KR20230026799A

KR20230026799A - 함초 추출물 또는 이로부터 분리된이소람네틴-3-Ｏ-β-Ｄ-글루코시드를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20230026799A
Application number: KR1020210108859A
Authority: KR
Inventors: 박성호
Original assignee: 주식회사 청원산업
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2023-02-27

Abstract

본 발명은 함초( Salicornia herbacea ) 추출물 또는 이로부터 분리된 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 함초 추출물은 스트렙토조토신(streptozotocin) 주입 유도 고혈당 래트에서 수정체 알도즈 환원 효소(Rat Lens Aldose Reductase) 및 솔비톨 축적(Sorbitol Accumulation)을 저해하는 활성을 나타내므로, 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료에 의약품 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

함초 추출물 또는 이로부터 분리된이소람네틴-3-Ｏ-β-Ｄ-글루코시드를 포함하는 조성물{Composition comprising from an extract of Salicorniaherbacea or isorhamnetin-3-O-β-D-glucoside isolatedtherefrom}

본 발명은 함초 추출물 또는 이로부터 분리된 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

당뇨병이란 인슐린 분비량(量)의 부족으로 혈액 중의 포도당(혈당)이 정상인보다 그 농도가 높아져서 소변에 포도당을 배출하는 만성질환이다. 정상의 경우 섭취한 음식물은 대부분 포도당으로 바뀌고, 혈액은 이 포도당을 각 세포로 운반해 준다. 포도당이 세포 속으로 이동하는 데는 인슐린(호르몬)이 필요하다. 당뇨병은 인슐린이 제대로 만들어지지 않거나 작용을 하지 못하기 때문에 포도당이 세포 내로 이동되지 못해 발생하는 것이다. 세포 속으로 운반되지 못한 포도당은 그대로 혈액 속에 남아 있게 되어 혈액은 당이 많은 '고혈당' 상태가 되고 소변으로 배출되는 것이다.

인슐린은 췌장에서 만들어지는 호르몬으로, 췌장의 내부에는 세포들이 작은 덩어리 모양을 하고 모여 있는 '랑게르한스섬'이 있고 랑게르한스섬 내부에는 인슐린을 분비하는 '베타세포'가 있다. 그런데 혈액 속 포도당이 세포 내로 운반되기 위해서는 인슐린의 도움이 필요하다. 즉, 자물쇠와 열쇠와 같이 세포막에 존재하는 인슐린 수용체(자물쇠)를 인슐린(열쇠)으로 열어줘야만 포도당이 세포 안으로 들어갈 수 있는 것이다.

당뇨병(diabetes)의 비정상적인 당 수치는 혈장내의 헤모글로빈(hemoglobin) 의 수치를 높이게 되며, 만성적인 고혈당증(hyperglycemia), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 미세혈관병증(microangiopathy), 신장 질환, 심장 질환, 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy) 및 다른 안과 질환과 같은 일련의 합병증을 야기하게 된다.

당뇨병은 인슐린 생산 여부에 따라 두 가지 유형으로 특징 지워지는데, 인슐린 의존형인 제 I형 당뇨병(insulin dependent diabetes, IDDM)은 혈액 내의 글루코스 조절 호르몬인 인슐린(Insulin)의 분비 결핍으로 야기되며, 주로 10 내지 20대의 젊은 연령층에서 발병되기 때문에 소아당뇨병(juvenile diabetes)이라 불리우기도 한다. 제 Ⅱ형 당뇨병(non-insulin dependent diabetes, NIDDM)은 주로 40대 이후에 발병되며, 우리나라 당뇨병 환자의 대부분을 차지한다. 제 Ⅰ형과는 달리 성인형 당뇨병이라 불리우며 발병 원인은 아직 명확히 밝혀져 있지 않으나, 유전적인 요인과 환경적 요소가 함께 관여되어 발생하는 것으로 알려졌다. 제 Ⅱ형 당뇨병의 병인으로 췌장베타세포에서 인슐린 분비의 장애와 표적세포에서 인슐린 작용의 결함(인슐린 저항성)이 모두 관찰되는데, 이중 어떠한 변화가 일차적 중요성을 갖는지는 아직 확실하지 않다.

