PT2198723E

PT2198723E - Compostos anti-inflamatórios

Info

Publication number: PT2198723E
Application number: PT101546430T
Authority: PT
Inventors: Thomas Luger
Original assignee: Thomas Luger; Thomas Brzoska; Stephan Grabbe
Priority date: 2001-02-14
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2013-06-12
Also published as: ES2281511T3; EP2196202B1; CY1114214T1; US20120045462A1; WO2002064131A2; ATE502632T1; HK1095538A1; JP2004533995A; EP1749524A3; DK1427405T3; DE50209873D1; PL223229B1; NZ542406A; CN1269477C; CN101810847B; CY1114024T1; AU2006203622B2; DK2198723T3; US8846617B2; AU2006203622A1

Description

1

DESCRIÇÃO "COMPOSTOS ΑΝΤΙ-INFLAMATÓRIOS" A hormona tridecapeptídica estimulante de a-hormonas melanocíticas (aMSH) origina-se a partir da hormona precursora pró-opiomelanocortina (POMC). Várias hormonas peptidicas biologicamente activas como p. ex. a β- lipotropina, a adrenocorticotrópica (ACTH), a β-endorfina e as melanotropinas (α, β e γΜΞΗ) derivam do produto génico da POMC. Para o processamento destes péptidos são necessárias enzimas proteoliticas com diferentes especificidades. Além disso, podem ocorrer modificações pós-tradução como acetilações.

Os efeitos da aMSH e de outros péptidos da POMC sobre diferentes tecidos são induzidos por uma família de receptores específicos. Estes receptores de melanocortina (MC) pertencem ao grupo de receptores acoplados à proteína G. Clonaram-se cinco receptores de melanocortina diferentes (MC-1 a MC-5) . Aceita-se que a aMSH é um sinal importante para a regulação de diferentes funções das hormonas melanocíticas. Por exemplo, a proliferação, a diferenciação e a produção de citoquinas de hormonas melanocíticas estariam influenciadas pela aMSH.

Também se revelou que os produtos génicos da POMC podem influir em reacções imunes e reacções inflamatórias. Por exemplo, parte-se do princípio que a aMSH regula para baixo várias citoquinas pró-inflamatórias, enquanto a produção da citoquina anti-inflamatória IL-10 é estimulada mediante a aMSH. A aMSH tem, por isso, uma função importante na supressão de reacções imunes e inflamatórias. Vários estudos indicam que os efeitos imuno-moduladores e anti-inflamatórios da aMSH são induzidos pela região C-terminal da aMSH (aminoácidos 11-13: Lys-Pro-Val), uma vez que a administração do tripéptido C-terminal é suficiente 2 para induzir estes efeitos (Catania e Lipton, 1993, Endoc. Rev. 14, 564-576; Bhardvaj et al., 1996, J. Immunol. 156, 2517-2521). A WO 88/00833 divulga a utilização do tripéptido Lys-Pro-Val na produção de um medicamento para o tratamento de inflamações. O tripéptido C-terminal da aMSH também foi proposto como agente contra a queda do cabelo (FR 2 733 421) . A WO 96/09063 Al descreve o tratamento de doenças oculares, em especial o tratamento ou profilaxia da cicatrização da retina, cujo descolamento pode ser motivado por infecções oculares bacterianas ou virais. Neste contexto foi descrita a utilização de compostos de muramil péptidos no tratamento de doenças como queratite ou a querato-uveite, especialmente quando provocadas por infecção virai ou bacteriana ou por infecção por clamidia. A. 0. Oluyomi et al (Eur. J. Pharmacol. 258, 1994, 131-138) divulga a pesquisa de uma série de análogos do tripéptido Lys-Pro-Thr em dois modelos da antinocicepção em ratinhos.

Um objectivo da presente invenção é pôr à disposição outros compostos anti-inflamatórios.

Surpreendentemente, foi encontrado que o tripéptido Lys-Pro-Thr apresenta propriedades anti-inflamatórias. Ao contrário do esperado, compostos inclusive menores como Lys-Pro apresentam propriedades vantajosas. O objectivo da presente invenção é por isso um composto com a fórmula (I) o Ϊ!

H.N—CH-C—X

I (CH2)4 í NH* 0), onde X é Pro ou Pro-Thr, ou um sal farmacêutico tolerável derivado dele, para sua aplicação no tratamento e/ou a 3 prevenção de doenças inflamatórias do intestino. 0 conceito "doenças inflamatórias" compreende não só as inflamações, mas também as doenças em que está envolvida uma inflamação, por exemplo, as doenças auto-imunes ou a rejeição aos implantes. 0 composto utilizado de acordo com a invenção pode ser o dipéptido lisina e prolina, mas preferentemente utiliza-se o tripéptido lisina-prolina-treonina (=KPT).

