後に 希少糖を添加したときの実験結果を図 15に示す。 白血球において zymosan添加し貪食が始まり活性酸素産生が始まった後に希少糖を 10mM の濃度添加した場合には、 D-ァロースにおいて抑制効果がみられた。 本 実施例 5により、 活性酸素の産生の時間的経過は希少糖の存在に拘わら ず同じであることが判明した。 また、 調べた希少糖の中では、 D -アロー スに特異的に、 活性酸素の産生を抑制する効果（活性酸素産生抑制効果） があることが判明した。
④ D-ァロースの各濃度における活性酸素抑制効果の実験結果を図 16 に示す。 この結果、 この系においては 5mMでは作用が現れず、 10mMに なって初めて 50 %以上の抑制効果が現れることが判明し、 D-ァロース の有効濃度は l OmM近辺にあることが判明した。 また、 本実施例 10およ び前記実施例 5により、 D-ァロースには活性酸素の産生を抑制する作用 があることが判明した。 他のアルドースについてもこの作用があること も予想され、 今後の課題として調べていかなければならない。
この活性酸素産生抑制効果は幅広い活性酸素が関連する病態 ·疾患に 対して、 有効であり、 今後、 治療薬、 機能性食品、 外用剤などとしての 応用の可能性があると思われる。 例えば、 脳神経系疾患 (一過性脳虚血 発作、 脳卒中、 パーキンソン症候群、 外傷性てんかん、 脊髄損傷等）、 心血管系病変（動脈硬化症、 虚血性心筋傷害等）、 呼吸器疾患 [Adu l t re sp i rat ory d i s t res s synd rome (ARDS)、 間質性肺炎、 肺線維症、 ウイ ルス性肺炎等)、 消化器疾患（胃粘膜病変、 肝の虚血，再循環障害、 黄疸 病態、 膝炎等）、 腎疾患（糸球体腎炎、 急性腎不全、 慢性腎不全、 尿毒症 等）、 糖尿病、 癌、 眼科疾患（網膜変性、 未熟児網膜症、 白内障、 眼炎 症、 角膜疾患等）、 皮膚疾患（アトピー性皮膚炎、 しみ、 そばかす、 色素 沈着、 皮膚の老化等）、 膠原病等のための治療薬への応用や、 その他の 用途としても 臓器保存剤、 各種臓器幹細胞保存剤、 精子 ·卵子保存剤 としても応用の可能性がある。 また、 本実施の形態では、 アルドース希 少糖として、 D-ァロースを用いているが、 活性酸素産生抑制効果を有す る他のアルドース希少糖も前記のような用途への応用の可能性がある。 実施例 6
(網膜虚血 ·再還流障害に対する希少糖の効果）
( 1) 目的：一過性眼虚血モデル （ラット） に対して！)-ァロースの網 膜に対する影響を検討する。
(2) 方法：一過性眼虚血モデルは眼圧を 120 mmHg程度まで上昇させ ることにより作製した。 45分間の虚血を行い、 その後再還流を行つ た。 マイクロダイァリ一シス法により虚血再還流時に放出されるグルタ ミン酸濃度を測定した。
(3) 結果： 図 17に示すように、 D-アロースを虚血前に静脈内投与 ( 200mg/kg体重） することにより、 虚血時のグルタミン酸濃度はコン トロール （D-ァロース非投与） に比べ抑制され、 また再還流時には完全 に抑制された。
(4) 考察：網膜の虚血 ·再還流障害においては、 海馬の神経細胞のそ れと同様に、 多量のグルタミン酸の放出による神経毒性があることが指 摘されている。 D-ァロースがグルタミン酸の放出を抑制することは D - ァロースが網膜神経保護効果を有する可能性を強く示唆している。 実施例 7
(希少糖（D-ァロース）の皮弁虚血再灌流障害軽減効果に関する実験〕 (1) 目的：本発明者らはこれまでの基礎研究で、 島状皮弁の虚血再灌 流後の皮弁壊死および乱走皮弁遠位部の壊死メカニズムの解明に取り組 んできた。 その結果、 島状皮弁の虚血再灌流後の壊死および乱走皮弁遠 位部の壊死に活性酸素が関与していることを明らかにした。 また、 島状 皮弁の虚血再灌流後の壊死および乱走皮弁遠位部の壊死には、 血腫や炎 症により産生される活性酸素の関与することも示唆されている。 本実施 例 7は、 希少糖の活性酸素産生抑制作用の基礎的データを得ることを第 一の目的とし、 島状皮弁および乱走皮弁の壊死を効果的に予防するため の臨床応用を第二の目的とする。 さらに、 遊離皮弁、 切断肢の長期保存 における保存液としての応用および血行再開後の再灌流障害予防法を開 発することを第三の目的とする。 （2) 実験方法： 1)ウィスター系ラット (σ 7〜8週、 300g弱）にペントバルビタール（ネンブタール）を腹腔内 投与して麻酔をする。 2) バリカンで腹部全体を剃毛する。 3) 左大腿動 静脈を血管茎とする 3 X 5 cmの島状皮弁を左腹部に作成する。 4) 挙上し た皮弁は、 4-0ナイロン糸を用いて元の位置に縫合する 5) 薬剤（いずれ も 0. 6ml)を右大腿静脈よりワンショットで静注する。 投与する薬剤 は、 各種濃度の D-ァロース、 グルコース（0. 2mg/g)、 生理食塩水。