알도즈 환원 효소는 보조인자로 NADPH를 사용하여 포도당을 극성 당 알콜과 솔비톨로 환원시키는 폴리올 경로(polyol pathway)에 있는 효소이다. 알도즈 환원 효소는 수정체의 백내장 외에도 신경장애, 신장병, 망막증과 같은 당뇨합병증 발병의 중요한 원인이 되는 것으로 알려졌다(Van Heyningen R. Formation of polyol by the lens of the rat with sugar cataract, Nature, 184 , pp.194-196, 1959),(Beyer-Mears A, et al., Diabetes , 33 , pp.604-607, 1984). 당뇨병에서는, 인슐린 비의존성 포도당 수송이 있는 세포에서 일어나는 세포내 포도당의 증가가 솔비톨 생성의 현저한 증가를 가져온다. 솔비톨 축적 증가는 세포 손실을 초래하여(Engerman RL, et al., Diabetes, 33 , p.97-100, 1984), 당뇨 합병증과 관련된 조직에서 일어나는 구조적, 기능적 변화가 알도즈 환원 효소 저해제에 의해 정지될 수 있다는 사실이 보고되어 있다(Donkor IO, et al., European Journal of Medicinal Chemistry, 34 , pp.235-43, 1999). 이는 효소의 특정한 저해제는 당뇨 합병증의 치료와 예방에 도움이 될 수 있음을 의미한다.

알도즈 환원 효소 저해제의 치료상 가능성은 에팔레스타트(epalrestat)와 톨레스타트(tolrestat)를 포함하는 여러 화합물의 임상결과에 의해 증명되었다.

포도당 물질 대사 작용의 솔비톨 경로(sorbitol pathway)에 있는 효소인 알도즈 환원 효소는 포도당을 솔비톨로의 환원을 촉진시킨다. 알도즈 환원 효소는 포도당에 낮은 기질 친화력을 가지고 있어 솔비톨이 되는 포도당의 전환은 보통의 조직에서 흔히 일어나는 것은 아니다. 그러나 당뇨병에서 인슐린에 반응이 없는 조직에서 포도당의 증가된 유효성은 폴리올 경로를 통하여 솔비톨의 증가를 이끈다. 이러한 경로에서 처음 단계는 알도즈 환원 효소와 NADPH에 의해 포도당이 솔비톨로 변하고, 다음 단계로 솔비톨 탈수소발생효소와 NAD + 에 의해 솔비톨의 산화가 일어나서, 결과적으로 과당(fructose)이 얻어진다. 솔비톨의 축적은 신장, 신경, 망막, 수정체, 심장근을 포함하는 당뇨 합병증의 중요한 원인이 된다. 수정체의 백내장의 진전과 신경 전도 속도의 감소는 렌즈, 백혈구, 말초신경에서 솔비톨과 과당수치의 증가와 관련이 있다(Malone JI, et al., an indicator of diabetic control. Diabetes , 29 , pp.861-864, 1980).

스트렙토조토신(이하, STZ)은 인슐린을 분비하는 췌장 효소의 세포들을 선택적으로 파괴하여 췌장 효소의 활동을 막아 당뇨병을 일으키는 원인이 된다(Gilman AG, et al., Goodman and Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th ed. Pergamon Press, New York , pp.1317-1322, pp.1463-1495, 1990). STZ를 주입한 고혈당증은 고혈당의 병원균 활동을 연구하기 위한 유용한 실험적 모델로 사용된다(Ledoux SP, et al., Diabetes , 35 : pp.866-72, 1986).

