ES2411935T3

ES2411935T3 - Compuestos antiinflamatorios

Info

Publication number: ES2411935T3
Application number: ES10154643T
Authority: ES
Inventors: Thomas Luger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-02-14
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2013-07-09
Anticipated expiration: 2022-02-08
Also published as: US20040077552A1; EP1749524A2; HK1095538A1; EP2196202B1; DK1749524T3; WO2002064131A2; JP2004533995A; EP1427405B1; PT2196202E; WO2002064131A3; DE50209873D1; MXPA03007255A; SI1749524T1; DK2196202T3; HK1140960A1; NZ542406A; EP2260843A2; JP4259870B2; EP1749524B1; EP1427405A2

Abstract

Compuesto, seleccionado del grupo constituido por el dipéptido lisina-prolina, el tripéptido lisina-prolina-treonina ysales farmacéuticamente aceptables del mismo, para su aplicación en el tratamiento de enfermedades inflamatoriasde los vasos.

Description

Compuestos antiinflamatorios

La hormona tridecapeptídica estimulante de α-melanocitos (αMSH) se origina a partir de la hormona precursora proopiomelanocortina (POMC). Varias hormonas peptídicas biológicamente activas como p. ej. la β-lipotropina, la adrenocorticotropina (ACTH), la β-endorfina y las melanotropinas (α, β y γMSH) se derivan del producto génico de la POMC. Para el procesamiento de estos péptidos son necesarias enzimas proteolíticas con diferentes especificidades. Aparte de esto, pueden tener lugar modificaciones postranslacionales tales como acetilaciones.

Los efectos de la αMSH y de otros péptidos de la POMC sobre diferentes tejidos son inducidos por una familia de receptores específicos. Estos receptores de melanocortina (MC) pertenecen al grupo de receptores acoplados a la proteína G. Se clonaron cinco receptores de melanocortina diferentes (MC-1 a MC-5). Se acepta que la αMSH es una señal importante para la regulación de distintas funciones de los melanocitos. Por ejemplo, la proliferación, diferenciación y producción de citoquinas de melanocitos estarían influenciadas por la αMSH.

También se mostró que los productos génicos de la POMC pueden influir en reacciones inmunes y reacciones inflamatorias. Por ejemplo, se parte de que la αMSH regula a la baja varias citoquinas proinflamatorias, mientras que la producción de la citoquina antiinflamatoria IL-10 se estimula mediante αMSH. La αMSH tiene con ello una función importante en la supresión de reacciones inmunes e inflamatorias. Varios estudios apuntan a que los efectos inmunomoduladores y antiinflamatorios de la αMSH son inducidos por la región C-terminal del αMSH (aminoácidos 11-13: Lys-Pro-Val), pues la administración del tripéptido C-terminal es suficiente para inducir estos efectos (Catania y Lipton, 1993, Endoc. Rev. 14, 564-576; Bhardvaj et al., 1996, J. Immunol. 156, 2517-2521).

El documento WO 88/00833 divulga la utilización del tripéptido Lys-Pro-Val en la producción de un medicamento para el tratamiento de inflamaciones. El tripéptido C-terminal de αMSH también se ha propuesto como agente contra la caída del cabello (FR 2 733 421).

El documento WO 96/09063 A1 describe el tratamiento de enfermedades oculares, de forma particular el tratamiento

: o profilaxis de cicatrización de la córnea, que puede tener lugar con infecciones oculares bacterias o virales. A este respecto se describe el uso de compuestos de muramilpéptido para el tratamiento de enfermedades como queratitis y queratouveitis, de forma particular si estas son provocadas por una infección viral o bacteriana o por una infección de clamidias.

A.: O. Oluyomi et. al. (Eur. J. Pharmacol. 258, 1994, 131-138) reportan sobre el ensayo de una serie de análogos del tripéptido Lys-Pro-Thr en dos modelos de antinocicepción en ratones.

Un objetivo de la presente invención es poner a disposición otros compuestos antiinflamatorios.

Sorprendentemente, se ha encontrado que el tripéptido Lys-Pro-Thr presenta propiedades antiinflamatorias. En contra de lo esperado, compuestos incluso más pequeños como Lys-Pro muestran propiedades ventajosas.

El objetivo de la presente invención es por tanto un compuesto con la fórmula (I)

en la que X es Pro o Pro-Thr, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su aplicación en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inflamatorias de los vasos. El concepto "enfermedades inflamatorias" comprende no sólo las inflamaciones, sino también las enfermedades en las que está implicada una inflamación, como por ejemplo, las enfermedades autoinmunes o los rechazos a los implantes.

