WO2002064131A2 - Entzündungshemmende verbindungen - Google Patents

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WO2002064131A2
WO2002064131A2 PCT/EP2002/001323 EP0201323W WO02064131A2 WO 2002064131 A2 WO2002064131 A2 WO 2002064131A2 EP 0201323 W EP0201323 W EP 0201323W WO 02064131 A2 WO02064131 A2 WO 02064131A2
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    • C12N2501/85—Hormones derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C12N2501/86—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]

Definitions

  • the tridecapeptide ⁇ -melanocyte stimulating hormone arises from the precursor hormone pro-opiomelanocortin (POMC).
  • POMC pro-opiomelanocortin
  • Several biologically active peptide hormones such as ⁇ -lipotropin, adrenocorticotropin (ACTH), ⁇ -endorphin and the melanotropins ( ⁇ -, ⁇ - and ⁇ MSH) are derived from the POMC gene product.
  • Proteolytic enzymes with different specificities are necessary for the processing of these peptides.
  • post-translational modifications such as acetylations can take place.
  • ⁇ MSH and other POMC peptides are mediated by a family of specific receptors.
  • These melanocortin (MC) receptors belong to the group of G protein-coupled receptors. Five different melanocortin receptors (MC-1 to MC-5) were cloned. It is believed that ⁇ MSH is an important signal for the regulation of various melanocyte functions. For example, the proliferation, differentiation and cytokine production of melanocytes are to be influenced by ⁇ MSH.
  • WO 88/00833 discloses the use of the tripeptide Lys-Pro-Val for the manufacture of a medicament for the treatment of inflammation.
  • the C-terminal tripeptide of ⁇ MSH has also been proposed as an anti-hair loss agent (FR 2 733 421).
  • An object of the present invention is to provide further anti-inflammatory compounds.
  • the present invention therefore relates to the use of a compound of the formula (I)
  • inflammatory diseases includes not only inflammation but also those diseases in which inflammation is involved, such as autoimmune diseases or graft rejection.
  • Naturally occurring amino acids usually have the (L) configuration.
  • the amino acids of the compounds used according to the invention can have either the (L) or the (D) configuration. Possible connections of the KPT structure are therefore
  • the compound (L) Lys- (D) Pro (L) Thr is most preferred.
  • the compounds used according to the invention can also have amino acid exchanges, one of the amino acids being exchanged conservatively.
  • the compound of formula (I) used according to the invention can be chemically modified at the N-terminus and / or at the C-terminus, for example by an acyl group, preferably an acetyl group at the N-terminus and / or an amidation or esterification at the C-terminus. Further protecting groups known per se are also possible. The modifications can also affect the amino group in the side chain of lysine or the hydroxyl group of threonine. Other modifications are also conceivable on the NH 2 group side, for example extension by a glycine, and further amino acid residues up to the length of ⁇ -MSH. In the context of the present application, the term “compound of the formula (I)” also includes the pharmaceutically acceptable salts of the compound.
  • the compounds mentioned can be used to treat all types of acute or chronic inflammation. These include acute and chronic inflammation e.g. the skin, psoriasis, atopic dermatitis, allergic reactions of all kinds, from rhinitis to contact allergies to asthma and food allergies, autoimmune diseases, fibrosis and scleroderma and transplant rejection, but also vascular diseases.
  • the compounds are preferably used for the treatment of inflammatory conditions of the skin. In this case, it is advantageous to administer the compound in the form of an ointment or cream as a topical formulation.
  • the compound is usually contained in an ointment or cream in a concentration of 1 ⁇ M to 1 mM, preferably from 10 ⁇ M to 100 ⁇ M.
  • Such an ointment or cream can furthermore contain conventional constituents, as described, for example, in Braun-Falco et al. (1996) Dermatology and Venerology, Springer Verlag, Berlin or Merk, Bickers (1992) Dermatopharmacologie und Dermatotherapie.
  • the peptides can also be used according to the invention for inflammatory diseases of the intestine.
  • inflammatory diseases are also chronic diseases of the intestine such as Crohn's disease or ulcerative colitis.
  • the compounds can be used according to the invention for the treatment of inflammatory diseases of inflammation which occur in parts of the body which come into contact with the outside world. These are in particular mucous membranes of the mouth and gastrointestinal tract and the lungs.
  • the compounds used according to the invention are also systemically active in order to treat or prevent inflammation.
  • the compound is then preferably administered intraperitoneally, intravenously or orally.
  • the dose of an application is generally 20 ⁇ g to 10 mg / kg body weight, preferably 100 ⁇ g to 1 mg / kg body weight.
  • the compounds mentioned can also be used in sprays, for example for inhalation for the treatment of respiratory infections.
  • the compounds of formula (I) can also be used in the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of inflammation. All of the above-mentioned embodiments are covered by this use in an analogous manner.
  • the compound is usually mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. Methods known per se for the production of pharmaceuticals are given in Forth, Henschler, Rummel (1996) General and Special Pharmacology and Toxicology, Urban & Fischer.
  • the compounds of formula (I) can also be added to foods in order to reduce the allergic potential of certain food ingredients.
  • the invention therefore also relates to the use of a compound of the formula (I) as a food additive.
  • the concentration in food can then be 1 ⁇ M to 1 mM.
  • a compound of the formula (I) as a non-pharmaceutical additive in cosmetics.
  • creams can be used on irritated skin or after sun exposure, which contain a compound of formula (I).
  • the present invention further provides a method for the in vitro production of cells which can confer tolerance to an antigen, which comprises providing antigen-presenting cells which contain cells with ⁇ MSH or a biologically active derivative or fragment thereof Brings contact and the cells in contact with the antigen brings, the last two steps can be performed in any order or simultaneously.
  • antigen presenting cells there are different types of antigen presenting cells. Preferred according to the present invention are dendritic cells or Langerhans cells. It is not necessary that the antigen presenting cells be in a preparation that is free of other components or cells.
  • the antigen presenting cells can also be made available in a mixture with other cells. For example, epidermal cells are preferably made available, in which Langerhans cells are contained as antigen-presenting cells.
  • Dendritic cells from bone marrow can also be isolated, or dendritic cells can be isolated from in progenitor cells, e.g. PBMC are manufactured. Methods for providing antigen-presenting cells are described, for example, in Labeur et al. J. of Immunol. 162 (1): 168-175 (1999).
  • ⁇ MSH a biologically active derivative or fragment thereof.
  • Biologically active derivatives or fragments of ⁇ MSH are, for example, chemical modifications of ⁇ MSH, fragments of ⁇ MSH which comprise Lys, Lys-Pro, Lys-Pro-Val or Lys-Pro-Thr, or compounds which comprise one of the substances mentioned. A wide variety of modifications are conceivable as long as the biological activity of ⁇ MSH - the ability to induce tolerance - is essentially preserved.
  • Usual concentrations of ⁇ MSH or the derivatives mentioned when contacting the cells are 10 "6 M to 10 " 15 M, preferably 10 "8 M to 10 " 12 M.
  • the cells After contacting the cells with ⁇ MSH or a biologically active derivative or fragment thereof or before or simultaneously, the cells are brought into contact with the antigen against which tolerance is to be induced in vitro.
  • the antigen can be a protein against which there is a risk of an allergic reaction. If, for example, it is known which hapten of the antigen the immune reaction is directed against, the cells can only be brought into contact with the special hapten. These can be, for example, peptides with a length of 7 to 20 amino acids, preferably 7 to 15 amino acids.
  • the antigen-presenting cells can be washed after the steps mentioned and mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. The cells can then be introduced into a patient or into a mammal, whereupon tolerance to the hapten or antigen used arises.
  • Another aspect of the invention is the use of ⁇ MSH or a biologically active derivative or fragment thereof for the manufacture of a medicament for inducing tolerance to an antigen.
  • the medicament produced contains cells obtainable by the method described above for the in vitro production of cells which can confer tolerance.
  • the peptide Lys-Pro-Thr prevents the activation of the transcription factor NF-i B by TNF ⁇ , IL-1 or LPS in endothelial cells and in keratinocytes. As a result, there is a reduced expression of cell adhesion molecules (endothelial cells) and chemokines (keratinocytes).
  • the inventors were also able to show that, for example, the peptide KPT prevents the occurrence of contact allergies (contact hypersensitivity reactions, CHS reactions) and induces an allergen-specific, long-lasting tolerance.