현재 제 Ⅱ형 당뇨병 및 인슐린 저항성 같은 합병증에 사용되는 제제로는 5 종류의 화합물군, 즉 비구아니드(biguanides), 티아졸리딘디온 (thiazolidinediones), 설포닐우레아(sulfonylureas), 벤조산(benzoic acid) 유도체 화합물 및 α-글루코시다제 저해제(α-glucosidase inhibitor) 등이 사용되고 있으며, 이중 메트포르민(metformin)과 같은 비구아니드 화합물은 과도한 혈액내 당신생성(gluconeogenesis)을 예방하는 것으로 알려져 있다. 티아졸리딘디온 화합물은 말초 신경의 글루코스 소비율을 증가시키는 작용을 하는 것으로 생각되며, 톨부타미드(tolbutamide) 및 글리부리드(glyburide)와 같은 설포닐우레아, 레파글리니드(repaglinide) 화합물과 같은 벤조산 유도체 및 아카보스(acarbose)와 같은 α-글루코시다제 저해제는 인슐린 분비를 자극하여 혈장 글루코스를 낮추는 작용을 한다.

상기의 설포닐우레아 화합물은 인슐린 의존형인 제 Ⅰ형 당뇨병 환자에게는 투여할 수 없으며, 비인슐린 의존형인 제 Ⅱ형 당뇨병 환자는 인슐린 분비를 감소하게 되고, 여성 환자에게 비정상적인 태아 출생, 유산(abortion) 및 사산(stillbirth)과 같은 부작용을 야기할 수 있다. 추가적으로, 대부분의 설포닐우레아 화합물은 설포닐우레아의 대사작용으로 인해 간 및 신장 기능에 장애가 있는 환자에게는 조심스럽게 투여해야 한다.

메트포르민과 같은 비구아니드 함유 제제의 메카니즘은 확실하게 규명되지는 않았으나, 비구아니드 화합물은 췌장의 인슐린 분비를 증가시킬 수 없음에도 불구하고 설포닐우레아 보다 더 효과적으로 혈당을 강하하고 저혈당 유발의 빈도도 낮다. 그러나 투여 초기에 구역질, 구토, 설사 및 발진 등을 야기할 수 있으며, 치명적인 락트산증(lactic acidosis)과 같은 부작용을 야기할 수 있으므로, 미국 내에서는 임상실험용 시약으로만 사용 가능하다.

설포닐우레아 및 비구아니드 함유 제제들은 상기와 같은 결점 및 부작용을 가지고 있으므로, 낮은 부작용 및 높은 안전성을 갖는 탁월한 혈당강하제가 필요한 실정이다.

본 발명에서 사용한 함초( Salicornia herbacea )는 명주아과(Chenopodiaceae)에 속하는 일년초로서, 신농초본경에는 맛이 짜다고 하여 함초(鹹草), 염초(鹽草) 또는 신령스러운 풀로 여겨 신초(神草)라고 적혀있으며, 해안이나 개펄, 염전 주위에 무리지어 자라서 '퉁퉁마디'라고도 불리우며, 1921년에 천연기념물로 지정되었다. 함초는 육지에 자라면서도 바닷물 속에 들어있는 갖가지 미네랄과 효소 성분 이 농축되어 있으며, 특히 함초 100g에 칼슘 671㎎, 마그네슘 661㎎, 칼륨 475㎎, 철 441㎎, 인 139㎎, 요오드 65.8㎎, 나트륨 6.5%, 염분 15.7% 등의 성분이 알려져 있고, 식물성 섬유질 5,200㎎ 및 숙변을 분해하는 효소군이 함유되어 있고, 이밖에 90여 가지의 미네랄이 골고루 들어있다. 약리작용으로는 비만증에 효과적이며, 위의 기능을 촉진하고, 신장염, 간염 및 고혈압, 저혈압, 빈혈증에 효과가 있고, 혈당 강하, 갑상선 기능의 향상 등의 작용을 한다.