El compuesto utilizado conforme a la invención puede ser el dipéptido lisina-prolina, pero preferiblemente se utiliza el tripéptido lisina-prolina-treonina (=KPT).

Los aminoácidos que se dan de manera natural presentan generalmente la configuración (L). Los aminoácidos de los compuestos utilizados conforme a la invención pueden tener o bien la configuración (L) o bien la (D). Por tanto, posibles compuestos de la estructura KPT son

(L)Lys-(D)Pro-(L)Thr, (L)Lys-(L)Pro-(D)Thr,

(L)Lys-(D)Pro-(D)Thr,

(L)Lys-(L)Pro-(L)Thr,

(D)Lys-(D)Pro-(L)Thr,

(D)Lys-(D)Pro-(D)Thr,

(D)Lys-(L)Pro-(L)Thr,

(D)Lys-(L)Pro-(D)Thr,

siendo preferido entre todos el compuesto (L)Lys-(D)Pro-(L)Thr. El compuesto de la fórmula (I) puede estar modificado químicamente en el N-terminal y/o en el C-terminal, por ejemplo por un grupo acilo, preferiblemente un grupo acetilo en el N-terminal y/o una amidación o esterificación en el C-terminal. Son también posibles otros grupos protectores conocidos de por sí.

En el marco de la presente solicitud, la expresión "compuesto de la fórmula (I)" también comprende las sales farmacéuticamente aceptables del compuesto.

Los compuestos citados se pueden utilizar para el tratamiento de todo tipo de inflamaciones agudas o crónicas de vasos. A ellas pertenecen, entre otras, las inflamaciones agudas y crónicas, p. ej. reacciones alérgicas, enfermedades autoinmunes, fibrosis y los rechazos a los trasplantes. Es ventajoso administrar el compuesto en forma de una pomada o crema como formulación tópica. Normalmente el compuesto está contenido en una pomada

o crema en una concentración de 1 μM a 1 mM, preferiblemente de 10 μM a 100 μM. Además pueden estar contenidos en una pomada o crema de este tipo componentes habituales como, por ejemplo, los que se describen en Braun-Falco et al. (1996) Dermatologie und Venerologie, editorial Springer, Berlín o Merk, Bickers (1992) Dermatopharmakologie und Dermatotherapie.

Los compuestos utilizados conforme a la invención son también efectivos para tratar o prevenir inflamaciones de manera sistémica. El compuesto se administra entonces preferiblemente por vía intraperitoneal, intravenosa u oral. La dosis de una administración es en general de 20 μg a 10 mg por kg de peso corporal, preferiblemente 100 μg a 1 mg por kg de peso corporal. Por último, los compuestos mencionados también se pueden utilizar en forma de pulverización, por ejemplo en inhalación, para el tratamiento de inflamaciones de las vías respiratorias.

Es posible emplear varios compuestos distintos de la fórmula (I) para el tratamiento. En esta forma de realización, para el tratamiento de inflamaciones se utilizan al menos dos compuestos diferentes de la fórmula (I).

Los compuestos de la fórmula (I) se pueden utilizar también para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de inflamaciones. Esta utilización comprende de manera análoga todas las formas de realización antes indicadas. El compuesto se mezcla habitualmente con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Procedimientos conocidos de por sí para la fabricación de medicamentos se indican en Forth, Henschler, Rummel (1996). Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie, Urban & Fischer.

Los compuestos de la fórmula (I) se pueden añadir también a productos alimenticios para reducir el potencial alérgico de determinados componentes de los productos alimentarios. La concentración en los productos alimentarios puede ser de 1 μM a 1 mM.

También es posible utilizar un compuesto de la fórmula (I) como aditivo no farmacológico en cosméticos. Por ejemplo, en el caso de piel irritada o tras la exposición al sol, se pueden emplear cremas que contengan un compuesto de la fórmula (I).