Os aminoácidos que ocorrem de forma natural apresentam geralmente a configuração (L). Os aminoácidos dos compostos utilizados de acordo com a invenção podem ter, quer a configuração (L), quer a configuração (D). Por isso, possíveis compostos da estrutura KPT são (L)Lys-(D)Pro-(L)Thr, (L)Lys-(L)Pro-(D)Thr, (L)Lys-(D)Pro-(D)Thr, (L)Lys-(L)Pro-(L)Thr, (D)Lys-(D)Pro-(L)Thr, (D)Lys-(D)Pro-(D)Thr, (D) Lys-(L)Pro-(L)Thr, (D)Lys-(L)Pro-(D)Thr, sendo preferido entre todos o composto (L)Lys-(D)Pro-(L) Thr. 0 composto da fórmula (I) pode estar modificado quimicamente no N-terminal e/ou no C-terminal, por exemplo por um grupo acilo, preferentemente um grupo acetilo no N-terminal e/ou uma amidação ou esterificação no C-terminal. São também possíveis outros grupos protectores conhecidos de per si.

No âmbito do presente pedido, o conceito "composto da fórmula (1)" também compreende os sais farmaceuticamente toleráveis do composto.

Os compostos mencionados podem ser utilizados para o tratamento de todo tipo de inflamações agudas ou crónicas vasculares. A elas pertencem, entre outras, as inflamações agudas e crónicas, p. ex. reacções alérgicas, doenças auto- 4 imunes, fibroses e rejeições aos transplantes. É vantajosa a utilização sob a forma de uma pomada ou creme, numa concentração de 1 μΜ a 1 mM, de preferência entre 10 μΜ a 100 μΜ. Uma pomada ou creme destes pode ainda conter componentes habituais, como descrito, por exemplo, em Braun-Falco et al. (1996) Dermatologie und Venerologie, Springer Verlag, Berlin ou Merk, Bickers (1992) Dermatopharmakologie und Dermatotherapie.

Os compostos utilizados conforme a invenção são também eficazes de forma sistémica para tratar ou prevenir inflamações. O composto é administrado então preferentemente por via intraperitoneal, intravenosa ou oral. A dose de uma administração é em geral de 20 pg a 10 mg por kg de peso corporal, preferentemente 100 pg a 1 mg por kg de peso corporal. Por último, os compostos mencionados também se podem utilizar em forma de spray, por exemplo por inalação, para o tratamento de inflamações das vias respiratórias. É possivel utilizar vários compostos diferentes da fórmula (I) para o tratamento. Nesta forma de realização, para o tratamento de inflamações são utilizados pelo menos dois compostos diferentes da fórmula (I).

Os compostos da fórmula (I) podem ser utilizados também para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de inflamações. Esta utilização compreende de forma análoga todas as formas de realização antes indicadas. O composto é misturado habitualmente com um suporte ou diluente farmaceuticamente tolerável. Métodos conhecidos de per si para a fabricação de medicamentos indicam-se em Forth, Henschler, Ruminei (1996) . Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie, Urban & Fischer.

Os compostos da fórmula (I) podem ser adicionados também a produtos alimentares para reduzir o potencial alérgico de determinados componentes dos produtos 5 alimentares. A concentração nos produtos alimentares pode ser de 1 μΜ a 1 mM.

Também é possível utilizar um composto da fórmula (I) como aditivo não farmacológico em cosméticos. Por exemplo, no caso de pele irritada ou após exposição solar, podem ser utilizados cremes que contenham um composto da fórmula (I). 0 péptido Lys-Pro-Thr impede a activação do factor de transcrição NF-κΒ mediante TNFa, IL-1 ou LPS em células endoteliais e em queratinócitos. Em consequência, atinge-se uma expressão reduzida de moléculas de adesão celular (células endoteliais) e quimioquinas (queratinócitos) . Os inventores demonstraram também que o péptido KPT, por exemplo, impede o aparecimento de alergias de contacto (Contact Hypersensitivity Reactions, CHS Reactions) e induz uma tolerância específica aos alérgenos duradoura. No caso das reacções de CHS há que diferenciar dois períodos: um primeiro contacto (fase de indução) com um antigénio estabelece as bases para uma reacção de CHS posterior; o seguinte contacto com o antigénio produz o aparecimento da reacção (eczema de contacto, isto é, inchaço, comichão, etc). Os compostos utilizados conforme a invenção podem ser utilizados antes dos dois períodos, no caso da sua utilização antes do primeiro contacto (por injecção ou administração tópica) reprime-se a CHS e a indução de tolerância; se for utilizado no momento em que surge o eczema de contacto, os compostos impedem o aparecimento do eczema. Em todas estas aplicações produz-se uma inibição praticamente total da reacção alérgica.