이에 본 연구자는 부작용이 없으며 안전한 천연 제제를 이용한 당뇨병 질환 치료제를 개발하기 위하여 함초의 유기용매 가용 추출물 및 이로부터 분리된 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드를 포함하는 조성물이 스트렙토조토신 유도 고혈당 래트에서 수정체 알도즈 환원 효소(Rat Lens Aldose Reductase)와 솔비톨 축적(sorbitol Accumulation)을 저해함을 확인하여, 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료에 효능이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다

본 발명의 목적은 스트렙토조토신 유도 고혈당 래트에서 수정체 알도즈 환원 효소와 솔비톨 축적량 측정 실험에서 저해 활성을 나타내는 함초 유기 용매 가용 추출물 및 이로부터 분리된 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드를 포함하는 당뇨병의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 함초의 유기 용매 가용 추출물을 유효 성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.

상기 유기 용매 가용 추출물은 n-헥산, 디클로로에틸렌, 에틸아세테이트, n-부탄올의 유기 용매에 가용한 추출물을 포함하며, 바람직하게는 에틸아세테이트에 가용한 추출물을 포함한다.

또한, 본 발명은 함초의 유기 용매 가용 추출물로부터 분리된 하기 구조식 A로 표기되는 이소람네틴-3- O -β-D글루코시드를 포함하는 당뇨병의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

화학식 1

(A)

상술한 바와 같이, 본 발명의 함초의 유기 용매 가용 추출물 또는 이로부터 분리된 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드는 스트렙토조토신 유도 고혈당 래트에서 수정체 알도즈 환원 효소 및 솔비톨 축적을 억제하는 효과를 나타내므로, 당뇨병의 예방 및 치료용 의약품 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드 또는 에팔레스타트를 각각 위내 튜브를 통하여 25 및 50 mg/kg/day로 주입한 후 스트렙토조토신으로 유도된 래트당뇨 모델에서 수정체내에서 솔비톨의 축적에 미치는 효과를 측정한 도(** P<0.01, * P<0.05)이고,
도 2는 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드 또는 에팔레스타트를 각각 위내 튜브를 통하여 25 및 50 mg/kg/day로 주입한 후 스트렙토조토신으로 유도된 래트당뇨 모델에서 좌골신경에서 솔비톨의 축적에 미치는 효과를 측정한 도(** P<0.01)이며,
도 3은 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드 또는 에팔레스타트를 각각 위내 튜브를 통하여 25 및 50 mg/kg/day로 주입한 후 스트렙토조토신으로 유도된 래트당뇨 모델에서 적혈구내에서 솔비톨의 축적에 미치는 효과를 측정한 도(* P<0.05)이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 함초의 유기 용매 가용 추출물 및 이로부터 분리된 상기 구조식(A)의 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드는 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 함초 유기 용매 가용 추출물은 본 발명의 함초를 채집하여 건조하고 마쇄기로 분말화한 후, 함초 시료 중량의 약 2 내지 10배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 유기 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 메탄올로 실온에서 약 1일 내지 5주간, 바람직하게는 1주 내지 3주간 동안 환류 냉각 추출 등의 추출방법을 사용하여, 진공여과에 의해 상층액을 회수한 다음, 상기의 과정을 2 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복 수행하여 상층액을 모으고 감압농축하여 함초 조추출물을 수득할 수 있다.

더욱 구체적으로는 상기 공정으로 수득된 함초 조추출물, 바람직하게는 함초 메탄올 추출물을 동량의 물로 현탁시킨 후 이 현탁액에 n-헥산, 디클로로에틸렌, 클로로포름 또는 에틸아세테이트와 같은 유기 용매로 수차례 반복하여 얻어진 상등액을 감압농축 및 건조하여 유기 용매 가용부를 얻고 남은 물층(하층부)에 다시 부탄올, 프로판올 또는 메탄올 등과 같은 유기 용매를 가하여 추출 분획함으로써 유기 용매 가용부를 수득할 수 있다.

또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B., A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. , pp.6-7, 1998).

