JP5787340B2 - 破骨細胞分化抑制組成物 - Google Patents
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骨の中で破骨細胞が作られたり、骨を吸収する際には破骨細胞と骨芽細胞がカップリングされている。試験管の中で破骨細胞を造る時にも破骨細胞が活動するためには骨芽細胞とのカップリングが不可欠です。これは、骨芽細胞が持っている膜結合性のサイトカインRANKL(Receptor Activator of NF-kappa B Ligand)と破骨細胞が持っているその受容体RANKとが応答し合うことが破骨細胞の形成、活性化、生存に必要である。
本発明の目的は、D-アロースを有効成分とする破骨細胞への分化を抑制する組成物を提供することにある。また、本発明の目的は、天然に産する希少糖の一種であるD-アロースを有効成分とする骨粗鬆症の治療などに有用な組成物を提供することにある。また、本発明の目的は、希少糖を用いることにより化合物からなる薬剤と同様の効果を持つ組成物を通常の食事などで摂取でき患者への負担を軽減することである。
(1)D-アロースを有効成分とし、チオレドキシン結合蛋白質(TXNIP)の発現を促進するための、またはチオレドキシン(Thioredoxin)の発現を抑制するための、破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化抑制組成物(但し、食品組成物である場合を除く。)。
(2)上記(1)記載の破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化抑制組成物(但し、食品組成物である場合を除く。)からなる骨吸収抑制剤。
(3)骨吸収性疾患の予防または改善のための上記(2)記載の骨吸収抑制剤。
(4)骨吸収性疾患が骨粗鬆症、骨量減少または骨折である上記(3)記載の骨吸収抑制剤。
本発明の破骨細胞分化抑制組成物により、骨代謝異常疾患である骨吸収疾患、例えば骨粗鬆症や骨折の予防または治療に有用な組成物を提供することが可能となる。また、本発明により、骨粗鬆症、関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、変形性腰、椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全における骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病、家族性拡張性骨溶解症または歯周疾患の予防または治療が期待される。また、D-アロースは天然物由来の糖であることから細胞毒性が低く安全性の高い骨粗鬆予防や治療用の組成物として提供される。D-アロースは、甘みを有する糖であることから食品類の甘味料の一部として簡便に摂取することが可能であるとともに、大量生産技術が開発されて安価に入手することができる利用に優れた糖である。
破骨細胞は骨芽細胞とともに骨の代謝に重要な役割を果たし、両者の良好なバランスにより骨の機能が維持される。破骨細胞の分化には、細胞質のチオレドキシン(Thioredoxin)の核内への移行が引き金になっていることが知られている。また、分化誘導因子であるRANKL(Receptor Activator of NF-kappa B Ligand)を添加すると、前駆細胞は多核大型化した破骨細胞に分化誘導される。破骨細胞の分化過程においては、TXNIP(チオレドキシン結合蛋白質、Thioredoxin-interacting protein)による発現抑制が認められ、また、TXNIPの過剰発現はチオレドキシンを結合することで核に移行するチオレドキシンを減少させ破骨細胞への分化を抑制すると考えられる。
「希少糖」とは、自然界に微量にしか存在しない単糖と定義づけることができる。自然界に多量に存在する単糖は、D-グルコース、D-フラクトース、D-ガラクトース、D-マンノース、D-リボース、D-キシロース、L−アラビノースの7種類あり、それ以外の単糖は、自然界における存在量が少なく希少糖に分類することができる。また、糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはD-ソルビトールおよびD-マンニトールが比較的多いが、それ以外のものは量的には少ないので、これらも希少糖と定義される。これらの希少糖は、これまで入手が困難であったが、自然界に多量に存在する単糖から希少糖を生産する方法が開発されつつあり、その技術を利用して製造することができる。