El péptido Lys-Pro-Thr impide la activación del factor de transcripción NF-κB mediante TNFα, IL-1 o LPS en células endoteliales y en queratinocitos. Como consecuencia, se llega a una expresión reducida de moléculas de adhesión celular (células endoteliales) y quimiocinas (queratinocitos). Los inventores pudieron demostrar también que el péptido KPT, por ejemplo, impide la aparición de alergias de contacto (Contact Hypersensitivity Reactions, CHS Reactions) e induce una tolerancia específica a los alergenos duradera. En el caso de las reacciones de CHS hay que diferenciar dos períodos: un primer contacto (fase de inducción) con un antígeno sienta las bases para una reacción de CHS posterior; el siguiente contacto con el antígeno lleva a la aparición de la reacción (eczema de contacto, es decir, hinchazón, picazón, etc). Los compuestos utilizados conforme a la invención se pueden emplear antes de los dos períodos, en el caso de su empleo antes del primer contacto (por inyección o administración tópica) se llega a reprimir la CHS y a la inducción de tolerancia; si se emplea en el momento en que surge el eczema de contacto, los compuestos impiden la aparición del eczema. En todas estas aplicaciones se llega a una inhibición prácticamente total de la reacción alérgica.

También se ha encontrado que Lys-Pro-Thr reduce la expresión de moléculas coestimulantes en células dendríticas. Con gran probabilidad, se trata de una parte del mecanismo para la represión de CHS y de la inducción de tolerancia. Al mismo tiempo, los compuestos incrementan la secreción del IL-10 antiinflamatorio a través de monocitos. Este efecto forma también parte del mecanismo en el contexto de los eczemas de contacto alérgicos.

Los compuestos conformes a la invención podrían unirse a receptores β-adrenérgicos. También se puede partir de que los péptidos empleados conforme a la invención tienen la capacidad de unirse al receptor de IL-1 de tipo I. No se puede excluir tampoco que los péptidos conformes a la invención se unan también a otros receptores, como por ejemplo al receptor κ-opioide. Partiendo de esta aceptación, se piensa que los péptidos conformes a la invención se pueden unir a varios receptores, que tras la activación y a través de sus ligandos originales intervendrían todos de forma pro-inflamatoria en el episodio inflamatorio. Con la unión de los péptidos conformes a la invención a estos receptores se impide la unión de los ligandos originales a estos receptores y con ello, se impide la inducción de los efectos pro-inflamatorios. Por otra parte, la unión de los péptidos conformes a la invención a los receptores de sus sustancias base (αMSH) activa estos receptores e induce así un nuevo componente del mecanismo de acción, que es antiinflamatorio en conjunto.

La figura 1 muestra que la inyección intravenosa de αMSH, KPV (lisina-prolina-valina) o KPT (lisina-prolina-treonina) reprime la fase de sensibilización de CHS ("contact hypersensitivity reaction", reacción de hipersensibilidad al contacto).

La figura 2 muestra que la administración intravenosa de αMSH, KPV o KPT puede inducir tolerancia.

La figura 3 ilustra la secreción de IL-10 (interleucina 10) por PBL humanos ("peripheral blood lymphocytes", linfocitos de sangre periférica) 24 horas después del tratamiento con αMSH, KPV o KPT.

La figura 4 muestra la secreción de IL-10 por PBL humanos 48 horas después del tratamiento con αMSH, KPV o KPT.

La figura 5 muestra que las células THP-1 (una línea celular monocítica) expresan receptores de αMSH.

Las figuras 6a-6d, 7a-7d y 8a-8d muestran que en un ensayo de competición, las αMSH, KPV o KPT no marcadas pueden desplazar a la αMSH marcada con biotina de los puntos de unión a células THP-1

La figura 9a muestra la expresión de "Cell Adhesion Molecules" (CAMS) sobre la superficie de células HMEC-1 ("Human Microvascular Endothelial Cell Line 1") 24 horas después del tratamiento con TNFα + αMSH o TNFα + KPT.

La figura 9b muestra la adhesión de linfocitos a HDMEC ("Human Dermal Microvascular Endothelial Cells") (Chromium Release Assay). A: Molt4 Linfocitos-T; B: JY linfocitos-B.

La figura 10 muestra la influencia de αMSH, KP, KPV o KPT sobre la activación de NF-κB (factor nuclear κB) en células HMEC-1 tratadas en LPS (lipopolisacárido).

La figura 11a muestra que el número de vasos que expresan E-selectina en cortes de tejidos disminuye mediante tratamiento con αMSH.

La figura 11b muestra que el número de lesiones petequiales en las orejas de ratones tratados con LPS se reduce mediante tratamiento con αMSH.

La figura 12 muestra que se puede reprimir la CHS e inducir tolerancia mediante el tratamiento in vitro de BMCD ("bone marrow derived dendritic cells", células dendríticas derivadas de médula ósea) con αMSH o KP.

La figura 13a muestra que en un "Band Shift Assay" de NF-κB, la intensidad de las bandas heterodímeras NF-κB p65/p50 se reduce con el uso de distintos péptidos derivados de αMSH.

