MXPA03007255A - Compuestos que inhiben la inflamacion. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere al uso de un compuesto de la formula Lys-X, en donde X representa un grupo hidroxilo, un grupo amino, alcoxi, pro o pro-thr, o bien al uso de una sal farmaceuticamente aceptable de dicho compuesto, para tratar una inflamacion. La invencion se refiere tambien al uso de aMSH para inducir la tolerancia.

Description

COMPUESTOS QUE INHIBEN LA INFIRMACIÓN La hormona de estimulación de a-melanocitos de tridecapépt do (aMSH) es producida a partir de la hormona precursora pro-opiomelanocortina (POMC) . Varias hormonas de péptidos biológicamente activas como por ejemplo beta-lipotropina, adrenocorticotropina (ACTH) , ß-endorfina y las melanotropinas (a-, ß- y yMSH) se derivan del producto de gen de POMC. Enzimas proteoliticas con varias especificidades son necesarias para procesar estos péptidos. Además, modificaciones post-traducción tales como acetilaciones pueden efectuarse. Los efectos de alfaMSH y otros péptidos de POMC sobre varios tejidos son mediados por una familia de receptores específicos. Estos receptores de melanocortina (MC) pertenecen al grupo de receptores acoplados a proteína G. Cinco receptores de melanocortina diferentes (MC-1 a MC-5) han sido clonados. Se considera que a-MSH es una señal importante para regular varias funciones de melanocitos. Se cree, por ejemplo, que la proliferación, diferenciación y producción de citocinas por melanocitos están influenciadas por aMSH. Se ha mostrado también que productos génicos de POMC pueden influenciar respuestas inmunes y reacciones inflamatorias . Por ejemplo, se considera que oMSH regula de manera descendente varias citocinas pro-inflamatorias, mientras que la producción de la citocina anti-inflamatoria IL-10 es estimulada por cMSH. Esto significa que o¿MSH tiene una función importante en la supresión de respuestas inmunes y reacciones inflamatorias. Varios estudios indican que los efectos inmunomoduladores y anti-inflamatorios de o SH son mediados por la región C-terminal de cxMSH (aminoácidos 11-13: Lys-Pro-Val) puesto que la administración del tripéptido C-terminal es suficiente para inducir estos efectos (Catania y Lipton, 1993, Endocr. Rev. 14, 564-576: Bhardvaj y colaboradores, 1996, J. Immunol . 156, 2517-2521) . El documento WO, 88/-00833 divulga .el uso del. _tripéptido... Lys-Pro-Val para producir un fármaco para el tratamiento de inflamaciones . El tripéptido C-terminal de oMSH ha sido también propuesto como agente para evitar la pérdida del cabello .(FE. 2 733 421) . Un objeto 'de la presente invención es ofrecer compuestos adicionales que inhiben la inflamació . Se ha encontrado de manera sorprendente que el tripéptido Lys-Pro-Thr, tiene propiedades anti-inflamatorias . Inesperadamente, compuestos aún más pequeños como Lys-Pro y Lys tienen también propiedades provechosas. La presente invención se refiere por consiguiente al uso de un compuesto de la fórmula (I) I en donde X es un grupo hidroxilo, un grupo amino, alcoxi, Pro o bien Pro-Thr, o bien de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para el tratamiento y/o prevención de enfermedades inflamatorias. El término "enfermedades inflamatorias" abarca no solamente inflamaciones sino también trastornos en los cuales participa una inflamación, como por ejemplo, enfermedades auto-inmunes o rechazos de trasplante. El compuesto utilizado de conformidad con la presente invención puede ser lisina o dipéptido lisina-prolina, pero se utiliza de preferencia el tripéptido lisina-prolina-treonina (=KPT) . Aminoácidos que ocurren naturalmente tienen habitualmente la configuración (L) . Los aminoácidos de los compuestos utilizados de conformidad con la presente invención pueden tener ya sea la configuración (L) o bien la configuración (D) . Compuestos posibles de la estructura KPT son por consiguiente (L)Lys- (D) ro- (L) Thr, (L)Lys- (L)Pro- (D) Thr, (L)Lys- (D)Pro- (D) Thr, (L)Lys- (L) Pro- (L) Thr, (D)Lys- (D) Pro- (L) Thr, CD.Lys- CD). Pro- (D).Thr, (D) Lys- (L) Pro- (L)Thr, (D)Lys- ÍL) Pro- (D) Thr, prefiriéndose especialmente el compuesto (L) Lys- (D) Pro- (L)Thr. Los compuestos utilizados de conformidad con la invención pueden también mostrar intercambios de aminoácidos, uno de los aminoácidos presentando un cambio conservador. El compuesto de la fórmula (I) utilizado de conformidad con la presente invención puede ser modificado químicamente en el extremo N y/o en el extremo C, por ejemplo, por un grupo acilo, de preferencia un grupo acetilo en el extremo N y/o una amidación o esterificación del extremo C. Grupos protectores adicionales conocidos per se son también posibles. Las modificaciones pueden también afectar el grupo amino en la cadena lateral de lisina o el grupo hidroxilo de treonina. Otras modificaciones son también concebibles en el lado del grupo H2í por ejemplo, extensión por una glicina, y residuos adicionales de aminoácidos hasta la longitud de o¿MSH. Para los propósitos de la presente solicitud, el término "compuesto de la fórmula (I)" incluye también las sales farmacéuticamente aceptables del compuesto. Tales compuestos pueden