JP4259870B2

JP4259870B2 - 炎症抑制化合物

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Publication number: JP4259870B2
Application number: JP2002563925A
Authority: JP
Inventors: ルガー・トーマス
Original assignee: ルガー・トーマス; ブロツォスカ・トーマス; グラベ・ステファン
Priority date: 2001-02-14
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2009-04-30
Anticipated expiration: 2022-02-08
Also published as: EP2196202A1; DK1427405T3; PL223478B1; US9550807B2; HK1140915A1; HK1140960A1; DE10106852A1; US20170087202A1; DE50214981D1; CN1541095A; EP1749524A3; EP2189156A1; US10046020B2; AU2002253000B2; EP2196202B1; PT2198723E; CN101215544A; CY1106563T1; EP1749524A2; ES2411935T3

Description

本発明は、炎症抑制化合物に関する。

トリデカペプチドであるα−メラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）は前駆ホルモンのプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）から産生される。幾つかの生物学的に活性のあるペプチドホルモン、例えば、β−リポトロピン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、β−エンドルフィンおよびメラノトロピン類（α−、β−およびγＭＳＨ）はＰＯＭＣの遺伝子産物に由来する。種々の特異性を有するタンパク質分解酵素がこれらペプチドのプロセッシングに必要である。加えて、アセチル化のような翻訳後修飾が起こる可能性がある。

さまざまな組織に対するαＭＳＨや他のＰＯＭＣペプチドの作用は、特定の受容体のファミリーで調節されている。これらのメラノコルチン（ＭＣ）受容体はＧタンパク共役受容体のグループに属する。５つの異なるメラノコルチン受容体（ＭＣ−１〜ＭＣ−５）がクローン化されている。αＭＳＨは種々のメラニン細胞機能を調整するための重要な指標であると考えられている。例えば、メラニン細胞による増殖、分化およびサイトカイン産生は、αＭＳＨの影響を受けると考えられている。

また、ＰＯＭＣ遺伝子産物が免疫応答や炎症反応に影響を与えられるということが明らかになっている。例えば、αＭＳＨは種々の炎症性サイトカインの反応を抑制し、また一方で抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生がαＭＳＨによって促進されていると考えられている。これはαＭＳＨが免疫応答や炎症反応の抑制に重要な役割を果たしていることを意味している。数々の研究により、Ｃ末端トリペプチドの投与がこれらの効果を引き起こすに十分であることから、αＭＳＨの免疫調節および抗炎症作用はαＭＳＨのＣ末端領域（アミノ酸１１−１３：Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）によって調節されることが示唆されている（非特許文献１、非特許文献２）。

国際公開第８８／００８３３号には、炎症治療用医薬を製造するためのトリペプチドＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌの使用が開示されている（特許文献１）。αＭＳＨのＣ末端トリペプチドは脱毛予防剤としても提案されている（特許文献２）。
国際公開第８８／００８３３号パンフレット仏国特許発明第２７３３４２１号明細書カタニアアンドリプトン（Catania and Lipton）、エンドクリンレビュー（Endocr. Rev.）、１４巻、５６４〜５７６頁（１９９３）バージャブ（Bhardvaj）他、ジャーナルオブイムノロジー（J.Immunol.）、１５６巻、２５１７〜２５２１頁（１９９６）

本発明の目的は、さらに進んだ炎症抑制化合物を提供することである。

トリペプチドであるＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒが、驚くべきことに抗炎症特性を有することが分かった。意外にも、Ｌｙｓ−ＰｒｏやＬｙｓのようなより低分子の化合物でさえもが有利な特性を示す。
したがって、本発明は、炎症性疾患の治療および／または予防のための式（Ｉ）

（式中、Ｘは、ヒドロキシル基、アミノ基、アルコキシ、ＰｒｏまたはＰｒｏ−Ｔｈｒを示す。）で表される化合物またはその薬理学的に許容しうる塩の使用に関する。炎症性疾患という語は、炎症だけでなく炎症を伴う疾患、例えば自己免疫疾患や移植拒絶のような疾患をも包含する。

本発明に用いられる化合物としては、リシンまたはジペプチドであるリシン−プロリンでもよいが、トリペプチドであるリシン−プロリン−トレオニン（＝ＫＰＴ）が好ましい。天然型アミノ酸類は通常Ｌ体である。本発明で用いられる化合物のアミノ酸類は、Ｌ体、Ｄ体のいずれでもよい。従って、ＫＰＴ構造である使用しうる化合物は、
（Ｌ）Ｌｙｓ−（Ｄ）Ｐｒｏ−（Ｌ）Ｔｈｒ、
（Ｌ）Ｌｙｓ−（Ｌ）Ｐｒｏ−（Ｄ）Ｔｈｒ、
（Ｌ）Ｌｙｓ−（Ｄ）Ｐｒｏ−（Ｄ）Ｔｈｒ、
（Ｌ）Ｌｙｓ−（Ｌ）Ｐｒｏ−（Ｌ）Ｔｈｒ、
（Ｄ）Ｌｙｓ−（Ｄ）Ｐｒｏ−（Ｌ）Ｔｈｒ、
（Ｄ）Ｌｙｓ−（Ｄ）Ｐｒｏ−（Ｄ）Ｔｈｒ、
（Ｄ）Ｌｙｓ−（Ｌ）Ｐｒｏ−（Ｌ）Ｔｈｒ、
（Ｄ）Ｌｙｓ−（Ｌ）Ｐｒｏ−（Ｄ）Ｔｈｒ
であり、（Ｌ）Ｌｙｓ−（Ｄ）Ｐｒｏ−（Ｌ）Ｔｈｒである化合物がもっとも好ましい。本発明に用いられる化合物は、アミノ酸の１つが保守的に(conservatively)置換されているアミノ酸置換を示していてもよい。