La figura 13b muestra el efecto de αMSH, KP o K en la reacción CHS y el efecto de αMSH o KP en la inducción de tolerancia en ratones BalbC.

La figura 14 muestra la represión de CHS mediante células T que fueron puestos en contacto in vitro con DC cargadas de antígenos y tratadas con αMSH o con un derivado.

La figura 15 muestra la inducción de tolerancia mediante células T que fueron puestos en contacto in vitro con DC cargadas de antígeno y αMSH.

La figura 16 muestra la sobrerregulación de CTLA-4 en células T después del contacto con DC cargadas de antígenos y tratadas con αMSH o con un derivado. A: células T CD4 positivas; B: células T CD8 positivos.

Los siguientes ejemplos explicarán en detalle la invención.

Ejemplo 1

Ratones:

Se recibieron ratones Balb/C hembra de 7 a 10 semanas de edad de Charles River (Sulzfeld, Alemania) y se mantuvieron de acuerdo con las normativas federales.

Administración de αMSH (ejemplo de referencia), KPV (ejemplo de referencia), KPT o KP:

La αMSH, y los péptidos se conservaron hasta su utilización como partes alícuotas a -20°C. Antes de la inyección, el compuesto respectivo se disolvió en PBS y 0,1% de suero de ratón y, hasta el momento de la inyección intravenosa en la vena caudal de los ratones, se conservó en hielo. Se inyectaron 5 μg de αMSH o 1,5 μg de péptido (KP: 50 μg) por cada ratón 2 horas antes de la sensibilización.

Determinación de la CHS y la tolerancia:

Los ratones fueron sensibilizados mediante la extensión de 75 μl de DNFB al 0,5% en acetona-aceite de oliva (4:1) sobre el vientre rasurado de ratones no tratados previamente. Para desencadenar la CHS, a los ratones se les untaron las orejas con 10 μl de DNFB al 0,3%, en ambos lados de una oreja. La CHS se determinó por el grado de hinchazón de la oreja expuesta al hapteno, en comparación con la otra oreja tratada como control, y se midió con un compás de espesores tensado con resorte, 24 horas después de la exposición al hapteno. Los ratones cuyas orejas fueron expuestas a hapteno sin previa sensibilización sirvieron de control negativo. Para determinar si la inyección de αMSH o de péptidos antes de la aplicación del hapteno conduce a la inducción de tolerancia, se inyectaron a los ratones de manera intravenosa (abdomen) αMSH o péptidos 2 horas antes de la sensibilización o se les expuso (oreja izquierda) como se ha descrito. Para confirmar la supresión de la CHS inducida por αMSH, se expuso las orejas de los ratones al hapteno, 7 días después de la sensibilización, y de 24 a 36 horas después se determinó la respuesta de hinchazón de la oreja. 14 días después se sensibilizaron nuevamente los mismos ratones en la espalda rasurada (ahora en ausencia de αMSH exogénico) y se examinó su capacidad de inducir una respuesta de CHS con una segunda exposición a hapteno en la oreja derecha, una semana después.

En algunos experimentos se utilizaron preparados tópicos de αMSH. En estos experimentos, los ratones se untaron en la zona de la sensibilización (abdomen) inmediatamente antes, o 3 o 24 horas antes de la sensibilización.

Resultado:

La inyección intravenosa de αMSH, o bien de KPV, KPT o KP, inhibe la capacidad de los ratones de inducir una respuesta de CHS a una exposición a DNFB que tuvo lugar 7 días más tarde. Por tanto, estos ratones no desarrollan ninguna sensibilización específica a DNFB. El KPT reprimió la respuesta de CHS de la manera más eficaz (véanse figuras 1 y 13b).

Para diferenciar entre inmunosupresión temporal y tolerancia inmunológica específica, los ratones fueron sensibilizados por segunda vez y expuestos a hapteno. Los ratones que habían sido inyectados con αMSH, KPV o KPT antes de la primera sensibilización, no pudieron ser sensibilizados ni siquiera por aplicación de una segunda dosis de haptenos sensibilizantes, lo que apunta a que estos ratones han desarrollado tolerancia frente a DNFB. KPV mostró un efecto débil, mientras que αMSH, KPT y KP inhibieron de manera muy potente la respuesta de hinchazón de la oreja (véanse figuras 2 y 13b).

