KR100868529B1 - 희소당의 생리활성 작용의 이용방법 및 희소당을 배합한조성물 - Google Patents

Abstract

생리활성작용 감수성 세포에 희소당을 작용시켜서 해당 세포의 기능을 변화시키는 것을 특징으로 하는 희소당의 생리활성작용의 이용방법. 생리활성작용 감수성 세포에 섭취시켜서 해당 세포의 기능을 변화시키는 작용을 가지는 희소당을 유효 성분으로서 배합한 조성물. 상기 세포는 인간 세포이다. 상기 조성물은 기능성 식품, 의약품 또는 화장품이다. 상기 희소당은 알도오스 및/또는 케토오스에 속하는 희소당이다. 상기 알도오스는 D-알로오스이며, 상기 세포는 암세포 증식억제 작용 감수성 세포 및 활성산소의 생산 억제작용 감수성 세포로 이루어지는 군에서 선택된다. 상기 케토오스는 D-프사이코스이며, 상기 세포는 케모카인 분비억제작용 감수성 세포, 마이크로글리아의 유주 억제 작용 감수성 세포 및 혈당 강하 작용 감수성 세포로 이루어지는 군에서 선택된다.

Description

희소당의 생리활성 작용의 이용방법 및 희소당을 배합한 조성물{METHOD OF UTILIZING PHYSIOLOGICAL ACTIVITY OF RARE SACCHARIDE AND COMPOSITIONS CONTAINING RARE SACCHARIDE}

본 발명은 희소당(稀少糖)의 생리활성작용의 이용방법, 및 희소당을 유효성분으로서 배합한 조성물, 특히 기능성식품 의약품 또는 화장품에 관한 것이다.

단당은 폴리히드록실알데히드 구조를 가지는 알도오스, 폴리히드록실케톤 구조를 가지는 가지는 케토오스, 및 그들을 환원하여 얻어지는 당알콜로 대별된다. 한편, 단당은 자연계에 있어서의 존재량에 따라서도 분류된다. 즉, 희소당은 국제희소당 학회의 정의에 의하면 「자연계에 드물게 존재하는 당」이라고 정의되어 있으며, 자연계에 있어서의 존재량이 적은 단당이다. 희소당은 일반적으로 유기화학적 합성방법에 있어서의 합성 반응에 있어서는 수량이 적은 것이 많다. 이 때문에, 희소당은 미지의 성질인 것이 많으며, D-글루코오스를 포함한 알도헥소오스(6탄당의 알도오스)의 희소당에 있어서도 미지의 성질이 많다는 것이 현재의 상황이다.

이 알도헥소오스에 속하는 희소당으로서는, D-알로오스 외에 D-글로오스, D-이도오스, D-타로오스, D-알토로오스, L-만노오스, L-글루코오스, L-갈락토오스 등이 예시된다. 또한, D-프사이코스를 포함한 케토헥소오스(6탄당의 케토오스)의 희 소당에 있어서도 마찬가지이다. 케토헥소오스에 속하는 희소당으로서는 D-프사이코스, L-프사이코스, D-소르보오스, L-소르보오스, D-타가토오스, L-타가토오스, L-후락토오스 등이 예시된다.

여기서, 종래, 당류와 암과의 관계에 대해서는, 예를 들면 특허문헌 1에 기재되어 있는 바와 같이, 암의 예방에 유효한 다당류가 알려져 있다. 또한, 올리고당이 정장(整腸) 작용을 가지는 것을 이용하여 변비를 해소하여 대장암 등으로 되기 어려운 효과를 가지는 것이나, 최근에는 아가리스쿠 등의 다당체가 암 억제효과를 가지는 것 등의 보고, 당쇄와 암 전이 관련의 보고도 있다.

한편, 당류의 활성산소에 대한 성질을 이용한 것으로는, 예를 들면 특허문헌 2에 기재되어 있는 바와 같이, 활성산소를 억제하는 성질을 가지는 다당류를 함유시킨 활성산소 억제제가 알려져 있다.

단당류 중에서 프사이코스는 케토헥소오스(6탄당)이다. 이 프사이코스에는 광학이성체로서 D체와 L체가 있다는 것이 알려져 있다. 여기서, D-프사이코스는 기지 물질이지만 자연계에 드물게 존재하기 때문에, 국제희소당 학회의 정의에 의하면 「희소당」으로 정의되어 있지만, 이 D-프사이코스는 근래, 에피메라아제의 출현(예를 들면, 특허문헌 3 참조)에 의해 고가이지만, 비교적 입수가 용이해졌다. 그리고, 이 공보에 따르면, 제조된 D-프사이코스는 감미료, 발효용 탄소원, 시약, 화장품ㆍ의약품의 원료ㆍ중간체 등으로서 유효하게 이용할 수 있다는 것이 시사되어 있다. 이 공보에 의하면, 이 감미료로서는 음식물, 사료, 치약, 내복약 등 경구 섭취물의 감미용의 기호성 향상에 이용할 수 있는 취지로 기재되어 있지만, 가식 배합물로서의 구체적인 구성에 대해서는 개시되어 있지 않다. D-프사이코스가 광학이성체인 L-프사이코스에 대해서는, 가식 배합물로서 이용 가능하다는 것이, 예를 들면 특허문헌 4에 상세히 개시되어 있다.

특허문헌 1 : 일본 특개평 5-112455호 공보

특허문헌 2 : 일본 특개평 7-285871호 공보

특허문헌 3 : 일본 특개평 6-125776호 공보

특허문헌 4 : 일본 특개소 57-129671호 공보

희소당의 생리활성에 착안하여, 세포를 이용한 실험에 의해 그것을 증명하는 것은 본 발명자들에 의해 시작되었다. 21세기는 생명과학의 세기라고도 불리워지고 있으며, 현재 국제적으로 DNA연구, 단백질 연구가 진행되고 있다. 포스트 게놈 연구에 있어서의 당이라면 당쇄의 연구가 중심이지만, 본 발명자들은 「단당」에 착안하고, 단당에 생리활성은 없는가라는 실마리로부터 연구를 진행시키고 있다. 본 발명의 배경으로서는 희소당의 생산에 관한 총망라적인 연구가 오랫동안 축적되어 오고 있으며, 근래에 들어 일부의 희소당의 대량생산 기술이 확립되었다는 것을 들 수가 있다.

본 발명은, 희소당에 대해서 특히 D-알로오스, D-프사이코스의 생리활성 작용의 이용방법의 제공 및 희소당의 생리활성을 활용한 기능성 식품, 의약품 등의 창생을 목적으로 한다.

본 발명은 이하의 (1) 내지 (9)의 희소당의 생리활성 작용의 이용방법을 요 지로 하고 있다.

(1) 생리활성작용 감수성세포에 희소당을 작용시켜서 해당 세포의 기능을 변화시키는 것을 특징으로 하는 희소당의 생리활성작용의 이용방법.

(2) 상기 (1)의 방법에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인 것을 특징으로 한다.

(3) 상기 (1) 또는 상기 (2)의 방법에 있어서, 상기 희소당으로서 희소당을 유효 성분으로서 배합한 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.

(4) 상기 (3)의 방법에 있어서, 상기 조성물이 기능성 식품, 의약품 또는 화장품인 것을 특징으로 하는 방법.

(5) 상기 (1) 내지 상기 (4)의 어느 것인가의 방법에 있어서, 상기 희소당이 알도오스 및/또는 케토오스에 속하는 희소당인 것을 특징으로 하는 방법.

(6) 상기 (5)의 방법에 있어서, 상기 알도오스가 D-알로오스인 것을 특징으로 하는 방법.

(7) 상기 (6)의 방법에 있어서, 상기 세포가 암세포 증식억제작용 감수성 세포 및 활성산소의 생산억제작용 감수성 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

(8) 상기 (5)의 방법에 있어서, 상기 케토오스가 D-프사이코스인 것을 특징으로 하는 방법.

(9) 상기 (8)의 방법에 있어서, 상기 세포가 케모카인 분비억제작용 감수성 세포, 마이크로글리아의 유주작용 감수성 세포 및 혈당강하작용 감수성 세포로 이 루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

본 발명은, 이하의 (10) 내지 (17)의 희소당을 유효성분으로서 배합한 조성물을 요지로 하고 있다.

(10) 생리활성작용 감수성 세포에 영향을 주어 해당 세포의 기능을 변화시키는 작용을 가지는 희소당을 유효 성분으로서 배합한 조성물.

(11) 상기 (10)의 조성물에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.

(12) 상기 (10) 또는 (11)의 조성물에 있어서, 상기 희소당이 알도오스 및/또는 케토오스에 속하는 희소당인 것을 특징으로 하는 조성물

(13) 상기 (12)의 조성물에 있어서, 상기 알도오스가 D-알로오스인 것을 특징으로 하는 조성물.

(14) 상기 (13)의 조성물에 있어서, 상기 세포가 암세포 증식억제작용 감수성 세포 및 활성산소의 생산억제작용 감수성 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.

(15) 상기 (12)의 조성물에 있어서, 상기 케토오스가 D-프사이코스인 것을 특징으로 하는 조성물.

(16) 상기 (15)의 조성물에 있어서, 상기 세포가 케모카인 분비억제작용 감수성 세포, 마이크로글리아의 유주 억제작용 감수성 세포 및 혈당 강하작용 감수성 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.

(17) 상기 (10) 내지 상기 (16)의 어느 것인가의 조성물에 있어서, 상기 조 성물이 기능성 식품, 의약품 또는 화장품인 것을 특징으로 하는 조성물.

도 1은, 본 발명에 관한 D-알로오스가 간암 세포(HepG2)에 대한 증식억제효과가 있음을 도시하는 도면.

도 2는, 본 발명에 관한 D-알로오스가 자궁암세포(Hela)에 대한 증식억제효과가 있음을 도시하는 도면.

도 3은, 본 발명에 관한 D-알로오스가 난소암세포(OVCAR3)에 대한 증식억제효과가 있음을 도시하는 도면.

도 4는, 본 발명에 관한 D-알로오스가 피부각화세포(HaCaT)에 대한 증식억제효과가 있음을 도시하는 도면.

도 5는, 본 발명에 관한 D-알로오스가 암세포 증식억제에 대한 농도의존성을 가짐을 도시하는 도면.

도 6은, 실시예 3의 희소당에 의한 HL60의 증식억제효과를 도시하는 도면.

도 7은, 실시예 3의 희소당에 의한 Daudi 세포의 증식억제효과를 도시하는 도면.

도 8은, 실시예 3의 희소당에 의한 THP1의 증식억제효과를 도시하는 도면.

도 9는, 실시예 3의 희소당에 의한 KS1의 증식억제효과를 도시하는 도면.

도 10은, 실시예 3의 희소당에 의한 MT2의 증식억제효과를 도시하는 도면.

도 11은, 실시예 3의 희소당에 의한 KG1의 증식억제효과를 도시하는 도면.

도 12는, 플로우사이토메트리에 의한 D-알로오스의 세포주기에의 영향을 도 시하는 도면.

도 13은, 백혈구로부터의 활성산소 생산의 경시변화를 도시하는 도면.

도 14는, 본 발명에 관한 D-알로오스가 백혈구의 활성산소의 생산 억제에 효과가 있음을 도시하는 도면.

도 15는, 각 당이 백혈구의 활성산소 생산이 시작된 후에 있어서의 활성산소억제에 대해서는 효과가 없다는 것을 도시하는 도면.

도 16은, 실시예 9의 본 발명에 관한 D-알로오스가, 활성산소 생산억제에 대한 농도의존성을 가지는 것을 도시하는 도면.

도 17은, 망막 허혈ㆍ재환류장해에 대한 D-알로오스의 효과를 도시하는 도면.

도 18은, 실시예 7의 D-알로오스의 피변(皮弁) 허혈 재환류장해 경감효과에 관한 것으로, 생착(生着) 면적(%)의 모든 데이터를 나타내는 표.

도 19는, 실시예 7의 D-알로오스의 피변 허혈 재환류장해 경감효과에 관한 것으로, 분산분석(일원배치)을 나타내는 표.

도 20은, 실시예 7의 D-알로오스의 피변 허혈 재환류장해 경감효과에 관한 것으로, 평균값과 표준편차를 도시하는 도면.

도 21은, 실시예 7의 D-알로오스의 피변 허혈 재환류장해 경감효과에 관한 것으로, 다중 비교검정의 결과를 나타내는 표.

도 22는, 실시예 8의 래트 신 허혈 재환류장해에 미치는 희소당의 효과에 관한 것으로, 노던(northern)블롯팅의 결과를 도시하는 도면을 대신하는 사진{도면은 CINC-1의 mRNA의 발현량을 도시하는 것이다. 표준으로서 GAPDH(glycer aldehyde 3-phosphate dehydrogenase)의 mRNA를 취하고, 이것이 대략 일정하다는 것을 확인하였다(사진상). 그 후에, CINC-1의 mRNA의 발현량을 비교하였다. 왼쪽에서부터 허혈전, 허혈후, D-알로오스 투여후 허혈, D-프사이코스 투여후 허혈에 있어서의 신장을 도시한다. CINC-1 mRNA는 허혈 전에는 전혀 발현하지 않았지만, 허혈에 의해 발현하고, D-알로오스와 D-프사이코스 투여에 의해 발현량이 억제되어 있었다}.

도 23은, 실시예 9의 희소당에 의한 해마 신경세포사(死)의 억제효과를 도시하는 도면.

도 24는, 실시예 9의 뇌허혈에 수반하는 신경세포 외로의 글루타민산의 방출, 및 알로오스에 의한 방출억제효과를 도시하는 도면.

도 25는, 실시예 9의 뇌허혈에 수반하는 신경세포 외로의 글루타민산의 방출, 및 2-데옥시글루코오스에 의한 방출억제효과를 도시하는 도면.

도 26은, 실시예 10에서 D-프사이코스가 MCP-1의 분비억제효과가 있음을 도시하는 도면.

도 27은, 실시예 10에서 D-프사이코스가 MCP-1의 분비를 자극하는 사이토카인에 작용하여 MCP-1의 분비를 억제하는 것을 도시하는 도면.

도 28은, 실시예 11에서 D-프사이코스가 마이크로글리아의 출현수에 미치는 영향을 도시하는 도면.

도 29는, 실시예 12에서 D-프사이코스가 인슐린의 분비자극효과에 미치는 영향을 도시하는 도면.

도 30은, 실시예 12에서 사용되는 반전 장관의 실험예를 설명하는 도면.

도 31은, 실시예 12에서 D-프사이코스가 포도당의 흡수에 미치는 영향을 도시하는 도면.

도 32는, 실시예 12에서 희소당 투여에 의한 래트 혈당값에 대한 영향에 관한 것으로, 마취하 생리식염수 투여에 의한 혈당에의 영향을 도시하는 도면.

도 33은, 실시예 13의 희소당 투여에 의한 래트 혈당값에 대한 영향에 관한 것으로, 마취 하에서 D-글루코오스 투여에 의한 혈당에의 영향을 도시하는 도면.

도 34는, 실시예 13의 희소당 투여에 의한 래트 혈당값에 대한 영향에 관한 것으로, D-프사이코스 투여에 의한 혈당에의 영향을 도시하는 도면.