상기 유기 용매 가용 분획물중 활성이 가장 높은 에틸아세테이트 분획물을 전개 용매로서 디클로로에틸렌 및 메탄올의 혼합용매를 사용하여 컬럼 크로마토그래피를 반복 수행함으로써 여러 개의 소분획으로 분리한 후, 상기 소분획물들을 재결정 또는 기타의 컬럼 크로마토그래피를 통한 정제과정을 거쳐 본 발명의 구조식(A)의 화합물을 수득할 수 있다.

또한 추가로 문헌에 기재된 통상의 플라보노이드 분리 공정을 통하여 플라보노이드 화합물을 분리할 수도 있다(Manguro LOA, et al. , Phytochemistry., 63 , pp.497-502, 2003),(Rychlinska I, et al. , Acta Poloniae Pharmaceutica , 59 , pp.53-6, 2002).

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 함초 유기 용매 가용 추출물 또는 이로부터 분리된 상기 구조식(A)로 표기되는 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드를 유효성분으로 함유하는 약학조성물을 제공한다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 함초 추출물의 당뇨병에 대한 효과를 래트에서의 수정체 알도즈 환원 효소(Rat Lens Aldose Reductase)활성 및 솔비톨의 축적(Sorbitol Accumulation)에 대한 저해를 확인하는 실험을 통하여 본 발명의 추출물 및 화합물들의 당뇨병에 대한 저해활성을 확인할 수 있었다.

본 발명의 당뇨병의 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.

본 발명의 추출물 또는 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 또는 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하 게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물또는 화합물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물 또는 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 당뇨병의 예방 및 개선 효과를 나타내는 상기 함초 추출물 또는 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 당뇨병의 예방 및 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물 또는 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량 %로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물 또는 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과 당 등; 디사카라이드, 예를들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물 또는 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물 또는 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 또는 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예. 통계 처리 모든 실험의 결과들은 평균 ± 표준편차로 나타내었고 통계 처리는 스튜던트 티-테스트(Student t-test)를 실시하여 p<0.05를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다(*은 P<0.05, **는 P<0.01, ***는 P<0.001 로 대조군과 유의적으로 다름을 의미함).

실시예 1. 함초의 유기 용매 가용 추출물 또는 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드의 분리

1-1. 함초 물 추출물의 제조

함초(300g)를 마쇄기로 갈아 분말화한 후, 물 1ℓ를 가하여 3회 반복하여 온침(heating)하여 추출한 다음, 감압 농축하여 함초 물 추출물 50g을 수득하였다.

1-2. 함초 메탄올 추출물의 제조

함초(2㎏)를 마쇄기로 갈아 분말화한 후, 메탄올 5ℓ를 가하여 3회 반복하여 온침(heating)하여 추출한 다음, 감압 농축하여 함초 메탄올 추출물 215g을 수득하여 하기 실험예에서 시료로 사용하였다.

1-3. 함초 용매별 분획물의 제조

상기 실시예 1-2 단계에서 얻은 함초 메탄올 추출물(215g)을 물에 현탁시킨 후에, 각각 n-헥산, 디클로로에틸렌, 에틸아세테이트, n-부탄올, 물 순으로 극성이 낮은 용매부터 극성이 높은 용매순으로 순차적으로 용매 분획하였다. 먼저 물에 현탁시킨 함초 메탄올 추출물에 n-헥산을 첨가하여 용해한 다음, 이를 분획여두에서 n-헥산층에 용해되는 성분만 분리해서 진공 건조하였다. 이 과정을 3회 반복 수행하여 헥산 분획물을 수득하였다(128g). 남은 수층에 디클로로에틸렌을 첨가하여 분획여두에서 디클로로에틸렌 층에 용해되는 성분만 분리해서 진공건조하였다. 이 과정을 3회 반복 수행하여 디클로로에틸렌 분획물을 수득하였으며(20g), 남은 수층에 에틸아세테이트를 첨가하여 분획여두에서 에틸아세테이트층에 용해되는 성분만 분리해서 진공 건조하였다. 이 과정을 3회 반복 수행하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하였다(10g). 남은 수층에 n-부탄을 가하여 상기와 같은 방법으로 수행하여 n-부탄 분획물을 수득하였다(5g). 각 분획물을 하기 실험예에서 시료로 사용하였다.