emplearse para el tratamiento de la totalidad de los tipos de inflamaciones agudas o crónicas. Estas incluyen, entre otras, inflamaciones agudas y crónicas por ejemplo de la piel, psoriasis, dermatitis atópica, reacciones alérgicas de todos tipos, desde rinitis por alergias de contacto hasta asma y alergias a los alimentos, enfermedades auto-inmunes, fibrosis y esclerodermas así como rechazo de trasplantes pero también enfermedades vasculares. Los compuestos se utilizan de preferencia para el tratamiento de condiciones inflamatorias de la piel. Es provechoso en este caso administrar el compuesto como formulación tópica en formad e un ungüento o crema. El compuesto está presente normalmente en un ungüento o en una crema en una concentración de 1 uM a 1 mM, de preferencia de 10 uM a 100 uM. Dicho ungüento o crema puede comprender además ingredientes convencionales tales como los descritos, por ejemplo, en Braun- alco y colaboradores (1996) Dermatologie und Venerologie [Dermatología y Venerología] , Springer Verlag, Berlín o Merk, Bickers (1992) Dermatolpharmakologie und Dermatotherapie [Dermatofarmacología y Dermatoterapia] . Es posible en una modalidad preferida que los péptidos sean también utilizados de conformidad con la invención para trastornos intestinales inflamatorios. Ejemplos de trastornos inflamatorios son, además de irritaciones de corto plazo de los intestinos causadas por envenenamientos por alimentos relativamente leves, trastornos intestinales crónicos como por ejemplo una enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa. En otra modalidad preferida, los compuestos pueden ser utilizados de conformidad con la invención para el tratamiento de trastornos inflamatorios o inflamaciones que ocurren en los sitios del cuerpo que están en contacto con el medio ambiente. Incluye, en particular, la membrana mucosa de la boca y del tracto gastrointestinal, y de los pulmones . Los compuestos utilizados de conformidad con la presente invención tienen también, sin embargo, una actividad sistémica para el tratamiento o prevención de inflamaciones . El compuesto es entonces administrado preferentemente de manera intraperitoneal, intravenosa u oral. La dosis de una administración es habitualmente de 20 g a 10 mg/kg de peso corporal, de preferencia de 100 g a 1 mg/kg de peso corporal. Finalmente, dichos compuestos pueden también ser utilizados en rocíos, por ejemplo, para la inhalación para el tratamiento de inflamaciones de las vías respiratorias. Es posible emplear varios compuestos diferentes de la fórmula (I) para el tratamiento. En esta modalidad, por lo menos dos compuestos diferentes de la fórmula (I) son utilizados para el tratamiento de inflamaciones . Los compuestos de la fórmula (I) pueden también utilizarse para producir un fármaco para el tratamiento y/o la prevención de inflamaciones. Todas las modalidades indicadas arriba están abarcadas de manera análoga por este uso. El compuesto es normalmente mezclado con un vehículo diluyenfe farmacéuticamente aceptable. Procesos conocidos per se para la producción de fármacos son indicados en Forth, Henschler, Rummel (1996) Allgemeine und Spezielle Pharmakologie und Toxikologie [Farmacología y Toxicologia Generales y Especiales] Urgan & Fischer. Los compuestos de la fórmula (I) pueden también ser agregados a alimentos con el objeto de reducir el potencial alérgico de ciertos constituyentes de los alimentos. La invención se refiere también por consiguiente al uso de un compuesto de la fórmula (I) como adición a alimentos. La concentración en alimentos puede ser entonces de 1 uM a 1 mM. Es también posible de conformidad con la presente invención utilizar un compuesto de la fórmula (I) como adición no farmacéutica en cosméticos. Por ejemplo, cremas que comprenden un compuesto de la fórmula (I) pueden emplearse para una piel irritada o bien después de un baño de sol. De manera sorprendente, los inventores han encontrado también que el tratamiento de células dendríticas in vitro con un hapteno y alfaMSH y la inyección subsecuente de las células en animales de experimento provoca la producción de tolerancia especifica a los haptenos y a la supresión de la reacción de CHS ("reacción de hipersensibilidad de contactos") . La presente invención se refiere también por consiguiente a un método para la producción in vitro de células que pueden proporcionar tolerancia a un antigeno, que comprenden el suministro de células de presentación de antigeno, poner las células en contacto con alfaMSH o un derivado biológicamente activo o fragmento del mismo, y poner las células en contacto con el antígenor en donde los dos últimos pasos pueden ser efectuados en cualquier frecuencia o bien simultáneamente. Existen varios tipos de células de presentación de antigenos . Las células dendriticas o células de Langerhans son preferidas de conformidad con la presente invención. Es innecesario que las células de presentación de antigeno estén presentes en una preparación libre de otros constituyentes o células . Las células de presentación de antigeno pueden proporcionarse también mezcladas con otras células. Un ejemplo preferido es el suministro de células epidérmicas en las cuales células de Langerhans están presentes como células de presentación de antigeno. Es también posible aislar células dendriticas de médula ósea o producir células dendriticas a partir de células precursoras, como por ejemplo, PBMC mediante cultivo in vitro conocido per se. Métodos para proporcionar células de presentación de antigeno se describen por ejemplo en Labeur y colaboradores J. of Immunol. 