Também foi descoberto que Lys-Pro-Thr reduz a expressão de moléculas co-estimulantes em células dendríticas. Com grande probabilidade, trata-se de uma parte do mecanismo para a repressão de CHS e da indução de tolerância. Ao mesmo tempo, os compostos aumentam a secreção do IL-10 anti-inflamatório através de monócitos. 6

Este efeito faz também parte do mecanismo no contexto dos eczemas de contacto alérgicos.

Os compostos de acordo com a invenção poderiam unir-se a receptores β-adrenérgicos. Também se pode considerar que os péptidos utilizados conforme a invenção têm a capacidade de se unir ao receptor de IL-1 de tipo I. Também não se pode excluir que os péptidos de acordo com a invenção se unam a outros receptores, como por exemplo ao receptor k-opioide. Partindo desta aceitação, pensa-se que os péptidos de acordo com a invenção se podem unir a vários receptores, que após a activação e através dos seus ligandos originais interviriam todos de forma pró-inflamatória no episódio inflamatório. Com a união dos péptidos conforme a invenção a estes receptores impede-se a união dos ligandos originais a estes receptores e com isso, impede-se a indução dos efeitos pró-inflamatórios. Por outra parte, a união dos péptidos conforme a invenção aos receptores de suas substâncias base (aMSH) activa estes receptores e induz desta forma uma nova componente do mecanismo de acção, que é anti-inflamatória em conjunto. A figura 1 mostra que a injecção intravenosa de aMSH, KPV (lisina-prolina-valina) ou KPT (lisina-prolina-treonina) reprime a fase de sensibilização de CHS ("contact hypersensitivity reaction", reacção de hipersensibilidade ao contacto). A figura 2 mostra que a administração intravenosa de aMSH, KPV ou KPT pode induzir tolerância. A figura 3 ilustra a secreção de IL-10 (interleucina 10) por PBL humano ("peripheral blood lymphocytes", linfócitos de sangue periférica) 24 horas após o tratamento com aMSH, KPV ou KPT. A figura 4 representa a secreção de IL-10 por PBL humano 48 horas após o tratamento com aMSH, KPV ou KPT. A figura 5 representa que as células THP-1 (uma linha celular monocitica) expressam receptores de aMSH. 7

As figuras 6a-6d, 7a-7d e 8a-8d mostram que num ensaio de comparação, as aMSH, KPV ou KPT não assinaladas podem deslocar à aMSH assinalada com biotina dos pontos de união para células THP-1 A figura 9a representa a expressão de "Cell Adhesion Molecules" (CAMS) sobre a superfície de células HMEC-1 ("Human Microvascular Endothelial Cell Line 1") 24 horas depois do tratamento com TNFa + aMSH ou TNFa + KPT. A figura 9b representa a adesão de linfócitos a HDMEC ("Human Dermal Microvascular Endothelial Cells") (Chromium Release Assay). A: Molt4 Linfocitos-T; B: JY linfócitos-B. A figura 10 representa a influência de aMSH, KP, KPV ou KPT sobre a activação de NF-κΒ (factor nuclear kB) em células HMEC-1 tratadas em LPS (lipopolissacarídeo). A figura 11a mostra que o número de vasos que expressam E-selectina em cortes de tecidos diminui mediante tratamento com aMSH. A figura 11b mostra que o número de lesões petequiais nas orelhas de ratinhos tratados com LPS se reduz mediante tratamento com aMSH. A figura 12 mostra que se pode reprimir a CHS e induzir tolerância mediante o tratamento in vitro de BMCD ("bone marrow derived dendritic cells", células dendríticas derivadas de medula óssea) com aMSH ou KP. A figura 13a mostra que num "Band Shift Assay" de NF-kB, a intensidade das bandas heterodímeras NF-κΒ -p65/p50 se reduz com a utilização de diferentes péptidos derivados de aMSH. A figura 13b mostra o efeito de aMSH, KP ou K na reacção CHS e o efeito de aMSH ou KP na indução de tolerância em ratinhos BalbC.

A figura 14 mostra a repressão de CHS mediante células T, que foram postas em contacto in vitro com DC carregadas de antigénios e tratadas com oíMSH ou com um derivado. A figura 15 mostra a indução de tolerância mediante células T, que foram postas em contacto in vitro com DC carregadas de antigénios e oíMSH. A figura 16 mostra a supra-regulação de CTLA-4 em células T após o contacto com DC carregadas de antigénios e tratadas com oíMSH ou com um derivado. A: CD4 células T positivas; B: CD8 células T positivas.