6) 薬剤を投与して 15分間待った後、 血管茎を動静脈ともクランプす る。 クランプには、 バスキュラークリップ（静脈用 60g)を 2個使用し た。
7) レーザードップラー血流計を用いて、 血行が完全に遮断されたこ とを確認する。
8) 8時間後、 クランプを外す。 同様に、 レーザ一ドップラー血流計 を用いて血行が再開したことを確認する。
9) 1週間後に、 皮弁の生死を判定する。
10) デジタルカメラで撮影後コンピューターに取り込み、 生着面積 (%)を面積計算ソフ卜で計算する。
(3) 実験群：下記の 6群：各群いずれも n= 15
1) D-ァロース 150mg (0. 5 mg/g)
2) D -アロース 60mg (0. 2 mg/g)
3) D-ァロース 30mg (0. 1 mg/g)
4) D-ァロース 15mg (0. 05mg/g)
5) D-グルコース 60mg (0. 2 mg/g)
6) 生理食塩水（コントロール）
(4) 結果（図 17〜20) ：生着面積は）の全データを図 18に、 分散分析 (一元配置） の結果を図 19に、 平均値と標準偏差を図 20に、 多重比較 検定 （F i sher ' s PLSD) の結果を図 21に示す。 多重比較検定は、 pく 0. 05で有意差ありと判定した。
30mg (0. 1 mg/g)以上 D-ァロースを投与した 1) 2) 3)の 3群は、 生食投 与群 6)に対してともに統計的有意差を認める。 さらに、 1) 2)の 2群は グルコース投与群 5)に対しても統計的有意差を認める。 しかし、 D-ァ ロースを l g (0. 05mg/g)投与した 4)は、 生食投与群 6)やグルコース投 与群 5)に対して統計的有意差を認めない。 また、 グルコース投与群 5) は生食投与群 6)に対して統計的有意差を認めない。 したがって、 D -ァ ロースは D-グルコースと異なり皮弁生着面積の延長効果があり、 その 効果発現には 30mg (0. 1 mg/g)以上の投与が必要であるといえる。
(5) 考察：上記の実験により D -ァロースに皮弁虚血再灌流障害軽減 効果があることが証明された。 この機序がいかなる作用によるものなの かを検証する必要がある。 われわれは D-ァロースが抗酸化作用を持つ のではないかと考えている。 この証明のためには、 各種酸化ストレスの 指標を測定する必要がある。 まず、 皮弁組織中の過酸化脂質を TBA (チ ォバルビタール） 法により経時的に測定すること、 4- hydroxy - 2- nonea l-mod i f i ed pro t e in (HNEによる免疫染色から測定） や白血球数 ( HE標本から測定） などの他のパラメ一夕一も測定することが必要が ある。
作用機序の概要が分かることにより、 どのタイミングで投与するのが 最も効果的なのかを検討することが可能である。 現在は皮弁挙上直後 (皮弁の血管茎をクランプする 15分前）に経静脈的に全身投与している が、 血管茎のクランプを解除する直前に全身または局所投与してみる実 験を続けるべきと考えている。 また、 至適投与量についても再検討し、 至適投与量 ·最も効果的な投与方法（夕イミング）が判明したところで、 既存の抗酸化剤（S0D、 ァロプリノールなど）と効果を比較してみること が必要であると考えている。 今後の展望として、 皮弁保護作用のある注 射薬または軟膏の開発につながると考えている。 効果的な皮弁壊死予防 薬が開発されれば、 皮弁による手術成績が飛躍的に向上する。 また、 切 断肢の保存が可能になれば、 緊急手術で再接着術を行う必要はなくな り、 待機手術として定時に行うことができるようになる。
(6) 参考文献： 1) Ashoori F, Suzuki S, et al： Involvement of lipid peroxidation in necrosis of skin flaps and its suppression by ellagic acid. Plast Reconstr Surg, 94 : 1027-1037, 1994.
2) Um SC, Suzuki S, et al： Format ion of 4 - hydroxy 2- noneal- modified proteins and 3- nit ro-L- tyrosine in rat island skin flaps during and after ischemia. Ann Plast Surg, 42： 293-298, 1999.
3)佐藤美樹， 鈴木茂彦， 宗内巌：皮弁虚血再灌流障害時における組織 内 Galectin- 9の発現変化. 日本形成外科学会会誌， 22 : 428-433, 2002.
4) Yagi K： A simple f luorometric assay for lipid peroxide in blood plasma. Bioc em Med, 15： 212-216, 1976.