  • a first contact (induction phase) with an antigen lays the foundation for the subsequent CHS reaction, further contact with the antigen leads to the occurrence of the reaction (contact eczema, i.e. swelling, itching, etc. ).
  • the compounds used according to the invention can be used before both sections; when used (injection or topical application) before the first contact, the CHS is suppressed and tolerance is induced; when used at the time the contact eczema is triggered, the compounds prevent the occurrence of eczema. In all of these applications there is a largely complete inhibition of the allergic reaction.
  • Lys-Pro-Thr has also been found to reduce expression of costimulatory molecules on dendritic cells. This is most likely part of the mechanism for suppressing CHS and tolerance induction. At the same time, the compounds increase the secretion of the anti-inflammatory IL-10 by monocytes. This effect is also part of the mechanism in the context of allergic contact eczema. Without wishing to be bound by theory in any way, the compounds according to the invention could bind to ⁇ -adrenergic receptors. Furthermore, it can be assumed that the peptides used according to the invention are capable of binding to the type I IL-1 receptor. It cannot be ruled out that the peptides according to the invention also bind to other receptors, such as the ⁇ -opioid receptor.
  • the peptides according to the invention can bind to several receptors which, after activation by their original ligands, would all intervene pro-inflammatively in the inflammatory process. Binding of the peptides according to the invention to these receptors prevents the binding of the original ligands to these receptors and thereby prevents the induction of the pro-inflammatory effects.
  • the binding of the peptides according to the invention to the receptors of their starting substances ( ⁇ MSH) activates these receptors and thus induces a further component of the mechanism of action, which is altogether anti-inflammatory.
  • Figure 1 shows that intravenous injection of ⁇ MSH, KPV or KPT suppresses the sensitization phase of CHS.
  • Figure 2 shows that the intravenous application of ⁇ MSH, KPV or KPT can induce tolerance.
  • Figure 3 illustrates IL-10 secretion by human PBL 24 hours after treatment with ⁇ MSH, KPV or KPT.
  • Figure 4 shows the IL-10 secretion by human PBL 48 hours after treatment with ⁇ MSH, KPV or KPT.
  • FIG. 5 shows that THP-1 cells express receptors for ⁇ MSH.
  • FIGS. 6a to d, 7a to d and 8a to d show that in a competition assay, unlabeled ⁇ MSH, KPV or KPT can displace biotin-labeled ⁇ MSH from binding sites on THP-1 cells.
  • FIG. 9a shows the expression of "Cell Adhesion Molecules" (CAMS) on the surface of HMEC-1 cells 24 hours after treatment by TNF ⁇ + ⁇ MSH or TNF ⁇ + KPT.
  • FIG. 9b shows the adhesion of lymphocytes to HDMEC (Chromium Release Assay).
  • A Molt4 T lymphocytes; B: JY B lymphocytes.
  • FIG. 10 shows the influence of ⁇ MSH, KP, KPV or KPT on NF-B activation in LPS-treated HMEC-1 cells.
  • FIG. 11 a shows that the number of E-selectin-expressing vessels in tissue sections is reduced by ⁇ MSH treatment.
  • Figure 11b shows that the number of petechial lesions on the ears of LPS-treated mice is reduced by ⁇ MSH treatment.
  • Figure 12 shows that by in vitro treatment of BMDC with ⁇ MSH or KP CHS can be suppressed and tolerance can be induced.
  • Figure 13a shows that in a NF-KB "band shift assay" the intensity of the NF- ⁇ B-p65 / p50 heterodimer bands is reduced by various ⁇ MSH-derived peptides.
  • FIG. 13b shows the effect of ⁇ MSH, KP or K on the CHS reaction and the effect of ⁇ MSH or KP on tolerance induction in BalbC mice.
  • FIG. 14 shows the CHS suppression by T cells which were contacted in vitro with antigen-loaded and ⁇ MSH or derivative-treated DC.
  • FIG. 15 shows the tolerance induction by T cells which were contacted in vitro with antigen-loaded and ⁇ MSH DC.
  • FIG. 16 shows the upregulation of CTLA-4 on T cells after contact with antigen-loaded and ⁇ MSH or derivative-treated DC.
  • A CD4 positive T cells
  • B CD8 positive T cells.
  • mice mice:
  • mice Female Balb / C mice, 7-10 weeks old, were obtained from Charles River (Sulzfeld, Germany) and maintained in accordance with federal regulations.
  • mice were sensitized by spreading 75 ul 0.5% DNFB in acetone olive oil (4: 1) on the shaved belly of naive mice.
  • the ears of the mice were coated with 10 ⁇ l 0.3% DNFB on both sides of one ear.
  • CHS was determined by the degree of ear swelling of the hapten-exposed ear compared to that of the other, control-treated ear and with a spring-loaded caliper measured 24 hours after hapten exposure. Mice whose ears were exposed to hapten without prior sensitization served as a negative control.
  • mice were i.v.
  • mice were exposed to hapten in one ear 7 days after sensitization and the ear swelling response was determined 24 to 36 hours later. 14 days later, the same mice were sensitized again on the shaved back (now in the absence of exogenous ⁇ MSH) and examined for their ability to induce a CHS response by a second exposure to the right ear a week later.
  • mice were smeared at the site of sensitization (abdomen) immediately before or 3 hours or 24 hours before sensitization.
  • mice were sensitized a second time and exposed to hapten. Mice injected with ⁇ MSH or KPV or KPT before the first sensitization could not even be sensitized by application of a second Haptenosis be sensitized, which indicates that these mice have developed tolerance to DNFB. KPV showed a weak effect, whereas ⁇ MSH and KPT and KP inhibited the swelling response very strongly (see Figures 2 and 13b).
  • PBMC Mononuclear cells
  • the monocytic cell line THP-1 was washed once in PBS, once in an acidic glycine buffer (50 mM glycine, 100 mM sodium chloride, pH 3) and three times with RPMI. The cells (2.5 ⁇ 10 6 per ml) were then resuspended in 100 ⁇ l RPMI / 1% BSA and transferred to 96-well microtiter plates.
  • biotin-labeled ⁇ MSH 10 "1 ° M
  • the cells were incubated for 1 hour at 4 ° C, washed once with PBS, resuspended in 100 ⁇ l PBS / 1% BSA and with FITC-labeled streptavidin (40 ⁇ g / ml ) Incubated in the dark for 30 minutes at 4 ° C. After a last washing step, the cells were resuspended in PBS.
  • the amount of bound biotin-labeled ⁇ MSH was analyzed with a flow cytometer. In control experiments, the cells were incubated without biotin-labeled ⁇ MSH but in the the presence of FITC-streptavidin.
  • THP-1 cells express one of the known melanocortin receptors (MC).
  • MC-1, MC-2, MC-3 and MC-4 specific primers Total RNA was obtained from THP-1 cells.
  • a PCR product specific for MC-1 with an expected length of 416 bp was detected (Rajora et al., 1996, J. Leuk. Biol., 59, 248).
  • PCR products specific to MC-2, MC-3 or MC-4 have not been detected.
  • the results show that THP-1 cells express MC-1 which, unlike other melanocortin receptors, is specific for ⁇ MSH and ACTH.
  • HDMEC Human Dermal Microvascular Endothelial Cells
  • HMEC-1 Human Microvascular Endothelial Cell Line 1
  • TNF ⁇ or LPS Human Dermal Microvascular Endothelial Cells
  • the cells were collected for RNA isolation at 3 and 6 hours after treatment or either for adhesion molecule EIA or FACS analysis 3, 6, 16 or 24 hours after treatment.
  • RNA was reverse transcribed and samples were subjected to a PCR for E-selectin, ICAM-1, VCAM or for ⁇ -actin as "housekeeping genes" in order to carry out a semi-quantitative determination.
  • the Endothelial cells are seeded in dishes and incubated with 51 Cr-labeled lymphocytes. After a washing step, the amount of remaining lymphocytes bound to the EC layer was determined by measuring the radioactivity in the samples.
  • ⁇ MSH significantly reduces the binding of T and B cells to LPS or TNF- ⁇ MSH-treated EC layers (see FIG. 9b). Taken together, these results show that ⁇ MSH has an effect on the adhesion of lymphocytes to EC and thus also reduces the extravasation of lymphocytes in conditions of tissue inflammation. This is supported by the in vivo data on localized vasculitis.