アロース (allose) は、六炭糖およびアルドースに分類される単糖の一種。グルコースの3位のエピマーである。希少糖の中では、プシコースと並び最も研究がなされている。水に対して溶解するが、メタノールには不溶である。アフリカに自生するヤマモガシ科プロテア属の低木Protea rubropilosaの葉から誘導体が単離されていることが多い。抗酸化作用を示し、虚血による神経細胞死の保護作用や、癌細胞増殖抑制作用などを示すことが明らかにされている。水溶液中では異性化を起こし、環状構造との混合物となる(変旋光)。平衡状態では、β-ピラノース体の存在比が最も高い。
本発明の破骨細胞分化抑制組成物(破骨細胞分化抑制剤)は、例えば、食品組成物や医療用の組成物に配合して利用することができる。食品として使用する場合、一般食品の他、骨吸収性疾患の予防または改善を目的とした、美容食品、病者用食品、栄養機能食品または特定保健用食品等の機能性食品とすることができる。食品は、固形、半固形または液状であり得る。食品の例としては、パン類、麺類、菓子類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、その他加工食品、飲料、スープ類、調味料、栄養補助食品等、およびそれらの原料が挙げられる。食品は、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。
食品中における本発明の植物またはそれらの抽出物の量は、通常、抽出物の乾燥物換算で、食品の全質量の0.0001質量%〜50質量%であり、好ましくは、0.0003質量%〜10質量%であり、さらに好ましくは、0.0005質量%〜5質量%である。
製剤中における本発明のD-アロースの量は、通常、製剤の全質量の0.01質量%〜100質量%であり、好ましくは、0.1質量%〜70質量%であり、さらに好ましくは、0.5質量%〜50質量%である。
マウス由来の破骨細胞前駆細胞のRAW264を5%二酸化炭素および高湿度の37℃インキュベーター内で、10%(v/v)ウシ胎児血清(MBL)、1%(v/v)ペニシリン・ストレプトマイシン(GIBCO)になるように調整して添加したDMEM(Sigma)を用いて培養した。このRAW264細胞に対して、30 ng/mL のRecombinant mouse RANKL(R&D)と希少糖D-アロース(25 mM)を、(1)何も加えないcontrol群、(2)D-アロースのみの添加群、(3)RANKLのみの添加群、(4)RANKLとD-アロースの添加群の4つの条件に合わせて添加し、1〜7日間培養した。
図1のようにRANKLではRAW267.4細胞の分化が促進され、これにD-アロースを加えると分化の程度が抑えられた(図2)。
Pit formationによる破骨能の確認は5日間培養した後に行った。分化した破骨細胞の破骨能(骨基質の貪食能)を測定するため、BD BioCoat OSTEOLOGIC Bone Cell Culture System(BD Biosciences)のwell内にRAW264細胞を50,000個/2mLになるように播種し、前述のDMEMで24時間培養した後、10%(v/v)ウシ胎児血清(MBL)、1%(v/v)ペニシリン・ストレプトマイシンになるように調整したMEM alpha(Invitrogen)にメディウムを変えた。メディウムを変えると同時に、RANKL(30ng/mL)とD-アロース(25mM)を添加し、5%二酸化炭素および高湿度の37℃インキュベーターで7日間培養した。培養後、bleach solutionで5分間固定し、十分乾燥させた後にデジタルカメラを用いて写真撮影を行った。写真はフリーソフトImageJを用いて貪食割合(面積)を算出した。
RAW264細胞を60mm dishに100,000個/4mLになるように播種し、前述のDMEMで24時間培養した後、10%(v/v)ウシ胎児血清(MBL)、1%(v/v)ペニシリン・ストレプトマイシンになるように調整したMEM alpha(Invitrogen)にメディウムを変えた。メディウムを変えると同時に、RANKL(30ng/mL)とD-アロース(25mM)を添加し、5%二酸化炭素および高湿度の37℃インキュベーターで培養した。
RNeasy Mini KiT(QIAGEN)のプロトコールに従ってRNAを抽出した後、Omniscript RT Kit(QIAGEN)のプロトコールに従って、cDNAを作製した。
