PT1427405E - Compostos inibidores de inflamações. - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "COMPOSTOS INIBIDORES DE INFLAMAÇÕES" A hormona tridecapeptídica estimuladora de a-melanócitos (aMSH) resulta da hormona precursora pró-opiomelanocortina (POMC). Várias hormonas peptidicas biologicamente activas como, por exemplo, β-lipotropina, adrenocorticotropina (ACTH), β-endorfina e as melanotropinas (α-, β- e γΜΞΗ) derivam do produto genético POMC. São necessárias enzimas proteoliticas com diferentes especificidades para o processamento destes peptideos. Além disso, podem ocorrer modificações pós-tradução como acetilações.
Os efeitos de aMSH e outros peptideos POMC sobre diferentes tecidos são mediados através de uma família de receptores específicos. Estes receptores de melanocortina (MC) pertencem ao grupo dos receptores acoplados da proteína G. Foram clonados cinco diferentes receptores de melanocortina (MC-1 até MC-5). Presume-se que aMSH é um sinal importante para a regulação de diferentes funções de melanócitos. A proliferação, diferenciação e produção de citocina de melanócitos devem ser, por exemplo, influenciadas através de aMSH.
Foi também mostrado que produtos genéticos POMC podem influenciar reacções imunológicas e reacções inflamatórias. Assume-se, por exemplo, que aMSH regula a jusante várias citocinas pró-inflamatórias, enquanto aMSH estimula a produção da citocina IL-10 anti-inflamatória. Assim, a aMSH tem uma função importante na supressão de reacções imunológicas e inflamatórias. Vários estudos sugerem que os efeitos 1 imunomodeladores e anti-inflamatórios de aMSH são mediados através da região C-terminal de aMSH (aminoácidos 11-13: Lys-Pro-Val, uma vez que é suficiente a administração do tripeptideo C-terminal de maneira a induzir este s efeitos (Catania e Lipton, 1993, Endocr. Rev. 14, 564-576; Bhardvaj et al., 1996, J. Immunol. 156, 2517-2521). 0 documento WO 88/00833 publica a utilização do tripeptideo Lys-Pro-Val para a preparação de um medicamento para o tratamento de inflamações. O tripeptideo C-terminal de aMSH foi igualmente proposto como agente contra a queda do cabelo documento(FR 2733421).
Oluyomi et al. (1994) European Journal of Pharmacology 258: 131-138 descrevem experiências animais sobre a actividade antinociceptiva de diferentes peptideos. Foi verificado que uma série de peptideos da fómula Lys-(D)Pro-X, depois de administração intraperitoneal ou oral em doses elevadas (10-100 mg/kg), apresentam um efeito antinociceptivo. O documento WO 96/23490 Al descreve ensaios para formulações e processos para diminuir a irritação da pele. Foi verificado que poliaminas orgânicas, solúveis em água, protonadas várias vezes, como espermina, espermidina e putrescina mas também aminoácidos individuais como arginina, lisina, histidina ou ornitina em doses mais elevadas (10 mM -3000 mM) apresentam um efeito anti-irritante.
Um objectivo da presente invenção é disponibilizar outros compostos inibidores de inflamações. 2
Foi verificado de forma surpreendente que o tripeptideo Lys-Pro-Thr apresenta propriedades anti-inflamatórias. Contra as expectativas, mesmo compostos ainda mais pequenos como Lys-Pro mostram propriedades vantajosas. 0 objectivo da presenta invenção é assim a utilização de um composto da fórmula (I)
O H2N—ÇH-C —X (ÇH2)4 NH2 (I), em que X é Pro ou Pro-Thr, ou um sal farmaceuticamente aceitável desteS, para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de doenças inflamatórias da pele. Este é o objectivo único da invenção. A designação "doenças inflamatórias" COMPREENDE não apenas inflamações, mas também aquelas doenças nas quais participa uma inflamação, como por exemplo, doenças auto-imunes ou rejeição de transplantes. 0 composto utilizado de acordo com a invenção pode ser o dipeptideo lisina-prolina, de um modo preferido é utilizado contudo o tripeptideo lisina-prolina-treonina (=KPT).