本発明に用いられる式（Ｉ）の化合物は、例えばアシル基によりＮ末端および／またはＣ末端で、好ましくはアセチル基によりＮ末端で化学的に修飾されていてもよく、および／またはＣ末端でのアミド化またはエステル化により修飾されていてもよい。また、自体公知の保護基も同様に考えられる。修飾によりリシン側鎖のアミノ基やトレオニンのヒドロキシル基もまた作用を受ける可能性がある。ＮＨ₂基側での他の修飾、例えばα―ＭＳＨの長さまでのグリシンやさらなるアミノ酸残基による延長もまた考えられる。

本願の目的に関し、「式（Ｉ）の化合物」という語は、該化合物の薬理学的に許容しうる塩も包含する。

前述の化合物は、あらゆるタイプの急性または慢性炎症の治療剤として使用できる。これらはなかんずく、例えば皮膚の急性または慢性炎症、乾癬、アトピー性皮膚炎、鼻炎から接触アレルギー、喘息、食物アレルギーに至るあらゆるアレルギー反応、自己免疫疾患、線維症や強皮症、移植拒否、また血管障害も含む。本化合物は、炎症状態の皮膚の治療に好適に用いられる。この場合において、軟膏やクリームの形状で局所的製剤として本化合物を塗布するのが好ましい。軟膏またはクリーム中の本化合物の濃度範囲は、通常１μＭから１ｍＭ、好ましくは１０μＭから１００μＭである。さらに、軟膏またはクリームは、例えば Dermatologie und Venerologie、ブラウン・ファルコ (Braun−Falco)他、スプリンガーフェアラーク(Springer Verlag) ベルリン（１９９６）、または Dermatopharmakologie und Dermatotherapie、Merk/Bickers（１９９２）に記載されている慣用の成分を含んでいてもよい。

本発明における好ましい実施形態として、ペプチドもまた炎症性腸疾患に対し使用することができる。炎症性疾患の例としては、比較的軽い食中毒によって生じる腸の短期間の炎症の他に、クローン病や潰瘍性大腸炎のような慢性腸疾患が挙げられる。

他の好ましい実施形態として、本発明によれば、本化合物は環境との接触により体の部位に発生する炎症等の炎症性疾患の治療に用いることができる。これらは特に、口腔、消化管粘膜および肺粘膜を含む。

また一方で、本発明で使用される化合物は、炎症の治療または予防のための全身性の活性をも有する。本化合物は、好ましくは腹腔内、静脈内、または経口的に投与される。投与量は、通常体重１ｋｇ当り２０μｇから１０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当り１００μｇから１ｍｇである。

また本化合物は、例えば気道の炎症治療のための吸入用スプレー類としても使用できる。

複数の異なる式（Ｉ）の化合物を治療に使用できる。この実施形態では、少なくとも２つの異なる式（Ｉ）の化合物が炎症の治療に使用される。

式（Ｉ）の化合物は、炎症の治療および／または予防のための医薬を製造するのに用いることができる。上記の全ての実施形態が同様にこの使用に包含される。本化合物は、通常薬理学的に許容しうる担体または希釈剤と混合される。医薬製造のための自体公知の方法は、Allegemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie、Forth/Henschler/ Rummel、アーバンアンドフィッシャー（Urban & Fisher）（１９９６）に示されている。

式（Ｉ）の化合物は、特定の食品成分のアレルギー潜在性を減少させるために食品に添加することもできる。従って、本発明は、食品添加物としての式（Ｉ）の化合物の使用にも関する。食品中の濃度は１μＭから１ｍＭであってよい。

本発明によれば、医薬外添加物として式（Ｉ）の化合物を化粧品に使用できる。例えば、式（Ｉ）の化合物を含有するクリームを、炎症を起こした皮膚や日焼け後に用いることができる。

本発明者らは、驚くべきことに、インビトロで樹状細胞をハプテンおよびαＭＳＨで処理し、次に実験動物へのその細胞を注入することにより、ハプテン特異耐性の産生やＣＨＳ反応（接触過敏性反応）の抑制がもたらされることを更に見出した。従って、さらに本発明は、抗原提示細胞を提供し、αＭＳＨまたはその生物学的に活性のある誘導体若しくはフラグメントを細胞に接触させ、かつ細胞を抗原と接触させることを含む、抗原に対する耐性を与えうる細胞のインビトロでの産生方法に関する。なお、最後の２つの工程は、どんな順序でも又同時にでも行うことができる。