既製のTaqman gene expression assaysプライマー(Applied Biosystems)と Premix EX Taq (TAKARA BIO)試薬を使用し、Realtime PCR 7300 system(Applied Biosystems)を用いて95℃10秒間の後、1サイクルを95℃10秒間、60℃31秒間とし、40サイクル繰り返して遺伝子の発現量を測定した。
その結果を図3に示す。TXNIPの測定では、RANKLの条件と比較してRANKL+ D-アロースの条件の方が顕著な増加を見せた。また、時間変化に伴ってRANKL対RANKL+ D-アロースのTXNIPの発現比率は増加して後者によるTXNIPの発現が優勢となることがわかった。
ちなみに図4の左はTRAP染色により分化を確認したものであり、図4の右はPit formationにより破骨能を確認したものである。
同様の実験を、Control、RANKL、RANKL+D-アロースの条件で培養を行い、Western blotによりTXNIP, Thioredoxin、β-actinの生成量の測定を行った。
CelLytic(登録商標) MT Cell Lysis Reagent (SIGMA)を使用して培養細胞のタンパク質を抽出した後、10%トリシンゲルを用いて各サンプル50μgずつ110Vで90分間泳動した。
蛋白質をニトロセルロースメンブレンに転写し、5% milk をTTBS (0.05% Tween in Tris Bufferd Saline)に溶かしたバッファーで60分間blockingを行った後、TTBSで10秒間の振とうwashを2回、更にTTBSで15分間のwashを1回、5分間のwashを2回行い、Can Get Signal Solution1(TOYOBO)を用いて500:1に希釈した1次抗体(anti-thioredoxin / Cell signaling, anti-TXNIP / Zymed)でパッキングし、4℃ cold roomでover nightインキュベーションした。TTBSで10分間のwashを3回行い、その後2次抗体 (Cell signaling)をCan Get Signal Solution2(TOYOBO)を用いて10,000:1に希釈し、室温で60分間メンブレンをパッキングし振とうした。TTBSで10分間のwashを3回行った後に、蛋白質バンドの撮影を行った。バンドの撮影はImmobilon Western発光試薬 (Millipore)にメンブレンを浸し、Lumi Vision Pro 400EX (AISIN)を用いた。その結果を図5に示す。TXNIP、チオレドキシンの発現量は、RANKLのみの条件と比較してRANKL+ D-アロースの条件の方が増加することがわかった。
TRAP染色とPit formationよりcontrol、D-アロースのみ添加した条件では破骨細胞への分化と破骨能が見られず、RANKLとRANKL+D-アロースの条件では破骨細胞への分化と破骨能が見られた。また、RANKLとRANKL+D-アロースを比較すると、RANKL+D-アロースの条件の方が破骨細胞への分化と破骨能が小さいことがわかる。よって、分化誘導因子RANKLと希少糖D-アロースを共に添加すると破骨細胞への分化が抑制され、破骨能が低下する。つまり、D-アロースにはRANKLによるRAW264.7細胞の破骨細胞への分化を抑制する作用があるといえる。
Western blotとリアルタイムPCRより、D-アロースを分化誘導因子RANKLと共に添加した場合のTXNIPの発現量はRANKLのみを添加した場合と比較して増加した。 このことより、D-アロースを添加することで破骨細胞への分化過程において、TXNIPの発現抑制が行なわれず、むしろTXNIPの過剰発現が起き、破骨細胞への分化が抑制されていると推測できる。
また、リアルタイムPCRによる時間変化のグラフではTXNIPの発現量が増加しているように見受けられた。チオレドキシンについては、RANKLとRANKL+D-アロースを比較するとほとんど変化がなかった。
RANKLを加えることで貪食能が高まっている。RANKLと同時にD-アロースを加えると貪食が抑制されていることが判明した。D-アロース単独では、貪食能への変化は認められなかった。