Aminoácidos que ocorrem naturalmente apresentam maioritariamente a configuração (L) . Os aminoácidos dos compostos utilizados de acordo com a invenção podem ter a configuração (L) ou (D) . Compostos possíveis de estrutura KPT são assim 3 (L)Lys-(D)Pro-(L)Thr, (L)Lys-(L)Pro-(D)Thr, (L)Lys-(D)Pro-(D)Thr, (L)Lys-(L)Pro-(L)Thr, (D)Lys-(D)Pro-(L)Thr, (D)Lys-(D)Pro-(D)Thr, (D)Lys-(L)Pro-(L)Thr, (D)Lys-(L)Pro-(D)Thr, sendo o mais preferido o composto (L)-Lys-(D)Pro-(L)Thr. 0 composto da fórmula (I) pode ser quimicamente modificado no terminal N e/ou terminal C, por exemplo, através de um grupo acilo, de um modo preferido um grupo acetilo no terminal N e/ou uma amidação ou esterificação no terminal C. Outros grupos de protecção em si conhecidos são igualmente possíveis.
No âmbito do presente pedido, a designação "composto da fórmula (1)" compreende também os sais farmaceuticamente aceitáveis do composto.
Os compostos mencionados podem ser utilizados para o tratamento de todos os tipos de inflamações agudas ou crónicas da pele. Entre estas contam-se, entre outros, psoríase, dermatite atópica, reacções alérgica de todos os tipos, alergias de contacto e alergias alimentares, doenças auto-imunes e esclerodermias e rejeição de transplantes. De acordo com a invenção, os compostos são utilizados para o tratamento de estados inflamatórios da pele. Neste caso é vantajoso administrar o composto na forma de um unguento ou creme como formulação tópica. Habitualmente, o composto está contido num unguento ou creme numa concentração de 1 μΜ até 1 mM, de um modo 4 preferido de 10 μΜ até 100 μΜ. Além disso podem estar contidos num unguento ou creme deste tipo componentes habituais, como está descrito, por exemplo, em Braun-Falco et al. (1996) Dermatologie und Venerologie, Springer Verlag, Berlin ou Merk, Bickers (1992) Dermatopharmakologie und Dermatotherapie.
Os compostos podem, de acordo com a invenção, ser utilizados para o tratamento de doenças inflamatórias de inflamações, que ocorrerem em partes do corpo, que entram em contacto com o mundo exterior.
Os compostos utilizados de acordo com a invenção são porém também sistemicamente efectivos, de maneira a tratarem ou prevenirem inflamações. O composto é então administrado, de um modo preferido, de forma intraperitoneal, intravenosa ou oral. A dose de uma aplicação é em geral de 20 pg até 10 mg/kg de peso corporal, de um modo preferido, 100 pg até 1 mg/kg de peso corporal.
Finalmente, os compostos mencionados podem também ser utilizados em sprays, por exemplo, para inalação para o tratamento de inflamações das vias respiratórias. É possivel que para o tratamento sejam utilizados vários compostos da fórmula (I) diferentes. Nesta forma de realização são utilizados, pelo menos, dois compostos da fórmula (I) diferentes para o tratamento de inflamações.
Os compostos da fórmula (I) podem também ser utilizados para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de inflamações. Todas as formas de realização acima mencionadas estão incluídas nesta utilização de forma análoga. O 5 composto é habitualmente misturado com um suporte farmaceuticamente aceitável ou agente de diluição. Processos em si conhecidos para a preparação de medicamentos são indicados em Forth, Henschler, Rummel (1996) Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie, Urban & Fischer.
Os compostos da fórmula (I) podem ser também adicionados a alimentos de maneira a reduzir o potencial alérgico de determinados constituintes dos alimentos. A concentração em alimentos pode então ser de 1 μΜ até 1 mM.
Também é possível utilizar em cosméticos um composto da fórmula (I) como aditivo não farmacêutico. Podem ser utilizados, por exemplo, cremes para pele irritada ou depois de um banho de sol que contenham um composto da fórmula (I). 0 peptídeo Lys-Pro-Thr impede a activação do factor de transcripção NF-κΒ através de TNFa, IL-1 ou LPS nas células endoteliais e nos queratinócitos. Em consequência ocorre uma diminuição da expressão de moléculas de adesão celular (células endoteliais) e quimiocinas (queratinócitos). Os requerentes puderam também mostrar que, por exemplo, o peptídeo KPT impede a ocorrência de alergias de contacto (reacções de hipersensibilidade de contacto, reacções CHS) e induz uma tolerância alergo-específica prolongada. Nas reacções CHS são de diferenciar duas partes. Um primeiro contacto (fase de indução) com um antigénio a promover as bases para a reacção CHS que ocorre mais tarde, um outro contacto com o antigénio conduz à ocorrência da reacção (eczema de contacto, ou seja uma tumefacção, prurido, etc.). Os compostos utilizados, de acordo com a invenção, podem ser utilizados antes de ambas as partes, ocorrendo na utilização (injecção ou aplicação tópica) antes do 6 primeiro contacto o impedimento da CHS e a indução da tolerância, na utilização na altura do despoletar do eczema de contacto, os compostos impedem que o eczema ocorra. Em todas estas aplicações ocorre uma extensiva inibição da reacção alérgica.