Os seguintes exemplos explicarão com pormenor a invenção.

Exemplo 1 Ratinhos:

Receberam-se ratinhos Balb/C fêmeas de 7 a 10 semanas de idade da Charles River (Sulzfeld, Alemanha) e trataram-se de acordo com as normas federais.

Administração de aMSH (exemplo de referência), KPV (exemplo de referência), KPT ou KP; A aMSH, e os péptidos conservaram-se até à sua utilização como partes alíquotas a -20°C. Antes da injecção, o composto respectivo foi dissolvido em PBS e 0,1% de soro de ratinho e, até o momento da injecção intravenosa na veia caudal dos ratinhos, conservou-se no gelo. Injectaram-se 5 pg de aMSH ou 1,5 pg de péptido (KP: 50 pg) por cada ratinho 2 horas antes da sensibilização. Determinação da CHS e da tolerância:

Os ratinhos foram sensibilizados espalhando 75 pl de DNFB a 0,5% em acetona-azeite (4:1) sobre o ventre sem pêlo de ratinhos não tratados previamente. Para desencadear a CHS, as orelhas dos ratinhos foram cobertas com 10 pl de DNFB a 0,3%, em ambos os lados de uma orelha. A CHS foi determinada pelo grau de inchaço da orelha exposta ao hapteno, em comparação com a outra orelha tratada como controlo, e foi medido com um compasso de espessuras em tensão de mola, 24 horas após a exposição ao hapteno. Os 9 ratinhos cujas orelhas foram expostas a hapteno sem sensibilização anterior serviram de controlo negativo. Para determinar se a injecção de aMSH ou de péptidos antes da aplicação do hapteno conduz à indução de tolerância, foram injectados nos ratinhos de forma intravenosa (abdómen) aMSH ou péptidos 2 horas antes da sensibilização ou foram expostos (orelha esquerda) como foi descrito. Para confirmar a supressão da CHS induzida por aMSH, as orelhas dos ratinhos foram expostas ao hapteno, 7 dias após a sensibilização, e de 24 a 36 horas após, foi determinada a resposta de inchaço da orelha. 14 dias depois sensibilizaram-se novamente os mesmos ratinhos nas costas sem pêlo (agora na ausência de aMSH exogénico) e examinou-se a sua capacidade de induzir uma resposta de CHS com uma segunda exposição a hapteno na orelha direita, uma semana depois.

Nalgumas experiências utilizaram-se preparados tópicos de aMSH. Nestas experiências, os ratinhos foram cobertos na zona da sensibilização (abdómen) imediatamente antes, ou 3 ou 24 horas antes da sensibilização.

Resultado: 1 injecção intravenosa de aMSH, ou então de KPV, KPT ou KP, inibe a capacidade dos ratinhos de induzirem uma resposta de CHS a uma exposição a DNFB que ocorreu 7 dias mais tarde. Por isso, estes ratinhos não desenvolvem nenhuma sensibilização especifica a DNFB. 0 KPT reprimiu a resposta de CHS da forma mais eficaz (ver figuras 1 e 13b).

Para diferenciar entre imuno-supressão temporária e tolerância imunológica especifica, os ratinhos foram sensibilizados por segunda vez e expostos a hapteno. Os ratinhos que tinham sido injectados com aMSH, KPV ou KPT antes da primeira sensibilização, não puderam ser sensibilizados sequer por aplicação de uma segunda dose de haptenos sensibilizantes, o que indica que estes ratinhos desenvolveram tolerância face a DNFB. 0 KPV demonstrou um 10 efeito débil, enquanto aMSH, KPT e KP inibiram de forma muito potente a resposta de inchaço da orelha (ver figuras 2 e 13b) .

Exemplo 2

Material e métodos:

Separaram-se células mononucleares (PBMC) de "Human Buffy Coats" por centrifugação em gradiente de densidades de Ficoll-Hypaque. As células (1 x 106 por ml), cultivadas em RPMI 1640 com antibióticos e 10% de FCS, ou então não foram tratadas ou se estimularam com aMSH (exemplo de referência) ou com os péptidos KPV (exemplo de referência) ou KPT, com ou sem IL-Ιβ (10 U/ml) . Os sobrenadantes das culturas de PBMC foram reunidos após 24 ou 48 horas de incubação e foram conservados a -20°C até a sua posterior utilização. Para a detecção de IL-10 utilizou-se um ELISA que se pode adquirir comercialmente.