  • ECs Epidermal cells
  • HNK normal human keratinocytes
  • ESA Electrophoretic Mobility Shift Assay
  • Unlabeled oligonucleotide was used as a competitor.
  • antibodies against the p65 or p50 chain of NF-KB were used to confirm the identity of the detected bands as either p50 homodimer or p50 / p65 heterodimer.
  • mice were treated with LPS by SC injection on one ear.
  • This preparatory injection induces a long-term increase in E-selectin expression at the site of the LPS injection.
  • 24 hours later, a second dose of LPS was administered i.p. injected (Challenge).
  • This second LPS injection leads to rapid vascular necrolysis and the formation of petechial lesions, which can be easily identified due to their size and number.
  • ⁇ MSH 25 ⁇ g was administered at the time of the preparatory LPS injection.
  • Bone marrow dendritic cells were isolated from the femur of mice and treated with IL-4 and GM-CSF for 6 or 9 days. On days 6 and 9, the cells were treated with ⁇ MSH (2 x 10 "11 M) or the peptide KP (2 x 10 " 6 M) for 3 hours and Treated 2.5 hours prior to reinjection into naive mice with the same genetic background. 2 hours before reinjection, the cells were treated with hapten (1 mM DNBS, the water-soluble form of DNFB). Immediately before the reinjection, the cells were washed twice with PBS. 5 x 10 "5 cells were injected iv per animal. Control cells were either treated with DNBS alone or ⁇ MSH alone or were left untreated.
  • the animals were contacted at the ear with DNFB and the ear thickness was measured the next day. 2 weeks later, the animals were resensitized to DNFB and re-contacted 5 days later, finally ear swelling was measured.
  • Recipient animals injected with untreated cells or ⁇ MSH-treated cells did not show an immune response after the first "challenge” as expected.
  • Recipients that had been injected with DNBS-treated BMDC showed a corresponding CHS response at the time of the first "challenge”. This response was suppressed in animals injected with cells previously treated with TNBS and ⁇ MSH or TNBS and KP in vitro. The contact of DCs with ⁇ MSH or peptide is therefore sufficient to trigger the inhibition of CHS (see FIG. 12).
  • DC Dendritic cells
  • GM-CSF and IL-4 preferably: 250-1000 ⁇ / ml for each of the substances
  • the cells are loaded with antigen (concentration depends on the respective antigen, same period) and treated with ⁇ MSH or derivatives thereof.
  • the derivatives correspond at least to amino acids 12 and 13 of the ⁇ MSH (Lys-Pro); preference is given to derivatives containing Lys-Pro-Val. D and L configuration of the AS are possible, ditto conservative AS exchanges. This leads, inter alia, to the fact that the Lys-Pro-Thr derived from the IL-1 ⁇ can also be used, and derivatives thereof which are extended at the N-terminal. Derivatives extended at the C-terminal can also be used.
  • the peptide can be added before the antigen is added, simultaneously, later, once or several times (preferred dose depends on the respective peptide, for ⁇ MSH, for example, 10 "8 M to 10 -14 M).
  • the cells treated in this way are then injected iv into the recipient organism (ip or sc would also be possible); Mouse: 2 x 10 5 cells approximately lower limit. Depending on the antigen, it is sufficient to carry out a single injection or several injections. It is also possible that the injections have to be repeated after longer periods (no data are available yet).
  • the antigen loading of the DC can take place before the contact with the T cells or during this.
  • the T cells can also come from individuals already sensitized to the respective antigen. In the mouse, the lower limit is about 1 million T cells, more cells are preferred (FIGS. 14 and 15).
  • Advantages of such an application are the prevention of any kind of undesirable immune reaction, which are antigen-specific and in which antigen-specific lymphocytes (B or T cells) play a pathogenetic role. These include allergies, autoimmune diseases, chronic inflammation or implantations. If sufficiently high cell numbers are used, it is also possible to cure existing diseases.
  • ⁇ MSH is a potent immunomodulator and has numerous anti-inflammatory properties. This includes its ability to reduce the expression of co-stimulatory molecules to DC.
  • the derivatives of ⁇ MSH according to the invention have similar properties, right down to the C-terminal tripeptide and also the dipeptide Lys-Pro.
  • Derivatives with a different amino acid composition also have comparable properties, including in particular the Lys-Pro-Thr derived from IL-1ß (so that it can be assumed that N-terminally (analogously to ⁇ MSH) extended peptides with the IL-1ß co-linear sequence act the same).
  • DC professional antigen-presenting cells that are able to induce numerous types of immune reactions and that also determine the course of such reactions. These immune reactions include above all the T cell-mediated immune reactions.
  • the mechanism here seems to be that the antigen presentation of the DC is modulated by ⁇ MSH or derivatives in such a way that suppressor T cells are generated. It could thus be shown that T-cells in corresponding mixtures have a high expression of CTLA-4 (FIG. 16). This is one of the surface molecules that characterize suppressive T cells. With DC or T cells generated in this way, it is possible to preventively prevent autoimmune diseases, chronic inflammation or allergies. Rejection of implants or transplants can also be prevented. If sufficiently high cell numbers are used, it is also conceivable to cure an existing disease state.
  • the compounds according to the invention can also be used for tumor treatment by means of in situ activation of dendritic cells. This method can possibly also be used for tolerance in the presence of the peptides according to the invention.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung der Formel Lys-X, wobei X eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe, Alkoxy, Pro oder Pro- Thr ist, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, zur Behandlung von Entzündungen. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von αMSH zur Induktion von Toleranz.

Description

Entzündungshemmende Verbindungen
Das Tridekapeptid α-Melanocyten-stimulierendes Hormon (αMSH) entsteht aus dem Vorläuferhormon Pro-Opiomelanocortin (POMC). Mehrere biologisch aktive Peptidhormone wie z.B. ß-Lipotropin, Adrenocorticotropin (ACTH), ß-Endorphin und die Melanotropine (α-, ß- und γMSH) leiten sich von dem POMC-Genprodukt ab. Proteolytische Enzyme mit verschiedenen Spezifitäten sind zur Prozessierung dieser Peptide notwendig. Darüber hinaus können posttranslationale Modifikationen wie Acetylierungen stattfinden.
Die Effekte von αMSH und anderen POMC-Peptiden auf die verschiedenen Gewebe werden durch eine Familie spezifischer Rezeptoren vermittelt. Diese Melanocortin (MC)- Rezeptoren gehören zur Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Fünf verschiedene Melanocortinrezeptoren (MC-1 bis MC-5) wurden kloniert. Man nimmt an, daß αMSH ein wichtiges Signal zur Regulation verschiedener Melanocytenfunktionen ist. Beispielsweise sollen die Proliferation, Differenzierung und Cytokinproduktion von Melanocyten durch αMSH beeinflußt werden.
Es wurde auch gezeigt, daß POMC-Genprodukte Immunreaktionen und Entzündungsreaktionen beeinflussen können. Beispielsweise geht man davon aus, daß αMSH mehrere proinflammatorische Cytokine herunterreguliert, während die Produktion des antiinflammatorischen Cytokins IL-10 durch αMSH stimuliert wird. Damit hat αMSH eine wichtige Funktion bei der Suppression von Immun- und Entzündungsreaktionen. Mehrere Studien deuten darauf hin, daß die immunmodulatorischen und antiinflammatorischen Effekte von αMSH durch die C-terminale Region von αMSH (Aminosäuren 11-13: Lys-Pro-Val) vermittelt werden, da Verabreichung des C-terminalen Tripeptids hinreichend ist, um diese Effekte zu induzieren (Catania und Lipton, 1993, Endocr. Rev. 14, 564-576; Bhardvaj et al., 1996, J. Immunol. 156, 2517-2521).
WO 88/00833 offenbart die Verwendung des Tripeptids Lys-Pro-Val zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündungen. Das C-terminale Tripeptid von αMSH wurde ebenfalls vorgeschlagen als Mittel gegen Haarausfall (FR 2 733 421).