5) O kawa H, Ohishi S, Yagi K： Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbi turic acid react ion. Anal Biochem, 95： 351-358, 1979. 実施例 8
(ラット腎虚血再灌流障害に及ぼす希少糖の効果）
(1) 目的： ショックや腎虚血を伴う手術時などで、 急性腎不全は生命 予後に悪影響を及ぼす重篤な合併症の一つである。 そこで、 今まで腎虚 血性障害に対しては ischemic precondi t ioningや各種薬物の有効性が 検討されている。 今回はラット腎虚血再灌流障害モデルを使用して腎虚 血性障害に及ぼす希少糖の効果を検討した。
(2) 方法：
対象…体重 300g前後の雄性ラット。
実験方法…ラットをネンブタールで麻酔後に腎虚血モデルを作製。 腎虚血…右腎摘出後、 左腎血管を 45分間クランプすることで作 製。
使用薬剤… D-アロース、 D-プシコース（ともに 400mg/kg)腎虚血 30 分前に静脈内投与する。
測定項目…障害性因子である cyt okine- induced neu t rophi l chemoat t rac t ant (CINC) -l mRNA (再灌流 2時間後）の発現に及ぼす影
(3) 結果 （図 22) ： ノーザンブロッテイダの結果を図 22に示す。 再 灌流 2時間後の CINC-lmRNAの発現量はァロース、 プシコースともに減 少しているように思われる。
(4) 考察：本実施例 8では、 たった 1回の予備実験の結果であるの で、 今後回数を重ねて、 必要濃度などの効果の検討を行う必要がある。 CINC-lmRNAの発現量だけでなく、 CINC- 1蛋白に及ぼす影響も検討しな ければならないと考えている。 腎虚血性障害に対する希少糖の有効性が 立証できれば、 ショック、 腎虚血を伴う手術時など新しい治療薬および 輸液製剤の開発として有望であると考えている。 実施例 9
(希少糖の脳虚血保護作用の研究）
(1) 目的 ：一過性の脳虚血に伴い、 海馬の神経細胞が死にいたること が知られている。 この原因は明らかではないが、 いくつかの可能性があ る仮説が提案されており、 現在、 多くの研究者がこれらの仮説の証明を 行っている。 我々もこのモデルを用いて研究を行っているが、 D -アロー スの前投与によりこの細胞死が抑制されることを明らかにした。 さら に、 より詳細な投与量の決定や、 作用機序の一部を明らかにした。
(2) 方法：砂ネズミを用い、 5分間の両側性の総頸動脈を閉塞する。
1週間後にサクリファイスし、 常法に従い、 切片作成を行い、 へマトキ シリン ェォジン染色を行う。 顕微鏡下で海馬の神経細胞数をカウント し、 残存率を計測した。 正常コントロール群、 虚血を与えたのみの群、 200mg/kgの D-ァロースまたは D-プシコースを虚血前に投与した群で 実験を行った。 虚血にともない細胞外に放出される大量のグルタミン酸 が神経細胞に毒性を有することが知られている。 これを明らかにするた め、 脳定位固定装置に砂ネズミを固定後、 海馬にグルタミン酸ォキシダ ーゼを溶解した液をマイクロダイァリシス用のプローブに還流し、 海馬 の神経細胞外のグルタミン酸濃度をリアルタイムで測定した。 また D- ァロースや 2-デォキシグルコースの前投与を行い、 虚血に伴うダルコ ースの代謝と D-ァロースの作用機序の関連を明らかにした。
(3) 結果： D-アロースは虚血に伴う神経細胞死を有意に抑制した。 し かし D-プシコースではこの抑制効果は認められなかった（図 23)。 虚血 に伴い、 海馬ではグルタミン酸は二相性に分泌される（図 24)。 最初の ピークは虚血に伴うもので、 第二のピークは虚血終了後の過還流時に伴 うものである。 この過還流は 1時間ほど持続し、 この過還流時に神経細 胞が障害を受けると考えられている。 D-ァロースの前投与により、 1番 目のピークは一部抑制されたが、 その抑制は 25 %程度であった。 しか し 2番目のピークは D-ァロースの投与によって 90%前後に強く抑制さ れた（図 24)。 またこのような効果は非代謝性の D-グルコース関連物質 である 2-デォキシグルコース投与によっても同様の効果が観察された (図 25)。 (4) 考察： D-グルコースは神経活動には必須のものであると同時に、 過不足にともない細胞毒性をもたらすことはよく知られている。 また虚 血のような強いス卜レスが与えられ、 かつ酸素の供給が断たれた場合 は、 強い細胞毒性を発揮する。 おそらくこれは活性酸素の発生を伴う細 胞障害であると考えられる。 D -ァロースは D-グルコース代謝に何らか の影響を与えて、 神経細胞死を抑制するものと考えられる。 これは非代 謝性の 2-デォキシグルコースの投与によっても同様な効果がもたらさ れたことから、 証明された。 一方、 脳虚血における D -グルコース消費 は神経細胞のみならず、 星状グリア細胞でもおこっており、 両者が D - グルコースを取り合うような可能性が示された。 星状グリア細胞におけ る D-グルコース消費は最終産物が、 神経とは異なっており、 嫌気的代 謝系が働き、 乳酸が放出されると報告されている。 プレリミナリーデ一 夕一であるが、 実際に虚血時における乳酸分泌が観察されていることか ら、 D -アロースの作用部位の一部は星状グリァ細胞ではないかと推測さ れる。 また、 グルタミン酸放出の 2番目のピークは活性酸素によっても たらされる可能性もある。 実施例 10
(ケ卜へキソースによる動脈硬化増悪に関連するケモカイン MCP-1の分泌 抑制作用）
ヒト血管内皮細胞 (HUVECs)を常法に従い培養液 (DMEM+ 10%FBS)の条件下 で細胞培養を行った。 HUVECsを約 70%の濃度で 96穴培養ディッシュに分注 し以下の実験に供した。