Foi igualmente verificado que Lys-Pro-Thr reduz a expressão de moléculas co-estimuladoras sobre as células dendriticas. Isto é muito provavelmente uma parte do mecanismo no impedimento da CHS e da indução da tolerância. Em simultâneo, os compostos aumentam a secreção de IL-10 anti-inflamatório através de monócitos. Este efeito é igualmente parte do mecanismo no âmbito dos eczemas alérgicos de contacto.
Sem querer de qualquer maneira associar-se a uma teoria, os compostos de acordo com a invenção poderiam-se ligar a receptores β-adrenérgicos. Além disso pode-se partir do princípio, que os peptídeos utilizados de acordo com a invenção, são capazes de se ligar ao receptor de IL-1 do tipo I. Não pode ser também excluído que os peptídeos de acordo com a invenção, se liguem também ainda a outros receptores, como por exemplo, ao receptor κ-opióide. Partindo desta suposição é presumido que, os peptídeos de acordo com a invenção, podem-se ligar a vários receptores, que depois da activação através dos seus ligandos originais, intervêm todos no acontecimento inflamatório de forma pro-inflamatória. Através da ligação dos peptídeos de acordo com a invenção a estes receptores, é impedida a ligação dos ligandos originais a estes receptores e assim é impedida a indução dos efeitos pro-inflamatórios. Por outro lado, a ligação dos peptídeos de acordo com a invenção aos receptores, das suas substâncias de partida (aMSH) activa estes receptores e induz 7 assim uma outra componente do mecanismo de actividade, que no conjunto é anti-inflamatório.
Figura 1 mostra que a injecção intravenosa de aMSH, KPV (lisina-prolina-valina) ou KPT (lisina-prolina-treonina) impede a fase de sensibilização de CHS ("contact hypersensitivity reaction", reacção de hipersensibilidade de contacto).
Figura 2 mostra que a aplicação intravenosa de aMSH, KPV ou KPT pode induzir tolerância.
Figura 3 ilustra a secreção de IL-10 (interleucina-10) através de PBL humanos ("peripheral blood lymphocytes", linfócitos de sangue periférico) 24 horas depois de tratamento com aMSH, KPV ou KPT.
Figura 4 mostra a secreção de IL-10 através de PBL humanos 48 horas depois de tratamento com aMSH, KPV ou KPT.
Figura 5 mostra que células THP-1 (uma linha de células monociticas) exprimem receptores para aMSH.
Figuras 6a até d, 7a até d e 8a até d mostram que num ensaio de competição, aMSH, KPV ou KPT não marcados, podem expulsar aMSH marcada com biotina dos locais de ligação em células THP-1.
Figura 9a mostra a expressão de "Cell Adhesion Molecules" (CAMS) sobre a superfície de células HMEC-1 ("Human Microvascular Endothelial Cell Line 1") 24 horas depois de tratamento através de TNFa + aMSH ou TNFa + KPT.
Figura 9b mostra a adesão de linfócitos a HDMEC ("Human Dermal Microvascular Endothelial Cells") (ensaio de libertação de crómio). A: Molt4 linfócitos-T; B: JY linfócitos-B.
Figura 10 mostra a influência de aMSH, KP, KPV ou KPT sobre a activação de NK-kB (factor nuclear kB) em células HMEC-1 tratadas com LPS (lipopolissacarídeo).
Figura 11a mostra que o número de vasos expressores de E-selectina é diminuído em sectores de tecido através de tratamento com aMSH.
Figura 11b mostra que o número de lesões petequiais nos ouvidos de murganhos tratados com LPS é reduzido através de tratamento com aMSH.
Figura 12 mostra que através de tratamento in vitro de BMDC ("bone marrow derived dendritic cells", células dendriticas derivadas da medula óssea) com aMSH ou KP, pode ser impedida a CHS e induzida tolerância.
Figura 13a mostra que num ("Band Shift Assay") NK-kB a intensidade das bandas heterodiméricas ΝΚ-κΒ-ρ65/ρ50 é reduzida através de diferentes peptídeos derivados de aMSH.
Figura 13b mostra o efeito de aMSH, KP ou K sobre a reacção CHS e o efeito de aMSH ou KP sobre a indução de tolerância em murganhos BalbC.