抗原提示細胞には様々な型がある。本発明によれば、樹状細胞またはランゲルハンス細胞が好ましい。抗原提示細胞が存在するのが他の成分や細胞を含まない製剤中である必要はない。抗原提示細胞は、また他の細胞と混合して供給することもできる。好ましい例は、抗原提示細胞としてランゲルハンス細胞が存在する上皮細胞の供給である。骨髄から樹状細胞を単離するか、または例えば自体公知のインビトロ培養によりＰＢＭＣのような前駆細胞から樹状細胞を生成することも可能である。抗原提示細胞を供給する方法は、例えばジャーナルオブイムノロジー（J.of Immunol）、１６２巻、１号、１６８〜１７５頁、Ｌａｕｂｅｕｒ他（１９９９）に記載されている。

次に細胞を、αＭＳＨまたはその生物学的に活性のある誘導体若しくはフラグメントとインビトロで接触させる。αＭＳＨの生物学的に活性のある誘導体若しくはフラグメントとは、例えば、αＭＳＨの化学的修飾型、Ｌｓｙ、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、Ｌｙｓ−ｐｒｏ−ＶａｌまたはＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒを含むαＭＳＨのフラグメント、あるいは前記物質の１つを含有する化合物である。実質的にαＭＳＨの生物学的活性（耐性を産生する能力）が保たれてさえいれば、多種多様な修飾が考えられる。細胞と接触させる際のαＭＳＨまたは前記誘導体の通常の濃度は、１０^-6Ｍ〜１０^-16Ｍ、好ましくは１０^-8Ｍ〜１０^-12Ｍである。

細胞をαＭＳＨまたはその生物学的に活性な誘導体若しくはフラグメントに接触させた後、あるいはその前または同時に、細胞をインビトロで、耐性を誘発させたい抗原と接触させる。この場合抗原は、アレルギー反応の対象となる危険性があるタンパクであってもよい。例えば、もし免疫応答の対象となる抗原のハプテンが判明していれば、細胞をその特定のハプテンとのみ接触させることができる。この場合に可能な実施例として、長さ７〜２０のアミノ酸、好ましくは長さ７〜１５のアミノ酸を持つペプチドが挙げられる。

抗原提示細胞は前記処理後に洗浄し、薬理学的に許容しうる担体または希釈剤と混合することができる。次いでその細胞を患者や哺乳動物に導入することができ、それにより使用したハプテンや抗原に対して耐性が生じる。

本発明のさらなる特徴は、抗原に対する耐性を誘発させる医薬を製造するためのαＭＳＨまたはその生物学的に活性な誘導体若しくはフラグメントの使用である。製造される医薬は、耐性を与えることができる細胞のインビトロ産生のための上記方法によって得られる細胞を含有しているのが好ましい。

ペプチドであるＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒは、内皮細胞やケラチノサイトでのＴＮＦα、ＩＬ−１またはＬＰＳによる転写因子ＮＦ−κＢの活性化を抑制する。その結果、細胞接着分子（内皮細胞）やケモカイン（ケラチノサイト）の発現が減弱する。また発明者らは、例えばペプチドＫＰＴが接触アレルギー（接触過敏反応、ＣＨＳ反応）の発生を予防し、抗原特異的で長期間継続する耐性を誘発することを示すことが出来た。ＣＨＳ反応は２段階に分けられる。抗原との最初の接触（誘導期）で後のＣＨＳ反応の基盤を据え、抗原との更なる接触により、その反応（接触性皮膚炎、すなわち、腫れ、かゆみなど）を生じさせる。本発明で使用される化合物は両段階の前に用いることができ、最初の接触前に用いられる時（注射、局所適用）は、ＣＨＳの抑制と耐性の誘発があり、接触性皮膚炎の惹起時に用いられる時は、本化合物は皮膚炎の発生を予防する。これらすべての適用において、実質的に完全にアレルギー反応が抑制される。

また、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒは、樹状細胞の共刺激分子の発現を抑制することが分かった。これは、恐らく、ＣＨＳの抑制や耐性誘発と関連するメカニズムの一部であると考えられる。同時に本化合物は単核白血球による抗炎症性ＩＬ−１０の分泌を増加する。この効果は同様に、アレルギー性接触皮膚炎と関連するメカニズムの１部である。

一つの説に拘束されることは決して望まないが、本発明の化合物は、β−アドレナリンレセプターと結び付く可能性がある。そのうえ本発明で用いられるペプチドは、Ｉ型ＩＬ−１レセプターと結合可能であると想定できる。本発明のペプチドが、例えばκオピオイドレセプターのような他のレセプターとも結合するということを除外することも出来ない。この前提に基づくと、本発明のペプチドは、炎症事象において独自のリガンドにより活性化された後に炎症を促進するよう介在する複数のレセプターと結合できると推測される。これらレセプターに本発明のペプチドが結合することにより、これらレセプターと独自のリガンドとの結合が妨げられ、かくして炎症促進の誘発が抑制される。一方、本発明のペプチドがそれらの最初の基質（αＭＳＨ）のレセプターと結合すると、これらレセプターが活性され、その結果、全般的に抗炎症に働く作用機構の更なる構成要素を誘起する。