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere entzündungshemmende Verbindungen zur Verfügung zu stellen.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß das Tripeptid Lys-Pro-Thr antiinflammatorische Eigenschaften aufweist. Wider Erwarten zeigen sogar noch kleinere Verbindungen wie Lys-Pro und Lys vorteilhafte Eigenschaften.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung einer Verbindung der Formel (I)
O
II
H,N— CH -c— X
(CH2)4
(D, wobei X eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe, Alkoxy, Pro oder Pro-Thr ist, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, zur Behandlung und/oder Vorbeugung von entzündlichen Erkrankungen. Der Begriff "entzündliche Erkrankungen umfaßt nicht nur Entzündungen sondern auch solche Erkrankungen, bei denen eine Entzündung beteiligt ist wie beispielsweise Autoimmunerkrankungen oder Transplantatabstoßungen.
Die erfindungsgemäß verwendete Verbindung kann Lysin oder das Dipeptid Lysin-Prolin sein, bevorzugt wird aber das Tripeptid Lysin-Prolin-Threonin (=KPT) verwendet.
Natürlicherweise vorkommende Aminosäuren weisen meist die (L)-Konfiguration auf. Die Aminosäuren der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen können entweder die (L)- oder die (D)-Konfiguration haben. Mögliche Verbindungen der Struktur KPT sind somit
(L)Lys-(D)Pro-(L)Thr,
(L)Lys-(L)Pro-(D)Thr,
(L)Lys-(D)Pro-(D)Thr,
(L)Lys-(L)Pro-(L)Thr,
(D)Lys-(D)Pro-(L)Thr,
(D)Lys-(D)Pro-(D)Thr,
(D)Lys-(L)Pro-(L)Thr,
(D)Lys-(L)Pro-(D)Thr,
am bevorzugtesten ist die Verbindung (L)Lys-(D)Pro-(L)Thr. Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen können auch Aminosäureaustausche aufweisen, wobei eine der Aminosäuren konservativ getauscht wurde.
Die erfindungsgemäß verwendete Verbindung der Formel (I) kann am N-Terminus und/oder am C-Terminus chemisch modifiziert sein, beispielsweise durch eine Acylgruppe, vorzugsweise eine Acetylgruppe am N-Terminus und/oder eine Amidierung oder Veresterung am C-Terminus. Weitere an sich bekannte Schutzgruppen sind ebenfalls möglich. Die Modifikationen können auch die Aminogruppe in der Seitenkette von Lysin oder die Hydroxylgruppe von Threonin betreffen. Auch auf der Seite der NH2-Gruppe sind noch andere Modifikationen denkbar, z.B. Verlängerung um ein Glycin, sowie weitere Aminosäurereste bis zur Länge von α-MSH. Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung umfaßt der Begriff "Verbindung der Formel (I)" auch die pharmazeutisch verträglichen Salze der Verbindung.
Die genannten Verbindungen können zur Behandlung aller Arten akuter oder chronischer Entzündungen verwendet werden. Hierzu zählen unter anderem akute und chronische Entzündungen z.B. der Haut, Psoriasis, atopische Dermatitis, allergische Reaktionen aller Art, von Rhinitis über Kontaktallergien bis Asthma und Nahrungsmittelallergien, Autoimmunerkrankungen, Fibrösen und Sklerodermien und Transplantatabstoßung aber auch Gefäßerkrankungen. Vorzugsweise werden die Verbindungen zur Behandlung von entzündlichen Zuständen der Haut verwendet. In diesem Fall ist es vorteilhaft, die Verbindung in Form einer Salbe oder Creme als topische Formulierung zu verabreichen. Üblicherweise ist die Verbindung in einer Salbe oder Creme in einer Konzentration von 1 μM bis 1 mM enthalten, vorzugsweise von 10 μM bis 100 μM. Weiter können in einer derartigen Salbe oder Creme übliche Bestandteile enthalten sein, wie beispielsweise in Braun-Falco et al. (1996) Dermatologie und Venerologie, Springer Verlag, Berlin oder Merk, Bickers (1992) Dermatopharmakologie und Dermatotherapie beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Peptide erfindungsgemäß auch für entzündliche Erkrankungen des Darmes verwendet werden. Beispiele für entzündliche Erkrankungen sind neben kurzzeitigen Reizungen des Darmes, die durch leichtere Lebensmittelvergiftungen hervorgerufen werden, auch chronische Erkrankungen des Darmes wie Morbus Crohn oder Colitis Ulcerosa.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können die Verbindungen erfindungsgemäß zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen von Entzündungen verwendet werden die an Stellen des Körpers auftreten, die mit der Außenwelt in Kontakt treten. Hierbei handelt es sich insbesondere um Schleimhaut des Mund- und Magen- Darm-Traktes sowie der Lunge.
Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen sind jedoch auch systemisch wirksam um Entzündungen zu behandeln oder vorzubeugen. Die Verbindung wird dann vorzugsweise intraperitoneal, intravenös oder oral verabreicht. Die Dosis einer Applikation beträgt in der Regel 20 μg bis 10 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt 100 μg bis 1 mg/kg Körpergewicht. Schließlich können die genannten Verbindungen auch in Sprays, beispielsweise zur Inhalation zur Behandlung von Atemwegsentzündungen verwendet werden.
Es ist möglich, daß zur Behandlung mehrere verschiedene Verbindungen der Formel (I) eingesetzt werden. In dieser Ausführungsform werden wenigstens zwei verschiedene Verbindungen der Formel (I) zur Behandlung von Entzündungen verwendet.
Die Verbindungen der Formel (I) können auch zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Entzündungen verwendet werden. Alle oben angegebenen Ausführungsformen sind von dieser Verwendung in analoger Weise mit umfaßt. Die Verbindung wird üblicherweise mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel gemischt. An sich bekannte Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln sind in Forth, Henschler, Rummel (1996) Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie, Urban & Fischer angegeben.
Die Verbindungen der Formel (I) können auch Nahrungsmitteln zugesetzt werden um das allergische Potential bestimmter Nahrungsmittelbestandteile zu reduzieren. Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) als Nahrungsmittelzusatz. Die Konzentration in Nahrungsmitteln kann dann 1 μM bis 1 mM betragen.
Erfiπdungsgemäß ist es auch möglich, eine Verbindung der Formel (I) als nichtpharmazeutischen Zusatz in Kosmetika zu verwenden. Beispielsweise können Cremes bei gereizter Haut oder nach dem Sonnenbad eingesetzt werden, die eine Verbindung der Formel (I) enthalten.
Überraschenderweise wurde von den Erfindern ebenfalls gefunden, daß die Behandlung dendritischer Zellen in vitro mit einem Hapten und αMSH und anschließende Injektion der Zellen in Versuchstiere zur Entstehung Hapten-spezifischer Toleranz und zur Unterdrückung der CHS-Reaktion ("contact hypersensitivity reaction") führt. Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur in vitro-Herstellung von Zellen, die Toleranz gegen ein Antigen verleihen können, das umfaßt, daß man Antigen- präsentierende Zellen bereitstellt, die Zellen mit αMSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon in Kontakt bringt und die Zellen mit dem Antigen in Kontakt bringt, wobei die letzten beiden Schritte in beliebiger Reihenfolge oder gleichzeitig durchgeführt werden können.
Es gibt verschiedene Arten Antigen-präsentierender Zellen. Bevorzugt gemäß der vorliegenden Erfindung sind dendritische Zellen oder Langerhans-Zellen. Es ist nicht erforderlich, daß die Antigen-präsentierenden Zellen in einer Präparation vorliegen, die frei von anderen Bestandteilen oder Zellen ist. Die Antigen-präsentierenden Zellen können auch im Gemisch mit anderen Zellen zur Verfügung gestellt werden. Beispielsweise werden bevorzugt epidermale Zellen zur Verfügung gestellt, in denen als Antigen- präsentierende Zellen Langerhans-Zellen enthalten sind. Es können auch dendritische Zellen aus Knochenmark isoliert werden oder dendritische Zellen durch an sich bekannte in vitro-Kultur aus Vorläuferzellen wie z.B. PBMC hergestellt werden. Verfahren zur Bereitstellung Antigen-präsentierender Zellen sind beispielsweise in Labeur et al. J. of Immunol. 162(1):168-175 (1999) beschrieben.
Die Zellen werden dann in vitro mit αMSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon in Kontakt gebracht werden. Biologische aktive Derivate oder Fragmente von αMSH sind beispielsweise chemische Modifikationen von αMSH, Fragmente von αMSH, die Lys, Lys-Pro, Lys-Pro-Val oder Lys-Pro-Thr umfassen, oder Verbindungen, die eine der genannten Substanzen umfassen. Es sind verschiedenste Abwandlungen denkbar, solange die biologische Aktivität von αMSH - die Fähigkeit zur Toleranzinduktion - im wesentlichen erhalten ist. Übliche Konzentrationen von αMSH oder den genannten Derivaten beim Inkontaktbringen mit den Zellen sind 10"6 M bis 10"15 M, vorzugsweise 10"8 M bis 10"12 M.