(実験 1)
D-プシコース濃度を OmM、 5. 6 M、 11. 2mMにて HUVECsの培養液に添加し、 24時間培養後、 培養液中の MCP-1を ELISA (Quant ikine，R&D) キットで測定 し、 結果を図 26に示した。
(実験 2)
HUVECsに作用して MCP- 1の分泌を刺激するサイトカイン、 IL- （最大分 泌刺激濃度 Ing/mL)および TNF-α (最大分泌刺激濃度 10ng/mL)で 1時間 HUVECsを前処理し、 次に D-プシコースを 0謹、 5. 6mM、 11. 2mMの濃度になる ように添加し 24時間培養後の培養液中の MCP- 1濃度を ELISAキッ卜で測定 し、 結果を図 27に示した。 図 26より、 血管内皮細胞における MCP- 1の基礎 分泌に関して、 D-プシコースは濃度依存的に MCP-1の分泌を抑制することが 理解される。 また、 血管内皮細胞における MCP-1の分泌はサイト力イン (TNF-α , IL-1|3)によって刺激され、 最大刺激濃度はそれぞれ IL- が最大分 泌刺激濃度 Ing/mLであり、 TNF-αが最大分泌刺激濃度 10ng/mLである。 図 27より、 血管内皮細胞を IL-l Mlng/mL)で刺激すると MCP-1が分泌され、 そ の分泌は添加された D-プシコースにより濃度依存的に抑制されることが理 解される。
一般に、 種々の血球成分に対する遊走活性を有するサイトカインであるケ モカインの一つとしての MCP-1は単球に対する遊走活性を有しており、 生理 的には炎症病巣における単球 ·マクロファージの集積に重要な役割を担って いる。 また、 臨床的には動脈硬化巣の形成において血管内皮細胞の障害に引 き続き、 泡末細胞形成のための細胞成分の遊走に重要な役割を演じている。 最近、 動脈硬化巣の免疫染色で、 動脈硬化病変における MCP-1の過剰発現が 指摘されている。
以上の実験により、 血管内皮細胞からのケモカイン MCP- 1の分泌が希少糖 に属するケトへキソースにより抑制されることが判明した。 また動脈硬化巣 における MCP- 1の発現は種々のサイトカインにより刺激されており、 特に Il-I TNF-aは重要な因子として位置付けられているが、 以上の実験によ り、 少なくとも IL- こよる MCP- 1の分泌刺激を希少糖に属す- ースが抑制することが示唆された。
MCP-1は動脈硬化病変形成に重要な役割を演じることが指摘されており、 希少糖に属するケトへキソースの MCP-1分泌抑制効果は、 動脈硬化の予防の 観点からも重要であり、 動脈硬化治療に有益な物質（例えば、 動脈硬化治療 物質や予防物質）への用途となり得ると考えられた。
これらの結果から、 希少糖に属するケトへキソースは、 それ単独で MCP-1 分泌を抑制する物質としての用途に利用できる。 また、 その誘導体や配糖体 について検討すれば、 MCP- 1分泌を抑制する物質ができる可能性が示唆され る。 また MCP-1は動脈硬化症のみならず、 他の疾患発症に関与していること が指摘されている。 例えば慢性関節リウマチにおける関節での炎症の惹起に MCP-1の関与が指摘されている。 また喘息などの肺疾患においても単球の遊 走および単球，マクロファージの活性化を介して疾患形成に関与している。 このような局所の炎症、 および単球 ·マクロファージが関与する疾患におい て希少糖に属するケトへキソースは疾患の活動性を調節する可能性があり、 幅広い疾患の治療薬としての応用が期待される。
実施例 11
(ケトへキソースによるマイクログリァ遊走抑制作用） 本実施例 11は、 希少糖に属するケ卜へキソースを有効成分とするマイク ログリァ遊走抑制物質に関する。 生体内の臓器は長時間血流が途絶え虚血状 態に陥ると壊死に陥る。 虚血状態は、 臓器の手術時に血流を一時遮断し術後 に再開する場合に必ず生じる。 また、 臓器移植等で臓器を摘出保存し移植す る場合も同様である。 臓器保存法には、 単純冷却法、 持続灌流法、 凍結法な どがあるが現在もっとも臨床的に応用されているのは、 単純冷却法である。 これは臓器摘出時に保存液で灌流し、 摘出後に同様の冷却した保存液に浸漬 する方法である。 現在では Belzerら Wisconsin大学外科のグループにより 開発された Univers i ty of Wi scons in (冊)液により飛躍的に保存時間が延長 され、 主としてこれが使用されるようになった。 しかし、 保存終了後の血流 再開時には、 臓器に対して活性酸素、 細胞外プロテアーゼおよびサイトカイ ンなどによる障害性変化が出現する。 これを抑制する目的で種々の薬剤 ipyrazolotriaz in 誘導体薬剤や ni tric oxide (NO)分泌誘発剤など）を灌流 液に添加する方法が提唱されているが臨床的にまだ十分ではない（松本光司 J Nippon Med Sch第 68卷第 3号、 001年)。
そこで、 本実施例 11では、 希少糖に属するケトへキソースのマイクログ リァ遊走抑制効果を確認することにより希少糖に属するケトへキソースの脳 臓器保存における有用性及び臨床応用への可能性について検討する。
以下の本実施例 πでは、 虚血で出現するマイクログリアの数に及ぼす希 少糖に属するケトへキソースの影響について検討する。 これにより、 希少糖 に属するケトへキソースはマイクログリアの出現数を減少させて脳臓器保存 における有用性及び脳の治療への臨床的応用へ有効であることが示唆され る。 なお、 希少糖に属するケトへキソースとしては、 D-プシコースを使用し た。 脳虚血モデルとして、 体重 70g程度の雄砂ネズミの両側総顏動脈を 5分 間結紮するモデルを使用する。 このモデルでは、 脳の海馬 CA1領域の神経細 胞が特異的に虚血性細胞死を起こす。