以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するものである。

マウス：
７〜１０週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスをチャールズリバー（Charles River； Sulzfeld, ドイツ）から入手し、政府規制に従って飼育した。

αＭＳＨまたはＫＰＶまたはＫＰＴまたはＫＰの投与：
αＭＳＨとペプチド類は、使用するまで分取して−２０℃で貯蔵した。注射前に、特定の化合物を０．１％マウス血清含有ＰＢＳに溶解し、マウスの尾静脈に静脈注射するまで氷中で保存した。マウス一匹当りαＭＳＨ５μｇまたはペプチド１．５μｇ（ＫＰ：５０μｇ）を、感作２時間前に静脈注射した。

ＣＨＳおよび耐性の決定：
実験未使用マウスの剃毛した腹に、０．５％ＤＮＦＢ含有アセトン／オリーブ油（４：１）７５μｌを塗布することによりマウスを感作した。マウスの一方の耳の両面に０．３％ＤＮＦＢを１０μｌ塗布してＣＨＳを誘起した。もう一方のコントロール処理耳と比較したハプテン曝露耳の耳の腫脹の度合いにより、ＣＨＳを測定した。ＣＨＳは、ハプテン曝露２４時間後にバネ付きコンパス（spring-loaded dividers）を用いて測定した。耳を事前感作無しにハプテン曝露させたマウスを、ネガティブコントロールとして用いた。ハプテン投与前のαＭＳＨまたはペプチド注射が耐性を誘導するか否か判定するため、感作２時間前に前述のようにマウスにαＭＳＨまたはペプチドを静脈注射（腹部）、または曝露（左耳）した。αＭＳＨに誘導されたＣＨＳ抑制を確認するため、感作７日後にマウスの一方の耳をハプテンで曝露し、その２４〜３６時間後に耳の腫脹反応を測定した。１４日後、同じマウスの剃毛した背中に再感作し（外因性αＭＳＨがなくなっている状態）、その１週間後、右耳に２度目のハプテン曝露を行いＣＨＳ反応誘導能力を調べた。
いくつかの実験ではαＭＳＨの局所製剤を使用した。これらの実験では、マウスへの塗布は、感作の直前、または３時間または２４時間前に感作部位（腹部）に施された。

結果：
αＭＳＨおよびＫＰＶまたはＫＰＴまたはＫＰの静脈注射により、７日後のＤＮＦＢ曝露に対するＣＨＳ反応を誘導するマウスの能力が抑制される。これらのマウスは、このようにＤＮＦＢ特異的感作を発現しなかった。ＫＰＴは、ＣＨＳ反応を最も効果的に抑制した（図１および１３ｂ参照）。
一時的な免疫抑制と特異な免疫学的耐性とを区別するため、マウスは２度目の感作を受け、ハプテン曝露された。最初の感作前にαＭＳＨまたはＫＰＶまたはＫＰＴを注射したマウスは、２度目の感作量のハプテン投与によっても感作不可能であった。このことは、これらマウスがＤＮＦＢに対する耐性を発現したことを示す。ＫＰＶは弱い効果を示し、一方αＭＳＨおよびＫＰＴおよびＫＰは耳腫脹反応を非常に大幅に抑制した（図２および１３ｂ参照）。

物質と方法：
単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ヒト軟膜からフィコール・ハイパック（Ficoll-Hypaque）密度勾配遠心分離法によって分離した。抗生物質および１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０中で培養した細胞（１×１０⁶／ｍｌ）は、処理されなかったか、またはＩＬ−１β（１０Ｕ／ｍｌ）の存在または非存在下でαＭＳＨまたはペプチドＫＰＶあるいはＫＰＴで刺激された。ＰＢＭＣ培養の上清を２４または４８時間培養後に集め、さらに使用するまで−２０℃で貯蔵した。ＩＬ−１０の検出は商業的に利用可能な酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって行った。

結果：
無処理またはさまざまな濃度のαＭＳＨまたはペプチド類で処理されたヒトＰＢＭＣは、２４時間培養後に低濃度のＩＬ−１０（５〜１０ｐｇ／ｍｌ）のみを産生した。αＭＳＨ（１０^-11Ｍ）、ＫＰＶ（１０^-8〜１０^-9Ｍ）およびＫＰＴ（１０^-8〜１０^-9Ｍ）は、ＩＬ−１０産生を明らかに誘導した（図３参照）。
ヒトＰＢＭＣは４８時間培養後、有意な量のＩＬ−１０を産生した。αＭＳＨ、ＫＰＶおよびＫＰＴはヒトＰＢＬＣによるＩＬ−１０の産生を有意に増加させた。αＭＳＨとペプチド類には実質的な相違はなかった（図４参照）。
これら結果は、ペプチドＫＰＴがαＭＳＨやＫＰＶと同様、静脈注射後にＣＨＳ感作を抑制できること、およびハプテン特異耐性を誘導できることを立証している。ＫＰＴはまた、インビボおよびインビトロにおいてＩＬ−１０を誘導できる。またデータよりインビボにおけるαＭＳＨの免疫抑制効果がＩＬ−１０誘導にのみ基づくものではないことが推定される。