Ejemplo 2

Material y métodos:

Se separaron células mononucleares (PBMC) de "Human Buffy Coats" por centrifugación en gradiente de densidades de Ficoll-Hypaque. Las células (1 x 106 por ml), cultivadas en RPMI 1640 con antibióticos y 10% de FCS,

o bien no fueron tratadas o se estimularon con αMSH (ejemplo de referencia) o con los péptidos KPV (ejemplo de referencia) o KPT, con o sin IL-1β (10 U/ml). Los sobrenadantes de los cultivos de PBMC se reunieron después de 24 o 48 horas de incubación y se conservaron a -20°C hasta su posterior utilización. Para la detección de IL-10 se empleó un ELISA que se puede adquirir comercialmente.

Resultados:

Los PBMC humanos que no fueron tratados o que habían sido tratados con distintas concentraciones de αMSH o de péptidos, tras 24 horas de incubación solo produjeron concentraciones bajas de IL-10 (5-10 μg/ml). La αMSH (1011M), KPV (10-8 a 10-9 M) y KPT (10-8 a 10-9 M) induce de forma evidente la producción de IL-10 (véase figura 3).

Tras 48 horas de incubación, los PBMC humanos produjeron cantidades importantes de IL-10. La αMSH, KPV y KPT incrementaron de manera importante la producción de IL-10 mediante PBLC humano. No hubo una diferencia esencial entre la αMSH y los péptidos (véase figura 4).

Los resultados mostrados prueban que el péptido KPT, como αMSH y KPV puede inhibir la sensibilización de CHS después de su administración intravenosa, y puede inducir tolerancia específica a los haptenos. KPT también está en condiciones de inducir IL-10 in vivo e in vitro. Los datos muestran que es también probable que el efecto inmunosupresor del αMSH in vivo no dependa sólo de la inducción de IL-10.

Ejemplo 3

Material y métodos:

Todas las etapas se llevaron a cabo a una temperatura de 0º C hasta 4° C. La línea celular monocítica THP-1 se lavó una vez en PBS, una vez en solución tampón de glicina ácida (glicina 50 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 3) y tres veces con RPMI. A continuación se resuspendieron las células (2,5 x 106 por ml) en 100 μl de RPMI/1% de BSA y se transfirieron a placas de microtitulación con 96 pocillos. Después de la adición de αMSH (10-10) marcado con biotina se incubaron las células durante 1 hora a 4°C, se lavaron una vez con PBS, se resuspendieron en 100 μl de PBS/1% de BSA y se incubaron en oscuridad con estreptavidina (40 μg/ml) marcada con FITC durante 30 minutos a 4°C. Después de una última etapa de lavado, las células se resuspendieron en PBS. La cantidad de αMSH ligada marcada con biotina, se analizó con un citómetro de caudal. En experimentos de control, las células se incubaron sin αMSH marcado con biotina pero en presencia de estreptavidina FITC. Las células muertas fueron excluidas por adición de yoduro de propidio poco antes del análisis de FACS. La especificidad de la unión del MSH marcado con biotina se determinó por adición de αMSH sin marcar ( de 10-6 a10-12 M) (ejemplo de referencia), KPV (ejemplo de referencia) o KPT (de 10-6 a10-12M).

Resultados:

Según el análisis de FACS con αMSH marcado con biotina, las células THP-1 no estimuladas expresan cantidades significativas en puntos de unión que son específicos de αMSH, en comparación con las partidas de control que sólo se incuban con estreptavidina FITC. En este experimento se empleó αMSH en una concentración 10-10 M (véase figura 5).

Para determinar si las células THP-1 expresan uno de los conocidos receptores de melanocortina (MC), se llevó a cabo un RT-PCR con iniciadores específicos MC-1, MC-2, MC-3 y MC-4. Todo el RNA se obtuvo a partir de células THP-1. Se detectó un producto de PCR específico de MC-1 con una longitud esperada de 416 pb (Rajora et al., 1996, J. Leuk, Biol. 59, 248). No se detectaron productos de PCR específicos de MC-2, MC-3 o MC-4. Estos resultados ponen de manifiesto que las células THP-1 expresan MC-1, el cual, al contrario que otros receptores de melanocortina, es específico de αMSH y ACTH.

Para examinar si los puntos de unión que se expresan sobre THP-1 son específicos de αMSH, se llevaron a cabo experimentos de competición con αMSH o KPV o KPT. La unión específica se obtuvo por incubación de células de THP-1 con αMSH marcado con biotina (10-10 M) y distintas concentraciones de αMSH o péptidos no marcados. El αMSH no marcado, en una concentración de 10-8 reprimió significativamente la unión de αMSH. Cuando se empleó αMSH en concentraciones de 10-6 M, 10-10 M o 10-12 M no se pudo observar supresión significativa alguna (figuras de 6a a 6d).