虚血を行わない対象（コントロール： Sham)、 虚血 +生理食塩水処理、 虚血 +D-プシコース処理の各 3例の各群に分けて比較検討した。
D -プシコース処理としては、 生理食塩水中に D-プシコースを溶解させて 濃度 200mg/mLの D-プシコース溶液として、 虚血前 5分と虚血直後にそれぞ れ、 200mg/kgずつ、 大腿静脈より虚血モデルに投与した。 生理食塩水処理 としては、 D-プシコース溶液に代えて生理食塩水のみを同様に投与した。 虚 血後 1週間して灌流固定し、 20 の凍結脳切片を作成し、 へマトキシリ ン ·ェォジン染色を行った。 結果を図 28に示すが、 炎症細胞であるマイクログリアの出現数が D-プシ コースの添加により減少され、 マクログリアの遊走が D-プシコースの投与 によって確実に抑制されることが理解される。 この虚血モデルでは、 炎症細 胞であるマイクロダリァの遊走は D -プシコースの投与によって抑えられ た。 一過性脳虚血の際には、 海馬の神経細胞死が起こり症状として記憶障害 が伴うことが知られている。 脳虚血による神経細胞死に関しては、 薬剤や低 体温療法などで一時的に虚血性神経細胞死を抑制した後でも、 脳ダリァ細胞 の一種であるマイクロダリァがグルタミン酸や活性酸素を出して、 治療後の 慢性的な細胞死に関与するということが指摘されている。 これにより、 こう したマイクロダリァの動きを抑制することも、 脳の虚血保護や移植時保存に 関して有用であると言える。 したがって、 D-プシコースは薬剤や低体温療法 など他の治療法との併用でその治療効果を上げることが期待される。 実施例 12
(ケトへキソースの血糖降下に関連する作用）
本実施例 12は、 希少糖に属するケトへキソースを有効成分とする血糖降 下作用物質に関する。 糖尿病は耐糖能異常も含めると 1000万人を遙かに超 える国民病となっている。 糖尿病の本態はグルコースによる特異的なィンス リン分泌不全であり、 fl¥臓からのィンスリン分泌が減弱した状態およびその 作用不足のために発症する代謝疾患と考えられている。 一般にインスリン分 泌を促進する薬剤として、 スルホニル尿素薬やフェニールァラニン誘導体な どの糖尿病治療薬があるが、 副作用などの種々の問題点がある。 そこで本実 施例 12では、 希少糖に属するケトへキソースの糖尿病における有用性およ び臨床応用の可能性について検討した。 第一に希少糖に属するケトへキソー スによる膝 ]3細胞からのインスリン分泌刺激能について、 グルコースと比較 して検討し、 また、 グルコースと希少糖に属するケトへキソースの共存下に おける膝 j3細胞からのインスリン分泌動態について検討する。 またダルコ一 スは、 食物が消化分解され腸から吸収されて供給されているので、 ダルコ一 ス吸収における希少糖に属するケトへキソースの影響について腸管を用いて 検討する。 これにより、 希少糖に属するケトへキソースは、 インスリンの分 泌を促進する効果があり、 特にグルコースと併用すること より加算的 （追 加的） にインスリンの分泌を促進させること、 また、 糖代謝に影響を及ぼさ ない希少糖に属するケトへキソースがダルコースの吸収を抑制していること により、 希少糖に属するケトへキソースの糖尿病の予防又は治療への有用性 が示唆される。
インスリノーマ由来の膝 )3細胞株 INS- 1を常法に従い培養液 (DMEM+ 10% FBS)の条件下で細胞培養を行った。 INS- 1細胞を約 70%の密度で 96穴培養 ディッシュに分注し以下の実験に供した。 希少糖に属するケトへキソースと しては、 D-プシコースを使用した。 .
(実験 1)
培養液のグルコース濃度を 2. 8mM、 5. 6mM、 11. 2mM、 16. 7mMにして 24時間 培養後、 培養液中のインスリン濃度を ELISA (レビス インスリンキット）で 測定した。 この結果、 インスリノ一マ由来の塍 /3細胞株 INS- 1細胞は培養 液中のグルコース濃度に反応してインスリン分泌が刺激された。 この分泌刺 激はグルコース濃度 11. 2ιηΜでブラトーに達した。
(実験 2)
培養液の D-プシコース濃度を OmM、 2. 8mM、 5. 6mM、 11. 2mM、 16. 7mMに変 えた時の培養液中のインスリン濃度を ELISA法にて測定し結果を図 29に示 した。 この結果、 塍 細胞株 INS- 1細胞を種々の濃度の D-プシコースで刺 激すると、 濃度依存的にインスリン分泌が認められた。 この分泌刺激は、 D プシコース濃度 11. 2mMでブラトーに達した。
(実験 3) . グルコースに基づくインスリン分泌がブラトーに達するグルコース濃度を 11. 2mMに固定し、 更に D-プシコースを加えてプシコース濃度を 2. 8謹、 5. 6mM、 11. 2mM、 16. 7mMと変化させて 24時間培養した。 膝 )3細胞株 INS - 1 細胞からのィンスリン分泌の状況を検討し結果を図 29に併せて示した。 こ の結果、 グルコースに基づくインスリン分泌の最大刺激濃度に保ったにもか かわらず、 D-プシコースの濃度を追加的に増加させると、 培養液中へのイン スリンの分泌がさらに加算的に刺激されたことが確認された。
(実験 4)
グルコースの吸収に与える D-プシコースの影響を調べるためにラッ卜の 腸管を用いて D-プシコースの吸収に及ぼす影響を解析した。 グルコースの 吸収はグルコースォキシダーゼ法による定量法により腸管粘膜を隔てて外部 と内部の濃度を測定することで解析する。 D-プシコースがグルコースと併存 することでグルコースの吸収がどのように変化するかを測定する。 また D- プシコースを長期間投与したラッ卜の腸管を用いて、 同様に糖の吸収系がど のように変化す ¾かを解析する。