도 35는, 실시예 14의 케토오스의 고혈당상태 개선효과에 관한 것으로, IVGTT에 있어서의 혈중 D-글루코오스 농도에의 영향을 도시하는 도면.

도 36은, 실시예 15의 케토오스의 고혈당상태 개선효과에 관한 것으로, 인슐린의 분비 동태를 도시하는 도면.

도 37은, 실시예 15의 케토오스의 고혈당상태 개선효과에 관한 것으로, 고혈당시에 있어서의 D-프사이코스의 작용을 도시하는 도면.

도 38은, 실시예 15의 희소당에 고혈당하에 있어서의 당화(糖化) 억제효과가 있는지 여부의 검토에 관한 것으로, GA 측정원리를 설명하는 도면.

도 39는, 실시예 15의 희소당에 고혈당하에 있어서의 당화 억제효과가 있는지 여부의 검토에 관한 것으로, 희소당에 의한 글리케이션의 검토를 도시하는 도면.

도 40은, 실시예 15의 희소당에 고혈당하에 있어서의 당화 억제효과가 있는지 여부의 검토에 관한 것으로, 글루코오스 공존하에서의 희소당에 의한 글리케이션의 검토를 도시하는 도면.

도 41은, 이즈모링(Izumoring) 연계도.

도 42는, 도 41의 하단의 이즈모링 C6의 설명도.

도 43은, 도 41의 중단의 이즈모링 C5의 설명도.

「희소당」이란 자연계에 미량 밖에 존재하지 않는 단당이라고 정의할 수가 있다. 본 발명에 있어서도 상기 정의에 의거하는 희소당으로, 바람직하게는 알도오스인 D-알로오스, 또는 케토오스인 D-프사이코스이다. 자연계에 다량으로 존재하는 단당은 D-글루코오스, D-후락토오스, D-갈락토오스, D-만노오스, D-리보오스, D-키시로오스, L-아라비노오스의 7종류이며, 그 이외의 단당은 모두 희소당이다. 또한, 당알콜은 단당을 환원하면 생기는데, 자연계에는 D-소르비톨이 비교적 많지만, 그 이외의 것은 양적으로는 적기 때문에, 그들도 본 발명에 따르는 희소당으로 정의된다. 이들 희소당은 지금까지 입수가 곤란했었지만, 자연계에 다량으로 존재하는 단당으로부터 희소당을 생산하는 방법이 개발되고 있으며, 그 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

이하, 이들 단당의 관계를 더한층 용이하게 이해하기 위해 제안된 Izumoring에 의거한 설명을 부연한다.

도 41에서 도시되는 생산과정을 분자구조(D형, L형)에 의해, 탄소수 4에서 6 의 단당 모두를 연결한 연계도가 이즈모링(Izumoring)의 전체도이다. 즉, 도 41에서 이해할 수 있는 것은, 단당은 탄소수 4, 5, 6 모두가 연결되어 있다는 것이다. 전체도는 이즈모링 C6 중에서의 연결과, 이즈모링 C5 중에서의 연결과, 이즈모링 C4 중에서의 연결과, C4, C5, C6이 모두 연결되어 있는 것이다. 이 생각은 중요하다. 탄소수를 감소시키기 위해서는 주로 발효법을 이용한다. 탄소수가 다른 단당 모두를 연결한다는 큰 연계도인 것도 특징이다. 또한, 이용 가치가 없다는 것도 이해할 수가 있다.

탄소수가 6개인 단당(헥소오스)의 이즈모링은 도 41의 하단 및 도 42에 도시하는 바와 같이, 탄소수가 6개인 단당(헥소오스)은 전부 34종류 있으며, 알도오스가 16종류, 케토오스가 8종류, 당알콜이 10종류 있다. 이들 당은, 산화환원효소의 반응, 알도오스 이성화효소의 반응, 알도오스환원효소의 반응으로 변환할 수 있다는 것은, 본 발명자들의 연구를 포함한 연구로 알려져 있다. 그러나, 지금까지의 연구에서는 위의 그룹, 한가운데의 그룹, 아래의 그룹은 효소반응으로 연결되어 있지 않았다. 즉, 위의 그룹에 속해 있는 D-글루코오스(포도당)나 D-후락토오스는 자연계에 다량으로 존재하는 당이고 염가이지만, 이들로부터 희소당을 합성할 수가 없었다. 그러나, 본 발명자들의 연구 과정에서, 이것을 연결하는 효소가 발견되었다. 그것은 갈락티톨로부터 D-타가토오스를 합성하는 효소를 가지는 균의 배양액 중에, 전혀 예기치 않았던 D-소르보오스가 발견된 것으로부터 시작된다. 그 원인을 조사한 결과, 이 균이 D-타가토오스 3 에피메라아제(DTE)라는 효소를 생산하고 있음을 발견하였다.

도 41의 하단 및 도 42에 도시하는 바와 같이, 이 DTE는 지금까지 절단되어 있던 D-타가토오스와 D-소르보오스 사이를 연결하는 효소임을 알 수 있다. 그리고, 더욱이 놀랍게도, 이 DTE는 모든 케토오스의 3위를 에피화(化)하는 효소이며, 지금까지 합성 접속할 수 없었던 D-후락토오스와 D-프사이코스, L-소르보오스와 L-타카토오스와 D-소르보오스, L-프사이코스와 L-후락토오스 에 작용한다는 매우 폭넓은 기질특이성을 가지는 독특한 효소임을 알 수 있었다. 이 DTE의 발견에 따라, 모든 단당이 링 형성으로 연결되고, 단당 지식의 구조화를 완성하여, 이즈모링(Izumoring)이라 명명하였다.

이 도 42를 잘 보면, 왼쪽에 L형, 오른쪽에 D형, 한가운데에 DL형이 있으며, 게다가 링의 중앙(별표)을 중심으로 하여 L형과 D형이 점대칭으로 되어 있다는 것도 알 수 있다. 예를 들면, D-글루코오스와 L-글루코오스는 중앙의 점을 기준으로 하여 점대칭으로 되어 있다. 게다가 이즈모링(Izumoring)의 가치는 모든 단당의 생산 설계도도 되고 있다는 것이다. 앞서의 예에서, D-글루코오스를 출발점으로 하여 L-글루코오스를 생산하려고 생각한다면, D-글루코오스를 이성화→에피화→환원→산화→에피화→이성화 하면 L-글루코오스를 만들 수 있음을 나타내고 있다.

탄소수가 6개인 단당(헥소오스)의 이즈모링(Izumoring)을 사용하여, 자연계에 다량으로 존재하는 당과 미량으로만 존재하는 희소당의 관계가 나타나 있다. D-글루코오스, D-후락토오스, D-만노오스와, 우유 중의 유당으로부터 생산할 수 있는 D-갈락토오스는 자연계에 많이 존재하고, 그 이외의 것은 미량으로밖에 존재하지 않는 희소당으로 분류된다. DTE의 발현에 의해, D-글루코오스로부터 D-후락토오스, D-프사이코스를 제조하고, 더욱이 D-알로오스, 알리톨, D-탈리톨을 제조할 수가 있게 되었다.

탄소수가 6개인 단당(헥소오스)의 이즈모링(Izumoring)의 의의를 정리하면, 생산과정과 분자구조(D형, L형)에 의해, 모든 단당이 구조적으로 정리되고(지식의 구조화), 단당의 전체상을 파악할 수 있다는 점, 연구의 효과적, 효율적인 어프로치를 선택할 수 있다는 점, 최적의 생산경로를 설계할 수 있다는 점, 결락 부분에 관해서 예견할 수 있다는 점을 들 수 있다.

탄소수가 5개인 단당(헥소오스)의 이즈모링은, 도 41의 중단 및 도 43에 도시하는 바와 같이, 탄소수 6의 이즈모링보다도 작은 링이다. 그러나, C6의 이즈모링과 마찬가지로 알도오스 8개, 케토오스 4개 및 당알콜 4개 모두를 포함하는 것에 변함이 없고, 모두가 효소반응으로 연결된다. 다른 점은, 산화환원반응, 이성화반응 뿐이며, 링 형상으로 모두를 연결할 수 있다는 것이다. 한편, DTE를 이용하는 것에 의해, 더욱 효율이 좋은 생산경로를 설계할 수 있음을 알 수 있다. 탄소수 5의 이즈모링이 점대칭으로 모든 단당이 배치되어 있는 것에 대해, 좌우가 대칭으로 배치되어 있다는 것이 큰 특징이다. 이들 모든 헥소오스는 효소반응에 의해 연결되어 있다는 것에서, 탄소수 6의 이즈모링의 경우와 완전히 마찬가지로, 모든 펜토오스가 구조적으로 정리되어(지식의 구조화), 전체상을 파악할 수 있다는 것, 연구의 효과적, 효율적인 어프로치를 선택할 수 있다는 것, 최적의 생산경로를 설계할 수 있다는 것, 결락 부분에 관해서 예견할 수 있다는 의의를 가지고 있다.

탄소수가 4개인 단당(테트로오스)의 이즈모링은, 도 41의 상단에 도시하는 바와 같이, 테트로오스의 구조상의 특성 때문에, 링이 완성되지 않았다는 특징이 있다. 탄소수 5의 이즈모링 상부 절반의 구조를 가지고 있다. 이 링의 경우에도, 탄소수 5, 6의 경우와 마찬가지의 산화환원 및 이성화 반응에 의해 연결되어 있다. DTE가 탄소수 4의 케토오스와 반응하지 않으므로, 케토오스 사이의 반응은 현재 존재하지 않는다. 그러나, 신규의 에피메라아제의 존재가 예측되며, 이 연구는 현재 연구 중에 있다. 전체의 배치는 탄소수 5와 마찬가지로 좌우 대칭이며, 알도오스 4개, 케토오스 2개 및 당알콜 3개 모두를 포함하고 있다. 즉, 탄소수 5, 6의 이즈모링과 마찬가지의 의의가 존재한다.

이즈모링 C6의 D-글루코오스는, 이즈모링 C5의 D-아라비톨 및 이즈모링 C4의 에리스리톨과 연결되어 있다. 이 선은 발효법에 의해 D-글루코오스로부터 D-아라비톨 및 에리스리톨을 생산할 수 있음을 나타내고 있다. 즉, 이즈모링 C6, 이즈모링 C5 및 이즈모링 C4는 연결되어 있다. 이 연결은 탄소수의 감소라고 하는 주로 발효법에 의한 반응이며, 이 D-아라비톨 및 에리스리톨으로의 전환반응의 2개 이외의 발효법에 의한 이즈모링 C6과 이즈모링 C5, C4의 연결은 가능하다. 예를 들면, D-글루코오스로부터 D-리보오스의 생산도 가능하다. 이와 같이, 3개의 이즈모링에 의해 모든 탄소수 4, 5, 6의 단당(알도오스, 케토오스, 당알콜)이 연결된 것으로, 각각의 단당이 모든 단당 중에서 그 존재 장소를 명확히 확인할 수 있다.

가장 유명한 키시리톨은 미(未) 이용자원인 목질로부터 생산할 수 있는 D-키시로오스를 환원시킴으로써 용이하게 생산할 수 있음을 명확히 확인할 수 있다. 만약 특정의 단당이 생물반응에 의해서 다량으로 얻어진 경우에는, 그것을 원료로 한 새로운 단당으로의 변환 가능성을 용이하게 발견하는 것이 가능하다. 즉, 이 전체상으로부터 모든 단당의 원료로서의 위치를 확실하게 파악할 수가 있으므로, 유용한 이용법을 설계할 수가 있다. 특히 폐기물의 부산물로부터 얻어진 경우의 이용방법을 용이하게 추정할 수 있는 것이다. 희소당의 생산분야뿐 아니라, 희소당이 가지는 생리활성을 탐색하는 연구에 있어서도 유효성을 발휘한다. 예를 들면, 어느 희소당에 생리활성이 판명된 경우, 도 41에서 도시되는 연계도의 존재위치를 확인한다. 그리고 구조가 가까운 희소당에 관한 생리활성과의 비교, 혹은 구조적으로 거울상 관계에 있는 희소당의 생리활성을 검토하는 것으로, 생리활성의 구조를 분자의 구조로부터 유추하는 데에 도움이 될 것이다. 또한, 희소당의 생리기능을 해석하고, 이즈모링 위에 성질을 집적하는 것에 의해, 지금까지 단순한 나열적 이해로부터, 단당 전체를 「단당의 구조」, 「단당의 생산법」, 및 「단당의 생리기능」을 포괄적으로 이해하는 것에 크게 이용할 수 있다고 기대된다.

희소당 중에서, 현재 대량 생산이 가능한 D-알로오스와 D-프사이코스라는 2개의 희소당에 관해서 설명한다.

본 발명에서 이용되는 D-알로오스(D-알로헥소오스)는, 알도오스(알도헥소오스)로 분류되는 알로오스의 D체이며, 융점이 178℃인 6탄당(C₆H₁₂O₆)이다.

그리고, 이 D-알로오스의 제법으로서는, D-아론산락톤을 나트륨아말감으로 환원시키는 방법이나, 또한 쉐이크왓트ㆍ호세인ㆍ브이얀 등에 의한 「저널ㆍ오브ㆍ퍼멘테이션ㆍ앤드ㆍ바이오엔지어링(Journal of Fermentation and Bioengineer ing) 」 제 85권, 539 내지 541페이지(1998년)에 있어서 기재되어 있는, L-람노오스ㆍ이소메라아제를 이용하여 D-프사이코스로부터 합성하는 제법이 있다.

더욱이, 근래에는 일본 특개 2002-17392호 공보에 기재되어 있는, D-프사이코스를 함유하는 용액에 D-키시로오스ㆍ이소메라아제를 작용시켜서, D-프사이코스로부터 D-알로오스를 생성하는 제법이 발명되어 있다.