Figura 14 mostra o impedimento de CHS através de células T que foram contactadas in vitro com DC carregado de antigénio e tratado com aMSH ou derivado. 9
Figura 15 mostra a indução da tolerância através de células T, que foram contactadas ín vitro com DC carregado de antigénio e aMSH.
Figura 16 mostra a regulação de CTLA-4 sobre células T depois de contacto com DC carregado de antigénio e tratado com aMSH ou derivado. A: CD4 células T positivas; B: CD8 células T positivas.
Os exemplos seguintes devem esclarecer mais detalhadamente a invenção.
Exemplo 1
Murganhos:
Murganhos Balb/C fêmas de 7 até 10 semanas de idade foram obtidos de Charles River (Sulzfeld, Alemanha) e mantidos de acordo com as determinações federais.
Administração de aMSH (exemplo de comparação) ou KPV (exemplo de comparação) ou KPT ou KP: aMSH e os peptídeos foram armazenados como aliquotas a -20 °C até à utilização. Antes da injecção, o respectivo composto foi dissolvido em PBS, 0,1% de soro de murganho e armazenou-se em gelo até à injecção i.v. na veia da cauda dos murganhos. 5 pg de aMSH ou 1,5 pg de peptídeo (KP: 50 pg) por murganho foram injectados 2 horas antes da sensibilização. 10
Determinação de CHS e tolerância:
Os murganhos foram sensibilizados através de espalhamento de 75 pL de 0,5% de DNFB em acetona-azeite (4:1) sobre o ventre rapado de murganhos não tratados. Para despoletar a CHS untou-se os ouvidos dos murganhos com 10 pL de 0,3% de DNFB em ambos os lados de um ouvido. A CHS foi determinada através do grau da tumefacção auricular do ouvido exposto a hapteno comparado com o do outro ouvido, com tratamento de controlo, e medida 24 horas depois da exposição a hapteno com um compasso de espessura de extensão elástica. Os murganhos cujos ouvidos foram expostos sem sensibilização prévia a hapteno serviram de controlo negativo. De maneira a determinar se a injecção de aMSH ou peptideos antes da aplicação de hapteno conduz à indução de tolerância, os murganhos foram injectados i.v. com aMSH ou peptideos 2 horas antes da sensibilização (abdómen) ou expostos (ouvido esquerdo) como descrito. Para confirmar a supressão de CHS induzida por aMSH, os murganhos, 7 dias depois da sensibilização, foram expostos num ouvido a hapteno, sendo a resposta de tumefacção auricular determinada 24 até 36 horas mais tarde. 14 dias mais tarde os mesmos murganhos foram mais uma vez sensibilizados nas costas rapadas (agora na ausência de aMSH exógeno) e pesquisados relativamente à sua capacidade no sentido de induzirem uma resposta CHS através de uma segunda exposição a hapteno no ouvido direito uma semana mais tarde.
Em algumas experiências foram utilizadas preparações tópicas de aMSH. Nessas experiências os murganhos, no local da sensibilização (abdómen), foram untados imediatamente antes ou 3 horas ou 24 horas antes da sensibilização. 11
Resultado:
Injecção i.v. de aMSH bem como de KPV ou KPT ou KP inibe a capacidade dos murganhos de induzirem uma resposta CHS sobre uma exposição a DNFB decorrida 7 dias mais tarde. Estes murganhos não desenvolvem assim nenhuma sensibilização especifica para DNFB. KPT impediu a resposta CHS da forma mais efectiva (ver figura 1 e 13b).
De maneira a diferenciar entre imunossupressão temporária e tolerância imunológica especifica, os murganhos foram sensibilizados uma segunda vez e expostos a hapteno. Os murganhos que tenham sido, antes da primeira sensibilização, injectados com aMSH ou KPV ou KPT, não puderam sequer ser sensibilizados através da aplicação de uma segunda dose sensibilizadora de hapteno, o que sugere, que estes murganhos desenvolveram tolerância contra DNFB. KPV mostrou um efeito fraco, em contrapartida aMSH e KPT e KP inibiram muito fortemente a resposta de tumefacção auricular (ver figura 2 e 13b) .