グルコースを含む緩衝液中に、 図 30に示すように、 ラット反転腸管を浸 漬し、 一定時間後に漿膜側の溶液をサンプリングしグルコース濃度を測定す る。 種々の濃度の D-プシコースを添加することによって、 粘膜側から漿膜 側へのグルコースの輸送に与える D-プシコースの影響について検討し、 結 果を図 31に示した。
この結果、 ラット反転腸管にグルコースと同濃度の])-プシコースを加え ておくと、 漿膜側のグルコース濃度の上昇が有意に抑制された。 D-プシコ一 スの添加が、 グルコースの輸送系に影響を与えている可能性が示唆された。 以上の結果より、 希少糖に属するケトへキソースは、 塍 /3細胞からのインス リン分泌を刺激することが判明した。 また最大のィンスリン分泌刺激が得ら れるグルコース濃度下の細胞において、 希少糖に属するケトへキソースを追 加的に添加することにより、 さらなるインスリン分泌が観察された。 一般 に、 糖尿病の本態はグルコースによる特異的なインスリン分泌不全である が、 グルコースに基づくインスリン分泌が不全である場合にも希少糖に属す るケトへキソースの作用により有効にィンスリン分泌を促進させることがで きると期待される'。 これにより、 希少糖に属するケトへキソースの膝 i3細胞 からのィンスリン分泌刺激作用および高血糖状態における希少糖に属するケ トへキソースのインスリン分泌増強作用が判明され、 希少糖に属するケ卜へ キソースは、 今までにない新しい作用機序を有する物質として期待される。 また、 臨床的に高血糖が認められる糖尿病患者において希少糖に属するケト へキソースがインスリン分泌を促進し、 血糖値を改善することが期待され る。 また経腸管的に投与された希少糖に属するケトへキソースがグルコース の吸収を抑制すること及び希少糖に属するケトへキソースが糖代謝に影響を 及ぼさないことは、 糖尿病における食後過血糖を抑制する可能性があり、 糖 尿病における予防又は治療に有益な物質として期待される。 さらに、 希少糖 に属するケトへキソースには糖尿病およびその合併症とも関連が大きい動脈 硬化の予防効果も認められ、 糖尿病の主死因は動脈硬化性疾患であるので、 動脈硬化抑制作用もある希少糖に属するケトへキソースは血糖値の改善およ び動脈硬化症の予防という画期的な糖尿病治療薬として期待される。 また、 希少糖に属するケトへキソースは、 これらの治療効果ゃ抗肥満等が期待され る健康補助食品となり得ると期待される。 実施例 13
(希少糖投与によるラット血糖値に対する影響）
(1) 目的：希少糖、 特に])-プシコースの投与によって])-フラク I ^一スの 長期大量投与負荷で発生する高ィンスリン血症が抑制されることが報告され ている。 今回我々は希少糖の投与によって正常ラッ卜の血糖値がどのように 変動するかを調べた。
(2) 方法： 1) 希少糖投与： SDラットォス（体重 300g前後）を 20-24時間 絶食後に実験に用いた。 ラッ卜にネンブタール（58mg/kg B. )を腹腔内投与 し、 麻酔下にて類部を切開して経静脈にシリコンチューブを留置した。 この チューブに 1mlシリンジを接続し、 希少糖を投与した。
2) 採血：顏静脈に挿入したシリコンチューブから l m 1シリンジを用い て採血を行った。 採血は希少糖投与直前、 5， 10, 15, 20, 25, 30,
60, 120, 180, 240分後に行った。
3) 血糖測定：採血した血液中の血糖値はアントセンス I I (バイエルメデ ィカル）によって決定した。
(3) 結果：
1) 麻酔下生理食塩水投与による血糖への影響 （図 32) ：まず、 3匹のラッ 卜に生理食塩水（0. 7ml)のみを静注して血糖値に対する麻酔等の影響を調べ た。 その結果、 生理食塩水のみの投与では血糖値の大きな変化はみられなか つた。 .
2) 麻酔下 D-グルコース投与による血糖値への影響 （図 33) : D -ダルコ一 ス（200mg/kg BW)を顏静脈より静注して注入前後の血糖値を測定した（N=2)。 血糖値は])-グルコース投与によって一過性に上昇し、 60分程度で正常値に 近づいた。
3) D-プシコース投与による血糖値への影響 （図 34) ： ラットに麻酔下で Ps icose (200ig/ kg BW)を静脈内投与して血糖値を測定した（N=4)。 そのうち 2匹では血糖値が希少糖投与 30_ 60分で減少し、 徐々に回復をしたが、 他 の 2匹では血糖低下ののちに初期値より上昇またはほとんど変化しなかつ た。
(4) 考察：本実施例 13が用いた正常ラット麻酔下における実験系にてネ ンブタール麻酔や生理食塩水静脈内投与が血糖値や D-グルコース負荷に対 して影響しないことが確認された。 本実施例 13の実験では、 ラッ卜のうち 半数は D-プシコースを投与することによって血糖値が投与後 30-60分で低 下し、 その後ゆっくりとした回復が見られた。 残りのラットは早期に血糖低 下を起こしその後上昇するか、 または徐々に血糖低下を示した。 これらのこ とから個体差はあるが正常ラットでは希少糖 (D-プシコース）により、 軽度の 血糖低下が起こることがわかった。 今後、 実験動物数を増やしてデータを解 析する必要がある。 また、 高血糖ラットにおいての作用を検討する必要性が ある。 同時に行った、 D-ァロースの実験では、 血糖低下は認められなかつ た。 実施例 14
(ケトースの高血糖状態改善効果）
(1) 目的：糖尿病は耐糖能異常も含めると 1000千万人を遥かにこえる国 民病となっている。 糖尿病の本態はグルコースによる特異的なインスリン分 泌不全である。 そこで今回我々は、 希少糖、 特にケ! ^一スである D-プシコ —スの糖尿病における有用性および臨床応用の可能性について検討した。 現 在までに、 ケトースによる滕/ 3細胞からのインスリン分泌刺激能について、 in vi troで検討してきた。 今回の検討は、 無麻酔無拘束ラットをもちいて