본 발명의 예를 들면 암세포 증식억제물질에 이용하는 D-알로오스는, 상기 제법 혹은 그 외의 제법 중 어느 것인가에 의해 얻어진 것이어도 좋지만, 상기 일본 특허 2002-17392호 공보에 기재되어 있는 제법에 의하면, 대량생산이 기대되기 때문에, 보다 용이하게 입수할 수 있게 될 것으로 기대된다. 그러나, 지금까지의 제조법은, D-알로오스의 분리회수에 관하여 완전히 만족할 수 있는 것은 아니며, 따라서 공업적인 제조를 하기 위해서는 아직 불경제적인 작업을 필요로 하고 있다. D-알로오스를 분리회수하는 것에 관한 종래기술의 불리한 점 「가장 에너지가 필요한 과정」을 극복하는 것, 즉 효율 좋게 분리회수하는 방법을 제공하는 것, 및 고순도 D-알로오스의 제조에 관해서 기술적으로 실행가능한 연속적 제조법을 제공하는 것을 목적으로 하여, D-알로오스의 결정화법에 의한 분별법과 그 대량생산에의 응용에 대해서 별도 출원중이다(일본 특원평 2003-95828호). 해당 고순도 D-알로오스의 분리회수법은, D-프사이코스의 일부분을 D-알로오스로 변환한 효소반응물인 예를 들면 35% D-프사이코스와 15% D-알로오스의 혼합 용액으로부터 D-알로오스를 회수할 때에, D-알로오스의 에탄올 및/또는 메탄올에 난용성의 성질을 이용하여 D-알로오스를 결정화시키고, 이 D-알로오스의 결정을 분리하는 것을 특징으로 한다. 상기의 방법에 있어서, D-프사이코스를 효소반응으로 D-알로오스로 변환시킬 때에 이용하는 효소는 「L-람노오스이소메라아제」가 예시된다. L-람노오스이소메라아제는, 상기 1998년의 문헌에서 발표된 공지 효소이며, Pseudomonas stutzerii 유래의 효소를 바람직한 것으로 하여 예시된다. 균주 Pseudomonas stutzerii LL172a는 상기 문헌에 기재된 공지 균이며, 카가와(香川)대학 농학부 생물자원식량화학과의 이즈모리 켄(何森健) 연구실에 보존되어 있다. 재단법인 발효연구소로부터 동일한 Pseudomonas stutzerii 는 얻어진다. Pseudomonas stutzerii IFO 3773, Pseudomonas stutzerii IFO 13596이 동일한 활성을 가지고 있다고 생각된다. L-람노오스이소메라아제는 각종 미생물로부터 용이하게 입수가 가능하며, L-람노오스가존재하는 배양조건일 때에 유도적으로 생산된다. 통상, L-람노오스이소메라아제 생산능을 가지는 미생물을 배양하여 얻을 수가 있다. 예를 들면, L-람노오스이소메라아제는 각종 미생물을 L-람노오스를 탄소원으로 하여 배양하면, L-람노오스가 유도제가 되어 균체 내에 생산된다. 효소를 대량으로 구성적으로 생산하는 변이주를 이용하는 것은, L-람노오스 등의 고가의 탄소원을 필요로 하지 않기 때문에 특히 유리하다. 얻어진 배양균주로부터 L-람노오스이소메라아제를 추출한 것, 또는 균체 그 자체를 이용한다. L-람노오스이소메라아제는 사용 목적에 따라 반드시 고순도로 정제된 것이 아니어도 좋고, 조(粗)효소일지라도 이용할 수가 있다. 조효소의 구체적인 예로서는 상기의 L-람노오스이소메라아제 생산능을 가지는 미생물 자체를, 또한 그 배양물이나 부분 정제한 배양물을 이용할 수가 있다. 본 발명에서는 특정의 고정화법에 의한 고정화 효소 또는 고정화 균체의 형태로 이용하는 것에 의해, 송 액압력이 낮고 안정되게 장기간 연속 사용가능한 리액터를 구축할 수가 있다.

상기의 고순도 D-알로오스를 연속적으로 제조하는 방법에 의해, D-알로오스의 분리와 동시에 탈염, 탈이온, 그리고 농축, 결정화를 행할 수 있으며, 종래 모두 별개 공정으로 행하였던 분리 방법을 원스텝으로 통합처리할 수 있다. 따라서, 단시간에 대량의 처리가 가능하다.

본 발명에서 이용되는 D-프사이코스는, 희소당에 속하는 케토헥소오스로 분류되는 프사이코스의 D체이며 6탄당(C₆H₁₂O₆)이다. 이와 같은 D-프사이코스는 자연계로부터 추출된 것, 화학적 또는 바이오적인 합성법에 의해 합성된 것 등을 포함하여, 어느 수단에 의해 입수해도 좋다. 비교적 용이하게는 예를 들면 에피메라아제를 이용한 수법(일본 특개평 6-125776호 공보 등 참조)에 의해 조제된 것이어도 좋다. 얻어진 D-프사이코스액은 필요에 따라 예를 들면, 제(除)단백, 탈색, 탈염 등의 방법으로 제조되고, 농축하여 시럽 상태의 D-프사이코스 제품을 채취할 수가 있으며, 더욱이 컬럼크로마토그래피로 분획, 정제시킴으로써 99% 이상의 고순도의 표품도 용이하게 얻을 수가 있다. 이와 같은 D-프사이코스는 단당으로서 그대로 이용할 수 있는 외에, 필요에 따라서 각종 유도체로서 이용하는 것도 기대된다.

본 발명에 있어서, 생리활성작용 감수 세포란 희소당을 작용시켜서 해당 세포의 기능을 변화시킬 수가 있는 세포를 말하며, 이와 같은 기능을 구비한 세포라면 특별히 한정되지 않는다. 희소당은 해당 세포에 영향을 미쳐서 해당 세포의 기능을 변화시킨다. 희소당의 종류에 따라 생리활성작용이 다르지만, 세포를 이용한 예비실험에 의해 그 작용을 예측할 수가 있으며, 본 실험에 의해 확인할 수가 있다. 해당 세포로서는 바람직하게는 인간 세포이지만, 인간 이외의 세포도 포함한다. 세포의 형태를 생체의 장기, 배양세포 중 어느 것이라도 좋다.

생리활성작용 감수 세포에 희소당의 영향을 미치게 하여 해당 세포의 기능을 변화시키는 작용을 발휘시키기 위해서는, 세포에 희소당을 작용시키는 것에 의해 행한다. 본 발명에 이용되는 희소당은 수용성이며, 작용시키는 형태에는 제한이 없다. 용도에 따라 적절한 수단을 채용하여 희소당을 작용시킬 수가 있다.

희소당을 유효 성분으로 하는 물질의 형태를 이용하여, 세포에 희소당을 작용시키는 것이 바람직하다. 희소당으로서 희소당을 유효 성분으로서 배합한 물질은 어떠한 형태의 것도 포함한다.

희소당 중에서, 알도오스로서 이즈모링에 있어서 D-후락토오스에서 가장 가까운 D-알로오스를, 케토오스로서 D-프사이코스를 2개의 대표적인 희소당으로서 취하여 그 생리활성에 대해서 설명한다.

우선 첫째로, D-알로오스에 대한 예를 나타낸다.

본 발명자들은 알도오스인 희소당이 활성산소의 생산을 억제하는 성질을 가진다는 것을 발견하였다. 본 발명은 알도오스인 희소당을 유효 성분으로 하는 활성산소 생산억제제를 제공할 수가 있다.

즉, D-알로오스가 장기의 허혈 장해를 보호한다는 데이터가 있다. 간 등의 장기의 수술 시에는, 반드시 혈류를 일시적으로 멈춘다. 그 결과, 장기는 허혈 상태에 빠진다. 수술 종료 후, 다시 혈액을 흐르게 하면, 이 때 백혈구로부터 활성산 소가 다량으로 생산되고, 이것이 장기 장해를 일으키는 큰 원인 중의 하나라고 생각되고 있다. 본 발명자들은 희소당을 이용하여 래트에서 90분간이라는 꽤 긴 시간동안 간을 허혈로 하고, 그 후 재환류하여 3개월 후의 생존율을 조사하였다. 통상에서는 3할 정도밖에 생존하지 않았던 것이, 허혈 전에 D-알로오스를 0.2g/kg 환류시켜 두면, 생존율이 약 7할로 증가하였다. 이것을 실증하기 위해서 백혈구를 이용하여 여러 가지 희소당 및 현재 자연계에 다량으로 존재하는 당(포도당 등)을 이용하여, 백혈구로부터의 활성산소의 생산에 대한 효과를 조사하였다. 백혈구로부터 활성산소를 생산시켜 두고 여러 가지 당을 가하면, D-알로오스만이 매우 강한 활성산소의 생산억제효과를 나타내었다. 이것이 장기 보호의 하나의 요인이라고 생각된다.

이와 같은 허혈에 대한 보호작용은 소장, 혹은 뇌의 신경세포사에도 유효하다는 것을 알았다. 신경세포는 허혈에 약하고, 해마의 신경세포는 5분간의 허혈에서도 사멸한다는 것을 알고 있다. 래트의 뇌를 이용하여 5분간의 허혈을 일으키면, 해마의 신경세포의 8할이 사멸하지만, 허혈 전에 D-알로오스를 포함하는 용액으로 환류시켜 두면 5분간의 허혈에서도 약 7할의 생존이 확인되었다. D-프사이코스에서는 이 작용은 인정되지 않았다.

더욱이, 이 허혈 보호 작용은 망막의 허혈의 보호작용이 있다는 것, 피변의 생착율이 현저히 향상된다는 것, 신장 허혈 보호작용이 있다는 것을 증명하고, 뇌신경세포 허혈보호작용이 글루타민산 분비억제에 의한 것임을 알았다.

본 발명자들은, 희소당에 속하는 알도헥소오스(6탄당)가 암세포의 증식을 억 제하는 성질을 가짐을 발견하였다. 본 발명은 희소당에 속하는 알도헥소오스를 유효성분으로 하는 암세포 증식억제제를 제공할 수가 있다. 즉, 인간 암 유래의 주화(株化)세포를 이용한 암세포의 증식에 대한 효과를 조사하였다. 후술하는 실시예에 결과를 나타내고 있지만, 암세포는 샤아레에 뿌려두고, 충분한 영양과 산소를 부여하면 점점 증식한다. 여기에 D-알로오스를 첨가하면 증식을 매우 강력하게 억제한다는 효과가 있음을 알았다. 이 효과는 간암이나 피부암의 세포에 있어서도 마찬가지로 인정되었다. D-알로오스를 유효성분으로 하는 암세포 증식억제제는, 용법으로서는 경구투여여도 좋고, 또한 정맥주사, 동맥주사, 임파관주사 및 질환부위에의 직접주사여도 좋다. 또한, 암세포 증식억제제에 유효성분으로서 함유시키는 것은 D-알로오스에 한정되지 않고, 암세포의 증식을 억제하는 효과(암세포 증식억제효과)를 가지는 다른 알도오스 희소당도 암세포 증식억제제의 유효성분으로서 함유시킬 수가 있다.

더욱이, D-알로오스의 백혈병세포에 대한 영향에 대해서, 임의의 종의 백혈병세포의 증식을 억제하는 것을 확인하여, 세포증식의 억제는 세포주기의 G2-M 기를 연장한다는 D-알로오스의 세포주기에의 영향의 메카니즘을 해명하였다.

다음에, 케토헥소오스의 생리활성에 대한 예를 나타낸다.

이와 같은 희소당에 속하는 케토헥소오스는 당대사에 영향을 미치지 않고, 케모카인 억제물질, 마이크로글리아 유주 억제물질, 인슐린 분비촉진물질 또는 암세포 증식억제물질로서 경구섭취, 복강내 투여, 정맥투여 등 각종 경로로 사용할 수가 있다. 이 경우, 희소당에 속하는 케토헥소오스는 단독으로 또는 희소당에 속 하는 케토헥소오스의 작용에 나쁜 영향을 주지 않는 첨가물을 첨가하거나, 유도체로 하거나, 또한 다른 물질(약리활성 성분)과 병용하여 이용할 수가 있다.

이하, 각 용도로 나누어 본 발명의 실시의 형태를 상세히 설명한다.

본 발명자들은 희소당에 속하는 케토헥소오스가 케모카인의 분비를 억제하는 물질을 가지고 있음을 발견하였다 이것에 의해, 희소당에 속하는 케토헥소오스를 유효성분으로 하는 케모카인 분비억제제 또는 물질을 제공할 수가 있다.

동맥경화증에 기인하는 사망은 사인의 제 1위이다. 동맥경화증의 위험인자로서는 당뇨병, 고지혈증, 고혈압 등이 지적되고 있다. 최근의 보고에 의하면, 이들 위험인자와 동맥경화증 발증의 기구에 대해서, 분자레벨에서의 해석이 진행되고 있다. 동맥경화증 발증의 계기는, 단구의 혈관벽으로의 유주 및 scavenger recepter에 의한 콜레스테롤 축적과 마크로파지의 포말(泡沫)세포화이다. 그 진전에는 각종 사이토사인이나 케모카인의 관여가 시사되고 있다. 특히, 케모카인(세포유주를 일으키는 사이토카인)의 하나인 MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1)은 동맥경화소(巢)의 혈관내피세포로부터 분비되어 단구의 유주에 관계하는 인자이며, 동맥경화 진전에 중요한 역할을 하고 있는 인자로서 주목되고 있다.

MCP-1 또는 MCP-1의 수용체인 CCR2를 녹아웃 시킨 마우스에 있어서는 동맥경화가 일어나기 어렵고, MCP-1이 동맥경화증에 있어서 중심적인 역할을 가지고 있다는 것이 분명하게 되었다.

MCP-1은 IL-1β나 TNF-α라는 염증성 사이토카인에 의해 자극되어 분비된다. 이러한 사이토카인의 생산을 억제하는 약제로서, pyrazolotriazin 유도체 약제나 nitric oxide(NO) 분비유발제가 알려져 있으며, 장기 보존에 사용되고 있다.

염증성 사이토카인ㆍ케모카인 생산억제제로서 호박산메틸프레드니조론나트륨(약효: 부신피질호르몬제)도 시판되고 있다(예를 들면, 파르마시아사, 후지 제약사, 유시피 재팬사, 사와이 제약사).

한편, 당류 또는 그 유도체의 동맥경화치료제로서는, 혈중 콜레스테롤 농도를 저하시키는 헥소오스인산칼슘(글루코오스인산칼슘 등)이 일본 특개평 63-198630호 공보에서 공표되어 있다.

또한, 콜라겐의 합성을 억제하는 피라노피라논 화합물이 일본 특개평 10-330268호 공보에서 공표되어 있다.

그러나, 희소당에 속하는 케토헥소오스 및 그 유도체에 의한 MCP-1 분비의 억제효과나 이것을 이용한 동맥경화억제에 대해서는 아직 알려져 있지 않다.

본 발명에 의해, 희소당에 속하는 케토헥소오스의 MCP-1 분비의 억제효과를 확인하는 것에 의해 희소당에 속하는 케토헥소오스의 동맥경화에 있어서의 유용성 및 임상응용에의 가능성을 증명할 수가 있다. 이하의 실시예에서는, 첫째로 희소당에 속하는 케토헥소오스의 하나로서 D-프사이코스에 의한 혈관내피세포로부터의 MCP-1 분비에 대한 영향에 관해서 검토한다. 또한, 혈관내피세포로부터의 MCP-1 분비를 자극하는 사이토카인 존재하에 있어서의 D-프사이코스의 MCP-1 분비억제효과에 관해서도 검토한다.

이것에 의해, 희소당에 속하는 케토헥소오스는 MCP-1의 분비를 억제하는 것에 의해, 단독으로 또는 다른 물질(약리활성 성분)과 병용해서, 동맥경화증의 예방 또는 치료에 유효하다는 가능성이 시사된다. 또한, 당뇨병, 고지혈증, 고혈압 등의 예방물질, 치료물질로서 기대된다. 또한, 염증성 사이토카인ㆍ케모카인 생산억제물질, 부신피질호르몬제나 항염증제의 대용물질로서의 이용이 기대된다. 더욱이, 장기 보존제로서의 적용도 기대된다.

D-프사이코스는 인슐린 분비를 촉진한다. 인슐린을 분비하는 래트의 췌장β세포주를 이용한 실험에 있어서, 생리적인 분비물질인 D-글루코오스의 농도를 높여가면, 농도에 의존하여 인슐린의 분비가 증가한다. D-글루코오스의 농도를 제로로 해 두고, D-프사이코스의 농도를 높여가면, D-글루코오스와 마찬가지로 농도의존성으로 인슐린을 분비한다는 반응이 보인다. 또한, D-글루코오스를 11.2mM 투여하면 최대로 인슐린이 분비되지만, 그 상태에서 더 D-프사이코스를 가하면 D-글루코오스와 동일 농도 정도까지 가했을 때 더욱 인슐린 분비가 촉진되어, D-글루코오스에서의 최대분비량과 D-프사이코스에서의 최대분비량을 더한 양의 인슐린이 분비된다.