Exemplo 2
Material e métodos: Células mononucleares (PBMC) foram separadas de "Human Buffy Coats" através de centrifugação por gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque. Células (1 χ 10β por mL), cultivadas em RPMI 1640 com antibióticos e 10% de FCS não foram tratadas ou foram estimuladas com aMSH ou com os peptideos KPV ou KPT, com ou sem IL-Ιβ (10 U/mL) . Os sobrenadantes das culturas de PBMC foram 12 recolhidos 24 ou 48 horas depois de incubação e armazenados a -20 °C até à próxima utilização. Para a detecção de IL-10 foi utilizado um ELISA comercialmente disponível.
Resultados: PBMC humanas que não foram tratadas ou que tenham sido tratadas com diferentes concentrações de aMSH ou peptídeos, produziram depois de 24 horas de incubação apenas reduzidas concentrações de IL-10 (5-10 pg/mL). aMSH (10’n M), KPV (10’8 até 10‘9 M) e KPT (10‘8 até 10’9 M) induziram visivelmente a produção de IL-10 (ver figura 3) .
Depois de 48 horas de incubação as PBMC humanas produziram quantidades significativas de IL-10. aMSH, KPV e KPT aumentaram significativamente a produção de IL-10 através de PBLC humanas. Não existiu nenhuma diferença essencial entre aMSH e os peptídeos (ver figura 4).
Os resultados mostrados demonstram que o peptídeo KPT pode, tal como aMSH e KPV, inibir a sensibilização de CHS depois de aplicação intravenosa e pode induzir a tolerância específica a hapteno. KPT é também capaz de induzir IL-10 in vivo e in vitro. Os dados tornam também provável que o efeito imunossupressivo de aMSH não dependa in vivo apenas da indução de IL-10. 13
Exemplo 3
Material e métodos:
Todos os passos foram efectuados a 0 até 4 °C. A linha de células THP-1 monocitica foi lavada uma vez em PBS, uma vez em tampão de glicina ácido (50 mM de glicina, 100 mM de cloreto de sódio, pH 3) e três vezes com RPMI. De seguida, as células (2,5 x 106 por mL) foram ressuspendidas em 100 pL de RPMI/1% de BSA e transferidas para placas de microtitulação de 96 poços. Depois da adição de aMSH marcada com biotina (IO-10 M) , as células foram incubadas durante 1 hora a 4 °C, lavadas uma vez com PBS, ressuspendidas em 100 pL de PBS/1% de BSA e incubadas com estreptavidina marcada com FITC (40 pg/mL) durante 30 minutos a 4 °C no escuro. Depois de um último passo de lavagem, as células foram ressuspendidas em PBS. A quantidade de aMSH marcada com biotina ligada foi analisada com um citómetro de fluxo. Em experiências de controlo as células foram incubadas sem aMSH marcada com biotina mas na presença de estreptavidina-FITC. As células mortas foram excluídas através da adição de iodeto de propídio pouco tempo antes da análise de FACS. A especificidade da ligação da MSH marcada com biotina foi determinada através da adição de aMSH não marcada (10-6 até 10’12 M) ou KPV ou KPT (10"6 até IO'12 M) .
Resultados:
Depois da análise por FACS com aMSH marcada com biotina, células THP-1 não estimuladas exprimem quantidades significativas de locais de ligação, que são específicos para aMSH em comparação com as misturas de controlo, que foram apenas 14 incubadas com estreptavidina-FITC. Nesta experiência foi utilizada aMSH numa concentração de IO'10 M (ver figura 5).
Para determinar se as células THP-1 exprimem um dos receptores conhecidos de melanocortina (MC), efectuou-se RT-PCR com iniciadores específicos MC-1, MC-2, MC-3 e MC-4 . 0 RNA total foi obtido a partir de células THP-1. Foi detectado um produto de PCR especifico para MC-1 com um comprimento esperado de 416 bp (Rajora et al., 1996, J. Leuk. Biol., 59, 248). Não foram ccomprovados produtos de PCR específicos para MC-2, MC-3 ou MC-4. Os resultados mostram que as células THP-1 exprimem MC-1, a qual ao contrário de outros receptores de melanocortina é específica para aMSH e ACTH.
Para pesquisar se os locais de ligação que são expressos sobre THP-1, são específicos para aMSH, foram efectuadas experiências de competição com aMSH ou KPV ou KPT. A ligação específica foi detectada através de incubação de células THP-1 com aMSH marcada com biotina (10“10 M) e diferentes concentrações de aMSH não marcada ou peptídeos. aMSH não marcada numa concentração de 10'8 M impediu significativamente a ligação de aMSH. Quando aMSH foi utilizada em concentrações de ΙΟ’6 Μ, IO-10 M ou 10'12 M, não pôde ser observada nenhuma supressão significativa (figuras 6a até 6d) .