Cuando se utilizó KPV no marcado, sólo se pudo observar una inhibición significativa con una concentración 10-6 M (véanse figuras de 7a a 7d).

En el caso del péptido KPT se pudo observar una inhibición importante de la unión de αMSH en cada una de las concentraciones probadas (10-6 a 10-12 M, véanse figuras de 8a a 8d).

Estos resultados muestran que el péptido KPT se une al receptor de melanocortina en células THP-1, que es específico de αMSH, lo que apunta a que αMSH y KPT presentan un punto de unión común. Pero puesto que KPT ya a concentraciones muy bajas muestra competición por el receptor, es probable que este péptido tenga una afinidad incluso mayor hacia el receptor de MC-1 que el MSH.

Ejemplo 4

Material y métodos:

"Human Dermal Microvascular Endothelial Cells" (HDMEC) y la línea celular de HMEC-1 (Human Micro-vascular Endothelial Cell Line 1) se trataron, o bien con TNFα o bien con LPS en presencia o ausencia de uno de los péptidos. Para el aislamiento del RNA se recogieron las células 3 y 6 horas después del tratamiento o bien para el EIA de la molécula de adhesión o para el análisis de FACS se recogieron 3, 6, 16 o 24 horas después del tratamiento. El RNA se transcribió de forma inversa, y se sometieron unas muestras a una PCR para E-selectina, ICAM-1, VCAM o para β-actina como "Housekeeping Gene" para llevar a cabo una valoración semicuantitativa. Para el ensayo de adhesión de linfocitos, las células endoteliales se sembraron en cápsulas y se incubaron con linfocitos marcados con Cr51. Después de una etapa de lavado, se determinó la cantidad de linfocitos sobrantes que estaban unidos a la capa de EC, por medición de la radioactividad en las muestras.

Resultados:

El tratamiento de las células endoteliales con αMSH (ejemplo de referencia) o KPT inhibió la expresión inducida por LPS o TNFα de las moléculas de adhesión. Este efecto se observó en un intervalo de concentraciones de 10-6 a 1012 M de αMSH o de péptido. El péptido KPT tuvo el efecto más potente sobre la expresión de la molécula de adhesión mRNA.

La expresión de superficie de moléculas de adhesión inducida por LPS o TNFα se redujo en pequeña medida mediante todos los agonistas. Estos datos se obtuvieron tanto por EIA, en donde se emplearon células enteras, como también por FACS con anticuerpos específicos (véanse figuras 9a, que muestra datos de EIA).

La αMSH reduce de manera importante la unión de células T y B en capas de EC tratadas con LPS o TNF-αMSH (véase figura 9b). Considerados en conjunto, estos resultados muestran que αMSH tiene un efecto en la adhesión de linfocitos a EC y, por consiguiente, reduce también la extravasación de linfocitos en situaciones de inflamación de tejidos. Ello se confirma por los datos in vivo relativos a la vasculitis localizada.

Ejemplo 5 (ejemplo de referencia)

Material y métodos:

Se trataron células epidérmicas (EC) o queratinocitos humanos normales (HNK) con IL-1, LPS o TNFα en presencia

o ausencia de péptidos. Al cabo de 15 o 30 minutos se obtuvieron las proteínas nucleares y se sometieron a un "Electrophoretic Mobility Shift Assay" (EMSA) con un oligonucleótido marcado radiactivamente, con secuencia de uniones específica NF-κB. El oligonucleótido no marcado se utilizó como competidor. En algunos experimentos se emplearon anticuerpos contra la cadena p65 o p50 de NF-κB para confirmar la identidad de las bandas detectadas bien como homodímeros p50 o como heterodímeros p50/p65.

Resultado:

En las ECs tratadas con TNFα o LPS, como en las HNK tratados con IL-1, la adición de los péptidos conduce a una activación reducida del factor de transcripción NF-κB (véanse las figuras 10 y 13a). Esto conduce por su parte a un debilitamiento de la transcripción de los genes para un gran número de mediadores proinflamatorios (citoquinas, quimioquinas, moléculas de adhesión, etc.). La identidad de las bandas observadas en el EMSA como heterodímero NF-κB se confirmó empleando anticuerpos anti-p65.