D -プシコースのインスリン分泌能および糖代謝に与える影響について検討を おこなう。 本研究により、 ケトースの膝 3細胞からのインスリン分泌刺激作 用および高血糖状態におけるケ 1 ^一スのィンスリン分泌増強作用を in vivo で検証するものである。 以上のことより今後ケトースの糖尿病における予防 Z治療薬としての可能性を検討する目的である。
(2)方法： 1) 経静脈ブドウ糖負荷試験（IVGTT) 8週令 SDラッ卜雄を使用 して頸静脈よりカテーテルを挿入して IVGTTを施行する。 希少糖 3匹 ·ダル コ一ス 3匹とする。 プロトコール 1
0. 5g/kg (0. 5g/1000g=500mg/1000g=0. 5mg/g)で IVする。
0. 5g/ml (0. 5g/1000ul=500mg/1000ul=0. 5mg/u l)の濃度の希少糖およびダル コースの溶液を調整する。 溶液は 2ml作成する。
200gのラッ卜であれば、 200ulを静脈注射（IV)する。
250gであれば 250ulとなる。
IVのあと生理食塩水を 300ul注入する。
血液サンプルは 150ul採血する。
前処置として 16時間絶食とする。 飲水は可。
採血時間は 0、 5、 10, 15, 20, 25, 30, 45， 60分の 9ポイントとする。 2) 高血糖時におけるプシコースの影響
8週令 SDラット雄を使用して頸静脈よりカテーテルを挿入して 50 %ダル コースを 20分間隔で注入し高血糖状態を作成し、 プシコースおよびデォ キシグルコースを使用し IVGTTを施行する。 希少糖 1匹 ·デォキシダルコ ース 1匹とする。
プロトコール 2
0. 5g/kg (0. 5g/1000g=500mg/1000g=0. 5mg/g)で IVする。
0. 5g/ml (0. 5g/1000ul=500fflg/1000ul=0. 5mg/u l)の濃度の希少糖およびデォ キシグルコースの溶液を調整する。 溶液は 2ml作成する。
200gのラッ卜であれば、 200u lを IVする。
250gであれば 250ulとなる。
IVのあと生理食塩水を 300ul注入する。
血液サンプルは 150ul採血する。
採血時間は 0、 5、 10, 15, 20, 25, 30， 45, 60分の 9ポイントとする。 (3) 結果： IVGTT…コントロールとしてブドウ糖を使用した。 図 35に示す ように、 ブドウ糖を負荷すると血糖値の上昇をみとめた。 プシコースを静脈 内に投与しても血糖値の上昇を認めなかった。 また IVGTT に経時的に血中 insul inを測定すると、 ブドウ糖負荷群では血糖値の上昇に一致して
insul inの上昇を認めたが、 プシコース投与群においては血糖値が上昇しな かったためか insul inの分泌にも影響を与えなかった（図 36)。
正常の血糖レベルではプシコースはィンスリン分泌を促進しないことが示 唆されたので、 次にブドウ糖を連続して投与し高血糖状態を作成したラッ卜 においてプシコースの影響を検討した。 コントロールとしてデォキシダルコ ースを使用した。 コントロールに比較して、 プシコース投与群においては血 糖値に低下が速やかであった。 また経時的に測定した insul in濃度はコント ロールに比較して分泌が増加していた（図 37)。
(4) 考察：本実施例 14の検討において in vivoにおいて D-プシコースは 糖代謝に影響を及ぼさずに膝 )3細胞からのィンスリン分泌を刺激することが 判明した。 またインスリン分泌作用に関しては、 高血糖時にインスリン分泌 作用を有するが、 通常の血糖においてはィンスリン分泌促進作用がほとんど 認められず、 低血糖の誘発は認められなかった。 糖尿病の本態はグルコース による特異的なインスリン分泌不全であるが、 希少糖は、 そのような状態に おいても有効にインスリン分泌を促進させることより、 今までにない新しい 作用機序を有する物質として期待される。 臨床的に高血糖が認められる糖尿 病患者において D-プシコースがィンスリン分泌を促進し、 血糖値の改善が 得られる可能性があり、 糖尿病治療に有益な医薬品または健康補助食品とな りえると考えられる。 実施例 15
(希少糖の蛋白質の糖化に対する効果）
(1) 目的：糖尿病における持続的高血糖状態は， 生体内での蛋白質の非酵 素的糖付加反応 (糖化）を促進する。 この反応はアマドリ産物など（前期生成 物）を経由して， やがて後期反応生成物（advanced glycat ion end products : AGE)を形成し、 酸化ストレスを増大させ、 糖尿病における網膜症、 腎障害な どの血管合併症を進展させる。 本実施例 15では， 希少糖に高血糖下におけ る糖化、 酸化ストレス抑制効果があるか否かを検討する。
(2) 方法：グリコアルブミン（GA)測定試薬（オリエンタル酵母社製）プロテ ァーゼ Kによりアルブミンをアミノ酸断片にした後， ケトアミンォキシダー ゼによりダリコリジンを測定する（図 38)。 各種希少糖によるヒトアルブミ ンのダリケーシヨンを検討した。 試料の調整は， PBSにヒトアルブミン純品 を 3g/dlにして， それに各種希少糖をそれぞれ終濃度 55. 5πιΜになるように 溶解した。 調整した溶液を 0. 25 z mのフィルターでろ過滅菌し， 37°Cで 7 日間インキュベーションした。 途中， 正確に 24時間おきに GA濃度（グリコ リジン濃度）を測定した。 さらに、 アルブミン（終濃度 3g/dl)、 グルコース (終濃度 55. 5mM)溶液に各希少糖を終濃度 55. 5mMになるように添加し、 同様 に実験した。
(3) 結果： 1) 最も糖化反応が顕著だったのは D-ァロースであり， その糖 化速度は約 90 ^mol/dayであった。 次に糖化反応が進んだのは D -ダルコ一 スと D-マンノースであり， 約 50 mol/dayであった。 他の希少糖 （D -プシ コースなど） ではアルブミンのダリケーシヨンは見られなかった（図 39)。