Resultados:

As PBMC humanas que não foram tratadas ou que foram tratadas com diferentes concentrações de aMSH ou de péptidos, após 24 horas de incubação só produziram concentrações baixas de IL-10 (5-10 pg/ml). Os aMSH (10' nM) , KPV (IO-8 a 10"9 M) e KPT (IO-8 a 10'9 M) induzem de forma evidente a produção de IL-10 (ver figura 3).

Após 48 horas de incubação, as PBMC humanas produziram quantidades importantes de IL-10. Os aMSH, KPV e KPT aumentaram de forma importante a produção de IL-10 mediante PBLC humanas. Não existiu uma diferença essencial entre o aMSH e os péptidos (ver figura 4).

Os resultados apresentados demonstram que o péptido KPT, como o aMSH e o KPV, podem inibir a sensibilização do CHS após a sua administração intravenosa, e pode induzir tolerância especifica aos haptenos. O KPT também está em condições de induzir IL-10 in vivo e in vitro. Os dados demonstram que é também provável que o efeito imuno- 11 supressor do aMSH in vivo não dependa apenas da indução de IL-10.

Exemplo 3

Material e métodos:

Todas as etapas realizaram-se a uma temperatura de 0o C até 4o C. A linha celular monocitica THP-1 foi lavada uma vez em PBS, uma vez em solução tampão de glicina ácida (glicina 50 mM, cloreto de sódio 100 mM, pH 3) e três vezes com RPMI. De seguida foram ressuspendidas as células (2,5 x 106 por ml) em 100 μΐ de RPMI/1% de BSA e foram transferidas para placas de microtitulação com 96 cavidades. Após a adição de aMSH (10“10) assinalado com biotina incubaram-se as células durante 1 hora a 4°C, lavaram-se uma vez com PBS, ressuspenderam-se em 100 μΐ de PBS/1% de BSA e incubaram-se na escuridão com estreptavidina (40 pg/ml) assinalada com FITC durante 30 minutos a 4°C. Após a última etapa de lavagem, as células ressuspenderam-se em PBS. A quantidade de aMSH ligada assinalada com biotina foi analisada com um citómetro de caudal. Em experiências de controlo, as células incubaram-se sem aMSH assinalado com biotina mas em presença de estreptavidina FITC. As células mortas foram excluidas por adição de iodeto de propídio pouco antes da análise de FACS. A especificidade da união do MSH assinalado com biotina foi determinada por adição de aMSH sem assinalar (de 10“6 a 10“12 M) (exemplo de referência), KPV (exemplo de referência) ou KPT (de 10“6 a 10“12M) .

Resultados:

De acordo com a análise de FACS com aMSH assinalado com biotina, as células THP-1 não estimuladas expressam quantidades significativas em pontos de união que são específicos do aMSH, em comparação com as quantidades de controlo que só se incubam com estreptavidina FITC. Nesta experiência utilizou-se aMSH numa concentração 10“10 M (ver figura 5). 12

Para determinar se as células THP-1 expressam um dos conhecidos receptores de melanocortina (MC), realizou-se um RT-PCR com iniciadores específicos MC-1, MC-2, MC-3 e MC-4. Todo o RNA obteve-se a partir de células THP-1. Detectou-se um produto de PCR específico de MC-1 com um comprimento esperado de 416 bp (Rajora et al., 1996, J. Leuk, Biol. 59, 248) . Não se detectaram produtos de PCR específicos de MC-2, MC-3 ou MC-4. Estes resultados põem de manifesto que as células THP-1 expressam MC-1, sendo o mesmo, ao contrário de outros receptores de melanocortina, específico de aMSH e ACTH.

Para examinar se os pontos de união que se expressam sobre THP-1 são específicos de aMSH, foram realizadas experiências de comparação com aMSH ou KPV ou KPT. A união específica obteve-se por incubação de células de THP-1 com aMSH assinalado com biotina (IO-10 M) e diferentes concentrações de aMSH ou péptidos não assinalados. 0 aMSH não assinalado, numa concentração de IO”8 reprimiu significativamente a união de aMSH. Quando foi utilizado aMSH em concentrações de ΙΟ”6 Μ, IO”10 M ou 10”12 M não foi observada supressão significativa (figuras de 6a a 6d).

Quando se utilizou KPV não assinalado, só foi possível observar uma inibição significativa com uma concentração 10”6 M (ver figuras de 7a a 7d) .

No caso do péptido KPT foi possível observar uma inibição importante da união de aMSH em cada uma das concentrações testadas (IO-6 a 10”12 M, ver figuras de 8a a 8d) .