Nach Inkontaktbringen der Zellen mit αMSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon oder vorher oder gleichzeitig werden die Zellen in vitro mit dem Antigen, gegen das Toleranz induziert werden soll, in Kontakt gebracht. Das Antigen kann dabei ein Protein sein, gegen das die Gefahr einer allergischen Reaktion besteht. Wenn beispielsweise bekannt ist, gegen welches Hapten des Antigens sich die Immunreaktion richtet, können die Zellen auch nur mit dem speziellen Hapten in Kontakt gebracht werden. Dabei kann es sich beispielsweise um Peptide in der Länge von 7 bis 20 Aminosäuren, vorzugsweise von 7 bis 15 Aminosäuren handeln. Die Antigen-präsentierenden Zellen können nach den genannten Schritten gewaschen werden und mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff oder Verdünnungsmittel gemischt werden. Die Zellen können dann in einen Patienten oder in ein Säugetier eingebracht werden, woraufhin Toleranz gegen das verwendete Hapten bzw. Antigen entsteht.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von αMSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induktion von Toleranz gegen ein Antigen. Vorzugsweise enthält das hergestellte Arzneimittel Zellen, die durch das oben beschriebene Verfahren zur in vitro-Herstellung von Zellen, die Toleranz verleihen können, erhältlich sind.
Das Peptid Lys-Pro-Thr verhindert die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-i B durch TNFα, IL-1 oder LPS in Endothelzellen und in Keratinocyten. In der Folge kommt es zu einer verminderten Expression von Zeiladhäsionsmolekülen (Endothelzellen) und Chemokinen (Keratinocyten). Die Erfinder konnten auch zeigen, daß beispielsweise das Peptid KPT das Auftreten von Kontaktallergien (Contact Hypersensitivity Reactions, CHS Reactions) verhindert und eine Allergen-spezifische, langanhaltende Toleranz induziert. Bei den CHS-Reaktionen sind zwei Abschnitte zur unterscheiden: Ein Erstkontakt (Induktionsphase) mit einem Antigen legt den Grundstein für die spätere CHS-Reaktion, ein weiterer Kontakt mit dem Antigen führt zum Auftreten der Reaktion (Kontaktekzem, also Schwellung, Juckreiz, etc.). Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen können vor beiden Abschnitten eingesetzt werden, bei Einsatz (Injektion oder topische Applikation) vor dem Erstkontakt kommt es zur Unterdrückung der CHS und zur Toleranzinduktion, bei Einsatz zur Zeit der Auslösung des Kontaktekzems verhindern die Verbindungen das Auftreten des Ekzems. In allen diesen Anwendungen kommt es zu einer weitgehend kompletten Inhibition der allergischen Reaktion.
Es wurde ebenfalls gefunden, daß Lys-Pro-Thr die Expression costimulatorischer Moleküle auf dendritischen Zellen reduziert. Dies ist höchstwahrscheinlich ein Teil des Mechanismus bei der Unterdrückung der CHS und der Toleranzinduktion. Gleichzeitig erhöhen die Verbindungen die Sekretion des antiinflammatorischen IL-10 durch Monocyten. Dieser Effekt ist ebenfalls Teil des Mechanismus im Rahmen der allergischen Kontaktekzeme. Ohne in irgendeiner Art und Weise an eine Theorie gebunden sein zu wollen, könnten die erfindungsgemäßen Verbindungen an ß-adrenerge Rezeptoren binden. Weiterhin kann davon ausgegangen werden, daß die erfindungsgemäß eingesetzten Peptide zur Bindung an den IL-1 Rezeptor vom Typ I befähigt sind. Nicht ausgeschlossen werden kann auch, daß die erfindungsgemäßen Peptide auch noch an weitere Rezeptoren, wie beispielsweise den κ-Opioid-Rezeptor binden. Ausgehend von dieser Annahme wird vermutet, daß die erfindungsgemäßen Peptide an mehrere Rezeptoren binden können, die nach Aktivierung durch ihre Original-Liganden alle pro-inflammatorisch in das Entzündungsgeschehen eingreifen würden. Durch die Bindung der erfindungsgemäßen Peptide an diese Rezeptoren wird die Bindung der Original-Liganden an diese Rezeptoren verhindert und dadurch wird die Induktion der pro-inflammatorischen Effekte verhindert. Andererseits aktiviert die Bindung der erfindungsgemäßen Peptide an die Rezeptoren ihrer Ausgangssubstanzen (αMSH) diese Rezeptoren und induziert somit eine weitere Komponente des Wirkmechanismus, der insgesamt antientzündlich ist.
Figur 1 zeigt, daß die intravenöse Injektion von αMSH, KPV oder KPT die Sensibilisierungsphase von CHS unterdrückt.
Figur 2 zeigt, daß die intravenöse Applikation von αMSH, KPV oder KPT Toleranz induzieren kann.
Figur 3 illustriert die IL-10-Sekretion durch humane PBL 24 Stunden nach Behandlung mit αMSH, KPV oder KPT.
Figur 4 zeigt die IL-10-Sekretion durch humane PBL 48 Stunden nach Behandlung mit αMSH, KPV oder KPT.
Figur 5 zeigt, daß THP-1-Zellen Rezeptoren für αMSH exprimieren.
Die Figuren 6a bis d, 7a bis d und 8a bis d zeigen, daß in einem Kompetitionsassay unmarkiertes αMSH, KPV oder KPT Biotin-markiertes αMSH von Bindungsstellen auf THP- 1-Zellen verdrängen können. Figur 9a zeigt die Expression von "Cell Adhesion Molecules" (CAMS) auf der Oberfläche von HMEC-1-Zellen 24 Stunden nach Behandlung durch TNFα + αMSH oder TNFα + KPT.
Figur 9b zeigt die Adhäsion von Lymphocyten an HDMEC (Chromium Release Assay). A: Molt4 T-Lymphocyten; B: JY B-Lymphocyten.
Figur 10 zeigt den Einfluß von αMSH, KP, KPV oder KPT auf die NF- B-Aktivierung in LPS-behandelten HMEC-1-Zellen.
Figur 11a zeigt, daß die Anzahl E-Selektin-exprimierender Gefäße in Gewebeschnitten durch αMSH-Behandlung erniedrigt wird.
Figur 11b zeigt, daß die Anzahl petechialer Läsionen an den Ohren LPS-behandelter Mäuse durch αMSH-Behandlung reduziert wird.
Figur 12 zeigt, daß durch in vitro-Behandlung von BMDC mit αMSH oder KP CHS unterdrückt und Toleranz induziert werden kann.
Figur 13a zeigt, daß in einem NF-KB "Band Shift Assay" die Intensität der NF-κB-p65/p50- Heterodimerbande durch verschiedene von αMSH abgeleitete Peptide erniedrigt wird.
Figur 13b zeigt den Effekt von αMSH, KP oder K auf die CHS-Reaktion und den Effekt von αMSH oder KP auf Toleranzinduktion in BalbC-Mäusen.
Figur 14 zeigt die CHS-Unterdrückung durch T-Zellen, die in vitro mit Antigen-beladenen und αMSH bzw. Derivat-behandelten DC kontaktiert wurden.
Figur 15 zeigt die Toleranz-Induktion durch T-Zellen, die in vitro mit Antigen-beladenen und αMSH DC kontaktiert wurden.
Figur 16 zeigt die Aufregulation von CTLA-4 auf T-Zellen nach Kontakt mit Antigen- beladenen und αMSH bzw. Derivat-behandelten DC. A: CD4 positive T-Zellen; B: CD8 positive T-Zellen.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Beispiel 1
Mäuse:
7 bis 10 Wochen alte, weibliche Balb/C-Mäuse wurden von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) erhalten und gemäß Bundesbestimmungen gehalten.