RAW264細胞を60mm dishに100,000個/4mLになるように播種し、前述のDMEMで24時間培養した後、10%(v/v)ウシ胎児血清(MBL)、1%(v/v)ペニシリン・ストレプトマイシンになるように調整したMEM alpha(Invitrogen)にメディウムを変えた。メディウムを変えると同時に、RANKL(30ng/mL)とD-アロース(25mM)を添加し、5%二酸化炭素および高湿度の37℃インキュベーターで1日、3日、5日間の培養日数で培養した。RNeasy Mini KiT(QIAGEN)のプロトコールに従ってRNAを抽出した後、Omniscript RT Kit(QIAGEN)のプロトコールに従って、cDNAを作製した。既製のTaqman gene expression assaysプライマー(Applied Biosystems)と Premix EX Taq (TAKARA BIO)試薬を使用し、Realtime PCR 7300 system(Applied Biosystems)を用いて95℃10秒間の後、1サイクルを95℃10秒間、60℃31秒間とし、40サイクル繰り返して遺伝子の発現量を測定した。
実施例2と同様にして試験を行いリアルタイムPCRによりチオレドキシン(TRX)の発現量を検討した。その結果を図8おいてRANKLのみ加えたもので著しい増加がみられるが、それ以外では有意な差はないという結果になった。RANKLで増加したTRXはD-アロースにより発現の抑制が3日、および5日で明らかに認められた。
実施例2と同様の試験を行い、TRP染色により破骨細胞に分化した細胞を計測しその結果を図10に示す。実際の写真、細胞計測ともにRANKLを加えることで破骨細胞に分化し、D-アロースを加えると分化が抑制されていることが分かる。分化した破骨細胞を示す多核細胞数で見ると、明らかにRANKLで増加するがD-アロースにより減少していた。
RAW264細胞を10cm dishに700,000個/10mLになるように播種し、前述のDMEMで24時間培養した後、10%(v/v)ウシ胎児血清(MBL)、1%(v/v)ペニシリン・ストレプトマイシンになるように調整したMEM alpha(Invitrogen)にメディウムを変えた。メディウムを変えると同時に、RANKL(30ng/mL)とD-アロース(25mM)を添加し、5%二酸化炭素および高湿度の37℃インキュベーターで1日、3日、5日間の培養日数で培養した。
蛋白質をニトロセルロースメンブレンに転写し、5% milk をTTBS (0.05% Tween in Tris Bufferd Saline)に溶かしたバッファーで60分間blockingを行った後、TTBSで10秒間の振とうwashを2回、更にTTBSで15分間のwashを1回、5分間のwashを2回行い、Can Get Signal Solution1(TOYOBO)を用いて500:1に希釈した1次抗体(anti-thioredoxin / Cell signaling, anti-TXNIP / Zymed)でパッキングし、4℃ cold roomでover nightインキュベーションした。TTBSで10分間のwashを3回行い、その後2次抗体 (Cell signaling)をCan Get Signal Solution2(TOYOBO)を用いて10,000:1に希釈し、室温で60分間メンブレンをパッキングし振とうした。TTBSで10分間のwashを3回行った後に、蛋白質バンドの撮影を行った。バンドの撮影はImmobilon Western発光試薬 (Millipore)にメンブレンを浸し、Lumi Vision Pro 400EX (AISIN)を用いた。
Claims (4)
- D-アロースを有効成分とし、チオレドキシン結合蛋白質(TXNIP)の発現を促進するための、またはチオレドキシン(Thioredoxin)の発現を抑制するための、破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化抑制組成物(但し、食品組成物である場合を除く。)。
- 請求項1記載の破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化抑制組成物(但し、食品組成物である場合を除く。)からなる骨吸収抑制剤。
- 骨吸収性疾患の予防または改善のための請求項2記載の骨吸収抑制剤。
- 骨吸収性疾患が骨粗鬆症、骨量減少または骨折である請求項3記載の骨吸収抑制剤。
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