Ejemplo 6 (ejemplo de referencia)

Material y métodos:

Los ratones se trataron mediante inyección subcutánea de LPS en una oreja. Esta inyección preparada induce un incremento duradero en la expresión de E-selectina en el lugar de la inyección de LPS. 24 horas más tarde se inyectó intraperitonealmente una segunda dosis de LPS (Challenge). Esta segunda inyección de LPS conduce a una rápida necrólisis vascular y a la formación de lesiones petequiales, que se pueden detectar fácilmente gracias a su magnitud y número. En el momento de la inyección preparada de LPS se administró αMSH (25 μg).

Resultado:

La inyección de αMSH en el momento de la administración preparada de LPS inhibe la inducción de la expresión local de E-selectina en la oreja (véase figura 11a) y reduce significativamente el número y tamaño de lesiones petequiales que se formaron después de la inyección de "Challenge" de LPS (véase figura 11b).

Ejemplo 7

Material y métodos:

Se aislaron células dentríticas de médula ósea (BMDC) del hueso fémur de ratones y se trataron con IL-4 y GM-CSF durante 6 o 9 días. El 6° y el 9° día, las células se trataron con αMSH (2 x 10-11M) (ejemplo de referencia) o con el péptido KP (2 x 10-6 M) durante 3 horas y 2,5 horas antes de la reinyección en ratones no tratados, con los mismos antecedentes genéticos. 2 horas antes de la reinyección se trataron las células con hapteno (1 mM DNBS, la forma soluble de DNFB). Inmediatamente antes de la reinyección, las células se lavaron 2 veces con PBS. Se inyectaron por vía intravenosa 5 x 10-5 células por cada animal. Las células de control se trataron o bien con DNBS sólo o con αMSH solo, o se dejaron sin tratar. 5 días después de la inyección, los animales fueron contactados en la oreja con DNFB, y al día siguiente se midió el grosor de la oreja. 2 semanas más tarde, los animales fueron resensibilizados con DNFB y de nuevo 5 días después fueron contactados de nuevo en la oreja. Por último se midió la hinchazón de la oreja.

Resultados:

Los animales receptores que fueron inyectados con células no tratadas o células tratadas con αMSH, no mostraron reacción inmune alguna después del primer "Challenge", tal como se esperaba. Los animales receptores que habían sido inyectados con BMDC tratado con DNBC, mostraron una reacción CHS correspondiente al momento del primer "Challenge". Esta reacción se suprimió en los animales que habían sido inyectados con células que se habían tratado previamente in vitro con TNBS y αMSH o TNBS y KP. Por tanto, el contacto de DCs con αMSH o péptido es suficiente para desencadenar la inhibición de los CHS (véase figura 12)

En el momento del segundo "Challenge" y de la correspondiente resensibilización, los animales a los que se habían inyectado de nuevo células tratadas con DNBS no mostraron respuesta inmune alguna, mientras que los animales a los que se habían inyectado células tratadas con DNBS/αMSH no mostraron respuesta inmune alguna, lo que apunta a que la tolerancia inducida por αMSH se induce igualmente por DC (véase figura 12).

Ejemplo 8

"Inmunoterapia con células dentríticas o células T tratados con αMSH o con un derivado de αMSH"

Se aislaron células dentríticas (DC) (a partir de sangre, médula ósea o tejidos). También se pueden utilizar de todos modos mezclas celulares que contengan DC (p. ej. mezclas celulares epidérmicas) y se cultivaron en presencia de GM-CSF e IL-4 (preferiblemente: 250-1000 μ/ml para cada una de las sustancias).

Después de un tiempo de maduración (preferiblemente, 6-9 días) se cargan las células con antígenos (la concentración depende del correspondiente antígeno, también del período de tiempo) y se trataron con αMSH (ejemplo de referencia) o derivados suyos. Los derivados corresponden al menos a los aminoácidos 12 y 13 de la αMSH (Lys-Pro), también son posibles los derivados que contienen Lys-Pro-Val (ejemplo de referencia). La configuración D-y L-de los AS (aminoácidos) es posible. También se puede utilizar Lys-Pro-Thr derivada del IL-1β. La adición del péptido puede tener lugar antes de la adición del antígeno, al mismo tiempo, más tarde, de forma simple o múltiple (la dosis preferida depende del correspondiente péptido; para αMSH por ejemplo, de 10-8 M a 1014 M).

Las células así tratadas se inyectan después por vía intravenosa en el organismo receptor (es posible también intraperitoneal o subcutáneamente); ratón: 2 x 105 células como límite inferior. Según el antígeno, puede ser suficiente efectuar una única inyección o si fuera necesario, varias inyecciones. También es posible que después de períodos de tiempo prolongados se tengan que repetir las inyecciones (para ello no existen datos todavía).