162 (1):168-175 (1999). Después se ponen las células en contacto in vitro con aMSH o un derivado biológicamente activo o fragmento de la misma. Derivados biológicamente activos o fragmentos de alfaMSH son, por ejemplo, modificaciones químicas o fragmentos de aMSH, incluyendo Lys, Lys-Pro, Lys-Pro-Val o Lys-Pro-T r, o compuestos que comprenden una de dichas sustancias . Una amplia gama de modificaciones es concebible en la medida en que la actividad biológica de oMSH - la capacidad de inducir la tolerancia - se conserva de manera sustancial . Concentraciones normales de oMSH o dichos derivados al entrar en contacto con las células son 10_ M hasta 10"16 M, de preferencia 10"8 M hasta 10-12 M. Después de la puesta en contacto de las células con oMSH o un derivado biológicamente activo o fragmento del mismo, o bien previa o simultáneamente, se ponen las células en contacto In vitro con el antigeno contra el cual se debe de inducir la tolerancia. El antigeno puede en este caso ser una proteina contra la cual existe un riesgo de reacción alérgica. Por ejemplo, si se sabe contra qué hapteno del antigeno se enfoca la respuesta inmune, las células pueden también ponerse en contacto solamente con el hapteno especifico. Ejemplos posibles con relación a este punto son péptidos con una longitud de 7 a 20 aminoácidos, de preferencia de 7 a 15 aminoácidos . Las cél las de presentación de antigeno pueden ser lavadas después de dicho paso y mezclarse con un vehículo diluyente farmacéuticamente aceptable. Las células pueden ser después introducidas en un paciente o en un mamífero, por lo que se produce tolerancia contra el hapteno o antígeno utilizado. Un aspecto adicional de la presente invención es el uso de alfaMSH o un derivado biológicamente activo o fragmento de la misma para la producción de un fármaco para inducir la tolerancia a un antigeno. El fármaco producido comprende de preferencia células que pueden obtenerse por el método descrito arriba para la producción in vitro de células capaces de proporcionar tolerancia. El péptido Lys-Pro-Thr previene la activación del factor de transcripción NF-?? por TNFalfa/ IL-1 o LPS en células endoteliales y en gueratinocitos . La consecuencia es una expresión reducida de moléculas de adhesión celular (células endoteliales) y guimiocinas (gueratinocitos) . Los inventores han podido también mostrar que, por ejemplo, el péptido KPT impide la ocurrencia de alergias por contacto (reacciones de hipersensibilidad al contacto, reacciones de CHS) e induce una tolerancia de larga duración especifica para un alérgeno. Dos secciones deben distinguirse en reacciones de CHS: un contacto inicial (fase de inducción) con un antigeno que establece la base para la reacción de CHS posterior, y un contacto adicional con el antigeno que lleva a la ocurrencia de la reacción (dermatitis de contacto, es decir, hinchazón, comezón, etc.). Los compuestos utilizados de conformidad con la presente invención pueden ser empleados antes de ambas secciones, y cuando se emplean (inyección o aplicación tópica) antes del contacto inicial existe una supresión del CHS y una inducción de la tolerancia, y cuando se emplean al momento de inducción de la dermatitis de contacto los compuestos impiden la ocurrencia de la dermatitis. En todas estas aplicaciones existe una inhibición sustancialmente completa de la reacción alérgica. Se ha encontrado también que Lys-Pro-Thr reduce la expresión de moléculas co-estimuladoras en células dendriticas. Es probablemente parte del mecanismo asociado con la supresión de CHS y la inducción de la tolerancia. Al mismo tiempo, los compuestos incrementan la secreción de la IL-10 antiinflamatoria por monocitos. Este efecto es probablemente parte del mecanismo asociado con la dermatitis alérgica por contacto . Sin desear ser limitado a alguna teoría, los compuestos de la presente invención pueden unirse a receptores -adrenérgicos . Se puede considerar además que los péptidos empleados de conformidad con la presente invención pueden unirse al receptor de IL-1 de tipo I. Tampoco se puede excluir que los péptidos de la invención se unan también a otros receptores como por ejemplo, el receptor de opioide ?. Con base en esta consideración, se estima que los péptidos de la invención pueden unirse a varios receptores los cuales, después de activación por sus ligandos originales, podrían intervenir en una forma pro-inflamatoria en el evento inflamatorio. La unión del péptido de la presente invención sobre estos receptores impide la unión de los ligandos originales sobre estos receptores, y por consiguiente se impide la inducción de los efectores pro-inflamatorios. Por otra parte, la unión de los péptidos de la presente invención con los