2) グルコース共存下での希少糖の糖化作用…次にアルブミン（終濃度 3g/dl)、 D -グルコース (終濃度 55. 5mM)溶液に各希少糖を終濃度 55. 5mMにな るように添加し、 グリコアルブミン濃度を測定した。 その結果、 D-ァロース は D -グルコース存在下でも急速な糖化反応が見られた。 その糖化速度は実 験 1の結果通りで、 約 140 mol/day (D-グルコース +D-ァロースの糖化速 度）であった。 また D -マンノースでは約 100 xmol/dayであり， グルコース の糖化速度をプラスした糖化速度が得られた。 一方、 D-プシコースなどの各 希少糖ではダリケーシヨンの抑制効果は認められなかった（図 40)。 (4) 考察：生体内ではタンパク質とグルコースなとが非酵素的に結合 (glycat ion)が起こっている。 蛋白質のァミノ基とアルデヒド基の反応が初 期反応において重要である。 今回の検討結果でアルブミンのグリケーション が認められた糖類（D-ァロ一ス、 D -グルコース、 D-マンノース）はいずれもァ ルドース類である。 アルド一スは糖化反応のみならず、 アルドース還元酵素 によるポリオール代謝への影響も考えられる。 臨床検査では、 糖尿病患者の 血糖コントロールの指標として HbAlcゃグリコアルブミンなどが有用とされ ている。 いずれも蛋白質のグルコースによる糖化反応生成物を測定してい る。 糖化部位は、 ヘモグロビンのグロビン 0鎖 N末端のバリン、 アルブミン の 199， 281, 439, 525番目のリジンと言われている。 今回希少糖の糖化反 応の検討に使用したアルブミンはヘモグロビンに比べて糖化部位が多いの で、 短い期間の実験でデータが得られた。
ヘモグロビンによる同様の検討を行うには問題点がある。 糖化速度が遅い ので、 インキュベーション中に蛋白の変性が進みすぎてうまく測定できな い。 現在、 市販ヘモグロビン粉末にて検討中である。
実施例 15の実験データで分かったように D-プシコースはアルブミンの糖 化を促進しない。 他の D-フラクト一スなどの糖も糖化は起こさなかった が、 それらの糖は体内に代謝経路をもっており、 多量に存在すると結果とし てアルドースなどが増加することになる。 今後の実験で D-プシコースのヒ ト体内代謝をあきらかにするべきだが、 少なくとも D-プシコースは多量に 服用しても糖化反応などがもたらす合併症の進展を促進しない可能性があ る。 加えて、 D-プシコースのインスリン分泌作用があることから有用な糖尿 病患者への利用価値があると考えられる。 一方、 今回のアルブミンを使用し た実験では希少糖に糖化抑制作用は認められなかった。 しかし、 今後さらに 希少糖の濃度を変更して検討し、 さらに酸化抑制効果を検討していきたい。 以上、 本発明を実施例により説明した。 ここで希少糖は常用の糖類とは反 対に身体により同化されないか又はたとえ同化されてもその程度は僅かであ ること、 また、 希少糖の脂質代謝に及ぼす影響から体脂肪蓄積の抑制効果が 期待されていることにより、 希少糖は、 本発明の開示により各種の医薬品へ の期待に加えて、 機能性食品としての付加価値を高くすることが期待され る。 産業上の利用可能性
本発明に従えば、 希少糖、 特に D -アロース、 D-プシコースが細胞に取り 込まれ又は作用されて当該細胞を変化させるので、 希少糖が生理活性作用を 有する物質として有効に利用されることが理解される。

Claims

I . 生理活性作用感受性細胞に希少糖を作用させて当該細胞の機能を変 化させることを特徴とする希少糖の生理活性作用の利用方法。
2 . 前記細胞がヒト細胞である請求項 1の希少糖の生理活性作用の利用
m胄
方法。
3 . 前記希少糖として希少糖を有効成分として配合した組成物を用いる の
請求項 1または 2の希少糖の生理活性作用の利用方法。
4 . 前記組成物が機能性食品、 医薬品または化粧品である請求項 3の希 囲
少糖の生理活性作用の利用方法。
5 . 前記希少糖がアルドースおよび Zまたはケトースに属する希少糖で ある請求項 1ないし 4のいずれかの希少糖の生理活性作用の利用方法。
6 . 前記アルド一スが D -アロースである請求項 5の希少糖の生理活性 作用の利用方法。
7 . 前記細胞が、 癌細胞増殖抑制作用感受性細胞および活性酸素の産生 抑制作用感受性細胞よりなる群より選ばれる請求項 6の希少糖の生理活 性作用の利用方法。
8 . 前記ケトースが D-プシコースである請求項 5の希少糖の生理活性 作用の利用方法。
9 . 前記細胞が、 ケモカイン分泌抑制作用感受性細胞、 マイクログリア の遊走抑制作用感受性細胞および血糖降下作用感受性細胞よりなる群よ り選ばれる請求項 8の希少糖の生理活性作用の利用方法。
1 0 . 生理活性作用感受性細胞に取り込ませて当該細胞の機能を変化さ せる作用を有する希少糖を有効成分として配合した組成物。
I I . 前記細胞がヒト細胞である請求項 1 0に記載の組成物。
1 2 . 前記希少糖がアルドースおよび またはケトースに属する希少糖 である請求項 10または 1 1の組成物。
1 3. 前記アルドースが D-ァロースである請求項 12の組成物。
14. 前記細胞が、 癌細胞増殖抑制作用感受性細胞および活性酸素の産 生抑制作用感受性細胞よりなる群より選ばれる請求項 1 3の組成物。
1 5. 前記ケトースが D-プシコースである請求項 12の組成物。
16. 前記細胞が、 ケモカイン分泌抑制作用感受性細胞、 マイクロダリ ァの遊走抑制作用感受性細胞および血糖降下作用感受性細胞よりなる群 より選ばれる請求項 15の組成物。
17. 前記組成物が機能性食品、 医薬品または化粧品である請求項 1 0 ないし 16の組成物。
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