De forma alternativa, es posible poner en contacto DC con células T fuera del cuerpo e inyectar después la mezcla o las células T. Para ello, la carga de antígenos de las DC se puede efectuar antes del contacto con las células T o durante el mismo. Las células T pueden proceder también de individuos ya sensibilizados contra el correspondiente antígeno. En el ratón, el límite inferior es aproximadamente 1 millón de células T, son preferibles más células (figuras 14 y 15).

Las ventajas de un modo de aplicación de este tipo son la prevención de cualquier clase de reacción inmune no deseada, que sea antígeno específica y en la cual los linfocitos específicos de antígenos (células B o T) jueguen un papel patogenético. Entre ellas se encuentran, entre otras, las alergias, enfermedades autoinmunes, inflamaciones crónicas o implantes. Con el empleo de un número suficientemente alto de células también es posible la curación de enfermedades ya existentes.

Los sorprendentes resultados, sin querer estar ligados a una teoría, se pueden considerar en el sentido de que αMSH es un potente inmunomodulador y posee numerosas propiedades antiinflamatorias. A ellas pertenece, entre otras, su propiedad de reducir la expresión de moléculas coestimulantes en DC. Los derivados de αMSH conformes a la invención presentan también propiedades análogas, que alcanzan hasta el tripéptido C-terminal y también el dipéptido Lys-Pro. También los derivados con otra composición de aminoácidos (sustituciones conservadoras de aminoácidos) tienen propiedades comparables, entre ellos se encuentran en concreto la Lys-Pro-Thr derivada de IL1β (de modo que se puede suponer que también los péptidos alargados por el N-terminal (análogamente a αMSH) con la secuencia colineal de IL-1β actúan de igual manera).

In vivo, la α-MSH, como también sus derivados, están en condiciones de inducir una tolerancia específica a haptenos. Las DC son células que presentan antígenos profesionalmente, que están en condiciones de inducir innumerables tipos de reacciones inmunes y que también determinan el transcurso de esta clase de reacciones. A estas reacciones inmunes pertenecen sobre todo las reacciones inmunes mediadas por células T.

Se pudo demostrar entonces que el tratamiento in vitro de DC o mezclas celulares de DC y células T con un antígeno, en presencia de α-MSH o derivados de éste, lleva a que tras su inyección en un organismo, estas células también induzcan una tolerancia específica a los haptenos.

El mecanismo aquí parece ser que la presentación de antígenos de las DC se modula mediante la αMSH o sus derivados de tal modo que se llega a la generación de células T supresoras. Así, se pudo demostrar que en las correspondientes mezclas, las células T presentan una elevada expresión de CTLA-4 (fig. 16). Esta es una de las moléculas de superficie que caracterizan a las células T supresoras.

Con DC o células T generadas de este modo, es posible impedir preventivamente enfermedades autoinmunes, inflamaciones crónicas o alergias. También se puede prevenir un rechazo a implantes o trasplantes. En el caso de utilizar un número suficientemente alto de células se puede considerar también la curación de un estado patológico ya existente.

Los compuestos conformes a la invención se pueden utilizar también para el tratamiento de tumores mediante una activación in situ de células dendítricas. Posiblemente, también se pueda recurrir a este método para conseguir tolerancia en presencia de los péptidos conformes a la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuesto, seleccionado del grupo constituido por el dipéptido lisina-prolina, el tripéptido lisina-prolina-treonina y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, para su aplicación en el tratamiento de enfermedades inflamatorias de los vasos.

5 2. Compuesto para la aplicación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto es el tripéptido lisina-prolina-treonina.
3. Compuesto para la aplicación de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque el compuesto es (L)Lys/(D)Pro-(L)Thr.
4. Compuesto para la aplicación conforme a una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el compuesto 10 se administra en forma de una pomada o crema.
5.

Compuesto para la aplicación de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el compuesto en la pomada o crema está contenido en una concentración de 1 μM a 1 mM.
6.

Compuesto para la aplicación conforme a una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el compuesto se administra por vía intraperitoneal, intravenosa u oralmente.

15 7. Compuesto para la aplicación conforme a la reivindicación 6, caracterizado porque se administran de 20 μg por kg de peso corporal a 10 mg por kg de peso corporal.
8. Compuesto para la aplicación conforme a una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se utilizan al menos dos compuestos distintos de los compuestos definidos en la reivindicación 1.

Fig. 2 Inducción de tolerancia por -MSM y péptidos derivados