Estes resultados demonstram que o péptido KPT se une ao receptor de melanocortina em células THP-1, que é especifico de aMSH, o que demonstra que o aMSH e o KPT apresentam um ponto de união comum. Mas, uma vez que o KPT a concentrações muito baixas demonstra competição pelo receptor, é provável que este péptido tenha uma afinidade inclusive maior para o receptor de MC-1 do que o MSH. Exemplo 4 13

Material e métodos; "Human Dermal Microvascular Endothelial Cells" (HDMEC) e a linha celular de HMEC-1 (Human Micro-vascular

Endothelial Cell Line 1) foam tratados com TNFa ou com LPS em presença ou ausência de um dos péptidos. Para o isolamento do RNA recolheram-se as células 3 e 6 horas após o tratamento ou, então, para o EIA da molécula de adesão ou para a análise de FACS recolheram-se 3, 6, 16 ou 24 horas após o tratamento. 0 RNA transcreveu-se de forma inversa, e submeteram-se umas amostras a uma PCR para E-selectina, ICAM-1, VCAM ou para β-actina como "Housekeeping Gene" para realizar uma avaliação semi-quantitativa. Para o ensaio de adesão de linfócitos, as células endoteliais cultivaram-se em cápsulas e com linfócitos assinalados com Cr51. Após uma etapa de lavagem, determinou-se a quantidade de linfócitos restantes que estavam unidos à camada de EC, por medição da radioactividade nas amostras.

Resultados; 0 tratamento das células endoteliais com aMSH (exemplo de referência) ou KPT inibiu a expressão induzida por LPS ou TNFa das moléculas de adesão. Este efeito observou-se num intervalo de concentrações de IO”6 a 10”12 M de aMSH ou de péptido. 0 péptido KPT teve o efeito mais potente sobre a expressão da molécula de adesão mRNA. A expressão de superfície de moléculas de adesão induzida por LPS ou TNFa reduziu-se em pequena medida mediante todos os agonistas. Estes dados obtiveram-se tanto por EIA, onde se utilizaram células inteiras, como também por FACS com anticorpos específicos (ver figuras 9a, que apresenta dados de EIA). A aMSH reduz de forma significativa a união de células T e B em camadas de EC tratadas com LPS ou TNF-aMSH (ver figura 9b). Considerados em conjunto, estes resultados demonstram que o aMSH tem um efeito na adesão de linfócitos a EC e, assim sendo, reduz também a extravasação de 14 linfócitos em situações de inflamação de tecidos. Isto é confirmado pelos dados in vivo relativos à vasculite localizada.

Exemplo 5 (exemplo de referência)

Material e métodos:

Trataram-se células epidérmicas (ECs) ou queratinócitos humanos normais (HNK) com IL-1, LPS ou TNFa em presença ou ausência de péptidos. Após 15 ou 30 minutos obtiveram-se as proteínas nucleares e submeteram-se a um "Electrophoretic Mobility Shift Assay" (EMSA) com um oligonucleótido assinalado radiactivamente, com sequência de uniões específica NF-κΒ. O oligonucleótido não assinalado foi utilizado como competidor. Nalgumas experiências utilizaram-se anticorpos contra a cadeia p65 ou p50 de NF-κΒ para confirmar a identidade das bandas detectadas quer como homodímeros p50 ou como heterodímeros p50/p65.

Resultado;

Nas ECs tratadas com TNFa ou LPS, como na HNKs tratada com IL-1, a adição dos péptidos conduz a uma activação reduzida do factor de transcrição NF-κΒ (ver as figuras 10 e 13a) . Isto conduz por sua vez a uma fragilidade da transcrição dos genes para um grande número de mediadores pro-inflamatórios (citoquinas, quimioquinas, moléculas de adesão, etc.). A identidade das bandas observadas no EMSA como heterodímero NF-κΒ foi confirmada através da adição de anticorpos anti-p65.

Exemplo 6 (exemplo de referência)

Material e métodos:

Os ratinhos foram tratados mediante injecção subcutânea de LPS numa orelha. Esta injecção preparatória induz um aumento duradouro na expressão de E-selectina no lugar da injecção de LPS. 24 horas mais tarde injectou-se intra-peritonealmente uma segunda dose de LPS (Challenge). Esta segunda injecção de LPS conduz a uma rápida necrólise 15 vascular e à formação de lesões petequiais, que se podem detectar facilmente graças a sua magnitude e número. No momento da injecção preparada de LPS foi administrado aMSH (25 pg) .

Resultado: A injecção de aMSH no momento da administração preparatória de LPS inibe a indução da expressão local de E-selectina na orelha (ver figura 11a) e reduz significativamente o número e tamanho de lesões petequiais que se formaram após a injecção de "Challenge" de LPS (ver figura 11b).