1-4. 함초로부터 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드의 분리

상기 실시예 1-3단계에서 얻은 에틸아세테이트 분획물을 하기와 같이 실리카겔 크로마토그래피를 수행하여 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드를 분리하였다. 즉, 컬럼에 실리카겔을 채우고 디클로로에틸렌과 평형을 맞춘 다음, 에틸아세테이트 분획물 20g을 로딩하였다. 이동상으로는 처음에는 디클로로에틸렌을 이용하여 유출시키다가 메탄올의 비율을 1%씩 증가시켰다. 메탄올의 비율이 10% 이후부터는 10%씩 증가시켜 100개의 분획으로 분리하였다. 얻어진 분획중 20 내지 30 소분획에서 가장 활성이 높은 경향이 있었고, 이들 소분획으로부터 유효성분을 확인하였으며, ¹H- NMR, ¹³C-NMR 스펙트럼을 이용하여 분석한 결과 하기와 같은 물성치를 갖는 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드로 확인하였다.

¹ H-NMR(400MHz, DMSO- d ₆): δ12.61(1H, s, 50OH), 7.94(1H, d, J =2.0 Hz, H-2`), 7.49(1H, dd, J =8.4, 2.0Hz, H-6`), 6.91 (1H, d, J =8.4Hz, H-5`), 6.44(1H, d, J =2.0Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J =2.0Hz, H-6), 5.57 (1H, d J =7.4Hz, 글루코실 H-1``), 3.83(3H, s, -OCH3)

¹³ C-NMR (100MHz, DMSO-d ₆): δ177.4(C-4), 164.3 (C-7), 161.2 (C-5), 156.4 (C-2), 156.3 (C-9), 149.4(C04`), 146.9 (C-3`), 133.0 (C-3), 122.0 (C-6`), 121.1 (C-1`), 115.2 (C-5`), 113.4 (C-2`), 104.0 (C-10), 100.8 (C-1``), 98.7 (C-6), 93.7 (C-8), 77.5 (C-3``), 76.4 (C-5``), 74.3 (C-2``), 69.8 (C-4``), 60.6 (C-6``), 55.7 (-OCH ₃)

IR ν _max (KBr): 3383 (OH), 1652 (C=O), 1055 (C-O) ㎝ ^-1

FAB-MS: m/z 479 [M + H] ⁺

실험예 1. 시험관 내에서 알도즈 환원 효소 활성도 측정 실험

상기 실시예 1로부터 얻어진 조추출물, 용매별 분획물 및 화합물들의 당뇨병에 대한 저해활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 실험 과정을 변형하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다(Sato S, et al., Biochemical Pharmacology. , 40 , pp.1033-1042, 1992).

1-1. 효소의 조제 및 활성 측정

알도즈 환원 효소는 무게 250-280g의 냉동 흰쥐로부터 제거된 수정체로서, 수정체 균질액은 문헌에 기재된 방법에 따라 준비하였고(Hayman S, et al., Journal of Biological Chemistry , 240 , pp.877-882), 효소는 6.5U/㎎의 특이활성도를 가지는, 부분적으로 정제된 효소를 사용하였으며, 각각 1.0㎖로 나누어 -40℃에 저장하였다. 알도즈 환원효소에 대한 본 발명의 AR(aldose reductase) 저해실험에서, 기질은 D.L-글리세르알데히드(glyceraldehyde)를 사용하였으며, 효소에 대한 억제활성도는 4분 동안 340㎚에서 NADPH의 흡수가 감소하는 과정을 측정하는 분광학적 방법으로 측정하였다.