Quando KPV não marcado foi utilizado, pôde ser observada uma inibição significativa apenas para uma concentração de 1CT6 M (ver figuras 7a até 7d) .
No caso do peptídeo KPT pôde ser observada uma inibição significativa da ligação de aMSH para cada uma das concentrações testadas (10'6 até 10'12 M, ver figuras 8a até 8d) . 15
Estes resultados mostram que o peptídeo KPT se liga ao receptor de melanocortina sobre células THP-1, que é específico para aMSH, o que sugera que aMSH e KPT apresentam um local de ligação comum. Uma vez que KPT contudo, mostra já em concentrações muito reduzidas competição para o receptor, é provável que este peptídeo tenha até uma afinidade mais elevada para o receptor de MC-1 que MSH.
Exemplo 4
Material e métodos: "Human Dermal Microvascular Endothelial Cells" (HDMEC) e a linha de células HMEC-1 (Human Microvascular Endothelial Cell Line 1) foram tratadas com TNFa ou LPS na presença ou ausência de um dos peptídeos. As células foram recolhidas para isolamento de RNA depois de 3 e depois de 6 horas após o tratamento ou recolhidas para EIA-adesão molecular ou análise por FACS, 3, 6, 16 ou 24 horas depois do tratamento. 0 RNA foi transcripto de forma reversa e as amostras submetidas a um PCR para E-selectina, ICAM-1, VCAM ou para β-actina como "Housekeeping Gene", de maneira a efectuar uma determinação semiquantitativa. Para o ensaio de adesão de linfócitos foram semeadas as células endoteliais em caixas e incubadas com linfócitos marcados com 51Cr. Depois de um passo de lavagem, foi determinada a quantidade de linfócitos restantes que ficaram ligados à camada de EC, através de medição da radioactividade nas amostras. 16
Resultados : 0 tratamento das células endoteliais com aMSH ou KPT inibiu a expressão induzida por LPS ou TNFa das moléculas de adesão. Este efeito foi observado numa gama de concentração de 10’6 até 10“12 M de aMSH ou peptídeo. 0 peptideo KPT tinha o efeito mais forte sobre a expressão da molécula de adesão-mRNA. A expressão superficial induzida através de LPS ou TNFa de moléculas de adesão foi reduzida em pequena medida através de todos os agonistas. Estes dados foram obtidos quer através de EIA, em que células inteiras foram utilizadas, como também através de FACS com anticorpos específicos (ver figura 9a, que mostra dados de EIA). aMSH reduz significativamente a ligação de células T e B à camada EC tratada com LPS ou TNF-aMSH (ver figura 9b) . Estes resultados mostram na totalidade que aMSH possui um efeito sobre a adesão de linfócitos à EC e assim reduz também a extravasação de linfócitos em estados de inflamação dos tecidos. Isto é apoiado através dos dados in vivo para vasculite localizada.
Exemplo 5
Material e métodos: Células epidermais (ECs) ou queratinócitos humanos normais (HNK) foram tratados com IL-1, LPS ou TNFa na presença ou ausência de peptídeos. Depois de 15 ou 30 minutos foram obtidas as proteínas centrais e submeteu-se a um "Electrophoretic Mobility Shift Assay" (EMSA) com oligonucleotídeo marcado 17 radioactivamente com sequência de ligação especifica NF-κΒ. 0 oligonucleotideo não marcado foi utilizado como competidor. Em algumas experiências foram utilizados anticorpos contra a cadeia p65 ou p50 de NF-κΒ, de maneira a confirmar a identidade das bandas detectadas como homodímero-p50 ou heterodimero-p50/p65.
Resultados:
Em ECs tratadas com TNFa ou LPS, bem como em HNKs tratados com IL-1, a adição dos peptideos conduz a uma activação reduzida do factor de transcripção NF-κΒ (ver figuras 10 e 13a) . Isto conduz por sua vez a um enfraquecimento da transcripção dos genes para numerosos mediadores pro-inflamatórios (citocinas, quimioquinas, moléculas de adesão, etc.) A identidade das bandas observadas no EMSA como heterodimero NF-κΒ foi confirmado através da utilização de anticorpo anti-p65.