receptores de sus sustancias iniciales (OÍMSH) activa estos receptores y por consiguiente induce un componente adicional o mecanismo de acción que es globalmente anti-inflamatorio . La Figura 1 muestra que la inyección intravenosa de oMSH, KPV o PT suprime la fase de sensibilización de CHS . La Figura 2 muestra que la administración intravenosa de cx SH, KPV o KPT puede inducir la tolerancia. La Figura 3 ilustra la secreción de IL-10 por PBL de ser humano 24 horas después del tratamiento con OÍMSH, KPV o KPT. La Figura 4 ilustra la secreción de IL-10 por PBL de ser humano 48 horas después del tratamiento con cxMSH, KPV o KPT. La Figura 5 muestra que las células de THP-1 expresan receptores para cxMSH. Las Figuras 6a a d, 7a a d y 8a a d muestran que oMSH, KPV o KPT no marcados pueden desplazar cxMSH marcada con biotina de sitios de enlace en células THP-1 en un ensayo competitivo. La Figura 9a muestra la expresión de moléculas de adhesión de células (C¾MS ) en la superficie de HMEC-1 24 horas después del tratamiento por TNFot + cxMSH o TNFOÍ + KPT. La figura 9b muestra la adhesión de linfocitos sobre HDMEC (ensayo de liberación de cromo) . A: linfocitos T molt4; B: linfocitos B JY. La Figura 10 muestra el efecto de OÍMSH, KP, KPV o KPT sobre la activación de NF- ? en células HMEC-1 tratadas con LPS. La Figura lia muestra que el número de vasos que expresan la selectina E en secciones de tejido es reducida por tratamiento con aMSH. La Figura 11b muestra que el número de lesiones petequiales en las orejas de ratones tratados con LPS es reducido por el tratamiento con aMSH. La Figura 12 muestra que el tratamiento in vitro de BMDC con aMSH o KP suprime CHS y puede inducir la tolerancia. La Figura 13a muestra que en un ensayo de desplazamiento de banda de NF-kappaB, la intensidad de heterodimeros de NF-kappaB p65/p50 es reducida por péptidos derivados de alfaMSH. La Figura 13b muestra el efecto de aMSH, KP o K sobre la reacción de CHS y el efecto de alfaMSH o KP sobre la inducción de tolerancia en ratones BalbC. La Figura 14 muestra la supresión de CHS por células T que han estado en contacto in vitro con DC cargadas con antigeno y tratadas con aMSH o derivados. La Figura 15 muestra la inducción de tolerancia por células T que han tenido contacto in vitro con DC cargadas antigeno y tratadas con aMSH. La Figura 16 muestra la regulación ascendente de CTLA-4 en células T después de contacto con DC cargadas de antigeno y tratadas con alfaMSH o derivados. ?: células T positivas para CD4; B: células T positivas para CD8.

Los ejemplos siguientes tienen el propósito de explicar la invención con mayores detalles . EJEMPLO 1 Ratones : Ratones Balb/C hembras de 7 a 10 semanas de edad fueron obtenidos en Charles River (Sulzfeld, Alemania) y mantenidos de conformidad con los reglamentos gubernamentales. Administración de oMSH o KPV o KPT o KP: Y los péptidos fueron almacenados como alícuotas a una temperatura de -20°C hasta su uso. Antes de la inyección, el compuesto particular fue disuelto en PBS, suero de ratón al 0.1%, y almacenado en hielo hasta su inyección i.v. en la vena de la cola de los ratones. Se inyectaron 5 ]ig de aMSH o 1.5 pg de péptido (KP: 50 pg) por ratón 2 horas antes de la sensibilización. Determinación de CHS y tolerancia: Los ratones fueron sensibilizados por la aplicación de 75 µ? de DNFB al 0.5% en acetona/aceite de oliva (4:1) sobre al abdomen afeitado de ratones naives . Se indujo CHS por aplicación de 10 µ? de DNFB al 0.3% en las orejas de los ratones en ambos lados de una oreja. Se determinó CHS por el grado de hinchazón auricular de la oreja expuesta al hapteno en comparación con la otra oreja, que es una oreja tratada con control y se midió utilizando divisores cargados con resortes 24 horas después la exposición a hapteno. Ratones cuyas orejas fueron expuestas a hapteno sin sensibilización previa sirvieron como controles negativos. Con objeto de determinar si la inyección de alfaMSH o péptidos antes de la administración de hapteno provoca la inducción de la tolerancia, los ratones fueron sometidos a inyección i.v. (abdomen) o exposición (oreja izquierda) de conformidad con lo descrito con alfaMSH o péptido 2 horas antes de la sensibilización. Para confirmar la supresión inducida por oMSH de CHS, ratones fueron expuestos a hapteno en una oreja 7 días después de la sensibilización, y la respuesta de hinchazón auricular fue determinada de 24 a 36 horas después. 