함초로부터 분리된 추출물과 개개 분획물들의 알도스 환원효소 억제효과는 기질인 D.L-글리세르알데히드에 대한 RLAR 효소에 의한 것으로 측정하였으며, RLAR 효소에서 실시예 1의 메탄올 추출물과 물 추출물들의 효소에 대한 저해율(%) 및 개개의 IC 50 의 값은 각각 표 1에 나타내었으며, 메탄올 추출물로부터 분리된 개개 분획물들의 저해율(%) 및 이들의 IC 50 의 값은 표 2에 나타내었다.

[표 1]

[표 2]

표 1에 나타난 바와 같이, 함초의 메탄올 추출물과 물 추출물은 농도에 따라 효소에 대하여 각각 서로 다른 활성도를 나타내었다. 메탄올 추출물과 물 추출물의 IC 50 값은 각각 약 4.99㎍/㎖와 13.90㎍/㎖로 측정되는 반면, 종래에 알도즈 환원 효소에 대한 저해제로 잘 알려진 테트라메틸렌 글루타릭산(이하, TMG)의 IC 50 의 값은 0.51㎍/㎖로 나타났으며, 함초로부터 분리된 메탄올 추출물로부터 얻어진 각각의 분획물들의 알도즈 환원 효소에 대한 저해 활성을 측정한 결과, 표 2에서 나타나는 바와 같이 에틸아세테이트 분획물의 IC 50 이 0.26㎍/㎖을 나타내어 알도즈 환원 효소에 대한 억제 활성이 가장 큰 것으로 확인되었다.

이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드의 IC 50 값 (1.44μM)은 TMG의 IC 50 값 (1.68μM)과 유사한 저해 활성을 나타내었으므로 알도즈 환원 효소의 중요한 저해제로 보여진다.

구조 변화에 따른 효능을 비교하기 위하여, 이소람네틴-3- O -β-D-루티노시드 및 이소람네틴의 저해 활성을 비교실험해 보았다. 3- O -모노사카라이드체의 플라보놀은 3번 위치에 수산화기를 가진 플라보놀 화합물보다 더 강한 저해 활성을 나타내었다. 또한 이소람네틴-3- O -글루코시드는 이소람네틴-3- O -루티노시드체보다 활성도가 더 높았다. 각 화합물들의 알도즈 환원 효소에 대한 저해효과를 실험한 결과를 표 3에서 기재하였다. 따라서 3- O -모노사카라이드체의 플라보놀이 AR 효소에 대하여 가장 저해 활성이 탁월함을 확인할 수 있었다.

[표 3]

실험예 2. 동물 실험에서 당뇨 유발 래트의 알도즈 환원 효소 측정 실험

본 실험에서 사용하는 실험동물로는 체중 250∼280 g의 SD계 수컷 흰쥐를 일주일 동안 습도 10%, 온도23±0.5℃로 유지되는 동물 사육장에서 명암은 12시간 간격으로 점등 및 소등하여 사육하였으며 먹이와 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 공급하였다. 0.05M 시트르산 (pH 4.5)으로 산성화시킨 인산 완충 염에 용해시킨 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ, Sigma Co., USA) 정맥주사를 1회 투여하여 (85mg/Kg) 당뇨를 유발시켰다.

STZ를 투약한 후, 4, 7, 24시간째 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드 또는 에팔레스타트(ONO Co. Ltd.)를 각각 25와 50mg/kg의 투약량으로 위내 튜브를 통하여 래트에 주입하였다. 마지막 투여 후 3시간 뒤, 체액 샘플은 모으고 수정체와 좌골 신경을 떼어내었다. 혈장 포도당 수치는 통상적으로 사용되는 문헌에 기재된 포도당 산화 효소 방법을 기초로 하여 측정하였으며(Trinder P., Annals of Clinical Biochemistry , 6 , pp.24-27, 1969), 헤모글로빈내의 글루코실화 헤모글로빈의 양은 문헌에 기재된 바와 같이 드라킨(Drabkin) 시약 키트 525를 사용하여 측정하였고(Drabkin DS, et al. , Journal of Biological Chemistry, 98 , p.719, 1932), 쥐의 수정체, 좌골 신경과 적혈구 내의 솔비톨 함유량은 효소학적으로 측정하였다.