이와 같이, 희소당이 생리활성을 가진다는 것을 잇달아 알게 되었다. 희소당을 세포 외에 투여한 경우, (1) 수송체를 통해 세포 안으로 들어올 가능성, (2) 수용체에 결합할 가능성, 혹은 (3) 세포 내의 대사를 희소당이 존재하는 것으로 변화시킬 가능성, 등이 생각된다. 그들 어느 경로에서도, 필경 정보는 핵에 전달되어 핵의 DNA의 전사에 변화가 일어나고, 단백질의 발현에 변화가 생기며, 그 결과, 세포기능이 변화하는 것이 아닌가 라고 생각하고 있다. D-프사이코스의 인슐린분비의 예를 보더라도, 지금까지 알려져 있는 메카니즘과 다를 가능성이 높다. 희소당의 작용 메카니즘에 관해서는 지금까지 거의 행해지지 않고 있으며, 그와 같은 경우에 있어서 메카니즘을 모색하기 위해서는, 희소당을 처리한 세포 혹은 장기에서의 정보 경로를 해석하는 수법을 취하지 않으면 안된다고 생각하고 있다.

거기서, 본 발명자들은 더욱 연구를 진행시켜, 인슐린 분비촉진작용에 관하여, D-프사이코스가 혈당값을 완만히 억제하는 작용을 동물(래트)에서 증명하고, D-프사이코스가 고혈당 시의 혈당 강하와 인슐린 분비촉진작용이 있다는 것, 및 D-프사이코스에 의해 단백질의 당화가 거의 일어나지 않는다는 것을 확인하였다.

이상, 의약품으로서의 응용을 예로 나타내었지만, 그 외에도 D-프사이코스에서는 동맥경화의 증악 인자인 케모카인 MCP-1의 혈관내피세포로부터의 분비를 억제하는 효과에 더하여, 간에서의 지방의 합성을 억제하는 효과가 있다는 것도 알았으며, 동맥경화 예방작용이나 면역억제작용 등, 여러 가지 생리활성효과의 가능성이 출현하고 있다. 또한, 희소당의 용도로서는 의약품 이외의 가능성에 관해서는 식품, 음료, 특히 기능성식품(비만예방 등), 화장품, 사료, 농약(식물성장조정제, 식물병해저항성 증폭제 등)이 예시된다.

농약의 사용량을 비약적으로 감소시킬 가능성이 있는, 식품에 대해서 병해 저항성을 증폭시키는 작용의 물질을 제공하는 것을 목적으로 하여, 본 발명자들의 다른 그룹은, 희소당에 의한 식물병해저항성 증폭제의 발명을 별도 출원중이다(일본 특원평 2003-95826호). 희소당을, 식물에 대해서 병해저항성을 증폭시키는 작용의 물질로서 이용하는 경우의 이점은, (1) 저농도(100μg/ml)의 희소당 수용액이, 전착제(展着劑) 없이 저항성 유전자를 신속하게 기동시키고, (2) 희소당은 자연계에 미량 밖에 존재하지 않지만, 「천연물」이기 때문에, 안전성이 높은 산포제라는 것이 기대되고, (3) 희소당은 병원균에 대한 작용은 강한 살균작용이 아니기 때문에, 내성균의 발생을 고려할 필요가 없으며, (4) 희소당 단독의 제제로서뿐만 아니라, 살균제와의 혼합 상품 등으로서의 개발이 기대되는 점을 들 수 있다.

식품, 음료 또는 화장품 혹은 사료에 있어서의 배합량은 특별히 한정되지 않지만 0.01∼10중량% 정도가 바람직하다. 의약품의 경우, 캡슐이나 분말, 정제 등으로서 경구투여할 수가 있으며, 물에 녹는다는 점에서 경구투여 이외에 정맥주사, 근육주사 등의 투여방법을 채용하는 것도 가능하다. 투여량은 예를 들면 당뇨병의 증상의 정도나 체중, 연령, 성별 등에 따라 다르며, 사용 시에 적절한 양을 증상에 따라 정하는 것이 바람직하다. 의약품에 있어서의 배합량은 특별히 제한되지 않지만, 체중 1kg 당, 경구투여일 경우 0.01∼2,000mg, 정맥주사투여일 경우 0.01∼1,000mg, 근육주사투여일 경우 0.01∼1,000mg 정도가 바람직하다.

또한, 본 발명의 희소당은 식품 소재에 미량으로 존재하며, 안전성이 높고, 대량생산 기술이 개발되면 코스트면에서도 이용가치가 높은 것이다. 또, 급성경구독성시험에서는 5,000mg/kg 이상이었다.

본 발명의 기능성 식품은, 특정한 질병 등을 예방(비만예방)하는 건강식품, 예방의약품 분야의 이용에 적합하다. 특정한 질병을 예방하는 건강식품에 있어서는, 필수성분인 희소당 외에, 임의적 성분으로서, 통상 식품에 첨가되는 비타민류, 탄수화물, 색소, 향료 등을 적절히 배합할 수가 있다. 식품은 액상 또는 고형의 임의의 형태로 섭취할 수가 있다. 젤라틴 등으로 외포하여 캡슐화한 연캡슐제로서 섭취할 수도 있다. 캡슐은, 예를 들면 원료 젤라틴에 물을 가하여 용해시키고, 이것 에 가소제(글리세린, D-소르비톨 등)를 가하는 것에 의해 조제한 젤라틴 피막으로 만들어진다.

본 발명의 약제에 있어서는, 유효성분인 희소당은 그 자체뿐만 아니라 그것의 약제로서 허용되는 염으로서 사용된다. 이 약제는, 희소당을 단독으로 제제로서 이용하는 것 외에, 제약상 사용할 수 있는 담체 혹은 희석제를 가한 제제 조성물로 가공한 것을 이용할 수도 있다. 이와 같은 제제 또는 약제조성물은, 경구 또는 비경구의 경로로 투여할 수가 있다. 예를 들면, 경구투여용의 고체 또는 액체(겔 및 액체)의 제제 또는 약제조성물은 태블릿, 캡슐, 정제, 환제, 분말, 과립 또는 겔 조제품의 형태를 취하다. 제제 또는 약제조성물의 정확한 투여량은, 그 목적으로 하는 사용형태 및 처리시간에 따라 변화하기 때문에, 담당 의사 또는 수의사가 적당하다고 생각하는 양이 된다. 복용 및 투여용량은 제제형태에 따라 적절히 조정할 수 있다. 정제 등의 경구고형제제, 경구액제 등으로서 1일 복용량을 1회 내지 수회에 걸쳐서 복용해도 좋다. 또한, 예를 들면 시럽이나 트로치, 츄어블정 등 용시 돈복하여 국소에서 작용시킴과 동시에, 내복에 의한 전신성 작용도 발휘시키는 제제 형태에서는, 1일 복용량의 1/2∼1/10을 1회량으로 하여 배합하여 복용하면 좋으며, 이 경우 전 복용량이 1일량을 채우지 않아도 좋다.

반대로, 제제형태에서 봐서 무리한 복용 용량이 되지 않으면 1일 복용량에 상당하는 양을 1회분으로서 배합해도 좋다. 제제의 조제 시에는, 통상 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 붕괴제, 표면활성제, 활택제, 코팅제, 서방화제 등, 활택제나 부형제를 이용할 수가 있다. 그 외에, 필요에 따라서 용해보조제, 완충제, 보존 제, 가용화제, 등장화제, 유화제, 현탁화제, 분산제, 증점제, 겔화제, 경화제, 흡수제, 점착제, 탄성제, 가소제, 흡착제, 향료, 착색제, 교미제, 향산화제, 보습제, 차광제, 광택제, 대전방지제 등을 사용할 수가 있다.

본 발명은 희소당의 항염증작용을 이용하는 피부외용제, 즉 치료약, 피부외용제, 화장료 등이 알려져 있는 피부거침, 거친성질에 대해서 개선ㆍ예방효과를 가지는 피부외용제를 제공할 수가 있다. 본 발명의 피부외용제에는, 희소당을 필수성분으로 하고, 그 이외에 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 수성 성분, 유성 성분, 분말 성분, 알콜류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라서 적절히 배합할 수가 있다. 그 외에, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 구연산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글리콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 베라파밀, 감초추출물, 글라브리딘, 카린의 과실의 열수추출물, 각종 생약, 초산토코페롤, 글리칠리친산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염 등의 약제, 비타민C, 아스코르빈산인산마그네슘, 아스코르빈산글루코시드, 알부틴, 코우지산, D-글루코오스, D-후룩토오스, 트레하로스 등의 당류 등도 적절히 배합할 수가 있다. 본 발명의 피부외용제는, 예를 들면 연고, 크림, 액제, 로션, 팩, 목욕용제 등, 종래의 피부외용제에 이용되는 형태이면 어느 것도 좋고, 제형은 특별히 문제시되지 않는다.

이하, 본 발명의 상세를 실시예에 의거하여 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 하등 한정되지 않는다.

실시예 1

(희소당의 배양세포증식에 미치는 영향)

이하의 조건에 의해, 각종 희소당을 배양액 중에 50mM의 농도로 첨가하고, 각 희소당이 주화 암세포의 증식 진행에 미치는 영향을 조사하였다.

(1) 첨가 대상 세포 : 간암세포(HepG2), 자궁암세포(Hela), 난소암세포(OVCAR3), 피부각화세포(HaCaT)를 첨가하는 대상세포로 하였다.

(2) 첨가한 희소당 : D-알로오스 외에, 비교하는 다른 당으로서 글루코오스, 및 케토오스 희소당의 D-알트로오스를 각 첨가대상세포에 첨가하였다. 또한, 컨트롤로서는, D-후룩토오스를 채용하였다.

(3) 실험방법 : 96구멍의 멀티웰 플라스틱디쉬(웰)에 각 첨가대상세포를 3,000∼5,000개 뿌리고, 세포종에 따라서 5∼10%의 Fetal Bovine Serum(FBS)를 첨가한 매체에서 4∼5일간 배양하였다. D-알로오스, D-글루코오스, D-알트로오스를 각각 50mM의 농도로 각 첨가대상세포에 첨가하였다. 컨트롤로서 D-후룩토오스를 상기와 마찬가지로 50mM의 농도로 첨가하였다. 세포 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해서 24시간 마다 하기의 MTT법에 의해 세포수를 확인하였다.

<MTT법>

① 시약의 조제 : MTT(tetrazolium salt)의 소정량을 오토크레이브에서 멸균한 PBS(-)로 용해하고, 여과멸균하여 MTT용액을 얻는다. 산성용액으로는, SDS의 소정량(20g)에 N,N-디메틸포름아미드 50mL 및 물을 가하여 100mL로 하고, 1N의 염산 약 200mM을 가하여 pH4.7로 조정한다 실온에서 보존하여 사용 전에 37℃로 한다.

② 시험방법 : 세포를 TEP로 처리하고, 세포부유액을 조제한다. 그 세포부유액을 소정수(300∼52000세포/웰), 각 웰에 분주한다(96웰 플레이트 : 배지 0.1mL). 약제로서 당을 소정량 첨가하고, 탄산가스 인큐베이터에서 일주야 전(前)배양한다. 상술한 MTT액 0.5mg/mL를 첨가하고, 탄산가스 인큐베이터 내에서 4시간배양 후, 배지를 완전히 제거한다. 더욱이, 37℃로 유지된 실내에서 산성용액을 0.1mM/웰 의 양으로 가하고, 마이크로플레이트 믹서에 올려 37℃에서 20분간 진동시키면서 용해시킨다(formazan을 산성용액으로 용해시킨다). 분광광도계를 이용하여, 570∼600nm의 파장으로 흡수광을 측정한다. 착색물질(formazan)을 산성용액으로 용해시킨 후, 그대로 플레이트 리더로 흡광도를 측정할 수 있다.

(4) 실험결과 : ① 간암세포(HepG2)…간암세포(HepG2)의 세포수의 경시변화를 도 1에 도시한다. 도 1에 의해, D-알로오스가 HepG2 세포의 증식을 강하게 억제했음을 알 수 있다. D-알트로오스에도 억제작용이 인정되었지만, D-알로오스에 비해 암세포 증식억제효과는 약한 것이었다.글루코오스에는 거의 억제효과가 인정되지 않았다.

② 자궁암세포(Hela)…자궁암세포(Hela)의 세포수의 경시변화를 도 2에 도시한다. D-알로오스는 Hela 세포의 증식을 강하게 억제했음을 알 수 있다.

③ 난소암세포(OVCAR3)…난소암세포(OVCAR3)의 세포수의 경시변화를 도 3에 도시한다. D-알로오스는 OVCAR3 세포의 증식을 강하게 억제했음을 알 수 있다. D-알트로오스에도 억제작용이 인정되었지만, D-알로오스에 비해 암세포 증식억제효과는 약한 것이었다. 글루코오스는 암세포의 증식에 대해서 촉진적으로 작용하였다.

④ 피부각화세포(HaCaT)…피부각화세포(HaCaT)의 세포수의 경시변화를 도 4에 도시한다. D-알로오스는 HaCaT 세포의 증식을 강하게 억제했음을 알 수 있다. 다른 희소당에서는 D-알트로오스에 중등도의 억제효과가 인정되었지만, D-알로오스에 비해 암세포 증식억제효과는 약한 것이었다. 도 1∼도 4로부터, D-알로오스의 암세포 증식억제효과는 세포종에 따라 강도가 다름을 알 수 있다. 알도오스 희소당으로서의 D-알로오스에는 암세포의 증식을 억제하는 효과가 있으며, 제암제로서의 유효 이용이 기대된다. 더욱이, D-알로오스에 비해 케토오스 희소당의 D-알트로오스의 암세포 증식억제효과는 약하다는 것에서, D-알로오스 뿐만 아니라 다른 알도오스 희소당도 제암제로서의 유효 이용을 기대할 수 있다.

실시예 2

(D-알로오스의 암세포 증식억제효과의 농도의존성)

실시예 2로서, D-알로오스의 암세포 증식억제효과의 농도의존성을 조사하였다.

(1) 실험방법 : 첨가대상세포로서, 난소암세포(OVCAR3)를 첨가하고, D-알로오스 농도를 1mM, 5mM, 10mM, 20mM, 50mM, 100mM로서 첨가하였다. 난소암세포(OVCAR3)의 배양방법, 세포수의 계측방법(MTT법) 등의 실험조건은 상기 실시예 1과 마찬가지이다.

(2) 실험결과 : 각 농도의 D-알로오스를 첨가한 난소암세포(OVCAR3)의 세포수의 경시변화를 도 5에 도시한다. 암세포 증식억제효과는 10mM에서 인정되기 시작하여 20mM, 50mM, 100mM 로 점차 강해졌다. 즉, D-알로오스의 억제효과에는 농도의 존성이 인정되었다. 억제효과가 보이는 농도는 본 실시예 2의 실험조건(10% 태아혈청)에서는 10mM이었지만, 이 유효농도는 다른 세포에 있어서도 동일하였다. 더욱이, D-알로오스를 투여한 세포를 현미경으로 보면, 죽은 세포는 거의 없었으며, 이 사실은 트리판블루 색소 배설시험에서도 확인되었다. 본 실험결과로부터는 D-알로오스는 세포증식을 억제하지만, 세포를 죽이는 작용은 없다고 생각된다.