物質および方法：
すべての工程は０〜４℃で行った。単球細胞株ＴＨＰ−１は、ＰＢＳで１回、酸性グリシン緩衝液（５０ｍＭグリシン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ３）で１回、およびＲＰＭＩで３回洗浄した。細胞（２．５×１０⁶／ｍｌ）を１００μｌのＲＰＭＩ／１％ＢＳＡに再分散し、９６穴マイクロタイタープレートに移した。ビオチン標識αＭＳＨ（１０⁻¹⁰Ｍ）の添加後、細胞を４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、１００μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡに再分散し、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（４０μｇ／ｍｌ）と共に４℃、３０分間暗所でインキュベートした。最後の洗浄処理後、細胞をＰＢＳで再分散した。結合したビオチン標識αＭＳＨ量をフローサイトメーターを用いて分析した。対照実験では、細胞はビオチン標識αＭＳＨを添加せずにＦＩＴＣ−スレプトアビジンの存在下でインキュベートした。死滅細胞はＦＡＣＳ分析直前にヨウ化プロピジウム（propidium iodide）を添加することにより排除した。ビオチン標識ＭＳＨの結合特異性を、非標識αＭＳＨ（１０^-6〜１０^-12Ｍ）またはＫＰＶあるいはＫＰＴ（１０^-6〜１０^-12Ｍ）を添加することにより判定した。

結果：
ビオチン標識αＭＳＨを用いたＦＡＣＳ分析によると、刺激されていないＴＨＰ−１細胞は、ＦＩＴＣ−ストレプトアビジンのみと共にインキュベートした対照混合物と比較して、有意な量のαＭＳＨに特異的な結合部位を発現した。この実験で用いられたαＭＳＨの濃度は、１０^-10Ｍであった（図５参照）。
ＴＨＦ−１細胞が公知のメラノコルチン（ＭＣ）受容体の一つを発現しているか否かを判定するために、ＭＣ−１、ＭＣ−２、ＭＣ−３およびＭＣ−４特異プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲが実施された。総ＲＮＡはＴＨＰ−１細胞から得た。予期された４１６ｂｐの長さを有するＭＣ−１特有のＰＣＲ産生物が検出された（ジャーナルオブルーコサイトバイオロジー(J. Leuk. Biol.)、５９巻、２４８頁、Ｒａｊｏｒａ他（１９９６））。ＭＣ−２、ＭＣ−３あるいはＭＣ−４特有のＰＣＲ産生物は検出されなかった。この結果は、ＴＨＰ−１細胞が他のメラノコルチン受容体とは異なり、αＭＳＨおよびＡＣＴＨに特異的であるＭＣ−１を発現することを示している。
ＴＨＰ−１上に発現した結合部位がαＭＳＨに特異的であるかどうかを調べるために、αＭＳＨ、ＫＰＶまたはＫＰＴを用いた競合実験（competition experiments）を実施した。ＴＨＰ−１細胞をビオチン標識αＭＳＨ（１０^-10Ｍ）およびさまざまな濃度の非標識αＭＳＨまたはペプチドと共にインキュベートし、その特異結合を測定した。濃度１０^-8Ｍの非標識αＭＳＨでは、αＭＳＨの結合が有意に抑制された。αＭＳＨが１０^-6Ｍ、１０^-10Ｍ、または１０^-12Ｍの濃度で用いられた時には、有意な抑制は認められなかった（図６ａ〜６ｄ）。
非標識ＫＰＶが用いられた時には、濃度が１０^-6Ｍの場合のみに有意な抑制が認められた（図７ａ〜７ｄ参照）。
ペプチドＫＰＴの場合には、テストした各濃度でαＭＳＨ結合の有意な抑制が認められた（１０^-6〜１０^-12Ｍ、図８ａ〜８ｄ参照）。
これらの結果は、ペプチドＫＰＴが、αＭＳＨに特異的であるＴＨＰ−１細胞上のメラノコルチン受容体と結合することを示している。そしてそのことは、αＭＳＨとＫＰＴが共通の結合部位を有することを示している。しかし、ＫＰＴが非常に低濃度でも受容体への競合を示すため、実際にはこのペプチドはＭＳＨよりも高いＭＣ−１受容体への親和性をもつと推定できる。