Exemplo 7

Material e métodos:

Isolaram-se células dentríticas de medula óssea (BMDC) do osso fémur de ratinhos e trataram-se com IL-4 e GM-CSF durante 6 ou 9 dias. No 6o e no 9o dia, as células foram tratadas com aMSH (2 x 10_11M) (exemplo de referência) ou com o péptido KP (2 x IO”6 M) durante 3 horas e 2,5 horas antes da repetição da injecção em ratinhos não tratados, com os mesmos antecedentes genéticos. 2 horas antes da repetição da injecção trataram-se as células com hapteno (1 mM DNBS, em solúvel de DNFB). Imediatamente antes da repetição da injecção, as células foram lavadas 2 vezes com PBS. Injectaram-se por via intravenosa 5 x 10”5 células por cada animal. As células de controlo foram tratadas com DNBS só ou com aMSH só, ou foram deixadas sem tratar. 5 dias após a injecção, os animais pôs-se DNFB em conctacto com a orelha e no dia a seguir mediu-se a espessura da orelha. 2 semanas mais tarde, os animais foram ressensibilizados com DNFB e 5 dias depois houve novo contacto na orelha. Por último mediu-se o inchaço da orelha.

Resultados:

Os animais receptores que foram injectados com células não tratadas ou células tratadas com aMSH, não manifestaram reacção imune qualquer após o primeiro "Challenge", tal 16 como se esperava. Os animais receptores que tinham sido injectados com BMDC tratado com DNBC, mostraram uma reacção CHS correspondente ao momento do primeiro "Challenge". Esta reacção suprimiu-se nos animais que tinham sido injectados com células que se tinham tratado previamente in vitro com TNBS e aMSH ou TNBS u KP. Assim sendo, o contacto de DCs com aMSH ou péptido é suficiente para desencadear a inibição dos CHS (ver figura 12)

No momento do segundo "Challenge" e da correspondente ressensibilização, os animais aos que se tinha injectado novamente células tratadas com DNBS não mostraram resposta imune alguma, enquanto os animais aos quais se tinha injectado células tratadas com DNBS/aMSH não mostraram resposta imune alguma, o que indica que a tolerância induzida por aMSH se induz igualmente por DC (ver figura 12) .

Exemplo 8 "Imunoterapia com células dentríticas ou células T tratadas com aMSH ou com um derivado de aMSH"

Isolaram-se células dentríticas (DC) (a partir de sangue, medula óssea ou tecidos). Também podem ser utilizadas, de todas formas, misturas celulares que contenham DC (p. ex. misturas celulares epidérmicas) e cultivaram-se em presença de GM-CSF e IL-4 (preferivelmente: 250-1000 μ/ml para cada uma das substâncias).

Após um tempo de maturação (preferivelmente, 6-9 dias) as células foram carregadas com antigénios (a concentração depende do correspondente antigénio, mas também do período de tempo) e trataram-se com aMSH (exemplo de referência) ou derivados seus. Os derivados correspondem pelo menos aos aminoácidos 12 e 13 de aMSH (Lys-Pro), também são possíveis os derivados que contêm Lys-Pro-Val (exemplo de referência). É possível ainda a configuração D- e L- dos AS (aminoácidos). Também se pode utilizar Lys-Pro-Thr derivada 17 do IL-Ιβ. A adição do péptido pode ocorrer antes da adição do antigénio, ao mesmo tempo, mais tarde, de forma simples ou múltipla (a dose preferida depende do correspondente péptido; para aMSH por exemplo, de 10‘8 M a 10‘14 M) .

As células assim tratadas foram injectadas depois por via intravenosa no organismo receptor (é possivel também intraperitoneal ou subcutaneamente) ; ratinho: 2 x 105 células como limite inferior. Consoante o antigénio, pode ser suficiente efectuar uma única injecção ou se necessário, várias injecções. Também é possivel que após períodos de tempo prolongados se tenham de repetir as injecções (para isso não existem dados ainda).

Em alternativa, é possível pôr em contacto DC com células T fora do corpo e injectar depois a mistura ou as células T. Para isso, a carga de antigénios das DC pode ser efectuada antes do contacto com as células T ou durante o mesmo. As células T podem ser provenientes também de indivíduos já sensibilizados contra o correspondente antigénio. No ratinho, o limite inferior é aproximadamente 1 milhão de células T, são preferíveis mais células (figuras 14 e 15).

As vantagens de um modo de aplicação deste tipo são, a prevenção de qualquer classe de reacção imune não desejada, que seja antigénio específica e na qual os linfócitos específicos de antigénios (células B ou T) desenvolvam uma função patogenética. Entre elas encontram-se, entre outras, as alergias, doenças auto-imunes, inflamações crónicas ou implantes. Com a utilização de um número suficientemente elevado de células também é possível a cura de doenças já existentes.