Verabreichung von αMSH oder KPV oder KPT oder KP:
αMSH und die Peptide wurden als Aliquots bei -20°C bis zur Verwendung aufbewahrt. Vor der Injektion wurde die jeweilige Verbindung in PBS, 0,1% Mausserum gelöst und bis zur i.v.-lnjektion in die Schwanzvene der Mäuse auf Eis gelagert. 5 μg αMSH oder 1 ,5 μg Peptid (KP: 50 μg) pro Maus wurden 2 Stunden vor der Sensibilisierung injiziert. Bestimmung von CHS und Toleranz:
Die Mäuse wurden durch Verstreichen von 75 μl 0,5% DNFB in Aceton-Olivenöl (4:1) auf dem rasierten Bauch naiver Mäuse sensibilisiert. Zur Auslösung der CHS wurden die Ohren der Mäuse mit 10 μl 0,3% DNFB auf beiden Seiten eines Ohres bestrichen. CHS wurde bestimmt durch den Grad der Ohrschwellung des Hapten-exponierten Ohres verglichen mit dem des anderen, kontrollbehandelten Ohres und mit einem federgespannten Greifzirkel 24 Stunden nach Hapten-Exposition gemessen. Mäuse, deren Ohren ohne vorherige Sensibilisierung Hapten-exponiert wurden, dienten als Negativkontrolle. Um zu bestimmen, ob die Injektion von αMSH oder Peptiden vor der Haptenapplikation zur Toleranzinduktion führt, wurden Mäuse i.v. mit αMSH oder Peptiden 2 Stunden vor der Sensibilisierung injiziert (Abdomen) oder exponiert (linkes Ohr) wie beschrieben. Zur Bestätigung der αMSH-induzierten Suppression von CHS wurden Mäuse 7 Tage nach der Sensibilisierung an einem Ohr Hapten-exponiert und die Ohrschwellungsantwort 24 bis 36 Stunden später bestimmt. 14 Tage später wurden dieselben Mäuse nochmals am rasierten Rücken sensibilisiert (jetzt in Abwesenheit von exogenem αMSH) und auf ihre Fähigkeit hin untersucht, eine CHS-Antwort durch eine zweite Haptenexposition am rechten Ohr eine Woche später zu induzieren.
In einigen Experimenten wurden topische Zubereitungen von αMSH benutzt. In diesen Experimenten wurden die Mäuse am Ort der Sensibilisierung (Abdomen) unmittelbar vor oder 3 Stunden oder 24 Stunden vor der Sensibilisierung bestrichen.
Ergebnis:
l.v.-lnjektion von αMSH sowie von KPV oder KPT oder KP inhibiert die Fähigkeit der Mäuse, eine CHS-Antwort auf eine 7 Tage später erfolgte DNFB-Exposition zu induzieren. Diese Mäuse entwickeln somit keine DNFB-spezifische Sensibilisierung. KPT unterdrückte die CHS-Antwort am effektivsten (siehe Figur 1 und 13b).
Um zwischen temporärer Immunsuppression und spezifischer immunologischer Toleranz zu unterscheiden wurden Mäuse ein zweites Mal sensibilisiert und Hapten-exponiert. Mäuse, die vor der ersten Sensibilisierung mit αMSH oder KPV oder KPT injiziert worden waren, konnten nicht einmal durch Applikation einer zweiten sensibilisierenden Haptendosis sensibilisiert werden, was darauf hindeutet, daß diese Mäuse gegen DNFB Toleranz entwickelt haben. KPV zeigte einen schwachen Effekt, wohingegen αMSH und KPT und KP die Ohrschwellungsantwort sehr stark hemmten (siehe Figur 2 und 13b).
Beispiel 2
Material und Methoden:
Mononukleäre Zellen (PBMC) wurden von "Human Buffy Coats" durch Ficoll-Hypaque- Dichtegradientenzentrifugation getrennt. Zellen (1 x 106 pro ml), kultiviert in RPMI 1640 mit Antibiotika und 10% FCS wurden entweder nicht behandelt oder mit αMSH oder den Peptiden KPV oder KPT mit oder ohne IL-1ß (10 U/ml) stimuliert. Die Überstände der PBMC-Kulturen wurden nach 24 oder 48 Stunden Inkubation gesammelt und bei -20°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Zur Detektion von IL-10 wurde ein kommerziell erhältlicher ELISA eingesetzt.
Ergebnisse:
Humane PBMC, die nicht behandelt wurden oder mit verschiedenen Konzentrationen an αMSH oder Peptiden behandelt worden sind, produzierten nach 24 Stunden Inkubation nur niedrige Konzentrationen an IL-10 (5-10 pg/ml). αMSH (10"11 M), KPV (10'8 bis 10"9 M) und KPT (10"8 bis 10"9 M) induzierten offensichtlich IL-10-Produktion (siehe Figur 3).
Nach 48 Stunden Inkubation produzierten die humanen PBMC signifikante Mengen an IL- 10. αMSH, KPV und KPT erhöhten signifikant die Produktion von IL-10 durch humane PBLC. Es gab keinen wesentlichen Unterschied zwischen αMSH und den Peptiden (siehe Figur 4).
Die gezeigten Ergebnisse beweisen, daß das Peptid KPT wie αMSH und KPV nach intravenöser Applikation die Sensibilisierung von CHS hemmen kann und Hapten- spezifische Toleranz induzieren kann. KPT ist auch in der Lage, IL-10 in vivo und in vitro zu induzieren. Die Daten machen es auch wahrscheinlich, daß der immunsuppressive Effekt von αMSH in vivo nicht nur von der IL-10-lnduktion abhängt. Beispiel 3
Material und Methoden:
Alle Schritte wurden bei 0 bis 4°C durchgeführt. Die monocytische Zellinie THP-1 wurde einmal in PBS, einmal ein saurem Glycinpuffer (50 mM Glycin, 100 mM Natriumchlorid, pH 3) und dreimal mit RPMI gewaschen. Anschließend wurden die Zellen (2,5 x 106 pro ml) in 100 μl RPMI/1% BSA resuspendiert und in 96-Well-Mikrotiterplatten transferiert. Nach Zugabe von Biotin-markiertem αMSH (10"1° M) wurden die Zellen 1 Stunde bei 4°C inkubiert, einmal mit PBS gewaschen, in 100 μl PBS/1% BSA resuspendiert und mit FITC- markiertem Streptavidin (40 μg/ml) 30 Minuten bei 4°C im Dunklen inkubiert. Nach einem letzten Waschschritt wurden die Zellen in PBS resuspendiert. Die Menge an gebundenem Biotin-markiertem αMSH wurde mit einem Durchflußcytometer analysiert. In Kontrollexperimenten wurden die Zellen ohne Biotin-markiertes αMSH inkubiert aber in der Gegenwart von FITC-Streptavidin. Tote Zellen wurden durch Zugabe von Propidiumiodid kurz vor der FACS-Analyse ausgeschlossen. Die Spezifität der Bindung des Biotin- markierten MSH wurde durch Zugabe von unmarkiertem αMSH (10"6 bis 10'12 M) oder KPV oder KPT (10~6 bis 10'12 M) bestimmt.
Ergebnisse:
Nach FACS-Analyse mit Biotin-markiertem αMSH exprimieren unstimulierte THP-1 -Zellen signifikante Mengen an Bindestellen, die spezifisch sind für αMSH im Vergleich zu Kontrollansätzen, die nur mit FITC-Streptavidin inkubiert werden. In diesem Experiment wurde αMSH in einer Konzentration von 10"10 M eingesetzt (siehe Figur 5).
Um zu bestimmen, ob THP-1-Zellen einen der bekannten Melanocortinrezeptoren (MC) exprimieren, wurde RT-PCR durchgeführt mit MC-1-, MC-2-, MC-3- und MC-4-spezifischen Primern. Gesamt-RNA wurde aus THP-1-Zellen gewonnen. Ein PCR-Produkt spezifisch für MC-1 mit einer erwarteten Länge von 416 bp wurde detektiert (Rajora et al., 1996, J. Leuk. Biol., 59, 248). PCR-Produkte spezifisch für MC-2, MC-3 oder MC-4 wurden nicht nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, daß THP-1-Zellen MC-1 exprimieren, welches im Gegensatz zu anderen Melanocortinrezeptoren spezifisch für αMSH und ACTH ist. Um zu untersuchen, ob die Bindestellen, die auf THP-1 exprimiert werden, spezifisch für αMSH sind, wurden Kompetitionsexperimente mit αMSH oder KPV oder KPT durchgeführt. Die spezifische Bindung wurde ermittelt durch Inkubation von THP-1-Zellen mit Biotin- markiertem αMSH (10"1° M) und unterschiedlichen Konzentrationen an unmarkiertem αMSH oder Peptiden. Unmarkiertes αMSH in einer Konzentration von 10'8 M unterdrückte signifikant die αMSH-Bindung. Wenn αMSH in Konzentrationen von 10"6 M, 10"10 M oder 10'12 M eingesetzt wurde, konnte keine signifikante Suppression beobachtet werden (Figuren 6a bis 6d).