物質および方法：
ヒト皮膚微小血管細胞（ＨＤＭＥＣ）および細胞株ＨＭＥＣ−１（ヒト微小血管内皮細胞株１）を、ペプチドのうち一つの存在または非存在下、ＴＮＦαまたはＬＰＳのどちらかで処理した。細胞を、処理３時間後または６時間後にＲＮＡ単離のため、また処理３、６、１６または２４時間後に接着分子の酵素免疫測定（ＥＩＡ）またはＦＡＣＳ分析のために採取した。ＲＮＡは逆転写を受け、半定量的な測定を行うため、Ｅセレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭまたはハウスキーピング遺伝子としてのβ−アクチンを目的としてサンプルのＰＣＲを行った。リンパ球接着能アッセイ用に、内皮細胞を培養皿に播種し、⁵¹Ｃｒ−標識リンパ球と共にインキュベートした。洗浄処理後、ＥＣ層と結合した残存リンパ球量をサンプル中の放射能を測定することにより決定した。

結果：
αＭＳＨまたはＫＰＴで内皮細胞の処理を行うと、ＬＰＳまたはＴＮＦαに誘導された接着分子の発現が抑制された。この作用は、１０^-6〜１０^-12Ｍの濃度範囲のαＭＳＨまたはペプチドに認められた。ペプチドＫＰＴは接着分子ｍＲＮＡの発現について最も強い作用を示した。
ＬＰＳまたはＴＮＦαに誘導された接着分子の表面発現は、全てのアゴニストによってわずかに減少した。これらのデータは、全細胞を用いたＥＩＡより、また特異抗体を用いたＦＡＣＳより得られた（ＥＩＡデータを示す図９ａ参照）。
αＭＳＨは、ＬＰＳまたはＴＮＦ−αＭＳＨで処理されたＥＣ層とのＴおよびＢ細胞の結合を有意に抑制する（図９ｂ参照）。総合すれば、これらの結果は、αＭＳＨがリンパ球のＥＣへの接着に対し影響を及ぼすことを示し、従って組織炎症状態におけるリンパ球の溢出をも減少させることを示している。これは、局部脈管炎に関するインビボのデータでサポートされている。

物質および方法：
上皮細胞（ＥＣｓ）または正常ヒトケラチノサイト（ＨＮＫ）を、ペプチドの存在または不存在下で、ＩＬ−１、ＬＰＳまたはＴＮＦαで処理した。１５または３０分後、核タンパクを得、ＮＦ−κＢ特異結合シークエンスを有する放射性同位体でラベルしたオリゴヌクレオチドを用い、電気泳動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）に付した。非標識オリゴヌクレオチドを競合物質として用いた。一部の実験において、ＮＦ−κＢのｐ６５やｐ５０鎖に対する抗体を、検出されるバンドがｐ５０ホモダイマーかｐ５０／ｐ６５ヘテロダイマーのどちらであるかを確認するために使用した。

結果：
ＴＮＦα−またはＬＰＳ処理ＥＣｓ、およびＩＬ−１処理ＨＮＫｓにペプチドを添加すると、転写調節因子ＮＦ−κＢの活性が減少する（図１０、１３ａ参照）。これにより、数多くの炎症促進メディエーター（サイトカイン、ケモカイン、接着分子など）の遺伝子の転写が減少する。ＥＭＳＡで観察されたバンドがＮＦ−κＢヘテロダイマーであることを、抗ｐ６５抗体を使って確認した。

物質および方法：
マウスの一方の耳にＬＰＳの皮下注射処理を行った。この事前の注射は、ＬＰＳ注射部位での長持続的なＥセレクチン発現の発生を誘導する。２４時間後、第２回目のＬＰＳ投薬を腹腔内注射により行った（チャレンジ）。この２回目のＬＰＳの注射は、急激な血管壊死症と、その大きさと数により容易に測定できる点状出血性病変の形成をもたらす。αＭＳＨ（２５μｇ）は、ＬＰＳの事前注射時に投与した。

結果：
ＬＰＳの事前投与時にαＭＳＨを注射すると、耳での局所Ｅセレクチン発現の誘導が抑制され（図１１ａ参照）、ＬＰＳのチャレンジ注射後に形成された点状出血性病変の数と大きさが有意に減少する。

物質および方法：
骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）をマウスの大腿骨から単離し、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで、６日または９日間処理した。６日または９日目に、細胞を、同じ遺伝的バックグランドを持つ実験未使用マウスへ再注射する３時間および２．５時間前に、αＭＳＨ（２×１０^-11Ｍ）またはペプチドＫＰ（２×１０^-6Ｍ）で処理した。再注射２時間前に、細胞をハプテン（１ｍＭＤＮＢＳ、ＤＮＦＢの水溶形状）で処理した。再注射直前に、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。５×１０^-5の細胞を動物各個体に静脈内注射した。対照細胞は、ＤＮＢＳ単独かαＭＳＨ単独で処理されるか、または未処理で放置した。注射５日後、動物の耳にＤＮＦＢを接触させ、次の日に耳の厚さを測定した。２週間後、動物をＤＮＦＢで再感作し、再度５日後に耳に再接触させた。最後に耳の腫脹を測定した。