Exemplo 6
Material e métodos:
Murganhos foram tratados com LPS através de injecção s.c. num ouvido. Esta injecção de preparação induz um aumento prolongado na expressão de E-selectina no local da injecção de LPS. 24 horas mais tarde foi injectada uma segunda dose de LPS i.p. (Challenge) . Esta segunda injecção de LPS conduz a uma necrólise vascular rápida e à formação de lesões petequiais, que devido ao seu tamanho e número podem ser determinadas com facilidade. Foi administrado aMSH (25 pg) na altura da injecção de preparação de LPS. 18
Resultado: A injecção de aMSH na altura da administração da LPS de preparação inibe a indução da expressão local de E-selectina no ouvido (ver figura 11a) e reduz significativamente o número e tamanho das lesões petequiais, que são formadas depois da injecção "Challenge" de LPS (ver figura 11b) .
Exemplo 7
Material e métodos: Células dendriticas da medula óssea (BDMC) fpram isoladas do osso de fémur de murganhos e tratadas com IL-4 e GM-CSF durante 6 ou 9 dias. No dia 6 ou 9 as células foram tratadas com aMSH (2 x 10’11 M) ou com o peptideo KP(2 χ IO’6 M) 3 horas e 2,5 horas antes da reinjecção em murganhos não tartados com a mesma base genética. 2 horas antes da reinjecção, as células foram tratadas com hapteno (1 mM de DNBS, a forma solúvel em água de DNFB). Imediatamente antes da reinjecção, as células foram lavadas 2 χ com PBS. 5 χ 10’5 células foram injectadas em cada animal de forma i.v.. Células de controlo foram tratadas com DNBS individualmente ou aMSH individualmente ou deixadas não tratadas. 5 dias depois da injecção os animais foram contactados no ouvido com DNFB e a espessura do ouvido foi medida no dia seguinte. 2 semanas mais tarde os animais foram ressensibilizados com DNFB e de novo 5 dias mais tarde recontactados no ouvido. Finalmente, foi medida a tumefacção auricular. 19
Resultados :
Animais receptores que foram injectados com células não tratadas ou células tratadas com aMSH, não mostraram, como esperado, nenhuma reacção imunológica depois da primeira "Challenge". Animais receptores que tinham sido injectados com BDMC tratadas com DNBS mostraram uma reacção CHS correspondente na altura da primeira "Challenge". Esta reacção foi suprimida em animais que tinham sido injectados com células, que anteriormente tinham sido tratadas in vitro com TNBS e aMSH ou TNBS e KP. Assim, o contacto de CDs com aMSH ou peptideo é suficiente de maneira a despoletar a inibição da CHS (ver figura 12) .
Na altura da segunda "Challenge" e a correspondente ressensibilização, os animais, que mais uma vez tinham sido injectados com células tratadas com DNBS, não mostraram nenhuma resposta imunológica, em contrapartida aqueles que tinham sido injectados com células tratadas com DNBS/aMSH não mostraram nenhuma resposta imunológica, o que indica que a tolerância induzida por aMSH é também mediada através de DC (ver fgura 12).
Exemplo 8 "Imunoterapia com células dendriticas ou células T tratadas com aMSH ou derivado de aMSH"
Foram isoladas células dendriticas (DC) (a partir de sangue, medula óssea ou tecidos). Podem também ser utilizadas contudo misturas de células, que contenham DC (por exemplo, mistura de células epidérmicas) e cultiva-se na presença de GM- 20 CSF e IL-4 (de um modo preferido: 250-1000 μ/mL de cada uma das substâncias).
Depois de um período de tempo de amadurecimento (de um modo preferido 6-9 dias) as células são carregadas com antigénio (concentração depende de cada antigénio, assim como no período de tempo) e tratadas com aMSH ou derivados desta. Os derivados correspondem pelo menos nos aminoácidos 12 e 13 da aMSH (Lys-Pro) . Os peptídeos reivindicados pelo presente pedido são Lys-Pro e Lys-Pro-Thr. São possíveis configurações D e L dos AA assim como permutas conservativas de AA. Isto conduz, entre outras, a que também pode ser utilizado o Lys-Pro-Thr derivado de IL-Ιβ, bem como derivados deste que são prolongados no terminal N. Também podem ser utilizados derivados prolongados no terminal C. A adição do peptídeo pode ocorrer antes da adição do antigénio, ao mesmo tempo, mais tarde uma vez ou várias vezes a dose preferida dependente do respectivo peptídeo, para aMSH por exemplo IO"8 M até 10”14 M) .
As células assim tratadas são depois injectadas i.v. no organismo receptor (i.p. ou s.c. seriam também possíveis); murganho: 2 χ 105 células, aproximadamente, limite inferior. Em função do antigénio é neste caso suficiente efectuar uma única injecção ou, caso necessário, várias injecções. Também é possível que depois de espaços de tempo prolongados, as injecções tenham de ser repetidas (para este efeito ainda não existem dados).