Wenn unmarkiertes KPV eingesetzt wurde, konnte eine signifikante Inhibition nur bei einer Konzentration von 10"6 M beobachtet werden (siehe Figuren 7a bis 7d).
Im Fall des Peptids KPT konnte eine signifikante Hemmung der αMSH-Bindung bei jeder ddeerr g < etesteten Konzentrationen beobachtet werden (10"e bis 10~12 M, siehe Figuren 8a bis
8d).
Diese Ergebnisse zeigen, daß das Peptid KPT an den Melanocortinrezeptor auf THP-1- Zellen bindet, der spezifisch für αMSH ist, was darauf hindeutet, daß αMSH und KPT eine gemeinsame Bindestelle aufweisen. Da KPT aber bereits in sehr geringen Konzentrationen Kompetition um den Rezeptor zeigt, ist es wahrscheinlich, daß dieses Peptid sogar eine höhere Affinität zu MC-1-Rezeptor hat als MSH.
Beispiel 4
Material und Methoden:
"Human Dermal Microvascular Endothelial Cells" (HDMEC) und die Zellinie HMEC-1 (Human Microvascular Endothelial Cell Line 1) wurden entweder mit TNFα oder LPS in Gegenwart oder Abwesenheit eines der Peptide behandelt. Die Zellen wurden zur RNA- Isolation nach 3 und nach 6 Stunden nach Behandlung gesammelt oder entweder für Adhäsionsmolekül-EIA oder FACS-Analyse 3, 6, 16 oder 24 Stunden nach Behandlung gesammelt. RNA wurde revers transkribiert und Proben einer PCR für E-Selektin, ICAM-1, VCAM oder für ß-Aktin als "Housekeeping Gene" unterworfen um eine semiquantitative Bestimmung durchzuführen. Für den Lymphocytenadhäsionsassay wurden die Endothelzellen in Schalen ausgesät und mit 51Cr-markierten Lymphocyten inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde die Menge übriger Lymphocyten, die an den EC-Layer bebunden waren, durch Messung der Radioaktivität in den Proben bestimmt.
Ergebnisse:
Behandlung der Endothelzellen mit αMSH oder KPT hemmte die LPS- oder TNFα- induzierte Expression von Adhäsionsmolekülen. Dieser Effekt wurde in einem Konzentrationsbereich von 10"6 bis 10"12 M αMSH oder Peptid beobachtet. Das Peptid KPT hatte den stärksten Effekt auf die Expression von Adhäsionsmolekül-mRNA.
Die durch LPS oder TNFα induzierte Oberflächenexpression von Adhäsionsmolekülen wurde in geringem Maß durch alle Agonisten reduziert. Diese Daten wurden sowohl durch EIA gewonnen, wobei ganze Zellen eingesetzt wurden, als auch durch FACS mit spezifischen Antikörpern (siehe Figur 9a, die EIA-Daten zeigt).
αMSH reduziert signifikant die Bindung von T- und B-Zellen an LPS- oder TNF-αMSH- behandelte EC Layer (siehe Figur 9b). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, daß αMSH eine Auswirkung auf die Adhäsion von Lymphocyten an EC hat und somit auch die Extravasation von Lymphocyten in Zuständen der Gewebeentzündung reduziert. Dies wird unterstützt durch die in vivo Daten zur lokalisierten Vaskulitis.
Beispiel 5
Material und Methoden:
Epidermale Zellen (ECs) oder normale humane Keratinocyten (HNK) wurden mit IL-1 , LPS oder TNFα behandelt in Gegenwart oder Abwesenheit von Peptiden. Nach 15 oder 30 Minuten wurden die Kernproteine gewonnen und einem "Electrophoretic Mobility Shift Assay" (EMSA) mit radioaktiv markiertem Oligonudeotid mit NF-icB-spezifischer Bindungssequenz unterworfen. Unmarkiertes Oligonudeotid wurde als Kompetitor verwendet. In einigen Experimenten wurden Antikörper gegen die p65- oder p50-Kette von NF-KB verwendet, um die Identität der detektierten Banden als entweder p50-Homodimer oder p50/p65-Heterodimer zu bestätigen. Ergebnis:
In TNFα- oder LPS-behandelten ECs sowie in IL-1-behandelten HNKs führt die Zugabe der Peptide zu einer reduzierten Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-KB (siehe Figuren 10 und 13a). Dies wiederum führt zu einer Abschwächung der Transkription der Gene für zahlreiche proinflammatorische Mediatoren (Cytokine, Chemokine, Adhäsionsmöleküle, etc.). Die Identität der beobachteten Banden in dem EMSA als NF- icB-Heterodimer wurde durch Einsatz von Anti-p65-Antikörper bestätigt.
Beispiel 6
Material und Methoden:
Mäuse wurden durch s.c.-lnjektion an einem Ohr mit LPS behandelt. Diese vorbereitende Injektion induziert einen langandauernden Anstieg in der E-Selektinexpression an der Stelle der LPS-Injektion. 24 Stunden später wurde eine zweite LPS-Dosis i.p. injiziert (Challenge). Diese zweite LPS-Injektion führt zu schneller Gefäßnekrolyse und zur Bildung petechialer Läsionen, die aufgrund ihrer Größe und Anzahl leicht ermittelt werden können. αMSH (25 μg) wurde zum Zeitpunkt der vorbereitenden LPS-Injektion verabreicht.
Ergebnis:
Injektion von αMSH zum Zeitpunkt der vorbereitenden LPS-Verabreichung hemmt die Induktion lokaler E-Selektinexpression im Ohr (siehe Figur 11a) und reduziert signifikant die Anzahl und Größe der petechialen Läsionen, die nach der "Challenge"-lnjektion von LPS gebildet werden (siehe Figur 11b).
Beispiel 7
Material und Methoden:
Dendritische Zellen aus Knochenmark (BMDC) wurden aus den Femurknochen von Mäusen isoliert und mit IL-4 und GM-CSF für 6 oder 9 Tage behandelt. An Tag 6 bzw. 9 wurden die Zellen mit αMSH (2 x 10"11 M) oder dem Peptid KP (2 x 10"6 M) 3 Stunden und 2,5 Stunden vor Reinjektion in naive Mäuse mit demselben genetischen Hintergrund behandelt. 2 Stunden vor Reinjektion wurden die Zellen mit Hapten (1 mM DNBS, der wasserlöslichen Form von DNFB) behandelt. Unmittelbar vor der Reinjektion wurden die Zellen 2 x mit PBS gewaschen. 5 x 10"5 Zellen wurden je Tier i.v. injiziert. Kontrollzellen wurden entweder mit DNBS allein oder αMSH allein behandelt oder wurden unbehandelt gelassen. 5 Tage nach Injektion wurden die Tiere am Ohr mit DNFB kontaktiert und die Ohrdicke wurde am nächsten Tag gemessen. 2 Wochen später wurden die Tiere mit DNFB resensibilisiert und wiederum 5 Tage später am Ohr rekontaktiert. Schließlich wurde die Ohrschwellung gemessen.
Ergebnisse:
Empfängertiere, die mit unbehandelten Zellen oder αMSH-behandelten Zellen injiziert wurden, zeigten keine Immunreaktion nach der ersten "Challenge", wie erwartet. Empfängertiere, die mit DNBS-behandelten BMDC injiziert worden waren, zeigten eine entsprechende CHS-Reaktion zum Zeitpunkt der ersten "Challenge". Diese Reaktion wurde in Tieren suprimiert, die mit Zellen injiziert worden waren, die vorher mit TNBS und αMSH oder TNBS und KP in vitro behandelt worden waren. Somit ist der Kontakt von DCs mit αMSH oder Peptid hinreichend um die Hemmung der CHS auszulösen (siehe Figur 12).