실시예 3

(희소당의 혈액계의 암세포주의 증식에의 영향)

본 실시예는 희소당에 속하는 알도오스를 유효성분으로 하는 암세포 증식억제물질에 관한 것이다. 각종 항종양약ㆍ제암제가 알려져 있지만, 일반적으로 그 부작용이 문제가 되고 있다. 또한, 현재에서는 질환의 치료에 타겟을 둔 약제보다 오히려 그 예방에 타겟을 둔 약제 또는 식품(기능성식품)에 대한 인식이나 기대가 높아져가고 있다. 당과 암과의 관계에서는, 올리고당이 정장작용을 가진다는 것을 이용하여 변비를 해소하여 대장암 등으로 되기 어려운 효과를 가지는 것이나, 최근에는 아가리쿠스 등의 다당체가 암억제효과를 가지는 것 등의 보고, 당쇄와 암전이 등의 관련 보고 등은 있지만, 단당 그 자체가 암세포 증식억제효과를 가지는 것에 대해서는 거의 보고가 없다. 본 실시예에서는, 희소당에 속하는 알도오스나 케토오스의 각종 주화 암세포에 대한 증식의 영향을 검토하였다. 이것에 의해, 희소당에 속하는 알도오스가 주화 암세포의 증식억제가 확인되었다. 당대사에 영향을 미치지 않는 희소당에 속하는 알도오스가 주화 암세포의 증식을 억제시키는 효과가 확인되었다는 것은, 부작용이 적은 암 치료제, 예방제, 증식억제제로서 기대된다. 또한, 희소당에 속하는 알도오스는 기능성식품으로서의 부가가치가 높아지는 것이 기대된다. 또, 희소당에 속하는 알도오스로서는 D-알로오스가 가장 유효하였다.

(1) 목적 : 희소당에 의한 세포주의 증식억제효과를 비교검토하였다.

(2) 방법 : Myeloid(HL-60, THP-1, KG-1), T-cell(MT-2), B-cell(Daudi, KS-1)의 합계 6주(株), 희소당 3종(D-psicose, D-altrose, D-allose)을 사용하였다. 배양액과 각 세포를 1×10⁵개, 총계 1㎖로 되도록 하고, 4일째와 7일째의 세포수를 콜터카운터로 카운트하였다. 당은 각각 0.05, 0.5, 5, 50mM로 첨가하고, 컨트롤에는 D-glucose를 이용하였다.

배지 : FBS 10% 첨가 RPMI1460

배양조건 : 37℃, 5% CO₂

배양용기 : FALCON, MULTIWELL, 12well

배양일수 : 7일간

당 농도 : 0.05, 0.5, 5, 50mM

(3) 결과(도 6∼도 11) : 6주의 세포 중, HL60과 Daudi 세포에 있어서 효과가 인정되었지만, 다른 세포에 있어서는 명확한 영향은 인정되지 않았다.

1) 도 6에 도시하는 바와 같이, psicose와 allose에서 억제가 보였지만, altrose 에서는 보이지 않았다.

① allose ; 당 농도가 높아질수록 7일째의 세포증식억제는 강해지는 경향이었다. 0.05mM; 62.6%, 0.5mM; 67.7%, 5mM; 41.5%, 50mM; 30.7%(glucose를 100%로 한다)

② psicose ; 세포증식억제는 당 농도에는 관련이 없고, 거의 일정하였다. 0.05mM; 84.7%, 0.5mM; 80.7%, 5mM; 84.2%, 50mM; 93.6%, (glucose를 100%로 한다)

2) 도 7에 도시하는 바와 같이, allose에서 억제가 보였지만, psicose와 altrose 에서는 인정되지 않았다.

① allose ; 당 농도가 크게 될 수록 7일째의 세포증식억제는 크게 되는 경향이었다. 0.05mM; 85.9%, 0.5mM; 80.6%, 5mM; 62.2%, 50mM; 3.9%(glucose를 100%로 한다)

3) 도 8 및 도 9에 도시하는 바와 같이, allose 50mM에서 세포증식억제가 보였지만, 다른 당 농도에서는 확실한 억제는 보이지 않았다.

4) 도 10 및 도 11에 도시하는 바와 같이, 컨트롤을 포함하여 모든 당 및 농도에서 억제가 보였기 때문에, 당 자체에 그들 세포에 대한 비특이적인 영향이 있음이 상정되었다.

이상으로부터, D-allose는 HL60, Daudi, KS1, KG1의 4종류의 세포에 있어서 억제효과가 인정되고, 사용한 희소당 중에서 가장 억제효과가 높았다. D-allose의 효과에는 세포의 종류에 따라 차가 있음이 확인되었다.

실시예 4

(D-알로오스의 세포주기에 미치는 영향)

(1) 목적 : 여러 가지 당을 시험한 가운데, D-알로오스만이 밀리M 농도로 암세포의 증식을 억제하였다. 작용 메카니즘은 아직 불명확하지만, 그것을 위해서 D- 알로오스가 세포주기에 미치는 영향을 조사하기로 하였다.

(2) 방법 : 플로우사이토미터에 의한 해석을 행하였다. 사용한 세포는 OVCAR-3(난소암) 세포이다.

1) 세포를 트립신으로 처리하고, 세포부유액을 조제한다.

2) 직경 100mm의 plastic tissue에 세포를 뿌리고 CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한다(overnight).

3) 희소당(D-알로오스 50mM)을 첨가와 무첨가(control로서 D-글루코오스)하고, 3일간 배양한다.

4) 분리한 세포를 PBS(-)로 2회 세정한다.

5) 원심 후 PBS(-) 3㎖를 가하고 피펫팅으로 교반한다.

6) 7㎖ 100% ethanol을 가하고, 4℃에서 2시간 고정시킨다.

7) 1500rpm, 5분간 원심한다.

8) Cold PBS(-)로 2회 세정한다.

9) 원심 후, RNase 200μg/㎖를 가하고, 37℃에서 30분 인큐베이션한다.

10) 0.5㎖ PI(propidium iodide)를 가하고, 15분 인큐베이션한다.

11) 플로우사이토미터로 측정한다.

(3) 결과 : D-알로오스를 첨가한 세포는 세포주기에 있어서 G2-M기의 세포의 비율이 22.6%이고, 컨트롤에서의 세포의 비율 12.6%에 비해 유의하게 많았다(도 12).

(4) 고찰 : 1) 희소당은 지금까지 거의 연구되지 않았기 때문에, 그 생리기능도 거의 알려져 있지 않은 것이 현 상황이다. 그 중에서 D-알로오스는 암세포의 증식을 억제효과가 있다는 것은 지금까지 전혀 알려지지 않은 신규한 작용이다. 2) 그 메카니즘에 대해서는 아직 명확하지 않지만, 이번의 해석에 의해, 세포주기 G2기를 지연시키는 효과가 있음을 알았다.

실시예 5

(희소당의 백혈구로부터의 활성산소의 생산에 대한 영향)

이하의 조건에 의해, 각종 희소당의 백혈구로부터의 활성산소의 생산에 대한 영향을 조사하였다. 여기서는 백혈구로부터의 활성산호 생산에 대한 작용을 L012 화학발광에 의해 조사하였다.

(1) 첨가대상 백혈구 : 래트 백혈구(과립구)를 이용하였다.

(2) 첨가한 희소당 : 알도오스 희소당으로서 D-알로오스 외에, 비교하는 다른 희소당으로서 케토오스 희소당인 D-프사이코스와 D-알트로오스를, 폴리올의 D-탈리톨을 이용하였다. 더욱이, 자연계에 다량 존재하는 당으로서 D-글루코오스와 D-후락토오스를 사용하였다.

(3) 실험방법 : ① 래트 백혈구로부터의 활성산소 생산의 경시변화…래트 백혈구(과립구)에 zymosan 입자를 첨가하는 것에 의해 일어나는 활성산소 생산의 시간경과를 조사하였다. 더욱이, 각 희소당의 존재화에 있어서의 활성산소 생산의 시간경과도 조사하였다.

② 활성산소 생산에 희소당이 미치는 영향…백혈구로부터의 활성산소 생산 계에 대해서, 여러 가지 당을 첨가하여 생산량을 측정하였다. 첨가한 당의 농도는 각각 10mM를 사용하였다. 또한, 당을 첨가하지 않은 조건하에서도 측정을 행하였다.

③ 희소당의 활성산소 생산에 대한 작용…백혈구에 있어서 zymosan 입자를 첨가하여 탐식이 시작되고 활성산소 생산이 시작된 후에 각각 10mM 농도의 각 희소당을 첨가하였다.

④ D-알로오스의 활성산소 생산억제효과의 농도의존성…D-알로오스의 활성산소 생산억제효과의 농도의존성을 조사하였다. D-알로오스 농도를 0mM, 5mM, 10mM로 하여 첨가하였다.

(4) 실험결과 : ① 래트 백혈구로부터의 활성산소 생산의 경시변화…래트 백혈구(과립구)에 zymosan 입자를 첨가하는 것에 의해 일어나는 활성산소 생산의 시간경과를 조사한 결과를 도 13에 도시한다. 활성산소 생산은 2∼3분에서 최대가 되고 그 후에는 수시로 감소되는 것이 판명되었다. 또한, 이 결과는 희소당 존재하에서도 변화하지 않았다.

② 활성산소 생산에 희소당이 미치는 영향…각 당을 첨가하여 생산량을 측정한 결과를 도 14에 도시한다. 활성산소 생산은 D-알로오스만에 의해 억제되었다(n=4). 글루코오스를 비롯하여, 다른 희소당(D-프사이코스, D-알트로오스, D-탈리톨)에서는 전혀 억제가 인정되지 않았다.

③ 희소당의 활성산소 생산에 대한 작용…활성산소 생산이 시작된 후에 희소당을 첨가했을 때의 실험결과를 도 15에 도시한다. 백혈구에 있어서 zymosan 입자 를 첨가하여 탐식이 시작되어 활성산소 생산이 시작된 후에 희소당을 10mM의 농도로 첨가한 경우에는, D-알로오스에 있어서 억제효과가 보였다. 본 실시예 5에 의해, 활성산소의 생산의 시간적 경과는 희소당의 존재에 구애되지 않고 동일하다는 것이 판명되었다. 또한, 조사한 희소당 중에서는, D-알로오스에 특이적으로, 활성산소의 생산을 억제하는 효과(활성산소 생산억제효과)가 있음이 판명되었다.

④ d-알로오스의 각 농도에 있어서의 활성산소 억제효과의 실험결과를 도 16에 도시한다. 이 결과, 이 계에 있어서는 5mM에서는 작용이 발현되지 않고, 10mM이 되어 처음으로 50% 이상의 억제효과가 발현되었음이 판명되었고, D-알로오스의 유효농도는 10mM 근처임이 판명되었다. 또한, 본 실시예 10 및 상기 실시예 5에 의해, D-알로오스에는 활성산소의 생산을 억제하는 작용이 있음이 판명되었다. 다른 알도오스에 관해서도 이 작용이 있다는 것도 예상되며, 금후의 과제로서 조사해 나가지 않으면 안된다.

이 활성산소 생산억제효과는 폭넓은 활성산소가 관련되는 병태ㆍ질환에 대해서 유효하고, 금후 치료약, 기능성식품, 외용제 등으로서 응용 가능성이 있다고 생각된다. 예를 들면, 뇌신경계질환(일과성 뇌허혈발작, 뇌졸중, 파킨슨증후군, 외상성간질병, 척수손상 등), 심혈관계질환(동맥경화증, 뇌허혈성심근상해 등), 호흡기질환{Adult respiratory distress syndrome(ARDS), 간질성폐렴, 폐선유증, 바이러스성폐렴 등}, 소화기질환(위점막병변, 간의 허혈ㆍ재순환장해, 황담병태, 췌장염 등), 신장질환(사구체신염, 급성신부전, 만성신부전, 요독증 등), 당뇨병, 암, 안과질환(망막변성, 미숙아망막증, 백내장, 안염증, 각막질환 등), 피부질환(아토피 성피부염, 반점, 주근깨, 색소침착, 피부의 노화 등), 교원병(膠原病) 등을 위한 치료약에의 응용이나, 그 외의 용도로서도 장기보존제, 각종 장기 간(幹)세포 보존제, 정자ㆍ난자 보존제로서도 응용의 가능성이 있다. 또한, 본 실시의 형태에서는, 알도오스 희소당으로서, D-알로오스를 이용하고 있지만, 활성산소 생산억제효과를 가지는 다른 알도오스 희소당도 상기와 같은 용도에의 응용의 가능성이 있다.

실시예 6

(망막허혈ㆍ재환류장해에 대한 희소당의 효과)

(1) 목적 : 일과성안허혈모델(래트)에 대해서 D-알로오스의 망막에 대한 영향을 검토한다.

(2) 방법 : 일과성안허혈모델은 안압을 120mmHg 정도까지 상승시킴으로써 제작하였다. 45분간의 허혈을 행하고, 그 후 재환류를 행하였다. 마이크로다이알리시스법에 의해 허혈재환류시에 방출되는 글루타민산 농도를 측정하였다.

(3) 결과 : 도 17에 도시하는 바와 같이, D-알로오스를 허혈 전에 정맥내 투여(200mg/kg 체중)하는 것에 의해, 허혈시의 글루타민산 농도는 컨트롤(D-알로오스 비투여)에 비해 억제되고, 또한 재환류시에는 완전히 억제되었다.

(4) 고찰 : 망막의 허혈ㆍ재환류장해에 있어서는, 해마의 신경세포의 그것과 마찬가지로, 다량의 글루타민산의 방출에 의한 신경독성이 있음이 지적되고 있다. D-알로오스가 글루타민산의 방출을 억제하는 것은 D-알로오스가 망막신경 보호효과를 가질 가능성을 강하게 시사하고 있다.

실시예 7

(희소당(D-알로오스)의 피변허혈재관류(灌流)장해 경감효과에 관한 실험)

(1) 목적 : 본 발명자들은 지금까지의 기초연구에서, 섬 형상 피변의 허혈재관류 후의 피변괴사 및 난주(亂走)피변원위부의 괴사 메카니즘의 해명에 열중해 왔다. 그 결과, 섬 형상 피변의 허혈재관류 후의 괴사 및 난주피변원위부의 괴사에 활성산소가 관여하고 있음을 밝혔다. 또한, 섬 형상 피변의 허혈재관류 후의 괴사 및 난주피변원위부의 괴사에는, 혈종이나 염증에 의해 생산되는 활성산소가 관여하는 것도 시사되어 있다. 본 실시예 7은, 희소당의 활성산소 생산억제작용의 기초적 데이터를 얻는 것을 제 1의 목표로 하고, 섬 형상 피변 및 난주피변의 괴사를 효과적으로 예방하기 위한 임상응용을 제 2의 목적으로 한다. 더욱이, 유리피변, 절단지의 장기보존에 있어서의 보존액으로서의 응용 및 혈행재개 후의 재관류장해 예방법을 개발하는 것을 제 3의 목적으로 한다. (2) 실험방법 : 1) 위스타계 래트(♂, 7∼8주, 300g에 약간 못미치는 정도)에 펜토바비탈(넨브탈)을 복강 내 투여하여 마취를 한다. 2) 헤어커터로 복부전체를 깎는다. 3) 좌(左)대퇴 동정맥을 혈관줄기로 하는 3×5cm의 섬 형상 피변을 좌복부에 작성한다. 4) 거상(擧上)시킨 피변은 4-0 나이론실을 이용하여 원래의 위치에 봉합한다. 5) 약제(모두 0.6㎖)를 우(右)대퇴 정맥으로 단번에 정주한다. 투여하는 약제는, 각종 농도의 D-알로오스, 글루코오스(0.2mg/g), 생리식염수.