Alternativamente é possível colocar em contacto DC fora do corpo com células T e depois injectar a mistura ou as células T. Neste caso o carregamento de antigénio de DC pode ocorrer antes do contacto com as células T ou durante o mesmo. As células T 21 podem neste acso também ser originárias de indivíduos já sensibilizados contra o respectivo antigénio. No murganho o limite inferior é de aproximadamente 1 milhão de células T, um são preferidas mais células (figura 14 e 15) .
As vantagens de uma forma de aplicação deste tipo são a prevenção contra cada tipo de reacções imunológicas indesejadas, que são específicas para o antigénio e para as quais linfócitos antigénio-específicos (células B ou T) desempenham um papel patogénico. Entre estes contam-se, entre outros, alergias, doenças auto-imunes, inflamações crónicas ou implantes. Na utilização de números de células suficientemente elevados é também possível uma cura de doenças já estabelecidas.
Os resultados surpreendentes podem ser vistos, sem se querer associar a uma teoria, no facto de a aMSH ser um imunomodelador potente e possuir numerosas propriedades anti-inflamatórias. Entre estas conta-se, entre outras, a sua propriedade de reduzir a expressão de moléculas co-estimuladoras sobre DC. Outros derivados de aMSH também apresentam propriedades similares, incluindo o tripeptídeo C-terminal e também o dipeptídeo Lys-Pro de acordo com a invenção. Também derivados com outra composição de aminoácidos (permutas conservativas de AA) têm propriedades comparáveis. Entre estes conta-se em especial o Lys-Pro-Thr, de acordo com a invenção, derivado de IL-Ιβ (sendo de presumir, que também peptídeos prolongados no terminal N (analogamente à aMSH) actuam de forma igual com a IL-Ιβ de sequência colinear).
In vivo a aMSH, bem como também os derivados, são capazes de induzir tolerância específica a hapteno. DC são células que apresentam profissionalmente antigénio, que são capazes de 22 induzir numerosos tipos de reacções imunológicas e que determinam também o decurso desse tipo de reacções. Entre estas reacções imunológicas contam-se acima de tudo as reacções imunológicas mediadas por células T. Pôde ser agora mostrado que o tratamento in vitro de DC ou misturas de células DC-T com um antigénio na presença de aMSH ou derivados desta, conduz a que estas células depois da injecção num organismo induzam igualmente tolerância especifica a hapteno. 0 mecanismo parece ser aqui que a apresentação do antigénio das DC através de aMSH ou derivados é modelado de tal forma, que ocorre a geração de células T supressoras. Assim pôde ser mostrado que as células T em misturas correspondentes apresentam uma elevada expressão de CTLA-4 (figura 16) . Isto é uma das moléculas de superfície, que caracterizam as células T supressoras.
Com as células DC ou T geradas deste tipo é possível evitar de forma preventiva doenças auto-imunes, inflamações crónicas ou alergias. Também pode ser prevenida uma rejeição de implantes ou transplantes. Na utilização de números de células suficientemente elevados é pensável também uma cura de um estado de doença já estabelecido. 23
Os compostos de acordo com a invenção podem ser utilizados também no tratamento de tumores por meio de uma activação in situ de células dendriticas. Este método pode possivelmente ser utilizado também para o desenvolvimento de tolerância na presença dos peptideos de acordo com a invenção.
Lisboa, 15 de Maio de 2007 24
Claims (7)
- REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um composto seleccionado do grupo constituído por lisina-prolina, lisina-prolina-treonina e sais farmaceuticamente aceitáveis destes para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de doenças inflamatórias da pele.
- 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o composto ser o tripeptideo lisina-prolina-treonina.
- 3. Utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a doença inflamatória da pele ser seleccionada do grupo constituído por psoriase, dermatite atópica, alergias de contacto e alergias alimentares.
- 4. Utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o composto ser administrado na forma de um unguento ou creme.
- 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por o composto estar contido no unguento ou creme numa concentração de 1 μΜ até 1 mM.
- 6. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 até 3, caracterizada por o composto ser administrado de forma intraperitoneal, intravenosa ou oral.
- 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por ser administrado 20 pg/kg de peso corporal até 10 mg/kg de peso corporal do composto. 1 Utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizada por serem utilizados, pelo menos, 2 compostos diferentes seleccionados do grupo constituído por lisina-prolina, lisina-prolina-treonina e sais farmaceuticamente aceitáveis destes. Lisboa, 15 de Maio de 2007
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