14 días después, los mismos ratones fueron sensibilizados otra vez en la espalda afeitada (ahora en ausencia de otMSH exógena) y se investigó para determinar su capacidad para inducir una respuesta CHS a través de una segunda exposición a hapteno en la orej a derecha una semana después . Preparaciones tópicas de aMSH fueron utilizadas en algunos experimentos. En estos experimentos, la aplicación a los ratones se llevó a cabo en el sitio de sensibilización (abdomen) inmediatamente antes de 3 horas o 24 horas antes de la sensibilización. Resultados : Una inyección i.v. de ocMSH y de KPV o KPT o KP inhibe la capacidad de los ratones para inducir una respuesta CHS a una exposición a DNFB llevándose a cabo 7 días después. Por consiguiente, estos ratones no desarrollaron ninguna sensibilización especifica a DNFB. PT suprimió la respuesta CHS de manera más efectiva (véase figura 1 y 13b) . Con el objeto de distinguirse entre la inmunosupresión temporal y la tolerancia inmunológica especifica, ratones fueron sensibilizados por segunda vez y expuestos a hapteno. Ratones inyectados con aMSH o KPV o KPT antes de la primera sensibilización no pudieron ser sensibilizados aún por la administración de una segunda dosis sensibilizadora de hepteno, lo que indica que estos ratones han desarrollado una tolerancia a DNFB. KPV mostró un efecto débil, mientras que OíMSH y KPT y KP inhibieron la respuesta de hinchazón auricular en forma mayor (véase Figura 2 y 13b) . Ejemplo 2 Material y métodos: Células mononucleares (PBMC) fueron separadas de revestimientos humanos por reticulación con un gradiente de densidad Ficoll Hypaque. Células (1 x 10 por mi), cultivadas en RPMI 1640 con antibióticos y 10% de FCS, o bien no fueron tratadas o bien fueron estimuladas con MSH o bien los péptidos KPV o KPT con o sin IL-?ß (10 U/ml) . Los sobrenadantes de los cultivos de PBMC fueron recogidos después de incubación durante 24 o 48 horas y almacenados a una temperatura de -20° C hasta su utilización posterior. Se empleó un análisis ELISA comercialmente disponible para detectar IL-10. Resultados : PBMC humano no tratados o que hayan sido tratados con varias concentraciones de ccMSH o péptidos produjeron solamente bajas concentraciones de IL-10 (5-10 pg/ml) después de incubación durante 24 horas. aMSH (10-11 M) , KPV (10~8 a 10"9 M) y KPT (10~8 a 10~9 M) indujeron evidentemente la producción de IL-10 (Véase figura 3) . PBMC de ser humano produjo cantidades significativas de IL-10 después de incubación durante 48 horas. aMSH, KPV y KPT incrementaron significativamente la producción del IL-10 por PBLC de ser humano. No se observaron diferencias importantes entre aMSH y los péptidos (véase figura 4) . Los resultados que se muestran comprueban que el péptido KPT puede, como aMSH y KPV, inhibir la sensibilización de CHS después de administración intravenosa e inducir la tolerancia especifica a los haptenos. KPT puede también inducir IL-10 in vivo e in vitro. Los datos hacen también probable que el efecto inmunosupresor de aMSH in vivo dependa no solamente de la inducción de IL-10. Ejemplo 3 Materiales y métodos: Todos los pasos fueron efectuados a una temperatura de 0 a 4o C. La linea de células monociticas THP-1 fue lavada una vez en PBS, una vez con amortiguador de glicina ácida (50 mM de glicina, 100 mM cloruro de sodio, pH 3) y tres veces con RPMI. Las células: (2.5 x 10° por mi) fueron después resuspendidos en 100 µ? de RPMI/1% BSA y transferidos en placas de microtitulación de 96 pozos. Después de adición de ocMSH marcada con biotina (10-10 M) , las células fueron incubadas a una temperatura de 4o C durante 1 hora, lavadas una vez con PBS, resuspendidas en 100 µ? de PBS/1% de BSA e incubadas con estreptavidina marcadas con FITC (40 g/ml) en la oscuridad durante 30 minutos a una temperatura de 4o C. Después de un último paso de lavado, las células fueron resuspendidas en PBS. La cantidad de ocMSH marcada con biotina fue analizada utilizando un citómetro de flujo. En experimentos de control, las células fueron incubadas sin ocMSH marcada con biotina pero en presencia de estreptavidina marcada con FITC. Células muertas fueron excluidas por adición de yoduro de propidio poco antes del análisis de FACS.. La especificidad de la unión de MSH marcada con biotina fue determinada por adición de otMSH no marcada (10~6 a 10~12 M), o PV o PT (10~6 a 10"12 M) . Resultados : De conformidad con el análisis de FACS con ocMSH marcada con biotina, células THP-1 no estimuladas expresan cantidades significativas de sitios de unión que son específicos para ocMSH en comparación con unas mezclas de control incubadas solamente con FITC-estreptavidina. La concentración de ctMSH que se empleó en este experimento fue de 1CT10 M (véase figura 5) . Con el objeto de determinar si células THF-1 expresan uno de los receptores de melanocortina conocidos (MC) , se efectúo RT-PCR con cebadores específicos para MC-1-, MC-2-, MC-3- y MC-4. El ARN total fue obtenido a partir de células THP-1. Un producto de la reacción en cadena de polimerasa especifico para MC-1 con una longitud esperada de 416 pares de bases fue detectada (Rajora y colaboradores, 1996, J. Leuk. Biol. 59, 248) . Productos de reacción en cadena de polimerasa específicos para MC-2, MC-3 o MC-4 no fueron detectados, los resultados muestran que células THP-1 expresan MC-1 que, en contraste con otros receptores de melanocortina, es especifico para oeMSH y ACTH. Con el objeto de investigar si los sitios de unión expresados en THP-1 son específicos para aMSH, experimentos de competición fueron efectuados con aMSH o PV o KPT. La unión específica fue medida por incubación de células THP-1 con aMSH marcada con biotina (10_1° M) y varias concentraciones de aMSH no marcada o péptido- aMSH no marcada en una concentración de 10-8 suprimió significativamente la unión con aMSH. No se observó ninguna