6) 약제를 투여하여 15분간 기다린 후, 혈관줄기를 동정맥과도 클램핑한다. 클램프에는 배스큘러 클립(정맥용 60g)를 2개 사용하였다.

7) 레이저 도플러 혈류계를 이용하여 혈행이 완전히 차단된 것을 확인한다.

8) 8시간 후, 클램프를 분리한다. 마찬가지로, 레이저 도플러 혈류계를 이용하여 혈행이 재개된 것을 확인한다.

9) 1시간 후에 피변의 생사를 판정한다.

10) 디지털카메라로 촬영한 후 컴퓨터에 입력하여 생착 면적(%)을 면적계산 소프트로 계산한다.

(3) 실험군 : 하기의 6군 ; 각 군 모두가 n=15

1) D-알로오스 : 150mg(0.5mg/g)

2) D-알로오스 : 60mg(0.2mg/g)

3) D-알로오스 : 30mg(0.1mg/g)

4) D-알로오스 : 15mg(0.05mg/g)

5) D-글루코오스 : 60mg(0.2mg/g)

6) 생리식염수(컨트롤)

(4) 결과(도 17∼도 20) : 생착 면적(%)의 모든 데이터를 도 18에, 분산분석(일원배치)의 결과를 도 19에, 평균값과 표준편차를 도 20에, 다중비교검정(Fisher's PLSD)의 결과를 도 21에 도시한다. 다중비교검정은 p<0.05로 유의차 있음 이라고 판정하였다.

30mg(0.1mg/g) 이상 D-알로오스를 투여한 1), 2), 3)의 3군은, 생리식염수 투여군 6)에 대해서 모두 통계적 유의차가 인정된다. 더욱이 1), 2)의 2군은 글루코오스 투여군 5)에 대해서도 통계적 유의차가 인정된다. 그러나, D-알로오스를 15mg(0.05mg/g) 투여한 4)는 생리식염수 투여군 6)이나 글루코오스 투여군 5)에 대 해서 통계적 유의차가 인정되지 않는다. 따라서, D-알로오스는 D-글루코오스와 달리 피변 생착 면적의 연장 효과가 있으며, 그 효과 발현에는 30mg(0.1mg/g) 이상의 투여가 필요하다고 말할 수 있다.

(5) 고찰 : 상기의 실험에 의해 D-알로오스에 피변 허혈 재관류장해 경감효과가 있음이 증명되었다. 이 기구가 어떠한 작용에 의한 것인가를 검증할 필요가 있다. 우리들은 D-알로오스가 항산화작용을 가지는 것이 아닌가 하고 생각하고 있다. 이 증명을 위해서는, 각종 산화스트레스의 지표를 측정할 필요가 있다. 우선, 피변 조직중의 과산화지질을 TBA(티오바비탈)법에 의해 경시적으로 측정할 것, 4-hydroxy-2-noneal-modified protein(HNE에 의한 면역염색으로부터 측정)이나 백혈구수(HE 표본으로부터 측정) 등의 다른 파라미터도 측정할 필요가 있다.

작용 기구의 개요를 앎으로써, 어떤 타이밍으로 투여하는 것이 가장 효과적인가를 검토하는 것이 가능하다. 현재는 피변 거상 직후(피변의 혈관줄기를 클램프하는 15분전)에 경정맥적으로 전신 투여하고 있지만, 혈관줄기의 클램프를 해제하기 직전에 전신 또는 국소투여해 보는 실험을 계속해야 한다고 생각하고 있다. 또한, 최적투여량에 관해서도 재검토하고, 최적투여량ㆍ가장 효과적인 투여방법(타이밍)이 판명된 시점에서, 기존의 항산화제(SOD, 알로프리놀 등)와 효과를 비교해 보는 것이 필요하다고 생각하고 있다. 금후의 전망으로서, 피변 보호작용이 있는 주사약 또는 연고의 개발로 연결된다고 생각하고 있다. 효과적인 피변 괴사예방약이 개발되면, 피변에 의한 수술성적이 비약적으로 향상된다. 또한, 절단지의 보존이 가능하게 되면, 긴급 수술로 재접착술을 행할 필요가 없어지며, 대기수술로서 정시 에 행할 수가 있게 된다.

(6) 참고문헌 : 1) Ashoori F, Suzuki S, et al : Involvement of lipid peroxidation in necrosis of skin flaps and its suppression by ellagic acid. Plast Reconstr Surg. 94 : 1027-1037, 1994.

2) Um SC, Suzuki S, et al : Formation od 4-hydroxy-2-noneal-modified proteins and 3-nitro-L-tyrosine in rat island skin flaps during and after ischemia. Ann Plast Surg, 42 : 293-298, 1999.

3) 사토 미키(佐藤美樹), 스즈키 시게히코(鈴木茂彦), 무네우치 겐(宗內嚴) : 피변허혈재관류장해시에 있어서의 조직내 Galectin-9의 발현변화. 일본 형성외과학회회지, 22 : 428-433, 2002.

4) Yagi K : A simple fluorometric assay for lipid peroxide in blood plasma. Biochem Med. 15 : 212-216, 1976.

5) Ohkawa H, Ohishi S, Yagi K : Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem, 95 : 351-358, 1979.

실시예 8

(래트 신허혈 재관류장해에 미치는 희소당의 효과)

(1) 목적 : 쇼크나 신허혈을 수반하는 수술시 등에서, 급성신부전은 생명예후에 악영향을 미치는 중독한 합병증의 하나이다. 거기서, 지금까지 신허혈성 장해에 대해서는 ischemic preconditioning이나 각종 약물의 유효성이 검토되고 있다. 이번에는 래트 신허혈 재관류장해 모델을 사용하여 신허혈성 장해에 미치는 희소당 의 효과를 검토하였다.

(2) 방법 :

대상…체중 300g 전후의 웅성(雄性) 래트

실험방법…래트를 넨브탈로 마취한 후에 신허혈 모델을 제작.

신허혈…우신장을 적출 후, 좌신장 혈관을 45분간 클램핑하는 것으로 제작.

사용약제…D-알로오스, D-프사이코스(모두 400mg/kg)를 신허혈 30분전에 정맥내 투여한다.

측정항목…장해성 인자인 cytokine-induced neutrophil chemoattractant (CINC)-1 mRNA(재관류 2시간후)의 발현에 미치는 영향.

(3) 결과(도 22) : 노던블롯팅의 결과를 도 22에 도시한다. 재관류 2시간후의 CINC-1 mRNA의 발현량은 알로오스, 프사이코스 모두 감소되어 있는 것으로 생각된다.

(4) 고찰 : 본 실시예 8에서는, 단 1회의 예비실험의 결과이기 때문에, 금후 회수를 거듭하여 필요농도 등 효과의 검토를 행할 필요가 있다. CINC-1 mRNA의 발현량 뿐만 아니라, CINC-1 단백질에 미치는 영향도 검토해야 할 것으로 생각된다. 신허혈 장해에 대한 희소당의 유효성을 입증할 수 있다면, 쇼크, 신허혈을 수반하는 수술시 등 새로운 치료약 및 수액제제의 개발로서 유망할 것으로 생각된다.

실시예 9

(희소당의 뇌허혈 보호작용의 연구)

(1) 목적 : 일과성의 뇌허혈에 수반하여, 해마의 신경세포가 죽음에 이르는 것으로 알려져 있다. 이 원인은 명확하지 않지만, 몇가지 가능성이 있는 가설이 제안되어 있으며, 현재 많은 연구자가 이들 가설의 증명을 행하고 있다. 우리들도 이 모델을 이용하여 연구를 하고 있지만, D-알로오스의 전투여에 의해 이 세포사가 억제되는 것을 밝혔다. 더욱이, 보다 상세한 투여량의 결정이나, 작용 기구의 일부를 밝혔다.

(2) 방법 : 모래쥐를 이용하여 5분간의 양측성의 총경동맥을 폐색(閉塞)한다. 1주일 후에 새크리파이싱(sacrificing) 하고 상법(常法)에 따라 절편 작성을 행하여, 헤마톡실린 ㆍ에오딘 염색을 행한다. 현미경하에서 해마의 신경세포수를 카운트하고, 잔존율을 계측하였다. 정상 컨트롤 군(群), 허혈을 부여했을 뿐인 군, 200mg/kg의 D-알로오스 또는 D-프사이코스를 허혈전에 투여한 군으로 실험을 행하였다. 허혈에 수반하여 세포외로 방출되는 대량의 글루타민산이 신경세포에 독성을 가지는 것이 알려져 있다. 이것을 밝히기 위해서 뇌 정위(定位) 고정장치에 모래쥐를 고정시킨 후, 해마에 글루타민산옥시다아제를 용해한 액을 마이크로다이알리시스용의 프로프에 환류시켜, 해마의 신경세포외의 글루타민산 농도를 실시간으로 측정하였다. 또한, D-알로오스나 2-데옥시글루코오스의 전투여를 행하여, 허혈에 수반하는 글루코오스의 대사와 D-알로오스의 작용기구의 관련성을 밝혔다.

(3) 결과 : D-알로오스는 허혈에 수반하는 신경세포사를 유의하게 억제하였다. 그러나, D-프사이코스에서는 이 억제효과는 인정되지 않았다(도 23). 허혈에 수반하여, 해마에서는 글루타민산은 이상성(二相性)으로 분비된다(도 24). 최초의 피크는 허혈에 수반되는 것으로, 제 2의 피크는 허혈 종료후의 과(過)환류시에 수 반되는 것이다. 이 과환류는 1시간 정도 지속되고, 이 과환류시에 신경세포가 장해를 받는 것으로 생각되고 있다. D-알로오스의 전투여에 의해, 첫 번째의 피크는 일부 억제되었지만, 그 억제는 25% 정도였다. 그러나 2번째의 피크는 D-알로오스의 투여에 의해 90% 전후로 강하게 억제되었다(도 24). 또한 이와 같은 효과는 비대사성의 D-글루코오스 관련물질인 2-데옥시글루코오스 투여에 의해서도 마찬가지의 결과가 관찰되었다(도 25).

(4) 고찰 : D-글루코오스는 신경활동에는 필수의 것임과 동시에, 과부족에 수반되는 세포독성을 초래한다는 사실은 잘 알려져 있다. 또한 허혈과 같은 강한 스트레스가 주어지고, 또한 산소의 공급이 중단된 경우에는, 강한 세포독성을 발휘한다. 아마도 이것은 활성산소의 발생을 수반하는 세포장해라고 생각된다. D-알로오스는 D-글루코오스 대사에 어떤 영향을 주어서, 신경세포사를 억제하는 것이라고 생각된다. 이것은 비대사성의 2-데옥시글루코오스의 투여에 의해서도 마찬가지의 효과가 초래되었다는 사실로부터 증명되었다. 한편, 뇌허혈에 있어서의 D-글루코오스 소비는 신경세포뿐만 아니라, 성상(星狀) 글리아세포에서도 일어나고 있으며, 양자가 D-글루코오스를 서로 받아들일 가능성이 시사되었다. 성상 글리아세포에 있어서의 D-글루코오스 소비는 최종산물이 신경과는 다르며, 혐기적 대사계가 작용하여 유산이 방출되는 것으로 보고되어 있다. 예비적인(preliminary) 데이터이지만 실제로 허혈시에 있어서의 유산분비가 관찰되고 있다는 점에서, D-알로오스의 작용부위의 일부는 성상 글리아세포가 아닐까 하고 추측된다. 또한, 글루타민산 방출의 2번째의 피크는 활성산소에 의해서도 나타날 가능성도 있다.

실시예 10

(케토헥소오스에 의한 동맥경화 증악에 관련하는 케모카인 MCP-1의 분비억제작용)

인간혈관내피세포(HUVECs)를 상법에 따라서 배양액(DMEM+10% FBS)의 조건하에서 세포배양을 행하였다. HUVECs를 약 70%의 농도로 96구멍 배양 디쉬에 분주하여 이하의 실험에 제공하였다.

(실험 1)

D-프사이코스 농도를 0mM, 5.6mM, 11.2mM로 HUVECs 의 배양액에 첨가하고, 24시간 배양후, 배양액 중의 MCP-1을 ELISA(Quantikine, R＆D) 키트로 측정하여, 결과를 도 26에 도시하였다.

(실험 2)

HUVECs에 작용하여 MCP-1의 분비를 자극하는 사이토카인, IL-1β(최대분비자극농도 1ng/mL) 및 TNF-α(최대분비자극농도 10ng/mL)로 1시간 HUVECs를 전처리하고, 이어서 D-프사이코스를 0mM, 5.6mM, 11.2mM의 농도가 되도록 첨가하여 24시간 배양후의 배양액 중의 MCP-1 농도를 ELISA 키트로 측정하여, 결과를 도 27에 도시하였다. 도 26으로부터, 혈관내피세포에 있어서의 MCP-1의 기초분비에 관하여, D-프사이코스는 농도의존적으로 MCP-1의 분비를 억제하는 것이 이해된다. 또한, 혈관내피세포에 있어서의 MCP-1의 분비는 사이토카인(TNF-α, IL-1β)에 의해 자극되며, 최대자극농도는 각각 IL-1β가 최대분비자극농도 1ng/mL이며, TNF-α가 최대분비자극농도 10mg/mL이다. 도 27로부터, 혈관내피세포를 IL-1β(1ng/mL)로 자극하면 MCP-1이 분비되고, 그 분비는 첨가된 D-프사이코스에 의해 농도의존적으로 억제된다는 것이 이해된다.

일반적으로, 각종 혈구 성분에 대한 유주 활성을 가지는 사이토카인인 케모카인의 하나로서의 MCP-1은 단구에 대한 유주 활성을 가지고 있으며, 생리적으로는 염증병소에 있어서의 단구ㆍ마크로파지의 집적에 중요한 역할을 담당하고 있다. 또한, 임상적으로는 동맥경화소(巢)의 형성에 있어서 혈관내피세포의 장해에 이어서, 포말세포형성을 위한 세포성분의 유주에 중요한 역할을 담당하고 있다. 최근, 동맥경화소의 면역염색에서, 동맥경화병변에 있어서의 MCP-1의 과잉발현이 지적되고 있다.

이상의 실험에 의해, 혈관내피세포로부터의 케모카인 MCP-1의 분비가 희소당에 속하는 케토헥소오스에 의해 억제된다는 것이 판명되었다. 또한, 동맥경화소에 있어서의 MCP-1의 발현은 각종 사이토카인에 의해 자극되고 있으며, 특히 IL-1β, TNF-α는 중요한 인자로서 위치 부여되어 있지만, 이상의 실험에 의해 적어도 IL-1β에 의한 MCP-1의 분비자극을 희소당에 속하는 케토헥소오스가 억제한다는 것이 시사되었다.