Zum Zeitpunkt der zweiten "Challenge" und der entsprechenden Resensibilisierung zeigten Tiere, die mit DNBS behandelten Zellen wiederum injiziert worden waren, keine Immunantwort, wohingegen Tiere, die mit DNBS/αMSH-behandelten Zellen injiziert worden waren, keine Immunantwort zeigten, was darauf hinweist, daß die αMSH-induzierte Toleranz ebenfalls durch DC vermittelt wird (siehe Figur 12). Beispiel 8
"Immuntherapie mit αMSH bzw. αMSH-Derivat-behandelten dendritischen Zellen bzw. T- Zellen"
Dendritische Zellen (DC) wurden isoliert (aus Blut, Knochenmark oder Gewebe). Es können aber auch Zellgemische, die DC enthalten verwendet werden (z.B. epidermale Zellgemische) und in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 (bevorzugt: 250-1000 μ/ml für jede der Substanzen) kultiviert.
Nach einer Reifungszeit (bevorzugt 6-9 Tage) werden die Zellen mit Antigen beladen (Konzentration hängt ab vom jeweiligen Antigen, dito Zeitraum) und mit αMSH oder Derivaten davon behandelt. Die Derivate entsprechen zumindest den Aminosäuren 12 und 13 des αMSH (Lys-Pro), bevorzugt sind Lys-Pro-Val enthaltende Derivate. D- und L- Konfiguration der AS sind möglich, dito konservative AS-Austausche. Dies führt u.a. dazu, daß auch das vom IL-1 ß abgeleitete Lys-Pro-Thr verwendet werden kann, sowie Derivate hiervon die N-terminal verlängert sind. Auch C-terminal verlängerte Derivate können eingesetzt werden. Der Zusatz des Peptids kann vor dem Zusatz des Antigens erfolgen, gleichzeitig, später, einfach oder mehrfach (bevorzugte Dosis ist abhängig vom jeweiligen Peptid, für αMSH z.B. 10"8 M bis 10-14 M).
Die so behandelten Zellen werden dann in den Empfängerorganismus i.v. injiziert (i.p. oder s.c. wären auch möglich); Maus: 2 x 105 Zellen etwa untere Grenze. Je nach Antigen ist es dabei ausreichend eine einmalige Injektion oder notwendig mehrere Injektionen vorzunehmen. Auch ist es möglich, daß nach längeren Zeiträumen die Injektionen wiederholt werden müssen (hierzu liegen noch keine Daten vor).
Alternativ ist es möglich, DC außerhalb des Körpers mit T-Zellen in Kontakt zu bringen und dann das Gemisch oder die T-Zellen zu injizieren. Hierbei kann die Antigenbeladung der DC vor dem Kontakt mit den T-Zellen oder währenddessen erfolgen. Die T-Zellen können dabei auch von bereits gegen das jeweilige Antigen sensibilisierten Individuen stammen. In der Maus ist die Untergrenze etwa 1 Mio. T-Zellen, bevorzugt sind mehr Zellen (Fig. 14 und 15). Vorteile einer derartigen Anwendungsweise sind die Vorbeugung gegen jede Art unerwünschter Immunreaktion, die antigen-spezifisch sind und bei denen antigen- spezifische Lymphozyten (B- oder T-Zellen) eine pathogenetische Rolle spielen. Hierzu zählen u.a. Allergien, Autoimmunkrankheiten, chronische Entzündungen oder Implantationen. Bei Einsatz genügend hoher Zellzahlen ist auch eine Heilung bereits bestehender Erkrankungen möglich.
Die überraschenden Ergebnisse können ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen darin gesehen werden, daß αMSH ein potenter Immunmodulator ist und zahlreiche antiinflammatorische Eigenschaften besitzt. Hierzu zählt u.a. seine Eigenschaft die Expression co-stimulatorischer Moleküle auf DC zu reduzieren. Ähnliche Eigenschaften weisen auch die erfindungsgemäßen Derivate von αMSH auf, bis hin zum C-terminalen Tripeptid und auch das Dipeptid Lys-Pro. Auch Derivate mit anderer Aminosäurezusammensetzung (konservative AS-Austausche) haben vergleichbare Eigenschaften, hierzu zählt insbesondere das vom IL-1ß abgeleitete Lys-Pro-Thr (so daß zu vermuten ist, daß auch N- terminal (analog zu αMSH) verlängerte Peptide mit dem IL-1ß co-linearer Sequenz gleich wirken).
In vivo ist αMSH, sowie auch die Derivate, in der Lage hapten-spezifische Toleranz zu induzieren. DC sind professionell Antigen-präsentierende Zellen, die in der Lage sind zahlreiche Typen von Immunreaktionen zu induzieren und die auch den Verlauf derartiger Reaktionen bestimmen. Zu diesen Immunreaktionen zählen vor allem die T-Zell vermittelten Immunreaktionen.
Nun konnte gezeigt werden, daß die in vitro Behandlung von DC oder DC-T-Zellgemischen mit einem Antigen in Gegenwart von αMSH oder Derivaten dazu führt, daß diese Zellen nach Injektion in einen Organismus ebenfalls hapten-spezifische Toleranz induzieren.
Der Mechanismus hier scheint zu sein, daß die Antigenpräsentation der DC durch αMSH oder Derivate so moduliert wird, daß es zur Generierung suppressorischer T-Zellen kommt. So konnte gezeigt werden, daß T-Zellen in entsprechenden Gemischen eine hohe Expression von CTLA-4 aufweisen (Fig. 16). Dies ist eines der Oberflächenmoleküle, die sύppressorische T-Zellen charakterisieren. Mit derartig generierten DC oder T-Zellen ist es möglich vorbeugend Autoimmunerkrankungen, chronische Entzündungen oder Allergien zu verhindern. Auch einer Abstoßung von Im- oder Transplantaten kann vorgebeugt werden. Bei Verwendung genügend hoher Zellzahlen ist auch eine Heilung eines bereits bestehenden Erkrankungszustandes denkbar.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zur Tumorbehandlung mittels einer in situ-Aktivierung von dendritischen Zellen verwendet werden. Diese Methode kann möglicherweise auch zur Tolerisierung in Gegenwart der erfindungsgemäßen Peptide herangezogen werden.

Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung einer Verbindung der Formel (I)
H2N— CH-C— X
(CH2)4 NH„
(I).
wobei X eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe, Alkoxy, Pro oder Pro-Thr ist, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, zur Behandlung und/oder Vorbeugung von entzündlichen Erkrankungen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel (I) am N-Terminus acyliert und/oder am C-Terminus amidiert oder verestert ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Entzündung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Entzündungen der Haut oder von Gefäßen, allergischen Reaktionen, Autoimmunerkrankungen, Fibrösen, Sklerodermien und Transplantatabstoßung.
4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Entzündung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Psoriasis, atopische Dermatitis, Rhinitis, Kontaktallergien, Asthma und Nahrungsmittelallergien.
5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Entzündung eine Entzündung der Haut ist.
6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel (I) in Form einer Salbe oder Creme verabreicht wird.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel (I) in der Salbe oder Creme in einer Konzentration von 1 μM bis 1 mM enthalten ist.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel (I) intraperitoneal, intravenös oder oral verabreicht wird.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß 20 μg/kg Körpergewicht bis 10 mg/kg Körpergewicht der Verbindung der Formel (I) verabreicht wird.
10. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 verschiedene Verbindungen der Formel (I) eingesetzt werden.
11. Verwendung einer Verbindung der Formel (I) als Nahrungsmittelzusatz.
12. Verwendung einer Verbindung der Formel (I) zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung.
13. Verfahren zur in vitro-Herstellung von Zellen, die Toleranz gegen ein Antigen verleihen können, das folgende Schritte umfaßt:
a) Bereitstellung von Antigen-präsentierenden Zellen,
b) in Kontakt Bringen der Zellen mit αMSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon und
c) in Kontakt Bringen der Zellen mit dem Antigen,
wobei die Schritte b) und c) in beliebiger Reihenfolge oder gleichzeitig durchgeführt werden können.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigen- präsentierenden Zellen im wesentlichen dendritische Zellen sind.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigen- präsentierenden Zellen im wesentlichen epidermale Zellen sind.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in Schritt b) mit einer Verbindung umfassend αMSH, Lys-Pro-Val, Lys-Pro-Thr, Lys- Pro oder Lys in Kontakt gebracht werden.
17. Verwendung von αMSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induktion von Toleranz gegen ein Antigen.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel Zellen enthält, die durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16 erhältlich sind.
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