supresión significativa cuando aMSH fue empleada en concentraciones de 10-6 M, 10~10 M o 10"12 M (véase figuras 6a a 6d) . Cuando se empleo KPV no marcado, se pudo observar una inhibición significativa solamente en una concentración de 1CT6 M (véase figuras 7a a 7d) . En el caso del péptido KPT, se pudo observar una inhibición significativa de unión de oeMSH en cada una de las concentraciones probadas (10~6 a 10~12 M) , véase figuras 8a a 8d) . Estos resultados muestran que el péptido de KPT se une al receptor de melanocortina en células THP-1 lo que es especifico para ctMSH, lo que indica que aMSH y KPT tienen un sitio de unión común. Sin embargo, puesto que KPT muestra competencia para el receptor aún en concentraciones muy bajas, es probable que este péptido de hecho tenga una afinidad mayor para el receptor de MC-1 que MSH. E emplo 4 Materiales y métodos: Células endoteliales miero asculares dérmicas humanas (HDMEC) de la linea de células HMEC-1 (linea de células endoteliales microvasculares humanas 1) fueron tratadas ya sea con TNFa o LPS en presencia o ausencia de uno de los péptidos. Las células fueron cosechadas para aislamiento de ARN después de 3 horas y después de 6 horas después de tratamiento o bien cosechadas ya sea para análisis EIA o FACS de molécula de adhesión 3, 6, 16 o 24 horas después del tratamiento. El AR fue sometido a transcripción reversa y muestras fueron sometidas a una reacción en cadena de polimerasa para E selectina, ICAM-1, VCAM o bien para ß-actina como gen de control con el objeto de llevar a cabo una determinación semi-cuantitativa. Para el ensayo de adhesión de linfocitos, las células endoteliales fueron sembradas en platos e incubadas con linfocitos marcados con ülCr. Después de un paso de lavado, la cantidad de linfocitos restantes unidos a la capa de EC fue determinada mediante la medición de la radioactividad en las muestras. Resultados : El tratamiento de las células endoteliales con aMSH o KPT inhibió la expresión inducida por LPS o TNFa de moléculas de adhesión. Este efecto fue observado en un rango de concentración de 1CT6 a 10~12 M de OÍMSH o péptido. El péptido KPT presentó el efecto más fuerte sobre la expresión del ARNm de moléculas de adhesión. La expresión superficial inducida por LPS- o TNFa de moléculas de adhesión fue reducida en una magnitud pequeña por todos los agonistas. Estos datos fueron observados tanto por ???, en cuyo caso células enteras fueron empleadas, como por FACS con anticuerpos específicos (véase figura 9a, que muestra datos de EIA) . aMSH reduce significativamente la unión de células T y células B sobre capas de LPS- o tratadas con EC o TNFa- SH (Véase figura 9b) . Conjuntamente, estos resultados muestran que aMSH tiene un efecto sobre la adhesión de linfocitos sobre EC y por consiguiente reduce también la extravasación de linfocitos en condiciones de inflamación tisular. Esto es apoyado por losa datos in vivo en vasculitis localizada. Ej emplo 5 Materiales y métodos : Células epidérmicas (Ees) o bien queratinocitos humanos normales (HNK) fueron tratados con IL-1, LPS o TNFcc en presencia o ausencia de péptidos. Después de 15 o 30 minutos, las proteínas nucleares fueron obtenidas y sometidas a un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) con oligonucleótidos radiomarcados con secuencia de unión específica para NF-kB. ün oligonucleótido no marcado fue utilizado como un competidor. En algunos experimentos, anticuerpos contra la cadena p65 o p50 de NF-DB fueron utilizados con el objeto de confirmar la identidad de las plantas detectadas como homodímero p50 o heterodímero p50/p65. Resultados : La adición de los péptidos en ECs tratadas con TNFoc o bien LPS y en HNKs tratadas con IL-1 lleva a una activación reducida del factor de transcripción NF-kB (véase figura 10 y 13a) . Esto a su vez provoca una disminución de la transfusión de los genes para numerosos mediadores proinflamatorios (citocinas, quimiocinas, moléculas de adhesión, etc) . la identidad de las bandas observadas en EMSA como heterodímeros de NF-kB fue confirmada mediante la utilización de anticuerpo anti-p65. Ejemplo 6 Materiales y métodos : Ratones fueron tratados con LPS por inyección s.c. en una oreja. Esta inyección de preparación induce una elevación duradera de la expresión de E selectina en el sitio de la inyección de LPS. 24 horas después, se inyecto i.p. (reto) una segunda dosis de LPS. Esta segunda inyección de LPS llevó a una necrólisis rápida vaso y la formación de lesiones petequiales que son fácilmente medibles debido a su tamaño y número. Se administró otMSH (25 g) al momento de la inyección de LPS de preparación. Resultados : La inyección de ctMSH al momento de la administración de LPS de preparación inhibe la inducción de la expresión local de E selectina en la oreja (véase figura lia) y reduce significativamente el número de tamaño de las lesiones petequiales formadas después de la inyección de reto de LPS (véase figura 11b) . E emplo 7 Materiales y métodos: Células dendriticas de medula ósea (BMDC) fueron aisladas de huesos femorales de ratones y tratadas con IL-4 y GM^CSF durante 6 o 9 dias. El dia 6 o 9, las células fueron tratadas con aMSH (2 x 10"11 M) o bien un péptido P (2x 10"6 M) 3 horas y 2.5 horas antes de re-inyección en ratones naives con el mismo fondo genético. 