MCP-1은 동맥경화 병변 형성에 중요한 역할을 담당한다는 것이 지적되고 있으며, 희소당에 속하는 케토헥소오스의 MCP-1 분비억제효과는, 동맥경화예방의 관점에서도 중요하고, 동맥경화치료에 유익한 물질(예를 들면, 동맥경화치료물질이나 예방물질)에의 용도가 될 수 있다고 생각되었다.

이들 결과로부터, 희소당에 속하는 케토헥소오스는, 그 단독으로 MCP-1 분비 를 억제하는 물질로서의 용도에 이용할 수 있다. 또한, 그 유도체나 배당체에 관해 검토하면, MCP-1 분비를 억제하는 물질이 생길 가능성이 시사된다. 또한 MCP-1은 동맥경화증 뿐만 아니라, 다른 질환 발증에 관여하고 있음이 지적되고 있다. 예를 들면 만성관절류마티즘에 있어서의 관절에서의 염증 야기에 MCP-1의 관여가 지적되고 있다. 또한 천식 등의 폐질환에 있어서도 단구의 유주 및 단구ㆍ마크로파지의 활성화를 거쳐서 질환형성에 관여하고 있다. 이와 같은 국소의 염증, 및 단구ㆍ마크로파지가 관여하는 질환에 있어서 희소당에 속하는 케토헥소오스는 질환의 활동성을 조절할 가능성이 있으며, 폭넓은 질환의 치료약으로서의 응용이 기대된다.

실시예 11

(케토헥소오스에 의한 마이크로글리아 유주억제작용)

본 실시예 11은, 희소당에 속하는 케토헥소오스를 유효성분으로 하는 마이크로글리아 유주억제물질에 관한 것이다. 생체내의 장기는 장시간 혈류가 중단되어 허혈상태에 빠지면 괴사에 빠진다. 허혈상태는 장기의 수술시에 혈류를 일시차단하여 수술후에 재개하는 경우에 반드시 생긴다. 또한, 장기이식 등으로 장기를 적출보존하고 이식하는 경우에도 마찬가지이다. 장기보존법에는 단순냉각법, 지속관류법, 동결법 등이 있지만 현재 가장 임상적으로 응용되고 있는 것은, 단순냉각법이다. 이것은 장기적출시에 보존액으로 관류시키고, 적출후에 마찬가지의 냉각시킨 보존액에 침지시키는 방법이다. 현재에서는 Belzer 등 Wisconsin 대학 외과의 그룹에 의해 개발된 University of Wisconsin(UW) 액에 의해 비약적으로 보존시간이 연장되었고, 주로 이것이 사용되게 되었다. 그러나, 보존종료 후의 혈류 재개시에는 장기에 대해서 활성산소, 세포외 프로테아제 및 사이토카인 등에 의한 장해성 변화가 출현한다. 이것을 억제할 목적으로 각종 약제(pyrazolotriazin 유도체 약제나 nitric oxide(NO) 분비유발제 등)를 관류액에 첨가하는 방법이 제창되고 있지만 임상적으로 아직 충분하지 않다{마츠모토 코지(松本光司) J Nippon Med Sch 제 68권 제 3호, 2001년}.

거기서, 본 실시예 11에서는, 희소당에 속하는 케토헥소오스의 마이크로글리아 유주억제효과를 확인하는 것에 의해 희소당에 속하는 케토헥소오스의 뇌장기보존에 있어서의 유용성 및 임상응용에의 가능성에 관하여 검토한다.

이하의 본 실시예 11에서는, 허혈로 출현하는 마이크로글리아의 수에 미치는 희소당에 속하는 케토헥소오스의 영향에 대해서 검토한다. 이것에 의해, 희소당에 속하는 케토헥소오스는 마이크로글리아의 출현수를 감소시켜서 뇌장기보존에 있어서의 유용성 및 뇌의 치료에의 임상적응용에 유효하다는 것이 시사된다. 또, 희소당에 속하는 케토헥소오스로서는 D-프사이코스를 사용하였다. 뇌허혈 모델로서, 체중 70kg 정도의 웅성 모래쥐의 양측 총경동맥을 5분간 결찰하는 모델을 사용한다. 이 모델에서는, 뇌의 해마 CA1 영역의 신경세포가 특이적으로 허혈성 세포사를 일으킨다.

허혈을 행하지 않는 대상(컨트롤 : Sham), 허혈+생리식염수 처리, 허혈+D-프사이코스 처리의 각 3예의 각 군으로 나누어서 비교 검토하였다.

D-프사이코스 처리로서는, 생리식염수 중에 D-프사이코스를 용해시켜서 농도 200mg/mL의 D-프사이코스 용액으로 하고, 허혈전 5분과 허혈직후에 각각 200mg/kg 씩 대퇴정맥으로 허혈모델에 투여하였다. 생리식염수 처리로서는, D-프사이코스 용액 대신에 생리식염수만을 마찬가지로 투여하였다. 허혈 후 1주일간 관류 고정하고, 20μm의 동결 뇌절편을 작성하고, 헤마톡실린ㆍ에오딘 염색을 행하였다.

결과를 도 28에 도시하지만, 염증세포인 마이크로글리아의 출현수가 D-프사이코스의 첨가에 의해 감소되었고, 마이크로글리아의 유주가 D-프사이코스의 투여에 의해 확실하게 억제된 것이 이해된다. 이 허혈 모델에서는, 염증세포인 마이크로글리아의 유주는 D-프사이코스의 투여에 의해 억제되었다. 일과성 뇌허혈 시에는, 해마의 신경세포사가 일어나며 증상으로서 기억장해가 수반되는 것이 알려져 있다. 뇌허혈에 의한 신경세포사에 관해서는, 약제나 저체온요법 등으로 일시적으로 허혈성 신경세포사를 억제한 후에도, 뇌 글리아세포의 일종인 마이크로글리아가 글루타민산이나 활성산소를 방출하여, 치료후의 만성적인 세포사에 관여한다는 것이 지적되고 있다. 이것에 의해, 이러한 마이크로글리아의 작용을 억제하는 것도, 뇌의 허혈보호나 이식시 보존에 관해 유용하다고 말할 수 있다. 따라서, D-프사이코스는 약제나 저체온요법 등 다른 치료법과의 병용으로 그 치료효과를 높이는 것이 기대된다.

실시예 12

(케토헥소오스의 혈당강하에 관련하는 작용)

본 실시예 12는, 희소당에 속하는 케토헥소오스를 유효성분으로 하는 혈당강하작용물질에 관한 것이다. 당뇨병은 내당능 이상도 포함하면 1000만명을 훨씬 넘는 국민병으로 되어 있다. 당뇨병의 본태는 글루코오스에 의한 특이적인 인슐린 분 비 부전이며, 췌장으로부터의 인슐린 분비가 감소된 상태 및 그 작용부족 때문에 발증하는 대사질환이라고 생각되고 있다. 일반적으로 인슐린 분비를 촉진하는 약제로서, 설포닐요소계나 페닐알라닌 유도체 등의 당뇨병 치료약이 있지만, 부작용 등 각종 문제점이 있다. 거기서 본 실시예 12에서는, 희소당에 속하는 케토헥소오스의 당뇨병에 있어서의 유용성 및 임상응용의 가능성에 관하여 검토하였다. 첫째로, 희소당에 속하는 케토헥소오스에 의한 췌장β세포로부터의 인슐린 분비 자극능에 관해 글루코오스와 비교하여 검토하고, 또한 글루코오스와 희소당에 속하는 케토헥소오스의 공존하에 있어서의 췌장β세포로부터의 인슐린 분비 동태에 관하여 검토한다. 또한 글루코오스는 음식물이 소화분화되어 장으로부터 흡수되어 공급되고 있기 때문에, 글루코오스 흡수에 있어서의 희소당에 속하는 케토헥소오스의 영향에 관하여 장관(腸管)을 이용하여 검토한다. 이것에 의해, 희소당에 속하는 케토헥소오스는 인슐린의 분비를 촉진하는 효과가 있고, 특히 글루코오스와 병용하는 것에 의해 가산적(추가적)으로 인슐린의 분비를 촉진시킨다는 것, 또한 당 대사에 영향을 미치지 않는 희소당에 속하는 케토헥소오스가 글루코오스의 흡수를 억제하고 있다는 것에 의해, 희소당에 속하는 케토헥소오스의 당뇨병의 예방 또는 치료에의 유용성이 시사된다.

인슐리노마 유래의 췌장β세포주 INS-1을 상법에 따라 배양액(DMEM+10% FBS)의 조건하에서 세포배양을 행하였다. INS-1 세포를 약 70%의 밀도로 96구멍 배양 디쉬에 분주하고 이하의 실험에 제공하였다. 희소당에 속하는 케토헥소오스로서는 D-프사이코스를 사용하였다.

(실험 1)

배양액의 글루코오스 농도를 2.8mM, 5.6mM, 11.2mM, 16.7mM 로 하고 24시간 배양한 후, 배양액 중의 인슐린 농도를 ELISA(레피스 인슐린 키트)로 측정하였다. 이 결과, 인슐리노마 유래의 췌장β세포주 INS-1 세포는 배양액 중의 글루코오스 농도에 반응하여 인슐린 분비가 자극되었다. 이 분비 자극은 글루코오스 농도 11.2mM에서 평탄역(plateau)에 달하였다.

(실험 2)

배양 후의 D-프사이코스 농도를 0mM, 2.8mM, 5.6mM, 11.2mM, 16.7mM으로 바꾸었을 때의 배양액 중의 인슐린 농도를 ELISA으로 측정하여 결과를 도 29에 도시하였다. 이 결과, 췌장β세포주 INS-1 세포를 각종 농도의 D-프사이코스로 자극하면, 농도의존적으로 인슐린 분비가 인정되었다. 이 분비 자극은 D-프사이코스 농도 11.2mM에서 평탄역에 달하였다.

글루코오스에 의거한 인슐린 분비가 평탄역에 달하는 글루코오스 농도를 11.2mM로 고정하고, D-프사이코스를 더 가하여 프사이코스 농도를 2.8mM, 5.6mM, 11.2mM, 16.7mM로 변화시켜서 24시간 배양하였다. 췌장β세포주 INS-1 세포로부터의 인슐린 분비의 상황을 검토하고 결과를 도 29에 함께 도시하였다. 이 결과, 글루코오스에 의거한 인슐린 분비의 최대 자극 농도로 유지했음에도 불구하고, D-프사이코스의 농도를 추가적으로 증가시키면, 배양액 중으로의 인슐린의 분비가 더 가산적으로 자극되었다는 것이 확인되었다.

(실험 4)

글루코오스의 흡수에 미치는 D-프사이코스의 영향을 조사하기 위해 래트의 장관을 이용하여 D-프사이코스의 흡수에 미치는 영향을 해석하였다. 글루코오스의 흡수는 글루코오스옥시다아제법에 의한 정량법에 의해 장관점막을 사이에 두고 외부와 내부의 농도를 측정하는 것으로 해석한다. D-프사이코스가 글루코오스와 병존하는 것으로 글루코오스의 흡수가 어떻게 변화하는지를 측정한다. 또한, D-프사이코스를 장기간 투여한 래트의 장관을 이용하여, 마찬가지로 당의 흡수계가 어떻게 변화하는지를 해석한다.

글루코오스를 포함하는 완충액 중에, 도 30에 도시하는 바와 같이 래트 반전(反轉) 장관을 침지하고, 일정 시간 후에 장막측의 용액을 샘플링하여 글루코오스 농도를 측정한다. 각종 농도의 D-프사이코스를 첨가하는 것에 의해, 점막측으로부터 장막측으로의 글루코오스의 수송에 미치는 D-프사이코스의 영향에 관하여 검토하고, 결과를 도 31에 도시하였다.

이 결과, 래트 반전 장관에 글루코오스와 동일 농도의 D-프사이코스를 가해 두면, 장막측의 글루코오스 농도의 상승이 유의하게 억제되었다. D-프사이코스의 첨가가 글루코오스의 수송계에 영향을 주고 있을 가능성이 시사되었다. 이상의 결과로부터, 희소당에 속하는 케토헥소오스는, 췌장β세포로부터의 인슐린 분비를 자극한다는 것이 판명되었다. 또한 최대의 인슐린 분비자극이 얻어지는 글루코오스 농도하의 세포에 있어서, 희소당에 속하는 케토헥소오스를 추가적으로 첨가하는 것에 의해, 더욱 인슐린이 분비된다는 것이 관찰되었다. 일반적으로, 당뇨병의 본태는 글루코오스에 의한 특이적인 인슐린 분비 부전이지만, 글루코오스에 의거한 인 슐린 분비가 부전인 경우에도 희소당에 속하는 케토헥소오스의 작용에 의해 유효하게 인슐린 분비를 촉진시킬 수가 있을 것으로 기대된다. 이것에 의해, 희소당에 속하는 케토헥소오스의 췌장β세포로부터의 인슐린 분비 자극작용 및 고혈당상태에 있어서의 희소당에 속하는 케토헥소오스의 인슐린 분비 증강작용이 판명되었고, 희소당에 속하는 케토헥소오스는 지금까지는 없는 새로운 작용기구를 가지는 물질로서 기대된다. 또한, 임상적으로 고혈당이 인정되는 당뇨병 환자에 있어서 희소당에 속하는 케토헥소오스가 인슐린 분비를 촉진하고, 혈당값을 개선한다는 것이 기대된다. 또한 경장관적으로 투여된 희소당에 속하는 케토헥소오스가 글루코오스의 흡수를 억제한다는 것 및 희소당에 속하는 케토헥소오스가 당 대사에 영향을 미치지 않는다는 것은, 당뇨병에 있어서의 식후 과혈당을 억제할 가능성이 있으며, 당뇨병에 있어서의 예방 또는 치료에 유익한 물질로서 기대된다. 더욱이, 희소당에 속하는 케토헥소오스에는 당뇨병 및 그 합병증과도 관련이 큰 동맥경화의 예방 효과도 인정되며, 당뇨병의 주 사인은 동맥경화성 질환이기 때문에, 동맥경화억제작용도 있는 희소당에 속하는 케토헥소오스는 혈당값의 개선 및 동맥경화증의 예방이라는 획기적인 당뇨병 치료약으로서 기대된다. 또한, 희소당에 속하는 케토헥소오스는, 이들 치료효과나 항비만 등이 기대되는 건강보조식품이 될 수 있다고 기대된다.

실시예 13

(희소당 투여에 의한 래트 혈당값에 대한 영향)

(1) 목적 : 희소당, 특히 D-프사이코스의 투여에 의해 D-후락토오스의 장기 대량 투여 부하에서 발생하는 고 인슐린혈증이 억제된다는 것이 보고되어 있다. 이 번에 우리들은 희소당의 투여에 의해 정상 래트의 혈당값이 어떻게 변동하는지를 조사하였다.

(2) 방법 : 1) 희소당 투여 : SD 래트(웅성, 체중 300g 전후)를 20-24시간 절식 후에 실험에 이용하였다. 래트에 넨브탈(58mg/kg, BW)을 복강내 투여하고, 마취하에서 경부를 절개하여 경정맥에 실리콘튜브를 유치하였다. 이 튜브에 1㎖ 실린지를 접속하고, 희소당을 투여하였다.