동물 실험에서 함초로부터 나온 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드의 유효성을 확인하기 위해 STZ를 주입하여 고혈당을 유발시킨 래트의 수정체, 좌골 신경과 적혈구내에서의 포도당 축적의 효과를 실험하였다.

당뇨모델 래트에서 혈중 포도당의 수치는 일반 래트에 비하여 현저하게 상승되었으며, 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드의 투여는 STZ 주입 당뇨 쥐에서 현저한 감소를 보였다. 표 4에서는 STZ를 투여하여 당뇨를 유발한 쥐의 혈중 포도당 축적 실험에서 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드는 탁월한 저해 효과를 나타내었다.

[표 4]

실험예 3. 동물 실험에서 당뇨유발 쥐의 솔비톨 함유량 측정 실험

상기 실시예 1로부터 얻어진 조추출물, 용매별 분획물 및 화합물의 당뇨병 에 대한 저해활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 바와 같은 효소학적 어세이법을 변형하여 솔비톨의 축적량을 측정하였다(Clements RS, et al. , Science , 166 , pp.1007-1008, 1969).

0.5㎖의 조직의 단백질 제거 여과액에 0.05M의 글리신 1.0㎖을 포함하는 완충용액(pH 9.4), 0.2mM NAD와 솔비톨탈수소 효소 0.64 U를 포함한 반응 혼합물을 넣고, NAD 또는 솔비톨 탈수소 효소를 넣지 않은 여과액과 동시에 실험을 수행하였다. NADH에 기인한 상대적 형광도는 여기 상태(366nm) 및 방출 파장(452nm)에서 각각 측정되었다.

수정체, 좌골 신경과 적혈구내에서의 평균 솔비톨의 축적량은 도 1 내지 도 3에 나타내었다. 당뇨병에 걸린 래트의 수정체내의 솔비톨 축적량(2.01± 0.14 nmol/mg 건조중량)은 일반 래트의 축적량(0.94± 0.06 nmol/mg 건조중량)보다 높았다. 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드 또는 에팔레스타트를 투여한 경우, 수정체 내에서의 솔비톨의 축적량은 각각 34.83%와 32.84%까지 감소하였다. 당뇨병에 걸린 래트에서의 적혈구내의 솔비톨 축적량(309.59± 21.36 nmol/g Hb)은 보통 래트에서의 적혈구내의 솔비톨의 축적량(45.03± 4.78 nmol/g Hb)보다 훨씬 높았다. 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드 또는 에팔레스타트를 투여한 쥐에서 적혈구내의 솔비톨의 축적량은 각각 44.19%와 71.6%를 나타내었다. 좌골신경에서 당뇨병에 걸린 래트의 솔비톨 축적량은 일반적 수치(0.61 nmol/mg 건조중량)에서 증가된 수치(1.09 nmol/mg 건조중량)로 증가함을 확인할 수 있었고, 또한 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드 또는 에팔레스타트는 각각 21.80% 와 24.52%의 솔비톨 축적량을 나타내었 다.

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

함초 추출물 분말 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

함초 추출물 분말 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

함초 추출물 분말 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

함초 추출물 분말 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na ₂ HPO ₄, 12H ₂ O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 음료의 제조

이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드 100 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B ₁ 0.25 g

비타민 B ₂ 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하 여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

함초( Salicornia herbacea )의 디클로로에틸렌 또는 에틸아세테이트 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 및 치료를 위한 약학조성물.
함초로부터 분리된 이소람네틴-3- O -β-D-글루코시드를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 및 치료를 위한 약학조성물.