2 horas antes de la re-inyección, las células fueron tratadas con hapteno (1 mM DNBS, la forma soluble en agua de DNBF) . Inmediatamente antes de la reinyección, las células fueron lavadas 2 x con PBS. Se inyectaron i.v. 5 x ??-3 células en cada animal. Células de control fueron tratadas ya sea con DNBS solo o bien con aMSH sola o bien fueron dejadas sin tratamiento. Cinco días después de la inyección, los animales fueron puestos en contacto con DNFB en la oreja, y se midió el espesor de la oreja al día siguiente. Dos semanas después, los animales fueron sensibilizados de nuevo con DNFB y puestos otra vez en contacto en la oreja 5 días después. Finalmente, se midió la hinchazón auricular. Resultados : Animales receptores inyectados con células no tratadas o bien con células tratadas con aMSH presentaron respuesta inmune después del primer reto, según se esperaba. Animales receptores inyectados con DNBS tratadas con BMDC presentaron una reacción CHS apropiada al momento del primer reto. Esta reacción fue suprimida en animales inyectados con células previamente tratadas con TNBS y aMSH o TNBS y KP in vitro. Asi, el contacto de DCs con aMSH o péptido es suficiente para inducir la inhibición de CHS (véase figura 12) .

Al momento del segundo reto y de la re-sensibilización correspondiente, animales que recibieron otra inyección de células tratadas con DNBS no presentaron ninguna respuesta inmune mientras que animales inyectadas con células tratadas con DNBS/ocMSH no presentaron respuesta inmune, lo que indica que la tolerancia inducida por aMSH es también mediada por DC (véase figura 12) . Ej emplo 8 "Inmunoterapia con células dendríticas o células T tratadas con gMSH o derivados de aMSH" Células dendriticas (DC) fueron aisladas (de sangre, medula ósea o tejido) . Sin embargo, es también posible utilizar mezclas de células que contienen DC (por ejemplo, mezclas de células epidérmicas) y cultivadas en presencia de GM-CSF e IL-4 (de preferencia: 250-1000 µ/ml para cada una de las sustancias . Después de un periodo de maduración (de preferencia 6-9 dias) , las células son cargadas con antigeno (concentración dependiente el antigeno particular, también en el caso del periodo) y tratadas con aMSH o derivados de la misma. Los derivados corresponden por lo menos a los aminoácidos 12 y 13 de aMSH (Lys-Pro) , con preferencia por los derivados que contienen Lys-Pro-Val. Son posibles tanto las configuraciones D como L de ??, y también intercambios ?? conservadores . Esto provoca, inter alia, la posibilidad de utilizar también Lys-Pro-Thr que es derivado de Il-?ß, y derivados del mismo con extensiones N-terminales . Derivados con extensiones C-terminales pueden también emplearse- La adición del péptido puede efectuarse antes de la adición del antigeno, al mismo tiempo que la adición del antigeno,, después de la adición de antigeno, una vez o varias veces (la dosis preferida depende del péptido particular, para oMSH, por ejemplo de 10~8 M a 10" 14 M) . Las células tratadas de esta forma son después inyectadas i.v. en el organismo receptor (i.p. o s.c. serian también posibles); ratones: 2 x 10° células limite inferior aproximado. Según el antigeno, es suficiente emprender una sola inyección o bien es necesario emprender varias inyecciones en este caso. Es también posible que las inyecciones deban ser repetidas después de periodos prolongados (no se cuentan con datos disponibles sobre esta materia) . Una posibilidad alternativa es llevar DC en contacto con células T fuera del cuerpo y después inyectar la mezcla o las células T. En este caso, la carga de antigeno de DC puede efectuarse antes del contacto con las células T o bien durante dicho contacto. Las células T pueden además originarse de individuos que ya han sido sensibilizados al antigeno particular. El limite inferior en ratón es de aproximadamente 1 millón de células T, prefiriéndose más células (Figura 14 y 15) . Las ventajas de dicho modo de uso son la prevención de cualquier tipo de respuesta inmune indeseada que son especificas para antigeno y en donde linfocitos específicos para antígenos (células B o T) desempeñan una parte patogenética. Incluyen, inter alia, alergias, enfermedades autoinmunes, inflamaciones crónicas o implantes. La curación de trastornos pre-existentes es también posible si se emplean números suficientemente grandes de células. Los resultados sorprendentes pueden, sin limitarnos a una teoría, considerarse como el hecho que MSH es un inmuno-modulador potente y tiene numerosas propiedades antiinflamatorias. Estas propiedades incluyen inter alia, y su propiedades de reducir la expresión moléculas co-estimuladoras en DC. Propiedades similares pueden se muestran también a través de derivados de aMSH de la invención, incluyendo el tripéptido C-terminal y el dipéptido Lys-pro. Derivados con una composición de aminoácidos diferentes (intercambios RA conservadores) tienen también propiedades comparables y estas incluyen, en particular, el Lys-Pro-Thr derivados de Il-?