結果：
未処理細胞、またはαＭＳＨ処理細胞を注射されたレシピエント動物は、予想されたとおり最初のチャレンジ後に免疫応答を示さなかった。ＤＮＢＳ処理したＢＭＤＣを注射されたレシピエント動物は、最初のチャレンジ時に妥当なＣＨＳ反応を示した。この反応は、インビトロでＴＮＢＳとαＭＳＨ、あるいはＴＮＢＳとＫＰで前もって処理された細胞を注射された動物において抑制された。このようにＤＣｓをαＭＳＨまたはペプチドと接触させると、ＣＨＳの抑制が十分に誘発される（図１２参照）。
２回目のチャレンジ時、および対応する再感作時に、ＤＮＢＳ処理細胞を再び注射された動物は免疫反応を示さず、またＤＮＢＳ／αＭＳＨ処理細胞を注射された動物は免疫反応を示さなかった。このことは、αＭＳＨに誘導された耐性についてもＤＣが介在していることを示している（図１２参照）。

αＭＳＨまたはαＭＳＨ誘導体処理樹状細胞あるいはＴ細胞を用いた免疫療法
樹状細胞（ＤＣ）は血液、骨髄または組織から単離した。しかし、ＤＣを含む細胞混合物（例えば、上皮細胞の混合物）も使用できる。そしてＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−４（好ましくは、各物質あたり２５０〜１０００μ／ｍｌ）の存在下で培養した。
成熟期間（好ましくは、６〜９日）後、細胞は抗原（濃度は特定の抗原ごとに異なる。期間も同様）負荷し、αＭＳＨまたはその誘導体で処理した。誘導体は、少なくともαＭＳＨの１２および１３番目のアミノ酸（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）が一致し、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌを含有する誘導体が好ましい。アミノ酸のＤおよびＬの立体配置が可能であり、同様に保守的なアミノ酸置換も可能である。これは、なかんずく、ＩＬ−１β由来のＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、およびそのＮ末の伸展を有する誘導体を使う可能性を導く。Ｃ末伸展を有する誘導体もまた用いることができる。ペプチドの添加は、抗原の添加前、同時、添加後に、１回または１回以上（好ましい用量は特定のペプチドごとに異なり、例えばαＭＳＨでは１０^-8〜１０^-14Ｍである。）行うことができる。
このように処理された細胞を、次にレシピエントの生物に静脈注射する（腹腔内、または皮下も可能）；マウス：下限２×１０⁵細胞程度。抗原によって、１回の注射で十分であるか、または複数回注射を行うことが必要である。また、長期間の後に注射を繰り返す必要があることも可能である（これについてのデータはまだ得られていない）。
別の可能性としては、体外でＤＣをＴ細胞と接触させ、次にその混合物またはＴ細胞を注射する方法がある。この場合、ＤＣの抗原負荷は、Ｔ細胞との接触前またはその最中に行うことが出来る。Ｔ細胞はさらに特定の抗原で既に感作された個々のものに由来していてもよい。マウスにおける下限はＴ細胞約１００万であり、更に多くの細胞がより好ましい（図１４と１５参照）。

このような使用形態の利点は、抗原特異的であり抗原特異リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞）が病原となっているあらゆるタイプの好ましからざる免疫反応を防止することである。これらはとりわけ、アレルギー、自己免疫疾患、慢性炎症や移植を包含する。十分に多くの数の細胞が用いられるのであれば、先在する病気の治療も可能である。
一つの説に拘束されることは望まないが、前記の驚くべき結果は、αＭＳＨが効果の高い免疫調節剤で、多くの抗炎症的特性を有するという事実を示していると考えられる。これらは、なかんずく、ＤＣにおける共刺激分子の発現を減少させる特性を包含する。同様の特性が、Ｃ末端のトリペプチドおよびジペプチドであるＬｙｓ−Ｐｒｏを含む本発明のαＭＳＨ誘導体によっても示される。異なるアミノ酸組成（保守的アミノ酸置換）をもつ誘導体もまた類似の性質を持ち、これらは特にＩＬ−１βに由来するＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒを包含する（ゆえに、ＩＬ−１βと共直線性のシークエンスを持つ、Ｎ末端側（αＭＳＨと相似）に伸びたペプチドは同じ作用を有すると考えられる。）。
αＭＳＨおよびその誘導体もまた、インビボにおいてハプテン特異耐性を誘導できる。ＤＣは、専門的には多様なタイプの免疫反応を誘導でき、またそのような反応の方向を決定する抗原提示細胞である。これらの免疫反応は、特にＴ細胞介在免疫反応を包含する。
インビトロにてαＭＳＨまたは誘導体の存在下でＤＣまたはＤＣ／Ｔ細胞混合物を抗原で処理すると、生物体内に注射後、その細胞が同様にハプテン特異耐性を誘発するということを今では示すことができる。
この場合、αＭＳＨまたは誘導体によりサプレッサーＴ細胞が産生されることでＤＣによる抗原提示が調節されるというメカニズムであると思われる。このように、適切な混合物中のＴ細胞は高いＣＴＬＡ−４の発現を示すということを明らかにすることができた（図１６参照）。これはサプレッサーＴ細胞の特性を示す表面分子の一つである。
このようにして生成されたＤＣまたはＴ細胞が存在する時、自己免疫疾患、慢性炎症やアレルギーを予防的に妨ぐことが可能である。十分に多くの量の細胞を使用すれば、先在する病的な状態の治療もまた考えられる。
本発明の化合物は、樹状細胞を発生部位（in situ）で活性化することによって、腫瘍の治療に使用できる。この方法は本発明のペプチドの存在下で寛容化（tolerization）に使用することも可能である。