Os resultados surpreendentes, sem querer estar ligados a uma teoria, podem ser considerados no sentido em que o aMSH é um potente imunomodulador e possui inúmeras propriedades anti-inflamatórias. A elas pertence, entre outras, a sua capacidade de reduzir a expressão de 18 moléculas co-estimulantes em DC. Os derivados de oíMSH de acordo com a invenção apresentam também propriedades análogas, que atingem até o tripéptido C-terminal e também o dipéptido Lys-Pro. Também os derivados com outra composição de aminoácidos (substituições conservadoras de aminoácidos) têm propriedades comparáveis, entre eles encontram-se em concreto a Lys-Pro-Thr derivada de IL-Ιβ (de modo que se pode supor que também os péptidos estendidos pelo N-terminal (analogamente a aMSH) com a sequência colinear de IL-Ιβ actuam de igual forma).

In vivo, a α-MSH, como também os seus derivados, estão em condições de induzir uma tolerância especifica a haptenos. As DC são células que apresentam antigénios profissionalmente, que estão em condições de induzir inúmeros tipos de reacções imunes e que também determinam o decorrer desta classe de reacções. A estas reacções imunes pertencem especialmente as reacções imunes mediadas por células T.

Foi possivel demonstrar então que o tratamento in vitro de DC ou misturas celulares de DC e células T com um antigénio, em presença de α-MSH ou derivados de este, provoca que após a sua injecção num organismo, estas células também introduzam uma tolerância especifica aos haptenos. 0 mecanismo aqui parece ser que a apresentação de antigénios das DC é configurado mediante a aMSH ou os seus derivados de tal forma que se consegue a criação de células T supressoras. Assim, foi possivel demonstrar que nas correspondentes misturas, as células T apresentam uma elevada expressão de CTLA-4 (fig. 16) . Esta é uma das moléculas de superfície que caracterizam as células T supressoras.

Com DC ou células T criadas desta forma, é possivel impedir preventivamente doenças auto-imunes, inflamações crónicas ou alergias. Também é possivel prevenir uma 19 rejeição a implantes ou transplantes. No caso de utilizar um número suficientemente elevado de células pode-se considerar também a cura de um estado patológico já existente.

Os compostos de acordo com a invenção podem ser utilizados também para o tratamento de tumores, mediante uma activação in situ de células denditricas. Possivelmente, também se possa recorrer a este método para conseguir tolerância em presença dos péptidos conformes a invenção. 20

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição * WO 8800833 A ρβ04] * WO 9609083 A1 [0005] * FR 2733421 [9004]

Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição ♦ CATANIA; LIPTON. Endocr, Rsv., 19S3„ vol. 14, 5S4-57S |00δ3] « BHÂRDVAJ ei ai J. ímmunat, 1898, voL 156, 2517-2521 [88031 - A. O. OLUYOMi et aí. Eur. J. PhannacoL 1894, voí. 2SS, 131-138 [8086] ♦ BRAUM-FALCO et ai Dermatoíogíe und Vensrefo-gts. Sprínger Verfag, 1988 [08131 * MefK. Biefcers DenrmiQiyÍisrms^Otogie wiD&ma-tofàempm, 1992 [8013] - FORTH ; HENSCHLER ; RUMMEL. Atígerasneynd &peziefe Pi-sfmskoíogie uno Toxikatogie. Uttean & R&dw, 19S6 [001S] * RAJORA et ai. J. Leuk. Sfcrf., 1996, vos 59, 248 [0052]

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto, seleccionado do grupo constituído pelo dipéptido lisina-prolina, pelo tripéptido lisina-prolina-treonina e por sais farmaceuticamente toleráveis dos mesmos, para aplicação no tratamento de doenças inflamatórias vasculares.

2. Composto para a aplicação segundo a reivindicação 1, caracterizado por o composto ser o tripéptido lisina-prolina-treonina.

3. Composto para a aplicação segundo a reivindicação 2, caracterizado por o composto ser (L)Lys-/(D)Pro-(L)Thr.

4. Composto para a aplicação conforme uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o composto ser administrado sob a forma de uma pomada ou creme.

5. Composto para a aplicação segundo a reivindicação 4, caracterizado por a pomada ou creme conter o composto numa concentração de 1 μΜ a 1 mM

6. Composto para a aplicação conforme uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o composto ser administrado por via intraperitoneal, intravenosa ou oral.

7. Composto para a aplicação conforme a reivindicação 6, caracterizado por se administrar 2 0 pg por kg de peso corporal a 10 mg por kg de peso corporal do composto.

8. Composto para a aplicação conforme uma das reivindicações precedentes, caracterizado por serem utilizados, pelo menos, dois compostos diferentes dos compostos definidos na reivindicação 1.