2) 채혈 : 경정맥에 삽입한 실리콘 튜브로부터 1㎖ 실린지를 이용하여 채혈을 행하였다. 채혈은 희소당 투여직전, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 60, 120, 180, 240분 후에 행하였다.

3) 혈당측정 : 채혈한 혈액중의 혈당값은 안토센스Ⅱ(바이엘메디컬)에 의해 결정하였다.

(3) 결과 :

1) 마취 하에서 생리식염수 투여에 따른 혈당에의 영향(도 32) : 우선, 3마리의 래트에 생리식염수(0.7㎖)만을 정주하여 혈당값에 대한 마취 등의 영향을 조사하였다. 그 결과, 생리식염수만의 투여에서는 혈당값의 큰 변화는 보이지 않았다.

2) 마취 하에서 D-글루코오스 투여에 따른 혈당값에의 영향(도 33) : D-글루코오스(200mg/kg BW)를 경정맥으로 정주하여 주입 전후의 혈당값을 측정하였다(N=2). 혈당값은 D-글루코오스 투여에 의해 일과성으로 상승하고, 60분 정도에서 정상값에 근접하였다.

3) D-프사이코스 투여에 의한 혈당값에의 영향(도 34) : 래트에 마취하에서 Psicose(200mg/kg BW)를 정맥내 투여하여 혈당값을 측정하였다(N=4). 그 중 2마리에서는 혈당값이 희소당 투여 30-60분에서 감소하여 서서히 회복되었지만, 다른 2마리에서는 혈당 저하 후에 초기값보다 상승 또는 거의 변화하지 않았다.

(4) 고찰 : 본 실시예 13이 이용한 정상 래트 마취하에 있어서의 실험계에서 넨브탈 마취나 생리식염수 정맥내 투여가 혈당값이나 D-글루코오스 부하에 대해서 영향을 미치지 않는다는 것이 확인되었다. 본 실시예 18의 실험에서는, 래트 중 반수는 D-프사이코스를 투여함으로 인해 혈당값이 투여후 30-60분에서 저하되어, 그 후 천천히 회복되었다. 나머지 래트는 조기에 혈당 저하를 일으켜 그 후 상승하거나, 또는 서서히 혈당 저하를 나타내었다. 이 사실들로부터 개체차는 있지만 정상 래트에서는 희소당(D-프사이코스)에 의해, 경도의 혈당 저하가 일어났음을 알 수 있었다. 금후, 실험 동물수를 늘려서 데이터를 해석할 필요가 있다. 또한, 고혈당 래트에 있어서의 작용을 검토할 필요성이 있다. 동시에 행한 D-알로오스의 실험에서는, 혈당 저하는 인정되지 않았다.

실시예 14

(케토오스의 고혈당 상태 개선효과)

(1) 목적 : 당뇨병은 내당능 이상도 포함하면 1000만명을 훨씬 넘는 국민병이 되고 있다. 당뇨병의 본태는 글루코오스에 의한 특이적인 인슐린 분비 부전이다. 거기서 이번에 우리들은 희소당, 특히 케토오스인 D-프사이코스의 당뇨병에 있어서의 유용성 및 임상응용의 가능성에 대해서 검토하였다. 현재까지, 케토오스에 의한 췌장β세포로부터의 인슐린 분비자극능에 관하여, in vitro 로 검토해 왔다. 이번의 검토는 무마취 무구속 래트를 이용하여 D-프사이코스의 인슐린 분비능 및 당 대사에 미치는 영향에 관하여 검토한다. 본 연구에 의해, 케토오스의 췌장β세포로부터의 인슐린 분비 자극작용 및 고혈당상태에 있어서의 케토오스의 인슐린 분비증강작용을 in vivo로 검증하는 것이다. 이상의 것으로부터 금후 케토오스의 당뇨병에 있어서의 예방/치료약으로서의 가능성을 검토하는 것을 목적으로 한다.

(2) 방법 : 1) 경정맥 포도당 부하시험(IVGTT)…8주령 SD래트(웅성)를 사용하여 경정맥으로부터 카테텔을 삽입하여 IVGTT를 시행한다. 희소당 3마리ㆍ글루코오스 3마리로 한다.

프로토콜 1

0.5g/kg(0.5g/1000g=500mg/1000g=0.5g/g)에서 정맥주사(IV)한다.

0.5g/㎖(0.5g/1000㎕=500mg/1000㎕=0.5mg/㎕) 농도의 희소당 및 글루코오스 용액을 조정한다. 용액은 2㎖ 작성한다.

200g의 래트일 경우, 200㎕를 정맥주사(IV)한다.

250g 이라면 250㎕로 한다.

정맥주사(IV) 후에 생리식염수를 300㎕ 주입한다.

혈장 샘플은 150㎕ 채혈한다.

전(前)처치로서 16시간 절식으로 한다. 음수(飮水)는 가능.

채혈시간은 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60분의 9포인트로 한다.

2) 고혈당 시에 있어서의 프사이코스의 영향

8주령 SD 래트(웅성)를 사용하여 경정맥으로 카테텔을 삽입하고 50% 글루코오스를 20분 간격으로 주입하여 고혈당 상태를 작성하고, 프사이코스 및 데옥시글루코오스를 사용하여 IVGTT를 시행한다. 희소당 1마리ㆍ데옥시글루코오스 1마리로 한다.

프로토콜 2

0.5g/kg(0.5g/1000g=500mg/1000g=0.5mg/g)으로 정맥주사(IV)한다.

0.5g/㎖(0.5g/1000㎕=500mg/1000㎕=0.5mg/㎕) 농도의 희소당 및 데옥시글루코오스 용액을 조정한다. 용액은 2㎖ 작성한다.

200g의 래트일 경우, 200㎕를 정맥주사(IV)한다.

250g 이라면 250㎕로 한다.

정맥주사(IV) 후에 생리식염수를 300㎕ 주입한다.

혈장 샘플은 150㎕ 채혈한다.

채혈시간은 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60분의 9포인트로 한다.

(3) 결과 : IVGTT…컨트롤로서 포도당을 사용하였다. 도 35에 도시하는 바와 같이, 포도당을 부하하면 혈당값의 상승이 인정되었다. 프사이코스를 정맥 내에 투여해도 혈당값의 상승이 인정되지 않았다. 또한 IVGTT 에 경시적으로 혈중 인슐린을 측정하면, 포도당 부하군에서는 혈당값의 상승과 일치하여 인슐린의 상승이 인정되었지만, 프사이코스 투여군에 있어서는 혈당값이 상승되지 않았기 때문인지 인슐린의 분비에도 영향을 주지 않았다(도 36).

정상적인 혈당 레벨에서는 프사이코스는 인슐린 분비를 촉진하지 않음이 시 사되었기 때문에, 다음에 포도당을 연속해서 투여하여 고혈당 상태를 작성한 래트에 있어서 프사이코스의 영향을 검토하였다. 컨트롤로서 데옥시글루코오스를 사용하였다. 컨트롤과 비교하여, 프사이코스 투여군에 있어서는 혈당값에 저하가 신속하였다. 또한 경시적으로 측정한 인슐린 농도는 컨트롤과 비교하여 분비가 증가해 있었다(도 37).

(4) 고찰 : 본 실시예 14의 검토에 있어서 in vivo에 있어서 D-프사이코스는 당 대사에 영향을 미치지 않고 췌장β세포로부터의 인슐린 분비를 자극한다는 것이 판명되었다. 또한 인슐린 분비작용에 관해서는, 고혈당시에 인슐린 분비작용을 가지지만, 통상의 혈당에 있어서는 인슐린 분비촉진작용이 거의 인정되지 않으며, 저혈당의 유발은 인정되지 않았다. 당뇨병의 본태는 글루코오스에 의한 특이적인 인슐린 분비 부전이지만, 희소당은 그와 같은 상태에 있어서도 유효하게 인슐린분비를 촉진시킴으로써, 지금까지 없는 새로운 작용기구를 가지는 물질로서 기대된다. 임상적으로 고혈당이 인정되는 당뇨병 환자에 있어서 D-프사이코스가 인슐린 분비를 촉진하고, 혈당값의 개선이 얻어질 가능성이 있어서, 당뇨병 치료에 유익한 의약품 또는 건강보조식품이 될 수 있다고 생각된다.

실시예 15

(희소당의 단백질의 당화에 대한 효과)

(1) 목적 : 당뇨병에 있어서의 지속적 고혈당 상태는, 생체내에서의 단백질의 비효소적 당 부가반응(당화)을 촉진한다. 이 반응은 아마드리 산물 등(전기 생성물)을 경유하여, 이윽고 후기 반응생성물(advanced glycation end products : AGE)을 형성하고, 산화스트레스를 증대시키며, 당뇨병에 있어서의 망막증, 신장해 등의 혈관 합병증을 진전시킨다. 본 실시예 15에서는, 희소당에 고혈당하에 있어서의 당화, 산화스트레스 억제효과가 있는지 여부를 검토한다.

(2) 방법 : 글리코알부민(GA) 측정시약(오리엔탈 효모사제) 프로테아제 K에 의해 글리코리신을 측정한다(도 38). 각종 희소당에 의한 인간 알부민의 글리케이션을 검토하였다. 시료의 조정은 PBS에 인간 알부민 순품을 3g/㎗로 하고, 그것에 각종 희소당을 각각 종(終)농도 55.5mM가 되도록 용해하였다. 조정된 용액을 0.25㎛의 필터로 여과 멸균하고, 37℃에서 7일간 인큐베이션하였다. 도중에 정확히 24시간 걸러서 GA농도(글리코리신 농도)를 측정하였다. 더욱이, 알부민(종농도 3g/㎗), 글루코오스(종농도 55.5mM) 용액에 각 희소당을 종농도 55.5mM가 되도록 첨가하고, 마찬가지로 실험하였다.

(3) 결과 : 1) 가장 당화반응이 현저한 것은 D-알로오스이며, 그 당화 속도는 약 90μmol/day 이었다. 다음으로 당화반응이 진행된 것은 D-글루코오스와 D-만노오스이고, 약 50μmol/day 이었다. 다른 희소당(D-프사이코스 등)에서는 알부민의 글리케이션은 관찰되지 않았다(도 39).

2) 글루코오스 공존하에서의 희소당의 당화작용…다음에 알부민(종농도 3g/㎗), D-글루코오스(종농도 55.5mM) 용액에 각 희소당을 종농도 55.5mM가 되도록 첨가하고, 글리코알부민 농도를 측정하였다. 그 결과, D-알로오스는 D-글루코오스 존재하에서도 급속한 당화 반응이 관찰되었다. 그 당화 속도는 실험 1의 결과와 같으며, 약 140μmol/day(D-글루코오스+D-알로오스의 당화 속도)였다. 또한 d-만노오스 에서는 약 100μmol/day 이며, 글루코오스의 당화속도를 더한 당화속도가 얻어졌다. 한편, D-프사이코스 등의 각 희소당에서는 글리케이션의 억제효과는 인정되지 않았다(도 40).

(4) 고찰 : 생체내에서는 단백질과 글루코오스 등이 비효소적으로 결합(glycation)이 일어나고 있다. 단백질의 아미노기와 알데히드기의 반응이 초기반응에 있어서 중요하다. 이번의 검토결과에서 알부민의 글리케이션이 인정된 당류(D-알로오스, D-글루코오스, D-만노오스)는 모두 알도오스류이다. 알도오스는 당화반응 뿐만 아니라, 알도오스 환원효소에 의한 폴리올 대사에의 영향도 생각된다. 임상검사에서는, 당뇨병 환자의 혈당컨트롤의 지표로서 HbAlc 나 글리코알부민 등이 유용한 것으로 되어 있다. 모두 단백질의 글루코오스에 의한 당화반응 생성물을 측정하고 있다. 당화부위는 헤모글로빈의 글로빈 β쇄 N말단의 발린, 알부민의 199, 281, 439, 525번째의 리신이라고 간주된다. 이번의 희소당의 당화반응의 검토에 사용한 알부민은 헤모글로빈에 비해서 당화부위가 많기 때문에, 짧은 기간의 실험에서 데이터가 얻어졌다.

헤모글로빈에 의한 마찬가지의 검토를 행하는 데에는 문제가 있다. 당화속도가 느리기 때문에, 인큐베이션 중에 단백질의 변성이 너무 진행하여 잘 측정할 수가 없다. 현재, 시판 헤모글로빈 분말로써 검토중이다.

실시예 15의 실험 데이터에서 알 수 있었던 바와 같이, D-프사이코스는 알부민의 당화를 촉진하지 않는다. 다른 D-후락토오스 등의 당도 당화는 일으키지 않았지만, 그 당들은 체내에 대사경로를 가지고 있으며, 다량으로 존재하면 결과로서 알도오스 등이 증가하게 된다. 금후의 실험에서 D-프사이코스의 인간 체내 대사를 명확히 해야 하지만, 적어도 D-프사이코스는 다량으로 복용하더라도 당화반응 등이 초래하는 합병증의 진전을 촉진하지 않을 가능성이 있다. 이에 더하여, D-프사이코스의 인슐린 분비작용이 있다는 것에서 유용한 당뇨병 환자에의 이용가치가 있다고 생각된다. 한편, 이번의 알부민을 사용한 실험에서는 희소당에 당화 억제작용은 인정되지 않았다. 그러나, 금후에 더욱이 희소당의 농도를 변경하여 검토하고, 더욱 산화억제효과를 검토해 나가고자 한다.

이상, 본 발명을 실시예에 의해 설명하였다. 여기서 희소당은 상용의 당류와는 반대로 신체에 의해 동화(同化)되지 않거나 또는 설령 동화되더라도 그 정도는 극히 소량이라는 것, 또한 희소당의 지질대사에 미치는 영향으로부터 체지방 축적의 억제효과가 기대되고 있다는 것에 의해, 희소당은 본 발명의 개시에 의해 각종 의약품에의 기대에 더하여, 기능성식품으로서의 부가가치를 높이는 것이 기대된다.

본 발명에 따르면, 희소당, 특히 D-알로오스, D-프사이코스가 세포에 섭취되거나 또는 작용해서 해당 세포를 변화시키기 때문에, 희소당이 생리활성작용을 가지는 물질로서 유효하게 이용된다는 것이 이해된다.

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20. 암세포 증식억제작용 감수성 세포, 케모카인 분비억제작용 감수성 세포, 및 혈당강하작용 감수성 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 생리활성작용 감수성 세포에 작용하는, 암, 동맥경화증, 또는 당뇨병의 예방 또는 치료에 유효한, D-프사이코스인 희소당을 유효성분으로서 배합한 약제 조성물.
21. 제 20항에 있어서,

    상기 세포가 인간세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
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25. 암세포 증식억제작용 감수성 세포, 케모카인 분비억제작용 감수성 세포, 및 혈당강하작용 감수성 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 생리활성작용 감수성 세포에 작용하는, 암, 동맥경화증, 또는 당뇨병의 예방 또는 치료에 유효한, D-프사이코스인 희소당을 유효성분으로서 배합한 기능성 식품용 조성물.
26. 제 25항에 있어서,

    상기 세포가 인간세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
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