図１は、αＭＳＨ、ＫＰＶまたはＫＰＴの静脈内注射がＣＨＳ感作期を抑制することを示す。図２は、αＭＳＨ、ＫＰＶまたはＫＰＴの静脈内投与が耐性を誘発することを示す。図３は、αＭＳＨ、ＫＰＶまたはＫＰＴの処理２４時間後のヒトＰＢＬによるＩＬ−１０分泌を示す。図４は、αＭＳＨ、ＫＰＶまたはＫＰＴでの処理４８時間後のヒトＰＢＬによるＩＬ−１０分泌を説明する。図５は、ＴＨＰ−１細胞がαＭＳＨに対するレセプターを発現することを示す。図６ａ−ｄは、競合アッセイにおいて、非標識のαＭＳＨが、ビオチン標識αＭＳＨをＴＨＰ−１細胞の結合部位から置き換えることができることを示す。図７ａ−ｄは、競合アッセイにおいて、非標識のＫＰＶが、ビオチン標識αＭＳＨをＴＨＰ−１細胞の結合部位から置き換えることができることを示す。図８ａ−ｄは、競合アッセイにおいて、非標識のＫＰＴが、ビオチン標識αＭＳＨをＴＨＰ−１細胞の結合部位から置き換えることができることを示す。図９ａは、ＴＮＦα＋αＭＳＨまたはＴＮＦα＋ＫＰＴでの処理２４時間後における、ＨＭＥＣ−１細胞表面での細胞接着分子（ＣＡＭＳ）の発現を示す。図９ｂは、ＨＤＭＥＣへのリンパ球の接着を示す（クロミウム放出アッセイ）。Ａ：モルト４Ｔリンパ球；Ｂ：ＪＹＢリンパ球図１０は、ＬＰＳ処理ＨＭＥＣ−１細胞におけるＮＦ−κＢ活性化に対するαＭＳＨ、ＫＰ、ＫＰＶまたはＫＰＴの効果を示す。図１１ａは、組織部のＥセレクチン発現血管の数がαＭＳＨ処理により減少することを示す。図１１ｂは、ＬＰＳ処理されたマウスの耳における点状出血性病変数がαＭＳＨ処理により減少することを示す。図１２は、インビトロでαＭＳＨまたはＫＰでＢＭＤＣを処理することによりＣＨＳが抑制され、また耐性が生じることを示す。図１３ａは、ＮＦ−κＢのバンドシフトアッセイにおいて、ＮＦ−κＢｐ６５／ｐ５０のヘテロダイマーのバンドが種々のαＭＳＨ由来ペプチドにより減少することを示す。図１３ｂは、ＢａｌｂＣマウスにおいて、ＣＨＳ反応に対するαＭＳＨ、ＫＰまたはＫの効果、および耐性誘導におけるαＭＳＨまたはＫＰの効果を示す。図１４は、抗原負荷されかつαＭＳＨまたは誘導体で処理したＤＣとインビトロで接触させたＴ細胞によるＣＨＳの抑制を示す。図１５は、抗原負荷されかつαＭＳＨで処理したＤＣとインビトロで接触させたＴ細胞による耐性誘導を示す。図１６は、抗原負荷されかつαＭＳＨまたは誘導体で処理したＤＣと接触後の、Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４の増加調節（up-regulation）を示す。Ａ：ＣＤ４ポジティブＴ細胞；Ｂ：ＣＤ８ポジティブＴ細胞

Claims

化合物Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（ＫＰＴ）またはその薬理学的に許容しうる塩を含有することを特徴とする、炎症性疾患の治療および／または予防剤。
化合物のＮ末端がアシル化、および／またはＣ末端がアミド化またはエステル化されていることを特徴とする請求項１記載の治療および／または予防剤。
炎症が、皮膚または血管の炎症、アレルギー反応、自己免疫疾患、線繊症、強皮症および移植拒絶からなる群より選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の治療および／または予防剤。
炎症が乾癬、アトピー性皮膚炎、鼻炎、接触アレルギー、喘息、食物アレルギーからなる群より選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の治療および／または予防剤。
炎症が皮膚炎症であることを特徴とする請求項１又は２に記載の治療および／または予防剤。
化合物が軟膏またはクリームの形態で投与されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の治療および／または予防剤。
化合物が１μＭ〜１ｍＭの濃度範囲で軟膏またはクリーム中に存在することを特徴とする請求項６に記載の治療および／または予防剤。
化合物が腹腔内、静脈内または経口的に投与されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の治療および／または予防剤。
化合物の投与量が体重１ｋｇ当り２０μｇ〜１０ｍｇであることを特徴とする請求項８に記載の治療および／または予防剤。