ß (de tal manera que deben considerarse que los péptidos extendidos N-terminalmente (análogos a aMSH) con una secuencia colinear a IL-?ß tienen el mismo efecto) . aMSH, así como los derivados, pueden inducir la tolerancia específica para haptenos in vivo. DC son células de presentación de antigeno profesionales que pueden inducir numerosos tipos de respuestas inmunes y que determinar también el transcurso de dichas respuestas. Estas respuestas inmunes incluyen, en particular, las respuestas inmunes mediadas por células T. Ahora ha sido posible mostrar que el tratamiento in vitro de mezclas de células DC o DC/T con un antigeno en presencia de ccMSH o derivados provoca que las células induzcan tolerancia especifica a los haptenos después de inyección en un organismo. En este caso, el mecanismo parece ser que la presentación de antigeno por la DC es modulada por aMSH o derivados de tal manera que células T supresoras se generan. Fue entonces posible mostrar que células T en mezclas apropiadas presentan una expresión elevada de CTLA-4 (figura 16) . Es una de las moléculas de superficie que caracterizan células T supresoras . Es posible que células DC o T generadas de esta manera impidan de manera preventiva enfermedades autoinmunes, inflamaciones crónicas o alergias. La curación de una condición patológica preexistente puede también concebirse si se utilizan numerosos suficientemente grandes de células. Los compuestos de la invención pueden también utilizarse para el tratamiento de tumores por medio de una activación in situ de células dendriticas . Es también posible que este método pueda utilizarse para el fomento de la tolerancia en presencia de los péptidos de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES El uso de un compuesto de la fórmula (I) (I) en donde X es Pro o bien Pro-Thr, o bien de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la producción de un fármaco para el tratamiento y/o- la prevención de una .enfermedad inflamatoria seleccionada dentro del grupo .' que consiste de -inflamaciones de la piel o de los vasos," reacciones alérgicas, enfermedades autoinmunes, fibrosis, esclerodermas y rechazo de trasplantes . El uso de conformidad con la reivindicación 1, que se caracteriza porque el compuesto de la fórmula (I) es acilado en el extremo N y/o amidado o esterificado en el extremo C. El uso de conformidad con la reivindicación 1, que se caracteriza porque el compuesto de la fórmula (I) es el dipéptido lisina-prolina o bien el tripéptido lisina- prolina-treonina . El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque la inflamación se selecciona dentro del grupo que consiste de psoriasis, dermatitis atópica, rinitis, alergias de contacto, asma y alergias a los alimentos. 5. El uso de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque la inflamación es una inflamación de la piel. 6. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque el compuesto de la fórmula (I) es administrado en forma de un ungüento o crema. 7. El uso de conformidad con la reivindicación 6, que se caracteriza porque el compuesto de la fórmula (I) está presente en el ungüento o crema en una concentración de 1 uM a 1 mM. 8. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se caracteriza porque el compuesto de la fórmula (I) se administra de manera intraperitoneal, intravenosa u oral. 9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, que se caracteriza porque se administra de 20 ?/¾ de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal del compuesto de la fórmula (I) . 10.El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque se emplean por lo menos 2 compuestos diferentes de la fórmula (I) . El uso de un compuesto de la fórmula (I) como adición a los alimentos. El uso de un compuesto de la fórmula (I) para producir una composición cosmética. Un método para la producción in vitro de células que pueden proporcionar tolerancia a un antigeno, que comprende los pasos siguientes: a) proporcionar células de presentación de antígeno, b) poner en contacto las células con oc SH o un derivado biológicamente activo o fragmento de la misma y c) poner las células en contacto con el antigeno, en donde los pasos b) y c) pueden llevarse a cabo en secuencia o de manera simultánea. El método de conformidad con la reivindicación 13, que se caracteriza porgue las células de presentación de antigeno son esencialmente células dendriticas . El método de conformidad con la reivindicación 13, que se caracteriza porque las células de presentación de antigeno son esencialmente células epidérmicas. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 13 a 15, que se caracteriza porque las células se ponen en contacto en el paso b) con un compuesto que comprende ccMSH, Lys-Pro-Val, Lys-Pro-Thr, Lys-Pro o Lys . 17.El uso de aMSH o de un derivado biológicamente activo o fragmento de la misma para la producción de un fármaco para inducir la tolerancia a un antigeno. 18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, que se caracteriza porque el fármaco comprende células que pueden ser obtenidas por un método de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 13 a 16.